CN102597262A

CN102597262A - 产生用于降低患布鲁氏菌病的风险的免疫应答

Info

Publication number: CN102597262A
Application number: CN2010800410862A
Authority: CN
Inventors: G·G·舒里格; S·M·博伊尔; N·斯里朗纳纳桑
Original assignee: VETERINARY TECHNOLOGIES Corp
Current assignee: VETERINARY TECHNOLOGIES Corp
Priority date: 2009-10-21
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2012-07-18
Also published as: EP2491142A1; BR112012008237A2; EP2491142A4; US20100226942A1; US20120202270A1; WO2011049590A1; MX2012002829A

Abstract

此文件涉及用于产生降低患布鲁氏菌病和其他疾病的风险的免疫应答的材料和方法。例如，此文件提供了用于对动物施用的疫苗，以及使用本文提供的疫苗产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答的方法。本文提供的疫苗可有效降低患由多种布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病的风险。

Description

产生用于降低患布鲁氏菌病的风险的免疫应答

此申请依赖于在2008年10月30日提交的标题为“产生用于降低患布鲁氏菌病的风险的免疫应答”的临时申请系列号61/109,804，将其引入本文作为参考，并具有相同的发明人和相同的记录在案的律师。在此附上该临时申请的副本。

背景

1. 技术领域

此文件涉及用于产生降低患布鲁氏菌病（brucellosis）和其他疾病的风险的免疫应答的材料和方法。例如，本发明提供了用于对动物施用的疫苗，以及使用本文提供的疫苗产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答的方法。

2. 背景信息

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属（Brucella）的细菌引起的传染病。存在多种能够感染野生动物和家畜二者的布鲁氏菌物种。在牛中引起布鲁氏菌病的主要原因是细菌流产布鲁氏菌（B. abortus）。感染的牛通常具有高发生率的自发流产，关节炎关节，和在产犊后保留胎盘。在美国，感染的牛通常被杀掉。绵羊和山羊是马尔他布鲁氏菌（B. melitensis）的偏好宿主，这是对人毒性最大的布鲁氏菌物种。人可通过与感染的动物或动物产品，例如被这些细菌污染的未经巴氏消毒的牛奶接触从而被感染。

发明概述

本发明涉及用于产生降低患布鲁氏菌病的风险的免疫应答的材料和方法。例如，本发明提供了对动物（驯养的和野生动物二者）施用的疫苗，以及使用本文提供的疫苗产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答的方法。本文提供的疫苗可有效降低患由多种布鲁氏菌引起的布鲁氏菌病的风险。例如，提供了分离的DNA构建体，用DNA构建体（例如质粒）转化的细菌，和用于在动物中产生降低患布鲁氏菌病的风险的免疫应答的方法。

大体上，本发明的一个方面的特征在于分离的DNA构建体，当其在RB 51?菌株中表达时，用于产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答。所述构建体包含下述核酸，或基本上由下述核酸组成：编码选自L7/L12、wboA、Bp26和85A的多肽的核酸。此构建体可包含编码多于一种所述多肽的核酸。构建体可包含编码诊断标记蛋白的核酸。构建体可包含编码L7/L12多肽、leuB多肽和绿色荧光蛋白（GFP）的核酸。构建体可包含编码Bp26多肽、leuB多肽和/或GFP多肽的核酸。构建体可包含编码L7/L12多肽、Bp26多肽和leuB多肽的核酸。构建体可包含编码L7/L12多肽、wboA多肽和leuB多肽的核酸。构建体可包含编码wboA多肽、85A多肽和leuB多肽的核酸。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于细菌细胞，用于产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答。所述细胞包含下述核酸，或基本上由下述核酸组成：编码选自L7/L12、wboA、Bp26或85 A的多肽的核酸。细菌可为流产布鲁氏菌（Brucella abortus）RB 51?菌株。

