TW200526778A

TW200526778A - Methods for the production of apolipoproteins in transgenic plants

Info

Publication number: TW200526778A
Application number: TW093134564A
Authority: TW
Inventors: Maurice M Moloney; Alexandra Reid
Original assignee: Sembiosys Genetics Inc; Maurice M Moloney
Priority date: 2003-11-14
Filing date: 2004-11-12
Publication date: 2005-08-16
Also published as: CN1906296A; MXPA06005363A; US7786352B2; EP1682664A2; WO2005047455A3; WO2005047455A2; NZ547024A; EA015167B1; AR047769A1; EA200600946A1; AU2004289720B2; KR20060124633A; US20120059150A1; EP1682664A4; NO20062480L; CN1906296B; JP2007510420A; AU2004289720A1; US20050172359A1; CA2544239A1

Description

200526778 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於植物遺傳工程方法，以及載脂蛋白之生產。更具體而言，本發明係關於在轉基因植物中重組體載脂蛋白之生產方法。【先前技術】 ,在健康的人體内，膽固醇的輸送和除去之間維持平衡。當人體的低密度脂蛋白（LDL)含量高，而高密度脂蛋白 (HDL)含量低時，不平衡造成沉積在動脈内的膽固醇，比除去為多（M. J. Van Dam 等人 2002 年，Lancet 359 : 37_ 42)。動脈粥樣硬化（動脈狹化或阻塞），是膽固醇一再沉積的結果，稱為動脈粥樣斑（A· S· Major等人2001年，

Arterioscler· Thromb· Vase. Biol. 21 : 1790-1795)。脂蛋白可分成致動脈粥樣化脂蛋白和血管保護性脂蛋白’致動脈粥樣化脂蛋白一般都是含載脂蛋白（Ap〇) B的脂蛋白，諸如很低密度脂蛋白（VLDL)、中度（IDL)、低 (LDL)或脂蛋白（Lp⑻），而血管保護性脂蛋白為含Ap〇 AI，諸如 HDL。

HDL主要蛋白成份之Ap〇 AI，在膽固醇體内穩態上扮演，鍵性角色。以臨床和族群為基礎的研究已證明，在心臟血管疾病和血漿HDL含量之間，有明顯的反逆相關性，而倡議 Apo AI和HDL有助於對抗動脈粥樣應對之保護性任務（H B. Rubins 等人 1993 年，Am· J. Cartiol 71 : 45_52)。對易感受動脈粥樣應對的轉基因鼠（Ε· M· Rubin等人1991年，Nature 353 · 265-267)和兔（Ν· Duverger 等人 1996 年，Circulation 94 · 713-717)研究’已顯示人類Ap〇 AI的表現，可抑制動脈粥樣硬化的發展。此效果可能與其有效促進膽固醇從細胞溢出有關（G· Castro等人 1997 年，Biochemistry 36 : 2243- 2249)，為「逆向膽固醇傳送」（RCT)過程中的第一步〇 a 200526778

Glomset 1968 年，J· Lipid Res· 9 : 155-167)。Apo AI 因係細胞膽固醇的優先接納體，而調諧此過程（G H R〇thblat等人 1999 年，J· LipidRes· 40 : 781_796)，提高 HDL 相關膽固醇的卵磷脂一膽固醇一醯基轉移酶（LCAT)活性若干倍（A.

Jonas 1991 年，Biochem· Biophys. Acta 1084 : 205-220 ; R. W· Mahley 等人 1984 年5 J· Lipid Res· 25 : 1277-1294)，而將 LACT衍生的膽固醇脂傳送到肝（j· R Morris〇n等人1992年， J· Biol. Chem· 267 : 13205-13209)。諸如LIPITOR® (atorvastatin鈣）等合成抗高血脂劑的作用是藉抑制膽固醇合以降低脂質含量（P· Alaupovic等人1997 年，Atherosclerosis 133 : 123_133)，不同的是，注入精製 Apo AI會刺激膽固醇從組織溢出，進入血漿内（μ· Navab等人 2002 年，Circulation 105 : 290-292)。此項倡議 Apo AI 會刺激膽固醇從動脈管壁内的泡沫細胞溢出，而誘導動脈粥樣斑的退化，有效「清掃」動脈。人體在肝臟和腸細胞内合成Apo AI，做為非糖基化前蛋白原（J· I· Gordon 等人 1983 年，J· Biol. Chem. 258 : 4037-4044)。蛋白離開細胞之前，有18種氨基酸前段被除去，而在血漿内利用未知蛋白酶分泌後，有6種氨基酸前段被裂解，留下成熟243種氨基酸蛋白質（K. Saku等人1999年， Eur. J. Clin. Invest· 29 : 196-203 )。載脂蛋白A-IMilan。（Apo AI-Μ)為首先記載的人體Apo AI 的分子變異體（G Franceschini 等人 1980 年，1(^1丨11.111¥651 66 : 892-900)。其特徵是 Arg 173 以 Cys 取代（Κ· H· Weisgraber 等人 1983 年，J. Biol· Chem. 258 ·· 2508_2513)。突變體載脂蛋白做為體染色體顯性特質傳輸，而有8代載體已告鑑定（G· C. Gerli 等人 1984 年，Hum. Hered· 34 : 133-MO) 〇

Apo AI-Μ載體個別狀態特徵為，明顯降低HDL膽固醇 200526778 3里° 4a官如此’ 的王體未g月顯顯示任何增加動脈疾病的危機，誠然，藉檢驗基因系統圖譜，顯示此等主體會受到「保護」，以免動脈粥樣硬化。 Μ 曰 Αρο ΑΙ·Μ在載體内可能保謝私文果的機制，似乎與突變載脂蛋白結構的改變有關，會失螺旋，而增加疏水性殘餘的暴露（G· Franceschini 等人 1985 车 T R彳n1 rVwam 260 : 16321_16325)。知螺旋的緊密結構，導致增加分子的柔性，較之正常A-I，更輕易與脂質關聯。此外，載脂蛋白脂質結合物更易變性，因此在突變體情況下，亦改進脂質輸送。、治療上使用Apo AI和Apo AI-1V[突變體，目前受到的限，是缺乏方法，可以充分量和適當型式製備該細蛋白。尤其是Apo AI重組體的生產顯示很難，由於其跨位傾向特性、自動聚集和降解之故（Η· H· Schmidt等人1997年Protein

