JP6329554B2 - 宿主細胞改変方法 - Google Patents
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Description
核酸配列を宿主細胞中に挿入する新規方法が本明細書において記載される。また、挿入された核酸配列を含む遺伝的に安定な宿主細胞及びタンパク質の作製においてかかる宿主細胞を使用する方法も本明細書において記載される。
単一遺伝子又は小さいDNA断片の組換え発現は、プラスミドに組換え遺伝子を提供することによって実施されることが最も多い。プラスミドは、分子生物学の技術によって効率的に産生され、操作され得る[1]。それらは、宿主細胞中に迅速に挿入され、同様に環状プラスミド分子にコードされる耐性カセットによってプラスミドを保持する宿主細胞に付与される抗生物質選択によって維持される。通常、組換えタンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子を含有するプラスミドを使用して発現される。
一態様では、DNAの大きな連続する配列を宿主細胞ゲノム中に挿入するための方法が、本明細書において提供される。このような大きなDNA配列は、複数の構成成分、例えば、遺伝子、プロモーター、ターミネーターなどを含み得、宿主細胞ゲノム中の所望の位置に選択的に挿入され得る。ある特定の実施形態では、大きなDNA配列が、宿主細胞ゲノムの領域中に選択的に挿入され得、その結果、断片中に存在する1種以上の構成成分(例えば、遺伝子)が、宿主細胞によって発現される、例えば、宿主細胞は、宿主細胞によって通常は発現されない1種以上の構成成分(例えば、遺伝子)を発現する、及び/又は、宿主細胞は、宿主細胞によって天然に発現される構成成分(例えば、遺伝子)を発現するが、このような構成成分をより多く発現する。
本明細書において、HRと略される相同領域とは、本明細書において記載されるドナープラスミド上に存在するDNAの領域を指す。HRとは、DNAが挿入されるよう意図される宿主細胞のゲノム上に存在するDNAの領域と相同であるDNAの領域である。ある特定の実施形態では、HRは、DNAが挿入されるよう意図される宿主細胞のゲノム上に存在するDNAの領域に対して、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、07%、98%、99%又は99.5%相同である。ある特定の実施形態では、HRは、DNAが挿入されるよう意図される宿主細胞のゲノム上に存在するDNAの領域に対して、100%相同である。ある特定の好ましい実施形態では、HRは、DNAが挿入されるよう意図される宿主細胞のゲノム上に存在するDNAの領域に対して、少なくとも99.5%相同である。
一態様では、宿主細胞ゲノム中にDNAの大きな連続する配列を挿入するための方法が本明細書において提供される。このような大きなDNA配列は、複数の構成成分、例えば、遺伝子、プロモーター、ターミネーターなどを含み得、宿主細胞ゲノム中の所望の位置で選択的に挿入され得る。ある特定の実施形態では、断片(例えば、遺伝子)中に存在する1種以上の構成成分が、宿主細胞によって発現される、例えば、宿主細胞が、宿主細胞によって通常は発現されない1種以上の構成成分(例えば、遺伝子)を発現する及び/又は宿主細胞が、宿主細胞によって天然に発現される成分(例えば、遺伝子)を発現するが、いっそう多くのこのような成分を発現するように、大きなDNA配列は、宿主細胞ゲノムの領域中に選択的に挿入され得る。
宿主細胞のゲノム中に、DNAの大きな配列(すなわち、異種挿入DNA)を挿入する方法が、本明細書において提供される。当業者ならば、本明細書において記載される新規方法は、いくつかの利点を有し、ワクチンを含めた商品の生物学的生産のために使用され得る宿主細胞(例えば、原核生物の宿主細胞)の作製を可能にすることを理解するであろう。本明細書に記載される方法に従って作製された遺伝的に安定な宿主細胞が有する利点の例として、制限するものではないが、(i)染色体に挿入されたDNAについては選択圧が不必要であること、(ii)異種挿入DNA内の遺伝子のコピー数が、細胞周期に応じて1又は2に厳密に調節されること、及び(iii)宿主細胞ゲノム中の異種挿入DNAが、宿主細胞増殖の複数世代にわたって安定なままであることが挙げられる。このような安定な宿主細胞は、例えば、工業的発酵にとって有用である。
本明細書において記載され、本明細書に記載される方法に従って使用されるヘルパープラスミドは、DNA挿入を媒介するために、また必要な期間、組換えを受ける宿主細胞、すなわち、本明細書において記載される方法によって異種DNAが挿入される宿主細胞内にヘルパープラスミドを維持するために、すべての必要な構成成分をコードする。以下は、本明細書において記載されるヘルパープラスミド中に導入され得る特定の構成成分である。
本明細書において記載されるように改変された宿主細胞中へのヘルパープラスミドの適切な導入を確実にするために、本明細書において記載されるヘルパープラスミド中に選択可能マーカーが導入される。特に、選択可能マーカーは、形質転換後にプラスミドを受け入れた宿主細胞を選択するため、及び組換え手順の間プラスミドを維持するために使用され得る。選択のための多数の系が、当技術分野で公知であり、当業者にとって利用可能である。例として、制限するものではないが、(i)抗生物質(例えば、amp、kan、spec、clm、gen、tmp、tet)に対する耐性[15];(ii)選択培地、例えば、栄養要求性マーカー系(Regis Sodoyer、Virginie Courtois、Isabelle Peubez and Charlotte Mignon (2012). Antibiotic-Free Selection for Bio-Production:Moving Towards a New「Gold Standard」、Antibiotic Resistant Bacteria-A Continuous Challenge in the New Millennium、Marina Pana (Ed.)、ISBN:978-953-51-0472-8、InTech、Available from:http://www.intechopen.com/books/antibiotic-resistant-bacteria-a-continuous-challenge-in-the-new-millennium/antibiotic-free-selection-for-bio-production-moving-towards-a-new-gold-standard)での増殖、(iii)毒素-抗毒素系、及び(iv)例えば、トリクロサンのような殺生物剤に対する耐性[16]を付与する遺伝子カセットが挙げられる。以下の表6はまた、選択のために使用され得る抗生物質の一覧を提供する。
本明細書において記載されるヘルパープラスミドは、交差(相同組換え)及びDNAの相同部分の再連結を支持するリコンビナーゼを含む。本明細書に記載される方法に従って使用され得る例示的リコンビナーゼとして、制限するものではないが、λレッドリコンビナーゼ、Racプロファージ由来のRecE/RecT[17]及びバクテリオファージλ由来のRedαβΔ[18〜20]が挙げられる。
