CN104837984A - 宿主细胞修饰方法 - Google Patents

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Abstract

本文所描述的是将核酸序列插入宿主细胞的新方法。本文还描述的是包含插入核酸序列的遗传稳定的宿主细胞以及将这样的宿主细胞用于蛋白质生产的方法。

Description

宿主细胞修饰方法
1 简介
本文描述的是将核酸序列插入宿主细胞的新方法。本文还描述了包含插入核酸序列的遗传稳定的宿主细胞以及将这样的宿主细胞用于产生蛋白质的方法。
2 背景技术
单个基因或小DNA片段的重组表达最常通过在质粒上提供重组基因来进行。质粒可以通过分子生物学技术有效地产生和操作[1]。将它们迅速插入宿主细胞中并通过抗生素选择进行维持，抗生素选择通过抗性盒赋予给拥有质粒的宿主细胞，抗性盒也是在环状质粒分子上编码的。通常，重组蛋白是使用含有编码该蛋白质的基因的质粒进行表达的。
大DNA片段的重组表达具有各种限制。例如标准表达质粒在大DNA片段插入之后经常是遗传学不稳定的。经常地，使用粘粒（cosmids）和/或fosmids，它们含有通过几种机制稳定化插入的DNA的元件，以试图克服质粒不稳定性。进一步地，质粒拷贝数包括不同数量级范围，这取决于复制起始点，并且它们可以额外受到生长状态[2]、培养基组成、以及个体细胞与细胞的差异[3]的影响。另外，仅有有限数量的粘粒和fosmids可用。因此，通常难于在单个细胞中组合多个大DNA片段。
通常质粒的更多缺点是需要选择压力来维持细胞中的附加型元件，无论它们是大质粒或小质粒。选择压力需要使用抗生素，这对于医学产品的生产来说是不希望的，这是由于对抗生素的过敏反应的危险以及用于制造的额外成本。此外，选择压力经常不完全，导致了不均一的细菌培养物，其中一些克隆已丢失了质粒，并因而不再产生重组蛋白[4]。
进一步地，大DNA片段难于插入宿主细胞染色体中。尽管已使用了策略来将大DNA片段插入大肠杆菌基因组中[5]，但目前已有方法不允许大于8 kb的DNA片段在宿主细胞基因组中所希望的位点插入。
3 概述
一方面，本文所提供的是用于将大的DNA连续序列插入宿主细胞基因组的方法。这样的大DNA序列可以包含多种组件，例如基因、启动子、终止子等，并可以选择性地插入到宿主细胞基因组的希望位置处。在某些实施方案中，大DNA序列可以选择性地插入到宿主细胞基因组的区域，使得片段中所存在的一种或更多种组件（例如基因）经宿主细胞表达，例如，宿主细胞表达通常不由该宿主细胞表达的一种或更多种组件（例如基因），和/或宿主细胞表达由该宿主细胞天然表达的组件（例如基因），但是表达更多这样的组件。
在具体实施方案中，本文所提供的是用于将大DNA序列插入宿主细胞基因组的方法，其中所述大DNA序列包含一个、两个、三个、四个、五个、或者更多个基因。在某些实施方案中，在根据本文所述方法而插入到宿主细胞中的DNA序列中所存在的基因是在一种或多种调节序列或启动子控制下的，它们也存在于DNA序列中。在某些实施方案中，在根据本文所述方法而插入到宿主细胞中的DNA序列可以包含对于大DNA序列中所存在的基因的表达是必要的或者有利的更多元件，例如增强子、终止子。
在另一具体实施方案中，本文所提供的是用于将大DNA序列插入宿主细胞基因组的方法，其中所述大DNA序列包含一种或更多种操纵子，例如，在共同调节信号或启动子控制下的基因簇。
在另一具体实施方案中，本文所提供的是用于将大DNA序列插入宿主细胞基因组的方法，其中所述宿主细胞基因组进一步具有通常与宿主细胞基因组相关联DNA的缺失，即该方法同时导致了异源DNA插入到宿主细胞基因组中以及通常存在的DNA从宿主细胞基因组中去除。在具体实施方案中，大DNA序列的插入是在同等大小的DNA序列从宿主细胞基因组去除的位点处进行的，即宿主细胞基因组DNA被插入的DNA序列替换了。
在某些实施方案中，本文所述方法包括将辅助质粒和供体质粒引入到宿主细胞中。如本文所使用的，辅助质粒意在包括包含将大DNA序列插入宿主细胞基因组所需的元件（例如编码基因）的质粒。根据本文所述方法，辅助质粒本身不并入任何DNA到宿主细胞基因组中，而是帮助本文所述供体质粒中所存在的插入DNA的并入。辅助质粒在下面的5.1.1节进行更为详细的描述。如本文所使用的，供体质粒意在包括包含了要插入到宿主细胞基因组中的大DNA序列的质粒，即供体质粒“捐出”了其部分到宿主细胞基因组中（即捐出了要插入到宿主细胞基因组中的大DNA序列）。在某些实施方案中，本文所提供的供体质粒包含大DNA序列插入宿主细胞基因组所需或者有用的其他元件。供体质粒在下面的5.1.2节进行更为详细的描述。
在其他方面，本文所提供的是包含基因组的宿主细胞（例如原核细胞，例如大肠杆菌），已根据本文所述方法将大DNA序列插入到该基因组中。不受理论所约束，本文所述方法可以用于产生遗传学上稳定的宿主细胞，它们能够产生目的蛋白质，例如用作疫苗的蛋白质、糖基化蛋白、用作化妆品的蛋白质等。由于本文所提供的方法，这样的宿主细胞不需要在某些标记物存在下进行维持和/或增殖，例如抗生素选择标记物，这是由于包含目的基因的DNA被直接插入到了宿主细胞基因组中。
在具体实施方案中，本文所提供的是包含供体质粒和辅助质粒的宿主细胞，（a）其中辅助质粒包含：（i）在第一启动子控制下的编码lamda red重组酶的开放读码框；以及（ii）在第二启动子控制下的编码限制性内切核酸酶的开放读码框，其具有宿主细胞基因组中不存在的识别序列；以及（b）其中供体质粒包含：（i）从5'到3'：（1）限制性内切核酸酶的识别序列；（2）至少0.5千碱基（kb）的第一同源区，（3）至少8 kb的异源插入DNA；以及（4）至少0.5 kb的第二同源区；以及（ii）反选择标记物。在具体实施方案中，识别序列包含至少18个碱基对。在另一具体实施方案中，限制性内切核酸酶为SceI。
根据本文所述方法插入到宿主细胞基因组中的异源插入DNA可包含选择标记物。在某些实施方案中，当异源插入DNA包含选择标记物时，选择标记物位于翻转酶识别靶（FRT）位点侧翼。在某些实施方案中，第一和第二同源区是与宿主细胞基因组的临近区域同源的。
本文所述供体质粒的第一和第二同源区可以是异源插入DNA的插入所需或所希望的任意大小。例如，同源区可以是大约或至少0.5 kb、0.6 kb、0.7 kb、0.8 kb、0.9 kb、1 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb、1.5 kb、1.6 kb、1.7 kb、1.8 kb、1.9 kb、2.0 kb、或者大于2.0 kb。在某些实施方案中，第一和第二同源区可以是相同大小的。在某些实施方案中，第一和第二同源区可以是不同大小的。
使用本文所提供的方法插入到本文所述宿主细胞中的异源插入DNA在大小上是较大的，例如，异源插入DNA是不能使用现有技术已知的标准方法插入到宿主细胞基因组中的大小。例如，使用本文所提供的方法插入到本文所述宿主细胞中的异源插入DNA可以是大约或至少8 kb、9 kb、10 kb、11 kb、12 kb、13 kb、14 kb、15 kb、16 kb、17 kb、18 kb、19 kb、20 kb、21 kb、22 kb、23 kb、24 kb、或者25 kb。
3.1 缩写和术语
如本文所使用的，同源区（缩写为HR）是指本文所述供体质粒上存在的DNA区域。HR是与意图插入DNA的宿主细胞基因组上所存在的DNA区域同源的该DNA的区域。在某些实施方案中，HR是与意图插入DNA的宿主细胞基因组上所存在的DNA区域至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%同源的。在某些实施方案中，HR是与打算插入DNA的宿主细胞基因组上所存在的DNA区域100%同源的。在某些优选实施方案中，HR是与意图插入DNA的宿主细胞基因组上所存在的DNA区域至少99.5%同源的。
如本文所使用的，靶位点是指与本文所述供体质粒的同源区互补的、宿主细胞基因组上所存在的位点。
如本文所使用的，异源插入DNA是指本文所述供体质粒上所存在的DNA序列，使用本文所述方法将所述DNA序列插入到靶宿主细胞基因组中。
如本文所使用的，在DNA的背景下，插入是指将异源插入DNA引入到另一段DNA（例如宿主细胞基因组）中的过程，其产生了包含异源插入DNA的DNA分子（例如，经修饰的宿主细胞基因组）。
如本文所使用的，受体细胞是指根据本文所提供的方法修饰的宿主细胞，例如，受体细胞包含基因组，该基因组被修饰以包含异源插入DNA。
如本文所使用的，盒是指DNA序列，它包含基因及其基因功能的表型表达（例如抗生素抗性）所需的调节序列。盒还可包含侧翼序列，它们帮助从受体细胞基因组或者从另一DNA序列（例如质粒）上去除盒。可与盒相关联的示例性侧翼序列包括翻转酶识别靶（FRT）位点。根据本文所述方法，抗生素选择（例如，表达特定抗生素抗性标记物的宿主细胞的选择）可在生长培养基中使用选择盒和抗生素进行。盒可以通过抗生素缩写紧跟代表抗性的大写R进行缩写，例如，ampR是指赋予氨苄青霉素（amp）抗性的盒。因此该命名法描述了表型而不是基因型。根据本文所述方法使用的抗生素缩写提供在下面的表6中。
如本文所使用的，O抗原簇和rfb簇是指负责O抗原生物合成的基因簇[6]。
如本文所使用的，十一异戊烯磷酸酯（Undecaprenol phosphate）缩写为Und-P；以及十一异戊烯焦磷酸酯（undecaprenol pyrophosphate）缩写为Und-PP。
如本文所使用的，脱毒的铜绿假单胞菌外毒素A缩写为EPA。本文所述的EPA可以使用现有技术中已知的方法进行脱毒[7]。
本文引用了来自不同保藏库的大肠杆菌株。在这样的引用中，upecGVXN“编号”、CCUG“编号”、以及StGVXN“号”表示了来自流行病学研究采集的尿路致病性大肠杆菌、瑞典哥德堡（Goteborg）的培养物保藏、以及GlycoVaxyn株保藏的菌株，其中“编号”是指分配给菌株的特定编号。
4 附图简述
图1.供体质粒pDOC-C和相关元件的示意图。ampR：编码赋予beta内酰胺抗性的基因的DNA盒；sacB：赋予蔗糖敏感性的表达盒；oriT：复制起始点；MCS：多克隆位点；SceI：用于从供体质粒移动DNA的归巢（homing）限制性内切核酸酶位点；DNA插入片段：替换HR1和HR2之间受体细胞DNA的DNA段；HR1、HR2：同源区1和2，这些是宿主细胞中存在的DNA区域，在此发生交换和同源重组；选择盒：筛选整合克隆的可选择标记物基因，该盒可以位于位点特异性同源重组位点侧翼，这使得能够去除盒；目的DNA：在选择盒去除之后保留在靶菌株中替换靶菌株DNA的外来DNA。
图2.整合程序方案。程序的不同步骤通过括号中的数字标记。使包含辅助质粒、供体质粒（标记pTKRED和pDOC的圆圈）和染色体（涂鸦状）的靶细胞（矩形）生长（1）并用IPTG和阿拉伯糖诱导（2）以诱导同源重组酶lamda red和归巢内切核酸酶SceI（剪刀状）的表达。后者切割pDOC供体质粒并从而移动插入DNA，在细胞内产生线性化的插入DNA（3）。线性化的插入DNA是lamda red重组酶的最佳底物，它帮助了在同源重组位点HR1和2处的交换和同源重组（粗体黑条）。酶重组是通过交叉的细黑线表示的（4）。所得菌株包含插入DNA，其替换了以前存在于HR1和2之间的DNA。然后通过如文字标示的不同程序从靶细胞中丢失辅助和供体质粒（“治愈”）。
图3.（A）上图显示了供体质粒的大肠杆菌O1 rfb簇，且侧翼HRs是用连接到菌株W3110的受体基因组中的靶位点（与插入DNA的HR区同源的位点）上的细线表示的；斜体显示了基因名，空心箭头表示来自供体质粒的基因，实心箭头表示来自W3110的受体rfb簇，其在整合之后被去除。黑色的窄实心框表示通过FLP介导的位点特异性重组去除clmR的位点特异性重组位点。大的实心矩形表示W3110的wbbL基因，包括赋予菌株W3110的O抗原阴性的破坏性插入元件。细箭头和数字表示用于PCR测试和供体质粒克隆的寡核苷酸的退火区和编号。（B）描述了确认O1 rfb簇存在于细胞中的菌落PCR结果。下图是通过电泳在琼脂糖凝胶上分离的PCR测试反应，用Gel Red DNA染料染色，并用UV光照射以可视化DNA。PCR反应包含寡核苷酸2241和2242（见A），并重悬对照菌株以及rfb簇插入、waaL缺失和选择盒去除之后的菌株的菌落：1, W3110 ΔO16::O1-clmR；2, W3110 ΔO16::rfbO1；3, W3110 ΔO16::rfbO1ΔwaaL::clmR；4, W3110 ΔO16::rfbO1ΔwaaL； 5, W3110 ΔwaaL；6, W3110。
图4.菌株构建不同阶段O1-糖表达的测试。整合rfb簇（W3110 ΔrfbO16::rfbO1-clmR，图A）、去除clmR盒（W3110 ΔrfbO16::rfbO1，图B）、waaL破坏（W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL::clmR，图C）、以及从waaL缺失体中去除clmR盒（W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL，图D）之后，用蛋白酶K处理大肠杆菌细胞全细胞提取物。使培养物在LB培养基中生长，在37℃孵育过夜，并通过溶于SDS Lämmli样品缓冲液中并用蛋白酶K在65℃孵育1h而处理细胞裂解物。通过SDS PAGE分离提取物，并且要么使用银染直接显影（以可视化LPS，A、C、D上图），要么通过电转移转移到硝酸纤维素膜上、接着用抗-O1抗血清免疫检测（αO1；A、B、C、D下图）。将对照进行平行分析（图A、B：upecGVXN140，它是用来扩增O1 rfb簇用于随后整合的临床分离物）。标示了泳道号，并且在黑色框中给出了菌株命名。M：标记物泳道，分子量以kDa表示。标记“克隆”的行表示来自实验的不同分析的克隆。
图5.通过2 AB标记和MS/MS分析来自菌株W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL的大肠杆菌O1 O抗原。A. 大肠杆菌O1重组O抗原的HPLC分析。将细胞提取物如所述进行处理：将来自细胞的干有机提取物水解并纯化。从脂质中释放所得的连接Und-PP的多糖，进一步纯化，并在还原端用2 AB经还原胺化进行标记。在通过GlycoSepN柱上的正相HPLC分离经标记的多糖之后，测量荧光发射。色谱图（实线）是依赖于洗脱时间的荧光痕迹（菌株W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL）。点状痕迹是不表达O抗原的对照样品（W3110 ΔwaaL）。1、2、3、4星号表示了对应1、2、3和4个O抗原重复单元的峰；5星号是6个重复单元分子的片段。B. 来自图A的两星HPLC洗脱级分的MALDI-TOF/TOF分析。对应两个O1重复单元Na+离子加合物的预期质量，选择了[m/z]=1849进行MS/MS，标示了确认预期单糖序列的Y片段离子系列。
图6.通过EPA的4位点O1糖基化插入菌株的EPA-O1糖蛋白的小规模表达测试。如下文实施例所述，用EPA表达质粒（p659）和五个不同的pglB表达质粒转化大肠杆菌细胞（W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL）。生长细胞，并在37℃过夜孵育之后用阿拉伯糖和IPTG诱导，收获细胞并制备周质蛋白提取物。然后通过SDS PAGE分离提取物，通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上，并免疫检测。左图：使用抗-EPA抗血清的Western印迹，右图：使用抗-O1抗血清的Western印迹。在泳道上方标示了PglB质粒（A，p114：未密码子优化的、包含HA标签的pglB；B，p939：密码子优化的、包含HA标签的；C，p970：密码子优化的、去除HA标签的；D，密码子优化的、包含HA标签的、去除天然糖基化位点N543Q的）；和E，密码子优化的，去除HA标签的天然糖基化位点N534Q去除的）标示了分子量标记物泳道大小。
图7.在不同构建阶段，来自大肠杆菌O2 O抗原缀合物生产菌株的菌株构建的PCR菌落筛选。通过使用特异性寡核苷酸的PCR测试了来自文中所示插入实验的大肠杆菌细胞的基因型特征。A. 上图显示了供体质粒中的rfb簇，且侧翼HR是用连接到菌株W3110的受体基因组中的靶位点上的细线表示的；斜体显示了基因名，空心箭头表示来自供体质粒的基因，实心箭头表示受体rfb簇。黑色的窄实心框表示通过FLP介导的位点特异性重组去除clmR的位点特异性重组位点。大的实心矩形表示了W3310被破坏的wbbL基因，包括插入元件。细箭头和数字表示用于PCR测试和供体质粒克隆的寡核苷酸的退火区。B. 下图是Gel Red染色的电泳过的琼脂糖凝胶，用UV光照射以可视化PCR测试反应的产物，以测试waaL的缺失。PCR反应包含寡核苷酸1114和1326，并重悬对照菌株以及整合、waaL缺失和选择盒去除之后的菌株的菌落：1，St4043 = W3110 ΔO16::O2-kanR；2，St4044 = W3110 ΔO16::O2-kanR ΔwaaL::clmR；3，W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL；4 W3110 ΔwaaL；5, W3110；6，W3110 ΔwaaL::clmR。未修饰序列的预期扩增子大小为1.7 kb，clmR插入的为1.5 kb，clmR盒去除之后的为0.5 kb。
图8.菌株构建不同阶段O2 O抗原表达的测试。整合rfb簇（W3110 ΔrfbO16::rfbO2-kanR，图A）、waaL破坏接着去除clmR和kanR盒（W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL，图B）之后的、用蛋白酶K处理的大肠杆菌细胞全细胞提取物是从生长在LB培养基中、在37℃过夜孵育的培养物中制备的。通过溶于SDS Lämmli样品缓冲液中并用蛋白酶K在65℃孵育1h而处理细胞裂解物。然后通过SDS PAGE分离提取物，并且要么使用银染直接显影（以可视化LPS，图B，左），要么通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上，并用抗O2抗血清（αO2）免疫检测，以检测连接Und-PP的O6多糖（连接Und-PP的O抗原，图A、B右侧）。平行分析了对照样品，在大多数情况下是亲本原型菌株。标示了泳道号，并且在黑色框中给出了菌株命名。图A：2泳道包含来自用于通过PCR产生目的DNA的临床分离物（upecGVXN116）的提取物。图B：2泳道包含waaL缺失之前的插入菌株。
图9.通过2 AB标记的来自菌株W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL的大肠杆菌O2 O抗原表达。将细胞如所述进行处理：将来自细胞的干有机提取物水解并纯化。通过用2 AB在还原末端的还原胺化标记多糖，并通过在GlycoSepN柱上的正相HPLC分析。A. 来自菌株W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL的大肠杆菌O2重组O抗原的HPLC分析。色谱图（实线）是依赖于洗脱时间的荧光痕迹。点状痕迹是不表达O抗原的对照样品。1、2、3星表示了对应具有与1、2和3个O抗原重复单元相一致的洗脱时间的峰。B. 图A中通过两星标记的峰级分的MALDI-TOF/TOF分析。对应连接有Na+离子的两个O2抗原重复单元的预期质量，选择了[m/z]=1817进行MS/MS，标示了确认正确单糖序列的Y片段离子系列。
图10.EPA的4位点O2糖基化的整合菌株的小规模测试。如文中所述，用p659和两个不同的pglB表达质粒转化大肠杆菌细胞（W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL）。生长细胞，并在37℃过夜孵育之后用阿拉伯糖和IPTG诱导，收获细胞并制备周质蛋白提取物。然后通过SDS PAGE分离提取物，通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上，并免疫检测。左图：使用抗EPA抗血清（αEPA）的Western印迹，右图：使用抗O2抗血清（αO2）的Western印迹。通过大写字母在泳道上方标示质粒（B，密码子优化的、包含HA标签的pglB表达质粒（p939），D，密码子优化的、不含HA标签的（p970）），标示了分子量标记物泳道大小。作为对照，分析了来自包含p659和p939的临床大肠杆菌分离物upecGVXN124（StGVXN3947）的提取物（x泳道）。
图11.在不同构建阶段，来自大肠杆菌O6 O抗原缀合物生产菌株的菌株构建的PCR菌落筛选。通过使用特异性寡核苷酸的PCR测试了来自实施例中所示整合实验的大肠杆菌细胞的基因型特征。图A显示了供体质粒中的rfb簇，且侧翼HR是用连接到W3110基因组受体位点中的HR区上的细线表示的；斜体显示了基因名，空心箭头表示来自供体质粒的基因，实心箭头表示W3110中的受体rfb簇。黑色的窄实心框表示通过FLP重组去除kanR的位点特异性重组位点。大的实心框表示了W3310被破坏的wbbL基因。细箭头和数字表示用于PCR测试和供体质粒克隆的寡核苷酸的退火区和编号。下图（B-D）是Gel Red染色的琼脂糖凝胶，用UV光照射以可视化PCR测试反应的产物。PCR反应包含上图中所示寡核苷酸，并重悬对照菌株以及整合、waaL破坏和选择盒去除之后的菌株的菌落：1，W3110；2, W3110 ΔwaaL；3，W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR ΔwaaL；4和5，W3110 ΔrfbO16::rfbO6 ΔwaaL的两个不同克隆。标示了所测试的寡核苷酸对。用于测试5'HR区转换的PCR（图B）产生了1.697 kb的PCR产物，对于3'HR区转换在存在或不存在kanR盒时为3.6 kb或2.3 kb（图C），以及对于O6 wzy（c2564）PCR为0.783 kb（图D）。
图12.菌株构建不同阶段O6 O抗原表达的测试。整合rfb簇（W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR，图A）、waaL破坏（W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR ΔwaaL::clmR，图B）、以及clmR盒去除（W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR ΔwaaL，图C）之后的、用蛋白酶K处理的大肠杆菌细胞全细胞提取物是从生长在LB培养基中、在37℃过夜孵育的培养物中制备的。通过将细胞沉淀溶于SDS Lämmli样品缓冲液中并用蛋白酶K在65℃孵育1h而制备细胞裂解物。然后通过SDS PAGE分离提取物，并且要么使用银染直接显影（以可视化LPS，图B和C，左），要么通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上，并用抗O6抗血清（αO6）免疫检测，以检测脂质连接的O6多糖（O抗原，图A、B右侧，C右侧）。平行分析了对照样品，在大多数情况下是所示的直接原型菌株。标示了泳道号，并且在黑色框中给出了菌株命名。图A：3泳道包含来自野生型大肠杆菌O6菌株（CCUG27）的提取物。
图13.编码EPA的4位点O6糖基化的整合菌株的小规模测试。用EPA（p659）和如文中所述的pglB表达质粒（密码子优化的、包含HA标签的pglB表达质粒，p939）转化大肠杆菌细胞（W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR ΔwaaL）。生长细胞，并在37℃过夜孵育之后用阿拉伯糖和IPTG诱导，收获细胞并制备周质蛋白提取物。然后通过SDS PAGE分离提取物，通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上，并免疫检测。左图：使用抗EPA抗血清（αEPA）的western印迹，右图：使用抗O6抗血清（αO6）的western印迹。