在另一个实施方案中，本发明的特征在于用于产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答的方法。所述方法包括下述步骤，或基本上由下述步骤组成：在动物针对细菌表达的抗原产生抗体的条件下，对动物施用一定量的包含DNA构建体的细菌，所述DNA构建体包含编码选自L7/L12、wboA和Bp26的多肽的核酸，由此产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答。细菌可为流产布鲁氏菌RB 51?菌株。动物可选自牛、绵羊、山羊和猪或其他感染布鲁氏菌的脊椎动物物种。

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员所通常理解的具有相同的含义。尽管可使用与本文描述的相似或等同的方法和材料实践本发明，下面描述合适的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请（包括临时申请）和其他参考以其整体引入作为参考。在有冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的且无意为限制性的。

通过以下的详细描述和权利要求书，本发明的其他特征和优势将是显而易见的。

附图简述

图1是用于表达L7/L12多肽和绿色荧光蛋白（GFP）表达报告物（reporter）的pleuB/L7/L12/GFP质粒的载体图。

图2是用于表达Bp26多肽和GFP报告物的pleuB/Bp26/GFP质粒的载体图。

图3是用于表达L7/L12多肽和Bp26多肽的pleuB/L7/L12/Bp26质粒的载体图。

图4是用于表达L7/L12多肽和wboA多肽的pleuB/L7/L12/WboA质粒的载体图。

图5是用于表达85A ( 32kDa抗原)多肽和wboA多肽的pleuB/WboA/32kDa质粒的载体图。

图6是描述破坏RB 51?疫苗中的流产布鲁氏菌leuB基因的示意图。

图7是Southern印迹的图。

图8是用于表达与亮氨酸营养缺陷的流产布鲁氏菌RB 51?菌株互补的3-异丙基苹果酸脱氢酶（leuB）多肽的pNS4质粒的载体图。

图9是在减去亮氨酸的布鲁氏菌基本培养基中培养的每单位时间的用不同DNA构建体转化的流产布鲁氏菌的菌落形成单位（log10 CFU）的图。

图10是在感染后36小时包含表达GFP的流产布鲁氏菌RB 51?的鼠J1771.A1鼠巨噬细胞的一系列照片。

图11是柱状图，其显示了用盐水、RB 51?疫苗、RB 51 (TAM) leuB疫苗、RB 51? leuB/pNS4疫苗或RB 51? leuB/pNS4GFP疫苗处理并用致病性强的流产布鲁氏菌2308攻击的小鼠中的每只小鼠脾的菌落形成单位数（log10 CFU）。

图12是免疫印迹，其显示了来自接种的CD-1小鼠的血清对纯化的GFP的反应性。

发明详述

本发明涉及用于产生降低患布鲁氏菌病的风险的免疫应答的材料和方法。例如，本发明提供了用于对动物施用的疫苗，以及使用本文提供的疫苗产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答的方法。

本文提供的疫苗可为参与诱发针对布鲁氏菌属细菌的免疫应答的重组多肽，被设计为表达这样的重组多肽的核酸载体（例如质粒），和用这样的核酸转化的细菌的形式。本文提供的疫苗可用于免疫或治疗任意种类的动物，包括但不限于牛、绵羊、山羊、猪、狗、家禽或任意感染布鲁氏菌的脊椎动物物种。

本文提供的疫苗可用于诱发针对任意布鲁氏菌物种的免疫应答，包括但不限于流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌（B. canis）、马尔他布鲁氏菌、林鼠布鲁氏菌（B. neotaomae）、绵羊布鲁氏菌（B. ovis）、猪布鲁氏菌（B. suis）和鳍足类海洋布鲁氏菌（B. pinnipediae）。例如，本文提供的疫苗可保护对抗多于一种布鲁氏菌。在有些情况下，本发明提供的疫苗可用于诱发针对在牛中引起自发流产的病原体（例如犬新孢子虫（Neospora caninum））的免疫应答。提供的疫苗可用于降低患与被称为布鲁氏菌病的疾病相关的症状的风险。

