KR20120058956A - Ｈｖｅｍ억제제를 유효성분으로 포함하는 골분화 또는 골생성 증진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HVEM 억제제를 유효성분으로 포함하는 골분화 및 골생성 증진용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 본 발명은 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제 또는 HVEM 단백질의 활성 억제제를 포함하는 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물, 골질환의 발병을 예측 또는 진단하는 방법, 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법 및 골분화 또는 골형성 촉진방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 동물모델을 대상으로 HVEM 유전자가 결핍된 마우스의 경우, HVEM 유전자가 발현하는 대조군 마우스에 비해 골 질량 및 골 형성이 증가하며 골분화가 촉진될 뿐만 아니라 골의 재흡수가 감소된다는 사실을 확인함으로써 본 발명에 따른 HVEM 유전자의 발현 억제제 또는 HVEM 단백질의 활성 억제제는 골분화 또는 골형성이 요구되는 골질환의 치료제로서 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

ＨＶＥＭ억제제를 유효성분으로 포함하는 골분화 또는 골생성 증진용 조성물{Composition of osteogenic differentiation or osteogenesis comprising inhibitor of HVEM}

본 발명은 HVEM 억제제를 유효성분으로 포함하는 골분화 및 골생성 증진용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물, 골질환 치료제를 스크리닝 하는 방법 및 시험관 내에서 골분화 및 골생성을 촉진시키는 방법에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생 하면서 균형을 유지하게 되는데, 이를 골재형성(bone remodeling)이라고 한다. 또한, 오래된 뼈는 제거되고 새로운 뼈로 대체하는 뼈의 순환(turnover)은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이라고 할 수 있다.

골재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있는데, 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 뼈를 생성하는 조골세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand)와 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성하며, RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK에 결합하면 파골 전구 세포가 파골세포로 성숙화(maturation)되어 골흡수(bone resorption)가 일어난다. 그러나 OPG가 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 필요 이상의 골 흡수가 일어나지 않게 된다. 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 혈액세포(조혈모세포)에서 생기는 파골세포에 의해 이루어지며 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다. 한편 뼈세포에서 생성된 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침척물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건한다. 뼈가 파괴되기 시작하여 다시 새로운 뼈로 재형성되기까지는 약 100일 정도 걸리는데, 유아에서는 1년 내에 뼈의 칼슘이 100% 바뀌지만 성인에서는 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다.

한편, 최근에는 의학의 발달과 식생활의 향상으로 인간의 평균수명이 늘어남에 따라 한국도 최근 고령화 사회로 진입하면서 노령화된 인구와 관련된 질환, 예컨대 골다공증, 골관절염(osteoarthritis) 및 골결손 질환과 같은 뼈 질환이 급증하면서 사회적으로 큰 관심사가 되고 있는데, 실제로 이와 같은 골질환 치료와 관련되어 전 세계적으로 약 1,300억 달러 이상의 시장이 형성되어 있고, 그 규모는 향후 계속적으로 증가할 것으로 예상되기 때문에 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.

현재 개발되어 사용되고 있는 골질환 치료제들 중, 골다공증을 예로 들어 살펴보면 골다공증 치료제로 사용되고 있는 물질로는 에스트로겐(estrogen), 앤드로제닉 아나볼릭 스테로이드(androgenic anabolic steroid), 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D3 등이 있고, 1995년 미국 머크사에서는 아미노비스포스포네이트(aminobisphosphonate)를, 1997년 미국 릴리사 (Lilly Co.)에서는 선택적인 에스트로젠 수용체 조절기(selective estrogen receptor modulator, SERM)로서의 역할을 하는 라록시펜(raloxifene)을 골다공증 치료제로 개발한 바 있다.