ヘルパープラスミド上のエンドヌクレアーゼは、ドナープラスミドを線状化し、それによって、DNAの挿入部分を可動化する。したがって、本明細書において記載される所与の方法において使用されるドナープラスミドは、ヘルパープラスミド中に存在する制限エンドヌクレアーゼの認識配列を有する。リコンビナーゼ酵素による相同組換えは、標的部位との対合の基質として一本鎖DNA挿入末端に依存している。したがって、線状化(すなわち、二本鎖末端を作製すること)は、DNA挿入部分の活性化にとって重要なステップである。開いた二本鎖DNA末端は、酵素的に消化されて一本鎖となり、次いで、これが対合及び組換えの実際の基質となる。
RecAは、相同組換え、DNA修復及びSOS応答の誘導において役割を有する細菌酵素である。RecAは、DNA鎖交換へのATP加水分解と共役する、すなわち、実際の組換え反応を触媒している。本明細書において記載されるような組換えの目的上、recA活性が、宿主細胞中に存在しなくてはならない。しかし、ほとんどの場合、野生型宿主細胞ゲノム中に存在するコピーは、組換えが起こるのに十分である。したがって、recAは、recAを内因性に発現する宿主細胞中に導入される必要はない。
複製起点は、ヘルパープラスミドのDNA複製にとって、また細胞分裂の際に娘細胞へのプラスミドコピーの分布にとって必要である。条件付き複製起点は、細胞中のプラスミドコピー数を増強又は低減するよう使用され得る。例えば、温度感受性複製起点は、本明細書において記載される方法において使用され得る。このような複製起点は、37℃を上回る温度で非機能的であり、プラスミド喪失をもたらす。その他の条件付き複製起点は、当技術分野で公知であり、本明細書において記載される方法とともに使用され得る[26]。条件付き複製起点の例示的一覧は、表5に提供されている。
連続組換えが促進される場合には不要な副反応が起こり得るので、ヘルパープラスミド機能を制御する能力は、細胞増殖の間の限定された時間、組換え活性を低減するために重要である。したがって、誘導プロモーター及び誘導物質は、ヘルパープラスミドの特定の構成成分が、望ましい場合にのみ発現されることを確実にするために利用され得る。誘導プロモーターの例として、制限するものではないが、araBADプロモーター系(アラビノースの存在によって誘導可能である)及びtacプロモーター(IPTGの存在によって誘導可能である)が挙げられる。表7は、本明細書に記載される方法に従って使用され得る誘導可能な構成成分のさらなる一覧を提供する。
本明細書において記載されるドナープラスミドは、所望の異種挿入DNA配列を宿主細胞に「供与し」、異種挿入DNAを安定に組み込んでいる宿主細胞をもたらす。
本明細書において記載されるドナープラスミド上に存在する選択可能マーカーは、上記の節5.1.1.1において提供されるもの並びに以下の表6において列挙されるものと同一の一覧から選択され得る。その他の選択系も使用され得、例えば、栄養要求性マーカーに基づいた選択系は、挿入事象のための選択にとって有用であろう。アクセプター株が、株を栄養要求性(すなわち、その増殖が特定の培地構成成分に依存する)にする遺伝子中に欠失を含有する場合には、この遺伝子が、DNA挿入部分に含まれ得る。
当業者ならば、任意の遺伝子又は遺伝子の組合せが、異種挿入DNA中に含まれ、続いて、本明細書において記載される方法を使用して宿主細胞ゲノム中に挿入され得ることは容易に理解するであろう。
本明細書に記載される方法に従って使用するための相同領域(HR)の長さは、実験的に決定され得る。一般に、HRは、約0.1kbから3.0kb又はそれ以上の範囲の長さを有し得る。ある特定の実施形態では、HRは、0.1kbから0.5kb、0.5kbから1kb、1kbから3kb、3kbから5kb、5kbから10kb、10kbから15kb、15kbから20kb又は20kb超である。ある特定の実施形態では、HRは、同一の長さのものであるか、同等な長さである。ある特定の実施形態では、HRは、同一の長さのものではなく、又は同等な長さではない。
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される方法は、宿主細胞DNAの欠失、例えば、挿入されたDNAの所望の結果を干渉し得る1種以上の遺伝子をコードするゲノムDNAの欠失をもたらす。ある特定の実施形態では、除去されるべき宿主細胞ゲノムDNAは、異種挿入DNAと直接置換される。この概念、すなわち、それを所望のものと置換することによって競合又は干渉する可能性がある経路を除去することは、DNA挿入の部位を選択する合理的な方法である。
不要な、不必要な配列は、組換え細菌株がGIMP下で臨床材料産生のために使用される場合には懸念となる。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って作製された宿主細胞から補助的DNA配列が、ひとたび、それらがもはや必要ではなくなると除去される。例えば、対象のDNAとともに挿入される選択カセットは、それらがもはや作製された宿主細胞と関連していないように、後に除去され得る。DNAの挿入後にこのようなエレメントを除去するために、種々の方法が使用され得る[34]。例えば、FRT/FLP由来の、部位特異的組換えが使用され得る[35](実施例参照のこと)。このような場合には、除去される配列を挟むFLP配列にとって特異的であるリコンビナーゼ(例えば、28bpの配列を認識するFLPリコンビナーゼ)は、配列を組換え、それによって、これらの特異的配列間のDNAを切除できる。代替的な切除系は、loxP/Cre、及びdifXer系である[14、36]。
ある特定の実施形態では、本明細書において記載される糖コンジュゲートは、最適増殖培地において産生される。ある特定の実施形態では、増殖培地は、(i)培地中の酵母抽出物の量(例えば、5〜35g/l)、(ii)培地のMg2+濃度(例えば、0〜25mM)、(iii)培地のペプトン抽出物濃度(例えば、5〜25g/l)、(iv)培地のトリプトン抽出物濃度(例えば、5〜25g/l)、及び/又は(v)培地への分子シャペロンの添加、例えば、トレハロース(例えば、25mM〜50mM)、エチレングリコール(例えば、0.5%)、グルタミン酸(例えば、0.1M)、プトレシン(例えば、25mM)、トリメチル-N-オキシド(例えば、5mM)及び/又はL-プロリン(例えば、5mM)の添加、のうち1つ以上を変更することによって最適化される。
当業者に公知の任意の方法が、プラスミド、例えば、ドナー及びヘルパープラスミド並びにDNAを、宿主細胞中に導入するために使用され得る。このような方法として、制限するものではないが、エレクトロポレーション、熱ショックによる化学的形質転換、天然形質転換、ファージ形質導入及びコンジュゲーションが挙げられる。
本明細書において記載される方法によって操作された宿主細胞が、本明細書において包含され、ここで、前記宿主細胞は、対象のタンパク質をコードする1種以上の遺伝子を含む。特定の実施形態では、本明細書において記載される宿主細胞によって産生されるタンパク質は、抗原、例えば、ワクチンにおいて使用され得るウイルス又は細菌抗原である。別の特定の実施形態では、本明細書において記載される宿主細胞によって産生されるタンパク質は、キャリアタンパク質であり、ここで、前記キャリアタンパク質は、1つ以上の有益な特徴を有するよう、本明細書において記載される宿主細胞によって修飾される、例えば、キャリアタンパク質は、グリコシル化される。
本発明の機能的適用のために、プラスミド維持(ヘルパープラスミド、ドナープラスミド)及びDNA挿入部分選択のために異なる選択系の組合せを使用することが必要である。これらの選択系は、互いに適合しなくてはならない、すなわち、それらは、既存の系(specR、ampR及びclmR又はkanR)、又は有用な抗生物質カセットの任意の代替組合せ及び/若しくは代替プラスミド選択系におけるようであり得る。
