MX2013013207A - Promotor de osteogenesis. - Google Patents

Abstract

El propósito de la presente invención es proporcionar un promotor de osteogénesis para promover directamente la osteogénesis por los osteoblastos, y un agente para prevenir y tratar la enfermedad ósea. La presente invención se caracteriza porque se usa una sustancia inhibidora de la unión, semaforina 4D y plexina El. Para la sustancia inhibidora de la unión, los ejemplos apropiados incluyen un anticuerpo de anti-semaforina 4D, anticuerpo de anti-plexina B1 y una proteína que comprende el dominio extracelular de la plexina B1.

Description

PROMOTOR DE OSTEOGENESIS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con un acelerador de osteogénesis y con un agente preventivo y terapéutico. Más particularmente se relaciona con un acelerador de osteogénesis y con un agente preventivo y terapéutico que tiene como un ingrediente activo una sustancia que inhibe la unión de semaforina 4D y plexina Bl.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Conforme la población de Japón envejece, ha habido un aumento en pacientes que sufren de fracturas óseas, osteoporosis , reumatismo articular, dolor lumbar y otras enfermedades óseas. La función del tejido en el tejido óseo se mantiene coordinando los osteoblastos que favorecen la osteogénesis y los osteoclastos que favorecen la resbrción ósea, y manteniendo un balance entre la osteogénesis y la resorción ósea. El balance del metabolismo óseo se destruye enve eciendo, una disminución en la función ovariana, así como otros factores. Cuando la osteogénesis disminuye o cuando hay una resorción ósea anormal, la cantidad de. hueso disminuye (densidad ósea) y se presenta una variedad de enfermedades óseas . Las enfermedades óseas incluyen fracturas óseas, deficiencia ósea, osteoporosis, osteomalacia, osteopenia, dolor lumbar, enfermedad de Paget de huesos, REF. : 244933 mielitis tónica, reumatismo articular, artrosis deformativa y similares, cuando una persona adulta sufre de una enfermedad ósea, es difícil que esta persona funcione en un nivel requerido para su vida diaria y dependiendo del caso, hay un riesgo de que el paciente llegue a estar en cama. Como resultado, es extremadamente significativo en la prevención y tratamiento de las enfermedades óseas en la sociedad moderna, en donde está aumentando el número de personas de edad adulta .

La vitamina D3 activada, bifosfonato, calcitonina, preparaciones hormonales que contienen estradiol, preparaciones de vitamina K2 y similares, en general, se usan como agentes terapéuticos para las enfermedades óseas. Los derivados de estradiol, los derivados de la vitamina D3 activados, los derivados de bifosfonato y similares, están siendo desarrollados como agentes terapéuticos más efectivos, ya que éstos tienen menores efectos secundarios (ver el Documento de Patente 1) . Sin embargo, la vitamina D3: tiene una acción que aumenta la concentración de calcio en la sangre y el estradiol y bifosfonato tienen un efecto de inhibición de la resorción ósea. Sin embargo, ninguno de éstos tiene un efecto que acelere directamente la osteogénesis por medio de los osteoblastos . Una terapia de fármaco múltiple es el tratamiento de elección en este caso, de modo que hay una necesidad de desarrollar un nuevo · agente preventivo y terapéutico que tenga una acción diferente de la de los agentes preventivos y terapéuticos convencionales.

Los huesos se están creando continuamente en las etapas conocidas como la remodelación ósea, en donde se repiten la etapa de resorción ósea y la siguiente etapa de osteogénesis . La transición de una etapa a otra debe controlarse precisamente mediante la secreción de la célula ósea, ya que contribuye a la comunicación entre osteoclasto-osteoblasto o mediante factores de reconstrucción ósea liberados de la matriz ósea. Es bien conocido que TGF-ß e IGF-1 liberados durante la resorción ósea, estimulan la osteogénesis, de modo que es conocido como un factor de acoplamiento. Aunque hay una abundancia de datos in vitro sobre las moléculas candidato, las cuales son extremadamente importantes para el factor de acoplamiento, aún no hay una evidencia in vitro para esto.

Las moléculas de guía de axones se manifiestan ampliamente fuera del sistema nervioso. Por lo tanto, se controlan la migración celular, la respuesta inmune, el desarrollo de tejido y la osteogénesis, y similares (ver los Documentos no patentados 1 y 2) . Con base en la investigación llevada a cabo en los últimos años, se sugiere que las moléculas de guía de axones de semaforina efrina y similares, contribuyen a la comunicación intercelular entre los osteoclastos y los osteoblastos (ver los Documentos no patentados 3 a 5) . .

Es bien sabido .que la semaforina 4D se secreta de los oligodendrocitos y que induce la destrucción del cono de crecimiento en el sistema nervioso central. También es claro que la semaforina 4D es extremadamente importante para mantener la respuesta inmune y la homeóstasis del sistema inmune. Un receptor de semaforina 4D bien conocido es la plexina-Bl (ver el Documento no patentado 6) . Además, el Documento no patentado 7 sugiere que la formación de osteoclasto puede acelerarse a través de la acción de diferenciación de osteoblastos , así como de los osteoclastos . El Documento no patentado 8 describe que la semaforina 4D no se detecta en los osteoclastos, que está presente sobre la superficie de los osteoclastos y la cantidad ósea se ha confirmado que aumenta comparado con los ratones de tipo silvestre en ratones sema4D-/- hembra, en donde la semaforina 4D (Sema 4D) es deficiente en homo (cigotos) .

DOCUMENTOS DE LA TECNICA PREVIA Documentos de patente Tabla especial en la Publicación 2005-509629.

Documento no patentado 1: BJ . Dickson, Science 298, 1959 (6 de diciembre de 2002) Documento no patentado 2: A.B. Huber, A.L. blodkin, D.D. Ginty, J.F. Cloutier, Annual Review Neuroscience 26, 509 (2003). · Documento no patentado 3: N. Takagahara et al., Nat . Cell Biol 8,615 (junio de 2006). '.

Documento no patentado 4: N. Irie et al., Cell Metab 4, 111 (agosto de 2006) .

Documento no patentado 5: C. Zhao et al., Cell Metab 4, 111 (agosto de 2006) Documento no patentado 6: I. Oinuma et al., Science, Vol. 305, No. 5685, pp . 862 -865 (6 de agosto de 2004) Documento no patentado 7: Ishida Masanari , Kaneda Toshio, Muto Akihiro, Yoshida Masashi, Meeting Program Abstracts of the Japan Society of Bone Metabolism, vol. 25, página 266, publicado en junio de 2007, [Analysis of Bioaction in Bone Metabolism in Osteoclast-derived Semaphorin 4D] .

Documento no patentado 8: Romain Dacquin, Chantal Domenget, Pierre Jurdic, Irma Machuca-Gayet , ASBMR 2010 Annual Meeting Abstracts, Presentation Abstracts, Presentation Number M00152, "Physiological Control of Bone Resorption by Semaphorin 4D is Dependent on Ovarían Function" . _ BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Problemas que la presente invención pretende resolver Es un objetivo de la presente invención proporcionar un agente de aceleración de osteogénesis y un agente preventivo y terapéutico para las enfermedades óseas, el cual involucra la promoción directa de la osteogénesis usando osteoblastos. Medios para resolver los problemas Después de un arduo trabajo de investigación bajo las condiciones descritas en los antecedentes de tecnología mencionados anteriormente, los inventores encontraron que: (a) cuando la semaforina 4D, la cual se deriva de los osteoclastos, se une con el receptor de plexina B sobre el osteoclasto, activa RhoA de proteína G pequeña, la cual inhibe la diferenciación de osteoblasto, disminuye las señales de IRS (señales que promueven la diferenciación de los osteoblastos) e inhibe la diferenciación de los osteoblastos , de modo que se inhibe la osteogénesis ; y que (b) los anticuerpos de anti-semaforina 4D y los anticuerpos de anti -plexina Bl aceleran directamente la osteogénesis usando los osteoblastos.

Esto significa que la presente invención se relaciona con: (1) un agente de aceleración de osteogénesis que tiene como ingrediente activo una sustancia que inhibe la unión entre la semaforina 4D y la plexina Bl; (2) un agente de aceleración de osteogénesis, como se describe e (1) anterior, característico porque la sustancia de inhibición de la unión es un anticuerpo de anti -semaforina 4D y (3) un agente de aceleración de osteogénesis como se describe en (1) anterior, característico porque la sustancia de inhibición de la unión es un anticuerpo de anti -plexina Bl o una proteína que contiene regiones extracelulares de plexina Bl.

La presente invención también se relaciona con: (4) un agente para la prevención y tratamiento de las enfermedades óseas, que tienen como ingrediente activo, una sustancia que inhibe la unión de semaforina 4D y plexina Bl; (5) un agente para la prevención y tratamiento de las enfermedades óseas, como se describe en (4) anterior, característico porque la sustancia de inhibición de la unión es un anticuerpo de anti-semaforina 4D; (6) un agente para la prevención y tratamiento de las enfermedades óseas, como se describe en (4) anterior, característico porque la sustancia de inhibición de la unión es un anticuerpo de anti-plexina Bl o un proteína que contiene regiones extracelulares de plexina Bl y (7) un agente para la prevención y tratamiento de enfermedades óseas, como se describe en cualquiera de (4) a (6) anteriores, característico porque las enfermedades óseas se seleccionan de fractura ósea, deficiencia ósea, osteoporosis, osteomalacia, osteopenia, dolor lumbar, enfermedad de Paget de huesos, mielitis tónica, reumatismo articular y artrosis deformativa.