그러나 현재 개발되어 사용되고 있는 치료제들 대부분의 경우, 혈전증, 담석증, 고혈압, 부종 등 부작용이 발생하고 있는데, 예컨대, 에스크로겐의 경우, 여성 환자들을 추적 관찰한 결과, 유방암, 뇌졸중, 폐색전 등의 발생률이 높다는 것이 증명된 바 있으며, 이외에도 비스포스포네이트 제제(알렌드로네이트, 에티드로네이트), 비타민 D 제제, 칼시토닌 제제 또는 칼슘 제제 등이 골다공증 치료제로서 사용되나, 비스포스포네이트 제제는 흡수율이 떨어지며 복용방법이 까다롭고 식도염을 유발시키는 문제점이 있을 뿐만 아니라, 비타민 D 제제는 고가이며 효과가 확실하지 않고, 칼시토닌 제제는 고가이며 투여방법이 용이하지 않으며, 칼슘제제는 부작용은 적지만 치료보다는 예방효과에 국한되는 단점이 있다.

따라서 이러한 골질환의 경우, 약물의 단기 투여만으로는 완벽한 치료효과를 볼 수 없으며, 장기 투여가 필수적이나, 장기 투여에 따른 부작용의 문제가 발생하고 있어, 약물을 장기 투여함에도 불구하고 상기와 같은 부작용이 없으며, 기존의 치료물질을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 동물모델을 대상으로 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자가 결핍된 마우스를 제조한 경우, HVEM이 발현되고 있는 마우스에 비해 골분화가 촉진되고 골형성이 증가된다는 사실을 확인함으로써 HVEM의 발현을 억제시킬 수 있는 물질의 경우, 이를 골분화 및 골형성 촉진제로 사용할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 본 발명은 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제 또는 HVEM 단백질의 활성 억제제를 포함하는 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 골질환의 발병을 예측 또는 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 다른 목적은 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 골분화 또는 골형성 촉진방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제 또는 HVEM 단백질의 활성 억제제를 포함하는 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제는 서열번호 1로 표시되는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제는 골량 증가, 골형성 촉진, 골흡수 억제 또는 골분화 촉진 작용을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골질환은 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은,

(a) 생물학적 시료에 존재하는 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현양 또는 HVEM 단백질의 양을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 HVEM 유전자의 발현양 또는 HVEM 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 골질환의 발병을 예측 또는 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄 반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA:radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은,

(a) HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자 또는 HVEM 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;

(b) 상기 HVEM 유전자의 발현양, HVEM 단백질의 양 또는 HVEM 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, HVEM 유전자의 발현양, HVEM 단백질의 양 또는 HVEM 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 골질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 골분화 또는 골형성 촉진방법을 제공한다.

본 발명에서는 동물모델을 대상으로 HVEM 유전자가 결핍된 마우스의 경우, HVEM 유전자가 발현하는 대조군 마우스에 비해 골 질량 및 골 형성이 증가하며 골분화가 촉진될 뿐만 아니라 골의 재흡수가 감소된다는 사실을 확인함으로써 본 발명에 따른 HVEM 유전자의 발현 억제제 또는 HVEM 단백질의 활성 억제제는 골분화 또는 골형성이 요구되는 골질환의 치료제로서 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 HVEM 유전자가 결핍된 마우스(HVEM -/-) 및 HVEM 유전자가 발현되는 마우스(HVEM +/+)를 대상으로 골질량을 비교 분석한 결과를 나타낸 것으로서,
도 1a는 10 주령의 HVEM -/- 마우스 및 HVEM +/+ 마우스 대퇴골에 대한 2차원 CT 촬영을 수행한 결과를 나타낸 도면이며, 이때 상부쪽 도면은 대퇴골 말단의 성장 플레이트로부터 0.7mm에 해당하는 부위를 나타낸 것이고, 하부쪽 도면은 2.3mm에 해당하는 부위를 나타낸 것이다.
도 1b는 HVEM -/- 마우스 및 HVEM +/+ 마우스의 오른쪽 대퇴골 대상으로 BMD를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 1c는 BMC를 측정한 결과를 나타낸 것이며, 도 1d는 cortical BMD의 측정 결과를 나타낸 것이고, 도 1e는 cortical BMC의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 1f는 HVEM -/- 마우스 및 HVEM +/+ 마우스의 혈청에 존재하는 CTX-1의 수준을 ELISA 방법을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이고, 도 1g는 PINP의 양을 도 1h는 TRACP 5b의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 HVEM -/- 마우스 및 HVEM +/+ 마우스의 BMSC(bone marrow stromal cell)를 골분화 유도용 배지에서 18일 및 21일간 각각 배양한 후, 골분화 정도를 골분화 표지마커인 ALP(alkaline phosphatase)의 양을 측정하여 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제 또는 HVEM 단백질의 활성 억제제를 포함하는 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 골손실에 의해 유도되는 많은 골질환의 치료방법을 찾기 위해 연구하던 중, 골분화 또는 골형성 기작에서 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자가 매우 중요한 조절자로서의 역할을 한다는 사실을 본 발명에서 최초로 규명하였는데, 그 동물모델, 즉 마우스를 대상으로 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현을 결핍시켰을 경우, HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자가 발현되는 대조군 마우스에 비해 골 분화, 골 질량 및 골 형성작용이 촉진되는 사실을 규명하였다.