Expr Purif· 10 ·· 226_236)。在本發明之時，人體八叫义重組體已在二真核生物系統的體外表現：即桿菌病毒轉染

Spodoptera fmgiperda (Sf9)細胞（M· G sorci_Tho聰等父 1996年，J. Lipid Res· 37 ·· 673-683)，以及穩定轉染中國田鼠 _巢（CHO)細胞（Τ· Μ· Forte 等人 1990 年，Bi〇chim Biophys· Acta 1047 : 11-18 ; J· Β· Mallory 等人 1987 年 J Bi〇1·

Chem· 262 : 4241-4247)。在桿菌病毒系統中，—旦細胞成功巧染，在正常構造物的細胞用於表現之前，即有深度篩選過紅。，理’ CHO細胞集落必須進行篩選過程，以找出穩定轉染的高度表現集落。此外，凡此二種細胞類型在達成重大表現之前，需要較長時間期限，其保養水準遠較細菌為高。細菌系統内蛋白質的重組體表現一般具有吸引力，因為可快速而經濟生成大量純蛋白。對於轉型大腸桿菌 (Escherichia coli)内的Apo AI表現有若干報告；然而，一般而言，近來在表現水準方面有一些改進〇· Ryan等人 200526778 2003 年，Protein Expr. Purif· 27 : 98-103)，此等方法提供較低產率，或有外來親和性標記或分泌訊號之不良存在（J·

Bergeron 等人 1997 年，；81〇(^111.61〇011}^.八〇^ 1344:139-152 ; Η· H. Li 等人 2001 年，J. Lipid Res. 42 : 2084-2091 ; K. A. McGuire 等人 1996 年，J· Lipid Res· 37 : 1519-1528)。此外，已知大腸桿菌内毒素與載脂蛋白形成特強錯合物 (Emancipator 等人（1992)，Infect· Immun. 60 : 596-601)。在載脂蛋白的製藥製劑内，與此等大腸桿菌内毒素相關的毒性亟需減少或消除，除去此等内毒素，同時在技術上有適用性，涉及複雜而昂貴的蛋白精製方法論（美國專利6,506,879 號），不完全消除人體健康的危險。技藝上已知使用植物為大量生產重組體蛋白之生物反應器，業已生產過許多蛋白質，包含人體治療用蛋白質。例如，美國專利4,956,282 ; 5,550,038和5,629,175號揭示在植物内生產r 一干擾素；美國專利5,650,307 ; 5,716,802和 5,763,748號評載在植物内生產人體血清清蛋白，而美國專利 5,202,422 ; 5,639,947和5,959，177號係關於在植物内生產抗體。以植物為基本的重組體蛋白生產系統具有的重大優點之一，是提尚成長植物的英故數，可以便宜方式把蛋白生產規模化到提供大量蛋白質。反之，醱酵和細胞培養系統的空間、設備和能量需求大，使得生產成本增加。然而，儘管事貝上使用植物為生物反應器已有充分文獻，且儘管有上述治療上應用載脂蛋白，然而先前技術尚未能提供在植物内生產載脂蛋白之方法。為提供實際另類的醱酵和細胞培養基為基礎的系統， =是植物要㈣健康，且餘蛋白可在祕内累積到重大水準。有鑑於載脂蛋白與脂質相關之固有性質，以重組方 2的载脂蛋白會與内源性植物脂質相關，因而干擾到“ 月曰矣之新陳代謝。@此，細蛋㈣重組縣現會影響到植 200526778 尚 H以重組方式表現的載白 t效水準，一如保紐機制在載脂蛋白降解中二ίΓ 合成能力是否以及如何在植物内達成商業化生ΐ洁用先前技術重組生絲脂蛋自方法_ ^缺點’在技藝上需要改進勸旨蛋白之生產【發明内容】本發__植物巾_蛋白之生產方法。本發在植物種籽内生產載脂蛋白之方法。无才曰包括 •因此，本發明提供載脂蛋白在植物中之表現方法， (a) 提供嵌合核酸構造物，在5，至3,的轉錄方向包括下列，做為操作上連接成份： (i) 能夠控制在植物細胞内表現之核酸序列；和 (ii) 將载脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列； (b) 把嵌合核酸構造物引進入植物細胞内；以及 (c) 讓植物細胞成長為能夠表現載脂蛋白之成熟植物。按照本發明，已發現植物種籽特別適用於生產載脂蛋。因此，本發明提供在植物種籽内表現載脂蛋白之方法，包括： (a) 提供嵌合核酸構造物，在5,至3,轉錄方向包括下列’做為操作上連接成份： ①能夠控制在植物種籽細胞内表現之核酸序列；和 (ii)將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列； (b) 把喪合核酸構造物引進到植物細胞内；以及 (c) 讓植物細胞成長為能夠結籽之成熟植物，其中種籽表現載脂蛋白。在進一步較佳具體例中，能夠控制在植物種籽細胞内表見的核酸序列’是種軒較佳啟動子，諸如蛋白鹼 200526778 (phaseolin)啟動子。在較佳具體例中，蜱妓種A 至少0·25〇/。是載月旨蛋白。 Τ…、種籽蛋白質的在本發明較佳具體例中，纟合核酸序列又 5肽之核酸序列，以讀框連接於將載脂蛋白相。穩定型纽最好是載脂蛋白不存在時在植現和穩定累積之纽，穩定型蛋白可ί植 i發明可用之植物專用穩定型多專用穩定型多肽， ίΐί。植物專用或非植物專關定型多肽，經由可出游離天_載脂蛋白之翻，連接到載脂蛋白。夕Jin列最好又包括標定訊號’其方式是载脂蛋白 ^肽累積在内質網（ER)，或與ER衍生的貯存小泡物細胞内的油體相關。因此，嵌合核酸構造物另外可包括把 £肽加以編碼之核酸序列，能夠把載脂蛋白標定在ER或ER 何生之貯存小泡。可用來把载脂蛋白標定於ER的核酸序列，包含例如對KDEL、HDEL、SDEL序列編碼之核酸序歹J 了用來把載月曰蛋白標定在油體的核酸序列，包含對油體蛋白，諸如油質蛋白（〇le〇sins)加以編碼之核酸序列。此外’按照本發明，载脂蛋白可藉表ί見載脂蛋白而標定於油體’其方式為載脂蛋白不含標定訊號，惟把載脂蛋白加以編碼之核酸序列，包括載脂蛋白前肽。口在另一較佳具體例中，嵌合核酸包括標定訊號，其方式疋载脂蛋白累積在質外粒。因此，在如此具體例中，嵌合核酸構造物最好又含有將多肽加以編碼之核酸序列，能夠把载脂蛋白多肽標定於質外體。在又一較佳具體例中，對載脂蛋白加以編碼的核酸序列’其表現方式是使載脂蛋白累積在細胞質内。在如此具體例中，核酸序列不包括標定訊號。 10 200526778 在又-較佳具體例中，喪合核酸構造物係在核基因組整 j件下引進人植物細胞内。在如此條件下，谈合核酸序列穩定整合於植物基因組内。在又-較佳具體例中，對載脂蛋白加以編碼之核酸序列’對於植物鹤子用途最佳。本發明所用較佳核酸序列，對人、牛或豬的載脂蛋白A_〗和前載脂蛋白A4加以編碼。在另一要旨中，本發明提供獲得包括載脂蛋白的植物種籽之方法。因j：b，按照本發明，提供麟植物種包括：乃忠 ⑻&供篏合核酸構造物，在5’至3’轉錄方向包括下列’做為操作上連接成份： (1)能夠控制在植物組織細胞内表現之核酸序列；和 ⑼將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列； (b) 把嵌合核酸構造物引進入植物細胞内； (c) 讓植物細胞生成為可結籽之成熟植物；以及 (d) 從該植物獲得種軒，其中種籽包括載脂蛋白。 +種籽可用來獲得子代植物之族群，各包括表現載脂蛋白的複數種籽。本發明亦提供能夠結籽表現載脂蛋白的植物。在本發明較佳具體例中，能夠結籽的植物包括嵌合核酸序列，在5’至3,轉錄方向包括： (a) 第一核酸序列’能夠控制在操作上所連接的植物細胞内之表現； (b) 第二核酸序列，將載脂蛋白多肽編碼，其中細胞含有載脂蛋白。在較佳具體例中，嵌合核酸序列整合於植物核基因組内。在本發明另一具體例内，所用植物為阿拉伯芥植物，而在特佳具體例中，植物係紅花植物。在另一要旨中，本發明提供表現載脂蛋白的植物種籽。 200526778 植物種籽包括嵌合核酸序列，在5’ (a)=-核酸序列，㊣夠控制在操作上所連接的植物細胞内之表現；錄H第二核酸序列，將載脂蛋白多肽加以編碼。可萃取載脂蛋白多肽的來源，由種軒細胞所合成， ϊϊίΐ多少為純型。載脂蛋白可絲處理血管疾病。 :’ 和特殊實施例雖是表示本發明較 ⑽各種變化更為稃定方法論。雜物為基本的生產原料 3 ;此ί;在，種籽内生產蛋白質，而且無細菌内發現載η白的ί明提供生產載脂蛋白的安全來源物料。又 ϊϊ:ί白的重組體表現生產之天然載脂蛋白，多少是純 ί提業化規模生產載脂蛋白。因此，按照本發包括r獅内载脂蛋白加以編碼的核酸序列之表現方法， ⑻提供嵌合核酸構造物，在5,至3,轉錄方向包括下列’做為操作上連接成份： W能夠控制在植物細胞内表現之核酸序列，·和 (II)將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列； ⑻把後合核酸構造物引進入植物細胞内；以及田胞成長為表現载脂蛋白之成熟植物。即可W μ $現姻在植物種籽絲現重_蛋白質，達成间水準的_蛋白表現。因此，本發明提供在植物 12 200526778 種籽内表現方法，包括： (a) 提供嵌合核酸構造物，在5,至3,轉錄方向包括下列，做為操作上連接成份： ①能夠控制在植物種籽細胞内表現之核酸序列；和 (ii)將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列，· (b) 把嵌合核酸構造物引進入植物細胞内；以及 (c) 讓植物細胞成長為能夠結籽的成熟植物，其中種籽表現載脂蛋白。術語和定義除非另有指明，否則本案所用技術和科學術語，與本發明所屬技藝的專家常用的意義相同。所有專利、申請/案、公告和其他出版物’含有來自GenBank、SwissPro和其&參照資料庫之核酸和多肽系列者，均全文列此參考。所用術語「核酸序列」指核苷酸系列或核苷酸系列，由天然發生的鹼、糖和内糖（骨架）連鎖。此術語亦包含修飾或取代序列，包括非天然發生的單體或其部份。本發明核酸序列可為去氧核糖核酸序列（DNA)或核糖核酸序列 (RNA) ’並可包含天然發生的驗，包含腺嗓呤、鳥苦酸、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶，以及黃嘌呤和冷黃嘌呤。「將载脂蛋白加以編碼之核酸序列」和「將載脂蛋白容