图14.不同糖缀合物生产系统的比较分析。用p659和p939（具有C末端HA标签的密码子优化的pglB）转化产生O1（图A）、O2（图B）和O6（图C）O抗原的不同大肠杆菌ΔwaaL细胞，并测试糖缀合物的表达。在补充了10 mM MgCl2的TB培养基中于37℃下生长表达培养物。通过0.2％阿拉伯糖和1 mM IPTG添加在0.4-1.2的OD600时诱导培养物。在过夜诱导（20小时）之后收获细胞，并通过溶菌酶方法制备周质提取物。然后通过SDS PAGE分离提取物，通过电印迹转移到硝酸纤维素膜上，并使用抗EPA抗血清（A、B和C，左图）和O1、O2或O6抗原特异性抗血清（A、B、C，右图）免疫检测。宿主细胞是临床大肠杆菌分离物（1泳道）、如本专利申请所述的插入的W3110细胞（2泳道：A，W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL，B，W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL，C，W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR ΔwaaL）、或者包含粘粒（pLAFR）上的相应rfb簇的W3110 ΔwaaL细胞（3泳道）。标示了分子大小标记物质量，以及用于每个Western印迹的探测血清。
图15.来自W3110菌株中的类志贺氏邻单胞菌（P. shigelloides）O17 rfb簇整合的菌落PCR筛选。通过使用特异性寡核苷酸的PCR测试了来自文中所示整合实验的大肠杆菌细胞的基因型特征。测试了两种不同受体菌株，W3110和W3110 ΔwecA-wzzE ΔwaaL。上图（A）显示了供体质粒中的类志贺氏邻单胞菌rfb簇（具有和不具有wzz）和黑色框中的侧翼HR，以及W3110基因组中的靶位点，斜体显示了基因名，空心箭头表示来自供体质粒的基因，空白表示来自受体位点。黑色的窄实心框表示通过FLP驱动的位点特异性重组去除clmR的位点特异性重组位点。大的实心矩形表示了W3310的通过插入元件天然破坏的wbbL基因区域。箭头和数字表示用于PCR测试的寡核苷酸的退火位置和名称。测试了以下寡核苷酸对：a）1226和1227，用于确认大肠杆菌O16 wzy的缺失，导致当wzy缺失时不存在PCR产物，以及当wzy存在时产生0.9 kb产物；b）1549和1550，对于类志贺氏邻单胞菌wzy & wbgV的存在，产生1.522 kb产物；c）1284和1513，对于HR1转换区产生2.545 kb具有wzz的产物，以及通过不具有wzz的克隆产生1.103 kb。B：包含整合菌落裂解物（白色数字）和所示寡核苷酸对的PCR反应混合物的琼脂糖凝胶电泳。O16 wzy的缺少、wzy-wbgV的存在和HR1（5'）转换区指示成功整合。标示了DNA标记条带大小。确认了以下菌株：W3110 ΔwecA-wzzE ΔwaaL ΔrfbO16::rfbPsO17-clmR，不具有wzz：克隆3，W3110 ΔwecA-wzzE ΔwaaL ΔrfbO16::PsO17-clmR，具有wzz，克隆51，W3110 ΔrfbO16::rfbPsO17-clmR，不具有wzz，克隆7，以及W3110 ΔrfbO16::rfbPsO17-clmR，具有wzz，克隆46。
图16.菌株构建不同阶段类志贺氏邻单胞菌O抗原表达的测试。将来自插入实验并经PCR筛选选择的大肠杆菌细胞通过银染（左图）或者使用宋内志贺氏菌（S. sonnei）抗血清的Western印迹（右图）测试糖脂产生。W3110 ΔwecA-wzzE ΔwaaL ΔrfbO16::rfbPsO17-clmR，不具有wzz：克隆3（3泳道），W3110 ΔwecA-wzzE ΔwaaL ΔrfbO16::rfbPsO17-clmR，具有wzz，克隆51（4泳道），W3110 ΔrfbO16::rfbPsO17-clmR，不具有wzz，克隆7（1泳道），以及W3110 ΔrfbO16::rfbPsO17-clmR，具有wzz，克隆46（2泳道）。
图17.替换W3110 rfb簇的rfp和rfb基因簇整合之后的痢疾志贺氏菌（S. dysenteriae）1型O抗原表达的测试。使用了用于插入W3110以及W3110 ΔwaaL细胞的靶菌株。将来自插入实验的大肠杆菌克隆经菌落PCR筛选。通过银染（左图）和针对抗痢疾志贺氏菌1型抗血清的Western印迹（右图）分析糖脂产生。3、4泳道：整合之后的W3110以及W3110 ΔwaaL；1、2泳道：整合之后并去除clmR盒的W3110以及W3110 ΔwaaL。
图18.通过2 AB标记和HPLC分析痢疾志贺氏菌1型O抗原表达。如实施例中所述处理W3110 ΔrfbO16::rfbSd1 ΔwaaL。色谱图（图A）是依赖于洗脱时间的荧光痕迹。星号表示了对应具有与2（**）、3（***）和4（****）个O抗原重复单元相一致的洗脱时间的峰，如通过MALDI-TOF/TOF MS（图B）所分析的[8, 9]。
图19.使用p293和p114在W3110 ΔrfbO16::rfbSd1 ΔwaaL中生产痢疾志贺氏菌1型O抗原糖缀合物。A. SEC HPLC分析。B. 用于单糖组成分析的PMP标记物。使用单糖混合物来校准葡萄糖、鼠李糖和2-N-乙酰氨基葡萄糖的洗脱时间。C. 糖缀合物的SDS PAGE分离和经考马斯蓝染色的检测，以及在电转移到硝酸纤维素膜上之后的抗痢疾志贺氏菌1抗血清检测。D. 肼解分析。通过肼解将糖蛋白制备中的多糖从蛋白质上分开，经2 AB标记并经HPLC分析。收集所示峰，并且MS/MS分析是与2或3个重复单元O抗原结构相一致的。
图20.通过gtrII或gtrX交换支链葡萄糖基转移酶gtrS之后的福氏志贺氏菌（S. flexneri ）糖脂表达的测试。A. 相关O抗原的重复单元结构。图中显示福氏志贺氏菌2a和3a的区别在于支链葡萄糖残基的连接位置。抗组II和抗组7、8的抗血清能够区别那些连接位点。B. gtrII整合到W3110基因组中的菌落PCR分析。通过包含融合到clmR盒上的gtrII的扩增子替换了 gtrS基因。图中显示了成功同源重组之后的 gtr簇周围的染色体段，仍然存在clmR盒。箭头标示了用于菌落PCR的寡核苷酸的退火位置。1泳道（W3110 ΔwbbIJK ΔgtrS::gtrII-clmR）显示了用重组克隆的菌落PCR的结果，2泳道（W3110 ΔwbbIJK）为对照。clmR盒位于dif 位点侧翼，该位点通过来自大肠杆菌Xer重组酶的位点特异性重组诱导盒的剪切。这意味着在菌落PCR中观察到了相应于包含和缺少clmR盒的片段的条带（预期大小为2.8和1.8 kb）。对照显示1.6 kb的条带，如对母菌株所预期的。C. 通过银染（左图）、抗组II抗血清和抗组7、8抗血清的Western印迹（中图和右图），分析了在质粒上包含福氏志贺氏菌2457T rfb簇的W3110大肠杆菌细胞。1泳道：W3110；2泳道：W3110 ΔgtrS::gtrII；3泳道：W3110 ΔgtrS::gtrX。
图21.使用p293和p114在W3110 ΔrfbO16::rfbpSf2a ΔwaaL中生产福氏志贺氏菌2a型O抗原糖缀合物。A. 糖缀合物的SDS PAGE分离和经考马斯蓝染色的检测，以及在电转移到硝酸纤维素膜上之后的抗II型抗血清检测。B. 经纯化的EPA糖蛋白的SEC HPLC分析。C. 用于单糖组成分析的PMP标记物。使用单糖来校准葡萄糖、鼠李糖和葡糖胺的洗脱时间。通过箭头标示了洗脱时间。D. 肼解分析。通过肼解将糖蛋白制备中的多糖从蛋白质上分开，经2 AB标记并经HPLC分析。收集所示峰，并且MS/MS分析是与2或3个重复单元O抗原结构及其片段相一致的。重要的是，通过MSMS清晰地检测到了葡萄糖支链（未显示）。
图22.将来自经注射的Sprague Dawley大鼠的血清进行了针对福氏志贺氏菌2a LPS的IgG效价分析。显示了来自每种个体大鼠血清的对数效价。在第三次注射之后2周收获血清。在第三次注射之后（post 3）2周达到了抗2a IgG的相应水平，并显示了各组之间的统计学差异（根据Mann-Whitney检验）。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）已检测到了动物血清的特异性IgG效价。将提取自福氏志贺氏菌2a菌株ATCC700930的2a LPS吸附到微量培养板的孔中。然后通过待分析血清的连续稀释物的添加来确定2a抗体效价。在酶学比色反应中使用偶联抗大鼠/或抗小鼠IgG第二抗体的辣根过氧化物酶来确定效价。将终点效价定义为高于预免疫池平均值+3倍预免疫血清标准偏差的最高稀释度，并表达为Log10。
图23.在PA103 O抗原簇整合之后的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）O11 O抗原表达的测试。将来自插入实验并经PCR筛选和表型测试所选择的大肠杆菌细胞通过针对抗铜绿假单胞菌组E抗血清的Western印迹分析糖脂产生。分析了整合的靶菌株（1-4泳道）以及源自包含了供体质粒p1012（5泳道）和p1013（6泳道）的DH5α细胞的对照提取物。
图24.16 kb嵌合簇的整合产生了能够制备重组糖缀合物的细胞，所述嵌合簇由包含替换O11 wzy和wbjA的盒的铜绿假单胞菌O11 rfb簇构成（所述盒由融合到clmR盒上的cap5HIJK基因构成）。从过夜生长的细胞制备全细胞提取物，并在SDS Lämmli缓冲液中裂解，以及用蛋白酶K处理1小时。使用SDS PAGE从这些样品分离糖脂，并使用银染或者针对抗CP5抗血清的Western印迹来鉴别CP5多糖。1-3泳道：用p471、p477或p498构建的整合克隆。p471包含相应于W3110的wecA上游和wzzE ORF序列下游的DNA的HR1和2。在W3110宿主细胞中进行插入。还使用了供体质粒在DH5α细胞中制备对照提取物，在5、6和7泳道中分析（p498、p477或p471）；4泳道包含阴性对照（p473）。8泳道代表了从W3110 ΔwecA细胞的提取物制备的阳性对照，该细胞中包含产生CP5多糖的质粒p393 [10]。
图25描述了通过MG1655 waaL::pglB-galK大肠杆菌宿主菌株产生pglB和O1-EPA的western印迹分析，所述宿主菌株包含表达O1抗原的质粒和表达EPA的质粒。左图显示了用抗-HIS抗体探测EPA的结果；右图显示了用抗-HA抗体探测pglB的结果。
图26描述了用于载体蛋白-糖抗原生物缀合物纯化的策略。
图27描述了在宿主细胞的渗透冲击之后获得的粗提物的色谱图，所述宿主细胞包含插入到宿主细胞基因组中的pglB且包含产生糖抗原（志贺氏菌O1）和载体蛋白（EPA）的质粒。色谱图描述了渗透冲击级分在第一阴离子交换柱（Source Q）上过柱的结果。在粗提物的汇集级分A6-A9中鉴别到的O1-EPA描述于考马斯染色的凝胶上（嵌入图）。
图28描述了获自经第一Source Q柱过柱蛋白质的级分中所存在的蛋白质的考马斯染色结果，所述过柱蛋白质分离自经培养的MG1655 waaL::pglB-galK大肠杆菌宿主菌株的周质，所述宿主菌株包含表达O1抗原的质粒和表达EPA的质粒。
图29描述了获自经第二Source Q柱过柱蛋白质的级分中所存在的蛋白质的考马斯染色结果，所述过柱蛋白质分离自经培养的MG1655 waaL::pglB-galK大肠杆菌宿主菌株的周质，所述宿主菌株包含表达O1抗原的质粒和表达EPA的质粒。
图30描述了在宿主细胞进行渗透冲击、经第一阴离子交换柱（Source Q）过柱以及经第二阴离子交换柱（Source Q）过柱之后所获得产物的色谱图，所述宿主细胞包含插入到宿主细胞基因组中的pglB且包含产生糖抗原（志贺氏菌O1）和载体蛋白（EPA）的质粒。
图31描述了获自经Superdex 200柱过柱蛋白质的级分中所存在的蛋白质的考马斯染色结果，所述过柱蛋白质分离自经培养的MG1655 waaL::pglB-galK大肠杆菌宿主菌株的周质，所述宿主菌株包含表达O1抗原的质粒和表达EPA的质粒。
图32描述了在宿主细胞进行渗透冲击、经第一阴离子交换柱（Source Q）过柱、经第二阴离子交换柱（Source Q）过柱以及经Superdex 200柱过柱之后所获得产物的色谱图，所述宿主细胞包含插入到宿主细胞基因组中的pglB且包含产生糖抗原（志贺氏菌O1）和载体蛋白（EPA）的质粒。
5 发明详述
一方面，本文所提供的是用于将大的DNA连续序列插入宿主细胞基因组的方法。这样的大DNA序列可包含多种组件，例如基因、启动子、终止子等，并可以选择性地插入到宿主细胞基因组的希望位置处。在某些实施方案中，大DNA序列可以选择性地插入到宿主细胞基因组的区域，以使得片段中所存在的一种或更多种组件（例如基因）经宿主细胞表达，例如，宿主细胞表达通常不由该宿主细胞表达的一种或更多种组件（例如基因），和/或宿主细胞表达由该宿主细胞天然表达的组件（例如基因），但是表达更多这样的组件。
在具体实施方案中，本文所提供的是用于将大DNA序列插入宿主细胞基因组的方法，其中所述大DNA序列包含一个、两个、三个、四个、五个、或者更多个基因。在某些实施方案中，在根据本文所述方法而插入到宿主细胞中的DNA序列中所存在的基因是在一种或多种调节序列或启动子控制下的，它们也存在于DNA序列中。在某些实施方案中，在根据本文所述方法而插入到宿主细胞中的DNA序列可以包含对于大DNA序列中所存在的基因的表达是必要的或者有利的更多元件，例如增强子、终止子。
在另一具体实施方案中，本文所提供的是用于将大DNA序列插入宿主细胞基因组的方法，其中所述大DNA序列包含一种或更多种操纵子，例如，在共同调节信号或启动子控制下的基因簇。
在另一具体实施方案中，本文所提供的是用于将大DNA序列插入宿主细胞基因组的方法，其中所述宿主细胞基因组进一步具有通常与宿主细胞基因组相关联DNA的缺失，即该方法同时导致了异源DNA插入到宿主细胞基因组中以及通常存在的DNA从宿主细胞基因组中去除。在具体实施方案中，大DNA序列的插入是在同等大小的DNA序列从宿主细胞基因组去除的位点处进行的，即宿主细胞基因组DNA被所插入的DNA序列替换了。
在某些实施方案中，本文所述方法包括将辅助质粒和供体质粒引入到宿主细胞中。如本文所使用的，辅助质粒意在涵盖包含了将大DNA序列插入宿主细胞基因组所需的元件（例如编码基因）的质粒。根据本文所述方法，辅助质粒本身不并入任何DNA到宿主细胞基因组中，而是帮助本文所述供体质粒中所存在的插入DNA的并入。辅助质粒在下面的5.1.1节进行更为详细的描述。如本文所使用的，供体质粒意在涵盖包含要插入到宿主细胞基因组中的大DNA序列的质粒，即供体质粒“捐出”了其部分到宿主细胞基因组中（即捐出了要插入到宿主细胞基因组中的大DNA序列）。在某些实施方案中，本文所提供的供体质粒包含大DNA序列插入宿主细胞基因组所需或者有用的其他元件。供体质粒在下面的5.1.2节进行更为详细的描述。
在另一方面，本文所提供的是包含基因组的宿主细胞（例如原核细胞，例如大肠杆菌），已根据本文所述方法将大DNA序列插入到该基因组中。不受理论所约束，本文所述方法可以用于产生遗传学上稳定的宿主细胞，它们能够产生目的蛋白质，例如用作疫苗的蛋白质、糖基化蛋白质、用作化妆品的蛋白质等。由于本文所提供的方法，这样的宿主细胞不需要在某些标记物存在下进行维持和/或增殖，例如抗生素选择标记物，这是由于包含目的基因的DNA被直接插入到了宿主细胞基因组中。
在具体实施方案中，本文所提供的是包含供体质粒和辅助质粒的宿主细胞，（a）其中辅助质粒包含：（i）在第一启动子控制下的编码lamda red重组酶的开放读码框；以及（ii）在第二启动子控制下的编码限制性内切核酸酶的开放读码框，所述酶具有宿主细胞基因组中不存在的识别序列；以及（b）其中供体质粒包含：（i）从5'到3'：（1）限制性内切核酸酶的识别序列；（2）至少0.5千碱基（kb）的第一同源区，（3）至少8 kb的异源插入DNA；以及（4）至少0.5 kb的第二同源区；以及（ii）反选择标记物。在具体实施方案中，识别序列包含至少18个碱基对。在另一具体实施方案中，限制性内切核酸酶为SceI。
5.1 DNA插入方法
本文提供的是将大DNA序列（即异源插入DNA）插入宿主细胞基因组的方法。本领域技术人员将理解，本文所述新方法拥有几个优点并允许宿主细胞（例如原核宿主细胞）的产生，所述细胞可以用于商品包括疫苗的生物学生产。根据本文所述方法产生的遗传学稳定的宿主细胞拥有的示例性优点包括，但不限于，（i）对于染色体上插入的DNA来说，选择压力是不必要的；（ii）异源插入DNA中的基因拷贝数严格调节至1或2，这取决于细胞循环，以及（iii）宿主细胞基因组中的异源插入DNA在宿主细胞增殖多代后保持稳定。这样的稳定宿主细胞对于例如工业发酵来说是有用的。
本领域技术人员将容易理解，本发明的新方法可以通过修饰方法中所使用的各种组件进行实施。例如，本文所述供体质粒和辅助质粒可包含多种不同元件，只要它们在本文所述方法中保持功能性。对本文所述供体质粒、本文所述辅助质粒、以及本文所述宿主细胞的示例性修饰在5.1.1节及其之后介绍。
在示例性实施方案中，将大DNA序列（即异源插入DNA）插入宿主细胞基因组的方法包括使用（i）供体质粒和（ii）辅助质粒，所述供体质粒包含（a）位于同源区（HR）例如长同源区（例如，任意适当大小的HR，例如，从0.4-2.0 kb）侧翼的异源插入DNA，其引导了宿主细胞基因组中的重组位点（使用这样的HR增加了插入效率），以及（b）抑制包含供体质粒的宿主细胞生长的反选择标记物，所述供体质粒即在引入供体质粒到宿主细胞后未整合的供体质粒（使用反选择标记物消除了假阳性克隆[11]）；所述辅助质粒包含编码lambda red重组酶的开放读码框和编码限制性内切核酸酶的开放读码框，所述酶具有宿主细胞基因组中所不存在的识别序列（例如，SceI限制性内切核酸酶）。在辅助质粒中，编码lambda red重组酶的开放读码框和编码限制性内切核酸酶的开放读码框，所述酶具有宿主细胞基因组中所不存在的识别序列（例如SceI 限制性内切核酸酶），可在不同启动子控制下（例如，第一启动子和第二启动子）进行开放读码框所产生的蛋白质的一致表达[12]。供体质粒也可包含辅助质粒中所存在的限制性内切核酸酶的识别序列。
本文所述方法使得能够进行一个接一个的多轮插入，即首先大DNA插入片段可以在一个位置插入，并且之后可以使用同样方法进行更多插入。这些连续插入可靶向宿主细胞基因组的任何部分，即也靶向先前插入的DNA或者宿主细胞中存在的原始染色体序列。此外，该方法与其他插入方法相容，象根据Datsenko和Wanner的同源重组（Datsenko KA, Wanner BL:One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97（12）:6640-6645.）。本文所述方法的插入步骤，即异源插入DNA插入宿主细胞基因组的步骤，是基于同源DNA段的体内同源重组或交换。在同源重组期间，一个DNA同源物必须在靶位点中，且一个在供体构建体（即供体质粒）中。根据本文所述方法，可将插入所需元件引入到宿主细胞中，例如，引入到引入宿主细胞中的一个或更多个质粒上。本领域技术人员将容易理解如何将质粒引入到宿主细胞中，且如此做的示例性方法提供在下面的5.1.3节中。
可将异源插入DNA插入宿主细胞基因组中的方法可包含多个步骤。例如，在进行该方法之前，可能需要加工供体质粒和/或辅助质粒。进一步地，可在插入方法之前或期间进行宿主细胞的修饰。本领域技术人员将容易明白，基于希望插入到给定宿主细胞中的异源插入DNA，需要进行哪些步骤。通常，本文所述异源插入DNA插入宿主细胞的方法可包含以下步骤的一些或全部：
（1）制备供体质粒。将希望的异源插入DNA序列（即包含一个或更多个目的基因的异源插入DNA序列）克隆到质粒的克隆位点（例如，多克隆位点，缩写为MCS）中，该质粒适于用作供体质粒（见5.1.2节）。将适于用作同源区的DNA序列（即与宿主细胞基因组上的插入位置同源的DNA序列）也克隆到供体质粒中，使得同源区位于异源插入DNA侧翼。供体质粒的这些克隆和组装方法可以根据任何确定的和熟知的技术进行，以修饰和合成DNA，诸如但不限于，使用限制酶和连接酶的分子克隆、转座酶、化学合成等，这些技术是本领域技术人员所已知的[1]。
另外，在某些实施方案中，将包含编码赋予抗生素抗性的开放读码框的选择盒定位于同源臂之间。包含插入其基因组中的异源插入DNA的宿主细胞可以通过在包含抗生素的培养基上培养它们而鉴别，选择盒的抗生素抗性基因提供了对所述抗生素的抗性。在某些实施方案中，选择盒可位于FRT位点侧翼[13]，这使得能够在以后通过定点重组而去除盒。以该方式将FRT位点并入供体质粒从而确保了选择盒不会保持整合在宿主细胞基因组中。在另一实施方案中，可以在整合之后将选择盒去除，其通过dif位点介导的定点同源重组[14]或者通过其他定点染色体诱变技术。
还加工了本文所述供体质粒以包含编码反选择蛋白质的开放读码框。本领域技术人员已知的适用于反选择方法中的蛋白质的任何编码基因都可以并入本文所述供体质粒中。在具体实施方案中，将sacB基因用于反选择。
还加工了本文所述供体质粒以包含复制起始点。本领域技术人员将容易理解，并入供体质粒中的复制起始点应当适用于正在进行基因组修饰的宿主细胞。例如，当在大肠杆菌中进行克隆时，必须存在大肠杆菌复制起始点。在具体实施方案中，复制起始点是oriT。本领域技术人员将容易理解，可以使用本领域已知的方法产生穿梭质粒（即能够在多种宿主细胞（例如，多种细菌种）中复制的质粒），并且这样的质粒可用来插入到许多类型的宿主细胞中，例如原核细胞、古细菌细胞、真细菌细胞、或者真核细胞。这样的穿梭质粒可包含生物特异性表达控制元件和复制起始点。
（2）制备辅助质粒。加工辅助质粒以编码用于介导DNA插入到本文所述宿主细胞中，以及用于在进行重组的宿主细胞中维持辅助质粒的所有必需活动。在某些实施方案中，本文所述辅助质粒包含（i）选择盒，用于宿主细胞中的质粒维持，（ii）调节子，用于表达重组酶,即支持和增强同源DNA段之间的交换效率的一种或多种酶，（iii）调节子，用于线性化DNA插入片段的功能表达，产生可以进行同源重组的末端同源序列，（iv）调节子，为不具有自己的recA拷贝的宿主细胞表达RecA同源物，以及（v）条件复制起始点。在下文更详细描述这些元件。
在某些实施方案中，用于根据本文所述方法中的辅助质粒包含类似于辅助质粒pTKRED （Gene bank GU327533.1；[12]）的组件。在具体实施方案中，将辅助质粒pTKRED （Gene bank GU327533.1；[12]）用于本文所述方法中。
（3）将供体质粒和辅助质粒引入到同一宿主细胞中。可以通过本领域技术人员已知的许多不同技术进行供体和辅助质粒的插入，包括但不限于，电穿孔、使用化学感受态细胞、热休克、以及噬菌体转导。然后可以将宿主细胞在选择性条件培养，以富集携具有所引入质粒的细胞。
（4）起始插入程序。示例性插入程序包含以下步骤：可以在例如30℃下于培养基中过夜生长阳性克隆（即包含辅助和供体质粒两者的宿主细胞）培养物，所述培养基包含用于选择的适当抗生素（这样的抗生素可以容易地由本领域技术人员基于供体/辅助质粒中所存在的选择盒进行选择）。然后可以将培养基稀释，并在例如30℃下生长，直到适当抗生素存在下的指数阶段。在这些条件下，辅助和供体质粒得到维持但是沉默。接下来，将培养基用包含用于选择的抗生素、以及质粒中所存在的条件性元件（例如可诱导启动子或者条件复制起始点）的任意诱导物的培养基替换，接着进一步孵育细胞。在这段时间，表达了辅助质粒中的限制性内切核酸酶（例如SceI）和辅助质粒中的重组酶（例如lambda red重组酶），导致供体质粒在同源臂处的切割，以及同源DNA在宿主细胞基因组同源位点处的同源重组（见图2）。接下来，在包含供体质粒反选择标记相应的组分（例如蔗糖，如果反选择标记物是sacB）的培养基上将细胞铺板。这一步产生了包含供体质粒的细胞的反选择，所述细胞即供体质粒以未插入状态存在的细胞。这样的培养基还包含供体质粒插入盒中所存在的抗性标记物（所述盒即存在于供体质粒HR之间的抗生素抗性盒），以选择包含异源插入DNA的细胞。在过夜孵育之后，然后筛选显示出抗生素抗性表型的重组克隆细胞，其符合（i）丢失辅助和供体质粒以及（ii）存在异源DNA插入片段。
本领域技术人员将理解，可以使用标准实验方法修改前述条件。例如，可以基于所使用的特定宿主细胞、所使用的选择和反选择标记物等，改变某些条件。示例性插入菌株示于表1和2中。