본 발명에서 관심대상이 된 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 경우, 이는 RANK와 같이 TNFR의 페밀리(family) 구성원 중 하나로서, Herpes simplx virus(HSV) 1DML 수용체로 동정되었다. 그러나 HVEM는 대부분의 TNFR 페밀리와는 달리 TNF 페밀리 리간드, LIGHT 또는 림포톡신 알파(lymphotoxiz a) 뿐만 아니라 면역글로블린 도메인을 갖는 HSV 타입 1 글리코프로테인 D(HSV 1gD), B 또는 T-lynphocyte attenuator(BTLA)와 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 LIGHT는 HVEM, 림포톡신 베타 수용체 또는 decot 수용체(DcR3/TR6)와 결합하는 다수의 파트너를 가지고 있으며, 이때 DcR3의 과발현은 골질량을 감소시키며, LIGHT는 골파괴를 촉진시키는 작용을 한다고 밝혀진 바 있다.

그러나 아직까지 HVEM(Herpesvirus-entry mediator)이 골분화 및 골형성 과정에서 어떤 역할을 하고 있는지에 구체적으로 알려진 바가 없다.

따라서 본 발명의 일실시예에서는 골분화 및 골형성에서의 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 역할을 규명하기 위해, HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자가 결핍된 마우스 동물모델을 제작한 후, HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자가 발현되는 대조군 마우스와 함께 골분화, 골형성, 골질량에 대한 비교 분석을 수행하였다.

구체적으로, 본 발명의 일실시예에 따르면, 세포 내에서 HVEM의 결핍이 골 재형성에 영향을 주는지 확인하기 위해 HVEM 결핍된 마우스 및 HVEM 발현 대조군 마우스를 대상으로 골 재형성 마커인 CTX-1(serum C-telopeptide fragment of collagen type I), PINP(serum N-terminal propeptide of type I procollagen) 및 혈청 TRACP 5b의 발현 정도를 각각 비교한 결과, HVEM 결핍 마우스의 대퇴골에서는 대조군 마우스의 대퇴골에 비해 골질량이 증가하는 것으로 나타났고(도 1a 참조), 섬유질 및 피질 대퇴골의 미네랄 농도(BMD; bone mineral density)도 대조군에 비해 증가한 것으로 나타났으며(도 1b 및 1c 참조), 골 형성 마커인 혈청내 PINP의 양도 증가한 것으로 나타났다. 반면, 골 재흡수의 마커인 혈청의 CTX-1는 HVEM 결핍 마우스의 경우, 대조군에 비해 감소하는 것으로 나타났다(도 1f 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 in vivo 내에서 HVEM 유전자의 발현이 결핍될 경우, 골질량 및 골형성(골생성)이 증가한다는 사실을 알 수 있었다.