La presente invención también se relaciona con: (8) un método usado para, determinar un ingrediente activo candidato para el agente de aceleración de osteogénesis , en donde se determina si la sustancia que está siendo estudiada es una sustancia que inhibe la unión entre la semaforina 4D y la plexina Bl, y si la sustancia mencionada anteriormente, que está siendo estudiada es la sustancia mencionada anteriormente que inhibe la unión, la sustancia mencionada anteriormente se determina que es un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de la osteogénesis; (9) un método, como se describe en (8) anterior, característico porque el método usado para determinar si la sustancia que es estudiada, es una sustancia que inhibe la unión entre la semaforina 4D y la plexina Bl, consiste de las siguientes etapas (A) a (D) : (A) una etapa en donde la semaforina 4D y la plexina Bl se ponen en contacto entre sí, en presencia de la sustancia que está siendo estudiada, (B) una etapa en donde se mide el grado de unión entre la semaforina 4D y la plexina Bl, (C) una etapa en donde el grado medido en la etapa (B) anterior, se compara con el grado cuando no está siendo estudiada la presencia de la sustancia, y (D) una etapa en donde la sustancia que es estudiada se determina que es una sustancia que inhibe la unión entre la semaforina 4D y la plexina Bl, cuando el grado medido en la etapa (B) anterior es menor que el grado cuando no está siendo estudiada la presencia de la sustancia; (10) un método para seleccionar un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de osteogénesis , característico porque los métodos descritos en (8) ó (9) anteriores, se usan para buscar sustancias que son estudiadas para un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de osteogénesis.

La presente invención puede usarse para promover directamente la osteogénesis usando osteoblastos y pare prevenir y/o tratar las enfermedades óseas. ' : BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama que indica la cantidad ósea en ratones silvestres (WT) , medida usando una tomografía microcomputarizada (uCT) y ratones modificados genéticamente (knockout) (Sema 4d-/-) .

La Figura 2 es un diagrama que indica el ancho trabecular en ratones WT, medido usando y ratones Sema4d- /-· La Figura 3 es un diagrama que indica la osteogénesis [área superficial de osteoblasto (izquierda) ; área superficial del hueso calcificado (centro) ; y velocidad de osteogénesis (derecha) ] medida usando análisis de osteomorfogénesis en ratones WT y ratones Sema4d-/- con el marcador doble de calceína cada 4 días.

La Figura 4 es un diagrama que indica el área superficial de osteoclasto y el conteo celular (a la izquierda y la mitad) , así como los parámetros (a la derecha) de la resorción ósea medida usando análisis de osteomorfogénesis en los ratones WT y ratones Sema4d-/-.

La Figura 5 es un diagrama que indica la cantidad ósea de ratones en los que se ha llevado a cabo el injerto celular inmune adoptivo usando células de la médula ósea de ratones WT y ratones Sema4d-/-. La segunda gráfica de la izquierda indica la cantidad de hueso de los ratones, cuando se injerta en ratones WT y la segunda gráfica de la derecha 3 indica la cantidad de hueso de los ratones cuando se injerta en ratones Sema4d-/- .

La Figura 6 es un diagrama que indica el número de nodulos óseos cuando Fc-Sema4D (semaforina 4D recombinada fusionada con el área Fe del IgGl) se adicionan a las células calváricas cultivadas bajo las condiciones de osteogénesis.

La Figura 7 es un diagrama que indica la manifestación de plexina tipo B y AR m de grupos de diferenciación 72 (CD72) durante la diferenciación de osteoblastos .

La Figura 8 es un diagrama que indica los resultados del análisis de disminución usando Fc-sema4D. El panel a la derecha indica los resultados del análisis de muestreo antes de la disminución y el panel a la izquierda indica los resultados del análisis de muestreo después de la disminución.

La Figura 9 es un diagrama que indica la cantidad de hueso en ratones WT, medida usando el análisis µ?? y en ratones modificados genéticamente con plexina Bl (Plxnbl-/-).

La Figura 10 es un diagrama que indica el ancho de la trabécula en ratones WT, medido usando ratones µ(_? y ratones Plxnbl-/-.

La Figura 11 es un diagrama que indica el área superficial de los osteoblastos en ratones WT, medida usando análisis de osteomorfogénesis . : La Figura 12 es un diagrama que indica el área superficial ósea que ha llegado a ser calcificada en ratones WT, medida usando análisis de osteomorfogénesis y ratones Plxnbl-/- .

La Figura 13 es un diagrama que indica la velocidad de osteogénesis en ratones WT, medida usando el análisis de osteomorfogénesis y ratones Plxnbl-/-.

La Figura 14 es un diagrama que indica mutantes RA (R166111662/1968A) de Plexina Bl y Plexina Bl que tiene mutaciones en el dominio GAP, así como el corte mutante para la Plexina Bl en la que está careciendo el dominio de unión PDZ (APDZ) .

La Figura 15 es un diagrama que indica la cantidad ósea en ratones WT (ratones de control) , medida usando el análisis ]iCT y ratones RhoA negativos dominantes (RhoA DNOB) .

La Figura 16 es un diagrama que indica la trabécula en ratones WT, medida usando el análisis µ?? y RhoA DNOB.

La Figura 17 .es un diagrama que indica la formación [área superficial de osteoblasto] en ratones WT y ratones RhoA DNOB, medida usando el análisis de osteomorfogénesis .

La Figura 18 es un diagrama que indica la formación [área superficial del hueso calcificado] de ratones WT y ratones RhoADNOB .

La Figura 19 es un diagrama que indica la formación [velocidad de osteogénesis] en ratones WT y ratones RhoA DNOB, medida usando el análisis de osteomorfogénesis . ; La Figura 20 es un diagrama que indica el área superficial de osteoblastos de ratones con los ovarios extraídos (OVX) y ratones OVX tratados con anticuerpos anti-Sema4D medidos usando el análisis de osteomorfogénesis .

La Figura 21 es un diagrama que indica la cantidad ósea de ratones OVX y ratones OVX tratados con anticuerpos anti-semaforina 4D (anticuerpos anti-Sema4D) medida usando el análisis ]i T.

La Figura 22 es un diagrama que indica la osteogénesis [velocidad de osteogénesis] en ratones OVX y ratones OVX tratados con anticuerpos anti-Sema4D, medida usando el análisis de osteomorfogénesis .

La Figura 23 es un diagrama que indica los intervalos trabeculares en ratones OVX y en ratones OVX tratados con anticuerpos anti-Sema4D, medida usando el análisis µ??.

La Figura 24 es un panel superior en la Figura 24 que indica los resultados del estudio de la formación de calcificación de osteoblastos de ratones cultivados usando osteoclastos de ratones WT de ratones Sema4D-/-, y cuando se cultivan en presencia de anticuerpos anti-Sema4D. El panel inferior en la Figura 24 es un diagrama que indica los resultados de estudiar la calcificación de osteoblastos de ratón cuando se cultivan en presencia de anticuerpos Fc-sema4D y/o anti-plexina Ba.

La Figura 25 es un diagrama que indica los resultados del estudio de la formación de calcificación de los osteoblastos humanos (HOS, por sus siglas en inglés) cultivados en presencia de osteoclastos o el sobrenadante y/o los anticuerpos anti-Sema4D y similares.

La Figura 26 es un diagrama que indica el área superficial de osteoblastos de ratones con los ovarios extraídos (OVX) y ratones OVX tratados con anticuerpos anti-semaforina 4D (anticuerpos anti-Sema4D) 6 semanas después del tratamiento OVX medido usando el análisis de osteomorfogénesis .

La Figura 27 es un diagrama que indica la cantidad ósea de ratones OVX y ratones OVX tratados con anticuerpos anti-Sema4D, 6 semanas después del tratamiento OVX medido usando el análisis uCT.

La Figura 28 es un diagrama que indica la osteogénesis [velocidad de osteogénesis] en ratones OVX y ratones OVX tratados con anticuerpos anti-Sema4D, 6 semanas después del tratamiento OVX medido usando el análisis de osteomorfogénesis . ; La Figura 29 es un diagrama que indica los intervalos trabeculares en ratones OVX y en ratones OVX tratados con anticuerpos anti-Sema4D, 6 semanas después del tratamiento OVX, medido usando el análisis µ??.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION No hay restricciones particulares en el "acelerador de osteogénesis" en la presente invención y en el "agente preventivo y terapéutico para las enfermedades óseas" (posteriormente referido colectivamente como "agente en la presente invención" , con tal de que tengan como ingrediente activo una sustancia que inhibe la unión de semaforina 4D y plexina Bl (posteriormente, referido simplemente como "[sustancia que inhibe la unión en la presente invención") como el ingrediente activo y no hay restricciones particulares sobre el inhibidor de unión en la presente invención, con tal de que sea una sustancia que inhiba la unión la semaforina 4D y la plexina Bl de los vertebrados. Sin embargo, la proteína que comprende las regiones extracelulares de los anticuerpos anti-semaforina 4D, anticuerpos anti-plexina Bl y plexina Bl, pueden citarse como ejemplos apropiados. El inhibidor de unión en la presente invención inhibe la unión de la semaforina 4D derivada de osteoclastos y los receptores de plexina Bl sobre los osteobiastos y mediante la .inhibición de la supresión de la diferenciación de los osteobiastos a través de la inhibición de la activación RhoaA y por medio de la inhibición: de la disminución de las señales IRS, de modo que se piensa acelerar la osteogénesis usando los osteobiastos. Además, en esta Especificación, los términos "inhibición" y "supresión" se usan de manera intercambiable.