13 200526778 肽加以編碼；（ii)在至少中度嚴格的雜交條件下，與上述任何載脂蛋白核酸序列雜交，或在至少中度嚴格條件下會對其雜交，但使用同義密碼字。 … 「實質上一致」一辭意指二個多肽序列以至少7〇%一致為宜，以至少85% —致更好，又以至少95% —致最好，可例如96%、97%、98%或99%—致。為測定二多肽序列間一致的百分比，使用例如Needleman和Wunsch的對準方法（j Mol· Biol·，1970, 48 : 443 )，經 Smith 和 Waterman 修正（Α& AppL Math·，1981，2 : 482)，將如此二序列之氨基酸序列加以對準，使二序列間可得最高階匹配，而在二序列間測得一致的氨基酸數。二氨基酸序列間一定百分比之計算方法為一般技術上所認知，包含例如Carillo和Lipton所載（SIAM J Applied Math·，1988, 48 : 1073)，以及《計算分子生物學》所載（Lesk編，1988年紐約市牛津大學出版部，生物計劃：訊息學和基因組計劃案）。一般而言，如此計算可以採用電腦程式。可用於此方面之電腦程式，包含但不限於gcg (Devereux 等人，Nucleic Acids Res·，1984，12 : 387 ) BLASTP、BLASTIN 和 FASTA (Altschul 等人彳 Molec· Biol·， 1990 · 215 · 403)。二多肽間一致百分比之特佳測定方法，涉及 W· Clustal 演算（JD Thompson, DG Higgines 和 TJ Gibson, 1994, Nucleic Acid Res·，22(22) ·· 4673-4680)，以及 BLOSUM 62 评分矩陣（s Henikoff & JG Henikoff，1992 年，Proc· Natl·