이와 같은 사실을 다음과 같은 실시예를 통해서도 확인할 수 있었는데, 즉, 본 발명에 따른 다른 일실시예에 따르면, HVEM 유전자의 발현이 결핍된 마우스와 대조군 마우스를 대상으로 상기 마우스로부터 각각 BMSC(bone marrow derived mesenchymal cell)를 분리하고, 골분화 자극에 따른 골형성 정도를 비교한 결과, 골분화 마커인 알칼라인 포스파타제(ALP)가 대조군에 비해 HVEM 결핍 마우스 유래의 BSMC를 분화시켰을 경우 ALP의 양이 더 증가한 것으로 나타났다(도 2 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 세포 내에서 HVEM 유전자의 발현을 억제시키거나 HVEM 단백질의 활성을 억제시킬 경우, 골형성을 촉진시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명을 통해 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 억제제 또는 HVEM 단백질의 활성을 억제할 수 있는 억제제의 경우 골의 분화 및 골 형성을 촉진시킬 수 있다는 사실을 확인함으로써, 본 발명은 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제 또는 HVEM 단백질 활성 억제제를 포함하는 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제는 서열번호 1로 표시되는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA을 포함할 수 있다.

또한, 상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제 또는 는 HVEM 단백질 활성 억제제는 골량 증가, 골형성 촉진, 골흡수 억제 또는 골분화 촉진 작용을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 특히, 본 발명에서 상기 골질환이란 골손상, 골손실 및 골형성 기작에 이상이 생겨 발생할 수 있는 골질환이라면 모두 포함할 수 있으며, 바람직하게는 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 골질환의 예방 또는 치료용 조성물은 골질환의 개선 또는 치료효과를 유도할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있는데, 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 골질환의 치료효과를 극대화할 수 있는 부가의 화학물질, 뉴클레오티드 또는 천연물 추출물을 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 상기에서 "유효량" 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물에 포함될 수 있는 유효성분인 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 단백질의 발현 억제제는 바람직하게 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이의 기능적 동등물의 억제, 감소 또는 방해 활성을 갖는 물질이라면 모두 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 HVEM과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 HVEM의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 HVEM의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 lin-28의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 HVEM의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른　단백질과　융합으로만들어진　융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 HVEM 유전자자를 이용하여 골질환의 발병을 예측 또는 진단할 수 있는 방법을 제공할 수 있는데, 바람직하게 본 발명에 따른 골질환 발병 예측 또는 진단방법은,

(a) 생물학적 시료에 존재하는 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현양 또는 HVEM 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 HVEM 유전자의 발현양 또는 HVEM 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

여기서 상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현양을 측정하는 방법은 바람직하게 HVEM 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 측정하는 방법일 수 있으며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 HVEM 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 HVEM 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 HVEM 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 상기 "프라이머"란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 HVEM 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.

상기 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기 "프로브"라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 HVEM 단백질의 양을 측정할 수 있는 물질로는 HVEM 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 "항체"를 포함할 수 있다.

상기 HVEM 단백질의 양을 측정할 수 있는 HVEM 단백질에 대한 항체의 경우, 시중에서 판매하고 있는 HVEM 단백질에 대한 항체라면 모두 사용 가능하며 또는 상기 항체를 제조하여 사용할 수 있는데, 항체 제조 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 HVEM 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

이와 같이, HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현양 또는 HVEM 단백질의 양의 측정은 앞서 기재된 HVEM에 대한 프라이머, 프로브 및 항체와 같은 물질을 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직 화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방 법을 이용하여 측정할 수 있다.

바람직하게, 상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현양을 측정하는 방법은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 상기 HVEM 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 HVEM 단백질과 이에 특이적인 항체 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성양은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등을 사용할 수 있다.

