WO2017217545A1 - プレキシンの結合調節剤 - Google Patents

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WO2017217545A1
WO2017217545A1 PCT/JP2017/022387 JP2017022387W WO2017217545A1 WO 2017217545 A1 WO2017217545 A1 WO 2017217545A1 JP 2017022387 W JP2017022387 W JP 2017022387W WO 2017217545 A1 WO2017217545 A1 WO 2017217545A1
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plexin
cyclic peptide
semaphorin
binding regulator
amino acid
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PCT/JP2017/022387
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裕明 菅
ナセル 加藤 バシルディン
淳一 ▲高▼木
幸子 松永
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国立大学法人東京大学
国立大学法人大阪大学
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    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link

Definitions

  • the present invention relates to a plexin binding regulator.
  • Semaphorin known as a nerve axon inducing factor is a highly functional protein having an important role in nerve cell growth, immune response, bone metabolism, cancer cell differentiation and organogenesis. In mammals, semaphorins are known as 3A-3G, 4A-4G, 5A, 5B, 6A-6D and 7A. Semaphorin and its signal receptor plexin are important as drug targets for various diseases (Non-Patent Documents 1 to 4).
  • Plexins which are single-transmembrane proteins having a molecular weight of 300 kDa or more, are classified into nine types in mammals: A1-A4, B1-B3, C1, and D1. Among them, plexin A1 and plexin B1 are known to be homologs. Among the nine plexins, plexin A1 interacts with semaphorin 3A and plexin B1 interacts with semaphorin 4D, and is controlled in various aspects of biological processes such as metabolism in bone tissue and growth of nerve cells. (Non-Patent Documents 4 and 5).
  • Non-Patent Document 6 discloses that bone mass increases due to gene disruption of plexin in mice. Therefore, the interaction between plexin and semaphorin is thought to inhibit bone formation.
  • Non-patent Document 7 Like semaphorin, plexin is expressed in various cells in neuroinflammation and enhances B cell differentiation (Non-Patent Documents 8 and 9).
  • Non-Patent Document 10 Involvement of plexin has also been reported in cell functions such as cell migration and cell differentiation, and many documents indicate that expression of plexin is increased in various cancers (for example, Non-Patent Document 10). In addition, it has been shown that the interaction between plexin and semaphorin is related to angiogenesis, cell migration and cell invasion in relation to cancer (Non-Patent Documents 11 to 16).
  • plexin can be a therapeutic target as an osteoporotic bone mass recovery, multiple sclerosis treatment, and cancer metastasis inhibitor.
  • plexin binding regulators include, for example, cancer treatment, bone It can be used for the treatment of diseases related to metabolism and the treatment of neurodegenerative diseases or neuroinflammatory diseases.
  • the tangent surface in the interaction between semaphorin and plexin is a wide and flat binding surface, it has been difficult to target traditional traditional low-molecular drugs. Therefore, the problem to be solved by the present invention is to provide a novel plexin binding regulator using a cyclic peptide.
  • a plexin binding regulator comprising a cyclic peptide having an Arg-Trp-Thr structure or a Leu-Ser-Trp structure or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the cyclic peptide has an Arg-Trp-Thr-Xaa2-Xaa3-Ile / Val / Leu structure (Xaa2 and Xaa3 are each independently any amino acid), described in (1) or (2) Binding regulator.
  • a pharmaceutical composition comprising the binding regulator according to any one of (13).
  • a novel plexin binding regulator using a cyclic peptide can be provided.
  • FIG. 1 a shows an example of the results of five selections by the RaPID system for plexin B1.
  • FIG. 1b shows the general formula of the cyclic peptide
  • FIG. 1c shows the amino acid sequence of the resulting cyclic peptide.
  • FIG. 2a shows the results of surface resonance plasmon (SPR) analysis of the binding of a chemically synthesized cyclic peptide to plexin B1.
  • FIG. 1b shows the general formula of the cyclic peptide
  • FIG. 1c shows the amino acid sequence of the cyclic peptide and the binding affinity for each plexin B1.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of a semaphorin 4D and plexin B1 binding assay.
  • FIG. 1 a shows an example of the results of five selections by the RaPID system for plexin B1.
  • FIG. 1b shows the general formula of the cyclic peptide
  • FIG. 1c shows the amino acid sequence of the resulting cyclic
  • FIG. 4a shows the results of a semaphorin 4D and plexin B1 binding assay
  • FIG. 4b shows the results of a semaphorin 6A and plexin A2 binding assay
  • FIG. 4c shows the general formula of the cyclic peptide
  • FIG. 4d shows the amino acid sequence of the cyclic peptide
  • FIG. 5a shows the results of the semaphorin 4D and plexin B1 binding assay
  • FIG. 5b shows the results of the semaphorin 6A and plexin A2 binding assay
  • FIG. 5c shows the general formula of the cyclic peptide
  • FIG. 5d shows the amino acid sequence of the cyclic peptide.
  • FIG. 6a shows the structure of the cyclic peptide P6, and FIG. 6b shows the results of a semaphorin 4D and plexin B1 binding inhibition assay at various concentrations of P6.
  • FIG. 7 shows the results of a cell process disruption test called the growth cone of HEK239 cells exogenously expressing plexin B1.
  • FIG. 6c shows that the addition of P6 inhibits the growth cone collapse dependent on semaphorin 4D observed in FIG. 6b.
  • FIG. 8a shows the cyclic peptide P6 conjugated with biotin.
  • FIG. 8b shows the result of fluorescent labeling in Plexin B1-expressing HEK239 cells with biotin-conjugated cyclic peptide P6.
  • FIG. 8a shows the cyclic peptide P6 conjugated with biotin.
  • FIG. 8b shows the result of fluorescent labeling in Plexin B1-expressing HEK239 cells with biotin-conjugated cyclic
  • FIG. 9 shows the influence of the alanine mutation of the cyclic peptide P6 on the plexin B1 binding ability by increasing the KD value determined by SPR.
  • FIG. 10 shows a cyclic peptide having an intramolecular lactam bridge structure. Asp represents aspartic acid, Glu represents glutamic acid, DAP represents 2,3-diaminopropionic acid, DAB represents 2,4-diaminobutyric acid, Orn represents ornithine, and Lys represents lysine.
  • FIG. 11a shows the result of SPR analysis of a cyclic peptide having an intramolecular lactam bridge structure.
  • FIG. 11b shows the structure of the cyclic peptide BC8.
  • FIG. 11c shows the half-life of degradation by proteases in serum.
  • FIG. 12 shows the dimer of cyclic peptide P6,
  • FIG. 12a shows P6dPEG11, and
  • FIG. 12b shows P6dPEG5.
  • FIG. 13 shows a comparison of the dimer activity of cyclic peptides P6 and P6.
  • FIG. 13a shows the results of a cell detachment inhibition test dependent on semaphorin 4D.
  • FIG. 13b shows a comparison of binding affinity to plexin B1 by the SPR method.
  • the plexin binding regulator in the present invention includes a cyclic peptide having an Arg-Trp-Thr structure or a Leu-Ser-Trp structure, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a cyclic peptide having an Arg-Trp-Thr structure or having a Leu-Ser-Trp structure binds to plexin via the Arg-Trp-Thr structure and allosterically signals of semaphorin and plexin It is thought to regulate transmission.
  • the binding regulator in the present invention preferably functions as a binding regulator for plexin B1 and its homologue plexin A1.
  • cyclic peptide means having at least a cyclic structure formed by four or more amino acids in the molecule.
  • the molecular structure of the cyclic peptide in addition to the cyclic structure, it may have a chain structure in which amino acids are linked by peptide bonds, or may have a structure other than the peptide structure.
  • the “cyclic structure” means a closed ring structure formed in a molecule by bonding two amino acids separated by two or more amino acid residues directly or via a linker in a linear peptide. Means.
  • two or more amino acid residues apart means that there are at least two amino acids between two amino acids.
  • the closed ring structure in the cyclic structure is not particularly limited, but is formed by covalently bonding two amino acids.
  • covalent bond between two amino acids include, for example, disulfide bond, peptide bond, alkyl bond, alkenyl bond, ester bond, thioester bond, ether bond, thioether bond, phosphonate ether bond, azo bond, CSC bond, Examples thereof include C—N—C bonds, C ⁇ N—C bonds, amide bonds, lactam bridges, carbamoyl bonds, urea bonds, thiourea bonds, amine bonds, and thioamide bonds.
  • a closed ring structure is formed by a peptide bond, but a covalent bond between the two amino acids is formed by the side chains of the two amino acids, the side chain and the main chain, etc. May be.
  • the cyclic structure is not limited to the bond between the N-terminal and C-terminal amino acids of the linear peptide, and may be formed by a bond between the terminal amino acid and an amino acid other than the terminal, or a bond between amino acids other than the terminal.
  • the cyclic peptide has a structure in which a linear peptide is attached to the cyclic structure as a tail.
  • amino acids that form a cyclic structure include artificial amino acid variants and derivatives.
  • natural proteinaceous L-amino acids unnatural amino acids, and characteristics known in the art that are characteristic of amino acids. Examples include chemically synthesized compounds.
  • Proteinaceous amino acids are represented by three letter notation well known in the art, Arg, His, Lys, Asp, Glu, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys, Gly, Pro, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, and Val.
  • Non-proteinogenic amino acids mean natural or non-natural amino acids other than proteinaceous amino acids.
  • non-natural amino acids examples include ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids ( ⁇ -methylalanine, etc.), N-alkyl- ⁇ -amino acids, D-amino acids, ⁇ -amino acids, ⁇ -Hydroxy acids, amino acids whose side chain structure is different from the natural type (norleucine, homohistidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain ("homo" amino acids, homophenylalanine, homohistidine, etc.), and in the side chain An amino acid (such as cysteic acid) in which the carboxylic acid functional group is substituted with a sulfonic acid group.
  • unnatural amino acid include amino acids described in International Publication No. 2015/030014.
  • the number of amino acids forming the cyclic structure is not particularly limited as long as it is 4 or more. For example, it may be 5 or more, 8 or more, 10 or more, or 30 or less, 25 or less, 20 or less, or 15 or less. Good.
  • the number of amino acids forming the cyclic structure is preferably 4 or more and 30 or less, and the number of amino acids forming the cyclic structure may be 5 or more, 8 or more, 10 or more within the range of 4 or more and 30 or less. 30 or less, 25 or less, 20 or less, or 15 or less.
  • the number of amino acids forming the cyclic structure may be 8 or more, 20 or less, 10 or more, and 20 or less, or 10 or more and 15 or less.
  • the cyclic peptide may be modified with phosphorylation, methylation, acetylation, adenylylation, ADP ribosylation, glycosylation, etc., and fused with other peptides or proteins. It may be.
  • the cyclic peptide may be biotinylated through an appropriate linker.
  • the cyclic peptide may be a dimer having two cyclic structures in a molecule in which two cyclic peptides having one cyclic structure are bonded via a linker structure. You may have the intramolecular lactam bridge structure which formed the lactam structure.
  • the linker structure that connects two cyclic peptides is not particularly limited, and those having a well-known structure can be adopted as a linker that connects peptides in the field of peptide synthesis.
  • the intramolecular lactam bridge structure may be formed by bonding side chains of amino acids constituting a cyclic peptide, for example, an amino group of a side chain of Lys and a carboxyl group of a side chain of Asp or Glu.
  • an intramolecular lactam structure is formed by forming a peptide bond, and the cyclic peptide has another ring structure as a bridge structure in the molecule.
  • Lys for example, DAP, DAB, and Orn may be bonded to Asp or Glu.