Acad. Sci· USA 89 ·· 10915-10919)，使用間隙開口處分 10和間隙延伸處分〇·1，使二序列間得最高階匹配，在對準中涉及二序列之一的總長度至少50%。「至少中等嚴格雜交條件」意指選定的條件，促進二相輔核酸分子間在溶液内的選擇性雜交。雜交可發生在核酸序列分子的全部或一部份。雜交部份典型上長度為至少15個 (例如20、25、30、40或50個）核苷酸。凡精於此道之士 14 200526778 均知’核酸雙鏈體或雜種之穩定性，是由Tm決定，，緩衝液内’係_子濃度和溫度的函數（ :c在= (，〔N〇)例%(G+C) —600/】)^ ϋ。因此，決定雜種穩性的洗液條件内之參數，是鈉 J和溫度。為檢定對已知核酸分子相她非—致的分子子二二= 錯配’造成Tm降低約比，例如找到〉娜認‘ 酉夂刀子，則最後洗液_降低約5t。基於如此考量 ^ =此道之士均能輕純擇適#的雜交條件。在較佳 = 中’、，用嚴格的雜交條件。舉例而言，可採用下述條件，以達成嚴格雜交··以5χ氯化鈉/檸檬酸鈉（ssc) ^nhardt’s 溶液"·〇% SDS，在 Tm (根據上式）— f以洗液0.2XSSC/0.1% SDS，在眺雜交。中 ^ ΐ亦可達成等效嚴格性。有關雜交條件之 ^外和引’可參見《分子生物學之目前規約》（她[wney & ^>ns, N.Y· 1989, 6.3.1-6.3.6)和 Sambrook 等人《分子選殖之貫驗手冊》（冷泉港實驗室出版社，1989,第3卷）。於此所稱「載脂蛋白」和「載脂蛋白多肽」，指餘蛋白，任何和全部纽序列，包含全部哺乳動物载脂蛋白多狀， ^括氨基酸殘基序列之多肽，係(〇實質上與上述構成任，脂蛋白多肽的氨基酸序列-致，或⑻细核酸序列編碼，广夠在至対度嚴格條件下，雜交於上善载脂蛋白編碼的任何核酸序列，或能夠在至少中度嚴格條件下，雜交於上述將載脂蛋白編碼的任何核酸序列，但用於同義密碼字。「載脂蛋白」和「載脂蛋白多肽」包含載脂蛋白原多肽在内。載脂蛋白多肽以人、豬或牛的起源為佳。在較佳具體例中，此等载脂蛋白包含但不限於載脂蛋白(Ap〇、載脂蛋白A_ IV (Apo AIV)、載脂蛋白Α_ν (Ap〇 AV)和载脂蛋白E (Apo E ) ° 200526778 「嵌合」一辭在核酸序列脈絡内所用，指至少二連接核西欠序列，係天然連接者。嵌合核酸序列包含不同天然源之連接核酸序列，例如構成植物啟動子的核酸序列連接於將人體載月曰蛋白加以編碼的核酸序列，可視為嵌合。嵌合核酸序列亦可包含同樣天然源的核酸序列，惟非天然連接者。例如構成由特殊細胞類型所得啟動子的核酸序列，可連接於將同樣細胞類型所得多肽加以編碼之核酸序列，但通常不連接於構成啟動子之核酸序列。嵌合核酸序列亦包含核酸序列，包括任何天然發生的核酸序列，連接於任何非天然發生之核酸序列者。复備重組表現載體，包括將載脂蛋白加以編礁夕盛厶_ 塗序列’以及控制在植物細胞内的袅現，能夠排序之枋酩按照本發明可用於將載脂蛋白加以編碼之核酸序列，及其中提供之組成物，可為將載脂蛋白多肽加以編碼之任何核酸序列，包含任何載脂蛋白原和前載脂蛋白原。

人體血漿内發現許多不同的載脂蛋白，有訊號的作用，造成脂蛋白作用於某些組織，或活化作用於此類脂蛋白之酵素（A· Lehninger等人《生物化學原理》第二版，紐約，w〇rth 出版公司，1993年）。此等蛋白質包含但不限於下列載脂蛋白 A-Ι之等位基因和訊號，例如Apo AI (例如參見CR Sharpe 等人，Nucleic Acids Res· 12⑼，3917-3932 (1984))、Apo II (例如參見 CR Sharpe 等人，>^16沁八^^1^.12(9)53917-3932 (1984))、Apo IV (例如參見 ΝΑ Elshourbagy 等人，1 Biol· Chem· 261(5)，1998_2002 (1986))、Apo AV (例如參見 Hubacek 等人，Physiol· Res· 2004, 53 ·· 225-228)、Apo B-100 (例如參見 SW Law 等人，Proc· Natl· Acad· Sci. USA，83(21)， 8142-8146 (1986))、Apo B48 (例如參見 LM Powell 等人， Cell 50(6)，831-840 (1987))、Apo C_II (例如參見 CR Sharpe 等人，Nucleic Acids Res. 12⑼，3917-3932 (1984))、Apo C-III 16 200526778 (例如參見 CR Sharpe 等人，>^〇16沁八(^5 1165.12(9)，3917-3932 ( 1984 ) )、Apo C-IV (例如參見 CM Allan 等人， Genomics 28(2)，291_300 ( 1995 ))、Apo D (D· Drayna 等人，J. Biol. Chem. 261(35)，16535-16539 (1986))、Apo E (例如參見 JL Brewslow 等人，J. Biol. Chem· 257(24)，14639-14641 (1982))、Apo F (例如參見 JR Day 等人，6丨〇(^111.8丨(^1^· Res· Commun. 203(2)，1146-1151 (1994))、Apo H (例如參見 H. Mehdi，Gene 108(2)，293-298 (1991))，以及 Apo L (例如參見 RN· Duchateau 等人，J· Biol. Chem. 272(41)，25576_25582 (1997))。將載脂蛋白加以編碼之核酸序列例，在技術上已屬公知，一般由各種各樣哺乳動物源輕易可得，包含人類 (見上述）、豬（例如參見VN Trieu等人，〇6此134(2)，267-270 (1993))、牛（例如參見 YW Yang 等人，j M〇1 Ev〇1 32(6)，469475 (1991))、羊（例如參見 ja· Robertson 等人』 Steroid Biochem· Mol· Biol· 67⑷，285_292 (1998))等。可用於將人體載脂蛋白加以編碼之序列，包含把例如定為SEQ ID NO : 1、7和8的多肽鏈加以編號者，而按照本發明可用於將非人類載脂蛋白加以編碼之序列，規定於SEq ID N〇 ·· 9_ 55和241-251。將載脂蛋白多肽鏈加以編碼之各相對應核酸序列，經由表1中所提供Accessi〇n鎧別符號碼，即可輕易定。，此等核酸序列，以精於此道之士熟二技卩輕易鑑疋將另外新穎載脂蛋白加以編碼之核酸序列。例如 ^庫、eDNA和蚊料敎庫，均可_， ίίί 序列資訊的資料庫，可以查尋類似序列。將 :J發現何_穎序列。在較佳具體載:蛋:加以編碼之核酸序列’是人類、豬和牛的許多載脂蛋白類似物為先前技術所知（例如參見地 200526778