5.2.1 タンパク質グリコシル化
ある特定の実施形態では、本明細書において提供された改変された宿主細胞は、タンパク質グリコシル化のために使用され得る。タンパク質グリコシル化は、コンジュゲートワクチン、すなわち、多糖及びワクチンが設計される病原体のタンパク質抗原を含有するワクチンを産生するよう設計され得る。
以下の多糖抗原と関連している遺伝子をコードするDNAが、本明細書に記載される方法に従う挿入DNAとして使用され得る:
コンジュゲートワクチンの産生において使用するのに適した任意のキャリアタンパク質が、本明細書において使用され得る。例示的キャリアタンパク質として、制限するものではないが、緑膿菌(P.aeruginosa)(EPA)外毒素A、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の解毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌(E. coli)FimH、大腸菌(E. coli)FimHC、大腸菌(E. coli)易熱性エンテロトキシン、大腸菌(E. coli)易熱性エンテロトキシンの解毒化変異体、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒化変異体、大腸菌(E. coli)satタンパク質、大腸菌(E. coli)satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA及びC.ジェジュニ(C.jejuni)天然糖タンパク質が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本明細書において記載されるコンジュゲートワクチンを産生するために使用される宿主細胞は、異種核酸、例えば、1種以上のキャリアタンパク質をコードする異種核酸及び/又は1種以上のタンパク質をコードする異種核酸、例えば、1種以上のタンパク質をコードする遺伝子を含むよう操作される。特定の実施形態では、グリコシル化経路(例えば、原核生物の及び/又は真核生物のグリコシル化経路)に関与するタンパク質をコードする異種核酸は、本明細書において記載される宿主細胞中に導入され得る。このような核酸は、制限するものではないが、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを含めたタンパク質をコードし得る。異種核酸(例えば、キャリアタンパク質をコードする核酸及び/又はその他のタンパク質、例えば、グリコシル化に関与するタンパク質をコードする核酸)が、当業者に公知の任意の方法、例えば、エレクトロポレーション、熱ショックによる化学的形質転換、天然形質転換、ファージ形質導入及びコンジュゲーションを使用して本明細書において記載される宿主細胞中に導入され得る。特定の実施形態では、異種核酸は、プラスミドを使用して本明細書において記載される宿主細胞中に導入される、例えば、異種核酸は、プラスミド(例えば、発現ベクター)によって宿主細胞において発現される。別の特定の実施形態では、異種核酸は、本明細書において提供される挿入の方法を使用して本明細書において記載される宿主細胞中に導入される。
本明細書において記載される方法は、グリコシル化されたキャリアタンパク質を含む糖コンジュゲートを産生するために使用され得る(例えば、節5.2.1.2を参照のこと)。特定の実施形態では、本明細書において記載された抗原(例えば、多糖)、例えば、節5.2.1.1に記載される抗原を用いてグリコシル化されたキャリアタンパク質(例えば、節5.2.1.2を参照のこと)を含む糖コンジュゲートが本明細書において提供される。特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、EPAである。
本明細書において記載される糖コンジュゲートを産生する方法は、それらが、発酵の間の、染色体に挿入されたDNAの安定性、ひいては、対象のDNAの発現の増大のために、より少ないリスクで大規模発酵を可能にするので、特に商業上重要であり、関連がある。挿入DNA発現を維持するための既知方法は、挿入DNAを保有するエピソームをベースとする。これらのエピソームは、抗生物質選択によって維持されることを必要とする。したがって、本明細書において記載される方法は、とりわけ、ひとたび異種DNAが宿主細胞ゲノム中に挿入されると、発酵の間の抗生物質選択は必要ではないので、挿入されたDNAのプラスミド媒介性の発現を上回って有利である。すなわち、挿入DNAが染色体中に挿入される場合には、宿主ゲノムの複製とともに増殖するので選択される必要がない。さらに、どの世代(すなわち、宿主細胞複製のサイクル)についても、プラスミドを失うリスクが増大することが、プラスミド媒介性の系における公知の不利点である。このプラスミドの喪失は、細胞分裂の際の細胞分離の段階でのプラスミドの娘細胞への不適当な分布によることもある。大規模では、細菌細胞培養物は、より小さい発酵規模においてよりも多く複製して、高細胞密度に達する。したがって、より高い細胞安定性及び挿入DNA発現が、より高い生産収率につながり、明白な利点を提供する。細胞安定性は、さらに、規制当局による承認のためのプロセス合否基準であり、さらに、抗生物質選択は、一般に、種々の理由、例えば、抗生物質が、最終医薬品中に不純物として存在し、アレルギー反応を引き起こすリスクを有する、また、抗生物質は、抗生物質耐性を促進し得る(例えば、遺伝子導入又は耐性病原体の選択によって)ために、発酵の間は望ましくない。
本明細書において記載される糖コンジュゲートの構造組成及び糖鎖の長さを分析するために、種々の方法が使用され得る。
挿入される系とは対照的に、3種のプラスミド系において、特定のタンパク質中の部位利用が変更されることを示すために、グリコシル化部位利用は、定量されなくてはならない。そうする方法は、以下に列挙されている。
糖コンジュゲート均一性(すなわち、結合している糖残基の均一性)は、グリカンの長さ及び流体力学半径を測定する方法を使用して評価され得る(上記及び節5.3.5を参照のこと)。
本明細書において記載される方法は、宿主細胞ゲノム中に大きなDNA断片を導入することが望まれる任意の宿主細胞の構築のために使用され得、ここで、DNA断片は、挿入DNAを保持する宿主細胞株の産生(例えば、所望の産物、例えば、挿入DNAによってコードされるタンパク質を生成する宿主細胞株の大規模産生)の間、維持される。例えば、本明細書において記載される方法は、制限するものではないが、抗生物質、アルカロイド、カロテノイド、ニコチンアミド及び同一細胞内の複数の酵素反応によって合成されるその他の二次代謝物及び補助因子をコードする挿入されたDNAを含む宿主細胞を産生するために使用され得る。したがって、このような構成成分をコードする挿入されたDNAを含む宿主細胞が本明細書において提供される。
組み込まれた株は、3プラスミド系と比較して低減された抗生物質選択負荷のために、糖コンジュゲートのより高い収量を作製し得る。さらに、細胞に対する、低減された代謝負荷のために、より少ないタンパク質分解が起こる。
組み込まれた株は、より短い、あまり広がっていない多糖の長さの分布を有する糖コンジュゲートを作製する。したがって、糖コンジュゲートは、特性決定しやすく、良好に定義される。さらに、挿入は、細胞に対する周辺質ストレスの程度を低減し得、これは、3プラスミド系と比較して、低減された抗生物質選択負荷による、発酵プロセスの間の産物の少ないタンパク質分解につながり得る。