  • the binding regulator for plexin is not particularly limited as long as it modulates the binding of semaphorin and plexin and causes a change in the cascade existing downstream thereafter, but as plexin, plexin A1 and / or It is preferably a binding regulator for plexin B1, and is preferably a binding regulator for semaphorin 3A and plexin A1 or semaphorin 4D and plexin B1.
  • the plexin binding regulator of the present invention may be a semaphorin-mediated inhibitor of plexin, specifically, semaphorin 4D and plexin B1, and activation of plexin, specifically, plexin B1.
  • An agent may be used.
  • the plexin binding regulator of the present invention may inhibit or promote the activation of plexin by semaphorin, specifically, activation of plexin B1 by semaphorin 4D.
  • the plexin binding regulator of the present invention is expected to promote bone formation by inhibiting the binding between semaphorin 4D and plexin B1, and can be used for treatment or prevention of diseases related to bone metabolism.
  • Diseases related to bone metabolism include, for example, fractures, bone defects, osteoporosis, osteomalacia, osteopenia, low back pain, bone paget disease, ankylosing spondylitis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, etc. Is mentioned.
  • the plexin-binding regulator of the present invention can be used for cancer treatment or prevention by regulating the binding between semaphorin and plexin, particularly by regulating the binding between semaphorin 4D and plexin B1.
  • the cancer disease is not particularly limited and includes various tumors such as lung cancer, breast cancer, mesothelioma, carcinoma, glioma, and abnormal angiogenesis.
  • the plexin binding regulator of the present invention can be used as a cancer metastasis inhibitor for cancer treatment or prevention.
  • the plexin binding regulator of the present invention regulates the binding between semaphorin and plexin, in particular, by regulating the binding between semaphorin 4D and plexin B1, thereby causing Alzheimer's disease, Parkinson's disease, central nervous system lesions, and It can be used for treatment or prevention of neurodegenerative diseases such as demyelination associated with lesions.
  • the plexin binding regulator of the present invention regulates the binding between semaphorin and plexin, in particular, by regulating the binding between semaphorin 4D and plexin B1, for example, multiple sclerosis, muscle atrophy, etc. It may be used for the treatment or prevention of neuroinflammatory diseases such as lateral sclerosis, epilepsy, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, meningitis, brain edema, brain trauma, and stroke.
  • the plexin binding regulator of the present invention is used for the treatment or prevention of atopic dermatitis treatment, cancer metastasis suppression, hyperimmune reaction suppression in autoimmune diseases, etc. by showing agost activity in the binding of semaphorin and plexin. May be.
  • the plexin binding regulator of the present invention can be used not only as a therapeutic or prophylactic agent for diseases, but also as a research tool for studying various roles in the interaction between semaphorin and plexin. It may be. Further, the plexin binding regulator of the present invention may be used as a diagnostic tool for measuring the expression level of plexin in a patient sample.
  • the cyclic peptide may be used as a pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salts of cyclic peptides include salts with pharmaceutically acceptable bases and acids.
  • Specific examples of pharmaceutically acceptable salts include addition salts of inorganic acids (hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, etc.), organic acids (p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid) , Oxalic acid, p-bromophenylsulfonic acid, carboxylic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, acetic acid, etc.) addition salt, inorganic base (ammonium hydroxide or alkali or alkaline earth metal hydroxide, carbonate, Bicarbonate, etc.), addition salts of amino acids and the like.
  • the cyclic peptide as a plexin binding regulator of the present invention is thought to regulate allosterically, particularly, semaphorin 4D and plexin B1 signal transduction via the Arg-Trp-Thr structure, and thus the Arg-Trp-Thr structure. If it is a cyclic peptide containing, it will not specifically limit, It has an amino acid sequence which can be represented with the following general formulas. (Xaa4) m -Arg-Trp-Thr- (Xaa5) n
  • Xaa4 and Xaa5 are each independently any amino acid, and at least one of m and n is an integer of 1 or more.
  • Xaa4 and Xaa5 form a cyclic peptide by forming a cyclic structure.
  • the cyclic structure may be formed by linking Xaa4 at the N-terminal to the C-terminal of Xaa5, and Xaa4 at the N-terminal Caa-terminal Xaa5 may be formed, non-N-terminal Xaa4 may be formed by combining with C-terminal Xaa5, and non-N-terminal Xaa4 may be formed with non-C-terminal Xaa5. It may be formed by bonding.
  • Xaa4 and Xaa5 may have a cyclic structure via a linker.
  • each Xaa is independently selected from arbitrary amino acids.
  • the two Xaas may be the same or different amino acids.
  • n and n are not particularly limited as long as m + n is 1 or more, but m and n are preferably integers independently selected so that m + n is 1 or more and 27 or less, and m + n is 1 It is appropriately selected within the range of the number of amino acids forming a cyclic structure within the range of 27 or less.
  • the cyclic peptide may have a Val / Ile-Xaa1-Arg-Trp-Thr structure (Xaa1 is any amino acid), and an Arg-Trp-Thr-Xaa2-Xaa3-Ile / Val / Leu structure (Xaa2 and Xaa3 are each independently any amino acid). Further, the cyclic peptide may have a Val / Ile-Xaa1-Arg-Trp-Thr-Xaa2-Xaa3-Ile / Val / Leu structure (Xaa1, Xaa2, and Xaa3 are each independently an arbitrary one. Amino acids). Xaa2 is preferably Gly.
  • Val / Ile in the structure of the cyclic peptide means Val or Ile.
  • Ile / Val / Leu in the structure of the cyclic peptide means Ile, Val or Leu, and Ile is preferred.
  • the cyclic peptide as a plexin binding regulator of the present invention is thought to regulate allosterically, particularly, semaphorin 4D and plexin B1 signaling through the Leu-Ser-Trp structure. If it is a cyclic peptide containing, it will not specifically limit, It has an amino acid sequence which can be represented with the following general formulas. (Xaa4) m -Leu-Ser-Trp- (Xaa5) n
  • Xaa4 and Xaa5 are each independently any amino acid, and at least one of m and n is an integer of 1 or more.
  • Xaa4 and Xaa5 form a cyclic peptide by forming a cyclic structure.
  • the cyclic structure may be formed by linking Xaa4 at the N-terminal to the C-terminal of Xaa5, and Xaa4 at the N-terminal Caa-terminal Xaa5 may be formed, non-N-terminal Xaa4 may be formed by combining with C-terminal Xaa5, and non-N-terminal Xaa4 may be formed with non-C-terminal Xaa5. It may be formed by bonding.
  • Xaa4 and Xaa5 may have a cyclic structure via a linker.
  • m and n are not particularly limited as long as m + n is 1 or more, but m and n are preferably integers independently selected so that m + n is 1 or more and 27 or less, and m + n is 1 It is appropriately selected within the range of the number of amino acids forming a cyclic structure within the range of 27 or less.
  • the cyclic peptide may have a Leu-Ser-Trp-Gln-Thr-Tyr-Ser structure.
  • the cyclic peptide may form a ring structure by the N—CO—CH 2 —S structure, and the structure is such that the amino group of Xaa 4 at the N-terminus is substituted with H by a leaving group such as a chloroacetyl group.
  • the acetyl group is preferably formed by the bond between the C-terminal Xaa5 cysteine thiol group, in which case the general formula is XCH 2 CO- (Xaa6)-(Xaa7) p -Arg-Trp-Thr- (Xaa8) q -Cys- (Xaa9) r or XCH 2 CO- (Xaa6)-(Xaa7) p -Leu It is preferably represented by -Ser-Trp- (Xaa8) q- Cys- (Xaa9) r .
  • Xaa6 to Xaa9 are each independently any amino acid, and p + q is suitably selected within the range of the number of amino acids that form a cyclic structure, preferably in the range of 0 to 25.
  • Xaa6 is preferably Trp
  • C-terminal Xaa9 is preferably Gly or Ser
  • r is not particularly limited as long as r is an integer of 0 or more, but may be 20 or less, and 10 or less. It may be 0 or 1 is preferable.
  • the cyclic peptide when r is 0, the cyclic peptide does not have Xaa9, and when r is an integer of 2 or more, (Xaa9) r in the cyclic peptide is an amino acid linked by a peptide bond. Corresponds to a chain structure.
  • a cyclic peptide having the structure Val / Ile-Xaa1-Arg-Trp-Thr-Xaa2-Xaa3-Ile / Val / Leu the general formula is XCH 2 CO- (Xaa6)-(Xaa10) s -Val / Ile-Xaa1-Arg-Trp-Thr-Xaa2-Xaa3-Ile / Val / Leu- (Xaa11) t -Cys- (Xaa9) r
  • Xaa1 to Xaa3, Xaa6, and Xaa9 to Xaa11 are each independently any amino acid, and s + t is suitably selected within the range of the number of amino acids that preferably form a cyclic structure within the range of 0 or more and 20 or less.
  • the Xaa6 is preferably Trp
  • C-terminal Xaa9 is preferably Gys or Ser
  • r is not particularly limited as long as r is an integer of 0 or more, but may be 20 or less, and 10 or less. It may be 0 or 1 is preferable.
  • a cyclic peptide having the Leu-Ser-Trp-Gln-Thr-Tyr-Ser structure the general formula is XCH 2 CO- (Xaa 6)-(Xaa 10) s -Leu-Ser-Trp-Gln-Thr-Tyr-Ser- (Xaa 12) u -Cys- (Xaa 9) r is preferable, and XCH 2 CO- More preferably, it is represented by Trp- (Xaa10) s -Leu-Ser-Trp-Gln-Thr-Tyr-Ser- (Xaa12) u -Cys- (Xaa9) r .
  • Xaa6, Xaa9, Xaa10, and Xaa12 are each independently any amino acid, and s + u is suitably selected within the range of the number of amino acids that preferably form a cyclic structure within the range of 0 to 21.
  • Xaa6 is preferably Trp
  • C-terminal Xaa9 is preferably Glya or Ser
  • r is not particularly limited as long as it is an integer of 0 or more, but may be 20 or less, or 10 or less. It may be 0 or 1 is preferable.
  • cyclic peptide of the present invention include the following.
  • D Trp means D form of Trp
  • S means a thiol group of Cys.
  • Xaa9 and r are as defined above.
  • Variable region (variable region) in the formula is RPRVARWTGQIIY RVRVERWTGKLI RPRVARWTGQIIH RPRVARWTGQVIY RPRVARWTGQNIY RPRVARWTGQISN RPRVARWTGQIIN RPRAARWTGQIIY RPYIERWTGRLIV RWFYDRWTGTFYV RAFIERWTGRLVV LGYIARWTGTVVK LAYERWTGQIVR NSNVLSWQTYSWY NGRLSWQTYSHL AVSNPPRPHYITIE LSWQAYSWGQ Is mentioned.
  • Arg-Trp-Thr structure or a Leu-Ser-Trp structure is included, preferably a Val / Ile-Xaa1-Arg-Trp-Thr structure is included, more preferably an Arg-Trp structure.
  • a Val / Ile-Xaa1-Arg-Trp-Thr structure is included, more preferably an Arg-Trp structure.
  • it includes a Thr-Xaa2-Xaa3-Ile / Val / Leu structure it is more preferable as long as it includes a Val / Ile-Xaa1-Arg-Trp-Thr-Xaa2-Xaa3-Ile / Val / Leu structure.
  • Binding regulatory effect of plexin B1 may be a cyclic peptide having the.