在具体实施方案中，插入DNA到宿主细胞中的方法包括以下：将阳性克隆（即包含辅助和供体质粒）的过夜培养物在包含选择抗生素（spec和供体质粒的一种或两种可选择标记物）的液体LB培养基中于30℃下生长，稀释到0.05的OD600并在壮观霉素和DNA插入片段选择标记物（kanR或clmR）存在下于30℃生长直到指数阶段。在这些条件下，辅助和供体质粒得到维持但是沉默。然后，将培养基用包含选择抗生素、0.2％阿拉伯糖和1 mM IPTG的LB培养基替换，并将细胞进一步于30℃下孵育几个小时（2、4、6、8 h）。在这段时间，表达了SceI和Red重组酶蛋白质，导致供体质粒在同源臂处的切割，以及同源DNA在基因组同源位点处的同源重组（图2）。然后，将细胞在包含10％蔗糖（以反选择包含供体质粒的细胞）、以及插入盒中存在的抗性标记物（kanR或clmR）的LB培养基上铺板，以选择仍然包含DNA插入片段的细胞。其他选择和反选择标记物可能需要调整条件。在37-42℃下过夜孵育之后，筛选细胞显示出抗生素抗性表型的重组克隆，其符合（i）丢失辅助和ii）供体质粒以及（iii）存在DNA插入片段。将克隆影印铺板在补充了amp、spec、和kan或clm的LM上，以筛选敏感性菌落。指示可能包含DNA插入片段的候选细菌菌落的复合表型是：对氨苄青霉素的敏感性（指示供体质粒的丢失）；壮观霉素敏感性（指示辅助质粒的丢失）；Clm或kan抗性（指示DNA插入片段的存在）。
如下面的工作实施例中所证实的，使用前述方法来将包含O抗原和荚膜多糖簇的异源DNA序列插入到大肠杆菌基因组的特定位置中，而同时在过程中从大肠杆菌基因组中去除了天然地先前存在的O抗原和荚膜簇。使用所得宿主细胞产生由载体蛋白组成的糖蛋白，所述载体蛋白是在所述宿主细胞的壁膜间隙中表达的，其在特定位点包含共价连接的O抗原多糖。本领域技术人员将容易理解，可以应用这样的方法来将任意所希望的异源DNA序列插入到宿主细胞中。
5.1.1 辅助质粒
本文所述的且根据本文所述方法使用的辅助质粒编码用于介导DNA插入且用于将辅助质粒维持在进行重组的宿主细胞中必需的时间的所有必需组件，所述细胞即通过本文所述方法插入了异源DNA的宿主细胞。以下是可以引入到本文所述辅助质粒中的某些组件。
5.1.1.1 选择标记物
将可选择标记物引入到本文所述辅助质粒中，以确保辅助质粒适当引入到如本文所述经修饰的宿主细胞中。具体而言，可以使用可选择标记物来选择已在转化之后接受质粒的宿主细胞，并且在重组程序期间维持质粒。许多选择系统是现有技术中已知的，并且是本领域技术人员可获得的。例子包括但不限于基因盒，其赋予（i）对抗生素的抗性（例如，amp、kan、spec、clm、gen、tmp、tet）[15]；（ii）在选择培养基上的生长，例如，营养缺陷型标记系统（Régis Sodoyer, Virginie Courtois, Isabelle Peubez and Charlotte Mignon （2012）.Antibiotic-Free Selection for Bio-Production:Moving Towards a New "Gold Standard", Antibiotic Resistant Bacteria - A Continuous Challenge in the New Millennium, Marina Pana （Ed.）, ISBN:978-953-51-0472-8, InTech，可获自： http://www.intechopen.com/books/antibiotic-resistant-bacteria-a-continuous-challenge-in-the-new-millennium/antibiotic-free-selection-for-bio-production-moving-towards-a-new-gold-standard），（iii）毒素-抗毒素系统，以及（iv）对抗微生物剂如例如三氯生（triclosan）的抗性[16]。下面的表6还提供了可以用于选择的抗生素列表。
在具体实施方案中，将壮观霉素抗性盒用于辅助质粒选择，即用于维持靶细胞中的辅助质粒。
5.1.1.2 重组酶
本文所述辅助质粒包含重组酶，以支持DNA同源部分的交换（同源重组）和再连接。可以根据本文所述方法使用的示例性重组酶包括但不限于lambda red重组酶、来自Rac原噬菌体的RecE/RecT [17]、以及来自细菌噬菌体lambda的RedαβΔ [17][18-20]。
在具体实施方案中，用于本文所述辅助质粒的重组酶是lambda red重组酶。在另一具体实施方案中，lambda red重组酶是在lac启动子控制下的。Lambda red重组酶催化同源重组反应（交换），并由三个功能亚单位组成，它们由质粒上的三个开放读码框所编码。第一个基因是gam，它是宿主核酸酶抑制蛋白Gam家族的成员。Gam蛋白抑制RecBCD核酸酶，并在细菌和细菌噬菌体两者中发现。第二个基因是beta，并编码RecT家族的蛋白质。RecT蛋白是DNA单链退火蛋白（SSAPs），诸如RecT、Red-beta、ERF和Rad52，并在RecA依赖的和不依赖RecA的DNA重组途径中起作用。第三个基因是exo基因，它编码YqaJ样病毒重组酶结构域蛋白质。该蛋白家族在许多不同细菌种中发现，但是是病毒源的。该蛋白质形成寡聚体并作为加工性的碱性外切核酸酶起作用，其在Mg（2+）依赖的反应中消化线性双链DNA。它对5'-磷酸化DNA末端具有偏好。这三种蛋白质促进了大肠杆菌和其他生物中的同源重组事件。
在某些实施方案中，辅助质粒上所存在的重组酶是在lac启动子以外的启动子控制下的。这样的其他启动子可包括但不限于araBAD启动子[21]、鼠李糖启动子[22]、热诱导型启动子[23]、水杨酸启动子[24]、四环素启动子[25]等。
5.1.1.3 内切核酸酶
辅助质粒上的内切核酸酶线性化供体质粒，并由此移动DNA插入片段。因此本文所述的给定方法中使用的供体质粒拥有辅助质粒上所存在的限制性内切核酸酶的识别序列。经重组酶的同源重组依赖于单链DNA插入片段末端作为底物与靶位点进行配对。因此，线性化（即产生双链末端）是活化DNA插入片段的重要步骤。开放的双链DNA末端被酶学消化成单链，然后单链是配对和重组的实际底物。
本文所使用的内切核酸酶可在宿主细胞的细胞质中起作用，由此它们可切割供体质粒，但不应影响宿主细胞染色体稳定性。通常，任何限制酶或DNA双链切割物都可以用于本文所述方法中，只要它不切割宿主细胞基因组DNA。在具体实施方案中，可以使用在细胞质中起作用并靶向长且稀有的识别位点的内切核酸酶，因为这样的内切核酸酶通过具有稀有识别序列而是高度位点特异性的。例如，可以选择具有大于15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个碱基对识别位点的识别序列的内切核酸酶用于本文所述方法中。
在具体实施方案中，将归巢内切核酸酶用于本文所述方法中。归巢内切核酸酶是由内含子所编码的特殊类型的限制酶或内含肽类。它们包含不同结构组，例如LAGLIDADG （SEQ ID NO:1 ）、 GIY-YIG （SEQ ID NO:2）、H-N-H和His-Cys盒家族。归巢内切核酸酶的示例性列表在下面的表4中给出。本文所使用的内切核酸酶可以存在于辅助质粒上，使得它们在也存在于辅助质粒上的诱导型启动子的控制下。
在具体实施方案中，由本文所述辅助质粒所编码的内切核酸酶是SceI。SceI是LAGLIDADG （SEQ ID NO:1） DNA内切核酸酶家族。这是由DNA移动元件所编码的位点特异性DNA内切核酸酶家族。在功能上，SceI是切割18个碱基对识别序列TAGGGATAACAGGGTAAT （SEQ ID NO:3）的归巢限制性内切核酸酶，这是大肠杆菌基因组中从来不会发生的。特殊的、稀有的且长的识别序列对于其在本发明中的应用来说是关键的。在某些实施方案中，SceI是在诱导型启动子例如阿拉伯糖启动子控制下的。
5.1.1.4 RecA
RecA是细菌酶，它在同源重组、DNA修复和SOS应答的诱导方面具有作用。RecA将ATP水解与DNA链交换相结合，即它催化实际的重组反应。为了如本文所述的重组目的，recA活性必须存在于宿主细胞中。然而，在大多数情况下，野生型宿主细胞基因组中存在的拷贝足以发生重组。因此，无需将recA引入内源表达recA的宿主细胞中。
在不表达recA的宿主细胞中，可以在辅助质粒上将recA引入到宿主细胞中。RecA同源物存在于几乎每种生物中。因此，本领域技术人员将理解，任何recA功能基因都可用于根据本文所述的方法中，即或者基于其在宿主细胞中的天然存在而使用，或者通过将recA功能引入到宿主细胞中而使用，例如天然不包含recA的宿主细胞。
5.1.1.5 条件复制起始点
复制起始点是辅助质粒的DNA复制所需的，以及在细胞分裂期间将质粒拷贝分布到子细胞中所需的。条件复制起始点可以用来增加或减少细胞中的质粒拷贝数。例如，温度敏感性复制起始点可以用于本文所述方法中。这样的复制起始点在高于37℃的温度下是无功能的，导致了质粒丢失。其他条件复制起始点是现有技术中已知的，并可以与本文所述方法一起使用[26]。条件复制起始点的示例性列表提供在表5中。
在具体实施方案中，本文使用的复制起始点是温度敏感性pSC101复制起始点[27]，其导致了在高温下生长的质粒的丢失。可以使用的其他复制起始点包括来自pMB1、ColE1、R100、IncW和其他的那些（参见例如[28]）。
5.1.1.6 诱导型启动子和诱导物
控制辅助质粒功能的能力是重要的，以在细胞生长期间降低重组活性到有限时间，因为如果促进了连续重组，那么就可能发生不需要的副反应。因此，可采用诱导型启动子和诱导物来确保辅助质粒的某些组件仅在希望时才表达。示例性诱导型启动子包括但不限于araBAD启动子系统（通过阿拉伯糖的存在可诱导）以及tac启动子（通过IPTG的存在可诱导）。表7提供了可以根据本文所述方法使用的诱导型组件的进一步列表。
5.1.2 供体质粒
本文所述供体质粒“捐出”了所希望的异源插入DNA序列给宿主细胞，产生了具有稳定整合的异源插入DNA的宿主细胞。
在具体实施方案中，在本文所述方法中使用的供体质粒是基于质粒pDOC-C（Gene bank GQ889494.1；[11]）的。pDOC-C是pEXT100T [29]的衍生物。 质粒包含用于选择的氨苄青霉素抗性基因（ampR）、用于复制的起始点（oriT）和sacB基因。SacB是来源于枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶（levansucrase）操纵子的分泌蛋白。在蔗糖存在下，sacB赋予了致死性。因此，通过简单地将蔗糖添加到培养基中，可以使用sacB作为系统来反选择具有质粒的细胞[30]。此外，pDOC-C编码位于SceI位点侧翼的多克隆位点，用于体内线性化。
以下是可以引入到本文辅助质粒中的某些组件。
5.1.2.1 选择标记物
存在于本文所述供体质粒上的选择标记物可选自如上述5.1.1.1节所提供的同样列表，以及下面表6中所列举的那些。还可以使用其他选择系统，例如基于营养缺陷型标记物的选择系统可能对于选择插入事件是有用的。当受体菌株在使菌株营养缺陷（即其生长依赖于某些培养基组分）的基因中包含缺失时，该基因可包括在DNA插入片段中。
在具体实施方案中，供体质粒包含clmR和/或kanR盒。
5.1.2.2 异源插入DNA
本领域技术人员将容易理解，任何基因或基因组合都可以包括在异源插入DNA中，并随后使用本文所述方法将其插入到宿主细胞基因组中。
在具体实施方案中，插入到本文所述宿主细胞中的异源插入DNA包含基因簇。在具体实施方案中，基因簇是编码荚膜多糖的一种。在另一具体实施方案中，基因簇是编码O抗原的一种。可以使用包含这样的插入基因簇的宿主细胞例如来合成可以用作疫苗的重组糖蛋白产品。
本领域技术人员将理解，本发明使得能够将大DNA序列稳定插入到宿主细胞基因组中。例如，DNA序列可包含1 kb直到40 kb。在某些实施方案中，异源插入DNA大于8 kb、9 kb、10 kb、11 kb、12 kb、13 kb、14 kb、15 kb、16 kb、17 kb、18 kb、19 kb、或20 kb。在某些实施方案中，异源插入DNA大于25 kb。在某些实施方案中，异源插入DNA大于30 kb。在某些实施方案中，异源插入DNA大于35 kb。在某些实施方案中，异源插入DNA大于40 kb。
在一个实施方案中，使用本文所述方法将包含大肠杆菌株rfb簇的DNA序列插入到宿主细胞中。所插入的rfb簇可属于现有技术中已知的任意O血清群/O抗原，例如O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144,O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、或O187，及其血清亚型。在具体实施方案中，宿主细胞为原核宿主细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一实施方案中，使用本文所述方法将包含假单胞菌株rfb簇的DNA序列插入到宿主细胞中。在具体实施方案中，假单胞菌株为铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）株。在具体实施方案中，宿主细胞为原核宿主细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一实施方案中，使用本文所述方法将包含沙门氏菌（Salmonella）株rfb簇的DNA序列插入到宿主细胞中。在具体实施方案中，沙门氏菌株为肠炎沙门氏菌（S. enterica）株。在具体实施方案中，宿主细胞为原核宿主细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一实施方案中，使用本文所述方法将包含耶尔森氏菌（Yersinia）株rfb簇的DNA序列插入到宿主细胞中。在具体实施方案中，宿主细胞为原核宿主细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一实施方案中，使用本文所述方法将包含肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）株rfb簇的DNA序列插入到宿主细胞中。在具体实施方案中，宿主细胞为原核宿主细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一实施方案中，使用本文所述方法将包含土拉热弗朗西丝菌（Francisella tularensis）株rfb簇的DNA序列插入到宿主细胞中。在具体实施方案中，宿主细胞为原核宿主细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一实施方案中，使用本文所述方法将包含鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）株rfb簇的DNA序列插入到宿主细胞中。在具体实施方案中，宿主细胞为原核宿主细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一实施方案中，使用本文所述方法将包含伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）株rfb簇的DNA序列插入到宿主细胞中。在具体实施方案中，宿主细胞为原核宿主细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一实施方案中，使用本文所述方法将包含志贺氏菌（Shigella）株rfb簇的DNA序列插入到宿主细胞中。在具体实施方案中，宿主细胞为原核宿主细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一实施方案中，使用本文所述方法将包含生物体荚膜多糖基因簇的DNA序列插入到宿主细胞中。在具体实施方案中，生物体为大肠杆菌株。在另一具体实施方案中，生物体为链球菌（Streptococcus）株（例如肺炎链球菌（S. pneumoniae）、化脓链球菌（S. pyrogenes）、无乳链球菌（S. agalacticae））、葡萄球菌（Staphylococcus）株（例如金黄色葡萄球菌（S. aureus））、伯克霍尔德氏菌株（例如鼻疽伯克霍尔德氏菌（B mallei）、类鼻疽伯克霍尔德氏菌（B. pseudomallei）、泰国伯克霍尔德氏菌（B. thailandensis））。在具体实施方案中，宿主细胞为原核宿主细胞。在另一具体实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌。
在另一实施方案中，使用本文所述方法将包含合成寡糖或多糖的一种或更多种酶的DNA序列插入到十一异戊烯焦磷酸酯上。
在某些实施方案中，通过将在rfb簇之外所编码的遗传元件引入到所述宿主细胞中而优化宿主细胞。例如，可以将编码糖基转移酶和乙酰基转移酶的基因引入到宿主细胞中，它们是在rfb簇和荚膜多糖簇之外发现的并修饰重组多糖。作为另一例子，在大肠杆菌和志贺氏菌O抗原中，存在原噬菌体基因簇中所编码的葡萄糖基转移酶[31, 32]。这些基因簇被称为gtr，并在由以下所组成的操纵子中进行组织的：将单个葡萄糖残基添加至十一异戊烯磷酸酯上的葡萄糖基转移酶（GtrA）、将结合有葡萄糖磷酸的十一异戊烯醇翻转至膜的周质面的GtrB、以及然后将结合有十一异戊烯磷酸酯的葡萄糖转移到生长的O抗原链上的特异性Gtr转移酶。可以将包含这样基因的DNA引入到本文所述宿主细胞中。
类似的修饰是乙酰化。O抗原的乙酰化在志贺氏菌中是普遍的，并且在大肠杆菌中程度较低。修饰是通过单个乙酰基转移酶催化的，它有时候是在（大肠杆菌O16）中编码的，但是也在rfb簇（福氏志贺氏菌（S. flexneri）3a）之外编码[33]。可以将包含这样的乙酰基转移酶的DNA引入到本文所述宿主细胞中。
O抗原的支链和修饰对于多糖的有效且特异性免疫应答经常是重要的。因此，这些修饰途径可以包括在插入的生产菌株中，以产生包含所有天然可能发现的表位的缀合物。
本发明的进一步实施方案是用于重组蛋白生产的表达盒的插入，其由诱导型启动子系统控制。这意味着，不仅包含表达盒而且包含调控蛋白表达构建体的大DNA段是所介绍技术的合理目标。
可以插入到根据本文所述方法的宿主细胞中的其他DNA序列包括但不限于源自已知来源的寡糖基转移酶和糖基转移酶，例如原核寡糖基转移酶和糖基转移酶和/或真核寡糖基转移酶和糖基转移酶。
(a) 同源区的选择
根据本文所述方法使用的同源区（HR）的长度可以通过实验确定。通常，HR可具有约0.1 kb和3.0 kb或者更大范围的长度。在某些实施方案中，HR为0.1 kb至0.5 kb、0.5 kb至1 kb、1 kb至3 kb、3 kb至5 kb、5 kb至10 kb、10 kb至15 kb、15 kb至20 kb、或者大于20 kb。在某些实施方案中，HR为相等长度或者可比长度的。在某些实施方案中，HR为不同长度或者不可比长度的。
HR之间的距离也可以通过实验确定。HR之间的距离可在.1 kb至12 kb、或者更大的范围，并且可以通过异源插入DNA和/或宿主细胞基因组中待缺失DNA段的长度来确定（例如，可以缺失宿主细胞基因组的长段，只要它们不包含对宿主细胞存活所必需的基因）。异源DNA插入片段的位置是通过HR序列进行定义的。因此，可以在宿主细胞基因组中事实上的任意位置进行插入（例如，在宿主细胞任意染色体上的任意位置）。在某些实施方案中，可以使用本文所述方法来将大DNA片段克隆到靶细胞上存在的质粒中，只要供体质粒的HR存在于宿主细胞中所存在的靶质粒上，例如，而不是在靶染色体中。
本文所述方法的重要方面是，DNA插入片段所插入的基因组位置是通过相应选择同源重组区而进行选择的（HR1和HR2，见图1）。HR1和HR2位于供体质粒上DNA插入片段侧翼，并且它们还在插入之后由DNA插入片段所替换的DNA的侧翼。在下面提供的工作实施例中，选择位于靶染色体上互相间隔3（替换wecA-wzzE）或者12 kb（替换rfb簇）之处的HRs，并观察到了成功插入。
可以以多种方式选择插入位置，包括但不限于：I）可因为希望通过用所希望的一个来替换它而去除可能的竞争性或者干扰性途径而选择插入区（见下面的实施例）；II）可选择在靶细胞天然包含类似簇的位置处插入。然后可平衡表达水平和位置用于优化表达；III）插入位置可能与插入的DNA无关，并且可以完全通过经验针对重组DNA插入片段在具体位置所显示的表达水平进行选择，即可以进行多个不同的随机插入并选择最佳生产的菌株；以及IV）插入可以缺失不希望的功能，或者缺失可以用于重组蛋白选择的功能。
(b) 在插入位点的DNA缺失
在某些实施方案中，本文所述方法产生了宿主细胞DNA的缺失，例如编码可干扰所插入DNA的期望结果的一种或更多种基因的基因组DNA的缺失。在某些实施方案中，用异源插入DNA直接替换要去除的宿主细胞基因组DNA。这种概念，即通过用希望的一种替换它而去除可能的竞争性或干扰性途径，是选择DNA插入位点的合理方式。
在具体实施方案中，在希望用使用本文所述方法而产生的经修饰宿主细胞来加工蛋白质糖缀合物的情况下，缺失以下基因是有用的：编码降低糖蛋白产率的基因，包括但不限于waaL，编码肠杆菌共同抗原（ECA）基因簇（也称为wec簇）的基因，gtr噬菌体基因簇基因，参与核苷酸糖生物合成的基因，编码周质蛋白酶的基因，以及Und-P生物合成和循环基因。在一些情况下，宿主细胞糖基转移酶可能干扰由DNA插入片段所编码的重组多糖的生产。因此，本发明进一步的实施方案是修饰重组多糖的宿主细胞糖基转移酶的缺失，该糖基转移酶产生具有不希望特征的杂交结构。
(c) 所插入DNA的去除
当重组细菌株用于GIMP下的临床材料生产时，不需要的和不必要的序列是要关注的。因此，在某些实施方案中，一旦不再需要它们时，就将辅助DNA序列从根据本文所述方法所产生的宿主细胞中去除。例如，随后可以将与目的DNA一起插入的选择盒去除，以便它们不再与所产生的宿主细胞相关联。为在DNA插入之后去除这样的元件，可以使用不同方法[34]。例如，可以使用FRT/FLP来源的位点特异性重组[35]（见实施例）。在这样的情况下，特异于要去除序列侧翼的FLP序列的重组酶（例如识别28 bp序列的FLP重组酶）可以重组序列，从而切除这些特定序列之间的DNA。可选切除系统是loxP/Cre和difXer系统[14, 36]。
5.1.2.3 其他修饰
在某些实施方案中，本文所述糖缀合物是在优化的生长培养基中生产的。在某些实施方案中，生长培养基是通过改变以下之一或更多而优化的：（i）培养基中酵母提取物的量（例如5至35 g/l），（ii）培养基的Mg2+浓度（例如0至25 mM），（iii）培养基的蛋白胨浓度（例如5-25 g/l），（iv）培养基的胰蛋白胨浓度（例如5-25 g/l），和/或（v）添加分子伴侣至培养基中，例如添加海藻糖（例如25 mM-50 mM）、乙二醇（例如0.5％）、谷氨酸（例如0.1 M）、腐胺（例如25 mM）、三甲基-N-氧化物（例如5 mM）、和/或L-脯氨酸（例如5 mM）。
在某些实施方案中，生长培养基是通过改变培养基的pH而优化的。例如，可以评价pH6.5至8.5的改变对糖缀合物产率的影响。某些基因在某些pH下最佳地发挥作用。因此，可以在选择来优化特定基因的pH值下使用生长培养基。例如，PglB活性在～pH 8下是最佳的。因此，在具体实施方案中，在本文所述方法中，宿主细胞的生长是在pH 8下进行的。在另一具体实施方案中，在本文所述方法中，宿主细胞的生长是在4-6、5-7、6-8或7-9范围的pH下进行的。
5.1.3 质粒引入方法
可以使用本领域技术人员已知的任何方法来引入质粒例如供体和辅助质粒，以及DNA到宿主细胞中。这样的方法可包括但不限于电穿孔、通过热休克的化学转化、天然转化、噬菌体转导、以及缀合。
5.1.4 宿主细胞
本文所包括的是通过本文所述方法加工的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码目的蛋白质的一种或更多种基因。在具体实施方案中，通过本文所述宿主细胞所生产的蛋白质为抗原，例如可以用于疫苗中的病毒或细菌抗原。在另一具体实施方案中，通过本文所述方法所生产的蛋白质为载体蛋白，其中所述载体蛋白是通过本文所述宿主细胞修饰的，以便拥有一种或更多种有利特征，例如载体蛋白是糖基化的。