나아가 본 발명은,

(a) HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자 또는 HVEM 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 HVEM 유전자의 발현양, HVEM 단백질의 양 또는 HVEM 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, HVEM 유전자의 발현양, HVEM 단백질의 양 또는 HVEM 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 골질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 먼저 HVEM 유전자 또는 HVEM 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기 "시료"는 HVEM 유전자의 발현양, HVEM 단백질의 양 또는 HVEM 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 HVEM 유전자의 발현양, HVEM 단백질의 양 또는 HVEM 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, HVEM 유전자의 발현양, HVEM 단백질의 양 또는 HVEM 단백질의 활성이 감소된 것이 측정되면 상기 시료는 골 질환을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.

상기에서 HVEM 유전자의 발현양, HVEM 단백질의 양 또는 HVEM 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)등을 이용하여 수행할 수 있다.

뿐만 아니라 본 발명은 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물의 골분화 또는 골형성 촉진방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자가 결핍된 마우스를 제조하였는데, HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 좌위를 포함하는 마우스 게놈 클론에 대해 타겟팅 벡터에서 HVEM 유전자가 포함된 유전자 부분을 pJNS2의 neo 유전자로 교체후, 이를 ES(embryonic stem cells) 세포로 전기천공법을 이용하여 형질도입 시킨 후, 상기 세포로부터 키메라 마우스를 생산하였고, 이를 번식시켜 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자가 결핍된 B6D2 마우스를 생산하였다. 이렇게 생산된 B6D2 마우스는 HVEM 유전자가 발현되는 마우스에 비해 골분화 및 골형성이 촉진되는 것으로 나타났고, 반면 골 재흡수는 감소되는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명에 따른 골분화 또는 골형성 촉진방법은 본 발명의 일실시예에서 수행한 방법 이외에도 시험관 내에서 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현을 억제할 수 있는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 HVEM에 대한 siRNA 또는 안티센스올리고뉴클레오티드의 사용 등과 같은 방법을 이용할 수 있으며, 또는 시험관 내에서 HVEM 단백질의 활성을 억제 또는 감소할 수 있는 물질을 처리하는 방법을 통해서도 수행할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

HVEM 결핍 마우스의 제작

골형성과 골분화 기작에서 HVEM이 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위해 먼저 다음과 같이 HVEM이 결핍된 마우스를 제작하였다. HVEM mRNA 서열로부터 유래된 HVEM 특이 프로브를 이용하여 129/SvEv 박테리오파지 라이브러리로부터 HVEM 좌위(locus)를 함유한 마우스 게놈성 클론을 분리하였다. 이후, 이러한 클론을 갖는 타겟 벡터에서 인트론 4에 존재하는 KpnI 제한효소 사이트에서부터 인트론 9에 존재하는 HindIII 제한효소 사이트를 이용하여 4.8Kb의 절편을 잘라낸 후, 그 부위에 pJNS에 존재하는 neo gene으로 치환시켰다. 이렇게 제작된 재조합 플라스미드는 전기천공법(electroporate)을 이용하여 배아세포인 ES 세포에 도입시킨 후, 네오마이신 및 간시클로빌(ganciclovir)을 처리하여 이에 대한 저항성을 갖는 균주를 동정하였다. 이후, 저항성을 갖는 클론으로부터 DNA를 추출한 후, KpnI 제한효소로 DNA를 절단한 다음, HVEM 유전자의 하위에 존재하는 프로브를 이용하여 서던 블럿을 수행함으로써 HVEM 유전자의 파괴(결핍)를 확인하였고, HVEM-타겟된 ES 세포주로부터 키메라 마우스를 생산하였으며, 번식시켜 B6D2 마우스를 생산하였다. 자손 마우스의 유전자형은 상기 기술된 프로브를 이용하여 꼬리의 DNA를 대상으로 서던블럿을 통해 분석하였으며, 이형 마우스는 12번 역교배시켜 HVEM이 결핍된 C57BL/6 마우스를 생산하였다. 또한, 하기 실시예들에서 대조군으로는 HVEM이 결핍되지 않은 마우스를 사용하였다.