本发明也提供了材料和方法，其涉及分离的核酸分子，基本上纯的多肽和包含分离的核酸分子的细菌。如本文使用的术语“核酸”包括RNA和DNA二者，包括cDNA、基因组DNA和合成（例如化学合成）的DNA。核酸可为双链或单链的。在单链的情况下，核酸可为正义链或反义链。另外，核酸可为环状或线状的。

如本文使用的有关核酸的术语“分离的”指与其来源的生物的天然存在的基因组中与其直接相邻的两侧序列（5’端序列和3’端序列）不直接相邻的天然存在的核酸。例如，分离的核酸可为，但不限于，任意长度的重组DNA分子，只要在天然存在的基因组中通常可见的直接在重组DNA分子两侧的核酸序列之一被去除或缺乏。因此，分离的核酸包括但不限于：作为分离的分子独立于其他序列存在的重组DNA（例如cDNA或通过PCR或限制性内切酶处理产生的基因组DNA片段），以及参入载体、自主复制的质粒、病毒（例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒）或参入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA。另外，分离的核酸可包括为杂种或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。

如本文使用的有关核酸的术语“分离的”也包括任意非天然存在的核酸，因为非天然存在的核酸在自然界中找不到且在天然存在的基因组中没有直接相邻的序列。例如，非天然存在的核酸例如改造的（engineered）核酸被认为是分离的核酸。可使用普通分子克隆或化学核酸合成技术制备改造的核酸。分离的非天然存在的核酸可独立于其他序列，或参入载体、自主复制的质粒、病毒（例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒）或参入原核生物或真核生物的基因组DNA中。另外，非天然存在的核酸可包括为杂种或融合核酸序列的一部分的核酸分子。

对本领域普通技术人员将是显而易见的，在例如cDNA或基因组文库，或包含基因组DNA限制酶切消化物的凝胶切片内的数百至数百万其他核酸分子中存在的核酸不被认为是分离的核酸。

例如，如本文描述的多肽可为在动物中产生免疫应答（例如抗体产生）的抗原。在有些情况下，本文提供的多肽可被表达为同源或异源的抗原。例如，多肽可为抗原，当在动物中表达时所述抗原被识别为外源的，或多肽可为产生抗原的酶，当在动物中表达时所述抗原被识别为外源的。例如，本文提供的多肽可为产生针对布鲁氏菌的免疫应答的抗原（例如从一种布鲁氏菌物种分离的核糖体蛋白、外膜蛋白、周质蛋白或脂多糖）。在有些情况下，如本文描述的使用的多肽可为L7/L1 12多肽 (例如，Entrez GeneID: 3788918), wboA多肽 (例如, Entrez GenelD: 3339782), Bp26 (例如, Genbank GI: 32699300)或85A ( 32 kDa)多肽(例如Genbank GI: 894882 )。在有些情况下，多肽可产生有效针对一种布鲁氏菌物种的免疫应答和另一种多肽可产生有效针对不同布鲁氏菌物种的免疫应答。

在有些情况下，本文提供的疫苗可作为预防疫苗递送，以降低在发生布鲁氏菌感染时将患布鲁氏菌病的风险。在有些情况下，本文提供的疫苗可降低患由流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、马尔他布鲁氏菌、林鼠布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌和鳍足类海洋布鲁氏菌的感染引起的布鲁氏菌病的风险。

本发明也提供了制备本文提供的疫苗的方法。这样的方法可包括用一定量的核酸载体（例如质粒）转化细菌。可通过任意合适的方法，包括例如电穿孔或化学转化实现转化。

可使用分离的核酸转化细菌培养物产生疫苗。例如，转化的细菌培养物可过表达抗原以产生免疫应答。在有些情况下，本文提供的分离的核酸可包括编码L7/L12多肽或Bp26多肽的核酸。在有些情况下，分离的核酸可包括编码3-异丙基苹果酸脱氢酶多肽（例如leuB）（例如，GenBank GI: 62197474）的核酸。在有些情况下，分离的核酸可包括编码GFP的核酸。在有些情况下，本文提供的疫苗可包括编码超过一种抗原多肽（例如L7/L12多肽和Bp26多肽）的核酸。在有些情况下，疫苗可包括编码2、3或4种多肽的核酸。

