CN106983919B - 一种Sema 4D-VEGF涂层的构建方法及应用 - Google Patents

一种Sema 4D-VEGF涂层的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Sema 4D‑VEGF涂层的构建方法及应用，其步骤包括，A、醌基活性层的制备；B、基底材料表面氨基化；C、Sema 4D纳米复合物的固定；D、功能因子VEGF的装载；本发明构建出Sema 4D‑VEGF协同作用下的快速内皮化的微环境，通过该方法对心血管材料表面进行生物修饰实现材料的诱导组织修复及快速内皮化功能。

Description

一种Sema 4D-VEGF涂层的构建方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料表面改性领域，具体涉及一种Sema 4D-VEGF涂层的构建方法及应用。
背景技术
心血管系统疾病是危害人类健康的重要疾病之一，人工植入血管支架或心脏瓣膜是治疗心血管疾病的有效方法；目前全世界每年大约超过200万冠心病病人需要进行经皮穿刺冠状动脉成形术，其中70％需要植入血管支架；我国2006年接受血管支架植入治疗的患者也逾10万次；我国心脏瓣膜病约占心脏病患者30％，每年也有十万以上危重病人必须施行人工心脏瓣膜置换术。
肝素(Heparin)在临床上常被用作抗凝剂，主要用于治疗血栓症、血栓静脉炎及血栓栓塞症；肝素结构中含有大量的硫酸根基团，是目前发现的负电性最强的生物分子；Sema4D是细胞膜表面锚定蛋白，广泛存在如血小板、T细胞等表面，其胞外蛋白水解产物Sema 4D具有促进内皮细胞迁移以及免疫调节的作用；Sema 4D的受体有plexin B1和CD72，前者主要存在于内皮细胞表面，而后者主要存在于免疫细胞中，Sema 4D功能主要通过作用相应受体而实现；大量研究表明，肝素与各种生长因子的结合能够对生长因子起到保护作用，延缓生长因子的半衰期，并促进生长因子和其受体间的识别和结合；目前还没有发现利用细胞膜表面锚定蛋白Sema 4D和血管内皮因子VEGF协同作用构建微环境的技术。
发明内容
本发明提供一种装载VEGF功能因子并能够与Sema 4D协同作用的涂层，可促进内皮细胞迁移和增值，加速内皮化进程。
本发明采用的技术方案是：一种Sema 4D-VEGF涂层的构建方法，包括以下步骤：
A、基底材料表面抛光清洗后用1-4mg/ml的盐酸多巴胺溶液，室温条件下浸泡反应12-24小时后，清洗；浸泡清洗过程重复2-5遍形成醌基活性层；
B、步骤A中的醌基活性层用2.5mg/ml的多赖氨酸(PLL)4℃条件下浸泡处理12h，清洗；
C、将50-400ng/ml的Sema 4D与浓度为5-10mg/ml的Heparin等体积混合，37℃条件下反应2-4h形成Sema 4D纳米复合物，将步骤B中处理后的样品浸没于Sema 4D纳米复合物中4℃条件下反应12-24h，清洗；
D、将步骤C中得到的样品浸于200-400ng/ml的VEGF溶液中，在4℃条件下反应24-48h，清洗后既得目标产物。
进一步的，所述步骤A中的基底材料为钛或钛合金。
进一步的，所述步骤A中基底材料清洗采用纯净水超声清洗3min。
进一步的，所述步骤A、B、C、D中样品的清洗采用磷酸盐缓冲液进行。
进一步的，所述步骤B中多赖氨酸分子量为150-300KDa。
一种Sema 4D-VEGF涂层的应用，诱导受损组织修复和内皮化。
本发明的有益效果是：