Los anticuerpos de anti- semaforina 4D mencionados anteriormente y los anticuerpos de anti-plexina Bl (posteriormente referidos como "anticuerpos de esta invención")/ pueden ser anticuerpos policlonales y pueden ser monoclonales y cualquier fragmento de éstos. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales se prefieren dada su alta especificidad. Los anticuerpos de anti-semaforina 4D mencionados anteriormente y los anticuerpos de anti-plexina Bl pueden producirse usando un método bien conocido convencional usando la sema orina 4D y plexina Bl . Los fragmentos funcionales que son los anticuerpos en la presente invención, indican los fragmentos de anticuerpos que unen específicamente con relación a (a) la semaforina 4D, la cual es un antígeno en el que los anticuerpos en la presente invención se unen específicamente y a (b) plexina B. Son ejemplos específicos F(ab')2, Fab' , Fab, Fv, FV enlazado a disulfuro, FV de cadena simple (scFV) y polímeros de éstos (D.J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, 1998 T.J. International Ltd.). Estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse usando un método convencional, tal como digestión de moléculas de anticuerpos usando papaína, pepsina y otras proteasas o usando un método de ingeniería genética bien conocido. : Los anticuerpos en la presente invención también incluyen los anticuerpos humanos. En la presente, "anticuerpos humanos" , como se mencionan en la presente invención, indican los anticuerpos los cuales son productos manifestados de genes de anticuerpos derivados de humano. Los anticuerpos humanos pueden obtenerse introduciendo un locus de gen de anticuerpo humano y administrando semaforina 4D y plexina Bl en animales transgénicos, los cuales son capaces de producir anticuerpos derivaos de humanos. Un ratón es un ejemplo de un animal transgénico. Los ratones que son capaces de producir anticuerpos humanos, por ejemplo, son deficientes en cadenas pesadas de inmunoglobulina (Ig) de ratón endógena y cadenas ligeras k de ratón y pueden usarse ratones, los cuales mantienen simultáneamente un fragmento del cromosoma 14to. (SC20) que comprende los genes de cadena pesada de Ig, así como los transgenes de Igk humanos (KCo5) . Estos ratones se producen cultivando ratones de cepa A que tienen un locus de cadena pesada de Ig humana y ratones de cepa B que tienen un transgen de cadena de Igk humana. Los ratones de la cepa A son homocigotos para la cadena pesada de Ig endógena, y la destrucción de la cadena ligera k y son una cepa de , ratón (Tomizuka, et al., Proc Nati Acad Sci USA, 200 Vol 97:722) que mantienen un fragmento del cromosona 14to. (SC20) que es capaz de la transmisión apomórfica. La cepa B también es un homocigoto para las cadenas pesadas de Ig endógena y la deficiencia de la cadena ligera k y es una cepa de ratón (Nat Biotechnol., 1996 Vol 14:845) que mantiene un transgen de cadena de Igk humana (KCo5) .

Los anticuerpos policlonales en la presente invención pueden producirse usando el método indicado a continuación. Éstos pueden obtenerse usando semaforina 4D y plexina Bl y, si es necesario, un agente de inmunoactivación (adyuvante de Freund y similares) en ratones, conejos, cabras, caballos y otros mamíferos no humanos. Los anticuerpos monoclonales en la presente invención se usan para producir hibridoma de células que producen anticuerpos de animales inmunosensiblizados y células de mieloma, los cuales no pueden producir sus propios anticuerpos. El hibridoma se clona y se seleccionan los clones, los cuales producen anticuerpos monoclonales que indican una afinidad específica hacia los antígenos usados para la inmunización. Tal hibridoma puede producirse con base en el método de Keller and Millstein (Nature, 1975 Vol . 256: 495-497). La selección del clon de hibridoma que produce los anticuerpos monoclonales se lleva a cabo cultivando el hibridoma en una placa de micr.otitulación . La sensibilidad a los inmunoantígenos en el sobrenadante de cultivo en los' pozos observados con proliferación, puede llevarse a cabo por medición, usando ELISA y otros métodos de inmunoensayo enzimático, radioinmunoensayo , el método de anticuerpo fluorescente y otros métodos inmunológicos .

La producción de anticuerpos monoclonales de los hibridomas puede llevarse a cabo cultivando el hibridoma in vi tro y aislándolo del sobrenadante. También puede cultivarse in vivo en el fluido pleural de ratones, ratas, cobayos, cerdos, hámsteres o conejos y similares, y aislarse del fluido pleural. Se clonan los genes que codifican los anticuerpos monoclonales del hibridoma y otros anticuerpos que producen las células, se recombinan en un vector apropiado y éstos se introducen en el huésped (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) y otra reserva de células de mamíferos, Escherichia coli, células de levadura, células de insectos, células de plantas y similares) y los anticuerpos recombinantes se producen usando la tecnología recombinante de genes (PJ. Delves, Antibody Production Essential Techniques, 1997, iley, P. Shepherd and C. Dean, Monoclonal Antibodies, 2000, Oxford University Press, J. . Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 1993, Academic Press) .

Las vacas, cabras, ovejas o cerdos transgénicos , en donde se producen genes del anticuerpo deseado que se recombinan en los genes endógenos usando la tecnología de producción de animales transgénicos y grandes cantidades de anticuerpos derivados de genes de anticuerpos, se obtienen de la leche de estos animales transgénicos.

Los anticuerpos producidos pueden retinarse usando un método bien conocido en el campo, tal como una combinación de cromatografía de columna de proteína A, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, él :método analítico de sulfato, filtración de gel, cromatografía de afinidad y similares.

La proteína que comprende la región extracelular de la plexina Bl mencionada anteriormente, puede inhibir la unión de la semaforina 4D y plexina Bl atrapando la semaforina 4D. No hay restricciones particulares sobre la proteína que comprende la región extracelular de plexina Bl . Sin embargo, es un ejemplo apropiado una proteína que se fusiona con el región constante de los anticuerpos (de preferencia el fragmento Fe de inmunoglobulina) .

La proteína que comprende la semaforina 4D mencionada anteriormente, plexina Bl y regiones extracelulares de plexina Bl, puede producir un vector de manifestación que comprende la secuencia basada en la información de la secuencia de estas proteínas. El vector de manifestación se somete a la transformación fenotípica en las células huéspedes apropiadas, la proteína blanco se produce dentro de las células y la proteína blanco puede introducirse usando un método de aislamiento u otro método bien conocido. Por ejemplo, la secuencia 3 de ADN (número de secuencia - 1) de semaforina 4D y la secuencia de aminoácido (número de secuencia 2)' se describen en GenBank Acceso Número NM_001142287 y la secuencia de ADN (número de secuencia 3) de la plexina Bl humana y la secuencia de aminoácido -¦ (secuencia número 4) se describen en GenBank Acceso Número NM 001130082.

Además, la región extracelular de la plexina Bl humana corresponde a los números de aminoácidos 1 a 1490 de la • secuencia de aminoácido del Acceso Número NM_001130082 mencionado anteriormente.

Se midió por análisis de inmuno-manchado, la unión entre la semaforina 4D y la plexina Bl, ambas en presencia y sin la presencia de la sustancia para observar si una cierta sustancia es una sustancia que inhibe la unión de la semaforina 4D y la plexina Bl, y se estudió si el enlace entre ellas disminuyó en presencia de tal sustancia, de modo que se podría confirmar fácilmente.

El efecto de aceleración de la osteogénesis referido en la presente invención, indica el efecto de la aceleración de la osteogénesis y, más precisamente, incluye el efecto de aceleración de la osteogénesis por los osteoblastos, inhibiendo la supresión de la diferenciación de osteoblastos. Sí o no una cierta sustancia tiene un efecto de aceleración de osteogénesis , puede confirmarse administrando lá sustancia a vertebrados que tienen una menor cantidad de hueso qué los pacientes acostumbrados (de preferencia, pacientes con osteoporosis y vertebrados de modelos de osteoporosis ) , y encontrar sí o no aumenta la cantidad de hueso.

El efecto de prevención y tratamiento de la enfermedad ósea en la presente invención indica el efecto . de la prevención y/o tratamiento de cualquiera de " estas enfermedades óseas o el efecto del mejoramiento de los síntomas en la presente invención. Sí o no una cierta sustancia tiene un efecto terapéutico de la enfermedad ósea, puede confirmarse por la administración de la sustancia a un paciente o un vertebrado con una enfermedad ósea (de preferencia, un paciente con osteoporosis o un vertebrado de modelo de osteoporosis) , y después estudiando si la enfermedad ósea se cura o se mejora.

La formulación de la presente invención sólo puede contener la sustancia de inhibición de la unión en la presente invención, sin embargo, puede adicionarse un vehículo farmacológicamente permitido usualmente, agente aglomerante, estabilizador, excipiente, diluyente, amortiguador de pH, desintegrador agente de solubilización, adyuvante de solubilización, isotónico u otro agente de ajuste que mezcla los componentes. La formulación del agente reductor en la presente invención puede ser una formulación en polvo, formulación granulada, un agente de encapsulación u otra preparación sólida. También puede ser una preparación en solución, una emulsión, una suspensión u otra formulación líquida.' Estas preparaciones pueden usarse conforme sea apropiado para la 'sustancia de inhibición de la unión en la presente invención, mediante el tratamiento usando el método acostumbrado.