在有些情况下，本文提供的疫苗可包括递送和表达标记物。例如，疫苗可包括编码作为疫苗表达和递送至动物的标记物的荧光多肽（例如GFP）的核酸。例如，递送和表达标记物可为来自免疫动物血清中的GFP抗体。

在有些情况下，本文提供的分离的核酸可包括驱动多肽表达的启动子。例如，分离的核酸可包括与启动子序列可操作连接的编码多肽的核酸。在有些情况下，编码L7/L12多肽的核酸可与SOD启动子序列(例如, Ofiate AA等人, Infect. Immun 67(2): 986-988 ( 1999)有效连接。在有些情况下，分离的核酸可在多于一个方向上转录。例如，编码L7/L12多肽的核酸的转录可在顺时针方向上进行和编码GFP多肽的核酸的转录可在逆时针方向上进行。在有些情况下，分离的核酸例如pleuB/L7/L12GFP质粒(图1) , pleuB/Bp 26/GFP质粒(图2)，pleuB/L7/L12/Bp26质粒(图3), pleuB/L7/L12/WboA质粒(图4)或pleuB/L7/L12/32kDa质粒(图5)可用于产生疫苗。

可使用任意细菌产生用于产生针对布鲁氏菌的免疫应答的疫苗。例如，可使用例如流产布鲁氏菌RB 51?的细菌菌株。在有些情况下，疫苗可包括表现为亮氨酸营养缺陷型的细菌菌株。例如，流产布鲁氏菌菌株可具有在leuB基因座上的破坏leuB表达的突变（例如缺失）。在有些情况下，可用分离的核酸转化亮氨酸营养缺陷型细菌菌株以恢复亮氨酸生物合成。例如，pleuB/L7/L12GFP质粒(图1)、pleuB/Bp 26/GFP质粒(图2)、pleuB/L7/L12/Bp26质粒(图3)、pleuB/L7/L12/WboA质粒(图4)或pleuB/L7/L12/32kDa质粒(图5)可用于在表现为亮氨酸营养缺陷型的细菌菌株中恢复亮氨酸生物合成。

可使用任意合适的方法施用本文提供的疫苗。施用可为例如局部的（例如经皮、眼部或鼻内）；肺的（例如通过吸入或吹入或散剂或气雾剂）；口腔或胃肠外的（例如通过皮下、鞘内、心室内（intraventricular）、肌肉内或腹膜内注射，或通过静脉滴注）。施用可为快速的（例如通过注射）或可发生一段时间（例如通过缓慢输注或施用缓释制剂）。

在以下实施例中进一步描述本发明，实施例不限制本发明的范围，本发明的范围在权利要求书中描述。

实施例

实施例1- RB 51? leuB亮氨酸营养缺陷型的构建

使用cre-lox方法在RB 51?疫苗株的leuB基因中产生无标记的突变（图6）。流产布鲁氏菌RB 51?的leuB基因的2个区域被扩增为2个单独的片段。使用引物5' GGG GAA TTC AGT TTC CGT CGC GGT GAG TGG 3'和5' GGG GGA TCC ATG ATT TCC TTC GGT TCG CCG 3'扩增包含leuB基因上游300 bp的750 bp（leu B1）的片段，和使用引物对5' GGG GGA TCC TAT GCT GGC TGA TGC TGG CGG 3'和5' GGG AAG CTT TCA GGC CGA AAG TGC CTT GAA 3'扩增450 bp的片段（leu B1 1）。使用这两个片段来故意缺失leuB的216 bp（图6），以根除在随后的营养缺陷型生长中的缺失的任意逆转。将包含中断的leuB基因的1200 bp扩增子克隆进pGEM3Z载体。将编码庆大霉素抗性并且两侧有loxP位点的acCl基因克隆进pUCGmlox质粒的BamHl片段中。