  • these amino acid sequences and Arg-Trp-Thr structure or Leu-Ser-Trp structure preferably, Val / Ile-Xaa1-Arg-Trp-Thr structure, more preferably Arg
  • Val / Ile-Xaa1-Arg-Trp-Thr structure preferably, it includes the Val / Ile-Xaa1-Arg-Trp-Thr-Xaa2-Xaa3-Ile / Val / Leu structure
  • the method for producing the cyclic peptide of the present invention is not particularly limited, and the cyclic peptide of the present invention can be produced using a known peptide synthesis technique.
  • Examples of the method for producing a cyclic peptide include a liquid phase method, a solid phase method, a chemical synthesis method such as a hybrid method combining a liquid phase method and a solid phase method, a gene recombination method, a translation synthesis method using a cell-free translation system, and the like. Can be mentioned.
  • the cyclic peptide of the present invention can be suitably produced by a translation synthesis method using a cell-free translation system. It can be prepared by preparing a nucleic acid encoding a circular peptide and translating the nucleic acid in a cell-free translation system. Nucleic acids encoding macrocyclic peptides can be appropriately designed by those skilled in the art using the genetic code used in biological translation systems, the reprogrammed genetic code, or a combination thereof.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA.
  • non-natural amino acids can be efficiently introduced into peptides in addition to natural amino acids using tRNA aminoacylated with non-natural amino acids.
  • tRNA aminoacylated with non-natural amino acids for example, by using an artificial aminoacyl-tRNA synthetase flexizyme developed by the present inventors, it is possible to aminoacylate a tRNA having any anticodon with any natural or non-natural amino acid. Therefore, using this technique, the genetic code consisting of a triplet of mRNA can be reprogrammed so that it encodes an amino acid different from that of a biological translation system (WO 2008/059823).
  • the initiation codon AUG encodes formylmethionine and methionine in prokaryotic and eukaryotic cells, respectively.
  • the tRNA corresponding to the start codon can be aminoacylated with another amino acid, so that peptide synthesis can be started with any amino acid.
  • any amino acid can be introduced into any position of the peptide using a cell-free translation system.
  • hydroxy acids and carboxylic acids other than amino acids can be bound to tRNA, so that any hydroxy acid or carboxylic acid can be introduced at any position of a peptide using a cell-free translation system. Is possible.
  • a hydroxy acid or a carboxylic acid may be introduced instead of an amino acid.
  • nucleic acid encoding the cyclic peptide corresponds to a codon encoding two amino acids necessary for forming a ring (hereinafter also referred to as “ring-forming amino acid”) and an Arg-Trp-Thr structure. Enter a codon that encodes three amino acids.
  • the method for cyclizing the peptide is not particularly limited. For example, by including an amino acid having a functional group 1 and an amino acid having a corresponding functional group 2 shown in Table 1 below, translational synthesis is performed by a spontaneous reaction.
  • the peptide can be cyclized to form a cyclic peptide.
  • Either functional group 1 or 2 may be on the N-terminal side, may be arranged at the N-terminal or C-terminal, one may be a terminal amino acid, the other may be a non-terminal amino acid, or both may be non-terminal amino acids Also good.
  • X 1 is a leaving group, and examples of the leaving group include halogen atoms such as Cl, Br and I, and Ar is an aromatic ring which may have a substituent.
  • a chloroacetylated amino acid for example, a chloroacetylated amino acid can be used.
  • the chloroacetylated amino acids include N-chloroacetyl-L-alanine, N-chloroacetyl-L-phenylalanine, N-chloroacetyl-L-tyrosine, N-chloroacetyl-L-tryptophan, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl- L-phenylalanine, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl-L-tyrosine, N-3- (2-chloroacetamido) benzoyl-L-tryptophane, ⁇ -N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic acid, ⁇ -N-chloroacetyl -L-diaminobutyricacid, ⁇ -N-chloroacety
  • N-chloroacetyl-L-tryptophan is preferably used, and the D-form is more preferable.
  • the D-form is more preferable.
  • amino acid having a functional group (A-2) examples include cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, and 2-amino-8-mercaptooctanoic acid.
  • cysteine is preferably used as the amino acid having the functional group (A-1).
  • Cyclization methods using an amino acid having a functional group (A-1) and an amino acid having a functional group (A-2) include, for example, Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009) Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009); Sako, akoY. Et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008); Goto,) Y. Et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008); Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008), and International Publication No. 2008/117833.
  • amino acids having the functional group (B-1) examples include propargylglycine, homopropargylglycine, 2-amino-6-heptynoic acid, 2-amino-7-octynoic acid, and 2-amino-8-nonynoic acid. It is done. A 4-pentynoylated or 5-hexynoylated amino acid may be used.
  • 4-pentynoylated amino acids include N- (4-pentenoyl) -L-alanine, N- (4-pentenoyl) -L-phenylalanine, N- (4-pentenoyl) -L-tyrosine, N- (4 -pentenoyl) -L-tryptophan, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-phenylalanine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tyrosine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L -tryptophane, ⁇ -N- (4-pentenoyl) -L-diaminopropanoic acid, ⁇ -N- (4-pentenoyl) -L-diaminobutyric acid, ⁇ -N- (4-pentenoyl) -L-ornithine, ⁇
  • amino acids having the functional group (B-2) include azidoalanine, 2-amino-4-azidobutanoic acid, azidoptonorvaline, azidonorleucine, 2-amino-7-azidoheptanoic acid, and 2-amino-8-azidooctanoic acid. Can be mentioned. Azidoacetylated or 3-azidopentanoylated amino acids can also be used.
  • azidoacetylated amino acids examples include N-azidoacetyl-L-alanine, N-azidoacetyl-L-phenylalanine, N-azidoacetyl-L-tyrosine, N-azidoacetyl-L-tryptophan, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl -L-phenylalanine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tyrosine, N-3- (4-pentynoylamido) benzoyl-L-tryptophane, ⁇ -N-azidoacetyl-L-diaminopropanoic acid, ⁇ -N- Examples include azidoacetyl-L-diaminobutyric acid, ⁇ -N-azidoacetyl-L-ornithine, ⁇ -N-azidoace
  • 3-azidopentanoylated amino acid examples include amino acids in which the azidoacetyl group is substituted with the 3-azidopentanoyl group in the compounds exemplified as the azidoacetylated amino acid.
  • Cyclization methods using an amino acid having a functional group (B-1) and an amino acid having a functional group (B-2) include, for example, Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 2008), and International Publication No. 2008/117833, and the like.
  • amino acids having a functional group (C-1) include N- (4-aminomethyl-benzoyl) -phenylalanine (AMBF) and 3-aminomethyltyrosine.
  • amino acid having a functional group (C-2) include 5-hydroxytryptophan (WOH).
  • Cyclization methods using an amino acid having a functional group of (C-1) and an amino acid having a functional group of (C-2) include, for example, Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009) and international The method described in the publication 2008/117833, etc. are mentioned.
  • amino acids having the functional group (D-1) include 2-amino-6-chloro-hexynoic acid, 2-amino-7-chloro-heptynoic acid, and 2-amino-8-chloro-octynoic acid. Is mentioned.
  • amino acids having the functional group (D-2) include cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, and 2-amino-8-mercaptooctanoic acid.
  • Examples of the cyclization method using the amino acid having the functional group (D-1) and the amino acid having the functional group (D-2) include the method described in International Publication No. 2012/074129.
  • Examples of the amino acid (E-1) include N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine. N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine, N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophane, and corresponding D-amino acid derivatives.
  • Examples of the amino acid (E-2) include cysteine, homocysteine, mercaptonorvaline, mercaptonorleucine, 2-amino-7-mercaptoheptanoic acid, and 2-amino-8-mercaptooctanoic acid.
  • Examples of the cyclization method using the amino acid having the functional group (E-1) and the amino acid having the functional group (E-2) include the cyclization methods (A-1) and (A-2) and (D- It can be carried out with reference to the cyclization method of 1) and (D-2).
  • ring-forming amino acid a combination of an amino acid having a functional group (A-1) and an amino acid having a functional group (A-2) is preferable, and N-acetyltryptophan and cystein in which H is substituted with a leaving group
  • N-haloroacetyl-D-tryptophan preferably N-chloroacetyl-D-tryptophan and cystein is more preferable.
  • the cyclic peptide of the present invention can also be produced by a solid phase synthesis method.
  • the solid phase synthesis method is a well-known method in the art, and a known method can be applied.
  • the hydroxyl group of a resin having a hydroxyl group and the carboxy group of the first amino acid (usually the C-terminal amino acid of the target peptide) in which the ⁇ -amino group is protected with a protecting group are esterified To react.
  • dehydration condensing agents such as 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), and diisopropylcarbodiimide (DIPCDI) can be used.
  • MSNT 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIPCDI diisopropylcarbodiimide
  • the ⁇ -amino group of the second amino acid is deprotected, a third amino acid in which all functional groups other than the carboxy group of the main chain are protected is added, the carboxy group is activated, and the second and Bind a third amino acid. This is repeated, and when a peptide having a desired length is synthesized, all functional groups are deprotected.
  • an ⁇ -amino group of an amino acid has been exemplified and described, the same can be applied even when the amino group of the amino acid is other than the ⁇ -amino group.
  • solid phase synthesis resins examples include Merrifield® resin, MBHA® resin, Cl-Trtresin, SASRIN® resin, Wang® resin, Rink® amide resin, HMFS® resin, Amino-PEGA® resin (Merck), and HMPA-PEGA® resin (Merck). Is mentioned.
  • Examples of the amino-protecting group include benzyloxycarbonyl (Cbz or Z) group, tert-butoxycarbonyl (Boc) group, fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, benzyl group, allyl group, and allyloxycarbonyl ( Alloc) group and the like.
  • Examples of the protecting group for the carboxyl group include a methyl group, an ethyl group, a benzyl group, a tert-butyl group, and a cyclohexyl group.
  • examples of the protective group for the hydroxy group of serine and threonine include benzyl group and tert-butyl group.
  • Examples of the protective group for the hydroxy group of tyrosine include 2-bromo Examples include benzyloxycarbonyl group and tert-butyl group.
  • Protection and deprotection can be carried out according to the method described in 1) or a method analogous thereto.
  • the activation of the carboxyl group in the condensation reaction for forming an amide bond can be performed using a condensing agent.
  • the condensing agent include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIPCDI), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC or WSC), (1H-benzotriazol-1-yloxy) tris (Dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP), 1- [bis (dimethylamino) methyl] -1H-benzotriazolium-3-oxide hexafluorophosphate (HBTU), and the like.
  • the peptide chain can be cleaved from the solid phase resin by treatment with an acid such as TFA and hydrogen fluoride (HF).
  • the plexin binding regulator of the present invention can be used as a pharmaceutical composition.
  • the administration form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and may be oral or parenteral.
  • parenteral administration include injection administration such as intramuscular injection, intravenous injection, and subcutaneous injection, transdermal administration, and transmucosal administration.
  • administration routes for transmucosal administration include nasal, oral cavity, ocular, pulmonary, vaginal, and rectal.
  • Various modifications may be made to the cyclic peptide in the pharmaceutical composition from the viewpoint of pharmacokinetics such as metabolism and excretion.
  • PEG polyethylene glycol
  • a sugar chain can be added to a cyclic peptide to increase the residence time in blood and reduce antigenicity.
  • biodegradable polymer compounds such as polylactic acid / glycol (PLGA), porous hydroxyapatite, liposomes, surface modified liposomes, emulsions prepared with unsaturated fatty acids, nanoparticles, nanospheres, etc. are sustained release bases These may be used as a cyclic peptide.