No hay restricciones particulares sobre el método usado para administrar el agente en la presente invención, con tal de que tenga el efecto preventivo o terapéutico deseado de la enfermedad ósea, y pueda administrarse oral o no oralmente. El método no oral usado para administrarlo incluye la administración vascular, administración muscular, administración hipodérmica, administración transdérmica , administración nasal, administración transpulmonar . De éstas, puede usarse la administración vascular e intravenosa como una ventaja particular. La dosis de la preparación en la presente invención, así como el número de veces administrada y la concentración, pueden ajustarse de acuerdo con el peso corporal del paciente, el tipo de enfermedad ósea y los síntomas de la enfermedad ósea.

El paciente para la presente invención pueden ser vertebrados, tales como mamíferos y animales que pertenecen a la familia de las aves. Éstos pueden incluir humanos, monos, ratones, conejos, hámsteres, cobayos, vacas, cerdos, caballos, conejos, ovejas, cabras, gatos, perros, pollos, codorniz y otros mamíferos apropiados. De éstos, son particularmente los humanos y los animales domésticos' y las aves de corral. La sustancia de inhibición de la unión contenida en el agente de la presente invención es apropiada desde el punto de vista de la obtención de un efecto de aceleración de la osteogénesis sobresaliente, y el efecto de tratamiento, ya sea el tipo de vertebrado derivado . de la semaforina 4D y plexina Bl, que lleva a la acción de inhibición de la acción, coincide con el tipo de vertebrado que es un candidato para la administración del agente en la presente invención. Además, un vertebrado derivado de la semaforina 4D y el tipo de vertebrado derivado de plexina Bl puede ser el mismo o diferente.

No hay restricciones particulares en cuanto al tipo de enfermedad ósea que puede tratarse usando la presente invención, con tal de que sea una enfermedad ósea que tiene un factor que ocasiona una disminución en la osteogénesis o una enfermedad ósea relacionada con una disminución en la osteogénesis. Sin embargo, las fracturas de huesos, deficiencia ósea, osteoporosis , osteomalacia, deficiencia ósea, dolor lumbar, enfermedad de Paget de huesos, mielitis tónica, reumatismo articular, disosteogénesis y artritis deformativa son todos candidatos apropiados. De éstas, son particularmente apropiadas la osteoporosis, osteomalacia, osteopenia y la disosteogénesis.

El método en la presente invención es un método usado para determinar un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de la osteogénesis, en donde se determina si una sustancia que es estudiada es una sustancia que inhibe la unión entre la semaforina 4D y plexina Bl, y si la sustancia mencionada anteriormente, que es estudiada, es la sustancia mencionada anteriormente, la cual inhibe la unión, siendo la sustancia estudiada mencionada anteriormente, se determina que es un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de la osteogénesis . En el método de determinación mencionado anteriormente, las siguientes etapas (A) a (D) son un ejemplo apropiado del método usado para determinar si una sustancia que es estudiada, es una sustancia que inhibe la unión entre la semaforina 4D y plexina Bl .

(A) una etapa, en donde la semaforina 4D y plexina Bl se ponen en contacto entre sí con presencia de la sustancia que es estudiada; (B) una etapa, en donde se mide el grado de unión entre la semaforina 4D y plexina Bl; (C) una etapa, en donde el grado medido en la etapa (B) anterior, se compara con el grado sin la presencia de la sustancia que es estudiada,- (D) una etapa, en donde la sustancia que es estudiada, se determina que es una sustancia que inhibe la unión entre la semaforina 4D y plexina Bl, cuando en grado medido en la etapa (B) anterior, es menor que el grado cuando no hay presencia de la sustancia que es estudiada.

En el método de determinación descrito anteriormente, lo siguiente puede usarse para medir el grado de unión: para la semaforina 4D, región extracelular de semaforina 4D marcada o la proteína de fusión de la región extracelular '. de la semaforina 4D y la región Fe de inmunoglobulina, y para la plexina Bl en su superficie. Los siguiente también puede usarse para medir el grado de unión: para la plexina Bl, la región extracelular de la plexina Bl o la proteína de fusión de la región extracelular de la plexina Bl y la región Fe de inmunoglobulina, etc., y para la semaforina 4D, una célula que expresa semaforina 4D sobre su superficie.

No hay restricciones particulares sobre a sustancia que es estudiada en el método de determinación en la presente invención, y puede ser una sustancia predeterminada por tener una actividad que inhibe la unión de la semaforina 4D y plexina Bl, y puede ser cualquier sustancia cuya actividad se desconoce. También es posible usar simultáneamente múltiples sustancias que son estudiadas. Cuando se usan simultáneamente múltiples sustancias, es posible usar simultáneamente sustancias individuales que se estudian cada una en una muestra separada, para usar simultáneamente · múltiples sustancias que se estudian en una sola muestra, o usar simultáneamente múltiples muestras preparadas individualmente con múltiples sustancias que son estudiadas. Cuando se estudian simultáneamente múltiples sustancias en una sola muestra, no puede ser posible en una prueba, determinar cual de las sustancias que es estudiada, inhibe la unión de la semaforina 4D y plexina Bl, sino que es posible determinar cual de las sustancias, que es estudiada, es un inhibidor de la unión, corriendo la prueba múltiples veces y acortando los sustratos que se estudian por etapas. El método de determinación en la presente invención se caracteriza por buscar sustancias que se estudian para un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de la osteogénesis, y el método puede usarse para seleccionar un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de la osteogénesis.

Además, otros modos de la presente invención pueden involucrar: (a) uso de la sustancia de inhibición de la unión en la presente invención, en la producción del agente preventivo y terapéutico para el agente de aceleración de la osteogénesis mencionado anteriormente y las enfermedades óseas; (b) una sustancia de inhibición de la unión en la presente invención para el uso como un agente de aceleración de la osteogénesis y en la prevención y tratamiento de las enfermedades óseas; (c) un método para usar la sustancia de inhibición de la unión para la aceleración de la osteogénesis y prevención y tratamiento de las enfermedades óseas; (d) un. método para promover la osteogénesis, administrando la sustancia de inhibición de la unción ,en la presente invención; y (e) un método para prevenir y tratar las enfermedades óseas administrando la sustancia de inhibición de la unión en la presente invención.

A continuación se describirá la presente invención en detalle con referencia a los ejemplos prácticos de ésta, sin embargo, no debería considerarse por ningún medio que la presente invención se restringe a estos ejemplos prácticos.

EJEMPLOS Análisis de los ratones y fenotipos óseos Se produjeron ratones modificados genéticamente Sema4d-/-, Plxnbl-/-, plexina B2 (Plxnb2-/-), CAT-RhoA DN y a 1 (I)-Cre de acuerdo con el método descrito en la literatura ( . Shi et al., Immunity 13, 633 (noviembre de 2000); R. H. Friedel et al . , J Neurosci 27, 3921 (4 de abril de 2007); R.H. Friedel et al., Proc Nati Acad Sci USA 102, 13188 (13 de septiembre de 2006); K. Kobayashi et al., J. Neurosci 24, 3480 (7 de abril de 2004) ; R. Dacquin, M. Starbuck, T. Schinke; G. Karsenty, Dev Dyn 224, 245 (junio de 2002)]. Todos los ratones se cruzaron 8 o más veces con ratones C57BL/6. Todos los ratones se mantuvieron en una condición en donde no existió un hongo patógeno específico. Todos los experimentos en los animales se autorizaron por el Animal Experiment Committee of the Tokyo Medical and .Dental University y cumplieron con las guías y leyes relacionadas. El análisis del fenotipo óseo involucró controlar respectivamente los ratones genéticamente alterados y los ratones de la misma carnada y se analizaron por lo menos 8 machos y 8 hembras. El análisis micro CT (µ(G?) tridimensional y el análisis de medición histomorfológico se llevaron a cabo de acuerdo con los métodos descritos en la literatura (K. Nishikawa et al., J Clin Invest 120, 3455 (1 de octubre de 2010); T. Koga et al., Nature 428, 758 (15 de abril de ,2004).

Ratones quiméricos de médula ósea Se produjeron ratones quiméricos de médula ósea cambiando en parte el método descrito en la literatura (B. Zhao et al., Nat ed 15, 1066 (septiembre de 2009). Esto significa que se colectaron células de la médula ósea de donadores (C57BL6-Ly5, 2 antecedentes) de ratones Sema 4d-/-de tipo silvestre de la misma carnada. Se inyectaron intravenosamente 2x10S células obtenidas de cada donador en la vena caudal de los ratones de tipo silvestre (3 semanas de edad, C57BL/6-Ly5, 1 antecedente), expuestos a radiación letal o ratones Sema4d-/-. Ocho semanas después del transplante de la médula ósea, se obtuvo un alto nivel de quimerismo de tipo donador (>95%) .

Análisis GeneChip Se llevó a cabo el análisis GeneChip de acuerdo con el método descrito en la literatura (K. Nishikawa et al . , J Clin Invest 120, 3455 (1 de octubre de 2010)). Esto significa que después de que se llevó a cabo la síntesis de ADNc usando transcripción inversa usando todo el AR , se sintetizó el ARNc que se había sometido a marcado biotiñilado por transcripción in vi ro. Después de que se fragmentó el ARNc, se llevó a cabo' la hibridación usando el ratón ?43? GeneChip (elaborado por Affymetrix) de acuerdo con el método descrito en la literatura (T. Koga et al., Nat Med 11, 880 (agosto de 2005); H. Takayanagi et al., Dev Cell 3, 889 (diciembre de 2002) .