Cheung 等人，Biochim Biophys Acta· 1988 年 5 月 2 日； 960(1) : 73-82，和 w· Strobl 等人，Pediatr Res· 1988 年 8 月； 24(2) · 222·8) ’且可按照本發明使用。於此可用之類似物包含人體載脂蛋白分子，其中發現各種天然和合成突變和修飾，包含但不限於點突變、缺失突變、移碼突變和化學^ 飾。按照本發明較佳具體例，使用稱為Ap〇 A!_M之天然變種，按照本發明可用之突變和修飾例，包含但不限於表2 列。在較佳具體例中，所用將載脂蛋白加以編碼的核酸庠列。將載脂蛋白加以編碼的核酸序列，加以變更以製造载脂蛋白類似物，可用精於此道之士所知的各種核酸修飾技術為之，包3例如疋點誘變、定向誘變、隨機誘變、添加有機^ 劑、基因倒位，或與精於此道之士所知其他技術組合 (Shraishi 等人，1988, Arch. Biochim. Biophys, 358 : 104-115 ; Galkm 等人，1997, Protein Eng. 10 : 687-690 ; Carugo 等人 1997, Proteins 28 : 10-28 ; Hurley 等人 1996, Biochem，35 Γ 5670-5678 ; Holmberg 等人，1999, Protein Eng 12 ·· 851_ 856) 〇按”、、此將載月曰蛋白加以編碼的核酸序列，連接至能夠控制在植物細胞内表現載脂蛋白多肽之核酸序列。因此，本發明亦提供將載脂蛋白加以編碼之核酸序列，連接至能夠控制在植物細胞内表現之啟動子。此處可用的能夠控制在植物細胞内表現的核酸序列，包括能夠控制在植物内表現多肽之任何植物所衍生啟動子。一般而言，若按照此選擇雙子葉植物，則可用雙子葉植物品種所得啟動子，而選擇單子葉^直物可用單子葉植物啟動子。在—具體例中，使用啟動子導致在全株植物内表現載脂蛋白多肽。可用之組成型啟動子，包含例如35S花椰菜鑲嵌病毒（CaMV)啟動子 18 200526778 Ϊ人，1987, Gene 53 ]53·161)、水稻肌動啟動子 57號）、泛蛋白啟動子，諸如泛 =5，Γ:和5,273,894號)以及荷蘭ΐ泛 (· Kawalleck 等人，1993, Plant Mol. Biol· 21 : 673-684)。以ίίΓ月特佳具體例中，於植物種軒内生成載脂蛋白。

'内生成具有把載脂蛋白做為原料儲存和運輸的彈性’因為麟蛋白從齡種籽萃取時财其活性。此外經萃取的生物量有限，由於植物種籽内存在的水含量較低。 f此’在本發明較佳具體射，植物細胞是種籽細胞，而植物成^為能夠結籽之成熟植物，其中種籽表現載脂蛋白。在 ^較佳具體例中，能夠控制在植物細胞内表現的核酸序列是種籽為佳之啟動子，諸如蛋白鹼啟動子。在如此具體例中，使用啟動子造成載脂蛋白多肽優先表現在種籽組織内。種籽優先啟動子」指控制表現重組蛋白（即載脂蛋白）之啟動子，使成熟植物内存在的重組蛋白總量最好至少8〇〇/〇存在於種籽内。最好是成熟植物内存在的重組蛋白總量至少 95%存士於種籽内。在此方面可用之種籽優先啟動子，包括

例如大豆蛋白驗啟動子（Sengupta-Gopalan等人，1985，Proc Natl· Acad. Sci. USA 82 : 3320-3324)，·阿拉伯芥518 j^’a 油質蛋白啟動子（美國專利5,792,922號）或亞麻油質蛋白啟動子 (WO 01 / 16340號）；或亞麻豆球蛋白般種籽儲蛋白（核絲）啟動子（WO 01 / 16340號）；亞麻2S儲存蛋白啟動子 (WO 01 / 16340號）；胚乳優先啟動子，諸如啟動子（Rogers 和 Milliman，J_ Biol· Chem·，1984, 259 : 12234-12240)、Amy6-4 啟動子（Kursheed 和 Rogers, J. Biol· Chem·， 1988, 263 : 18953-18960)’ 或 Aleurain 啟動子（Whittier 等人， 1982, Nucleic Acids Res·，15 ·· 2515-2535)，或大豆 arcdin 啟’ 動子（GD Jaeger 等人，2002, Nat Biotechnol，Dec ; 20 : 1265- 19 200526778 種植_可狀新啟動子持魏玩發現^植物啟動子，許夕例可蒼見 0hamur〇等人（Bi〇chem 〇f plams，1989 15 · 1-82)〇 ’ ’ 本發明較佳具體例中，嵌合核酸序列又包括將穩定型碼之核酸序列，以讀框連接於將_蛋白加以編序列。穩定型多肽用於方便蛋白f折疊和/或增進载^曰蛋白穩定累積於植物細胞内。此外，穩定型多肽可於ΐ物細胞内所需位置，和/或方便載月旨蛋和稃^以多肽以在無載脂蛋白存在τ，可輕易表現積在轉基雜物細胞内之多肽為佳。穩定型多肽可 ίίϊΐϋ或非植物專用型多狀。按照本發明可用之植物了疋里多肽，包含油體蛋白（見下述）和硫氧化還原用之id ν〇 :56内所示硫氧化_酶。按照此^ tv i t穩定型多肽’包含綠螢光蛋白（GFP) NO 5；)：lT；r^W〇rId 3(2) ： 43"8) 1D 好經?辭最触，狀型多狀最單鏈此，之抗體’包含方便載脂蛋白精製之白特殊關聯用與油體或油體蛋單鏈抗在又—齡具體例中，相關之單鍵抗體。在最各種可或「抗體片段」，指多肽含有 L;…構域，利用肽接頭（L)連接於可變重 20 200526778 (Vh)結構域’以vl-L-Vh表示。「結構域」（domain)是假設分別功能的蛋白質區段，諸如抗原結合或抗原識別。本發明内所用單鏈抗原片段，可從任何抗體的輕和/或重鏈可^ 結構域衍生。輕、重鏈可變結構域以同樣抗原專用為佳。最好抗原是油體蛋白，結合形成多價單鏈抗體的個別抗體片可針對同樣抗原或不同抗原引導。產生單鏈抗體的方法論為技術上所公知。例如單鏈抗體可利用篩選單鏈（scFV) 嗤菌體顯示庫所產生。從嗟菌體顯示庫產生單鏈抗體的方法論，在技術上已屬公知。McCarrerty 等人（Nature 348 ·· 552·554)證明使用嘆菌體顯示系統中，抗體的片段表現成具有fd噬菌體載體之融合蛋白，得以在噬菌體表面表現單鏈抗體。使用例如由 ^mersham生物科技學和Cambridge抗體科技所開發的重組嗟菌體抗體系統，可達成單鏈抗體噬菌顯示庫之生產。更詳細規約可從Amersham生物科技取得，分3部份銷售，包含老鼠scFV分子、表現模組和檢測模組。簡言之，單鏈抗體的生產規約如下。從所研究抗原免疫接種過的老鼠所得老鼠雜交瘤或老既牌細胞，可得信使。老鼠雜交瘤代表抗體基因最豐富來源，因其表現單—抗體㈣重