(1)本发明将功能因子Sema 4D和VEGF通过肝素间接固定于材料表面，肝素和Sema4D的结合形成纳米复合物能够延缓Sema 4D的半衰期，并对Sema 4D起到保护作用，避免被蛋白酶降解，同时肝素能够促进Sema 4D、VEGF与其相应受体间的识别与结合，保证Sema 4D和VEGF功能的发挥；
(2)本发明Sema 4D和VEGF双因子协同作用加速机体血管创伤修复；
(3)本发明工艺简单易于操作、无需昂贵复杂的设备，适用于各种复杂的心血管植入器械如血管支架等具有抗凝、快速内皮化要求的表面。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
图2为本发明中实施例1和实施例2中制备样品的XPS图谱。
图3为本发明中涂层修饰后12小时内皮细胞在材料表面迁移效果图。
图4为本发明中涂层修饰后内皮细胞培养1、3天的细胞数量图。
图5为本发明中涂层修饰后SD大鼠腹主动脉体内植入后的血管切片结果。
图6为本发明中涂层修饰后SD大鼠腹主动脉体内植入后的血管内皮细胞CD31和平滑肌α-SMA的表达。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例一
A、基底材料表面抛光清洗后用1-4mg/ml的盐酸多巴胺溶液，pH为8.5，室温条件下浸泡反应12-24小时后，清洗；浸泡清洗过程重复2-5遍形成醌基活性层；其中基底材料选用纯钛，用纯净水超声清洗3min；浸泡清洗后形成一层醌基活性层，浸泡清洗过程重复2-5遍，制备多层醌基活性层，保证材料表面足够多的活性醌基，利于后续氨基层的固定；
B、步骤A中的醌基活性层用2.5mg/ml的多赖氨酸4℃条件下浸泡处理12h，清洗；其中多赖氨酸的分子量为150-300KDa，清洗过程采用磷酸盐缓冲液清洗；
C、将50-400ng/ml的Sema 4D与浓度为5-10mg/ml的Heparin等体积混合，37℃条件下反应2-4h形成Sema 4D纳米复合物，将步骤B中处理后的样品浸没于Sema 4D纳米复合物中4℃条件下反应12-24h，清洗；其中清洗过程采用磷酸盐缓冲液进行；
D、将步骤C中得到的样品浸于200ng/ml的VEGF溶液中，采用磷酸缓冲液PBS作为溶剂，pH为7.4；在4℃条件下反应24-48h，清洗后既得表面装载Sema 4D功能因子的材料；附图中用该方法制得的样品用V200表示。
对比例
A、基底材料表面抛光清洗后用1-4mg/ml的盐酸多巴胺溶液，pH为8.5，室温条件下浸泡反应12-24小时后，清洗；浸泡清洗过程重复2-5遍形成醌基活性层；其中基底材料选用纯钛，用纯净水超声清洗3min；浸泡清洗后形成一层醌基活性层，浸泡清洗过程重复2-5遍，制备多层醌基活性层，保证材料表面足够多的活性醌基，利于后续氨基层的固定；
B、步骤A中的醌基活性层用2.5mg/ml的多赖氨酸4℃条件下浸泡处理12h，清洗；其中多赖氨酸的分子量为150-300KDa，清洗过程采用磷酸盐缓冲液清洗；
C、将50-400ng/ml的Sema 4D与浓度为5-10mg/ml的Heparin等体积混合，37℃条件下反应2-4h形成Sema 4D纳米复合物，将步骤B中处理后的样品浸没于Sema 4D纳米复合物中4℃条件下反应12-24h，清洗；其中清洗过程采用磷酸盐缓冲液进行；
D、将步骤C中得到的样品浸于0ng/ml的VEGF溶液中，采用磷酸缓冲液PBS作为溶剂，pH为7.4；在4℃条件下反应24-48h，清洗后既得表面装载Sema 4D功能因子的材料；附图中用该方法制得的样品用V0表示。
表1.Sema 4D-VEGF涂层修饰后表面元素含量