在辅助和供体质粒中编码的元件确定了本发明是否可以用于某些宿主细胞中。下面的实施例描述了在革兰氏阴性大肠杆菌宿主细胞中的使用；然而，本领域技术人员已知的任何宿主细胞都可能用作DNA插入的受体细胞，包括古细菌、原核宿主细胞、以及真核宿主细胞。示例性原核宿主细胞包括但不限于埃希氏菌种、志贺氏菌种、克雷伯氏菌种、黄单胞菌种、沙门氏菌种、耶尔森氏菌种、乳球菌种、乳杆菌种、假单胞菌种、棒杆菌种、链霉菌种、链球菌种、葡萄球菌种、芽孢杆菌种、以及梭菌种。
5.1.5 分析方法
为了本发明的功能性应用，使用用于质粒维持（辅助质粒、供体质粒）和DNA插入片段选择的不同选择系统的组合是必要的。这些选择系统必须彼此相容，即它们在已有系统中（specR、ampR和clmR或kanR,），或者有用的抗生素盒和/或可选质粒选择系统的任何可选组合中可以是相似的。
可以通过用于DNA分析的任何方法来检查候选插入克隆的基因型。筛选必须基于分析DNA插入片段在染色体插入位置周围的存在。这意味着DNA插入片段必须在靶位点附近找到，即靶位点区域外的序列。可以进行PCR来显示已通过重组切除的基因的缺失，例如当O抗原簇被用不同的一种抗原簇交换时。或者其可用于显示DNA插入片段的存在。或者其可以用于使用HRs侧翼的寡核苷酸扩增DNA段，显示发生了染色体DNA和DNA插入片段的连接。DNA测序可以显示相同结果，即DNA插入片段必须连续地连接到不受同源重组影响的染色体DNA序列上。或者可以使用southern印迹来鉴别染色体DNA片段，染色体DNA片段包含DNA插入片段和插入（HR）位点附近的未受影响的染色体序列。或者可以使用具有特异于DNA插入片段的PCR探针的菌落杂交。
显示DNA插入片段存在的另一方式是通过评估所插入基因的活性。候选克隆的表型分析使得能够检查DNA插入片段的活性，但是不能够检查正确的插入位置。在下面所示例子中，插入了重组多糖生物合成基因簇，因此在插入重组细胞后显示多糖存在的简单实验就足以确认成功的重组。这可通过使用多糖特异性抗血清的免疫印迹（western印迹、菌落印迹、斑点印迹等）进行，可能地但非必需地结合通过SDS-PAGE或层析的细胞提取物分离、接着通过western印迹或ELISA；同样，高分辨率技术如MS、NMR、HPLC或者用于产品的化学或物理鉴别方法对于确认DNA插入片段活性是有用的。
5.2 应用
5.2.1 蛋白质糖基化
在某些实施方案中，本文所提供的经修饰的宿主细胞可以用于蛋白质糖基化。可设计蛋白质糖基化来生产缀合物疫苗，即包含多糖和设计疫苗所针对的病原体的蛋白抗原的疫苗。
5.2.1.1 抗原
编码与以下多糖抗原相关联的基因的DNA可以用作根据本文所述方法的插入DNA：
大肠杆菌（O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144,O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、O187）、沙门氏菌种（肠道沙门氏菌亚种Enterica、肠道沙门氏菌亚种alamae、肠道沙门氏菌亚种arizonae、肠道沙门氏菌亚种Diarizonae、肠道沙门氏菌亚种Houtenae、帮戈沙门氏菌（S. bongori）和肠道沙门氏菌亚种Indica，以及O型1-67，详见[37]）、假单胞菌种（铜绿假单胞菌O血清型1-20 [38]）、克雷伯氏菌种（特别是肺炎克雷伯氏菌血清型O1、O2（和血清亚型）、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12，[39]）的O抗原，不动杆菌O抗原（特别是[40]中鉴别到的鲍氏不动杆菌O抗原）, 沙眼衣原体O抗原（血清型A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L1、L2、L3），霍乱弧菌O抗原O1至155，李斯特氏菌种，特别是单核细胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）1、2、3、4型及其血清亚型，嗜肺军团菌血清型1至15的O抗原，副百日咳博得特氏菌O抗原，鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌O抗原，土拉热弗朗西丝菌，弯曲菌种（空肠弯曲菌）；难辨梭菌（血清型A、G、H、K、S1、S4、D、Cd-5，K Toma等1988，以及产气荚膜梭菌血清型A、B、C、D和E）、金黄色葡萄球菌5和8型、化脓链球菌（组B链球菌荚膜血清型多糖）、大肠杆菌、无乳链球菌（组A链球菌荚膜多糖）、脑膜炎奈瑟氏菌（血清型A、B、C、W、Y、X）、白色念珠菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌荚膜多糖I-V型的荚膜多糖；以及其他表面多糖结构，例如伯氏疏螺旋体糖脂（[41]）、脑膜炎奈瑟氏球菌菌毛蛋白O聚糖[42, 43]和脂寡糖（LOS）、流感嗜血杆菌LOS、硕大利什曼原虫脂磷聚糖[44, 45]）, 肿瘤相关碳水化合物抗原（疟疾糖基磷脂酰肌醇、结核分枝杆菌阿拉伯甘露聚糖[46]）。
5.2.1.2 载体蛋白
本文可以使用适用于缀合疫苗生产的任何载体蛋白。示例性的载体蛋白包括但不限于铜绿假单胞菌外毒素A （EPA）、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基（CTB）、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的信使结构域、空肠弯曲菌AcrA、以及空肠弯曲菌的天然糖蛋白。
在某些实施方案中，用于本文所述缀合疫苗生产的载体蛋白是经修饰的，例如以使得蛋白质毒性更低和/或更易糖基化等的方式修饰。在具体实施方案中，用于本文所述缀合疫苗生产的载体蛋白是经修饰的，使得载体蛋白中的糖基化位点数以一种方式最大化，其使得能够施用更低浓度的蛋白质，例如在免疫原性组合物中、以其生物缀合物形式。因此在某些实施方案中，修饰本文所述载体蛋白以包括比通常与载体蛋白相关联的糖基化位点多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个（例如相对于与天然/自然的例如“野生型”状态的载体蛋白相关联的糖基化位点数）。在具体实施方案中，糖基化位点的引入是通过糖基化共有序列在蛋白质一级结构任意位置的插入而实现的。这样的糖基化位点的引入可以通过以下来实现，例如通过添加新氨基酸到蛋白质一级结构上（即全部或部分地添加糖基化位点），或者通过突变蛋白质中的已有氨基酸以便产生糖基化位点（即不添加氨基酸到蛋白质上，而是蛋白质的所选择氨基酸被突变以形成糖基化位点）。本领域技术人员将理解，使用现有技术中已知的方法可以很容易修饰蛋白质的氨基酸序列，例如包括编码蛋白质的核酸序列的修饰在内的重组方法。在具体实施方案中，将糖基化共有序列引入到载体蛋白的特定区域中，例如蛋白质的表面结构、在蛋白质的N或C末端、和/或在蛋白质基础上通过二硫键稳定的环中。在某些实施方案中，典型的5氨基酸糖基化共有序列可通过赖氨酸残基延长以更有效糖基化，以及由此所插入的共有序列可编码应当插入或者替换受体蛋白氨基酸的5、6或7个氨基酸。
在某些实施方案中，用于本文所述缀合疫苗生产中的载体蛋白包含“标签”，即允许载体蛋白分离和/或鉴别的氨基酸序列。例如，添加标签到本文所述载体蛋白上可以在该蛋白质的纯化中是有用的，以及由此在包含标签化载体蛋白的缀合疫苗的纯化中是有用的。本文可以使用的示例性标签包括但不限于组氨酸（HIS）标签（例如六组氨酸标签，或者6XHis-Tag）、FLAG-TAG和HA标签。在某些实施方案中，本文所使用的标签是可去除的，例如通过化学试剂或者通过酶学手段去除，一旦不再需要它们，例如在蛋白质已纯化后。
5.2.1.3 宿主细胞修饰
在某些实施方案中，将用于生产本文所述缀合疫苗的宿主细胞加工以包含异源核酸，例如编码一种或更多种载体蛋白的异源核酸和/或编码一种或更多种蛋白质的异源核酸，例如编码一种或更多种蛋白质的基因。在具体实施方案中，可将编码参与糖基化途径（例如原核和/或真核糖基化途径）的蛋白质的异源核酸引入到本文所述宿主细胞中。这样的核酸可编码蛋白质，包括但不限于寡糖基转移酶和/或糖基转移酶。可以使用本领域技术人员已知的任何方法将异源核酸（例如编码载体蛋白的核酸和/或编码其他蛋白质例如参与糖基化的蛋白质的核酸）引入到本文所述宿主细胞中，例如电穿孔、通过热休克的化学转化、自然转化、噬菌体转导和缀合。在具体实施方案中，使用质粒将异源核酸引入到本文所述宿主细胞中，例如异源核酸是通过质粒（例如表达载体）在宿主细胞中表达的。在另一具体实施方案中，使用本文所提供的插入方法将异源核酸引入到本文所述宿主细胞中。
在某些实施方案中，可将另外的修饰引入（例如使用重组技术）到本文所述宿主细胞中。例如，可以以使它们失活/失去功能的方式（即所缺失/经修饰的宿主细胞核酸不编码功能性蛋白质或者不编码任何蛋白质）在宿主细胞背景（基因组）中缺失或修饰编码蛋白质的宿主细胞核酸（例如基因），所述蛋白质形成可能的竞争性或干扰性糖基化途径的一部分（例如与参与糖基化的一种或者更多种异源基因相竞争或干扰，所述基因是经重组引入到宿主细胞中的）。在某些实施方案中，当从本文提供的宿主细胞基因组中缺失核酸时，通过所需要的序列替换它们，例如对于糖蛋白生产有用的序列。这样的替换可以通过本文所述的一种或更多种插入方法的方式，其中插入到宿主细胞中的异源插入DNA可替换从宿主细胞中缺失的一种或多种基因的功能。
可以从宿主细胞中缺失的示例性基因（以及在一些情况下，用其他需要的核酸序列替换）包括参与糖脂生物合成的宿主细胞基因，诸如waaL（见例如Feldman等, 2005, PNAS USA 102:3016-3021）、脂A核心生物合成簇、半乳糖簇、阿拉伯糖簇、colonic acid簇、荚膜多糖簇、十一异戊烯磷酸酯生物合成基因、und-P循环基因、参与核苷酸激活的糖生物合成的代谢酶、肠道细菌共同抗原簇、以及原噬菌体O抗原修饰簇如grabs簇。在具体实施方案中，修饰本文所述宿主细胞，使得它们不表达除通过本文所述方法插入到宿主细胞基因组中的异源插入DNA所产生的O抗原之外的任何O抗原。在另一具体实施方案中，修饰本文所述宿主细胞，使得它们不产生除通过本文所述方法插入到宿主细胞基因组中的异源插入DNA所产生的荚膜多糖之外的任何荚膜多糖。
5.2.1.4 糖缀合物
本文所述方法可以用于生产包含糖基化载体蛋白（参见例如5.2.1.2节）的糖缀合物。在具体实施方案中，本文所提供的是包含载体蛋白（参见例如5.2.1.2节）的糖缀合物，其用本文所述抗原（例如多糖）糖基化，所述抗原例如5.2.1.1节所述的抗原。在具体实施方案中，载体蛋白是EPA。
在具体实施方案中，本文所提供的是包含EPA和一种或更多种不同多糖的糖缀合物，例如5.2.1.1节所述的一种或更多种多糖。
在另一具体实施方案中，本文所提供的是包含载体蛋白的糖缀合物，所述载体蛋白缀合到一种或更多种大肠杆菌O1、O2、O4、O6、O7、O8、O11、O15、O16、O17、O18、O20、O22、O25、O73、O75和/或O83上。在具体实施方案中，载体蛋白是EPA。
在另一具体实施方案中，本文所提供的是包含载体蛋白的糖缀合物，所述载体蛋白缀合到一种或更多种不同的铜绿假单胞菌多糖上。在具体实施方案中，载体蛋白是EPA。
在另一具体实施方案中，本文所提供的是包含载体蛋白的糖缀合物，所述载体蛋白缀合到一种或更多种不同的肺炎克雷伯氏菌多糖上。在具体实施方案中，载体蛋白是EPA。
5.2.1.5 益处
本文所述的糖缀合物生产方法具有特别的商业重要性和关联性，因为它们允许更低风险的大规模发酵，这是由于在染色体上插入的DNA增加的稳定性以及由此在发酵期间的目的DNA的表达。用于维持插入DNA表达的已知方法基于携具有插入DNA的附加体。需要通过抗生素选择维持这些附加体。因此本文所述方法优于插入DNA的质粒源性表达，尤其是因为一旦异源DNA插入到宿主细胞基因组中，发酵期间的抗生素选择就不再需要了。也就是说，当插入DNA插入到染色体中时，不需要进行选择，因为它是随着宿主基因组的复制而增殖的。进一步地，质粒源性系统的一个缺点是已知的，丢失质粒的风险随着每一代（即宿主细胞复制的周期）而增加。这种质粒丢失是由于在细胞分裂期间的细胞分离阶段，有时候质粒不适当地分布到子代细胞中。在大规模，细菌细胞培养物复制得比更小的发酵规模的更频繁，以达到高细胞密度。因此，更高的细胞稳定性和插入DNA的表达导致了更高的产率，提供了明显优势。而且细胞稳定性是由监管机构所认可的工艺验收标准，而抗生素选择由于各种原因在发酵期间通常是不希望的，例如抗生素在医学终产品中作为杂质存在并具有引起变态反应的风险，以及抗生素可能促进抗生素抗性（例如通过抗性病原体的基因转移或选择）。
本文所述方法的另一优点是，大片段DNA可以一次性插入到宿主细胞基因组中（“一次性插入”）。将DNA引入宿主细胞基因组的已有方法采用通过同源重组的小DNA片段的重复插入[47]。因此，不受限于理论，本文所述一次性插入方法是有利的，因为它们使得能够避免多次插入。
5.2.1.6 分析方法
可以使用各种方法分析本文所述糖缀合物的结构组成和糖链长度。
在一个实施方案中，可以使用肼解分析聚糖。首先，通过与肼孵育而从它们的蛋白质载体中释放多糖，根据制造商说明（Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, UK）。亲核肼攻击多糖和载体蛋白之间的糖苷键，并允许所攻击聚糖的释放。N-乙酰基在该处理期间丢失，以及必须通过再次N-乙酰化而重构。在碳柱上纯化游离聚糖，并随后在还原末端用荧光团2-氨基苯甲酰胺标记[48]。将标记的多糖在GlycoSep-N柱（GL Sciences）上根据Royle等的HPLC方案分离 [49]。所得荧光色谱图标示了多糖长度和重复单元数。可以通过收集个体峰并随后进行MS/MS分析来收集结构信息。从而单糖组成和重复单元序列可以得到确认，并可以额外地鉴别多糖组成的不均一性。在肼解后获得了HPLC色谱图，并在一个例子中显示了2 AB标记（图21）。可以通过MALDI-MS/MS分析低分子量的具体峰，并使用结果来确认聚糖序列。每个峰对应由特定数量的重复单元及其片段所组成的聚合物。由此使得色谱图能够测量聚合物长度分布。洗脱时间指示了聚合物长度，荧光强度与相应聚合物的摩尔丰度相关。
在另一实施方案中，可以使用SDS-PAGE或毛细管凝胶电泳来分析聚糖和糖缀合物。这里合成的O抗原聚糖的聚合物长度是通过线性组装的重复单元数定义的。这意味着典型的梯状模式是组成聚糖的不同重复单元数的结果。因此，在SDA-PAGE中或通过大小分离的其他技术中的两条紧挨着的带仅相差单个重复单元。当分析糖蛋白的聚糖大小时，利用了这些离散差分。根据它们的电泳迁移率分离未糖基化的载体蛋白和具有不同聚合物链长的糖缀合物。测量了糖缀合物上存在的首个可检测的重复单元数（n1）和平均重复单元数（n平均）。可以使用这些参数来证明批次间一致性或者多糖稳定性。
在另一实施方案中，可以应用高质量MS和大小排阻HPLC来测量完整糖缀合物的大小。
在另一实施方案中，可以使用蒽酮-硫酸测定法来测量多糖产率[50]。
(a) 糖基化位点使用中的变化
为显示具体蛋白质中的位点使用在三质粒系统相对于插入系统中改变了，必须定量糖基化位点使用。如此做的方法列在下面。
糖肽LC-MS/MS：用一种或多种蛋白酶消化糖缀合物，并通过合适的层析方法（C18、亲水相互作用HPLC HILIC、GlycoSepN柱、SE HPLC、AE HPLC）分离肽，并使用MS/MS鉴别不同肽。该方法可以具有或不具有前述糖链进行使用，该糖链通过化学（smith降解）或酶学方法缩短。使用214至280 nm处的UV检测的糖肽峰定量使得能够相对确定糖基化位点使用。
大小排阻HPLC：更高的糖基化位点使用是通过来自SE HPLC柱的更早洗脱时间来反映的。也参见（a）。
(b) 均一性
可以使用测量聚糖长度和流体动力学半径的方法来评价糖缀合物均一性（即所连接的糖残基的均一性）（见上述和5.3.5节）。
5.2.2 其他潜在的临床/实践应用
本文所述方法可以用于希望将大DNA片段引入到宿主细胞基因组中的任何宿主细胞的构建，其中在携带插入DNA的宿主细胞系生产期间维持DNA片段（例如大规模生产宿主细胞系以产生期望产品，例如由插入DNA所编码的蛋白质）。例如，本文所述方法可以用于生产包含插入DNA的宿主细胞，该插入DNA编码但不限于抗生素、生物碱、类胡萝卜素、烟酰胺和其他次级代谢产物以及通过多种酶反应在同一细胞中合成的辅因子。因此，本文所提供的是包含编码这些组分的插入DNA的宿主细胞。
5.2.3 更高蛋白质产率
整合菌株可以产生更高的糖缀合物产率，这是由于与三质粒系统相比降低了抗生素选择负荷。另外，由于降低了对细胞的代谢负荷而更少发生蛋白降解。
5.2.4 更高蛋白质均一性
整合菌株使得糖缀合物具有更短的、更少分散的多糖长度分布。因此，糖缀合物更容易表征且更好地定义。另外，插入可降低对细胞的周质应激程度，这可导致发酵过程中更少的产物蛋白酶解，这是由于与三质粒系统相比降低了抗生素选择负荷。
5.2.5 更高的生产菌株稳定性
蛋白质糖基化系统需要生产宿主中的三种重组元件：载体蛋白表达DNA、寡糖基转移酶表达DNA、以及多糖表达DNA。现有技术的细菌生产系统包含质粒上的这三种元件。因此，由于质粒丢失而在制造期间存在不稳定的风险，特别是因为用于维持质粒的抗生素禁止在GIMP材料发酵期间存在。由于插入菌株包含更少的移动元件，它们在经过许多代之后更为稳定。这意味着更大规模发酵和更长孵育时间（更高代数）是更可行的。另外，不存在用于选择的抗生素制造了更安全的产品，这是由于不存在可以在敏感主体中引起变态反应的痕量抗生素[4]。
5.2.6 生产过程的更高再现性
插入菌株在遗传学上更稳定，这是由于固定的染色体插入，从而导致生产过程中期望蛋白质产物的更高再现性，例如在包含插入异源DNA的宿主细胞的培养期间。
5.2.7 测试益处的分析方法
产率。作为源自一升细菌生产培养物的碳水化合物量而测量产率，该培养物是在受控的且优化的条件下在生物反应器中生长的。在糖缀合物纯化后，碳水化合物产率可以通过蒽酮测定（参见例如5.2.1.7节）或者使用碳水化合物特异性抗血清的ELISA直接测量。通过使用蛋白质的量（通过熟知的BCA、Lowry或bradford测定法所测量的）以及聚糖长度和结构来计算每克蛋白质的理论碳水化合物量的间接测量是可能的。另外，也可以通过干燥由挥发性缓冲液制备的糖蛋白并使用天平测重来测量产率。
均一性。均一性意指聚糖长度和可能的糖基化位点数的变化性。上文列举的方法可以用于该目的。SE-HPLC允许测量流体动力学半径。载体中更高数量的糖基化位点导致了与具有更少糖基化位点的载体相比的更高流体动力学半径的变化。然而，当分析单个聚糖链时，它们可能更均一，这是由于更受控的长度。聚糖长度是通过肼解、SDS-PAGE和CGE测量的（参见5.1.2.7节）。另外，均一性也可以意指某些糖基化位点使用模式变成更宽/更窄的范围。可以通过糖肽LC-MS/MS测量这些因子（参见5.1.2.7节）。
菌株稳定性和再现性。在不存在选择压力的细菌发酵期间的菌株稳定性是通过直接和间接方法测量的，所述方法确认生产培养细胞中重组DNA的存在或不存在。可以通过延长培养时间（意味着增加的世代时间）来激发培养体积影响。发酵中的世代越多，就越有可能丢失重组元件。重组元件的丢失被认为是不稳定性。间接方法依赖于选择盒与重组DNA的关联性，例如质粒中的抗生素抗性盒。将生产培养细胞铺板在选择培养基上，例如补充了抗生素或者与选择系统相关的其他化学物的LB平板上，以及抗性菌落被认为是对于与各个选择化学物相关联的重组DNA阳性的。在三质粒系统的情况下，计数所有三种抗生素的抗性菌落，以及包含所有三种抗性的细胞部分被认为是稳定菌群。可选地，可以使用定量PCR来测量存在或不存在选择时以及在不同发酵时间点的三种重组元件的重组DNA量。由此，测量并比较重组DNA的相对和绝对量。通过本申请中所述方法对一致性批次的完全分析来测量生产过程的再现性。
5.3 组合物
5.3.1 包含质粒的组合物
在一个实施方案中，本文所提供的是包含本文所述的一种或更多种质粒的组合物，例如一种或更多种供体或辅助质粒。
在具体实施方案中，本文所提供的是包含供体质粒的组合物，其中所述供体质粒包含（i）从5'到3'：（1）限制性内切核酸酶的识别序列，（2）至少0.5千碱基（kb）的第一同源区，（3）至少8 kb的异源插入DNA；和（4）至少0.5 kb的第二同源区；以及（ii）反选择标记物。
在另一具体实施方案中，本文所提供的是包含辅助质粒的组合物，其中辅助质粒包含（i）在第一启动子控制下的编码lamda red重组酶的开放读码框；以及（ii）在第二启动子控制下的编码限制性内切核酸酶的开放读码框，其具有宿主细胞基因组中不存在的识别序列。
在另一具体实施方案中，本文所提供的是包含供体质粒和辅助质粒的组合物，其中所述供体质粒包含（i）从5'到3'：（1）限制性内切核酸酶的识别序列，（2）至少0.5千碱基（kb）的第一同源区，（3）至少8 kb的异源插入DNA；和（4）至少0.5 kb的第二同源区；以及（ii）反选择标记物；以及其中辅助质粒包含（i）在第一启动子控制下的编码lamda red重组酶的开放读码框；以及（ii）在第二启动子控制下的编码限制性内切核酸酶的开放读码框，所述酶具有宿主细胞基因组中不存在的识别序列。
5.3.2 包含宿主细胞的组合物
在一个实施方案中，本文所提供的是包含本文所述宿主细胞的组合物。这样的组合物可以用于生产本文所述缀合疫苗的方法中，例如可以在适于蛋白质生产的条件下培养该组合物。随后，可以从所述组合物分离生物缀合物。
包含本文所提供宿主细胞的组合物可以包含适于本文所述宿主细胞的维持和存活的更多组分，并且可以另外包含宿主细胞蛋白质生产所需的或有利的更多组分，例如用于诱导型启动子的诱导物，诸如阿拉伯糖、IPTG。
5.3.3 免疫原性组合物
5.3.3.1 包含糖基化蛋白质的组合物
在一个实施方案中，本文所提供的是包含一种或更多种糖缀合物的免疫原性组合物，所述糖缀合物是由通过本文所述DNA插入方法所产生的宿主细胞生产的。这样的糖缀合物可包含连接到糖基化共有序列上的O抗原聚糖，所述共有序列是在蛋白质例如载体蛋白内编码。在具体实施方案中，载体蛋白可以是包含一个或更多个所引入的糖基化位点的外毒素A，或者载体蛋白可以是FimCH并包含一个或更多个所引入的糖基化位点。在其他具体实施方案中，载体蛋白可包含大肠杆菌蛋白质抗原，所述抗原包含一个或更多个所引入的糖基化位点。在具体实施方案中，O抗原是来自病原性大肠杆菌分离物的大肠杆菌O抗原，例如O1、O2、O4、O7、O8、O9、O11、O15、O16、O17、O18；O20、O22、O25、O73、O75、或O83。
在另一具体实施方案中，本文所提供的免疫原性组合物包含载体蛋白（例如5.2.1.2节所述载体蛋白），其缀合到本文所述抗原上，例如5.2.1.1节所述抗原。在具体实施方案中，载体蛋白是EPA。在另一具体实施方案中，抗原是大肠杆菌抗原，例如大肠杆菌多糖。
在另一具体实施方案中，本文所提供的免疫原性组合物包含载体蛋白（例如5.2.1.2节所述载体蛋白，例如EPA），其通过O1血清型的大肠杆菌O抗原（O1-EPA）糖基化。
在另一具体实施方案中，本文所提供的免疫原性组合物包含载体蛋白（例如5.2.1.2节所述载体蛋白，例如EPA），其通过O2血清型的大肠杆菌O抗原（O2-EPA）糖基化。
在另一具体实施方案中，本文所提供的免疫原性组合物包含载体蛋白（例如5.2.1.2节所述载体蛋白，例如EPA），其通过O6血清型的大肠杆菌O抗原（O6-EPA）糖基化。
在其它具体实施方案中，本文所提供的免疫原性组合物包含载体蛋白（例如5.2.1.2节所述载体蛋白，例如EPA），其通过O1、O2、O4、O7、O8、O9、O11、O15、O16、O17、O18；O20、O22、O25、O73、O75、或O83血清型的大肠杆菌O抗原糖基化。
本文所提供的免疫原性组合物可以用于在组合物所施用的宿主中激发免疫应答。因此，本文所述免疫原性组合物可以用作疫苗并可以因此配成药物组合物。在具体实施方案中，本文所述免疫原性组合物用于预防对象（例如人对象）的大肠杆菌感染。在具体实施方案中，本文所述免疫原性组合物用作针对由大肠杆菌感染所引起的尿道感染的疫苗。
例如，用作针对由大肠杆菌感染所引起的尿道感染的疫苗的本文所述免疫原性组合物可包含载体蛋白（例如5.2.1.2节所述载体蛋白，例如EPA），其通过大肠杆菌抗原（例如5.2.1.1节所述的大肠杆菌抗原）糖基化。在具体实施方案中，大肠杆菌抗原是O1、O2、O4、O7、O8、O9、O11、O15、O16、O17、O18；O20、O22、O25、O73、O75、或O83血清型的O抗原。