因’但抗體亦可制來自免疫雛老鼠⑽細胞加以選殖。使用逆轉錄酶和隨機六聚體引物，可將 rtl用隨機六聚體可得cDNA奸，長度足以選Ϊ 子、的可變區。俟產生eDNA分子後，即進行主要 PCR反應，*開放大重、輕可變區。引物的設計在於利兩端雜交，將重或輕鏈可變區放大。可變區一旦放大p 到電料7凝軸化，峨去⑽和任何外為单-基S。接視的設計在於確髓、㈣確& 匡。例如可變重鏈（νΗ)和可變輕鏈（Vl)可用（吻如): 21 200526778 接頭連接，而得長度大約750鹼基對之單鏈抗體片段 (scFv)。一旦重、輕鏈與接頭組合，即進行次要pcr反應，將組合的SCFV DNA片段放大。引物應設計成引進限制部位，容許選殖成噬菌體粒表現載體。例如明〗和部位可加到此等scFv基因的5,和3’末端，供選殖成pCANTAB 5E載體（Amersham生物科學）。一旦PCR完成，DNA片段應純化，以除去未加入之引物和dNTPs。此可用迴旋管柱純化達成。DNA片段一旦已告純化和量化，片段即以適當限制酵素消化，使選殖成適當表現載體。DNA片段隨即連結於表現載體，例如pCANTAB 5E (Amersham生物科學），並引進入勝任大腸桿菌細胞内。細胞應在適當選用培養基上成長，確保只有含表現載體的細胞會成長（即使用特殊碳源和抗生素選擇）。大腸桿菌一旦成長，含噬菌體粒之菌落，即以M13 辅助嗤菌體（即K07—Amersham生物科學）感染，生成重組噬菌體，顯示scFv片段。M13噬菌體會發動噬菌體複製，產生完整噬菌體顆粒，從細胞釋出，在表面表現seFv物種。顯示正確scFv抗體的噬菌體，可藉晃動使用特殊抗原來檢疋。為消许非特殊嗤痛體’可把重組嗤菌體的培養物轉移到塗佈抗原之支持體（即燒瓶或試管），加以洗滌。只有顯示正確scFv的噬菌體會結合於支持體。易感的大腸桿菌菌株隨即以結合於塗佈抗原的支持體之噬菌體加以感染。噬菌體可藉輔助噬菌體的搶救而增濃，並對抗原晃動多次，亦可直接^ 板接種於固體培養基上，不需進一步增濃。以對適當抗原選用的噬菌體感染過的大腸桿菌細胞，經平板接種，而拾取個別菌落。取自個別菌落的噬菌體，再使用例如HLISA檢驗法 (酵素連接免疫吸附劑檢驗法）加以檢驗。使用ELISA檢驗為陽性之噬菌體抗體，即可用來感染大腸桿菌細胞，以供生產可溶性重組抗體。適當選殖一旦選定，即可檢定scFv抗體基因之序列，用於本發明。 22 200526778 、穩定型蛋白可經由接頭連接至載脂蛋白，可裂解以釋出游離天然型之載脂蛋白。在此方面包含在内之接頭，包含以 Xa因子、igA蛋白酶或腸激酶識別之肽序列。在特佳具體例中’接頭把凝乳酶前序列編碼，可藉成熟的凝乳酶分解，見 PCT專利申請案w〇 98 / 49326號。在較佳具體例中，嵌合核酸序列又包括「標定訊號」。於此所用標定訊號意指能夠把載脂蛋白多肽在表現時引導至植物，胞内所需位置之任何氨基酸序列。於此可用之適當標定訊號’包含能夠把載脂蛋白多肽標定於内質網狀體，或衍自内質網狀體的貯存小泡，諸如油體，以及質外體。為達成載脂蛋白累積於ER或ER衍生的貯存小泡，將載⑩ 脂蛋白加以編碼之多肽連接至標定訊號，造成載脂蛋白保存在ER或ER衍生之貯存小泡内。在本發明較佳具體例中，能夠把載脂蛋白保存在ER内之標定訊號，含有羧基末端ER— 保留模體。此等羧基末端ER_保留模體包含KDEL、 HDEL、DDEL、ADEL和SDEL序列。其他例包含HDEF (Lohmann 等人，2001，Plant Physiol，127(2) : 436-439)，或二精氣酸’接近位於2和3、3和4或4和5位置之胺基末端 (摘自 Plant Biology 2001 Program，ASPB，2001 年 7 月，美國羅德島州Providence市）。將羧基末端保留模體加以編碼的核酸序列，宜連接到將載脂蛋白加以編碼的核酸序列，其方式攀使能夠將載脂蛋白保存在ER内之多肽，即連接至載脂多肽的羧基末端。在將載脂蛋白保存在ER内之本發明具體例中，嵌合核酸序列另含有核酸序列，把核酸序列標定於内膜系統（「訊號肽」）。在載脂蛋白多肽使用KDEL、HDEL或SDEL多肽等序列保存在ER内之本發明具體例中，特別需要含有將訊號肽加以編碼之核酸序列。於此可用之訊號肽例，包含菸草發病相關蛋白（PR-S)訊號序列（SEQ ID NO : 58) (Sijmons 23 200526778 等人，1990，Bio/technology, 8 : 217-221)、卵石粦脂訊號序列 (Boehn 等人，2000, Transgenic Res· 9(6) : 477_86)、來自菜豆 (Phaseolus vulgaris)富含羥基脯胺酸的糖蛋白之訊號序列 (Yan 等人，1997, Plant Phyiol，115(3) ·· 915-24 和 Corbin 等人， 1987, Mol Cell Biol 7(12) : 4337-44)、馬鈴薯 patatin 訊號序列 (G. Iturriaga 等人，1989, Plant Cell 1 : 381_390 和 Bevan 等人， 1986, Nuc. Acids Res· 41 ·· 4625-4638)，以及大麥α —澱粉酶訊號序列（Rasmussen 和 Johansson, 1992, Plant Mol. Biol. 18 (2) : 423-7)。於此實施例3表示載脂蛋白累積於ER内。序列，彳，排序計劃查索含序列資訊之資料庫。可用另類方法，以單離將油體蛋白多肽加以編碼的另外核酸序列，並按照本發明發現和使用新穎序列。特佳的油體蛋白是油質蛋白，例如玉米油質蛋白（B〇wman_Vance等人，1987, J. Biol· ^二262 : 11275七279 ; Qu 等人，1990, J. _· Chem. 265 : 2238-2243)或油菜類（Lee 等人，1991，Plant Phv^in! Qfi : 在又一較佳具體例内，載脂蛋白多肽係連接至能夠將載脂蛋白多肽保存在ER衍生貯存小泡内之多肽。在較佳具體例中，ER衍生貯存小泡為油體，而載脂蛋白連接至油體蛋白。在此方面可用之油體蛋白包含與油體天然相關之任何蛋白（見表3内SEQ ID NO : 59-137)。將油體蛋白多肽鏈加以編碼之各相對應核酸序列，經由表3提供之檢驗識別符號碼’可輕易檢定，使用此等核酸序列，以精於此道之士所知技術，即可輕易檢定將核酸序列加以編碼之另外新穎油體蛋白，例如可篩選表現庫、CDNA和基因組庫等，並可為類似