  • PLGA polylactic acid / glycol
  • porous hydroxyapatite hydroxyapatite
  • liposomes liposomes
  • surface modified liposomes emulsions prepared with unsaturated fatty acids, nanoparticles, nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nanospheres, etc.
  • emulsions prepared with unsaturated fatty acids nanoparticles, nano
  • the pharmaceutical composition may use the cyclic peptide as an active ingredient as it is, or may be formulated with a pharmaceutically acceptable additive.
  • dosage form of the pharmaceutical preparation include, for example, liquids (for example, injections), dispersions, suspensions, tablets, pills, powders, suppositories, powders, fine granules, granules, capsules, syrups, Examples include troches, inhalants, ointments, eye drops, nasal drops, ear drops, and poultices.
  • Formulation includes, for example, excipients, binders, disintegrants, lubricants, solubilizers, solubilizers, colorants, flavoring agents, stabilizers, emulsifiers, absorption enhancers, surfactants, pH adjustments It can be carried out in a conventional manner using additives such as a preservative, preservative, wetting agent, dispersant, and antioxidant as appropriate.
  • the additive used for the formulation is not particularly limited, and examples thereof include pharmaceutically acceptable organic solvents such as purified water, saline, phosphate buffer, dextrose, glycerol, ethanol, and animal and vegetable oils.
  • surfactants such as polyoxyethylene lauryl ethers, sodium lauryl sulfate, and saponin; bile salts such as glycocholic acid, deoxycholic acid, and taurocholic acid; EDTA and salicylic acids Chelating agents; fatty acids such as caproic acid, capric acid, lauric acid, oleic acid, linoleic acid, and mixed micelles; enamine derivatives, N-acyl collagen peptides, N-acyl amino acids, cyclodextrins, chitosans, and one Nitrogen oxide donors and the like may be used.
  • the tablets or pills may be sugar-coated, gastric-soluble, and coated tablets coated with enteric substances.
  • the liquid preparation may contain distilled water for injection, physiological saline, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil, alcohols and the like. Wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers, solubilizers, solubilizers, preservatives, and the like may be added.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing a disease in a patient by administering a plexin binding regulator, preferably a semaphorin 4D and plexin B1 binding regulator, to a patient in need thereof.
  • a plexin binding regulator preferably a semaphorin 4D and plexin B1 binding regulator
  • the dose of the plexin binding regulator of the present invention is determined by those skilled in the art according to the symptoms, age, sex, body weight, sensitivity difference, administration of the patient in need thereof. It can be appropriately determined depending on the method, the administration interval, the type of the preparation and the like.
  • the patient is a mammal and is preferably a human.
  • a RaPID system on the N-terminal headpiece of human plexin B1 was performed to obtain a cyclic peptide that binds to plexin B1.
  • Cyclic peptides categorized into four families were obtained by selection with the RaPID system repeated 5 times or more.
  • the amino acid sequence of the cyclic peptide is shown in FIG.
  • the cyclic peptide shown in FIG. 1c was chemically synthesized and analyzed for binding affinity for plexin B1 by surface resonance plasmon (SPR). As shown in FIG. 2c, an nM order dissociation constant (KD) was shown.
  • the binding affinity for human and mouse plexin B1 was similarly analyzed for the cyclic peptides shown in Table 2 below. It was shown that the cyclic peptides shown in Table 2 have a dissociation constant (KD) on the order of nM even in mouse plexin B1.
  • KD dissociation constant
  • w means D W in the cyclic peptide shown in FIG. 2b.
  • Ser binds to C, which is Cys.
  • cyclic peptides other than the cyclic peptide P6 shown it is Gly that binds to C.
  • FIG. 2c The efficacy of the cyclic peptide shown in FIG. 2c on protein-protein interaction (PPI) of plexin B1 and semaphorin 4D was confirmed by in vitro pull-down assay (FIG. 3).
  • Plexin B1 or plexin A2 was immobilized on Sepharose beads.
  • Cyclic peptide, negative control peptide or dimethyl sulfoxide (DMSO) that binds to plexin B1 was added to plexin B1 immobilized beads.
  • Semaphorin 4D or semaphorin 6A alkaline phosphatase (AP) fusion protein was added. 4).
  • AP activity was measured by washing the beads and measuring the increase in absorbance of the sample at 405 nm.
  • the cyclic peptide mp6-9 showed inhibitory activity on the interaction between human plexin B1 and semaphorin 4D equivalent to the cyclic peptide P6.
  • the cyclic peptide mp6-2 exhibits an inhibitory activity on the interaction between mouse plexin B1 and semaphorin 4D equivalent to the cyclic peptide P6, and the cyclic peptides mp6-9 and mp6-3 have a stronger inhibitory activity than the cyclic peptide P6. showed that.
  • Cyclic peptide P6 was biotinylated according to a conventional method.
  • the structure of biotinylated cyclic peptide P6 is shown in FIG. 8a.
  • Synthesized biotinylated P6 is added to mock cells that do not express plexin B1 and HEK239 cells that exogenously express plexin B1, followed by addition of streptavidin-PE and FACS (fluorescence activated cell sorting). The amount of binding was measured. The result is shown in FIG.
  • cyclic peptide P6 For the cyclic peptide P6, a cyclic peptide having an intramolecular lactam bridge structure shown in FIG. 10 was chemically synthesized, and the binding affinity to plexin B1 was analyzed by surface resonance plasmon (SPR) (FIG. 11a). A stability test of the cyclic peptide P6 and the cyclic peptide having an intramolecular lactam bridge structure with serum protease was performed (FIG. 11c). P6 showed a half-life of 3-6 hours, but the cyclic peptide BC8 having an intramolecular lactam bridge structure did not degrade even after 29 hours.
  • SPR surface resonance plasmon
  • the cyclic peptide P6 was dimerized according to a conventional method.
  • the structure of the dimerized cyclic peptide P6 (P6dPEG5 and P6dPEG11) is shown in FIG.
  • the P7-PEG dimer (P7dPEG5 and P7dPEG11) obtained by dimerizing the cyclic peptide P7 in the same manner as the dimerized cyclic peptide P6 having the structure shown in FIG. 12 was subjected to plexin B1 in a Collapse assay using xCELLligence (ACEA Biosciences Inc.). It was observed that Sema4D-like collapse action was specifically induced on the expressed cells, that is, the effect of promoting the activation of plexin B1.

Abstract

本発明は、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を有するか、若しくはＬｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ構造を有する環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を含む、プレキシンの結合調節剤を提供する。

Description

プレキシンの結合調節剤
　本発明は、プレキシンの結合調節剤に関する。
　神経軸索誘導因子として知られるセマフォリンは、神経細胞の成長、免疫応答、骨代謝、がん細胞分化及び器官形成等において重要な役割を有する高機能タンパク質である。哺乳類においては、セマフォリンは、３Ａ～３Ｇ、４Ａ～４Ｇ、５Ａ、５Ｂ、６Ａ～６Ｄ及び７Ａが知られている。
　セマフォリンと、そのシグナル受容体であるプレキシンは、様々な疾患の薬剤ターゲットとして重要である（非特許文献１～４）。
　３００ｋＤａ以上の分子量を有する１回膜貫通型のタンパク質であるプレキシンは、哺乳類では、Ａ１～Ａ４、Ｂ１～Ｂ３、Ｃ１及びＤ１と９種に分類される。中でも、プレキシンＡ１とプレキシンＢ１は、ホモログであることが知られている。
　９種のプレキシンのうち、プレキシンＡ１は、セマフォリン３Ａと、プレキシンＢ１は、セマフォリン４Ｄと相互作用し、骨組織における代謝や神経細胞の成長等の生物学的プロセスの様々な場面で、制御的役割を担っている（非特許文献４及び５）。
　骨組織における代謝において、プレキシンは、骨形成に関与する骨芽細胞の表面に発現し、セマフォリンは、骨吸収に関与する破骨細胞の表面に発現している。
　非特許文献６には、マウスにおけるプレキシンの遺伝子破壊により、骨量が増大することが開示されている。したがって、プレキシンとセマフォリンの相互作用は、骨形成を阻害することになると考えられる。