< 실시예 2>

HVEM 결핍 마우스의 골질량 변화 분석

HVEM 유전자가 골질량 변화에 어떠한 역할을 하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 제작한 HVEM 결핍 마우스와 HVEM 발현 대조군 마우스(실험예 사용한 마우스들은 모두 면역조절연구센터의 무균 동물 사육실에서 사육하였으며, 실험동물운영위원회에서 제공하는 규칙에 따라 취급하였음)로부터 대퇴골과 경골을 분리하였는데 이때 부착된 연조직이 없도록 절개하였고 무균상태로 분리하였다. 분리된 대퇴골과 경골은 10% 포르말린으로 각각 고정시킨 후, 헤마토크실렌 및 에오신으로 염색한 후, GE eXplore Locus SP 시스템(Locus SP; GE Helathcare company, USA)을 이용하여 Micro CT 스캐닝하여 조직학적 분석을 수행하였다. 또한, 3차원 현미경 분석과 뼈 구조의 가시화를 위해, 마우스의 대퇴골을 0.008mm의 검출 픽셀크기로 고정한 후, 고해상 마이크로 CT 이미징 시스템으로 스캐닝하였다. 3D 마이크로 구조분석은 익스플로어 MicroView 2.2에 의해 제공받아 사용하였다.

또한, 본 발명자들은 HVEM 결핍이 골 재형성에 영향을 주는지 확인하기 위해 HVEM 결핍된 마우스 및 HVEM 발현 대조군 마우스를 대상으로 골 재형성 마커인 CTX-1(serum C-telopeptide fragment of collagen type I)를 RatLaps EIA를 이용하여 측정하였고, PINP(serum N-terminal propeptide of type I procollagen)을 컴피티트 EIA를 이용하여 측정하였으며, 혈청 TRACP 5b는 고체상 면역고정의 효소 활성 분석(immunodiagnostic systems Inc)을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 10주 사육한 마우스들의 경우, HVEM 결핍 마우스와 대조군 마우스에서 체중 및 체형의 차이가 유의있게 나타나지는 않았다. 한편 Micro CY 분석 결과, HVEM 결핍 마우스의 대퇴골에서는 대조군 마우스의 대퇴골에 비해 골질량이 증가하는 것으로 나타났고(도 1a 참조), 또한, 섬유질 및 피질 대퇴골의 미네랄 농도(BMD; bone mineral density)도 대조군에 비해 증가한 것으로 나타났다(도 1b 및 1c 참조). 또한, 골 미네랄 함량(BMC: bone mineral content)을 유사한 패턴인 것으로 나타났다.

또한, 뼈 재흡수 마커인 혈청의 CTX-1는 HVEM 결핍 마우스의 경우, 대조군에 비해 감소하는 것으로 나타났고(도 1f 참조), 골형성 마커인 혈청의 PINP는 증가된 것으로 나타났다. 반면 TRACP 5b의 양은 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다(도 1 h 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 in vivo 내에서 HVEM 유전자가 결핍될 경우, 골질량 및 골형성(골생성)이 증가한다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