在另一具体实施方案中，本文所述免疫原性组合物用于预防对象（例如人对象）的假单胞菌感染。在另一具体实施方案中，本文所述免疫原性组合物用于预防对象（例如人对象）的志贺氏菌感染。
包含本文所述生物缀合物的组合物可包含适合用于药物施用的任何额外组分。在具体实施方案中，本文所述免疫原性组合物是单价制剂。在具体实施方案中，本文所述免疫原性组合物是多价制剂。例如，多价制剂包含多于一种的本文所述生物缀合物。
在某些实施方案中，本文所述组合物另外包含防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞。在具体实施方案中，本文所述药物组合物包含0.001％至0.01％硫柳汞。在其他实施方案中，本文所述药物组合物不包含防腐剂。
在某些实施方案中，本文所述组合物（例如免疫原性组合物）包含佐剂，或者是与佐剂组合施用的。用于与本文所述组合物组合施用的佐剂可在施用所述组合物之前、同时、或者之后施用。在一些实施方案中，术语“佐剂”是指与本文所述组合物联合或作为其部分施用时增加、加强和/或提高针对生物缀合物的免疫应答的化合物，但是当单独施用该化合物时不产生针对生物缀合物的免疫应答。在一些实施方案中，佐剂产生了针对多聚生物缀合物多肽的免疫应答并且不会产生过敏反应或其他不良反应。佐剂可以通过几种机制加强免疫应答，包括例如淋巴细胞募集、B和/或T细胞刺激、以及巨噬细胞刺激。佐剂的具体例子包括但不限于铝盐（明矾）（诸如氢氧化铝、磷酸铝、以及硫酸铝），3脱-O-酰基单磷酰脂质A（MPL）（参见英国专利GB2220211），MF59 （Novartis），AS03 （GlaxoSmithKline），AS04 （GlaxoSmithKline），聚山梨酯80 （Tween 80；ICL Americas, Inc.），咪唑并吡啶化合物（参见国际申请号 PCT/US2007/064857，作为国际公开号 WO2007/109812公布），咪唑并喹噁啉化合物（参见国际申请号 PCT/US2007/064858，作为国际公开号 WO2007/109813公布）以及皂苷，诸如QS21（参见Kensil等，Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach（Powell & Newman编辑，Plenum Press, NY, 1995）；美国专利号 5,057,540）。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂（完全的或不完全的）。其他佐剂是水包油乳剂（诸如角鲨烯或花生油），任选与免疫刺激物组合，诸如单磷酰脂质A（参见Stoute等，N.336, 86-91 （1997））。另一佐剂是CpG（Bioworld Today, 1998年11月15日）。
5.4 治疗和免疫方法
在一个实施方案中，本文所提供的是治疗对象中感染的方法，包括将本文所述糖缀合物或其组合物施用给对象。在具体实施方案中，用本文所述于治疗感染的方法包括将有效量的本文所述糖缀合物或其组合物施用给有此需要的对象。
在另一实施方案中，本文所提供的是诱导对象中的免疫应答的方法，包含将本文所述糖缀合物或其组合物施用给对象。在具体实施方案中，用于诱导针对本文所述糖缀合物的免疫应答的方法包括将有效量的本文所述生物缀合物或其组合物施用给有此需要的对象。
在另一实施方案中，本文所提供的是用于产生单克隆抗体以预防感染的方法，其使用本文所述生物缀合物或其组合物。
在具体实施方案中，施用糖缀合物或其组合物的对象具有或者易受感染，例如细菌感染。在另一具体实施方案中，施用生物缀合物或其组合物的对象感染了大肠杆菌或者易受大肠杆菌感染。
6 实施例
6.1 实施例1：用于大肠杆菌O1 O抗原缀合物生产的菌株构建
插入的第一步是通过标准分子克隆技术[1]将O1 rfb簇克隆到供体质粒pDOC中。将O1 rfb簇区域克隆到质粒pLAFR1中以确认活性（A，下文），并平行克隆到供体质粒pDOC中以将O1簇插入到基因组中（B，下文）。
A. 将O1 rfb簇及其侧翼1.5 kb区域亚克隆到粘粒载体pLAFR1（GenBank:AY532632.1）中。使用寡核苷酸2193/2161（见表3）通过PCR从名为upecGVXN032（StGVXN3736）的临床分离物的染色体DNA扩增O1簇。寡核苷酸2193/2161在O1 rfb簇的侧翼基因中（即在galF中和gnd后）退火。将PCR产物克隆到p157的SgsI位点中。p157是包含由两个互补寡核苷酸（300/301）构成的盒的pLAFR1，将其克隆到EcoRI位点中得到p947。使用p947作为模板，使用寡核苷酸2198/2166进行PCR以从5'末端（galF’）至簇的最后基因（wekO）末端的侧翼区扩增O1 rfb簇DNA（参见图3）。将产物克隆到p967的BamHI/SgsI位点，得到p985。p967是从pDOC-C（GenBank:GQ889494.1）克隆的，且包含MCS和kanR盒（细节参见6.2节）。使用p985作为模板进行O1 rfb簇的PCR用于进一步插入到p562中（见下文）。
B. 如下制备p562：使用两种PCR产物和寡核苷酸1187/1188由装配PCR（assembly PCR）产生插入片段（见表3）。使用寡核苷酸1188/1189从pKD3（GenBank:AY048742.1）产生一种PCR产物（见表3；编码clmR盒和FRT位点），以及另一种是用寡核苷酸1186/1187的源自W3110基因组DNA的PCR的3'同源区（见表3；即W3110基因组的O16 rfb簇下游的DNA，其编码基因间区域和gnd基因）。使用BamHI/EcoRI切割组装的DNA，并克隆到pDOC-C的相同位点中，得到p482。然后使用W3110染色体DNA和寡核苷酸1171/1515产生5'同源区的PCR产物（编码表示为galF'的galF基因，以及galF和第一个O16基因之间的基因间区域），用BamHI和SpeI切割，并克隆到p482的SpeI/BamHI位点中，得到p562。
p562编码具有MCS和位于其间的反向clmR抗性盒的5'和3'同源区（5'：O16 rfb簇的rmlB上游1 kb；3'：O16 rfb簇最后基因的1.6 kb下游DNA）。MCS是用来插入O1 rfb簇，它是使用寡核苷酸2214/2215从p985扩增的。所得质粒p1003是用于O1 rfb簇插入的供体质粒，并包含如图3A和表1所示的元件。
插入和选择：通过电穿孔将辅助质粒p999（GenBank:GU327533.1）引入到W3110细胞中。由于p999的温度敏感复制表型，所得细胞一直于30℃下生长在LB中，所述LB中补充了用于p999选择的壮观霉素。在下一步中，通过电穿孔将p1003引入到包含p999的W3110细胞中。在30℃的LB培养基中选择氨苄青霉素和壮观霉素抗性的细胞。将质粒插入到受体细胞中以使得辅助质粒上所编码的酶能够在同一细胞中存在供体质粒DNA的情况下表达。
接下来，进行插入程序。在氨苄青霉素和壮观霉素存在下，30℃下以5 ml规模于LB培养基中生长新鲜转化的菌株，以180 rpm过夜。将10 μl高浓度培养物转移到包含1 ml补充了spec和amp的LB的新管中。然后在180 rpm于30℃生长新培养物2小时，将细胞在5000 rpm于4℃离心5分钟，用补充了spec、0.2％阿拉伯糖（w/v）和1 mM IPTG的LB培养基替换上清液。培养基组成支持辅助质粒选择、以及重组酶和SceI内切核酸酶表达以使得能够插入。将细胞重悬浮并进一步于30℃以180 rpm孵育4-18小时。
在培养基更换后的不同时间点，将0.5 ml培养物在补充有clm（用于DNA插入片段的选择）和10％（w/v）蔗糖（以反选择供体质粒）的LB平板上铺板，并在37℃孵育过夜（以针对温度敏感的辅助质粒的丢失进行选择）。
为筛选所得菌落的正确插入表型，将细胞在补充有spec、amp、或clm的LB平板上影印铺板。将clm抗性（存在插入片段）但是amp和spec敏感（不存在供体和辅助质粒）的菌落针对插入进行进一步的分析。
为确认菌株丢失了源自W3110的替换DNA并包含DNA插入片段，进行了菌落PCR。挑取具有正确表型的候选菌落（氨苄青霉素敏感性、氯霉素抗性、壮观霉素敏感性、蔗糖抗性），并进行菌落PCR测试。使用PCR策略[51]鉴别肠外大肠杆菌（ExPEC）菌株的O血清型。使用了特异于14种普通ExPEC O血清型的rfb簇中所存在的独特基因序列的寡核苷酸对。在O1插入的情况下，使用了从O1（2241和2242）或O16扩增wzx部分的寡核苷酸。检验了各种克隆。在一些克隆中确认了成功的插入，这是通过O16特异性寡核苷酸的PCR产物的不存在（未显示）、以及O1寡核苷酸特异性信号的存在，图3B。将所得菌株命名为W3110 ΔrfbO16::rfbO1-clmR。
在下一步中，通过使用表达FLP重组酶的温度敏感性pCP20质粒将随O1 rfb簇插入的clmR盒从DNA中去除，如[35]所报道的。测试所得细胞对clm的敏感性，以及然后进一步测试。将所得菌株命名为W3110 ΔrfbO16::rfbO1。
此外，为了最佳糖缀合物生产，将O抗原连接酶（waaL）从生产菌株中缺失。这是通过噬菌体转导进行的。使用P1vir噬菌体（大肠杆菌遗传资源中心#12133）产生来自W3110 ΔwaaL::clmR菌株的裂解物，其中waaL基因被clmR盒替换，是通过使用寡核苷酸623和624从pKD3中PCR扩增的[13，52]。在W3110 ΔrfbO16::rfbO1上进行噬菌体转导，并将所得菌株命名为W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL::clmR。随后，通过FLP驱动的重组将氯霉素抗性盒去除（W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL）。
在重组加工和选择的每个阶段，对O1 wzx的存在进行PCR测试以确认O1 rfb簇的存在（图3B）。可以进行进一步的PCR测试，使用特异性扩增插入片段5'和3'末端重组区域的寡核苷酸，即在HR1和2区域之外退火的寡核苷酸对（‘5'和3'转换区PCR’）。例如，可以产生在W3110基因组中退火的一种PCR寡核苷酸，以及在DNA插入片段中退火的另一种。因此，只有插入成功，阳性PCR信号才是可能的。然后可以对所得PCR产物测序以确认染色体受体株DNA和DNA插入片段的连接。另外，PCR和测序可以用来确认噬菌体转导和clmR盒去除修饰。
为确认所插入DNA的活性，测试了菌株构建不同阶段的插入菌株的糖脂生产，所述菌株中含有O1抗原多糖。根据来自通过抗生素和蔗糖敏感性表型预筛以及PCR测试的阳性结果，选择了来自初始插入实验的候选克隆。将细胞在LB培养基中过夜生长，并制备全细胞提取物。为分析所产生的糖脂，用蛋白酶K处理提取物以消除可能的蛋白质干扰。将所得样品在SDS-PAGE上跑电泳，并在转移到硝酸纤维素膜上之后，通过银染染色检测，或者使用抗O1的特异性抗血清通过免疫染色检测。当通过银染分析来自推定整合体的提取物时，观察到了指示LPS的25至55 kDa之间的梯状模式（图4上图，1、2泳道），如对照菌株中一样（3泳道）。Western印迹显示了相同分子量范围的梯状信号，这确认了LPS包含O1抗原（图4A下图，1、2泳道），类似于源自临床O1分离物的对照LPS（3泳道）。这些结果确认了W3110 ΔrfbO16::rfbO1-clmR中的脂质A上所显示的O1抗原产生。
再次通过Western印迹（图4B，1、2泳道）测试W3110 ΔrfbO16::rfbO1菌株（在去除clmR盒之后）以确认O1 LPS产生，尽管进行了修饰。为确认菌株W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL::cat中经噬菌体转导的waaL缺失，再次分析LPS产生（图4C，1泳道）。梯状信号如预期那样从银染测定中消失了（上图）。Western印迹分析仍然检测到了梯状信号（1泳道，下图），虽然具有低于对照菌株（W3110 ΔrfbO16::rfbO1）的强度，其仍然包含waaL基因（2泳道）并能够产生如银染所见的LPS。更弱的信号源自连接有Und-PP的O1 O抗原，其由于waaL基因的缺失而不能转移到脂质A上。这意味着如预期那样发生了经噬菌体转导的waaL缺失，确认了基因型W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL::cat。选择以与通过FLP源性重组同样方式去除clmR盒的所选克隆。通过银染和Western印迹（图4D）分析所得克隆（W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL），并显示了如图4D的1泳道所观察到的相当的表型。
通过另外的方法表征最终菌株W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL。为确认这些细胞在Und-PP上的O抗原的产生，使用了允许通过荧光2 AB标记接着通过HPLC和MS/MS对脂质连接寡糖（Und-PP连接的O抗原）进行分子表征的方法。于37℃在摇瓶中过夜生长W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL和对照菌株（W3110 ΔwaaL）。收集OD600等于400的细胞，并用0.9％ NaCl冲洗一次。将冲洗过的细胞沉淀冻干。用95％甲醇（MeOH）从干的细胞中提取脂质，其通过重复几轮的涡旋并在冰上孵育10 min。通过添加ddH2O将悬浮液转变成85％ MeOH并在冰上进一步孵育10 min，同时有规律地涡旋。离心之后，收集上清液并在N2下干燥提取物。将干燥的脂质溶于1:1（v/v）甲醇/水（M/W）中，并通过C18 SepPak预装柱（Waters Corp., Milford, MA）。用10 ml MeOH活化预装柱，接着用1:1 M/W的10 ml的10 mM TBAP平衡。加载样品之后，用1:1 M/W的10 ml的10 mM TBAP冲洗预装柱，并用5 ml MeOH接着用5 ml的10:10:3氯仿/甲醇/水（C/M/W）洗脱。将合并的洗脱液在N2下干燥。
通过将干燥样品溶于50％正丙醇中2ml 1M三氟乙酸（TFA）中并加热到50℃持续15 min而将脂质样品水解。将水解样品在N2下干燥，溶于4 ml的3:48:47 C/M/W中并通过C18 SepPak预装柱以将脂质从水解的聚糖中分离。用10 ml MeOH条件化预装柱，接着用10 ml的3:48:47 C/M/W平衡。将样品应用到预装柱上，并收集流过液。用4 ml的3:48:47 C/M/W冲洗预装柱，并使用SpeedVac将合并的流过液干燥。
根据Bigge等用2-氨基苯甲酰胺（2 AB）标记干燥样品[48]。使用根据Merry等描述的纸盘法进行聚糖清除[53]。通过HPLC进行2 AB标记聚糖的分离，HPLC使用根据Royle等[49]的GlycoSep N正相柱，但是修改为三溶剂体系：溶剂A：80％乙腈中的10 mM甲酸铵，pH 4.4。溶剂B：40%乙腈中的30 mM甲酸铵，pH 4.4。溶剂C：0.5％甲酸。柱温为30℃，并通过荧光检测2 AB标记的聚糖（λex= 330 nm, λem= 420 nm）。梯度条件：以0.4 ml min-1流速的100％A到100％B的线性梯度经过160 min，接着是2 min的100％B到100％C，经过2 min回到100％A并在100％A以1 ml min-1流速运行15 min，然后流速回到0.4 ml min-1运行5 min。将样品注入ddH2O中。
为鉴别O-抗原特异性聚糖，将来自对照细胞的2 AB聚糖概况与获自W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL的概况（图5A）相比较。采集W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL的具体峰，并在MALDI SYNAPT HDMS Q-TOF系统（Waters Corp., Milford, MA）上分析2 AB聚糖（图5B）。将样品溶于5:95乙腈/水中，并用80:20甲醇/水中的20 mg ml-1 DHB以1:1点样。用PEG（现成的混合溶液，Waters Corp., Milford, MA）进行校准，用60:40:0.1乙腈/水/三氟乙酸中的5 mg ml-1 α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA, Sigma-Aldrich, Switzerland）以1:3点样。仪器配备有200 Hz固态UV激光器。以正离子模式记录质谱。对于MSMS：激光能以200Hz发射率固定在240，碰撞气为氩气，使用碰撞能谱逐渐改变（ramp）碰撞能，其取决于m/z。合并所有光谱，使用MassLynx v4.0软件（Waters Corp., Milford, MA）进行背景扣除、平滑（Savitzsky Golay）和居中。该方法也在US2011/0274720 A1中描述。
通过MALDI-TOF/TOF分析，源自W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL的几个特定峰（图5B）的碎片离子系列是与所报道的大肠杆菌O1A血清亚型的单糖序列[54]一致的。由此确认了适用于糖缀合物形成的产生O1A O抗原的基于W3110的大肠杆菌株的构建。
为显示该菌株的O1A糖缀合物的产生，将编码弯曲空肠菌PglB寡糖基转移酶（五种不同变体，见下文）和铜绿假单胞菌载体蛋白外毒素A（编码4个糖基化共有序列，p659）的诱导型表达的质粒通过电穿孔引入到W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL中。将生产细胞接种到补充了5 mM MgCl2、spec和amp的LB培养基中，在37℃下过夜生长到静止期。然后将细胞稀释到0.05的OD600，并在包含spec和amp的TB中生长直至0.8的OD600。通过添加0.2％阿拉伯糖和1 mM IPTG来起始EPA和PglB表达，并将培养物再生长20小时。然后通过离心收获细胞，并使用溶菌酶方法制备周质细胞提取物[55]。通过SDS PAGE分离周质提取物（标准化成OD600），并在电转移后通过免疫印迹分析（图6）。对所有样品用抗EPA抗血清（左图）和抗O1抗血清（右图）检测都显示了100至130 kDa之间的清楚梯状模式，这是由EPA蛋白和O1多糖所组成的糖蛋白的强标志。用单独的EPA抗血清所获得的信号（大于70 kDa）对应未糖基化的EPA。显然，不同PglB变体导致了不同的糖蛋白比生产率：用相应于原始野生型弯曲空肠杆菌蛋白质序列的包含C末端HA标签的PglB（p114, [9]）获得了最小产率。单独的密码子优化（p939），密码子优化和HA标签去除（p970），密码子优化和天然PglB糖基化位点突变为N534Q（p948），以及密码子优化、HA标签去除和天然PglB糖基化位点的去除（p971），导致了表明数倍更高产率的更强信号。更高产率可通过当使用密码子优化的基因时PglB翻译的更有效方式，并且C末端HA标签妨碍了PglB蛋白质的活性或折叠来解释。
可以通过生物反应器中的插入菌株以10 l规模生产糖蛋白，用于高纯糖缀合物的制备纯化，所述缀合物显示了如三质粒系统所观察到的更短聚糖长度。可以使用毛细管凝胶电泳来分析糖缀合物的纯度和大小。例如，连接到糖缀合物上的多糖可以通过肼解从蛋白质上去除，并通过2 AB标记和HPLC-MS/MS进行分析，用于多糖结构和长度分析。可以使用这样的分析来确认O1A O抗原连接到糖蛋白载体上。此外，可以进行PMP分析用于单糖组成确定，进行NMR分析和气相层析用于结构确认。另外，可以进行动物免疫以产生抗聚糖和载体蛋白的抗体。抗感染活性可以通过临床前测定显示，诸如调理吞噬（opsonophagocytotic）杀灭测定和/或被动保护。
6.2 实施例2：用于大肠杆菌O2 O抗原缀合物生产的菌株构建
类似实施例1进行菌株构建。将O2 rfb簇克隆到由HR区和盒组成的pDOC质粒中，详见表1。用寡核苷酸2207/2166从临床分离物upecGVXN116（StGVXN3949）扩增O2 rfb簇，并克隆到p967的BamHI/SgsI位点中。O2 rfb扩增子包含galF内直到wekR的所有序列。从DNA插入片段中删掉wekR和gnd之间的DNA。通过由两个部分互补寡核苷酸（2167/2168）构成的寡聚盒插入而将p967克隆到p946的XhoI和BamHI位点中。p946的获得是通过用AscI消化p843，用DNA聚合酶的Klenow片段处理线性化质粒以填平粘性限制性位点末端，以及质粒的连续再连接获得p946。使用同样的酶，使用寡核苷酸2066和2068（见表3）克隆源自pKD4[13]的PCR扩增子到p482的BamHI和SgsI位点来产生p843。所得供体质粒p1003包含来自upecGVXN116的上游HR1区和rfb簇，接着是可去除的kanR盒，并且接着是HR2区（图7）。
通过电穿孔将p999辅助质粒（GenBank:GU327533.1）引入到W3110细胞中[1]。将水中的5-500 ng DNA与50μl电感受态细胞悬浮液在冰上的标准电穿孔槽中混合，并以1.8 kV电压在BioRad Micro Pulser（BioRad, Hercules, CA）中电穿孔2-10 ms。由于p999的温度敏感性复制表型，将所得细胞铺板并一直在30℃下生长。在下一步中，通过在补充了用来选择p999的壮观霉素的LB中于30℃生长包含p999的W3110而制备感受态细胞，并通过电穿孔将p1003引入到细胞中，以及在30℃于LB平板上选择氨苄青霉素和壮观霉素抗性的细胞。将质粒插入到受体细胞中以使得辅助质粒上所编码的酶能在同一细胞中存在供体质粒DNA的情况下表达。
在氨苄青霉素和壮观霉素存在下，30℃下以5 ml规模于LB培养基中生长新鲜转化的菌株，以180 rpm过夜。将10 μl培养物转移到包含1 ml补充了spec和amp的液体LB的新管中。然后以180 rpm于30℃生长新培养物2小时。然后，将细胞以5000 rpm于4℃离心5分钟，丢弃上清液，并添加补充了壮观霉素、0.2％阿拉伯糖（w/v）和1 mM IPTG的LB培养基以支持辅助质粒选择（Spec）、以及重组酶（阿拉伯糖）和SceI内切核酸酶（IPTG）表达。将重悬浮细胞进一步于30℃以180 rpm孵育4-18小时。
在培养基更换后从4至18小时的不同时间点，将0.5 ml培养物在补充了kan（用于DNA插入片段的选择）和10％（w/v）蔗糖（以反选择供体质粒）的LB上铺板，并在37℃孵育过夜（以针对温度敏感性辅助质粒的丢失进行选择）。
为筛选所得菌落的正确插入表型，将细胞在补充了spec、amp、或kan的LB平板上影印铺板。将kan抗性（存在插入片段）但是amp和spec敏感（不存在供体和辅助质粒）的菌落针对插入进行进一步的分析。
在下一步中，如上述通过噬菌体转导破坏waaL基因。将噬菌体转导所得菌株进行clm（waaL缺失）和kan（O2 rfb簇插入）抗性选择，产生基因型W3110 ΔrfbO16::rfbO2-kanR ΔwaaL::cat。
如所述使用pCP20通过FLP重组酶驱动的重组在单个步骤中将kan（来自rfb簇插入）和clm（waaL缺失）抗生素抗性盒去除[35]。
使用以前公布的寡核苷酸2243和2244，通过PCR针对O16 wzx不存在和O2 wzy的存在来测试DNA插入片段的插入（图7A）。[51]。进一步分析可以包括5'和3'转换区PCR和测序。使用在waaL基因侧翼DNA区域退火的寡核苷酸1114和1326（见表3），通过菌落PCR方法测试waaL缺失（图7B）。当存在完整waaL拷贝时用这些寡核苷酸得到的PCR产物大于1.5kb（1和5泳道），如果waaL被clmR盒替换则稍小一些（低于1.5 kb，2和6泳道），以及在clmR盒去除之后PCR扩增子为约0.5 kb大小（图7B）。因此，waaL缺失是成功的。可以通过5'和3'转换区PCR测试最终菌株（W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL）。