　また、神経細胞の成長において、神経細胞表面におけるセマフォリンとプレキシンの相互作用は、成長円錐の崩壊を導く細胞骨格系の再構築へと導く反発シグナルとして理解されている。
　さらに、神経の炎症は、活性化Ｔ細胞でのプレキシンとセマフォリンの相互作用を必要とすることが示されており、それゆえに、プレキシンを欠くマウスでは、神経炎症から保護されることが示されている（非特許文献７）。セマフォリンと同様に、プレキシンは、神経炎症における様々な細胞に発現しており、Ｂ細胞の分化を増強させる（非特許文献８及び９）。
　細胞遊走や細胞分化などの細胞機能においてもプレキシンの関与が報告され、様々ながんにおいてプレキシンの発現が亢進していることが多くの文献で示されている（例えば、非特許文献１０）。また、プレキシンとセマフォリンの相互作用が、がんに関連して、血管新生や細胞遊走や細胞浸潤に関連していることが示されている（非特許文献１１～１６）。
　プレキシンとセマフォリンの相互作用の様々な役割から、プレキシンは、骨粗鬆症の骨量の回復、多発性硬化症などの治療、がん転移抑制剤としての治療ターゲットとなり得る。
Nat Rev Cancer, 2008, 8(8), 632-645 Nat Immunol, 2008, 9(1), 17-23 J Cell Sci, 122(Pt 11), 1723-1736 Nat Rev Drug Discov, 2014, 13(8), 603-621 Nature, 2010, 467(7319), 1118-1122 Nat Med, 2011, 17(11), 1473-1480 J Immunol, 2010, 184(3), 1499-1506 Blood, 2003, 101(5), 1962-1969 Int Immunol, 2005, 17(4), 439-447 Mol Cancer, 2010, 9, 251 Blood, 2005, 105(11), 4321-4329 Cancer Res, 2004, 64(15), 5212-5224 Oncogene, 2009, 28(30), 2697-2709 J BiolChem, 2008, 283(4), 1893-1901 Clin Cancer Res, 2007, 13(4), 1115-1122 Proc Natl AcadSci U S A, 2007, 104(48), 19040-19045
　以上のとおり、セマフォリンとプレキシンの相互作用は、例えば、がん細胞分化、骨代謝及び神経変性や神経炎症を調節する因子であるので、プレキシンの結合調節剤は、例えば、がん治療、骨代謝に関連する疾患治療及び神経変性疾患又は神経炎症性疾患治療に用いることができると考えられる。
　その一方、セマフォリンとプレキシンの相互作用における接面が、広くフラットな結合表面であるため、従来の伝統的な低分子薬の標的とすることは難しかった。
　そこで、本発明が解決しようとする課題は、環状ペプチドによるプレキシンの新規結合調節剤を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の構造を有する環状ペプチドが、プレキシンの結合を調節することを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、以下のとおりである。
（１）
　Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を有するか、若しくはＬｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ構造を有する環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を含む、プレキシンの結合調節剤。
（２）
　環状ペプチドが、Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を有する（Ｘａａ１は、任意のアミノ酸である）、（１）に記載の結合調節剤。
（３）
　環状ペプチドが、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ構造を有する（Ｘａａ２及びＸａａ３は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である）、（１）又は（２）に記載の結合調節剤。
（４）
　環状ペプチドが、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ構造を有する、（１）に記載の結合調節剤。
（５）
　環状ペプチドが、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造を有する、（１）～（４）のいずれかに記載の結合調節剤。
（６）
　前記Ｎが、トリプトファンのアミノ基に由来する、（５）に記載の結合調節剤。
（７）
　前記Ｓが、システインのチオール基に由来する、（５）又は（６）に記載の結合調節剤。
（８）
　環状ペプチドが、１０～２０のアミノ酸で構成される環構造を有する、（１）～（７）のいずれかに記載の結合調節剤。
（９）
　環状ペプチドが、分子内ラクタムブリッジ構造を有する、（１）～（８）のいずれかに記載の結合調節剤。
（１０）
　環状ペプチドの二量体である、（１）～（９）のいずれかに記載の結合調節剤。
（１１）
　プレキシンがプレキシンＡ１又はプレキシンＢ１である、（１）～（１０）のいずれかに記載の結合調節剤。
（１２）
　セマフォリンとプレキシンとの結合調節剤であり、セマフォリンがセマフォリン３Ａ又はセマフォリン４Ｄである、（１）～（１１）のいずれかに記載の結合調節剤。
（１３）
　セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合調節剤である、（１）～（１２）のいずれかに記載の結合調節剤。
（１４）
　（１）～（１３）のいずれかに記載の結合調節剤を含む、医薬組成物。
（１５）
　がん治療に用いられる、（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）
　骨代謝に関連する疾患治療に用いられる、（１４）に記載の医薬組成物。
（１７）
　神経変性疾患又は神経炎症性疾患治療に用いられる、（１４）に記載の医薬組成物。
　本発明によれば、環状ペプチドによるプレキシンの新規結合調節剤を提供することができる。
図１ａは、プレキシンＢ１に対するＲａＰＩＤシステムによる５回の選択結果の一例を示す。図１ｂは、環状ペプチドの一般式を示し、図１ｃは、得られた環状ペプチドのアミノ酸配列を示す。 図２ａは、化学合成した環状ペプチドのプレキシンＢ１に対する結合の表面共鳴プラズモン（ＳＰＲ）分析結果を示す。図１ｂは、環状ペプチドの一般式を示し、図１ｃは、環状ペプチドのアミノ酸配列とそれぞれのプレキシンＢ１に対する結合親和性を示す。 図３は、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１結合アッセイの模式図を示す。 図４ａは、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１結合アッセイの結果を示し、図４ｂは、セマフォリン６ＡとプレキシンＡ２結合アッセイの結果を示す。図４ｃは、環状ペプチドの一般式を示し、図４ｄは、環状ペプチドのアミノ酸配列を示す。 図５ａは、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１結合アッセイの結果を示し、図５ｂは、セマフォリン６ＡとプレキシンＡ２結合アッセイの結果を示す。図５ｃは、環状ペプチドの一般式を示し、図５ｄは、環状ペプチドのアミノ酸配列を示す。 図６ａは、環状ペプチドＰ６の構造を示し、図６ｂは、Ｐ６の様々な濃度でのセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１結合阻害アッセイの結果を示す。 図７は、プレキシンＢ１を外因性に発現するＨＥＫ２３９細胞の成長円錐と呼ばれる細胞突起の崩壊試験の結果を示す。図６ｃは、Ｐ６の添加により図６ｂで観察されたセマフォリン４Ｄに依存した成長円錐崩壊を阻害することを示す。 図８ａは、ビオチンを結合させた環状ペプチドＰ６を示す。図８ｂは、ビオチン結合の環状ペプチドＰ６におけるプレキシンＢ１発現ＨＥＫ２３９細胞での蛍光標識の結果を示す。 図９は、環状ペプチドＰ６のアラニン変異によるプレキシンＢ１結合能への影響を、ＳＰＲで求めたＫＤ値の増大で示す。 図１０は、分子内ラクタムブリッジ構造を有する環状ペプチドを示す。Ａｓｐは、アスパラギン酸、Ｇｌｕは、グルタミン酸、ＤＡＰは、２，３－ジアミノプロピオン酸、ＤＡＢは、２，４－ジアミノ酪酸、Ｏｒｎはオルニチン、Ｌｙｓはリジンを示す。 図１１ａは、分子内ラクタムブリッジ構造を有する環状ペプチドのＳＰＲ分析結果を示す。図１１ｂは、環状ペプチドＢＣ８の構造を示す。図１１ｃは、血清中のプロテアーゼによる分解の半減期を示す。 図１２は、環状ペプチドＰ６の二量体を示し、図１２ａは、Ｐ６ｄＰＥＧ１１を、図１２ｂは、Ｐ６ｄＰＥＧ５を示す。 図１３は、環状ペプチドＰ６及びＰ６の二量体の活性の比較を示す。図１３ａはセマフォリン４Ｄに依存した細胞脱着の阻害試験の結果を示す。図１３ｂはＳＰＲ法によるプレキシンＢ１への結合親和性の比較を示す。
　本発明を、発明を実施するための形態により具体的に説明するが、本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、種々変形して実施することができる。
　本発明において参照される文献に開示されている内容は、本発明に参照として取り込まれる。
　本発明におけるプレキシンの結合調節剤は、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を有するか、若しくはＬｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ構造を有する環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を含む。
　本発明においては、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を有するか、若しくはＬｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ構造を有する環状ペプチドが、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を介してプレキシンに結合してアロステリックにセマフォリンとプレキシンのシグナル伝達を調節すると考えられる。中でも、本発明における結合調節剤は、好適には、プレキシンＢ１及びそのホモログであるプレキシンＡ１の結合調節剤として機能する。
　本明細書において、「環状ペプチド」とは、４以上のアミノ酸により形成される環状構造を分子内に少なくとも有することを意味する。
　環状ペプチドの分子構造として、環状構造以外に、アミノ酸がペプチド結合により連結した鎖状構造を有していてもよく、また、ペプチド構造以外の構造を有していてもよい。
　本明細書において、「環状構造」とは、直鎖状ペプチドにおいて、２アミノ酸残基以上離れた２つのアミノ酸が直接に、又はリンカー等を介して結合することによって分子内に形成される閉環構造を意味する。
　本明細書において、「２アミノ酸残基以上離れた」とは、２つのアミノ酸の間に少なくとも２残基のアミノ酸が存在することを意味する。
　環状構造における閉環構造は、特に限定されないが、２つのアミノ酸が、共有結合することにより形成される。
　２つのアミノ酸間の共有結合としては、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ－Ｓ－Ｃ結合、Ｃ－Ｎ－Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ－Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、及びチオアミド結合等が挙げられる。
　２つのアミノ酸がアミノ酸の主鎖において結合すると、ペプチド結合により閉環構造が形成されるが、２つのアミノ酸の側鎖同士、側鎖と主鎖の結合等により、２つのアミノ酸間の共有結合は形成されてもよい。
　環状構造は、直鎖状ペプチドのＮ末端とＣ末端のアミノ酸の結合に限られず、末端のアミノ酸と末端以外のアミノ酸の結合、又は末端以外のアミノ酸同士の結合により形成されてもよい。環状構造を形成のために結合するアミノ酸の一方が末端アミノ酸で、他方が非末端アミノ酸である場合、環状ペプチドは、環状構造に直鎖のペプチドが尾のように付いた構造を有する。
　環状構造を形成するアミノ酸としては、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含み、例えば、天然タンパク質性Ｌ－アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられる。
　タンパク質性アミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ）は、当業界に周知の３文字表記により表すと、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌである。
　非タンパク質性アミノ酸（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ）としては、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を意味する。
　非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α，α－二置換アミノ酸（α－メチルアラニンなど）、Ｎ－アルキル－α－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、α－ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）等が挙げられる。非天然アミノ酸の具体例としては、国際公開第２０１５／０３００１４号に記載のアミノ酸が挙げられる。
　環状構造を形成するアミノ酸の数は４以上であれば特に限定されないが、例えば、５以上、８以上、１０以上であってもよく、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下であってもよい。
　環状構造を形成するアミノ酸の数としては、４以上３０以下であることが好ましく、４以上３０以下の範囲内で、環状構造を形成するアミノ酸の数を５以上、８以上、１０以上としてもよく、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下としてもよい。
　環状構造を形成するアミノ酸の数は、８以上２０以下としてもよく、１０以上２０以下としてもよく、１０以上１５以下としてもよい。
　本発明において、環状ペプチドは、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ＡＤＰリボシル化、及び糖鎖付加等の修飾が加えられたものであってもよく、他のペプチドやタンパク質と融合させたものであってもよい。また、環状ペプチドは、適当なリンカーを介して、ビオチン化されていてもよい。
　また、本発明において、環状ペプチドは、２つの、１つの環状構造を有する環状ペプチドがリンカー構造を介して結合した分子内に２つの環状構造を有する二量体であってもよく、分子内でラクタム構造を形成した分子内ラクタムブリッジ構造を有していてもよい。
　２つの環状ペプチドを繋ぐリンカー構造としては、特に限定されず、ペプチド合成分野においてペプチド同士を繋ぐリンカーとして周知の構造のものを採用することができる。
　分子内ラクタムブリッジ構造は、環状ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖同士が結合することによって形成されてよく、例えば、Ｌｙｓの側鎖のアミノ基と、Ａｓｐ又はＧｌｕの側鎖のカルボキシル基が結合して、ペプチド結合を形成することにより、分子内ラクタム構造が形成され、環状ペプチドは、分子内にブリッジ構造として、もう１つの環構造を有する。Ｌｙｓに代えて、例えば、ＤＡＰ、ＤＡＢ、及びＯｒｎがＡｓｐ又はＧｌｕと結合していてもよい。
　本発明において、プレキシンの結合調節剤は、セマフォリンとプレキシンの結合を調節し、その後の下流に存在するカスケードにおける変化がもたらされるものであれば特に限定されないが、プレキシンとして、プレキシンＡ１及び／又はプレキシンＢ１に対する結合調節剤であることが好ましく、セマフォリン３ＡとプレキシンＡ１あるいはセマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合調節剤であることが好ましい。本発明のプレキシンの結合調節剤は、セマフォリンによるプレキシンの、具体的には、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合阻害剤であってもよく、プレキシンの、具体的には、プレキシンＢ１の活性化剤であってもよい。