实施例二
A、基底材料表面抛光清洗后用1-4mg/ml的盐酸多巴胺溶液，pH为7.4；室温条件下浸泡反应12-24小时后，清洗；浸泡清洗过程重复2-5遍形成醌基活性层；其中基底材料选用纯钛，用纯净水超声清洗3min；浸泡清洗后形成一层醌基活性层，浸泡清洗过程重复2-5遍，制备多层醌基活性层，保证材料表面足够多的活性醌基，利于后续氨基层的固定；
B、步骤A中的醌基活性层用2.5mg/ml的多赖氨酸4℃条件下浸泡处理12h，清洗；其中多赖氨酸的分子量为150-300KDa，清洗过程采用磷酸盐缓冲液清洗；
C、将50-400ng/ml的Sema 4D与浓度为5-10mg/ml的Heparin等体积混合，37℃条件下反应2-4h形成Sema 4D纳米复合物，将步骤B中处理后的样品浸没于Sema 4D纳米复合物中4℃条件下反应12-24h，清洗；其中清洗过程采用磷酸盐缓冲液进行；
D、将步骤C中得到的样品浸于300ng/ml的VEGF溶液中，采用磷酸缓冲液PBS作为溶剂，pH为7.4；在4℃条件下反应24-48h，清洗后既得表面装载Sema 4D和VEGF功能因子的材料；附图中用该方法制得的样品用V200表示。
表1.Sema 4D-VEGF涂层修饰后表面元素含量
实施例三
A、基底材料表面抛光清洗后用1-4mg/ml的盐酸多巴胺溶液，pH为8.5，室温条件下浸泡反应12-24小时后，清洗；浸泡清洗过程重复2-5遍形成醌基活性层；其中基底材料选用纯钛，用纯净水超声清洗3min；浸泡清洗后形成一层醌基活性层，浸泡清洗过程重复2-5遍，制备多层醌基活性层，保证材料表面足够多的活性醌基，利于后续氨基层的固定；
B、步骤A中的醌基活性层用2.5mg/ml的多赖氨酸4℃条件下浸泡处理12h，清洗；其中多赖氨酸的分子量为150-300KDa，清洗过程采用磷酸盐缓冲液清洗；
C、将50-400ng/ml的Sema 4D与浓度为5-10mg/ml的Heparin等体积混合，37℃条件下反应2-4h形成Sema 4D纳米复合物，将步骤B中处理后的样品浸没于Sema 4D纳米复合物中4℃条件下反应12-24h，清洗；其中清洗过程采用磷酸盐缓冲液进行；
D、将步骤C中得到的样品浸于400ng/ml的VEGF溶液中，采用磷酸缓冲液PBS作为溶剂，pH为7.4；在4℃条件下反应24-48h，清洗后既得表面装载Sema 4D和VEGF功能因子的材料；附图中用该方法制得的样品用V400表示。
图2-6中，V0表示，实施例1中制备的样品，V200表示实施例2中制备的样品，V400为实施例3中制备的样品，Ti表示基底材料未处理，作为对比样品；从图2可以看出构建了VEGF活性层的样品表面硫元素的特征吸收峰消失，说明采用本制备方法VEGF成功构建了活性层表面；从图3中可以看出构建了VEGF活性层的样品较纯Ti表面和未构建VEGF活性层的样品具有更强的促迁移能力；从图4中可以看出构建了VEGF活性层的样品较纯Ti表面和未构建VEGF活性层的样品具有更好的促进内皮细胞增殖的能力；从图5中可以看出中可以看出构建了VEGF活性层的样品较纯Ti表面和未构建VEGF活性层的样品具有更完整的内皮层，内皮化功能更优异；从图6中可以看出中可以看出构建了VEGF活性层的样品较纯Ti表面和未构建VEGF活性层的样品具有更高的内皮；从图中CD31和适度平滑肌(SMA)表达说明Sema 4D-VEGF活性层具有较好的快速内皮化的功能；从表1中可以看出构建了VEGF的活性层较未构建VEGF的活性层硫元素减少，硫元素是肝素特有的元素，其他生物分子中几乎不存在硫元素，证明表面的肝素参与了对VEGF的固定，本发明Sema 4D-VEGF活性层构建成功。