将使用LPS样品的O2分型血清的银染和Western印迹用来确认菌株构建期间的O抗原生产表型（图8）。当用抗O2抗血清探测时，在来自推定整合体（W3110 ΔrfbO16::O2-kanR，A，1泳道）的提取物中以及阳性对照株临床大肠杆菌O2分离物（2泳道）中都检测到了梯状。这表明整合体包含了活性O2 rfb簇。通过银染（图8B，左图）和Western印迹（图8B，右图）测试了最终菌株（W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL）的LPS和Und-PPO抗原产生。尽管waaL阳性株产生了LPS，如通过银染可见的具有梯状信号（2泳道），而在waaL缺失和抗生素盒去除后，信号不存在了（1泳道）。Western印迹（图B）在两种样品中都显示出了梯状模式，虽然waaL缺失株中强度低得多。这表明waaL缺失株实际上产生了Und-PP连接的O2活性多糖。
为确认这些细胞Und-PP上的O抗原产生，使用上述2 AB标记方法（6.2节）。当与不能产生O抗原的菌株比较荧光痕迹时，观察到了特异于W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL的信号。具体峰洗脱时间是与以前鉴别的O2重复单元一致的，如通过MALDI MS/MS所分析的（图9A）。如上述通过MALDI-TOF/TOF分析了来自几个所收集峰的碎片离子系列。碎片模式是与O2 O抗原重复单元一致的（图9B）。由此确认了产生O2 O抗原的基于W3110的大肠杆菌株W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL的构建。
为显示W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL的O2糖缀合物的产生，将用于弯曲空肠菌PglB寡糖基转移酶（两种不同变体）和载体蛋白EPA（编码4个糖基化共有序列，p659）的诱导型表达的质粒通过电穿孔引入到W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL中。将细胞接种到补充了5 mM MgCl2、spec和amp的LB培养基中，在37℃下过夜生长到静止期。然后将细胞稀释到0.05的OD600，并在包含spec和amp的TB中生长直至0.8的OD600。通过添加0.2％阿拉伯糖和1 mM IPTG来起始EPA和PglB表达，并将培养物再生长20小时。然后通过离心收获细胞，并使用溶菌酶方法制备周质细胞提取物[55]。通过SDS PAGE分离周质提取物（标准化成细胞密度），并通过western印迹分析（图10）。用抗EPA抗血清（左图）和抗O2抗血清（右图）的检测都显示了大于100 kDa的典型O抗原梯状模式的两个簇，强烈指示由EPA蛋白和O2多糖所组成的糖蛋白。用单独的EPA抗血清所获得的信号（大于70 kDa）对应未糖基化的EPA。第一个簇（100和130 kDa之间）对应单倍，第二个较弱的簇（大于130 kDa）对应双倍糖基化的EPA蛋白。在抗O2 western印迹中所观察到的梯状信号最可能是EPA O2糖缀合物的降解产物，其仍包含多糖部分。显然两种PglB变体产生了相似的糖蛋白比生产率。upecGVXN124（StGVXN3947）是临床O2血清型分离物，其中缺失了waaL基因[13]，并通过电穿孔将质粒p659和p939引入其中。使用该对照表达系统作为比较对象（x泳道），从源自W3110 ΔrfbO16::rfbO2 ΔwaaL的提取物（B泳道）观察到了比从使用临床分离物（upecGVXN124）作为表达宿主的表达系统更强的信号。因此，W3110中的插入可以产生与天然菌株中的糖基化相比更高的糖缀合物产率。
还可以通过生物反应器中的插入菌株以10 l规模生产糖蛋白，用于展示如三质粒系统所观察到的更短聚糖长度的高纯糖缀合物的制备纯化。可以使用毛细管凝胶电泳来分析糖缀合物的纯度、量和大小。连接到糖缀合物上的多糖可以通过肼解从蛋白质上去除，并通过2 AB标记和HPLC-MS/MS进行分析，用于多糖结构和长度分析。可以使用这样的分析来确认O2 O抗原连接到糖蛋白载体上。此外，可以进行PMP分析用于单糖组成确定，进行NMR分析和气相层析用于结构确认。另外，可以进行动物免疫以产生抗聚糖和载体蛋白的抗体。抗感染活性可以通过使用诸如调理吞噬杀灭测定和/或被动保护的测定来显示。
6.3 实施例3：用于大肠杆菌O6 O抗原缀合物生产的菌株构建
如上所述进行菌株构建将O6 rfb簇克隆到由HR区和kanR盒组成的pDOC质粒中，详见表1。用寡核苷酸1907/1908从来自大肠杆菌株CCUG11309的基因组DNA扩增O6簇（图11A），并克隆到p843的BamHI和BcuI位点中，产生p914。
通过电穿孔将p999辅助质粒（GenBank:GU327533.1）引入到W3110细胞中[1]。将水中的5-500 ng DNA与50μl电感受态细胞悬浮液在冰上的标准电穿孔槽中混合，并以1.8 kV电压在BioRad Micro Pulser（BioRad）中电穿孔2-10 ms。由于p999的温度敏感性复制表型，将所得细胞铺板并一直在30℃下生长。在下一步中，通过电穿孔将p914引入到具有p999的W3110中，并在30℃的LB平板上选择amp和spec抗性的细胞。将质粒插入到受体细胞中以使得辅助质粒上所编码的酶能够在同一细胞中存在供体质粒DNA的情况下表达。
在amp和spec存在下，于30℃下以5 ml规模于LB培养基中生长包含辅助和供体质粒的电穿孔克隆，以180 rpm过夜。将10μl培养物转移到包含1 ml补充了spec和amp的液体LB的新管中。然后以180 rpm于30℃生长新培养物2小时。然后，更换培养基：将培养物以5000 rpm于4℃离心5分钟，丢弃上清液，并将细胞沉淀重悬浮在补充了spec、0.2％阿拉伯糖（w/v）和1 mM IPTG的LB培养基中以支持辅助质粒选择（Spec）、以及重组酶（ara）和SceI内切核酸酶（IPTG）表达。将重悬浮细胞进一步于30℃以180 rpm孵育4-18小时，以使得重组事件能够发生。
在培养基更换后从4至18小时的不同时间点，将0.5 ml培养物在补充了kan（用于DNA插入片段的选择）和10％（w/v）蔗糖（以反选择供体质粒）的LB上铺板，并在37℃孵育过夜（以选择温度敏感性辅助质粒的丢失）。
为筛选所得菌落的正确插入表型（W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR），将细胞在补充了spec、amp、或kan的LB平板上影印铺板。将kan抗性（存在DNA插入片段）但是amp和spec敏感（缺少供体和辅助质粒）的菌落针对插入进行进一步的分析。另外，进行了菌落印迹。将生长在补充了kan的LB上的影印铺板的菌落通过“菌落提升（colony lifting）”转移到硝酸纤维素膜上：将圆形硝酸纤维素膜铺在LB平板上生长的菌落之上直到膜完全变湿。提起膜后，将粘附在膜上的菌落在补充了Tween 20（0.02 % w/v）的PBS中冲洗掉。此后，使用抗O6抗血清以western印迹处理膜，以检测产生O6抗原的菌落。在膜显影之后，阳性菌落显示为黑点。
如所述使用质粒pCP20通过FLP重组酶驱动的重组在单个步骤中将kan（来自rfb簇插入）和clm（waaL缺失）抗生素抗性盒去除[35]。
通过针对O16 wzx不存在和O6 wzy的存在的PCR[51]（图11D）、通过5'（图11B）和3'（图11C）转换区PCR、LPS样品的银染、以及使用O6分型血清的western印迹分析（图12）测试DNA插入片段的插入。当用抗O6血清分析时，只有克隆A（图12A，1泳道）产生了梯状O抗原信号（类似于大肠杆菌O6对照株，3泳道），而克隆B是阴性的（2泳道）。对于rfb簇的功能性活性的所有进一步测试都是阳性的。
在下一步中，如上所述通过来自克隆A的噬菌体转导破坏waaL基因[52]。银染显示了waaL缺失株缺少O抗原（图12B，左图，1泳道），以及western分析显示了相同提取物中Und-PP连接的O6 O抗原为典型的弱梯状信号（图12B，右图，1泳道）。在waaL缺失之前，清楚地观察到了LPS（两个图中，2泳道）。该结果显示了成功的waaL缺失。
通过FLP重组在两个连续步骤中去除clm（waaL缺失）以及然后kan（rfb簇插入）的抗生素抗性盒[35]。图12C显示了在clmR去除之后剩余Und-PP连接信号的两个克隆（泳道1，2）（western印迹，右图）。通过5'和3'转换区PCR测试最终菌株（两个克隆，W3110 ΔrfbO16::rfbO6 ΔwaaL）（图11A和B）。可以进行LPS的银染，Und-PP连接的多糖的Western印迹和荧光2 AB标记、接着HPLC和MS/MS分析来确认。所有数据可以确认成功的插入，以及两个所选克隆的rfb簇的功能性活性。
为显示O6糖缀合物的产生，通过电穿孔将提供弯曲空肠杆菌PglB寡糖基转移酶（p939）和载体蛋白EPA（编码4个糖基化共有序列，p659）的诱导型表达的质粒引入到W3110 ΔrfbO16::rfbO6-kanR ΔwaaL（即最终菌株W3110 ΔrfbO16::rfbO6 ΔwaaL的原型）中。生长细胞并添加诱导物，并将细胞进一步过夜生长。收集样品，并使用溶菌酶方法[55]制备周质细胞提取物。通过SDS PAGE分离周质提取物（标准化成细胞密度），并在电转移后通过免疫印迹分析。用抗EPA抗血清和抗O6抗血清两者的检测都显示了两个清楚的梯状信号簇，一个在100和130之间，以及一个在130 kDa以上（图13）。这些信号强烈指示由EPA蛋白和O6多糖组成的糖蛋白。用单独的EPA抗血清所获得的信号（大于70 kDa）对应未糖基化的EPA。显然检测到了两个梯状簇，指示两个位点的EPA糖基化。
还可以在生物反应器中以10 l规模通过插入菌株生产糖蛋白，用于糖缀合物的制备性纯化。连接到糖缀合物上的多糖可以通过肼解从蛋白质上去除，并通过2 AB标记和HPLC-MS/MS作为Und-PP连接的O抗原进行分析。该分析可以确认O6抗原连接到糖蛋白载体上。
为分析插入菌株的缀合物生产的质量和数量，插入菌株的O1、O2和O6 EPA糖缀合物生产的性能与可选生产系统进行了比较，所述系统是“三质粒系统”，即具有现有技术[9]中所述附加体上所编码的rfb簇的系统，或者“野生型菌株”系统。在前者中，使用W3110 ΔwaaL株作为表达宿主。在与插入的和野生型系统相比的那种系统中存在一些技术差别。三质粒系统需要在宿主中引入和维持三质粒。这意味着发酵期间不得不添加三种不同的抗生素到培养基中以确保质粒维持。三质粒的共存需要相容的载体主链。尤其是大的rfb簇序列需要特定维持系统和强选择压力。对于重组微生物发酵产物来说，质粒维持是生产过程中产率降低的恒定原因，主要是因为发生了质粒丢失，以及因此受影响的细胞停止生产重组产物，或者是因为质粒维持施加了如此大的负担给细胞以至于产率降低了。由于人类对抗生素的潜在过敏性不良事件，监管机构越来越多要求不含抗生素的生产过程。因此，将以前存在于附加体上的生物合成簇整合到染色体上具有明确优点。
第二种可能的生产系统基于源自受感染个体或者来自野外的天然临床分离物，并使用它们作为生产平台。因为它们天然产生目的O抗原，简单的waaL缺失就使那些菌株成为合适的天然插入生产株。然而，由于大肠杆菌临床分离物中编码并表达了许多毒素和因子，监管机构对来自这样系统的产品要求更高的质量标准，这是昂贵且费时的。因此，插入到充分研究的且安全的宿主W3110中代表了合适的可选方案：减少了质粒相关的缺点，并满足了经济需求。
我们对所有三种大肠杆菌O抗原分析了所有三种生产系统（图14）。将EPA（p659）和PglB（p939）的表达质粒引入到包含rfb基因座的宿主细胞中，该基因座要么在基因组中（插入菌株或临床分离物）要么在质粒上（三质粒系统）。首先将细菌培养物在LB培养基中过夜生长，该培养基中包含维持细胞中存在的质粒所需的所有抗生素。然后，将培养物在TB培养基中稀释到0.05的OD600，并生长直至0.4-1.2的OD600，且添加诱导物（阿拉伯糖0.2％，IPTG 1 mM）。诱导后在37℃下20小时，收获细胞，并使用溶菌酶方法制备周质提取物。然后通过SDS PAGE和免疫检测（western印迹）分析周质裂解物。
在抗-EPA印迹中观察到了大于70 kDa的未糖基化的EPA。大于100 kDa的梯状模式簇代表全长糖缀合物，其具有典型O抗原多糖长度分布。通常，所有系统都产生相似数量级的糖缀合物。然而，三质粒系统在抗-EPA和抗多糖Western印迹中产生了比插入菌株（野生型和插入的）似乎分布更广（图14，图A，比较3泳道和2泳道）或者达到更高分子量水平（所有小图，比较3泳道和2泳道）的梯状信号。这表明插入策略对于糖缀合物生产来说是强力的过程调节工具。
可以进行长多糖糖缀合物（由三质粒系统制备）和插入菌株的临床前比较，以确定后一缀合物是否更有免疫原性以及更明确。
可以进行生产培养物中培养物均一性和重组DNA元件维持的比较，以显示来自插入宿主菌株的细胞能够产生更高水平的产物、展现更好的再现性魔术以及它们是遗传学上更稳定的，由此确认由于提升规模的高可行性，插入是优异的。
6.4 实施例4：用于宋内志贺氏菌（S. sonnei）O抗原生产的菌株构建
类志贺氏邻单胞菌O17簇与宋内志贺氏菌在功能上是相同的，但是不在不稳定的病原性质粒上编码，并由此从类志贺氏邻单胞菌克隆。用寡核苷酸1508/1509（不具有wzz）和1528/1509（具有wzz）从来自类志贺氏邻单胞菌O17的基因组DNA扩增该簇。将类志贺氏邻单胞菌O17的rfb簇克隆到pDOC衍生质粒p562中，产生p563（其中包括wzz）和p568（缺少wzz基因）。辅助质粒由HR区和选择盒组成，详见表1。如实施例1所述进行菌株构建。通过针对O16 wzy不存在和宋内志贺氏菌wzy-wbgV的存在的PCR、通过5'和3'转换区PCR（图15）、LPS样品的银染、以及使用宋内志贺氏菌分型血清的Western印迹分析（图16）测试DNA插入片段的插入。
6.5 实施例5：用于痢疾志贺氏菌（S. dysenteriae）O抗原糖缀合物生产的插入菌株
尽管痢疾志贺氏菌的rfp和rfb簇形成了生产大肠杆菌O抗原的功能单元，但是在痢疾志贺氏菌基因组中，它们存在于不同位置（[8]）。将两个簇克隆到由HR区和选择盒组成的pDOC质粒中，详见表1。将来自包含rfb/rfp（[8]）的质粒pSDM7的BamHI片段亚克隆到包含合适MCS盒的pLAFR1中。由此，使用寡核苷酸1261和1272（见表3）将一个扩增子中的rfp/rfb克隆到pDOC衍生的p503中，产生p504。p503是从p482克隆的（见6.1节）：用SpeI和BamHI消化PCR扩增子，并连接到用同样的酶消化的p482中（产生p503），该PCR扩增子编码用于插入的HR1区、包含galF的一部分（galF'）和菌株W3110的galF和rmlB之间的基因间区域（使用寡核苷酸1171/1263）。rfp和rfb是作为痢疾志贺氏菌I型基因组上的两个分离簇而发现的，并进行克隆，当从p504表达时，galF'、rfp、rfb和gnd的翻译方向是相同的。DNA插入片段的插入是在waaL阳性和阴性菌株中进行的，并通过针对O16 wzy不存在的PCR、通过5'和3'转换区PCR、LPS样品的银染、以及使用分型血清的Western印迹分析（未显示）来测试。图17显示了clmR盒去除之前和之后的插入W3110 ΔrfbO16::rfbSd1 ΔwaaL和W3110 ΔrfbO16::rfbSd1的糖脂分析。当在SDS PAGE之后通过银染分析提取物时，只有waaL阳性菌株显示LPS的典型O抗原模式，而ΔwaaL菌株则没有。所有菌株应答了抗痢疾志贺氏菌1的O抗原特异性抗血清，这确认了这些菌株中重组O抗原的产生（图17）。
为分析分子细节的重组O抗原结构，通过细胞的水解有机提取物的2 AB标记以及正相HPLC，分析了来自W3110 ΔrfbO16::rfbSd1-clmR ΔwaaL的Und-PP结合的多糖池（图18）。痕迹显示出了SDS PAGE中经常观察到的梯状模式。可以使用特定峰的MS/MS分析来确认痢疾志贺氏菌1型多糖序列。
W3110 ΔrfbO16::rfbSd1-clmR ΔwaaL是用于生产如下所述EPA痢疾志贺氏菌1缀合物的宿主。为确认使用该菌株产生的糖缀合物疫苗候选，将表达质粒p293和p114转化到菌株中并在生物反应器中以10 l规模发酵。纯化EPA缀合物，并通过经典层析法去除未糖基化的EPA。分析所得最终本体以确认糖结构和缀合物质量，通过SEC HPLC（图19A）、SDS PAGE接着通过考马斯染色或者免疫检测（图19C）、单糖组成分析（图19B）以及肼解接着通过2 AB标记、HPLC分析和MS/MS（图19D）。
6.6 实施例6：用于福氏志贺氏菌（S. flexneri）2a O抗原糖缀合物生产的插入菌株
志贺氏菌O抗原在免疫学上是多样性的。对于使用O抗原多糖作为抗原的针对志贺氏菌的综合疫苗，据信必须包括至少五种血清型的O抗原结构，以产生足够覆盖范围。目的是要包括尽可能多的来自最流行感染株的抗原性元件，并包含痢疾志贺氏菌1型、宋内志贺氏菌以及福氏志贺氏菌6型、和福氏志贺氏菌2a和3a的O抗原[56]。
血清型2a和3a是基于称为血清型Y的相同O抗原主链多糖结构。在福氏志贺氏菌中存在巨大的O血清型多样性。这是由于通过葡萄糖和乙酰基对Y血清型重复单元的修饰。这类修饰是构成2a或3a血清型结构的原因（图20A）。Y主链修饰是多样性的，并且不同修饰组合导致了许多血清学上交叉反应的多糖结构。血清学2a和3a包含志贺氏菌中经常发现的两种不同的葡萄糖修饰和一种乙酰化支链修饰，并因此包括在疫苗中以保护免于其他交叉反应性抗原。
产生结构多样性的修饰酶是特定转移酶，其将葡萄糖和乙酰残基连接到血清型Y的主链上。尽管主链全部在rfb簇中编码，但是负责葡萄糖或乙酰基添加的酶都是在rfb簇之外编码的。对一些大肠杆菌O抗原（例如O16）进行了同样的观察。由于在许多情况下，据信主链修饰对于免疫原性是重要的，因此它们必须包括在插入的生产菌株中。
对于产生O抗原的插入大肠杆菌株的构建来说，所述菌株需要位于rfb簇之外的糖基转移酶（或者乙酰基转移酶），首先构建包含附加转移酶的宿主菌株，并通过共表达来自质粒的rfb簇来测试其功能性。在进一步的步骤中，进行替换W3110 rfb簇的O抗原簇的插入。这些事件的顺序纯粹是实用的而不是系统化的，即顺序可以相反。执行该程序以制备福氏志贺氏菌2a的O抗原，并且显示了用该菌株制备的糖缀合物在临床前测试中是功能活性的。
我们选择大肠杆菌W3110作为2a和3a糖缀合物生产的宿主菌株，因为它具有已证明的有效糖缀合物生产的能力。W3110是O抗原生产缺陷的，这是由于O16 rfb簇中被破坏的糖基转移酶基因。然而，为了避免rfb簇的残留活性对我们所计划测定的潜在干扰，缺失了rfb糖基和乙酰基转移酶基因wbbIJK [13]。通过使用位点特异性重组自动去除了选择盒，所述位点特异性重组通过大肠杆菌重组酶所使用的dif位点起作用[14]。当表达了克隆自菌株福氏志贺氏菌2457T（血清型2a）的福氏志贺氏菌rfb簇时，提取物的糖脂分析显示了福氏志贺氏菌血清型Y表型。来自这些提取物的LPS对侧链修饰特异性的抗组II和抗组7、8抗血清没有反应（图20C，1泳道）。
为了添加葡萄糖修饰到Y血清型上，利用了大肠杆菌W3110中所存在的已有修饰系统。葡萄糖修饰经常是由源自原噬菌体DNA插入片段的酶学机制所催化的[57]。大肠杆菌W3110包含这种称为gtr操纵子的遗传元件。gtr操纵子包含三个基因。前两个基因是高度保守的，并且是迄今所鉴别到的大多数gtr簇所共有的（gtrAB）。第三个基因编码葡萄糖基转移酶，该酶将葡萄糖添加到膜周质侧的生长中O抗原链的特定位置上。在W3110的例子中，该基因名为gtrS。在福氏志贺氏菌2a和3a中，存在gtr簇。各自的gtrAB基因是高度同源的，而第三个基因（2a中为gtrII，以及3a中为gtrX）是不同的[32]。由于它们与W3110系统的机制同源性，有理由认为用gtrII或gtrX交换gtrS也将转移葡萄糖修饰活性。
为测试该假设，通过同源重组[13]用gtrII或gtrX交换了gtrS基因，使用如[14]所述的盒剪切策略。将dif位点侧翼的clmR盒放在质粒p411的化学合成的gtrII或gtrX ORFs的下游。使用寡核苷酸1018和1019产生来自p411的编码gtrII和clmR的PCR片段。寡核苷酸突出是与gtrS ORF上游（gtrB序列）和下游序列相同的。使用该扩增子，进行同源重组[13]。通过菌落PCR（使用寡核苷酸1016/1017）检验正确的重组，并且将PCR产物测序（图20B）。为检验gtr酶能否修饰Y型主链结构，用表达来自菌株2457T的rfb簇的质粒转化阳性菌株。来自这些细胞的提取物包含LPS，如通过银染所分析的，但是它们的电泳迁移率似乎与单独表达rfb簇的对照株有轻微差异（图20C，左图，比较1、2、3泳道）。象以前那样用葡萄糖侧链特异性抗血清探测相同提取物，并且如预期的，抗组II的抗血清产生了W3110 ΔgtrS::gtrII菌株的信号，以及用抗组7、8的抗血清产生了W3110 ΔgtrS::gtrX菌株的信号。因此，gtr基因交换将葡萄糖修饰的特定能力转移给了大肠杆菌W3110，产生了菌株W3110 ΔgtrS::gtrII和W3110 ΔgtrS::gtrX。同样地，人们可以将整个gtr簇或者还可以仅将第三个基因（即特定葡萄糖基转移酶）插入到合适宿主菌株中，以产生重组糖缀合物表达菌株中的修饰活性。
为了用乙酰化修饰完成福氏志贺氏菌3a结构，可以是使用类似策略将已知乙酰基转移酶基因插入到生产菌株中。对于2a血清型，可以使用基因组测序和同源性分析来鉴别候选乙酰基转移酶基因，可以测试所述基因的多糖修饰活性。
为了用重组2a O抗原调节蛋白糖基化，通过同源重组[13, 14]缺失waaL基因，产生菌株W3110 ΔgtrS::gtrX ΔwaaL，此外，如实施例1所述通过福氏志贺氏菌2457T的rfb簇交换大肠杆菌W3110 rfb簇，产生W3110 ΔrfbO16::rfb2457T ΔgtrS::gtrX ΔwaaL。通过使用寡核苷酸1171和1172制备的PCR扩增子的插入，从p482构建供体质粒p487。另外，为了避免用于载体蛋白诱导的阿拉伯糖的代谢降解，破坏了该菌株中的araBAD簇。所熟知的是，当重组蛋白是受araBAD启动子系统控制时，araBAD缺失就增加了产率。因此，用制备自菌株W3110 ΔaraBAD::cat的噬菌体裂解物转导菌株W3110 ΔrfbO16::rfb2457T ΔgtrS::gtrX ΔwaaL。通过使用DNA插入片段的同源重组制备W3110 ΔaraBAD::clmR，该DNA插入片段是通过使用寡核苷酸1562和1563以及pKD3为模板[13]的PCR制备的。
为将所得菌株W3110 ΔaraBAD::clmR ΔrfbO16::rfb2457T ΔgtrS::gtrII ΔwaaL用于工业规模候选疫苗的生产，将包含2个糖基化位点的EPA载体蛋白的表达质粒（p293）和包含HA标签的pglB寡糖基转移酶的表达载体（p114）通过电转化引入到W3110 ΔaraBAD::clmR ΔrfbO16::rfb2457T ΔgtrS::gtrII ΔwaaL中。以10 l规模发酵所得菌株，并从所得生物量中纯化EPA糖缀合物。进行纯化以去除宿主细胞杂质和未糖基化的载体蛋白。通过SEC HPLC（图21B）、SDS PAGE接着通过考马斯染色和免疫检测（图21A）、肼解接着通过MS/MS（图21D）、单糖组成分析（图21C）以及用于绝对单糖构型的GC/MS（未显示）表征缀合物（参见5.2.1.7和5.3.5）。该数据确认了菌株的插入和染色体修饰产生了有效的生产系统，用于福氏志贺氏菌2a疫苗产品候选物的产生。
为了显示候选疫苗在动物模型中是有功能的，测试了 2a-EPA E. coli 糖缀合物疫苗的免疫原性，所述疫苗是在包含p114和p293的插入菌株W3110 ΔaraBAD::clmR ΔrfbO16::rfb2457T ΔgtrS::gtrII ΔwaaL中产生的。用2a-EPA缀合物皮下施用给大鼠，以三周间隔施用三次，所述缀合物包含PBS中的2.5μg碳水化合物或者单独的PBS（图22）。结果显示了大多数个体中的显著血清转化，与接受对照注射（PBS）的动物相比，在免疫动物（di-BC和Flex-BC组）中的平均对数效价是统计学上显著更高的。该结果还表明，对于免疫原性和由此可能的效果来说，O抗原的乙酰化是不需要的。通过使用同样程序在减毒的福氏志贺氏菌2a菌株（菌株2457T）中产生乙酰化的2a-EPA糖缀合物（Flex-BC），但是生产菌株福氏志贺氏菌2a ΔwaaL具有所引入的p114和p293。已知菌株2457T乙酰化了其O抗原[58]。