l白，諸如從阿拉伯芥 :138)或油菜籽（Brassica 由質蛋白，與其他植物油質蛋白， (Arabidopsis thaliana, SEQ ID NO ： 138 ) 24 200526778 napus，SEQ ID NO : 139)單離之油質蛋白。 =油體蛋白是來自植物、真g或其他來源之賴合^白，1 5從阿拉伯芥（SEQ ID N0 :⑽和SEQ ID NO :如〕早離_結合蛋白等植物舞結合蛋白，享有序朗系。在另 -具，例中’油體蛋白為固醇結合去氫酵素（SEQ id n〇 : 142) (L-J Lin 等人，2〇〇2, Plant PhySi〇i 128 ·· 1200-1211 )，太發明此具體例在實施例3内舉例說明。此外，按照本發明可藉表現載脂蛋白，而將載脂蛋白標定於油體，使得_蛋白不含標定訊號，惟將载脂蛋白加以編碼之核酸序列，包括載脂蛋白肽原。本發明此具體實施例3。

能夠將載脂蛋白保存在ER或ER衍生貯存小泡内之多肽，典型上不剪切，而載脂蛋白可以融合蛋白的型式累積，例如典型情況為，使用KDEL保留訊號將多肽保留於ER 内，或使用油體蛋白把多肽保留在油體内。在本發明另一具體例中，载脂蛋白多肽表現方式視，使多肽累積在質外體。為達成如此累積，嵌合核酸序列宜包括標定序列，能夠將載脂蛋白多肽引導至ER (「訊號肽」），於此可用的訊號肽例如包含上述菸草發病相關蛋白（PR-S)訊

號序列（SEQ ro NO : 58) (Sijmons 等人，1990, Bio/ technology，8 : 217-221 )、卵磷脂訊號序列（Boehn 等人，2〇〇〇, Transgenic Res· 9(6) : 477_86 )、來自菜豆（Phaseolus vulgaris)富含羥基脯胺酸的糖蛋白之訊號序列（Yan等人， 1997, Plant Phyiol，115(3) ·· 915_24 和 Corbin 等人，1987, Mol Cell Biol 7(12) : 4337-44)、馬鈴薯 patatin 訊號序列（G· Iturriaga 等人，1989, Plant Cell 1 : 381_390 和 Bevan 等人，1986, Nuc· Acids Res· 41 : 4625_4638)，以及大麥α -澱粉酵素訊號序列（Rasmussen 和 Johansson，1992, Plant Mol. Biol· 18(2): 423-7)。此等標定訊號可在體内從載脂蛋白分裂，典型情況 25 200526778 為使用質外體標定訊號，諸如菸草發病相關蛋白s (pR_s) 訊號序列（Sijmons 等人，1990, Bio/technology，8 : 2i7- 221)。其他訊號肽可用Signalp w〇rld別如〜必服務站 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )預計，可預計來自不同微生物的胺基酸序列内訊號肽剪切部位之存在和位置。一般而言，主要胺基酸序列稍微保守，雖然一般物理化學性能保守到某些程度。訊號肽的概括結構有三區，短胺基末端「η區」含有帶正電殘基，中央疏水性「h區」大小範圍在7至15個胺基酸’和羧基末端rc區」含極性胺基酸，以及由膜結合訊號肽酵素識別之剪切部份（K Nakai，2〇〇〇,