将此片段克隆进中间构建体的被破坏的leuB基因的BamHl位点中以产生最终的自杀质粒pLGL。通过电穿孔将自杀质粒pLGL引入流产布鲁氏菌RB 51?。通过在包含庆大霉素的选择培养基和然后在包含卡那霉素的培养基上涂板转化体得到最终的菌株RB 51? leuB。在亮氨酸缺乏的基本培养基中证明无标记的突变体的亮氨酸缺陷。进行Southern杂交以证明仅leuB基因被破坏，流产布鲁氏菌基因组的其余部分保持不变（图7）。在生物安全3级设施中操纵活的流产布鲁氏菌。使用抗生素抗性标记GmR. AmP和KnR。

实施例2 - PNS4/GFP和leuB互补的构建

通过PCR使用以下引物扩增疫苗株RB 51?的leu B基因( 1412 bp )及其启动子：5' GGG-AAG-CTT-GGG-TCT-AGA-AGT-TTC-GCT-CGC-GGT-GAG-TGG-CGA 3'和5' GGG-ACT-AGT-TCA-GGC-CGA- AAG-TGC-CTT-GAA 3 '。扩增了复制起点（1700 bp）和质粒pNSGroE的具有布鲁氏菌groE启动子、多克隆位点和6 x His标签的表达盒（259 bp）。在限制酶消化后，纯化leuB基因片段和pNSGroE片段并连接形成质粒pNS4（图8）。使用标记物leuB基因替换抗生素抗性基因以在亮氨酸缺乏的基本培养基中与任意leuB营养缺陷型菌株互补。使用BamHl和Xbal 位点将用作模式异源抗原的绿色荧光蛋白（GFP）基因克隆进pNS4的MSC并命名为PNS4/GFP。将互补质粒电穿孔进感受态（competent）RB 51? leuB，并通过在亮氨酸缺乏的布鲁氏菌基本培养基（BMM）板上涂板选择转化体。当在紫外光下观察时，表达GFP的被补充的（complemented）RB 51? leuB显示为绿色荧光菌落，其之后通过质粒提取和限制图谱筛选pNS4/GFP的存在。通过使用GFP抗体的免疫印迹确认GFP的表达。

实施例3 - 体外生长

在液体BMM中接种特定的流产布鲁氏菌leuB克隆的单个菌落，并在37摄氏度和200 rpm下培养72小时以制造起子培养物（starter culture）。使用起子培养物接种基本培养基并调整为10-12 Klett单位（KU）。使用Klett-Summerson色度计在不同的时间点测量KU，并测量相应的菌落形成单位（CFU）。观察到RB 51?或被补充的leuB营养缺陷型在基本培养基中的倍增时间为约7小时。亮氨酸缺陷的BMM不支持leuB营养缺陷型的生长。用PNS4补充leuB营养缺陷型恢复了其在亮氨酸缺陷的BMM中的生长。在pNS4/GFP转化的流产布鲁氏菌中的GFP的表达没有影响菌株被leuB补充的能力（图9）。

实施例4 - 在感染的巨噬细胞中的GFP的表达

在6孔板上铺布鼠J1774.A1巨噬细胞，使其粘附在盖玻片上并在包含10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco最低必需培养基（DMEM）中在37摄氏度下在5% CO₂中培养24小时。在PBS中重悬PNS4/Gfp补充的RB 51? leuB转化的流产布鲁氏菌的48小时培养物并用于以100：1的感染复数（细菌：巨噬细胞）感染巨噬细胞。45分钟后，用PBS洗3次巨噬细胞并然后在包含100 ug/ml链霉素-青霉素的DMEM中培养。在感染后24、36和72小时洗涤盖玻片，在福尔马林中固定，并置于盖玻片上。在Zeiss LSM 510 nm激光扫描显微镜下以荧光模式观察盖玻片以检测GFP的表达。当通过510nm激发观察时，被包含leuB补充的质粒pNS4/GFP的流产布鲁氏菌感染的J774.A1巨噬细胞显示为绿色。图5是在感染后36小时包含表达GFP的流产布鲁氏菌的巨噬细胞的代表图。