本发明的反应过程与机理主要分为三部分。第一部分多巴胺氧化和自聚合反应后在材料表面形成醌基层，醌基可与PLL氨基间发生西夫碱反应，将PLL共价固定于材料表面，使材料表面形成富氨基层；第二部分为Sema 4D纳米复合物的制备，Heparin和Sema 4D为两种PI不同的分子，在中性pH7.4条件下，两者携带不同电荷，利用静电结合的方式形成特定的蛋白-糖纳米复合物；第三部分为Sema 4D纳米复合物表面肝素的强负电性与PLL的强正电性间能够发生离子反应，可将Sema 4D纳米复合物固定于材料表面，同时肝素还能再与功能因子VEGF结合，将VEGF装载在材料表面。
本发明创造性地将双功能因子Sema 4D与VEGF通过肝素间接固定于材料表面，肝素和Sema 4D的结合形成纳米复合物能够延缓Sema 4D的半衰期，并对Sema 4D起到保护作用，避免被蛋白酶降解，同时肝素能够促进Sema 4D、VEGF与其相应受体间的识别与结合，保证Sema 4D和VEGF功能的发挥；Sema 4D-VEGF双因子协同作用可加速机体血管创伤修复；首先，肝素作为抗凝剂能够抑制体内血栓形成，抑制血小板和纤维蛋白在材料表面的粘附；其次，Sema 4D和VEGF均为机体损伤后血小板激活过程中加速释放的促进机体修复的因子，Sema 4D能够促进T细胞和抗原递呈细胞的相互作用，激活T细胞启动(T cell priming)，促进B细胞增殖和抗体产生，产生正向免疫调控作用，同时通过受体Plexin-B1促进内皮细胞迁移的功能，VEGF可促进内皮细胞增值，同时协同促进Sema 4D功能的发挥，促进内皮化，加速血管组织修复；本发明简单易于操作，无需昂贵复杂的设备，浸没固定生物分子的方法保证样品表面生物分子均匀覆盖，适用于各种复杂的心血管植入器械如血管支架等具有抗凝、快速内皮化要求的表面。

Claims (5)

1.一种Sema4D-VEGF涂层的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、基底材料表面抛光清洗后用1-4mg/ml的盐酸多巴胺溶液，室温条件下浸泡反应12-24小时后，清洗；浸泡清洗过程重复2-5遍形成醌基活性层；
B、步骤A中的醌基活性层用2.5mg/ml的多赖氨酸4℃条件下浸泡处理12h，清洗；
C、将50-400ng/ml的Sema4D与浓度为5-10mg/ml的Heparin等体积混合，37℃条件下反应2-4h形成Sema4D纳米复合物，将步骤B中处理后的样品浸没于Sema4D纳米复合物中4℃条件下反应12-24h，清洗；
D、将步骤C中得到的样品浸于200-400ng/ml的VEGF溶液中，在4℃条件下反应24-48h，清洗后既得目标产物。
2.根据权利要求1所述的一种Sema4D-VEGF涂层的构建方法，其特征在于：所述步骤A中的基底材料为钛或钛合金。
3.根据权利要求1所述的一种Sema4D-VEGF涂层的构建方法，其特征在于：所述步骤A中基底材料清洗采用纯净水超声清洗3min。
4.根据权利要求1所述的一种Sema4D-VEGF涂层的构建方法，其特征在于：所述步骤A、B、C、D中样品的清洗采用磷酸盐缓冲液进行。
5.根据权利要求1所述的一种Sema4D-VEGF涂层的构建方法，其特征在于：所述步骤B中多赖氨酸分子量为150-300KDa。
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