Inducción de la diferenciación a osteoblastos in vitro La inducción de la diferenciación a osteoblastos y osteoclastos in vitro se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en el documento (T. Koga et al., Nat ed II, 880 (agosto de 2005); y H. Takayanagi et al., Dev Cell 3, 889 (diciembre de 2002) . Esto significa que se llevó a cabo la inducción de diferenciación mediante el cultivo de células derivadas calváricas, en un medio de cultivo de osteogénesis (50 uM de ácido ascórbico, 10 nM de dextrasono y 10 mM de ß glicerofosfato) y la inducción de diferenciación se confirmó por la prueba de fosfatasa alcalina (ALP) (después de 7 días) y el análisis de osteonodosidad (21 días después, teñido de rojo de alizarina) . Los anticuerpos Fc-sema4D, anti-Semar4D y los anticuerpos anti-plexina BA (anticuerpos anti-Plexina-Bl) se adicionó cada 3 días. El sobrenadante de osteoclasto se recuperó de cada una de las soluciones de cultivo de las células de tipo silvestre y Sema4d-/- después de la estimulación del ligando del receptor activado del factor intranuclear K B (RA KL; elaborado por Peprotech) . Se cultivaron los osteoclastos cultivados en una placa de código de colágeno (elaborada por IWAKI) y se recuperó usando tripsina dos días después de la estimulación de RANKL. Se usó el sobrenadante de osteoclasto como un medio de cultivo de osteogénesis que contiene el reactivo mencionado anteriormente y se adicionó a los osteoclastos cultivados (1 x 150 células/pozo, placa de 24 pozos) cada 3 días.

Análisis cuantitativo de RT-PCR en tiempo real Se llevó a cabo RR-PCR en tiempo real de acuerdo con los protocolos del producto, usando a un dispositivo de ciclado de luz (elaborado por Roche) y SYBR Green (elaborado por Toyobo) . Se usaron los siguientes cebadores.

Plxnbl sentido: 5 ' -tgggtcatgtgcagtacgat-3 ' (número de secuencia 5) , Plxnbl antisentido: 5 ' -cactgctctccaggttctcc-3 ' (número de secuencia 6 ) , Plxnb2 sentido: 5 ' -aggggagcctctctacaagc-3 ' (número de secuencia 7) , Plxnb2 antisentido: 5 ' -tcgatcccttcatcctgaac-3 ' (número de secuencia 8) , Plnxb3 sentido: 5 ' -atatgctgagcgtgccttct-3 ' (número de secuencia 9) , Plnxb3 antisentido: 5 ' -tgctgttgagcaaattggag-3 ' (número de secuencia 10) , CD72 sentido: 5 ' -gccttctcctgtcctgtctg-3 ' (número de secuencia 11) , CD72 antisentido: 5 ' -cctcctggaactgctgagac-3 ' (número de secuencia 12 ) , ¦ : Alpl sentido: 5 ' -aacccagacacáagcattcc-3 ' (número de secuencia 13) Alpl antisentido: 5 ' -gcctttgaggtttttggtca-3 ' (número de secuencia 14) Bglap sentido: 5 ' -gcgctctgtctctctgacct-3 ' (número de secuencia 15) , Bglap antisentido: 5 ' -accttattgccctcctgctt-3 ' (número de secuencia 16) , Collal sentido: 5 ' -gagcggagagtactggatcg-3 ' (número de secuencia 17) , Collll antisentido: 5 ' -gttcgggctgatgtaccagt-3 ' (número de secuencia 18) Gapdh sentido: 5 ' -acccagaaagactgtggatgg-3 ' (número de secuencia 19) .

Introducción genética de Adenovirus y Retrovirus El método para producir el vector de adenovirus que porta el tipo activo de configuración (CA, por sus siglas en inglés) de Rho A (Myc-V14Rho) y Racl (hRacl V12) y el tipo negativo dominante (DN, por sus siglas en inglés) de RhoA (Myc-N19Rho) y Racl (hRacl V12) y el método para introducir éstos, se llevaron a cabo de acuerdo con el método descrito en la literatura (Bito, H. et al., A Critical Role for a Rho-Associated Kinase, pl60ROC , en Determining Axon Oütgrowth in Manunalian CNS Neurons, Neuron 26, 431-441 (2000). La producción del vector de retrovirus (pMXs-Plexina-B-lEGFP, pMXs-Plexina-Bl RA-EGFP y pMXs-Plexina-Bl DPDS-EGFP en donde el mutante [Plexina-Bl DPDZ-EGFP] ) manifestado, en donde la activación de [plexina-Bl RA] y RhoA no podría activarse, se llevó a cabo insertando el fragmento de ADNc de Plexina-Bl, Plexina-Bl RA, respectivamente (I. Oinuma, Y. Ishika a, H. Katoh, M. Negishi, Science 305, 862 (6 de agosto de 2004) y Plexina-Bl DPDZ (V. Perrot, J. Vázquez-Prado, J.S. Gutkind, J Biol Chem 277, 43115 (8 de noviembre de 2002)) en pMXs-IRES-EGFP. La producción de un retrovirus recombinante se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en la literatura (S. Morita, T. Kojima, T. Kitamura, Gene Ther 7, 1063 (junio de 2000) . Esto significa que se llevó a cabo un empaque del retrovirus introduciendo el vector de retrovirus vector producido en las células Plat-E.

Procesamiento del anticuerpo anti-Sema4D para la disminución inducida por OVX sobre la cantidad de ósea La producción de ratones del modelo de osteoporosis inducida por OVX (ovarios extraídos) se llevó a cabo de acuerdo con el método descrito en la literatura (M. Shinohara et al., J. Bio Chem 282, 17640 (15 de junio de 2007). Esto significa que se llevó a cabo una operación o pseudo-operación de extracción ovariana en ratones hembra de 7 semanas de edad. De estos ratones modelo, se llevaron: a cabo pruebas en más de 6 ratones en cada grupo. Se validó esto usando el método descrito a continuación, para encontrar sí o no hubo un efecto preventivo sobre la disminución de la cantidad ósea. Esto significa que se inyectaron intravenosamente 20 ig de anticuerpos Sema4D (elaborado por MBL) o una solución salina de la vena caudal una vez por semana. Se sacrificaron todos los ratones 8 semanas después de la cirugía y se llevó a cabo el análisis pCT y el análisis de osteomorfogénesis . También se llevó a cabo la validación usando el siguiente método para estudiar sí o no hubo un efecto de aceleración sobre la cantidad ósea que había disminuido. Esto significa que después de 6 semanas, se inyectaron intravenosamente 20 µ< de los anticuerpos anti-Sema4D (elaborado por MBL) de la vena caudal durante 3 semanas cada 3 días en ratones OVX. Se sacrificaron todos los ratones 9 semanas después de la operación y se usaron para el análisis uCT.

Análisis de inmunoteñido, análisis de disminución y teñido inmunofluoreacente Se cultivaron células calváricas durante dos días en un medio de cultivo de osteogénesis (ácido ascórbico 50 µ , dexametasona 10 mM y ß-glicerofosfato 10 mM) y después se estimularon con Fc-Sema4D. Se usó IgG de humana purificada (parte Fe) (elaborada por Beckman Coulter) para él control nativo para el análisis de disminución (tiempo 0) . Se colectaron las células en el punto indicado y se llevóla cabo el análisis de inmunoteñido o el análisis de disminución usando los " anticuerpos anti-Plexina-Bl (clon A-8, elaborado por Santa Cruz); anticuerpos anti-PDZ-RhoGEF (policlonal, elaborado por Protein Express) ; anticuerpos anti-LARG (policlonal, elaborado por Lifespan Biosciences); anticuerpos anti-phospho-Akt (Thr308) (policlonal, elaborado por Cell Signaling) ; anticuerpos anti-Akt (policlonal, elaborado por Cell Signaling) ; anticuerpos anti-phosphor ERK (Thr202/Tyr204) (policlonal, elaborado por Cell Signaling); anticuerpos anti-ERK (policlonal, elaborado por Cell Signaling); anticuerpos anti-Met (clon 25H2) (elaborado por Cell Signaling) ; anticuerpos anti-ErbB2 (clon 29D8) (elaborado por Cell Signaling) ; anticuerpos anti-Racl (clon 102/Racl) (elaborado por BD Transduction Laboratories) ; anticuerpos anti-RhoA (clon 55/Rho) (elaborado por BD Transduction Laboratories) ; anticuerpos anti -cadherina- 11 (policlonal, elaborado por Invitrogen) ; anticuerpos anti-IRSl (clon 53-IOC-31) (elaborado por Millipore) ; y anticuerpos anti-b-actina (clon AC40) (elaborado por Sigma-Aldrich) . La fosforilación de plexina Bl, Met, ErbB2 y IRS1 se detectó por los anticuerpos anti-fosfotirosina (4G10, elaborado por Upstate) después de la immunoprecipitación usando respectivamente los anticuerpos específicos para éstos. Se incubó un producto celular disuelto con Fc-sema4D (500 ng) que se unión con cuentas de proteína A-agarosa para detectar la plexina Bl que se unió a semaforina 4D y se llevó a cabo el análisis de inmunoteñido usando los anticuerpos anti-Plexina-Bl. La detección de la activación de la GTPasa se llevó a cabo de acuerdo con la descripción en la literatura (M. Shinohara et al., J Bio Chem 282, 17640 (15 de junio de 2007) . Esto significa que se trató con células calváricas con Fc-sema4D y se colectaron en el punto en que se exhibieron. Se incubó el producto celular disuelto con GST-RBD (usando RhoA) o GST-PAKI (usando Racl) (2 ug) que se unió con glutationa sefarosa y se llevó a cabo el análisis de inmunoteñido usando respectivamente los anticuerpos anti-RhoA o anticuerpos anti-Racl. Se fijaron las células con una paraforma de aldehido al 4% para el teñido inmunofluorescente , se llevó a cabo el procesamiento de permeación y luego se tiñó usando los anticuerpos secundarios de marcado de Alex Fluor 488 y faloidina de conjugado de rodamina (elaborado por Molecular Probes) .