　本発明のプレキシンの結合調節剤は、セマフォリンによるプレキシンの、具体的には、セマフォリン４ＤによるプレキシンＢ１の活性化を阻害するものであってもよく、または促進するものであってもよい。
　セマフォリン４Ｄが、骨芽細胞上のプレキシンＢ１に結合すると、骨芽細胞分化を阻害するスモールＧタンパク質ＲｈｏＡを活性化して、骨芽細胞の分化を促進するシグナル（ＩＲＳシグナル）を低下させ、骨芽細胞の分化を抑制することによって、骨形成を阻害することが知られている（国際公開第２０１２／１５７２３７号）。
　本発明のプレキシンの結合調節剤は、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合を阻害することにより、骨形成を促進することが期待され、骨代謝に関連する疾患の治療又は予防に用いることができる。
　骨代謝に関連する疾患としては、例えば、骨折、骨欠損、骨粗しょう症、骨軟化症、骨減少症、腰背痛、骨ページェット病、硬直性脊椎炎、関節リウマチ及び変形性関節症等が挙げられる。
　本発明のプレキシンの結合調節剤は、セマフォリンとプレキシンの結合を調節することにより、中でも、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合を調節することにより、がん治療又は予防に用いることができる。
　がん疾患としては、特に限定されるものではなく、各種腫瘍が挙げられ、例えば、肺がん、乳がん、中皮がん、癌腫、神経膠腫、及び異常血管新生等が挙げられる。また、本発明のプレキシンの結合調節剤は、がん転移抑制剤として、がん治療又は予防に用いることができる。
　本発明のプレキシンの結合調節剤は、セマフォリンとプレキシンの結合を調節することにより、中でも、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合を調節することにより、アルツハイマー病、パーキンソン病、中枢神経系病変、及び病変に伴う脱髄等の神経変性疾患の治療又は予防に用いることができる。
　また、本発明のプレキシンの結合調節剤は、セマフォリンとプレキシンの結合を調節することにより、中でも、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合を調節することにより、例えば、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、髄膜炎、脳浮腫、脳外傷、及び脳卒中等の神経炎症性疾患の治療又は予防に用いてもよい。
　本発明のプレキシンの結合調節剤は、セマフォリンとプレキシンの結合においてアゴスト活性を示すことにより、アトピー性皮膚炎治療、がん転移抑制、自己免疫疾患における過免疫反応抑制等の治療又は予防に用いてもよい。
　本発明のプレキシンの結合調節剤は、疾患の治療又は予防剤としてだけではなく、セマフォリンとプレキシンの相互作用における様々な役割を研究するためのリサーチツールとしても用いることができ、例えば、研究試薬であってよい。
　また、本発明のプレキシンの結合調節剤を、患者サンプルにおけるプレキシンの発現量を測定するための診断ツールとして用いてもよい。
　本発明において、環状ペプチドは、医薬的に許容可能な塩として用いてもよい。環状ペプチドの医薬的に許容可能な塩としては、例えば、医薬として許容される塩基や酸との塩が挙げられる。
　医薬的に許容可能な塩の具体例としては、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
　本発明のプレキシンの結合調節剤としての環状ペプチドは、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を介してアロステリックに、中でも、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１のシグナル伝達を調節すると考えられるので、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を含む環状ペプチドであれば、特に限定されるものではなく、以下の一般式で表すことのできるアミノ酸配列を有する。
　（Ｘａａ４）ｍ－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－（Ｘａａ５）ｎ
　上記一般式において、Ｘａａ４とＸａａ５は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｍ及びｎは、少なくとも一方が１以上の整数である。
　Ｘａａ４とＸａａ５が環状構造を形成することにより、環状ペプチドとなるが、環状構造は、Ｎ末端のＸａａ４が、Ｘａａ５のＣ末端と結合して形成されていてもよく、Ｎ末端のＸａａ４が、非Ｃ末端のＸａａ５と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＸａａ４が、Ｃ末端のＸａａ５と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＸａａ４が、非Ｃ末端のＸａａ５と結合して形成されていてもよい。
　また、Ｘａａ４及びＸａａ５が、リンカーを介して環状構造となっていてもよい。
　ｍが０である場合、Ａｒｇが、Ｘａａ５と結合し、ｎが０である場合、Ｘａａ４がＴｈｒと結合する。
　本明細書において、Ｘａａとして表されるアミノ酸が０である場合とは、Ｘａａで表されるアミノ酸が存在しないことを意味する。また、本明細書において、Ｘａａで表されるアミノ酸が２以上である場合、各Ｘａａが独立して、任意のアミノ酸から選択される。環状ペプチドが、例えば、（Ｘａａ）２で表される構造を有する場合、２つのＸａａは、同一のアミノ酸でも異なるアミノ酸であってもよい。
　ｍ及びｎは、ｍ＋ｎが１以上であれば特に限定されないが、ｍ＋ｎが１以上２７以下となるように、ｍとｎは、それぞれ独立して選択される整数であることが好ましく、ｍ＋ｎが１以上２７以下の範囲内で環状構造を形成するアミノ酸の数の範囲内で適宜選択される。
　環状ペプチドは、Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を有していてもよく（Ｘａａ１は、任意のアミノ酸である）、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ構造を有していてもよい（Ｘａａ２及びＸａａ３は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である）。
　さらに、環状ペプチドは、Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ構造を有していてもよい（Ｘａａ１、Ｘａａ２及びＸａａ３は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である）。
　Ｘａａ２は、Ｇｌｙであることが好ましい。
　本明細書において、環状ペプチドの構造におけるＶａｌ／Ｉｌｅとの記載は、Ｖａｌ又はＩｌｅであることを意味する。本明細書において、環状ペプチドの構造におけるＩｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕとの記載は、Ｉｌｅ、Ｖａｌ又はＬｅｕであることを意味し、Ｉｌｅが好ましい。
　本発明のプレキシンの結合調節剤としての環状ペプチドは、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ構造を介してアロステリックに、中でも、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１のシグナル伝達を調節すると考えられるので、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ構造を含む環状ペプチドであれば、特に限定されるものではなく、以下の一般式で表すことのできるアミノ酸配列を有する。
　（Ｘａａ４）m－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－（Ｘａａ５）n
　上記一般式において、Ｘａａ４とＸａａ５は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｍ及びｎは、少なくとも一方が１以上の整数である。
　Ｘａａ４とＸａａ５が環状構造を形成することにより、環状ペプチドとなるが、環状構造は、Ｎ末端のＸａａ４が、Ｘａａ５のＣ末端と結合して形成されていてもよく、Ｎ末端のＸａａ４が、非Ｃ末端のＸａａ５と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＸａａ４が、Ｃ末端のＸａａ５と結合して形成されていてもよく、非Ｎ末端のＸａａ４が、非Ｃ末端のＸａａ５と結合して形成されていてもよい。
　また、Ｘａａ４及びＸａａ５が、リンカーを介して環状構造となっていてもよい。
　ｍが０である場合、Ｌｅｕが、Ｘａａ５と結合し、ｎが０である場合、Ｘａａ４がＴｒｐと結合する。
　ｍ及びｎは、ｍ＋ｎが１以上であれば特に限定されないが、ｍ＋ｎが１以上２７以下となるように、ｍとｎは、それぞれ独立して選択される整数であることが好ましく、ｍ＋ｎが１以上２７以下の範囲内で環状構造を形成するアミノ酸の数の範囲内で適宜選択される。
　環状ペプチドは、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ構造を有していてもよい。
　環状ペプチドは、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造により環構造を形成していてもよく、当該構造は、Ｎ末端のＸａａ４のアミノ基にクロロアセチル基等の、脱離基でＨが置換されたアセチル基と、Ｃ末端側のＸａａ５のシステインのチオール基との結合により形成されることが好ましく、その場合、一般式は、
ＸＣＨ２ＣＯ－（Ｘａａ６）－（Ｘａａ７）ｐ－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－（Ｘａａ８）ｑ－Ｃｙｓ－（Ｘａａ９）ｒで表されるか、ＸＣＨ２ＣＯ－（Ｘａａ６）－（Ｘａａ７）ｐ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－（Ｘａａ８）ｑ－Ｃｙｓ－（Ｘａａ９）ｒで表されることが好ましい。
　Ｘａａ６～Ｘａａ９は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｐ＋ｑが、好ましくは０以上２５以下の範囲内で環状構造を形成するアミノ酸の数の範囲内で適宜選択される。
　Ｘａａ６は、Ｔｒｐであることが好ましく、Ｃ末端のＸａａ９は、Ｇｌｙ又はＳｅｒであることが好ましく、ｒは０以上の整数であれば特に限定されないが、２０以下であってもよく、１０以下であってもよく、０または１であることが好ましい。
　本明細書において、ｒが０である場合には、環状ペプチドは、Ｘａａ９を有さず、ｒが２以上の整数である場合、環状ペプチドにおける（Ｘａａ９）ｒは、アミノ酸がペプチド結合により連結した鎖状構造に相当する。
　Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ構造を有する環状ペプチドとして、一般式は、
ＸＣＨ２ＣＯ－（Ｘａａ６）－（Ｘａａ１０）ｓ－Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ－（Ｘａａ１１）ｔ－Ｃｙｓ－（Ｘａａ９）ｒで表されることが好ましく、
ＸＣＨ２ＣＯ－Ｔｒｐ－（Ｘａａ１０）ｓ－Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ－（Ｘａａ１１）ｔ－Ｃｙｓ－（Ｘａａ９）ｒで表されることがより好ましい。なお、ここで、Ｎ末端のＸａａ６又はＴｒｐのアミノ基に結合する－ＣＯ－ＣＨ２－Ｘ基と、Ｃｙｓのチオール基が結合して、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造により環構造を形成する。
　Ｘａａ１～Ｘａａ３、Ｘａａ６、Ｘａａ９～Ｘａａ１１は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｓ＋ｔが、好ましくは０以上２０以下の範囲内で環状構造を形成するアミノ酸の数の範囲内で適宜選択される。
　Ｘａａ６は、Ｔｒｐであることが好ましく、Ｃ末端のＸａａ９は、Ｇｙｓ又はＳｅｒであることが好ましく、ｒは０以上の整数であれば特に限定されないが、２０以下であってもよく、１０以下であってもよく、０又は１であることが好ましい。
　Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ構造を有する環状ペプチドとして、一般式は、
ＸＣＨ２ＣＯ－（Ｘａａ６）－（Ｘａａ１０）ｓ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－（Ｘａａ１２）ｕ－Ｃｙｓ－（Ｘａａ９）ｒで表されることが好ましく、ＸＣＨ２ＣＯ－Ｔｒｐ－（Ｘａａ１０）ｓ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－（Ｘａａ１２）ｕ－Ｃｙｓ－（Ｘａａ９）ｒで表されることがより好ましい。なお、ここで、Ｎ末端のＸａａ６又はＴｒｐのアミノ基に結合する－ＣＯ－ＣＨ２－Ｘ基と、Ｃｙｓのチオール基が結合して、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｓ構造により環構造を形成する。
　Ｘａａ６、Ｘａａ９、Ｘａａ１０及びＸａａ１２は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸であり、ｓ＋ｕが、好ましくは０以上２１以下の範囲内で環状構造を形成するアミノ酸の数の範囲内で適宜選択される。
　Ｘａａ６は、Ｔｒｐであることが好ましく、Ｃ末端のＸａａ９は、Ｇｌｙア又はＳｅｒであることが好ましく、ｒは０以上の整数であれば特に限定されないが、２０以下であってもよく、１０以下であってもよく、０又は１であることが好ましい。
　本発明の環状ペプチドの具体例として、以下のものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　上記構造において、ＤＴｒｐは、ＴｒｐのＤ体であることを意味し、Ｓは、Ｃｙｓのチオール基を意味する。Ｘａａ９とｒは、前記と同義である。
　式中のＶａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）は、
ＲＰＲＶＡＲＷＴＧＱＩＩＹ
ＲＶＲＶＥＲＷＴＧＫＬＩ
ＲＰＲＶＡＲＷＴＧＱＩＩＨ
ＲＰＲＶＡＲＷＴＧＱＶＩＹ
ＲＰＲＶＡＲＷＴＧＱＮＩＹ
ＲＰＲＶＡＲＷＴＧＱＩＳＮ
ＲＰＲＶＡＲＷＴＧＱＩＩＮ
ＲＰＲＡＡＲＷＴＧＱＩＩＹ
ＲＰＹＩＥＲＷＴＧＲＬＩＶ
ＲＷＦＹＤＲＷＴＧＴＦＹＶ
ＲＡＦＩＥＲＷＴＧＲＬＶＶ
ＬＧＹＩＡＲＷＴＧＴＶＶＫ
ＬＡＹＩＥＲＷＴＧＱＩＶＲ
ＮＳＮＶＬＳＷＱＴＹＳＷＹ
ＮＧＲＬＳＷＱＴＹＳＨＬ
ＡＶＳＮＰＰＲＰＨＹＩＴＩＥ
ＬＳＷＱＡＹＳＷＧＱ
が挙げられる。
　これらのアミノ酸配列から、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造か、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ構造を含む限り、好ましくは、Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を含む限り、より好ましくは、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ構造を含む限り、さらに好ましくは、Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ構造を含む限り、また、好ましくは、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ構造を含む限り、１又は数個、好ましくは１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１又は２個のアミノ酸が付加、置換、又は欠失したアミノ酸配列を含み、セマフォリンとプレキシンの、好ましくは、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合調節効果を有する環状ペプチドであってもよい。
　また、これらのアミノ酸配列と、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造か、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ構造を含む限り、好ましくは、Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を含む限り、より好ましくは、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ構造を含む限り、さらに好ましくは、Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ構造を含む限り、また、好ましくは、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ構造を含む限り、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、セマフォリンとプレキシンの、好ましくは、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合調節効果を有する環状ペプチドであってもよい。