タンパク質グリコシル化系は、産生宿主中に3つの組換えエレメント:キャリアタンパク質発現DNA、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ発現DNA及び多糖発現DNAを必要とする。先行技術の細菌産生系は、これら3種のエレメントをプラスミド上に含有する。したがって、特に、プラスミドの維持のために使用される抗生物質は、GIMP材料の発酵の間に存在してはならないので、プラスミド喪失による製造の間の不安定性に対するリスクがある。挿入された株はさらに、可動エレメントをより少なく含有するので、多数の世代にわたってより安定である。これは、より大規模の発酵及びより長いインキュベーション時間(より多い世代数)が、より実現可能であることを意味する。さらに、選択のための抗生物質がないことは、感受性対象においてアレルギー反応を引き起こし得る微量の抗生物質がないために、より安全な産物を作製する[4]。
挿入された株は、固定された染色体挿入のために、より遺伝的に安定であり、したがって、産生プロセスの間、例えば、挿入された異種DNAを含む宿主細胞の培養の間の所望のタンパク質産物のより高い再現性につながる。
収量。収量は、制御され、最適化された条件下、バイオリアクター中で増殖された1リットルの細菌産生培養物に由来する炭水化物量として測定される。糖コンジュゲートを精製した後、炭水化物収量は、アンスロンアッセイ(例えば、節5.2.1.7を参照のこと)又は炭水化物特異的抗血清を使用するELISAのいずれかによって直接的に測定され得る。間接的測定は、タンパク質量(周知のBCA、ローリー又はブラッドフォード(bardford)アッセイによって測定された)並びにタンパク質1グラム当たりの理論上の炭水化物量を算出するためのグリカンの長さ及び構造を使用することによって可能である。さらに、収量はまた、揮発性バッファーから糖タンパク質調製物を乾燥させること及び重量を測定するために天秤を使用することによって測定され得る。
5.3.1 プラスミドを含む組成物
一実施形態では、本明細書において記載される1種以上のプラスミド、例えば、1種以上のドナー又はヘルパープラスミドを含む組成物が、本明細書において提供される。
一実施形態では、本明細書において記載される宿主細胞を含む組成物が本明細書において提供される。このような組成物は、本明細書において記載されるコンジュゲートワクチンを作製するための方法において使用され得、例えば、組成物は、タンパク質の産生に適した条件下で培養され得る。その後、バイオコンジュゲートが、前記組成物から単離され得る。
5.3.3.1 グリコシル化タンパク質を含む組成物
一実施形態では、本明細書において記載されたDNA挿入法によって作製された宿主細胞によって産生された1種以上の糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物が、本明細書において提供される。このような糖コンジュゲートは、タンパク質、例えば、キャリアタンパク質内にコードされるグリコシル化コンセンサス配列と結合しているO抗原グリカンを含み得る。特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、1種以上の導入されたグリコシル化部位を含む外毒素Aであり得るか、又はキャリアタンパク質は、FimCHであり得、1種以上の導入されたグリコシル化部位を含む。その他の特定の実施形態では、キャリアタンパク質は、1種以上の導入されたグリコシル化部位を含む大腸菌(E. coli)タンパク質抗原を含み得る。特定の実施形態では、O抗原は、病原体大腸菌(E. coli)分離株、例えば、O1、O2、O4、O7、O8、O9、O11、O15、O16、O17、O18;O20、O22、O25、O73、O75又はO83由来の大腸菌(E. coli)O抗原である。
一実施形態では、対象に、本明細書において記載される糖コンジュゲート又はその組成物を投与することを含む、対象において感染を治療する方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、本明細書において記載される感染を治療するための方法は、有効量の本明細書において記載される糖コンジュゲート又はその組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
6.1 実施例1:大腸菌(E. coli)O1 O抗原コンジュゲート産生のための株構築
挿入のための第1のステップは、標準分子クローニング技術[1]によるドナープラスミドpDOC中へのO1 rfbクラスターのクローニングである。O1 rfbクラスター領域を、活性を確認するためにプラスミドpLAFR1中に(A、以下)、並行して、O1クラスターをゲノム中に挿入するためにドナープラスミドpDOC中にクローニングした(B、以下)。
実施例1と同様に、株構築を実施した。O2 rfbクラスターを、表1に詳述されるようなHR領域及びカセットからなるpDOCプラスミド中にクローニングした。O2 rfbクラスターを、オリゴ2207/2166を用いて臨床分離株upecGVXN116(StGVXN3949)から増幅し、p967のBamHI/SgsI部位中にクローニングした。O2 rfbアンプリコンは、galF内からwekRまでのすべての配列を含有していた。wekRからgndの間のDNAは、DNA挿入部分から省いた。p967を、2種の部分的に相補的なオリゴヌクレオチド(2167/2168)からなるオリゴカセットの、p946のXhoI及びBamHI部位への挿入によってクローニングした。p946は、p843をAscIを用いて消化すること、付着制限部位末端を埋めるために、直線化プラスミドを、DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントで処理すること及びプラスミドの連続再ライゲーションによって得た。p843は、オリゴヌクレオチド2066及び2068を使用して(表3を参照のこと)、pKD4に由来するPCRアンプリコン[13]を、同一酵素を使用してp482のBamHI及びSgsI部位中にクローニングすることによって作製した。得られたドナープラスミドp1003は、上流HR1領域及びupecGVXN116由来のrfbクラスターと、続いて、除去可能なkanRカセットと、続いて、HR2領域を含有していた(図7)。
上記のように、株構築を実施した。O6 rfbクラスターを、表1に詳述されるようなHR領域及びkanRカセットからなるpDOCプラスミド中にクローニングした。O6クラスターを、オリゴヌクレオチド1907/1908を用いて大腸菌(E. coli)株CCUG11309由来のゲノムDNAから増幅し(図11A)、p843のBamHI及びBcuI部位中にクローニングし、その結果、p914が得られた。
P.シゲロイデス(P.shigelloides)O17クラスターは、S.ソネイ(S.sonnei)rfbクラスターと機能的に同一であるが、不安定な病原性プラスミド上にコードされず、したがって、P.シゲロイデス(P.shigelloides)からクローニングした。クラスターをP.シゲロイデス(P.shigelloides)O17から得たゲノムDNAから、オリゴヌクレオチド1508/1509を用いて(wzzを伴わない)及び1528/1509を用いて(wzzを伴う)増幅した。P.シゲロイデス(P.shigelloides)O17のrfbクラスターを、pDOC由来プラスミドp562中にクローニングし、その結果、p563(これには、wzzが含まれた)及びp568(wzz遺伝子を欠く) が得られた。ヘルパープラスミドは、表1に詳述されるように、HR領域及び選択カセットからなっていた。株構築を実施例1に記載されるように実施した。DNA挿入部分の挿入を、5'及び3'移行領域PCR(図15)、LPSサンプルの銀染色及びS.ソネイ(S.sonnei)タイピング血清を使用するウエスタンブロット解析(図16)によって、O16 wzyの不在及びS.ソネイ(S.sonnei)wzy-wbgVの存在についてPCRによって調べた。