实施例5 - 用布鲁氏菌RB 51? /leuB和pNS4菌株免疫小鼠

使用5-6周龄雌性CD-1小鼠评估流产布鲁氏菌RB51? /leuB和leuB被补充的菌株的保护效力。使用CD-1小鼠，因为该小鼠来自远交品系，其更接近在野外条件下接受接种的被模拟的远交遗传背景，例如牛。使用在100ul中的3-5 x 10⁸CFU的菌株RB 51?、RB 51? leuB/pNS4或Rb51? leuB/pNS4/GSP腹膜内接种4组小鼠（每组10只）。

在接种后5周对另一组10只小鼠取血以收获血清。通过免疫印迹筛选血清中的GFP特异性抗体。在接种后6周，用4 x 10⁸CFU的流产布鲁氏菌菌株2308腹膜内攻击所有组的小鼠。在攻击后2周，通过CO₂窒息对小鼠实施安乐死并回收脾。均质化脾，连续稀释并涂在TSA板上以评估CFU。RB 51?菌株的leuB营养缺陷型和被补充的leuB营养缺陷型能够保护CD-1小鼠免于致病性强的流产布鲁氏菌菌株2308的攻击（图6）。当将被补充的leuB营养缺陷型和被补充的表达GFP的leuB营养缺陷型与用菌株RB51?接种的小鼠比较时，在由leuB营养缺陷型给予的保护水平（即脾清除）中没有显著差异。然而，在用任意RB51?菌株和盐水对照接种的小鼠之间给予的保护存在显著差异(P<0.005)。只有用RB51? leuB/pNS4/GFP接种的组的血清具有GFP特异性抗体（图7）。在单独的实验中，leuB营养缺陷型和被补充的leuB营养缺陷型在4-5周内从CD-1小鼠脾中被清除。清除率与用疫苗RB51?观察到的相同。分析了流产布鲁氏菌菌株2308的脾清除率以测定方差。使用Tukey’s法比较了平均值和方差。

当与其亲本质粒PBBRIMCS比较时，pNS质粒在体外和体内的非选择性条件下在流产布鲁氏菌中更稳定。甚至在11次继代培养后，在富集的培养基（非选择性条件）中有可能从流产布鲁氏菌的leuB缺陷菌株的10个随机菌落中回收质粒pNS4。这暗示补充质粒pNS4在亮氨酸充足的条件下在菌株内部稳定，且所述质粒在选择性和非选择性条件下都表达。当在紫外光下观察时，用pNS$GroE/GFP转化的RB51?/LEUb的所有菌落和从CD-1小鼠脾中回收的菌落都展示绿色荧光。结合在巨噬细胞中注意到的GFP表达，这些数据暗示，pNS4能够在小鼠免疫后表达在流产布鲁氏菌中的异源抗原（GFP）。

RB51? leuB疫苗和leuB补充的形式在CD-1小鼠中的保护效力与RB 51?疫苗在BALB/c小鼠中所观察到的一样好（图11）。亮氨酸营养缺陷型和RB51?疫苗的被补充的形式以和它们在近交的BALB/c小鼠中相同的速度在CD-1小鼠中被清除。当流产布鲁氏菌在营养受限的环境下生长时，leuB基因似乎提供了保留pNS4的选择压力。使用纯化的GFP特异性抗体应答进行免疫印迹（图12）。这些结果暗示，保护性同源或异源抗原可替换编码GFP的核酸，且由Rb51? leuB驱动的过表达可诱导针对流产布鲁氏菌和其他感染原的保护性应答。