6.7 实施例7：用于铜绿假单胞菌O11 O抗原生产的插入菌株
将O11 O抗原簇克隆到由HR区和选择盒组成的pDOC质粒中，详见表1。用寡核苷酸2245/2247（见表3）从铜绿假单胞菌株PA103扩增O抗原簇。如实施例1所述进行菌株构建。通过针对O16 wzx不存在和O11的存在的PCR、通过5'和3'转换区PCR、LPS样品的银染、以及使用铜绿假单胞菌抗组E（O11）分型血清的western印迹分析来测试DNA插入片段（具有wzz）在W3110 ΔwaaL中的插入。在所示例子中，测试了具有正确抗生素抗性表型的4个克隆的O11 O抗原产生（A到D，1-4泳道），并且当用抗组E血清分析时，它们产生了典型的梯状O抗原信号，具有相应于大约34 kDa大小的电泳迁移率（图23）。使用了包含具有wzz和不具有wzz的供体质粒的大肠杆菌DH5a细胞作为对照（5和6泳道）。对照菌株包含活性waaL基因，并因此产生了O11 LPS，它显示了不同于O11 Und-PP的模式（1-4泳道）。因此，信号更强并在更高的分子量范围中观察到了。在不存在wzz时（6泳道），信号集中于更小的分子量，这表明大肠杆菌O16 wzz可以有效接管该功能。总的来说，这些结果显示了铜绿假单胞菌O11 O抗原簇在大肠杆菌中的成功插入和功能性表达。更多的数据表明铜绿假单胞菌O11 wzz对于大肠杆菌DH5a中的链调节是有活性的，而且其活性可以通过wzz类的大肠杆菌链长调节剂酶类进行功能性替换。
6.8.实施例8：嵌合的非天然簇的插入
使用大肠杆菌中的这种多糖实现了革兰氏阳性荚膜多糖生产和载体蛋白的糖基化[10]。多糖是通过由融合构建体所构成的引入DNA合成的，所述DNA由O抗原簇片段和CPS簇片段组成以制备具有CPS结构的重组O抗原。
将这样构建的嵌合簇在两个不同位置插入到W3110基因组中，以测试Und-PP-CP5的生产率。为引导插入，将不同的同源区克隆到供体质粒中。
在一种情况下，靶位点是如上述实施例中的W3110 rfb簇，即HR区是来自O16 rfb簇所包含的ORFs的上下游区域。为将HR位点插入到pDOC-C中，用HindIII和XhoI切割pDOC-C，并将用同样的酶切割的组装PCR产物连接到其中。用寡核苷酸1182和1184在两种PCR产物上进行组装，它们是使用i）寡核苷酸1181和1182、或ii）寡核苷酸1183和1184所产生的，并且在两种情况下都用W3110 ΔwaaL的基因组DNA作为模板DNA。所得质粒为p473。使用寡核苷酸1142和771（或1281）从质粒（p393，US2011/0274720 A1）扩增产生嵌合CP5的基因簇，以通过使用Eco81I克隆到p473中，得到p477（或p498）。p498是以在该质粒中缺失O11簇的wzz和wzx的方式克隆的（与p477相比，其中存在wzz和wzx）。
在另一种情况下，插入是在ECA基因wecA和wzzE侧翼的靶位点处进行的。由于wecA可能与重组多糖竞争细胞中可用的Und-P，因此wecA缺失有理由产生更高的CP5多糖产率。为了制备允许wecA和wzzE替换的供体质粒，首先用两个HR区以及然后用所插入的CP5嵌合簇修饰pDOC-C。使用寡核苷酸1126和1129、以及1127和1128扩增HR区1和2，使用W3110染色体DNA作为模板。使用寡核苷酸1126和1127组装PCR产物，并将组装的HRs克隆到pDOC-C的XhoI和HindIII位点中，得到p467。使用寡核苷酸1142和771从质粒（p393，US2011/0274720 A1）扩增产生嵌合CP5的基因簇，并将相应PCR产物克隆到p467的位点Eco81I中，得到p471。
使用p471、p498和p477进行两个位置中的插入，详见实施例1中所述。将供体和辅助质粒电穿孔到W3110细胞中，并如上所述处理细胞。使用菌落PCR确认正确插入位置。为了显示插入得到了能够产生重组O抗原的菌株，通过SDS PAGE分离经蛋白酶K处理的来自插入克隆和对照细胞的细胞裂解物，以及要么通过银染，要么转移到硝酸纤维素膜上，并用抗CP5特异性抗血清探测。作为对照，分析了来自DH5α细胞或W3110 ΔwecA的提取物，所述DH5α细胞包含相应供体质粒，所述W3110 ΔwecA包含表达CP5修饰O抗原的p393粘粒（US2011/0274720 A1）。获得了不同的梯状信号强度（图24），供体质粒p471的信号最强（7泳道），p498的信号类似地强（5泳道），p477的信号很弱（6泳道）。4泳道包含具有p473的阴性对照细胞，它不包含嵌合CP5簇，只有HR1和2区并且没有CP5信号。低分子量的梯状信号最可能是由于ECA多糖而不是CP5，因为用CP5特异性抗血清没有检测到它们。p498和p477的区别在于编码铜绿假单胞菌O11 wzz和wzx基因的小DNA段，它存在于p477中。由此得出结论，wzz-wzx由于启动子效应而限制了糖脂产生。包含包括了wzz-wzx的嵌合簇的p471最可能是从HR1中所存在的ECA启动子转录的。因此，p471中的位置支持CP5生物合成。插入克隆是使用p471（1泳道）、p477（2泳道）和p498（3泳道）作为供体质粒制备的。尽管信号一般来说弱得多，但是检测到了中间梯带和低分子量条带的特异性检测。源自最强供体质粒的克隆的强度最强（图24）。因此，该数据确认了所介绍的插入方法可以将至少达16 kb长的DNA片段插入到不同的可选择位置。
6.9.实施例9：具有插入寡糖基转移酶的细菌株产生生物缀合物
该实施例证实，可以通过细菌宿主菌株成功产生生物缀合物，已通过将编码寡糖基转移酶的核酸插入到细菌宿主细胞基因组中遗传修饰了该菌株。
使用Staby™Codon T7技术（Delphi Genetics, Charleroi, Belgium）将具有HA标签的空肠弯曲菌pglB基因稳定插入到大肠杆菌株MG1655（K12）的基因组中。作为产生具有插入pglB的大肠杆菌株的方法的一部分，将pglB从p114质粒分离，融合到galK基因中，并插入到宿主细胞基因组中替换waaL基因。确认了所得大肠杆菌株MG1655 waaL::pglB-galK包含正确序列的稳定整合pglB。
为了评估MG1655 waaL::pglB-galK产生生物缀合物的能力，将两个质粒引入到菌株中。第一个质粒p64包含编码痢疾志贺氏菌O1基因簇的核酸。第二个质粒p271包含编码具有组氨酸标签的EPA载体蛋白的核酸。将宿主细胞培养4小时或过夜，分离，并用抗-HA抗体进行Western印迹分析以鉴别pglB产生，以及用抗-his抗体分析以鉴别EPA产生。Western印迹证实，表达质粒p64和p271的MG1655 waaL::pglB-galK宿主菌株成功了产生了EPA和pglB蛋白两者。参见图25。重要的是，鉴别到了O1-EPA生物缀合物，表明了所插入的pglB基因在宿主细胞中产生功能性寡糖基转移酶的能力，并由此证实了pglB基因可以插入到细菌宿主细胞中且保留其功能。参见图25。
在评估MG1655 waaL::pglB-galK产生生物缀合物的能力的另一实验中，将不同质粒引入到菌株中。第一个质粒p281包含编码痢疾志贺氏菌O1基因簇的核酸。第二个质粒p293包含编码EPA载体蛋白的核酸。将宿主细胞在生物反应器中培养达16小时。在各个时间点，使用抗-EPA和抗-HA抗体通过Western印迹分析评估pglB和EPA的产生。如图26所示，Western印迹证实，表达质粒p281和p293的MG1655 waaL::pglB-galK宿主菌株成功了产生了EPA和pglB蛋白两者。重要的是，如用表达质粒p64和p271的MG1655 waaL::pglB-galK宿主菌株所观察到的一样，表达质粒p281和p293的MG1655 waaL::pglB-galK宿主菌株产生了O1-EPA生物缀合物，表明了所插入的pglB基因在宿主细胞中产生功能性寡糖基转移酶的能力，并由此证实了pglB基因可以插入到细菌宿主细胞中且保留其功能。
接下来，使用生物缀合物纯化策略，将表达质粒p281和p293的MG1655 waaL::pglB-galK宿主菌株所产生的O1-EPA生物缀合物成功分离。参见图26。简要地说，将从过夜生长的表达质粒p281和p293的MG1655 waaL::pglB-galK宿主菌株周质级分所分离到的蛋白质在第一Q-琼脂糖柱上过柱。描述结果的色谱图示于图27中；观察到了O1-EPA的强产生（参见级分A6-A9和插入图片）。将级分在SDS-PAGE凝胶上跑胶，接着经考马斯染色，以鉴别包含O1-EPA的级分。参见图28。将辨别为富含O1-EPA的级分A6-A9合并，并在第二Q-琼脂糖柱上过柱，并将从第二柱上获得的级分在SDS-PAGE凝胶上跑胶，接着经考马斯染色，以鉴别包含O1-EPA的级分。参见图29。描述结果的色谱图示于图30中；在级分B4-B6中观察到了O1-EPA的强产生。最后，将辨别为富含O1-EPA的级分B4-B6合并，并在Superdex 200柱上过柱，接着经考马斯染色，以鉴别包含纯化的O1-EPA生物缀合物的级分。经图31中的考马斯染色所显示的，发现所分离的O1-EPA生物缀合物的最终合并物是高度纯化的（参见图32），并证明了与使用三质粒系统所制备的O1-EPA生物缀合物具有等同质量，其中在三质粒系统中，将pglB基因通过质粒方式引入到大肠杆菌宿主细胞中，而不是通过插入到宿主细胞基因组中。
综上所述，已证实可以使用细菌宿主细胞成功产生生物缀合物，该宿主细胞已被加工以稳定表达作为其基因组一部分的寡糖基转移酶，所述酶是生物缀合物生产的必要组分。有利地，使用该新系统生产生物缀合物比目前已知的通过使用异源糖基化机制在宿主细胞中产生生物缀合物的系统需要更少的质粒。
表1：插入菌株。
a 参见图1。
b HR1，编码galF和rmlB之间的基因间区域以及galF基因的C末端片段的大肠杆菌W3110 rfb簇的上游1kb DNA；
c wbbL的1.6kb下游DNA，O16 rfb簇的最后基因，从大肠杆菌株W3110克隆
d 从pKD3和pKD4[13]克隆的氯霉素抗性盒（clmR）和kan抗性盒（kanR）；
e 当rfb簇的序列是公开的，则给出识别号。如果rfb簇是从临床分离物或者从没有rfb簇公布序列的菌株克隆的，则指示相近的公布序列并用星号*标记。
f 痢疾志贺氏菌I型rfb簇由两个操纵子组成，一个从rmlB-rfbQ延伸（位于痢疾志贺氏菌基因组的galF和gnd之间），以及第二个由双顺反子操纵子rfpA和rfpB组成（位于hisH和rfe之间（wecA））
g 从类志贺氏邻单胞菌O17克隆
h 参见[10]；该簇能够产生与金黄色葡萄球菌CP5荚膜多糖相同重复单元结构的O抗原。
j 将两个版本的嵌合簇插入到rfb基因座中，一个包含且一个缺少来自铜绿假单胞菌PA103的wzz-wzx基因。
表2. 更多的插入菌株
DNA插入片段 DNA插入片段长度/kb 插入位置/菌株；受体菌株中被替换的DNA（HR1到2） 所显示的插入DNA的功能性
肺炎链球菌CP14簇（wchA到wciY） 8 kb 大肠杆菌W3110；rfb簇（galF到gnd）以及可拉酸（colanic acid）（wcaM的上游到wcaA的下游） 通过肺炎链球菌CP14 PS的产生
来自CCUG11450的大肠杆菌rfb簇血清型O4 14 kb 大肠杆菌W3110；rfb簇（galF到gnd） 通过大肠杆菌O4 O多糖的产生
来自临床分离物upecGVXN436的大肠杆菌rfb簇血清型O25 16 kb 大肠杆菌W3110；rfb簇（galF到gnd） 通过大肠杆菌O25 O多糖的产生
来自菌株CCUG31的大肠杆菌rfb簇血清型O75 12.5 kb 大肠杆菌W3110；rfb簇（galF到gnd） 通过大肠杆菌O75 O多糖的产生
表3. 寡核苷酸列表
表5：复制起始点列表
表6：分子生物学中使用的抗生素
缩写 抗生素
amp 氨苄青霉素
clm 氯霉素
红霉素
gen 庆大霉素
kan 卡那霉素
neo 新霉素
萘啶酸
利福平
spec 壮观霉素
链霉素
tet 四环素
tmp 甲氧苄啶
博来霉素（zeocin）
表8：细菌表达株
大肠杆菌
沙门氏菌种
志贺氏菌
耶尔森氏菌
黄单胞菌
假单胞菌种
乳杆菌
乳球菌
葡萄球菌
链球菌
链霉菌
不动杆菌
柠檬酸杆菌
等效方案：
本文所披露的方法、宿主细胞和组合物不受本文所述具体实施方案限制范围。实际上，除了所描述的那些，根据前述说明书和附图，方法、宿主细胞和组合物的各种修饰对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这样的修饰意图落在所附权利要求的范围内。
本文引用了各种出版物、专利和专利申请，其公开内容通过引用以其整体并入。
序列表
<110> GlycoVaxyn AG
<120> 宿主细胞修饰的方法
<130> 13064-033-228
<140>
<141>
<150> 61/713,281
<151> 2012-10-12
<160> 71
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶中发现的结构组
<400> 1
Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶中发现的结构组
<400> 2
Gly Ile Tyr Tyr Ile Gly
1 5
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 由SceI所识别的序列
<400> 3
tagggataac agggtaat 18
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶AniI的5-引发识别位点
<400> 4
ttgaggaggt ttctctgtaa ataa 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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aactcctcca aagagacatt tatt 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶CeuI的5-引发识别位点
<400> 6
taactataac ggtcctaagg tagcga 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶CeuI的3-引发识别位点
<400> 7
attgatattg ccaggattcc atcgct 26
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶ChuI的5-引发识别位点
<400> 8
gaaggtttgg cacctcgatg tcggctcatc 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶ChuI的3-引发识别位点
<400> 9
cttccaaacc gtggagctac agccgagtag 30
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶CpaI的5-引发识别位点
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<210> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶CpaI的3-引发识别位点
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gctaggattc catcgcttta agt 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶CpaII的5-引发识别位点
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cccggctaac tctgtgccag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶CpaII的3-引发识别位点
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gggccgattg agacacggtc 20
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶CreI的5-引发识别位点
<400> 14
ctgggttcaa aacgtcgtga gacagtttgg 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶CreI的3-引发识别位点
<400> 15
gacccaagtt ttgcagcact ctgtcaaacc 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶DmoI的5-引发识别位点
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atgccttgcc gggtaagttc cggcgcgcat 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶DmoI的3-引发识别位点
<400> 17
tacggaacgg cccattcaag gccgcgcgta 30
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶DreI的5-引发识别位点
<400> 18
caaaacgtcg taagttccgg cgcg 24
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<220>
<223> 归巢内切核酸酶DreI的3-引发识别位点
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gttttgcagc attcaaggcc gcgc 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶HmuI的5-引发识别位点
<400> 20
agtaatgagc ctaacgctca gcaa 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶HmuI的3-引发识别位点
<400> 21
tcattactcg gattgcgagt cgtt 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶HmuII的5-引发识别位点
<400> 22
agtaatgagc ctaacgctca acaa 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶HmuII的3-引发识别位点
<400> 23
tcattactcg gattgcgagt tgtt 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶LlaI的5-引发识别位点
<400> 24
cacatccata accatatcat tttt 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶LlaI的3-引发识别位点
<400> 25
gtgtaggtat tggtatagta aaaa 24
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶MsoI的5-引发识别位点
<400> 26
ctgggttcaa aacgtcgtga gacagtttgg 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶MsoI的3-引发识别位点
<400> 27
gacccaagtt ttgcagcact ctgtcaaacc 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-PfuI的5-引发识别位点
<400> 28
gaagatggga ggagggaccg gactcaactt 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-PfuI的3-引发识别位点
<400> 29
cttctaccct cctccctggc ctgagttgaa 30
<210> 30
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-PkoII的5-引发识别位点
<400> 30
cagtactacg gttac 15
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-PkoII的3-引发识别位点
<400> 31
gtcatgatgc caatg 15
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PorI的5-引发识别位点
<400> 32
gcgagcccgt aagggtgtgt acggg 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PorI的3-引发识别位点
<400> 33
cgctcgggca ttcccacaca tgccc 25
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PpoI的5-引发识别位点
<400> 34
taactatgac tctcttaagg tagccaaat 29
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PpoI的3-引发识别位点
<400> 35
attgatactg agagaattcc atcggttta 29
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-PspI的5-引发识别位点
<400> 36
tggcaaacag ctattatggg tattatgggt 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-PspI的3-引发识别位点
<400> 37
accgtttgtc gataataccc ataataccca 30
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶ScaI的5-引发识别位点
<400> 38
tgtcacattg aggtgcacta gttattac 28
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶ScaI的3-引发识别位点
<400> 39
acagtgtaac tccacgtgat caataatg 28
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceI的5-引发识别位点
<400> 40
agttacgcta gggataacag ggtaatatag 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceI的3-引发识别位点
<400> 41
tcaatgcgat ccctattgtc ccattatatc 30
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-SceI的5-引发识别位点
<400> 42
atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat gaaatggca 39
<210> 43
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-SceI的3-引发识别位点
<400> 43