志賀赤痢菌(S.dysenteriae)のrfp及びrfbクラスターは、大腸菌(E. coli)において、志賀赤痢菌(S.dysenteriae)ゲノムにおいて、O抗原を産生する機能的単位を形成するが、それらは、異なる位置に存在する([8])。両クラスターを、表1に詳述されるようなHR領域及び選択カセットからなるpDOCプラスミド中にクローニングした。rfb/rfpを含有するプラスミドpSDM7から得られたBamHI断片([8])を、適したMCSカセットを含有するpLAFR1中にサブクローニングした。そこから、オリゴヌクレオチド1261及び1272(表3参照のこと)を使用して、rfp/rfbを、1種のアンプリコンで、pDOC由来p503中にクローニングし、その結果、p504が得られた。p503は、p482からクローニングされ(節6.1を参照のこと):株W3110のgalF(galF')の一部及びgalFとrmlBの間の遺伝子間領域を含有する、挿入のためのHR1領域をコードするPCRアンプリコン(オリゴヌクレオチド1171/1263を使用する)を、SpeI及びBamHIを用いて消化し、同一酵素を用いて消化したp482中にライゲーションした(その結果、p503が得られた)。rfp及びrfbは、志賀赤痢菌(S.dysenteriae)I型のゲノム上の2種の別個のクラスターとして見出され、p504から発現される場合に、翻訳方向がgalF'、rfp、rfb及びgndについてと同一であるようにクローニングした。DNA挿入部分の挿入を、waaL陽性及び陰性株において実施し、O16 wzyの不在についてPCRによって、5'及び3'移行領域PCR、LPSサンプルの銀染色及びタイピング血清を使用するウエスタンブロット解析(図示せず)によって調べた。図17は、clmRカセット除去の前後の挿入されたW3110ΔrfbO16::rfbSd1ΔwaaL及びW3110ΔrfbO16::rfbSd1の糖脂質分析を示す。抽出物が、SDS PAGE後に銀染色によって分析された場合には、waaL陽性株のみが、LPSの通常のO抗原パターンを示し、ΔwaaL株は示さなかった。すべての株が、抗志賀赤痢菌(S.dysenteriae)1 O抗原特異的抗血清に反応し、これらの株における組換えO抗原の産生が確認された(図17)。
シゲラ属(Shigella)O抗原は、免疫学的に多様である。抗原としてO抗原多糖を使用する細菌性赤痢に対する包括的ワクチンについて、十分な適用範囲をもたらすためには、少なくとも5種の血清型のO抗原構造が含まれなければならないと考えられる。目的は、最も流行している感染性株からできる限り多数の抗原エレメントを含み、志賀赤痢菌(S. dysenteriae)1型、S.ソネイ(S.sonnei)並びに S.フレックスネリ(S.flexneri)6型及びS.フレックスネリ(S.flexneri)2a及び3a O抗原を含有することである[56]。
O11 O抗原クラスターを、表1に詳述されるようなHR領域及び選択カセットからなるpDOCプラスミド中にクローニングした。O抗原クラスターを、オリゴヌクレオチド2245/2247(表3を参照のこと)を用いて緑膿菌(P.aeruginosa)株PA103から増幅した。株構築を、実施例1に記載のように実施した。DNA挿入部分(wzzを有する)の、W3110ΔwaaLへの挿入を、O16 wzxの不在及びO11の存在についてPCRによって、5'及び3'移行領域PCR、LPSサンプルの銀染色及び緑膿菌(P.aeruginosa)抗群E(O11)タイピング血清を使用するウエスタンブロット解析によって調べた。示された実施例において、正しい抗生物質耐性表現型を有する4クローンを、O11 O抗原産生について調べ(A〜D、レーン1〜4)、それらは、抗群E血清(図23)を用いて分析した場合に、およそ34kDaの大きさに対応する電気泳動移動度を有する通常のラダー様O抗原シグナルを作り出した。対照として、wzzを有する、及びwzzを有さないドナープラスミドを含有する大腸菌(E. coli)DH5a細胞を使用した(レーン5及び6)。対照株は、活性waaL遺伝子を含有し、したがって、O11 Und-PP(レーン1〜4)と異なるパターンを示すO11 LPSを作製する。したがって、シグナルはより強く、より高い分子量範囲で観察される。wzzの不在下で(レーン6)、シグナルはより小さい分子量に集中し、これは、大腸菌(E. coli)O16 wzzがこの機能を効率的に引き継ぐことができることを示す。総合すると、これらの結果は、大腸菌(E. coli)における緑膿菌(P.aeruginosa)O11 O抗原クラスターの挿入の成功及び機能的発現を示した。さらなるデータは、緑膿菌(P.aeruginosa)O11 wzzが、大腸菌(E. coli)DH5aにおける鎖調節のために活性であること及びその活性が、wzzクラスの大腸菌(E. coli)鎖長制御因子酵素によって機能的に置き換えられ得ることを示す。
グラム陽性莢膜多糖産生及び大腸菌(E. coli)におけるこの多糖を使用するキャリアタンパク質のグリコシル化が達成された[10]。多糖は、CPS構造を有する組換えO抗原を作製するためのO抗原クラスター断片及びCPSクラスター断片からなる融合構築物から構成される導入DNAによって合成された。
この実施例は、バイオコンジュゲートが、オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする核酸の細菌宿主ゲノムへの挿入によって、遺伝子改変されている細菌宿主株によって成功裏に産生され得ることを実証する。
1. ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを含む宿主細胞であって、
(a)ヘルパープラスミドは、(i)第1のプロモーターの制御下に、λレッドリコンビナーゼをコードするオープンリーディングフレーム、(ii)第2のプロモーターの制御下に、宿主細胞ゲノム中に存在しない認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含み、
(b)ドナープラスミドは、(i)5'から3'に、(1)制限エンドヌクレアーゼの認識配列、(2)少なくとも0.5キロベース(kb)の第1の相同領域、(3)少なくとも8kbの異種挿入DNA、及び(4)少なくとも0.5kbの第2の相同領域、並びに(ii)対抗選択マーカーを含む、
宿主細胞。
2. 異種挿入DNAが、選択マーカーを含む、実施形態1に記載の宿主細胞。
3. 選択マーカーが、フリッパーゼ認識標的(FRT)部位に挟まれている、実施形態2に記載の宿主細胞。
4. 第1及び第2の相同領域が、宿主細胞ゲノムの隣接する領域と相同である、実施形態1から3のいずれかに記載の宿主細胞。
5. 第1の相同領域が、少なくとも2kbである、実施形態1から4のいずれかに記載の宿主細胞。
6. 第2の相同領域が、少なくとも2kbである、実施形態1から5のいずれかに記載の宿主細胞。
7. 異種挿入DNAが、少なくとも20kbである、実施形態1から6のいずれかに記載の宿主細胞。
8. 認識配列が、少なくとも18塩基対を含む、実施形態1から7のいずれかに記載の宿主細胞。