　本発明の環状ペプチドの製造方法は特に限定されず、公知のペプチド合成技術を用いて本発明の環状ペプチドを製造することができる。
　環状ペプチドの製造方法としては、例えば、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法、遺伝子組み換え法、無細胞翻訳系による翻訳合成法等が挙げられる。
　本発明の環状ペプチドは、無細胞翻訳系による翻訳合成法により好適に製造できる。
　環状ぺプチドをコードする核酸を調製し、当該核酸を無細胞翻訳系で翻訳することによって調製することができる。大環状ペプチドをコードする核酸は、生体の翻訳系で用いられる遺伝暗号、リプログラミングした遺伝暗号、又はこれらの組み合わせを用いて、当業者が適宜設計することができる。核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
　無細胞翻訳系を用いる方法によれば、非天然アミノ酸でアミノアシル化したｔＲＮＡを使用して、天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸をペプチドに効率よく導入することができる。例えば、本発明者らが開発した人工アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素フレキシザイムを用いれば、任意の天然又は非天然のアミノ酸で、任意のアンチコドンを有するｔＲＮＡをアミノアシル化することが可能である。したがって、この技術を用いて、ｍＲＮＡのトリプレットからなる遺伝暗号が、生体の翻訳系とは異なるアミノ酸をコードするように、リプログラミングすることができる（国際公開第２００８／０５９８２３号）。
　例えば、開始コドンＡＵＧは、原核細胞と真核細胞では、それぞれホルミルメチオニンとメチオニンをコードする。一方、フレキシザイムによれば、開始コドンに対応するｔＲＮＡを別のアミノ酸でアミノアシル化することができるので、任意のアミノ酸でペプチド合成を開始することができる。また、開始コドン以外のコドンに対応するｔＲＮＡも、任意のアミノ酸でアミノアシル化できるので、無細胞翻訳系を用いて、任意のアミノ酸をペプチドの任意の位置に導入することができる。
　フレキシザイムによれば、アミノ酸以外のヒドロキシ酸やカルボン酸をｔＲＮＡに結合させることもできるので、無細胞翻訳系を用いて、任意のヒドロキシ酸やカルボン酸をペプチドの任意の位置に導入することも可能である。本発明の環状ペプチドには、アミノ酸に代えて、ヒドロキシ酸やカルボン酸を導入してもよい。
　フレキシザイムとしては、例えば、以下の文献に記載されたものが知られている。
　H. Murakami, H.Saito, and H. Suga, (2003) Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662;
　H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003) Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084;
　H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga, (2006) Nature methods 3, 357-359;
　N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga, (2009) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894; 及び
　国際公開第２００７／０６６６２７号
　フレキシザイムは、原型のフレキシザイム（Ｆｘ）、及び改変型のジニトロベンジルフレキシザイム（ｄＦｘ）、エンハンスドフレキシザイム（ｅＦｘ）、アミノフレキザイム（ａＦｘ）等も知られている。
　なお、任意のｔＲＮＡを任意のアミノ酸でアミノアシル化する方法は、フレキシザイムを用いる方法に限定されず、その他の方法も本発明に適用可能である。
　無細胞翻訳系による技術を利用すれば、本発明の環状ペプチドに、環を形成するために必要なアミノ酸や、環構造及びその他の構造を構成するアミノ酸を、所望の位置に導入することができる。
　この場合、環状ペプチドをコードする核酸に、環を形成するために必要な２つのアミノ酸（以下「環形成アミノ酸」ということもある。）をコードするコドンと、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造に対応する３つのアミノ酸をコードするコドンを入れる。
　５´末端から、環形成アミノ酸をコードするコドン、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造に対応する３つのアミノ酸をコードするコドン、環形成アミノ酸をコードするコドンの順となるように、そして、間に適当な数のアミノ酸が入るように核酸配列を決定すればよい。
　また、ペプチドを環状化させる方法は特に限定されないが、例えば、下記表１に示す官能基１を有するアミノ酸と、対応する官能基２を有するアミノ酸を含めることにより、自発的な反応によって翻訳合成されたペプチドを環状化して、環状ペプチドとすることができる。
　官能基１と２はどちらがＮ末端側にきてもよく、Ｎ末端とＣ末端に配置してもよいし、一方を末端アミノ酸、他方を非末端アミノ酸としてもよいし、両方を非末端アミノ酸としてもよい。
表１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　式中、Ｘ1は脱離基であり、脱離基としては、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ等のハロゲン原子が挙げられ、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香環である。
　（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、クロロアセチル化したアミノ酸を用いることができる。クロロアセチル化アミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-alanine、N-chloroacetyl-L-phenylalanine、N-chloroacetyl-L-tyrosine、N-chloroacetyl-L-tryptophan、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tryptophane、β-N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-chloroacetyl-L-diaminobutyricacid、σ-N-chloroacetyl-L-ornithine、ε-N-chloroacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体等が挙げられる。
　（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-tryptophanが好適に用いられ、Ｄ体であることがより好適である。
　なお、本明細書において、Ｌ体であることを明示して記載する場合があるが、Ｌ体であってもよく、Ｄ体であってもよいことを意味し、また、Ｌ体とＤ体の任意の割合での混合物であってもよい。Ｌ体及びＤ体であることを明示して記載していない場合についても、Ｌ体であってもよく、Ｄ体であってもよいことを意味し、また、Ｌ体とＤ体の任意の割合での混合物であってもよい。
　（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、 mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8- mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
　（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、cysteineが好適に用いられる。
　（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009)；Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)；Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)；Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008)；Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)、及び国際公開第２００８／１１７８３３号等に記載された方法が挙げられる。
　（Ｂ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、propargylglycine、homopropargylglycine、2-amino-6-heptynoic acid、2-amino-7-octynoic acid、及び2-amino-8-nonynoic acid等が挙げられる。
　4-pentynoyl化や5-hexynoyl化したアミノ酸を用いてもよい。
　4-pentynoyl化アミノ酸としては、例えば、N-(4-pentenoyl)-L-alanine、N-(4-pentenoyl)-L-phenylalanine、N-(4-pentenoyl)-L-tyrosine、N-(4-pentenoyl)-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophane、β-N-(4-pentenoyl)-L-diaminopropanoic acid、γ-N-(4-pentenoyl)-L-diaminobutyric acid、σ-N-(4-pentenoyl)-L-ornithine、ε-N-(4-pentenoyl)-L-lysine、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体等が挙げられる。
　5-hexynoyl化アミノ酸としては、4-pentynoyl化アミノ酸として例示した化合物において、4-pentynoyl基が、5-hexynoyl基に置換されたアミノ酸が挙げられる。
　（Ｂ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、azidoalanine、2-amino-4-azidobutanoic acid、azidoptonorvaline、 azidonorleucine、2-amino-7-azidoheptanoic acid、及び2-amino-8- azidooctanoicacid等が挙げられる。
　azidoacetyl化や3-azidopentanoyl化したアミノ酸を用いることもできる。
　azidoacetyl化アミノ酸としては、例えば、N-azidoacetyl-L-alanine、N-azidoacetyl-L-phenylalanine、N-azidoacetyl-L-tyrosine、N-azidoacetyl-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophane、β-N-azidoacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-azidoacetyl-L-diaminobutyric acid、σ-N-azidoacetyl-L-ornithine、ε-N-azidoacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体等が挙げられる。
　3-azidopentanoyl化アミノ酸としては、azidoacetyl化アミノ酸として例示した化合物において、azidoacetyl基が、3-azidopentanoyl基に置換されたアミノ酸が挙げられる。
　（Ｂ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｂ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)、及び国際公開第２００８／１１７８３３号等に記載された方法が挙げられる。
　（Ｃ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、N-(4-aminomethyl-benzoyl)-phenylalanine (AMBF)及び3-aminomethyltyrosine等が挙げられる。
　（Ｃ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、5-hydroxytryptophan(WOH)等が挙げられる。
　（Ｃ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｃ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)及び国際公開第２００８／１１７８３３号に記載された方法等が挙げられる。
　（Ｄ－１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、2-amino-6-chloro-hexynoic acid、2-amino-7-chloro-heptynoic acid、及び2-amino-8-chloro-octynoic acid等が挙げられる。
　（Ｄ－２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、 mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8- mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
　（Ｄ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｄ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、国際公開第２０１２／０７４１２９号に記載された方法等が挙げられる。
　（Ｅ－１）のアミノ酸としては、例えば、N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine
、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophane、及
びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体等が挙げられる。
　（Ｅ－２）のアミノ酸としては、例えば、cysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、 mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8- mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
　（Ｅ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｅ－２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、（Ａ－１）と（Ａ－２）の環状化方法や（Ｄ－１）と（Ｄ－２）の環状化方法を参考にして行うことができる。
　環形成アミノ酸としては、（Ａ－１）の官能基を有するアミノ酸と（Ａ－２）の官能基を有するアミノ酸との組み合わせが好ましく、脱離基でＨが置換されたＮ－アセチルトリプトファンとcysteinの組み合わせがより好ましく、N-haloroacetyl-D-tryptophan、好適にはN-chloroacetyl-D-tryptophanとcysteinの組み合わせがさらに好ましい。
　本発明の環状ペプチドは、固相合成法によっても製造できる。
　固相合成法については、当業界において周知の方法であって、公知の方法を適用することができる。
　以下、例示として説明するが、例えば、水酸基を有するレジンの水酸基と、α－アミノ基が保護基で保護された第一のアミノ酸（通常、目的とするペプチドのＣ末端アミノ酸）のカルボキシ基をエステル化反応させる。エステル化触媒としては、１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、及びジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。