大体上，本发明提供了RB51?疫苗，所述疫苗将保护牛对抗流产布鲁氏菌的攻击和对抗副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）的感染。所述疫苗将不包含除了RB51?中的本来的抗性（利福平）以外的任意新的抗生素抗性，因此在批准时将不会有来自主管当局有关抗生素抗性的反对。所述疫苗将利用通过表达leuB基因和同源的布鲁氏菌“O”链抗原和异源的分枝杆菌32KDa抗原的基因的质粒而被补充的疫苗流产布鲁氏菌菌株RB51?菌株，过表达1个同源抗原，细胞质O链，并将表达1个异源抗原，来自副结核分枝杆菌的32Kda的蛋白质。所述疫苗是独特的，因为其是被批准和检测的RB 51?疫苗的改进并将保护免受多个布鲁氏菌物种（流产布鲁氏菌、马尔他布鲁氏菌和猪布鲁氏菌）的伤害，由于同源的过表达保护性布鲁氏菌抗原将提供比现有的疫苗更高水平的保护，并将赋予免受副结核分枝杆菌感染的保护。另外，所述疫苗将不携带与RB 51?菌株不同的任意新的药物抗性特征。

其他实施方案

应当理解，尽管本发明已结合了其详细描述进行了描述，以上描述旨在说明而不是限制本发明的范围，通过随附的权利要求书定义本发明的范围。本领域普通技术人员可进行其他方面、优势和修改，但这些将在以下权利要求书的范围内。

序列表

<110> SCHURIG, GERHARDT G.

BOYLE, STEPHEN M.

SRIRANGANATHAN, NAMMALWAR

<120> 产生用于降低患上布鲁氏菌病的风险的免疫应答

<130> 24262-0002P01

<140> 12/589,299

<141> 2009-10-21

<150> 61/109,804

<151> 2008-10-30

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的引物

<400> 1

ggggaattca gtttccgtcg cggtgagtgg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的引物

<400> 2

gggggatcca tgatttcctt cggttcgccg 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的引物

<400> 3

gggggatcct atgctggctg atgctggcgg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的引物

<400> 4

gggaagcttt caggccgaaa gtgccttgaa 30

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的引物

<400> 5

gggaagcttg ggtctagaag tttcgctcgc ggtgagtggc ga 42

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的引物

<400> 6

gggactagtt caggccgaaa gtgccttgaa 30

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：合成的6xHis标签

<400> 7

His His His His His His

1 5

Claims

1. 一种分离的DNA构建体，用于产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答，所述构建体包含编码选自L7/L12、whoa、Bp26和85 A的多肽的核酸。

2. 权利要求1的DNA构建体，其中所述构建体包含编码多于一种所述多肽的核酸。

3. 权利要求1的DNA构建体，其中所述构建体包含编码表达报告物的核酸。

4. 权利要求1的DNA构建体，其中所述构建体包含编码L7/L12多肽、leuB多肽和GFP多肽的核酸。

5. 权利要求1的DNA构建体，其中所述构建体包含编码Bp26多肽、leuB多肽和GFP多肽的核酸。

6. 权利要求1的DNA构建体，其中所述构建体包含编码L7/L12多肽、Bp26多肽和leuB多肽的核酸。

7. 权利要求1的DNA构建体，其中所述构建体包含编码L7/L12多肽、wboA多肽和leuB多肽的核酸。

8. 权利要求1的DNA构建体，其中所述构建体包含编码wboA多肽和leuB多肽的核酸。

9. 一种细菌细胞，用于产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答，所述细胞包含编码选自L7/L12、wboA、Bp26和85 A的多肽的核酸。

10. 权利要求9的细菌细胞，其中所述细菌是流产布鲁氏菌RB51菌株。

11. 一种用于在动物中产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答的方法，所述方法包括在动物针对细菌表达的抗原产生抗体的条件下，对动物施用一定量的包含DNA构建体的细菌，所述DNA构建体包含编码选自L7/L12、wboA和Bp26的多肽的核酸，由此产生针对引起布鲁氏菌病的细菌的免疫应答。

12. 权利要求11的方法，其中所述细菌是流产布鲁氏菌RB51菌株。

13. 权利要求11的方法，其中所述动物选自牛、绵羊、山羊和猪或任意感染布鲁氏菌的脊椎动物。