9. 制限エンドヌクレアーゼが、SceIである、実施形態1に記載の宿主細胞。
10. 対抗選択マーカーが、sacBである、実施形態1に記載の宿主細胞。
11. オリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに含む、実施形態1から10のいずれかに記載の宿主細胞。
12. 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、宿主細胞にとって異種である、実施形態11に記載の宿主細胞。
13. 前記オリゴサッカリルトランスフェラーゼが、原核生物のオリゴサッカリルトランスフェラーゼである、実施形態11又は12に記載の宿主細胞。
14. 少なくとも1種のグリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、実施形態1から13のいずれかに記載の宿主細胞。
15. 前記グリコシルトランスフェラーゼが、宿主細胞にとって異種である、実施形態14に記載の宿主細胞。
16. 前記異種グリコシルトランスフェラーゼが、原核生物のグリコシルトランスフェラーゼである、実施形態15に記載の宿主細胞。
17. 宿主細胞にとって天然である1種以上の遺伝子が、欠失又は不活性化されている、実施形態1から16のいずれかに記載の宿主細胞。
18. 前記異種挿入DNAが、原核生物のrfbクラスターを含む、実施形態1から17のいずれかに記載の宿主細胞。
19. 前記rfbクラスターが、大腸菌(E. coli)rfbクラスター、シュードモナス属(Pseudomonas)rfbクラスター、サルモネラ属(Salmonella)rfbクラスター、エルシニア属(Yercinia)rfbクラスター、フランシセラ属(Francisella)rfbクラスター、クレブシエラ属(Klebsiella)rfbクラスター、アシネトバクター・バウマンニイ(Acinetobacter baumannii)株由来のrfbクラスター、シゲラ属(Shigella)rfbクラスター又はバークホルデリア属(Burkholderia)rfbクラスターである、実施形態18に記載の宿主細胞。
20. 前記rfbクラスターが、大腸菌(E. coli)rfbクラスターである、実施形態19に記載の宿主細胞。
21. 前記大腸菌(E. coli)rfbクラスターが、血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、又はO187のものである、実施形態20に記載の宿主細胞。
22. 前記異種挿入DNAが、原核生物の莢膜多糖遺伝子クラスターを含む、実施形態1から17のいずれかに記載の宿主細胞。
23. 前記多糖遺伝子クラスターが、大腸菌(E. coli)株、ストレプトコッカス属(Streptococcus)株、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)株又はバークホリデリア属(Burkholderia)株由来である、実施形態22に記載の宿主細胞。
24. 前記異種挿入DNAが、大腸菌(E. coli)、サルモネラ属(Salmonella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、クレブシエラ属(Klebsiella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、コレラ菌(Vibrio cholera)、リステニア属(Listeria)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、ボルデテラ・パラペルツシス(Bordetella parapertussis)、バークホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)及びシュードマレイ(pseudomallei)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)又はカンピロバクター属(Campylobacter)のO抗原をコードする、実施形態1から17のいずれかに記載の宿主細胞。
25. 大腸菌(E. coli)の前記O抗原が、O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、又はO187である、実施形態24に記載の宿主細胞。
26. クレブシエラ属(Klebsiella)の前記O抗原が、K.ニューモニア(K.pneumonia)血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11又はO12である、実施形態24に記載の宿主細胞。
27. 前記異種挿入DNAが、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)糖脂質、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meringitidis)ピリンOグリカン又はリポオリゴ糖(LOS)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)LOS、大形リーシュマニア(Leishmania major)リポホスホグリカン又は腫瘍関連炭水化物抗原をコードする、実施形態1から17のいずれかに記載の宿主細胞。
28. 前記宿主細胞が、N-グリコシル化のためのコンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸をさらに含む、実施形態1から27のいずれかに記載の宿主細胞。
29. キャリアタンパク質をコードする核酸が、宿主細胞にとって異種である、実施形態28に記載の宿主細胞。
30. 前記キャリアタンパク質が、緑膿菌(P.aeruginosa)の解毒化外毒素A(EPA)、CRM197、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、黄色ブドウ球菌(S.aureus)の解毒化溶血素A、クランピング因子A、クランピング因子B、大腸菌(E. coli)FimH、大腸菌(E. coli)FimHC、大腸菌(E. coli)易熱性エンテロトキシン、大腸菌(E. coli)易熱性エンテロトキシンの解毒化変異体、コレラ毒素Bサブユニット(CTB)、コレラ毒素、コレラ毒素の解毒化変異体、大腸菌(E. coli)satタンパク質、大腸菌(E. coli)satタンパク質のパッセンジャードメイン、C.ジェジュニ(C.jejuni)AcrA又はC.ジェジュニ(C.jejuni)天然糖タンパク質である、実施形態28又は29に記載の宿主細胞。
31. 前記キャリアタンパク質が、緑膿菌(P.aeruginosa)の解毒化外毒素A(EPA)である、実施形態30に記載の宿主細胞。
32. 前記宿主細胞が、エシェリキア属(Escherichia)の種、シゲラ属(Shigella)の種、クレブシエラ属(Klebsiella)の種、キサントモナス属(Xhantomonas)の種、サルモネラ属(Salmonella)の種、エルシニア属(Yersinia)の種、ラクトコッカス属(Lactococcus)の種、ラクトバチルス属(Lactobacillus)の種、シュードモナス属(Pseudomonas)の種、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種、ストレプトマイセス属(Streptomyces)の種、ストレプトコッカス属(Streptococcus)の種、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)の種、バチルス属(Bacillus)の種又はクロストリジウム属(Clostridium)の種である、実施形態1から31のいずれかに記載の宿主細胞。