Citometría de flujo Se tiñó una solución flotante de células simples usando los anticuerpos monoclonales conjugados con 8 tipos de pigmentos fluorescentes [anticuerpos anti-CD45.2 conjugados con PerCP . Cy5.5 anticuerpos antiCD45.2. (clon 104) conjugados con FITC; anticuerpos anti-CDllb (clon M1170) conjugados con eFLuor450,- anticuerpos anti-CD105 (clon MJ7/18) = conjugados con PE; anticuerpos antiCDlO (clon 4.29E+02) conjugados con Alex Fluor 647; anticuerpos anti-C044 conjugados con APC-Alexa Fluor 750; anticuerpos anti-Cd44 (clon IM7) conjugados con ACCy7; y anticuerpos anti-Sca-1 (clon 07) (elaborados por eBioscience) conjugados con APC para analizar las células derivadas de la médula ósea y las células palvSricas .

Después, se llevó a cabo la citometría de flujo usando pFACSCant II usando los elementos de programación (software) Diva (elaborado por BO Biosciences) .

Análisis de la proliferación celular Se cultivaron células instersticiales derivadas de la médula ósea en un medio de cultivo de condición de osteogénesis y se analizaron la velocidad de proliferación celular antes de la diferenciación de osteoblastos (día 0) o en el proceso de diferenciación de osteoblastos (Día 14), usando estimulación de semaforina 4D, usando Fe parcial de IgG humana o usando el kit de ELISA de proliferación celular (elaborado por Roche) en presencia de Fc-Semar4D y se detectó la incorporación de 5-bromo-2' desoxiuridina (BrdU) .

Análisis de la unidad de formación de colonia (CFU, por sus siglas en inglés) Se colocaron en placas las células de la médula ósea a 3 x 106 células por pozo simple, en una placa de 24 pozos. Después, se cultivó esto durante 3 días usando un medio de cultivo de OÍ-MEM, que contiene 10% de suero fetal de bovino y luego se reemplazó con un medio de cultivo de condición de osteogénesis. Se detectó la fosfatasa alcalina de unidad de formación de colonia (CFU-ALP, por sus siglas en inglés) como una colonia positiva de ALP en el séptimo día y se detectó el osteoblasto CFU (CFU-Ob) como una colonia positiva de rojo de alizarina en el día 21. El número de agregado de colonias (CFU-fibroblastos (CFU-F) ) se detectó tiñendo con azul de toluidina en el día 7 y el día 21.

Análisis estadístico Todos los datos se indican como la media+SEM (n=15) . El análisis estadístico se llevó a cabo usando la prueba t de Student A NOVA y, cuando sea posible, la prueba Bonferroni (*p < 0.05; ** p<0.001; *** p<0.005; n.s., no significativo).

Los resultados se indican en el ejemplo representativo de 4 o más experimentos individuales.

Resultados Se llevó a cabo la selección amplia del genoraa de ARNm en los osteoclastos y los osteoblastos, usando el análisis GeneChip para estudiar sí o no la semaforina, efrina, cortes y netrina que son moléculas de guía de axones, contribuyen a la remodelación del hueso. Esto significa que después de analizar 20 tipos de semaforina, 16 tipos de efrina, 6 tipos de cortes y 6 tipos de netrina, se confirmó una manifestación extremadamente alta de semaforina 4D en los osteoclastos.

Mientras tanto, esta manifestación no se confirmó en los osteoblastos. Estos resultados indican que la semaforina 4D tuvo una manifestación inducida selectivamente en el proceso de formación de osteoclasto.

Se llevó a cabo un análisis funcional del sistema esquelético usando ratones Sema4d-/- para estudiar la función de la semaforina 4D con una manifestación; inducida selectivamente en el proceso de formación de osteoclasto. La cantidad ósea (Figura 1) y el ancho trabecular (Figura 2) en los ratones Sema4d-/- se mostró que aumentó significativamente comparado con los ratones de tipo silvestre (ratones WT) usando el análisis µ?? y osteomorfogénesis . El área superficial de la osteogénesis en los ratones Sema4d-/- (Figura 3, a la izquierda), el área superficial del hueso calcificado (Figura 3, a la mitad) y la velocidad de osteogénesis (Figura 3, a la derecha) aumentó visiblemente comparado con los ratones de tipo silvestre. Sin embargo, no existieron cambios en los parámetros (áreas superficiales de osteoclastos (Figura 4, a la izquierda), el número de osteoclastos (Figura 4, centro) y el área superficial del hueso corroído (Figura 4, a la derecha) , que indica la resorción ósea de los osteoclastos . También se observó que la formación de osteoclasto in vitro en las células Sema4d-/- fue normal. A pesar del hecho de que la semaforina 4D se manifestó específicamente en los osteoclastos, estos resultados sugieren que aumentó el fenotipo de la alta densidad ósea en los ratones Sema4d-/-debido a la osteogénesis a través de los osteoblastos .

Se 'llevó a cabo un injerto celular inmune adoptivo usando las células de la médula ósea, las cuales -incluyeron las células precursoras de osteoclastos, para encontrar sí o no el fenotipo óseo de los ratones Sema4d-/- se básó en anormalidades en el sistema de células de la médula ósea. Como resultado, aumentó la cantidad ósea cuando se injertaron células de la médula ósea en los ratones silvestres, comparado con cuando se injertaron células de la médula ósea de tipo silvestre (ver las dos gráficas a la izquierda en la Figura 5) . Mientras tanto, cuando se injertaron células de la médula ósea de tipo silvestre en los ratones Sema4d-/-, la cantidad ósea disminuyó y regresó a la normal, comparado cuando se injertaron células de la médula ósea deficientes de Sema4d (ver los dos párrafos a la derecha en la Figura 5) . Con base en estos resultados, se indicó que el fenotipo óseo en los ratones Sema4d-/- fue tal que fueron la causa de las anormalidades en las células del sistema hematopoyético que comprenden los osteoclastos . Además, no se confirmó ün aumento de corte evidente en los osteonodos de las células calváricas de Sem4d-/- en la osteonodosidad de las células calváricas Sema4d-/-. Estos resultados sugieren que la semaforina 4D, la cual se manifiesta en los osteoclastos, funciona como un factor de remodelación ósea que inhibe la osteogénesis por medio de los osteoblastos.

Se produjo Fc-sema4D (I. Ishida et al., Int Immunol 15, 1027 (agosto de 2003) para estudiar en detalle el. efecto de inhibición de la semaforina 4D en los osteoblastos. Luego, se adicionó Fc-sema4D a las células calváricas que se "habían cultivado bajo condiciones de osteogénesis. La adición1 de Fe- sema4D inhibió la activación dependiente de la concentración de ALP y la manifestación de osteocalcina [Bglap] y colágeno de tipo I [Collal] ) . Estos resultados indican que la osteonodosidad se inhibe como resultado de la diferenciación inducida por Sema4D de los osteoblastos . También se cultivaron las células calváricas en presencia del sobrenadante de cultivo de los osteoclastos o en presencia de los osteoblastos para ver sí o no el derivado de semaforina 4D de los osteoclastos contribuyó a la regulación de la osteogénesis . En el cultivo de articulaciones con el sobrenadante de cultivo de los osteoclastos de tipo silvestre o con los osteoclastos, no hubo efecto sobre la osteonodosidad, mientras que en el cultivo de la articulación con el sobrenadante de cultivo de los osteoclastos Sema4d-/-o en el cultivo de articulación con los osteoclastos, la osteonodosidad se aceleró claramente. Con base en estos resultados, los osteoclastos se indican como inhibidores de la osteogénesis por medio de la semaforina 4D producida como por lo menos parcialmente soluble. También debe visualizarse que uno o más factores están contenidos en el sobrenadante de los osteoclastos. El efecto de aceleración de la osteogénesis ocasionado por estos factores, se cree que sobres-ale al máximo cuando no está presente la semaforina 4D.

Se analizó (a) la manifestación de la plexina tipo B, la cual es bien conocida como un receptor de semaforina 4D en las células no linfáticas y las células linfáticas y (b) el ARN de CD72 (K. Suzuki, A. Kumanogoh, H. Kikutani, Nat Immunol 9, 17 (enero de 2008) usando RT-PCR cuantitativo en tiempo real para especificar el receptor de semaforina 4D, en donde se manifiestan los osteoblastos . Como resultado, la cantidad de plexina Bl manifestada aumentó notoriamente durante la diferenciación de osteoblastos (Figura 7) . Mientras tanto, la cantidad de plexina B2 manifestada fue bastante baja y virtualmente no hubo manifestación de plexina B3 y CD72 (Figura 7) . Después de llevar a cabo el análisis de disminución usando Fc-sema 4D, se indicó que la semaforina 4D interactuó con la plexina Bl (Figura 8) . También se indicó que la Fc-sema 4D induce la fosforilación de la plexina Bl . Es bien conocido que cuando la semaforina 4D se une con la plexina Bl, se forma un conjugado con la tirosina cinasa ErbB2 y ErbB2 fosforoliza por sí misma y la plexina . Bl es dependiente de la semaforina B4. En la osteogénesis , después de inhibir la activación de la cinasa ErbB2 , la fosforilación disminuye, dependiendo de la estimulación de semaforina 4D de la plexina Bl . Con base en estos resultados, se sugiere que la plexina Bl actúa como el receptor principal para la semaforina 4D en los osteoblastos. Después, se analizó el fenotipo óseo de los ratones Plxbl-/-. Como los ratones Sema4d-/-, la cantidad ósea (Figura 9) y el ancho de la trabécula (Figura 10) de los ratones Plxnbl-/¡- aumenta notablemente, comparado con los ratones de tipo silvestre debido a un aumento en la osteogénesis de osteoblastos. El área superficial de los osteoblastos en los ratones Plxnbl-/-(Figura 11) , el área superficial del hueso calcificado (Figura 12) y la velocidad de osteogénesis (Figura 13) también aumentó respectivamente, comparado con los ratones de tipo silvestre. Sin embargo, no hubo un cambio en los parámetros (área superficial de los osteoclastos, conteo celular de osteoclastos y corrosión del área superficial ósea) que indican la resorción ósea en los osteoclastos. Con base en estos resultados, se sugiere que el fenotipo de densidad ósea alta de los ratones Plxnbl-/-, como el fenotipo de la alta densidad ósea de los ratones Sema4d-/-, es causado por el aumento en la osteogénesis ocasionada por los osteoblastos. No se confirmó el efecto de estimulación con los osteoclastos Semd4d-/- sobre la osteonodosidad por los osteoblastos confirmados por los osteoclastos Sema4d-/- de tipo silvestre. Por lo tanto, esto sugiere que la plexina Bl reconoce la osteogénesis principalmente a través de la semaforina 4D.