HVEM 결핍 마우스의 골수 기질세포에서의 골형성 분석

나아가 본 발명자들은 HVEM 결핍 마우스의 경우 HVEM 발현되는 마우스에 비해 골형성이 증가되는 원인을 분자적 메카니즘에서 규명하고자 HVEM 결핍 마우스로부터 BMSC(bone marrow derived mesenchymal cell)를 분리하였고 골분화 자극에 따른 골형성 정도를 대조군 마우스의 BMSC와 비교하여 분석하였다. 즉 이를 위해, 실시예 1에서 제조한 C57BL/6을 배경으로 한 HVEM -/-(KO) 마우스로부터 뼈를 분리한 후, 뼈의 한쪽 끝을 절단하고, RPMI-1640 배지로 멸균된 21-게이지 니들을 이용하여 RPMI-1640 배지로 골수강이 흘러나가도록 하였다. 이후, 골수(bone marrow) 현택액을 조심스럽게 플라스틱 파스테르 피펫으로 피펫팅하여 단일 세포를 수득하였고, 이를 2번 세척한 후, 분리 배지(9% 소태아혈청, 9% 말혈청, 100u/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신, 12uM L-글루타민)로 재현탁시킨 후, 세포를 함유한 현탁액을 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 비부착성 세포들은 제거하고, 부착된 세포들은 세척한 다음, 상기에서 사용한 분리 배지로 교체하였는데, 매3일마다 교체 배양하였다. 4주 후, 세포들을 PBS로 세척한 다음, 0.25% 트립신/1mM EDTA로 37℃ 온도에서 2분간 배양한 후, 떨어진 세포들을 세척하고 1주일간 더 배양한 다음, 확장 배지(9% FBS, 9% 말혈청, 100u/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신, 12uM L-글루타민이 첨가된 알파-MEM 배지)를 이용하여 8000 cells/dish의 플레이트에서 확장 배양시켰다. 이후 배양된 세포들(BMSC)을 모은 후, FACS를 이용하여 CD44, CD3, CD11b 및 CD45R에 대한 양성 및 음성 여부를 조사하였다.

또한, BMSC 세포들로부터 골형성 여부를 조사하기 위해 상기 배양한 BMSC 세포를 50uM의 아르코르브산 및 10mM의 베타-glycerophophate를 함유한 확장 배지를 이용하여 매 3일마다 배지 교체를 하면서 21일간 배양하여 골형성을 촉진시켰다. 또한, 세포외 기질 분류는 Alzarin red S 염색을 이용하여 분석하였고, 골분화의 확인은 이미지 분석 프로그램을 이용하여(Image J)를 Alzarin red 염색된 부위 및 밀도를 측정하여 이를 정량화한 값에 의해 평가하였다.

또한, 알칼라인 포스파타제(ALP)의 수준 측정은 세포 용해물을 대상으로 fluorimetric 분석(AtarBright Alkaline Phosphatase detection kit; MT-1000, 시그마 알드리치)을 통해 수행하였다.