33. 前記宿主細胞が、大腸菌(E. coli)の種である、実施形態32に記載の宿主細胞。
34. キャリアタンパク質及び抗原を含む糖コンジュゲートを産生する方法であって、タンパク質の産生に適した条件下で、実施形態28から33のいずれかに記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
35. 実施形態34に記載の方法によって産生される糖コンジュゲート。
36. キャリアタンパク質及び抗原を含む、実施形態35に記載の糖コンジュゲート。
37. 前記抗原が、(i)大腸菌(E. coli)、サルモネラ属(Salmonella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、クレブシエラ属(Klebsiella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、コレラ菌(Vibrio cholera)、リステニア属(Listeria)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、ボルデテラ・パラペルツシス(Bordetella parapertussis)、バークホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)及びシュードマレイ(pseudomallei)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)又はカンピロバクター属(Campylobacter)のO抗原、 (ii)クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、黄色ブドウ球菌(staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ピロゲネス(Streptococcus pyrogenes)、大腸菌(E. coli)、ストレプトコッカス・アガラクチカエ(Streptococcus agalacticae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meringitidis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)の莢膜多糖、あるいは(iii)ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)糖脂質、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meringitidis)ピリンOグリカン若しくはリポオリゴ糖(LOS)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)LOS、大形リーシュマニア(Leishmania major)リポホスホグリカン若しくは腫瘍関連炭水化物抗原である、実施形態36に記載の糖コンジュゲート。
38. 大腸菌(E. coli)の前記O抗原が、O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144、O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、又はO187である、実施形態37に記載の糖コンジュゲート。
39. クレブシエラ属(Klebsiella)の前記O抗原が、K.ニューモニア(K.pneumonia)血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11又はO12である、実施形態37に記載の糖コンジュゲート。
40. 前記キャリアタンパク質が、解毒化EPAである、実施形態36から39のいずれかに記載の糖コンジュゲート。
41. 実施形態35から40のいずれかに記載の糖コンジュゲートを含む免疫原性組成物。
42. 実施形態41に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象において感染を治療又は予防する方法。
43. 前記感染が、尿路病原性大腸菌(E. coli)による感染である、実施形態42に記載の方法。
44. 実施形態41に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫応答を誘導する方法。
45. 前記免疫応答が、病原体に対する免疫応答である、実施形態44に記載の方法。
46. 前記病原体が、大腸菌(E. coli)、サルモネラ属(Salmonella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、クレブシエラ属(Klebsiella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、コレラ菌(Vibrio cholera)、リステニア属(Listeria)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、ボルデテラ・パラペルツシス(Bordetella parapertussis)、バークホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、バークホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、カンピロバクター属(Campylobacter);クロストリジウム属(Clostridium)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meringitidis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis);ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)又は大形リーシュマニア(Leishmania major)である、実施形態45に記載の方法。
47. 対象がヒトである、実施形態42から46のいずれかに記載の方法。
48. ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを含むキットであって、
(a)ヘルパープラスミドは、(i)第1のプロモーターの制御下に、λレッドリコンビナーゼをコードするオープンリーディングフレーム、(ii)第2のプロモーターの制御下に、宿主細胞ゲノム中に存在しない認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含み、
(b)ドナープラスミドは、(i)5'から3'に、(1)制限エンドヌクレアーゼの認識配列、(2)少なくとも0.5キロベース(kb)の第1の相同領域、(3)少なくとも8kbの異種挿入DNA、及び(4)少なくとも0.5kbの第2の相同領域、並びに(ii)対抗選択マーカーを含む、
キット。
49. (i)第1のプロモーターの制御下に、λレッドリコンビナーゼをコードするオープンリーディングフレーム、(ii)第2のプロモーターの制御下に、宿主細胞ゲノム中に存在しない認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、単離されたプラスミド。