¿Cómo se transforma la semaforina 4D-plexina Bl a las señales de inhibición en los osteoblastos? Es bien sabido que el sistema de semaforina-plexina regula la osteomorfogénesis y la migración celular mediante la regulación del rearreglo de las células de actina óseas. También es sabido que , cuando la semaforina 4D se combina con la plexina B2 , la actividad de RhoA se estimula en presencia de la tirosina cinasa ErbB2 , mientras que la semaforina 4D tiene una acción contadora en presencia de otra tirosina cinasa Met (J.M. Swiercz, T. Worzfeld, S. Offermanns, J Bio Chem 283, 1893 (25 de enero de 2008) . Por lo tanto, se estudió la posibilidad de la semaforina 4D que activa RhoA. Cuando se analizó la cantidad de ErbB2 y Met manifestada en la osteogénesis , se sugirió que EbrB2 se manifestó en cantidades considerablemente mayores que el Met. Aunque la estimulación de semaforina 4D indujo la fosforilación del ErbB2 , no se indujo la fosforilación de Met. Además, con base en el análisis de inmunoteñido y el análisis de disminución, la semaforina 4D aumentó el GTP que combina el tipo de activación para RhoA y se indica que esta actividad se inhibe particularmente por las células Plxnbl-/0. Mientras tanto, la actividad de Racl, el cual es otra familia de Rho, no afectó la estimulación de semaforina 4D. Coincidiendo con estos resultados, cuando se introduce un RhoA de tipo de activación estructurada usando un adenovirus, se inhibió la osteonodosidad en las células calváricas, mientras que cuando se introdujo un RhoA negativo dominante, se acéleró la osteonodosidad. Mientras tanto, Racl de tipo de activación estructurada y Racl negativo dominante, no afectó la osteogénesis. Con base en estos resultados, se sugiere que RhoA media selectivamente el efecto de inhibición para la osteogénesis de la seraaforina 4D, plexina Bl. La plexina Bl tiene dos dominios de regulación RhoGTPasa, esto es, un dominio de la proteína de activación GTPasa (GAP) y un dominio de unión POZ, el cual une a Rho-GEF (I. Oinuma, Y. Ishikawa, H. Katoh, M. Negishi, Science 305, 862 (6 de agosto de 2004), J.M. Swiercz, R. Kuner, J. Behrens, S. Offermanns, Neuron 35, 51 (3 julio de 2002) , V. Perrot, J. Vázquez-Prado, J.S. Gutkind, J Bio Chem 277, 43115 (8 de noviembre de 2002), M.H. Driessens, C. Olivo, K. Nagata, M. Inagaki, J.G. Collard, FEBS Lett 529, 168 (9 de octubre de 2002) . Con base en el análisis de disminución y el análisis de inmunoteñido, POZ-RhoGEF y LARG (RhoGEF asociado a leucemia) que se conocen como Rho-GEG se indicaron como unión con la plexina Bl, aun en los osteoblastos . Por lo tanto, el dominio GAP mencionado anteriormente y el dominio de unión POZ produjo dos tipos de mutantes de plexina Bl (Plexina Bl-? POZ y Plexina Bl · RA) para determinar si la osteoporosis se inhibió significativamente (I. Oinuma, Y. Ishikawa, H. Katóh, M. Negishi, Science 305, 862 (6 de agosto de 2004) (Figura 14) . Después, los dos tipos de mutantes de plexina Bl y la plexina Bl de tipo silvestre (W · Plexina · Bl) se 'usaron respectivamente para producir células calváricas Plxnbl-/-con una manifestación en exceso, se estimularon éstas usando Fe-sema 4D y se evaluó el efecto de inhibición de diferenciación de osteoblastos. El efecto de inhibición de Fc-Sema4d indicado en la manifestación de ARNm de los marcadores de osteoblastos (Alpl, Bglap y Collal) se recuperó en la manifestación en exceso de WT-Plexina Bl y PlexinaBl-RA, sin embargo, no se recuperó en la manifestación en exceso de PlexinaBl-? PDZ . Estos resultados sugieren que RhoA media la inhibición de la osteogénesis específicamente por la semaforina 4D.

Se cruzaron ratones transgénicos CAT-RHoA DN (K. Kobayashi et al., J. Neurosci 24, 3480 (7 de abril de 2004) y ratones transgénicos de colágeno a 1 (l)-Cre (R. Dacquin, M. Starbuck, T. Schinke, G. Karsenty, Dev. Dyn 224, 245 (junio de 2002)) y los ratones producidos, en los que RhoA negativo dominante se manifestó específicamente (RhoA DNOB) en los osteoblastos para estudiar el papel de RhoA en los osteoblastos in vivo. Aumentó la cantidad ósea (Figura 15) y el ancho de la trabécula (Figura 16) de los ratones RhoA DNOB, comparado con los ratones de tipo silvestre, cuando la osteogénesis se aceleró por los osteoblastos. Además, el área superficial de los osteoblastos (Figura 17) de los ratones RhoA ONOB, el área superficial del hueso (Figura 18) :qüe ha calcificado y la velocidad de osteogénesis (Figura 19) aumentaron notablemente, comparado con los ratones de tipo silvestre, sin embargo, no existieron cambios en los parámetros que indicaran la resorción ósea' d los osteoclastos (área superficial de los osteoclastos, número de osteoclastos y el área superficial del hueso corroído) . El fenotipo óseo fue el mismo que el fenotipo óseo para los ratones Sema4d-/- y Plxbl-/-. Ya que aumentó la manifestación de RhoA ONOB durante la diferenciación de osteoblastos , la manifestación de la osteonodosidad y los genes marcadores de de osteoblastos (Alpa, Bglap and Collal) aumentó considerablemente en las células calváricas que se originan en los ratones RhoA DNOB . La osteonodosidad que aumentó en las células RhoA DNOB no se inhibió por Fc-sema4d, de modo que se sugiere que RhoA media las señales de inhibición en la dirección 3' de la semaforina 4D-plexina Bl .

Para estudiar sí o no la inhibición de la función de Sema4D fue efectiva para la osteoporosis , se llevó a cabo la validación usando ratones modelo con osteoporosis después de la menopausia, tratados para OVX (ovarios retirados) . Esto significa que se administraron intravenosamente los anticuerpos anti-Sema4D en los ratones sobre una: base semanal, después del tratamiento de OVX y se estudió si hubo un efecto preventivo para una disminución en la cantidad ósea. Después de analizar el te ido óseo, la cantidad ósea disminuyó cuando no se administraron los anticuerpos anti-Sema4d, mientras que cuando se administraron los anticuerpos Sema4d, se confirmó la aceleración en la osteogénesis (aumento en el área superficial de osteoblasto [Figura 20] , la cantidad ósea [Figura 21] y la velocidad de osteogénesis [Figura 22] y la disminución de los intervalos trabeculares [Figura 23] . Mientras tanto, no hubo cambios en los parámetros que indican la resorción ósea de los osteoclastos (número de osteoclastos y área superficial del hueso corroído) . Con base en estos resultados, cuando se inhibe la función de la semaforina 4D por el tratamiento de anticuerpos anti-Sema4D, se indica un efecto preventivo sobre la disminución en la cantidad ósea en la osteoporosis . También se estudió sí o no la inhibición funcional de la semaforina 4D fue efectiva aun para el tratamiento de la cantidad ósea que ya se había disminuido. Esto significa que después del tratamiento OVX, se administraron los anticuerpos anti-Sema4d de la vena caudal durante tres veces una semana, 6 semanas después de que había disminuido la cantidad ósea. Los resultados para analizar los parámetros que indican la osteogénesis (área superficial de los osteoblastos , aumento en la cantidad ósea, aumento en la velocidad de osteogénesis y disminución en los intervalos trabeculares) confirmaron la aceleración en la osteogénesis (aumento en el área superficial del osteoblasto [Figura 26] , cantidad ósea [Figura 27] y velocidad de osteogénesis [Figura 28] y disminución én los intervalos trabeculares [Figura 29] ) . Por lo tanto, llegó a ser claro que una vez que la cantidad ósea había disminuido, ésta regresó al mismo nivel que ^ cuando se administraron los anticuerpos Sema4D sobre una base semanal después del tratamiento OVX mencionado anteriormente. Esto significa que hubo un retorno al mismo nivel que cuando se previno la disminución en la cantidad ósea. Mientras tanto, no hubo cambios en los parámetros que indican la resorción ósea de los osteoclastos (área superficial del hueso corroído) . También se estudió el efecto de la inhibición funcional de la semaforina 4D y plexina Bl sobre la osteonodosidad . Cuando se usaron los osteoblastos del ratón y los osteoclastos de ratones WT, se aceleró la osteonodosidad como una función de la concentración de los anticuerpos anti-Sema 4D (placas 1 a 3 de la izquierda en el panel superior de la Figura 24) . Mientras tanto, la osteonodosidad que se inhibió por Fc-Sema4d se aceleró como una función de la concentración de los anticuerpos anti-plexina Bl (panel inferior en la Figura 24) . Con base en estos resultados, cuando se inhibe la interacción de semaforina 4D-plexina Bl por el tratamiento de anticuerpos anti-Sema4d o por el tratamiento de anti-plexina Bl, no sólo es inhibida la disminución en la cantidad ósea en la osteoporósis , sino también se indica un efecto que promueve un aumento en la cantidad ósea. También se estudió el efecto de la inhibición funcional de l semaforina 4D en los osteoblastos humanos sobre la osteonodosidad. Esto significa que cuando se llevó a cabo la validación usando los osteoclastos que se habían diferenciado de las células positivas CD14 derivadas de monocitos . de sangre periférica humana (Figura 25, fila inferior) y el sobrenadante de la misma (Figura 25, fila superior) y cuando se adicionó a los osteoclastos y su sobrenadante de cultivo y se adicionaron los anticuerpos anti-Sema4d a los osteoblastos , se aceleró la osteonodosidad como una función de la concentración de los anticuerpos anti-Sema 4d (Figura 25) . Estos resultados indican que los resultados en los ratones del modelo de osteoporosis post-menopáusico descrito anteriormente, se soportaron en las células humanas y que la inhibición de la interacción de semaforina 4D-plexina Bl es una nueva estrategia para promover la osteogénesis .