본 발명에 따른 실시예들에서 모든 통계 처리는 평균± SE으로 표시하였으며, 스튜던트 t-테스트를 이용하여 샘플과 대조군 샘플과의 차이를 분석하였다. 또한, P 값은 0.05 이하의 값을 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 골분화 마커인 알칼라인 포스파타제(ALP)의 경우, 대조군에 비해 HVEM 결핍 마우스 유래의 BSMC를 분화시켰을 경우 ALP의 양이 더 증가한 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 동물 모델을 대상으로 실험한 in vivo 실험 결과들을 토대로 HVEM 유전자의 발현을 억제 또는 HVEM의 활성을 억제시킬 경우, 골 세포 분화를 촉진시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry academy cooperation foundation ulsan university <120> Composition of osteogenic differentiation or osteogenesis comprising inhibitor of HVEM <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1730 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HVEM cDNA sequence <400> 1 ccttcatacc ggcccttccc ctcggctttg cctggacagc tcctgcctcc cgcagggccc 60 acctgtgtcc cccagcgccg ctccacccag caggcctgag cccctctctg ctgccagaca 120 ccccctgctg cccactctcc tgctgctcgg gttctgaggc acagcttgtc acaccgaggc 180 ggattctctt tctctttctc tttctcttct ggcccacagc cgcagcaatg gcgctgagtt 240 cctctgctgg agttcatcct gctagctggg ttcccgagct gccggtctga gcctgaggca 300 tggagcctcc tggagactgg gggcctcctc cctggagatc cacccccaaa accgacgtct 360 tgaggctggt gctgtatctc accttcctgg gagccccctg ctacgcccca gctctgccgt 420 cctgcaagga ggacgagtac ccagtgggct ccgagtgctg ccccaagtgc agtccaggtt 480 atcgtgtgaa ggaggcctgc ggggagctga cgggcacagt gtgtgaaccc tgccctccag 540 gcacctacat tgcccacctc aatggcctaa gcaagtgtct gcagtgccaa atgtgtgacc 600 cagccatggg cctgcgcgcg agccggaact gctccaggac agagaacgcc gtgtgtggct 660 gcagcccagg ccacttctgc atcgtccagg acggggacca ctgcgccgcg tgccgcgctt 720 acgccacctc cagcccgggc cagagggtgc agaagggagg caccgagagt caggacaccc 780 tgtgtcagaa ctgccccccg gggaccttct ctcccaatgg gaccctggag gaatgtcagc 840 accagaccaa gtgcagctgg ctggtgacga aggccggagc tgggaccagc agctcccact 900 gggtatggtg gtttctctca gggagcctcg tcatcgtcat tgtttgctcc acagttggcc 960 taatcatatg tgtgaaaaga agaaagccaa ggggtgatgt agtcaaggtg atcgtctccg 1020 tccagcggaa aagacaggag gcagaaggtg aggccacagt cattgaggcc ctgcaggccc 1080 ctccggacgt caccacggtg gccgtggagg agacaatacc ctcattcacg gggaggagcc 1140 caaaccactg acccacagac tctgcacccc gacgccagag atacctggag cgacggctgc 1200 tgaaagaggc tgtccacctg gcggaaccac cggagcccgg aggcttgggg gctccgccct 1260 gggctggctt ccgtctcctc cagtggaggg agaggtgggg cccctgctgg ggtagagctg 1320 gggacgccac gtgccattcc catgggccag tgagggcctg gggcctctgt tctgctgtgg 1380 cctgagctcc ccagagtcct gaggaggagc gccagttgcc cctcgctcac agaccacaca 1440 cccagccctc ctgggccagc ccagagggcc cttcagaccc cagctgtctg cgcgtctgac 1500 tcttgtggcc tcagcaggac aggccccggg cactgcctca cagccaaggc tggactgggt 1560 tggctgcagt gtggtgttta gtggatacca catcggaagt gattttctaa attggatttg 1620 aattcggctc ctgttttcta tttgtcatga aacagtgtat ttggggagat gctgtgggag 1680 gatgtaaata tcttgtttct cctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1730 <210> 2 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVEM amino acid sequence <400> 2 Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro 1 5 10 15 Lys Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala 20 25 30 Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro 35 40 45 Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys 50 55 60 Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro 65 70 75 80 Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys 85 90 95 Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser 100 105 110 Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile 115 120 125 Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser 130 135 140 Ser Pro Gly Gln Arg Val Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr 145 150 155 160 Leu Cys Gln Asn Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu 165 170 175 Glu Glu Cys Gln His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala 180 185 190 Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ser His Trp Val Trp Trp Phe Leu Ser Gly 195 200 205 Ser Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr Val Gly Leu Ile Ile Cys 210 215 220 Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val Ser 225 230 235 240 Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile Glu 245 250 255 Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu Thr 260 265 270 Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His 275 280

Claims (11)

1. HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제 또는 HVEM 단백질의 활성 억제제를 포함하는 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제는 서열번호 1로 표시되는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA인 것을 특징으로 하는 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현 억제제는 골량 증가, 골형성 촉진, 골흡수 억제 또는 골분화 촉진 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 골분화 또는 골형성 촉진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 골질환은 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 조성물.
7. (a) 생물학적 시료에 존재하는 HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현양 또는 HVEM 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 HVEM 유전자의 발현양 또는 HVEM 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 골질환의 발병을 예측 또는 진단하는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직 화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골질환의 발병을 예측 또는 진단하는 방법.
9. (a) HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자 또는 HVEM 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;
   (b) 상기 HVEM 유전자의 발현양, HVEM 단백질의 양 또는 HVEM 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
   (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, HVEM 유전자의 발현양, HVEM 단백질의 양 또는 HVEM 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 골질환의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 및 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
11. HVEM(Herpesvirus-entry mediator) 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물.

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