50. (i)5'から3'に、(1)制限エンドヌクレアーゼの認識配列、(2)少なくとも0.5キロベース(kb)の第1の相同領域、(3)少なくとも8kbの異種挿入DNA、及び(4)少なくとも0.5kbの第2の相同領域、並びに(ii)対抗選択マーカーを含む、単離されたプラスミド。
51. ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを含む宿主細胞を作製する方法であって、実施形態49及び50に記載のプラスミドを宿主細胞中に導入することを含む、方法。
52. 前記導入が、形質転換を含む、実施形態51に記載の方法。
53. ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを含み、以下の方法:(i)ドナープラスミドを宿主細胞中に導入すること及び(ii)ヘルパープラスミドを宿主細胞中に導入することに従って産生される、単離された宿主細胞。
54. ヘルパープラスミドが、(i)第1のプロモーターの制御下に、λレッドリコンビナーゼをコードするオープンリーディングフレーム、(ii)第2のプロモーターの制御下に、宿主細胞ゲノム中に存在しない認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含む、実施形態53に記載の宿主細胞。
55. ドナープラスミドが、(i)5'から3'に、(1)制限エンドヌクレアーゼの認識配列、(2)少なくとも0.5キロベース(kb)の第1の相同領域、(3)少なくとも8kbの異種挿入DNA、及び(4)少なくとも0.5kbの第2の相同領域、並びに(ii)対抗選択マーカーを含む、実施形態53又は54に記載の宿主細胞。
56. 前記導入が、形質転換を含む、実施形態53から55のいずれかに記載の宿主細胞。
57. 前記ドナープラスミド及び前記ヘルパープラスミドが、宿主細胞中に個別に導入される、実施形態53から56のいずれかに記載の宿主細胞。
58. 前記ドナープラスミド及び前記ヘルパープラスミドが、宿主細胞中に同時に導入される、実施形態53から56のいずれかに記載の宿主細胞。
59. オリゴサッカリルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子が、宿主細胞のゲノム中に挿入されている、単離された宿主細胞。
60. 大腸菌(E. coli)である、実施形態59に記載の単離された宿主細胞。
61. 前記遺伝子が、C.ジェジュニ(C.jejuni)pglB遺伝子である、実施形態59又は60に記載の単離された宿主細胞。
62. 宿主細胞中の異種遺伝子のコピー数が、1、2、3、4又は5である、実施形態59から61のいずれかに記載の単離された宿主細胞。
63. 宿主細胞中の異種遺伝子のコピー数が、1である、実施形態62に記載の単離された宿主細胞。
64. コンセンサス配列Asn-X-Ser(Thr)[Xは、Proを除く任意のアミノ酸であり得る]を含むキャリアタンパク質を含む、実施形態59から63のいずれかに記載の単離された宿主細胞。
65. 前記キャリアタンパク質が、前記宿主細胞にとって異種である、実施形態64に記載の単離された宿主細胞。
66. 前記キャリアタンパク質が、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素A、コレラ毒素B、AcrA、HlA又はClfAである、実施形態64又は65に記載の単離された宿主細胞。
67. N-グリコシル化タンパク質を産生する方法であって、実施形態59から66のいずれかに記載の宿主細胞をタンパク質の産生に適した条件下で培養することを含む、方法。
同等物:
本明細書において開示される方法、宿主細胞及び組成物は、本明細書において記載された特定の実施形態による範囲に制限されるものではない。実際、記載されたものに加えて、方法、宿主細胞及び組成物の種々の改変は、前述の記載及び添付の図面から当業者に明らかとなろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入るものとする。
Claims (10)
- ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを含む宿主細胞であって、
(a)ヘルパープラスミドは、(i)第1のプロモーターの制御下に、λレッドリコンビナーゼをコードするオープンリーディングフレーム、(ii)第2のプロモーターの制御下に、宿主細胞ゲノム中に存在しない認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含み、
(b)ドナープラスミドは、(i)5'から3'に、(1)制限エンドヌクレアーゼの認識配列、(2)少なくとも0.5キロベース(kb)の第1の相同領域、(3)少なくとも10kbの異種挿入DNA、及び(4)少なくとも0.5kbの第2の相同領域、並びに(ii)対抗選択マーカーを含む、
宿主細胞。 - 異種挿入DNAが、少なくとも20kbである、請求項1に記載の宿主細胞。
- オリゴサッカリルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項1又は2に記載の宿主細胞。
- 少なくとも1種のグリコシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞にとって天然である1種以上の遺伝子が、欠失又は不活性化されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記異種挿入DNAが、原核生物のrfbクラスターを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、N-グリコシル化のためのコンセンサス配列を含むキャリアタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の宿主細胞。
- ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを使用することを含む宿主細胞のゲノム中にDNAの大きな配列を挿入する方法であって、(A)ドナープラスミド及びヘルパープラスミドを同じ宿主細胞に導入するステップと、(B)挿入手順を開始するステップとを含み、
(a)ヘルパープラスミドは、(i)第1のプロモーターの制御下に、λレッドリコンビナーゼをコードするオープンリーディングフレーム、(ii)第2のプロモーターの制御下に、宿主細胞ゲノム中に存在しない認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレームを含み、
(b)ドナープラスミドは、(i)5'から3'に、(1)制限エンドヌクレアーゼの認識配列、(2)少なくとも0.5キロベース(kb)の第1の相同領域、(3)少なくとも10kbの異種挿入DNA、及び(4)少なくとも0.5kbの第2の相同領域、並びに(ii)対抗選択マーカーを含む、
上記方法。 - 請求項8に記載の方法により作製された宿主細胞であって、対象のタンパク質をコードする1種以上の遺伝子を含む、宿主細胞。
- キャリアタンパク質及び細菌又はウイルス多糖抗原を含む糖コンジュゲートを産生する方法であって、タンパク質の産生に適した条件下で、請求項7又は9に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
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