tagatacagc ccacgcctct ttctccatta ctttaccgt 39
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceII的5-引发识别位点
<400> 44
ttttgattct ttggtcaccc tgaagtata 29
<210> 45
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceII的3-引发识别位点
<400> 45
aaaactaaga aaccagtggg acttcatat 29
<210> 46
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceIII的5-引发识别位点
<400> 46
attggaggtt ttggtaacta tttattacc 29
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceIII的3-引发识别位点
<400> 47
taacctccaa aaccattgat aaataatgg 29
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceIV的5-引发识别位点
<400> 48
tcttttctct tgattagccc taatctacg 29
<210> 49
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceIV的3-引发识别位点
<400> 49
agaaaagaga actaatcggg attagatgc 29
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceV的5-引发识别位点
<400> 50
aataattttc ttcttagtaa tgcc 24
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceV的3-引发识别位点
<400> 51
ttattaaaag aagaatcatt acgg 24
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceVI的5-引发识别位点
<400> 52
gttatttaat gttttagtag ttgg 24
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceVI的3-引发识别位点
<400> 53
caataaatta caaaatcatc aacc 24
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceVII的5-引发识别位点
<400> 54
tgtcacattg aggtgcacta gttattac 28
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶SceVII的3-引发识别位点
<400> 55
acagtgtaac tccacgtgat caataatg 28
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶Ssp6803I的5-引发识别位点
<400> 56
gtcgggctca taacccgaa 19
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶Ssp6803I的3-引发识别位点
<400> 57
cagcccgagt attgggctt 19
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶TevI的5-引发识别位点
<400> 58
agtggtatca acgctcagta gatg 24
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶TevI的3-引发识别位点
<400> 59
tcaccatagt tgcgagtcat ctac 24
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶TevII的5-引发识别位点
<400> 60
gcttatgagt atgaagtgaa cacgttattc 30
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶TevII的3-引发识别位点
<400> 61
cgaatactca tacttcactt gtgcaataag 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶TevIII的5-引发识别位点
<400> 62
tatgtatctt ttgcgtgtac ctttaacttc 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶TevIII的3-引发识别位点
<400> 63
atacatagaa aacgcacatg gaaattgaag 30
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-TliI的5-引发识别位点
<220>
<221> misc_feature
<222> 6, 12
<223> n = A,T,C or G
<400> 64
taygcngaya cngacggytt yt 22
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-TliI的3-引发识别位点
<220>
<221> misc_feature
<222> 6, 12
<223> n = A,T,C or G
<400> 65
atrcgnctrt gnctgcctaa ra 22
<210> 66
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-TliII的5-引发识别位点
<400> 66
aaattgcttg caaacagcta ttacggctat 30
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶PI-TliII的5-引发识别位点
<400> 67
tttaacgaac gtttgtcgat aatgccgata 30
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶Tsp061I的5-引发识别位点
<400> 68
cttcagtatg ccccgaaac 19
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶Tsp061I的3-引发识别位点
<400> 69
gaagtcatac ggggctttg 19
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶Vdi141I的5-引发识别位点
<400> 70
cctgactctc ttaaggtagc caaa 24
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 归巢内切核酸酶Vdi141I的3-引发识别位点
<400> 71
ggactgagag aattccatcg gttt 24

Claims (67)

1.宿主细胞，所述宿主细胞包含供体质粒和辅助质粒，
（a）其中所述辅助质粒包含：（i）在第一启动子控制下的编码lamda red重组酶的开放读码框；以及（ii）在第二启动子控制下的编码限制性内切核酸酶的开放读码框，所述限制性内切核酸酶具有宿主细胞基因组中不存在的识别序列；以及
（b）其中所述供体质粒包含：（i）从5'到3'：（1）所述限制性内切核酸酶的识别序列，（2）至少0.5千碱基（kb）的第一同源区，（3）至少8 kb的异源插入DNA；以及（4）至少0.5 kb的第二同源区；以及（ii）反选择标记物。
2.权利要求1所述的宿主细胞，其中所述异源插入DNA包含选择标记物。
3.权利要求2所述的宿主细胞，其中所述选择标记物位于翻转酶识别靶（FRT）位点侧翼。
4.权利要求1-3任一项所述的宿主细胞，其中所述第一和第二同源区是与所述宿主细胞基因组的临近区域同源的。
5.权利要求1-4任一项所述的宿主细胞，其中所述第一同源区为至少2 kb。
6.权利要求1-5任一项所述的宿主细胞，其中所述第二同源区为至少2 kb。
7.权利要求1-6任一项所述的宿主细胞，其中所述异源插入DNA为至少20 kb。
8.权利要求1-7任一项所述的宿主细胞，其中所述识别序列包含至少18个碱基对。
9.权利要求1所述的宿主细胞，其中所述限制性内切核酸酶为SceI。
10.权利要求1所述的宿主细胞，其中所述反选择标记物为sacB。
11.权利要求1-10任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞进一步包含寡糖基转移酶。
12.权利要求11所述的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶是与所述宿主细胞异源的。
13.权利要求11或12所述的宿主细胞，其中所述寡糖基转移酶是原核寡糖基转移酶。
14.权利要求1-13任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞进一步包含至少一种糖基转移酶。
15.权利要求14所述的宿主细胞，其中所述糖基转移酶是与所述宿主细胞异源的。
16.权利要求15所述的宿主细胞，其中所述异源糖基转移酶是原核糖基转移酶。
17.权利要求1-16任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞的一种或更多种天然基因已被缺失或失活。
18.权利要求1-17任一项所述的宿主细胞，其中所述异源插入DNA包含原核生物的rfb簇。
19.权利要求18所述的宿主细胞，其中所述rfb簇为大肠杆菌rfb簇、假单胞菌（Pseudomonas）rfb簇、沙门氏菌（Salmonella）rfb簇、耶尔森氏菌（Yersinia）rfb 簇、弗朗西丝菌（Francisella）rfb簇、克雷伯氏菌（Klebsiella）rfb簇、来自鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）株的rfb簇、志贺氏菌（Shigella）rfb簇、或者伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）rfb簇。
20.权利要求19所述的宿主细胞，其中所述rfb簇为大肠杆菌rfb簇。
21.权利要求20所述的宿主细胞，其中所述大肠杆菌rfb簇为血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144,O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、或O187。
22.权利要求1-17任一项所述的宿主细胞，其中所述异源插入DNA包含原核生物的荚膜多糖基因簇。
23.权利要求22所述的宿主细胞，其中所述多糖基因簇来自大肠杆菌株、链球菌株、葡萄球菌株、或者伯克霍尔德氏菌株。
24.权利要求1-17任一项所述的宿主细胞，其中所述异源插入DNA编码大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、克雷伯氏菌、不动杆菌（Acinetobacter）、沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）、霍乱弧菌（Vibrio cholera）、李斯特氏菌（Listeria）、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、副百日咳博得特氏菌（Bordetella parapertussis）、鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia mallei）和类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）、土拉热弗朗西丝菌（Francisella tularensis）、或者弯曲菌（Campylobacter）的O抗原。
25.权利要求24所述的宿主细胞，其中所述大肠杆菌的O抗原为O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144,O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、或O187。
26.权利要求24所述的宿主细胞，其中所述克雷伯氏菌的O抗原为肺炎克雷伯氏菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、或O12。
27.权利要求1-17任一项所述的宿主细胞，其中所述异源插入DNA编码伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）糖脂、脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）菌毛蛋白O聚糖或脂寡糖（LOS）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza）LOS、硕大利什曼原虫（Leishmania major）脂磷聚糖、或者肿瘤相关的碳水化合物抗原。
28.权利要求1-27任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步包含编码载体蛋白的核酸，所述载体蛋白包含N-糖基化共有序列。
29.权利要求28所述的宿主细胞，其中所述编码载体蛋白的核酸是与所述宿主细胞异源的。
30.权利要求28或29所述的宿主细胞，其中所述载体蛋白为脱毒的铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）外毒素A（EPA）、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌（S. aureus）的溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基（CTB）、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的信使结构域、空肠弯曲菌AcrA、或者空肠弯曲菌的天然糖蛋白。
31.权利要求30所述的宿主细胞，其中所述载体蛋白为脱毒的铜绿假单胞菌外毒素A（EPA）。
32.权利要求1-31任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为埃希氏菌种、志贺氏菌种、克雷伯氏菌种、黄单胞菌（Xhantomonas）种、沙门氏菌种、耶尔森氏菌种、乳球菌种、乳杆菌种、假单胞菌种、棒杆菌（Corynebacterium）种、链霉菌种、链球菌种、葡萄球菌种、芽孢杆菌种、或者梭菌（Clostridium）种。
33.权利要求32所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌种。
34.生产包含载体蛋白和抗原的糖缀合物的方法，其中所述方法包括在适于蛋白质生产的条件下培养权利要求28-33任一项所述的宿主细胞。
35.由权利要求34所述的方法生产的糖缀合物。
36.权利要求35所述的糖缀合物，其中所述糖缀合物包含载体蛋白和抗原。
37.权利要求36所述的糖缀合物，其中所述抗原为（i）大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、克雷伯氏菌、不动杆菌、沙眼衣原体、霍乱弧菌、李斯特氏菌、嗜肺军团菌、副百日咳博得特氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、土拉热弗朗西丝菌、或者弯曲菌的O抗原；（ii）难辨梭菌（Clostridium difficile）、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌（Streptococcus pyrogenes）、大肠杆菌、无乳链球菌（Streptococcus agalacticae）、脑膜炎奈瑟氏菌、白色念珠菌（Candida albicans）、流感嗜血杆菌、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的荚膜多糖；或者（iii）伯氏疏螺旋体糖脂、脑膜炎奈瑟氏菌菌毛蛋白O聚糖或脂寡糖（LOS）、流感嗜血杆菌LOS、硕大利什曼原虫脂磷聚糖、或者肿瘤相关的碳水化合物抗原。
38.权利要求37所述的糖缀合物，其中所述大肠杆菌的O抗原为O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19、O20、O21、O22、O23、O24、O25、O26、O27、O28、O29、O30、O32、O33、O34、O35、O36、O37、O38、O39、O40、O41、O42、O43、O44、O45、O46、O48、O49、O50、O51、O52、O53、O54、O55、O56、O57、O58、O59、O60、O61、O62、O63、O64、O65、O66、O68、O69、O70、O71、O73、O74、O75、O76、O77、O78、O79、O80、O81、O82、O83、O84、O85、O86、O87、O88、O89、O90、O91、O92、O93、O95、O96、O97、O98、O99、O100、O101、O102、O103、O104、O105、O106、O107、O108、O109、O110、O111、O112、O113、O114、O115、O116、O117、O118、O119、O120、O121、O123、O124、O125、O126、O127、O128、O129、O130、O131、O132、O133、O134、O135、O136、O137、O138、O139、O140、O141、O142、O143、O144,O145、O146、O147、O148、O149、O150、O151、O152、O153、O154、O155、O156、O157、O158、O159、O160、O161、O162、O163、O164、O165、O166、O167、O168、O169、O170、O171、O172、O173、O174、O175、O176、O177、O178、O179、O180、O181、O182、O183、O184、O185、O186、或O187。
39.权利要求37所述的糖缀合物，其中所述克雷伯氏菌的O抗原为肺炎克雷伯氏菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、或O12。
40.权利要求36-39任一项所述的糖缀合物，其中所述载体蛋白为脱毒的EPA。
41.包含权利要求35-40任一项所述糖缀合物的免疫原性组合物。
42.治疗或预防对象中感染的方法，所述方法包括施用权利要求41所述的免疫原性组合物给对象。
43.权利要求42所述的方法，其中所述感染是尿路致病性大肠杆菌（uropathogenic E. coli）感染。
44.诱导对象中免疫应答的方法，所述方法包括施用权利要求41所述的免疫原性组合物给对象。
45.权利要求44所述的方法，其中所述免疫应答是针对病原体的免疫应答。
46.权利要求45所述的方法，其中所述抗原为大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌、克雷伯氏菌、不动杆菌、沙眼衣原体、霍乱弧菌、李斯特氏菌、嗜肺军团菌、副百日咳博得特氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、土拉热弗朗西丝菌、弯曲菌、梭菌、葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌、白色念珠菌、流感嗜血杆菌、粪肠球菌、伯氏疏螺旋体或者硕大利什曼原虫。
47.权利要求42-46任一项所述的方法，其中所述对象为人。
48.包含供体质粒和辅助质粒的试剂盒，
（a）其中所述辅助质粒包含：（i）在第一启动子控制下的编码lamda red重组酶的开放读码框；以及（ii）在第二启动子控制下的编码限制性内切核酸酶的开放读码框，所述限制性内切核酸酶具有宿主细胞基因组中不存在的识别序列；以及
（b）其中所述供体质粒包含：（i）从5'到3'：（1）所述限制性内切核酸酶的识别序列，（2）至少0.5千碱基（kb）的第一同源区，（3）至少8 kb的异源插入DNA；以及（4）至少0.5 kb的第二同源区；以及（ii）反选择标记物。
49.分离的质粒，所述质粒包含（i）在第一启动子控制下的编码lamda red重组酶的开放读码框；以及（ii）在第二启动子控制下的编码限制性内切核酸酶的开放读码框，所述限制性内切核酸酶具有所述宿主细胞基因组中不存在的识别序列。
50.分离的质粒，所述质粒包含（i）从5'到3'：（1）所述限制性内切核酸酶的识别序列；（2）至少0.5千碱基（kb）的第一同源区，（3）至少8 kb的异源插入DNA；以及（4）至少0.5 kb的第二同源区；以及（ii）反选择标记物。
51.制备宿主细胞的方法，其中所述宿主细胞包含供体质粒和辅助质粒，所述方法包括将权利要求49和50所述的质粒引入所述宿主细胞中。
52.权利要求51所述的方法，其中所述引入包含转化。
53.分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含供体质粒和辅助质粒，其中所述宿主细胞是根据以下方法产生的：（i）引入供体质粒到所述宿主细胞中以及（ii）引入辅助质粒到所述宿主细胞中。
54.权利要求53所述的宿主细胞，其中所述辅助质粒包含（i）在第一启动子控制下的编码lamda red重组酶的开放读码框；以及（ii）在第二启动子控制下的编码限制性内切核酸酶的开放读码框，所述限制性内切核酸酶具有所述宿主细胞基因组中不存在的识别序列。
55.权利要求53或54所述的宿主细胞，其中所述供体质粒包含（i）从5'到3'：（1）所述限制性内切核酸酶的识别序列，（2）至少0.5千碱基（kb）的第一同源区，（3）至少8 kb的异源插入DNA；以及（4）至少0.5 kb的第二同源区；以及（ii）反选择标记物。
56.权利要求53-55任一项所述的宿主细胞，其中所述引入包含转化。
57.权利要求53-56任一项所述的宿主细胞，其中将所述供体质粒和所述辅助质粒分开引入到所述宿主细胞中。
58.权利要求53-56任一项所述的宿主细胞，其中将所述供体质粒和所述辅助质粒同时引入到所述宿主细胞中。
59.分离的宿主细胞，其中编码寡糖基转移酶的异源基因已被插入所述宿主细胞的基因组中。
60.权利要求59所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
61.权利要求59或60所述的分离的宿主细胞，其中所述基因是空肠弯曲菌pglB基因。
62.权利要求59-61任一项所述的分离的宿主细胞，其中宿主细胞中所述异源基因的拷贝数为1、2、3、4或5。
63.权利要求62所述的分离的宿主细胞，其中宿主细胞中所述异源基因的拷贝数为1。
64.权利要求59-63任一项所述的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含载体蛋白，所述载体蛋白包含共有序列Asn-X-Ser（Thr），其中X可以是除Pro之外的任意氨基酸。
65.权利要求64所述的分离的宿主细胞，其中所述载体蛋白是与所述宿主细胞异源的。
66.权利要求64或65所述的分离的宿主细胞，其中所述载体蛋白为假单胞菌外毒素A、霍乱毒素B、AcrA、H1A或ClfA。
67.生产N－糖基化蛋白质的方法，其中所述方法包括在适于蛋白质生产的条件下培养权利要求59-66任一项所述的宿主细胞。
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