Se realizó un análisis detallado de la acción de la inhibición de la diferenciación de los osteoblastos de semaforina RD. Esto significa que cuando se comparó el número de células hematopoyéticas en la médula ósea · (Sca-1 +CD105+CD106+CD44+CD4 , 2-CDllb) en los ratones Sema4d-/- con los ratones de tipo silvestre llevando a cabo el análisis de citometría de flujo, no existieron diferencias. También se llevó a cabo el análisis de diferenciación celular y aunque hubo un aumento debido a Sema4d antes de la diferenciación de los osteoblastos (Día ?) , no hubo cambios debido' a la estimulación de semaforina 4D en el proceso de diferenciación de osteoblastos (Día 14). Además, con base en el análisis CFU, la osteogénesis indicada en la manifestación ALP y la alizarina se inhibió debido a la estimulación de la semaforina 4D. Estos resultados sugieren que la semaforina 4D actúa en las etapas de diferenciación de los osteoblastos.

La señales del sustrato receptor de insulina (IRS, por sus siglas en inglés) causadas por los factores de crecimiento similares a insulina (IGF, por sus siglas en inglés) -1 se conoce que aceleran la diferenciación de los osteoblastos. Por lo tanto, se estudió la fosforilación Akt y ERK que se relaciona con las señales de IRS con la estimulación de semaforina 4D y el nivel de fosforilación disminuido. También disminuyó la fosforilación Tyr, la cual es el indicador de la activación de IRS. Estos resultados sugieren que la estimulación de semaforina 4D disminuye las señales IRS. También es claro que RhoA de tipo activado disminuye la fosforilación de Akt y ERK y por el contrario, Y-27632 y RIG que son inhibidores de RhoA promueven esta fosforilación. También es claro que el inhibidor de RhoA induce la promoción de la fosforilación de tipo activación en las señales de IRS. Estos resultados sugieren que la semaforina 4D induce una disminución en las señales IRS activando RhoA e inhibe la diferenciación de osteoblastos. Sumario Con base en los experimentos mencionados anteriormente, se identificó la semaforina 4D derivada de osteoclastoe como un mediador extremadamente importante para la transmisión entre los osteoclastos-osteoblastos en la reconstrucción ósea. La reconstrucción ósea se lleva a cabo en ciclos realizados de tres etapas (comenzando de la resorción ósea debida a los osteoclastos , transición a una nueva osteogénesis debida a los osteoblastos y completar la nueva síntesis ósea (K. Matsuo, N. Irie, Arch Biochem Biophys 473, 201 (mayo de 2008) . Semar4d, que se manifiesta en los osteoclastos funciona hasta el momento que se completa la resorción ósea como un factor de inhibición de la osteogénesis en la etapa inicial, en la que se inhibe la diferenciación de los osteoblastos. Además, la activación de RhoA también se indica que inhibe la osteogénesis de osteoblastos in vivo. EfrinaB2/EphB4 indicada por contribuir a la etapa de transición, también hace uso de Rho A para regular la osteogénesis (C. Zhao et al., Cell Metab 4, 111 (agosto de 2006) lo que sugiere que la GTPasa molecular inferior de la familia Rho actúa como un coordinador para la transmisión simple de reconstrucción ósea. GEF Arfgef 12 específico de RhoA que contiene PDZ (LARG) (J.M. Swiercz, R. Kuner, J. Behrens, S. Offermanns, Neuron 35,51 (3 de julio de 2002); V. Perrot, J. Vázquez-Prado, J.S. Gutkind, J Bio Chem 277, 43115 (8 de noviembre de 2002)) se ha indicado por tener una alta manifestación en los osteoblastos en el análisis GeneChip . Estos resultados retroceden la importancia de la ruta de semaforina 4D-plexina Bl-RhoA. Además, con base en el análisis usando teñido inmunofluorescente , se ha observado una regulación en la dirección 3' para la cadherina 11 después de la estimulación Fc-ema Rd y se sugiere la contribución de la unión de espacio regulado. El tratamiento intermitente de la hormona paratiroides (PTH, por sus siglas en inglés) es el único método efectivo que se ha probado que aumenta la osteogénesis . Los anticuerpos anti-Sost que están actualmente en desarrollo, han adquirido la atención como un nuevo agente de osteogénesis, mientras que los factores que dirigen los anticuerpos relacionados con la ruta de semaforina 4D-plexina Bl-RhoA y los inhibidores y similares, pueden expresarse como nuevos agentes terapéuticos para los pacientes con osteopenia.

Aplicabilidad industrial La presente invención puede usarse para efectuar la aceleración de la osteogénesis y la prevención y tratamiento de las enfermedades óseas.

Tabla de Secuencias Solicitud de patente Pll-0052011-108642_0. app Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Agente de aceleración de la osteogénesis , caracterizado porque tiene como ingrediente activo una sustancia que inhibe la unión de semaforina 4D y plexina Bl .

2. Agente de aceleración de osteogénesis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia de inhibición de la unión es un anticuerpo de anti - semaforina 4D.

3. Agente de aceleración de osteogénesis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia de inhibición de la unión es un anticuerpo de anti-plexina Bl o una proteína que contiene regiones extracelulares de plexina Bl .

4. Agente para la prevención y tratamiento de las enfermedades óseas, caracterizado porque tiene, como el ingrediente activo, una sustancia que inhibe la unión' de la semaforina 4D y plexina Bl .

5. Agente para la prevención y tratamiento de las enfermedades óseas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la sustancia de inhibición de la unión es un anticuerpo anti-semaforina 4D.

6. Agente para la prevención y tratamiento de las enfermedades óseas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la sustancia de inhibición de la unión es un anticuerpo de anti-plexina Bl o una proteína que contiene regiones extracelulares de plexina Bl.

7. Agente para la prevención y tratamiento de las enfermedades óseas como se describe de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque las enfermedades óseas se seleccionan de fractura de hueso, deficiencia ósea, osteoporosis , osteomalacia, osteopenia, dolor lumbar, enfermedad de Paget de huesos, mielitis tónica, reumatismo articular y artrosis deformativa.

8. Método para usarse en la determinación de un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de osteogénesis , caracterizado porque se determina si una sustancia que es estudiada es una sustancia que inhibe la unión entre la semaforina 4D y plexina Bl, y si la sustancia mencionada anteriormente que es estudiada, es la sustancia mencionada anteriormente que inhibe la unión, la sustancia mencionada anteriormente que es estudiada se determina como un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de la osteogénesis.

9. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el método para usarse en la determinación de si una sustancia que es estudiada es una sustancia que inhibe la unión entre la' semaforina 4D y plexina Bl, consiste de las siguientes etapas (A) a (D) : (A) una etapa en donde la semaforina 4D y la plexina Bl se ponen en contacto entre sí, en presencia de la sustancia que está siendo estudiada; (B) una etapa en donde se mide el grado de unión entre la semaforina 4D y la plexina Bl; (C) una etapa en donde el grado medido en la etapa (B) anterior, se compara con el grado cuando no está siendo estudiada la presencia de la sustancia; (D) una etapa en donde la sustancia que es estudiada se determina que es una sustancia que inhibe la unión entre la semaforina 4D y la plexina Bl, cuando el grado medido en la etapa (B) anterior es menor que el grado cuando no está siendo estudiada la presencia de la sustancia.

10. Método para seleccionar un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de la osteogénesis, caracterizado porque los métodos descritos de conformidad con las reivindicaciones 8 ó 9, se usan para buscar sustancias que se estudian para un ingrediente activo candidato para un agente de aceleración de la osteogénesis.