　次いで、第一アミノ酸のα－アミノ基の保護基を脱離させるとともに、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第二のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第一及び第二のアミノ酸を結合させる。さらに、第二のアミノ酸のα－アミノ基を脱保護し、主鎖のカルボキシ基以外のすべての官能基が保護された第三のアミノ酸を加え、当該カルボキシ基を活性化させて、第二及び第三のアミノ酸を結合させる。これを繰り返して、目的とする長さのペプチドが合成されたら、すべての官能基を脱保護する。
　アミノ酸のα－アミノ基の場合について例示して説明したが、アミノ酸のアミノ基がα－アミノ基以外の場合であっても同様に実施することができる。
　固相合成のレジンとしては、例えば、Merrifield resin、MBHA resin、Cl-Trtresin、SASRIN resin、Wang resin、Rink amide resin、HMFS resin、Amino-PEGA resin（Merck）、及びHMPA-PEGA resin（Merck）等が挙げられる。
　アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ又はＺ）基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、及びアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基等が挙げられる。
　カルボキシル基の保護基としては、例えば、メチル基、エチル基、ベンジル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、及びシクロヘキシル基等が挙げられる。
　アミノ酸のその他の官能基については、セリンやトレオニンのヒドロキシ基の保護基としては、例えば、ベンジル基及びｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられ、チロシンのヒドロキシ基の保護基としては、例えば、２－ブロモベンジルオキシカルボニル基及びｔｅｒｔ－ブチル基等が挙げられる。
　保護基については、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　Ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ　ａｎｄ　Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．に記載されている方法又はそれに準ずる方法に従って、保護及び脱保護を行うことができる。
　アミド結合を形成する縮合反応における、カルボキシル基の活性化は、縮合剤を用いて行うことができる。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣあるいはＷＳＣ）、（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）、及び１－［ビス（ジメチルアミノ）メチル］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム－３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）等が挙げられる。
　固相レジンからのペプチド鎖の切断は、ＴＦＡ及びフッ化水素（ＨＦ）等の酸で処理することによって行うことができる。
　本発明のプレキシンの結合調節剤は、医薬組成物として用いることができる。
　医薬組成物の投与形態は特に限定されず、経口投与でも非経口投与でもよい。非経口投与としては、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、及び皮下注射等の注射投与、経皮投与、並びに経粘膜投与等が挙げられる。
　経粘膜投与の投与経路としては、例えば、経鼻、経口腔、経眼、経肺、経膣、及び経直腸等が挙げられる。
　医薬組成物中の環状ペプチドに対し、代謝や排泄等の薬物動態の観点から、各種の修飾を行ってよい。例えば、環状ペプチドにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や糖鎖を付加して血中滞留時間を長くし、抗原性を低下させることができる。
　また、ポリ乳酸・グリコール（ＰＬＧＡ）等の生体内分解性の高分子化合物、多孔性ヒドロキシアパタイト、リポソーム、表面修飾リポソーム、不飽和脂肪酸で調製したエマルジョン、ナノパーティクル、ナノスフェア等を徐放化基剤として用い、これらに環状ペプチドを内包させてもよい。経皮投与する場合、弱い電流を皮膚表面に流して角質層を透過させることもできる（イオントフォレシス法）。
　医薬組成物は、有効成分として環状ペプチドをそのまま用いてもよいし、医薬的に許容可能な添加剤等を加えて製剤化してもよい。
　医薬製剤の剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、及びパップ剤等が挙げられる。
　製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、及び抗酸化剤等の添加剤を適宜使用して、常法により行うことができる。
　製剤化に用いられる添加剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等の医薬的に許容可能な有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、及びヒト血清アルブミン等が挙げられ。
　経粘膜吸収における吸収促進剤として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類、ラウリル硫酸ナトリウム、及びサポニン等の界面活性剤；グリココール酸、デオキシコール酸、及びタウロコール酸等の胆汁酸塩；ＥＤＴＡ及びサリチル酸類等のキレート剤；カプロン酸、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、及び混合ミセル等の脂肪酸類；エナミン誘導体、Ｎ－アシルコラーゲンペプチド、Ｎ－アシルアミノ酸、シクロデキストリン類、キトサン類、並びに一酸化窒素供与体等を用いてもよい。
　錠剤又は丸剤は、糖衣、胃溶性、及び腸溶性物質等で被覆されたコート錠等であってもよい。
　液剤は、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びアルコール類等を含んでもよい。湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解剤、溶解補助剤、及び防腐剤等を加えてもよい。
　本発明は、プレキシンの結合調節剤を、好ましくは、セマフォリン４ＤとプレキシンンＢ１の結合調節剤を、それ必要とする患者に投与して、患者における疾患を治療又は予防する方法も提供する。
　本発明のプレキシンの結合調節剤、好ましくは、セマフォリン４ＤとプレキシンンＢ１の結合調節剤の投与量は、当業者が、それを必要とする患者の症状、年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、及び製剤の種類等に応じて、適宜決定することができる。
　患者は、哺乳動物であり、ヒトであることが好ましい。
　以下、実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでない。
　ヒトプレキシンＢ１のＮ末ヘッドピースに対するＲａＰＩＤシステムを実施して、プレキシンＢ１に結合する環状ペプチドを得た。５回以上繰り返すＲａＰＩＤシステムによる選択により、４つのファミリーにカテゴライズされる環状ペプチドを得た。
　環状ペプチドのアミノ酸配列を図１に示す。
　図１ｃに示す環状ペプチドを化学的に合成して、表面共鳴プラスモン（ＳＰＲ）によりプレキシンＢ１に対する結合親和力を分析した。
　図２ｃに示すように、ｎＭオーダーの解離定数（ＫＤ）を示した。
　また、下記表２に示す環状ペプチドについて、同様にして、ヒト及びマウスのプレキシンＢ１に対する結合親和力を分析した。表２に示す環状ペプチドが、マウスプレキシンＢ１においてもｎＭオーダーの解離定数（ＫＤ）有することが示された。なお、表２中、ｗは、図２ｂに示される環状ペプチド中のＤＷを意味し、図２ｂに示される環状ペプチドでは、ＣｙｓであるＣに結合するのはＳｅｒであるが、表２に示す環状ペプチドＰ６以外の環状ペプチドにおいては、Ｃに結合するのはＧｌｙである。
表２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図２ｃに示す環状ペプチドのプレキシンＢ１及びセマフォリン４Ｄのタンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）への効能をインビトロプルダウンアッセイにより確認した（図３）。
１．プレキシンＢ１又はプレキシンＡ２をセファロースビーズに固定化した。
２．プレキシンＢ１に結合する環状ペプチド、ネガティブなコントロールペプチド又はジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）をプレキシンＢ１固定化ビーズに添加した。
３．セマフォリン４Ｄ又はセマフォリン６Ａのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）融合タンパク質を添加した。
４．ビーズを洗浄し、４０５ｎｍでサンプルの吸光度の上昇を測定することにより、ＡＰ活性を測定した。
　高いＡＰ活性は、セマフォリンとプレキシンの高い相互作用に相関し（５）、低いＡＰ活性は、セマフォリンとプレキシンの高い相互作用に相関する（６）。
　結果を図４及び図５に示す。図４ｃ及びｄに示す環状ペプチドは、プレキシンＢ１とセマフォリン４Ｄの相互作用を阻害し、図５ｃ及びｄに示す環状ペプチドは、プレキシンＢ１とセマフォリン４Ｄの相互作用を増強した。
　表２に示す環状ペプチドについてＡＰ活性を測定したところ、環状ペプチドｍｐ６－９は、環状ペプチドＰ６と同等のヒトプレキシンＢ１とセマフォリン４Ｄの相互作用の阻害活性を示した。また、環状ペプチドｍｐ６－２は、環状ペプチドＰ６と同等のマウスプレキシンＢ１とセマフォリン４Ｄの相互作用の阻害活性を示し、環状ペプチドｍｐ６－９及びｍｐ６－３は環状ペプチドＰ６よりも強い阻害活性を示した。
　環状ペプチドＰ６について、プレキシンＰＰＩ阻害活性を各濃度で測定した。結果を図６に示す。
　プレキシンＢ１を外因性に発現する細胞ＨＥＫ２９３を用いて、セマフォリン４Ｄに依存する成長円錐崩壊の阻害試験を行った。結果を図７に示す。
　環状ペプチドＰ６を常法に従いビオチン化した。ビオチン化した環状ペプチドＰ６の構造を図８ａとして示す。
　プレキシンＢ１を発現しないモック細胞と外因性にプレキシンＢ１を発現するＨＥＫ２３９細胞に対して、合成したビオチン化Ｐ６を添加し、次いで、ストレプトアビジン－ＰＥを添加して、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ）でその結合量を測定した。その結果を図８ｂに示す。
　さらに、環状ペプチドＰ６を用いて、プレキシンＢ１との結合におけるＰ６の各アミノ酸の役割を試験するために、ＳＰＲ分析を行った。
　本ＳＰＲ分析により、環状ペプチドとプレキシンＢ１との結合において必須なアミノ酸残基を見出すことに成功した。図９に示すように、Ｐ６においては、Ｒ７、Ｗ８及びＴ９が環状ペプチドとプレキシンＢ１との結合に重要であることが分かった。すなわち、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を有する環状ペプチドであることにより、セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合調節剤として機能し得ることが見出された。
　環状ペプチドＰ６に対し、図１０に示す分子内ラクタムブリッジ構造を有する環状ペプチドを化学的に合成して、表面共鳴プラスモン（ＳＰＲ）によりプレキシンＢ１に対する結合親和力を分析した（図１１ａ）。
　環状ペプチドＰ６及び分子内ラクタムブリッジ構造を有する環状ペプチドの血清プロテアーゼによる安定試験を行った（図１１ｃ）。Ｐ６は、３～６時間の半減期を示したが、分子内ラクタムブリッジ構造を有する環状ペプチドＢＣ８は、２９時間後においても分解しなかった。
　環状ペプチドＰ６を常法に従い二量化した。二量化した環状ペプチドＰ６の構造（Ｐ６ｄＰＥＧ５及びＰ６ｄＰＥＧ１１）を図１２に示す。図１２に示す二量化した環状ペプチドと、プレキシンＢ１を外因性に発現する細胞ＨＥＫ２９３を用いて、セマフォリン４Ｄ刺激による細胞脱着に対する各ペプチドの阻害試験を行った。結果を図１３に示す。
　環状ペプチドＰ７を、図１２に構造を示す二量化した環状ペプチドＰ６と同様に二量化したＰ７－ＰＥＧダイマー（Ｐ７ｄＰＥＧ５及びＰ７ｄＰＥＧ１１）は、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（ＡＣＥＡ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．）を用いたＣｏｌｌａｐｓｅアッセイにおいて、プレキシンＢ１発現細胞に対して特異的にＳｅｍａ４Ｄ様のコラプス作用を引き起すこと、すなわちプレキシンＢ１の活性化を促進する効果があることが観察された。

Claims (17)

  1. 　Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を有するか、若しくはＬｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ構造を有する環状ペプチド又はその医薬的に許容可能な塩を含む、プレキシンの結合調節剤。
  2. 　環状ペプチドが、Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｘａａ１－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ構造を有する（Ｘａａ１は、任意のアミノ酸である）、請求項１に記載の結合調節剤。
  3. 　環状ペプチドが、Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｔｈｒ－Ｘａａ２－Ｘａａ３－Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ構造を有する（Ｘａａ２及びＸａａ３は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である）、請求項１又は２に記載の結合調節剤。
  4. 　環状ペプチドが、Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ構造を有する、請求項１に記載の結合調節剤。
  5. 　環状ペプチドが、Ｎ－ＣＯ－ＣＨ2－Ｓ構造を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の結合調節剤。
  6. 　前記Ｎが、トリプトファンのアミノ基に由来する、請求項５に記載の結合調節剤。
  7. 　前記Ｓが、システインのチオール基に由来する、請求項５又は６に記載の結合調節剤。
  8. 　環状ペプチドが、１０～２０のアミノ酸で構成される環構造を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の結合調節剤。
  9. 　環状ペプチドが、分子内ラクタムブリッジ構造を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の結合調節剤。
  10. 　環状ペプチドの二量体である、請求項１～９のいずれか１項に記載の結合調節剤。
  11. 　プレキシンがプレキシンＡ１又はプレキシンＢ１である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の結合調節剤。
  12. 　セマフォリンとプレキシンとの結合調節剤であり、セマフォリンがセマフォリン３Ａ又はセマフォリン４Ｄである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の結合調節剤。
  13. 　セマフォリン４ＤとプレキシンＢ１の結合調節剤である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の結合調節剤。
  14. 　請求項１～１３のいずれか１項に記載の結合調節剤を含む、医薬組成物。
  15. 　がん治療に用いられる、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 　骨代謝に関連する疾患治療に用いられる、請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. 　神経変性疾患又は神経炎症性疾患治療に用いられる、請求項１４に記載の医薬組成物。
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