Advances in Protein Chem 54 : 277-344)。按照此亦可用之;^ 定訊號，包含天然載脂蛋白訊號序列（以人體序列言，長^ 為18個胺基酸）。在其較佳具體例中，位於胺基末端的質外體標定序列，諸如前述菸草PR-S序列，可與位於羧基末端的 ER保留序列’諸如KDEL序列組合使用。在又一較佳具體例中，將載脂蛋白加以編碼的核酸序列’其表現方式是使載脂蛋白累積在細胞質内。在如此具體例内，核酸序列不包括標定訊號。在如此具體例中，載脂蛋白包括其他穩定型多肽，諸如綠螢光蛋白（GFP)。嵌合核酸序列亦可包括胺基和/或羧基多肽延伸段。此等延伸段可用來穩定和/或協助折疊載脂蛋白多肽鏈，亦可方便標定於細胞内之區室，例如油體。在此方面可用之多肽延伸段，包含例如將單鏈抗體加以編碼之核酸序列，將綠螢光蛋白加以編碼之核酸序列（Davis和Vierstra，1996，Weeds World 3(2) : 43-48)，或此類多肽之組合物。特別需要的單鏈抗體延伸段，包含可使載脂蛋白與油體關聯者，以方便與油體部份關聯的載脂蛋白純化。此等延伸段宜包含在本發明具體例内，其中載脂蛋白在植物種籽内表現，並在種籽細胞内標定於ER或質外體。 26 200526778 在又-具體綱，剪切部位可位於載基末端之上游，或祕末端之下游，使肽的胺可從融合夥伴剪切，而得單輔脂蛋白A4。= Aj多肽例可參見WO 98/搬6 (融合蛋白的剪切方、、Jff雜之請案，以及LaVame等人（1994)「融合蛋白口相關^ 切」，载於《分子生物學的現時規约》胃1645:上;，|到紐約。在較佳具體例中，剪切部位是 (SEQ ID NO · M3)，可利用含凝乳酶白酶加以細。在又—較佳具體例中，於 1 1蛋 AI多肽狀絲末端，加額外蛋胺酸殘基f 肽或AP〇

本發明又提供從宿主細胞成份分離異種蛋白之 h 把油體部份隔離，隨即經由異種蛋白_油體蛋白融 ^ 剪切，而釋放異種蛋白。視情形，剪切部位可在^狀胺基末端上游和縣末端下游，使得融合純可藉分相切和分離成其組份肽。

將載爿日蛋白加以編碼之核酸序列，可加以改變以改進表現水準，例如對為表現細蛋白多肽而_的特定植物細胞類型，按照較佳密碼子用途，使核酸序列最適宜，或改變將 mRNAs去穩定化所知模體（例如參見PCT專利申請案97/ 02352號）。將載脂蛋白多肽加以編碼的核酸序列之密碼子用途，與植物細胞型的密碼子用途加以比較，使密碼子的識別可以改變。利用改變密碼子用途構成合成基因，載於例如 PCT專利申請案93/07278號。在較佳具體例中，所用將載脂蛋白加以編碼的核酸序列，以 SEQIDNCU、SEQIDNOJ 或 SEQIDN0.5 表示。在此可用一些遺傳元素，能夠增進載脂蛋白多肽之表現。此等元素包含從某些病素未轉譯之前導序列，諸如AMV 前導序列（Jobling 和 Gehrke，1987, Nature, 325 : 622-625)，以及與玉米泛蛋白啟動子關聯之内含子（美國專利5,5〇4,2〇〇 27 200526778 號)_。一般而言，可製備嵌合核酸序列，使能夠增進表現的遺傳元素位於將載脂蛋白多肽加以編碼的核酸序列之5,。按照本發明，包括能夠控制在植物内表現的啟動子之嵌合核酸序列，連接於將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列，可整合於重組表現載體，確保在細胞内有良好表現。因此，本發明包含重組表現載體，在5,至3,的轉錄方向包括下列操作上連接成份： ” (i) 能夠控制在植物細胞内表現之核酸序列；和 (ii) 將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列；其中表現載體適於在植物細胞内表現。「適於在植物細胞内表現」指重組表現載體包括本發明嵌合核酸序列，連接於需在植物細胞内達成表現之遺傳元素。在此方面可包含在表現載體内之遺傳元素，包含轉錄型末端區，將標誌基因加以編碼之一或以上核酸序列，一或以上之複製起源等等。在較佳具體例中，表現載體又包括載體或其一部份在植物細胞核基因組内整合所需遺傳元素，例如T-DNA左、右邊界序列，方便在植物細胞使用土壤桿菌（Agrobacterium)轉型的本發明具體例中，整合於植物核基因組内。在又一較佳具體例中，該植物細胞是植物種軒細胞。如前所述’重組表現載體一般包括轉錄型終止子，除了做為轉錄終止訊號外，又可做為能夠延長半生期之保護性元素（Guameros 等人，1982, Proc· Natl· Acad· Sci. USA, 79 : 238_242)。轉錄終止子一般約200個核苷酸至約looo核苦酸，並製備表現載體使轉錄終止子位在將載脂蛋白加以編碼的核酸序列之3’。於此可用之終止序列包含例如胭脂鹼終止區（Bevan 等人，1983, Nucl· Acids· Res” 11 : 369-385)、蛋白鹼終止子（van der Geest 等人，1994, Plant J. 6 : 413423)、 arcelin 終止子（GD Jaeger 等人，2002, Nat· Biotechnol. 20 : 1265-8)、根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)的章魚 28 200526778 5酶基因用之終止子’或其他類似功能性元素。轉錄型終 at子可按An所述獲得（An，19胸滅& E 53 :

292) 〇 J 根，本發明，表現载體可又含有標誌、基因。按照本發明可用的標認基因，包含可把轉型細胞與未轉型細胞分辨之所有基，，包含全部可選擇和可篩選的標誌基因。標誌基因可抗巧標誌，諸如對康納黴素（美國專利6，174,724號）、 ^青黴素、G418、博萊黴素、驗素之抗生素抵抗性標魏，得以利用化學手段或對化學劑耐受標諸，諸如正常植物毒性糖甘露糖（Negrotto 等人，20005 Plant Cell Rep” 19 : 798-803)，選擇特質。於此可用之其他適宜標誌、，包含輸送對除籲草劑，諸如嘉磷塞（美國專利4,940,935和5，188,642號）、 phosphmothricin (美國專利5,879,903號）或磺醯脲（美國專利5,633,437號）’具有抵抗性之標魏，抵抗性標諸連接很近將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列時，可用來維持對植物細胞族群，或未喪失將载脂蛋白多肽加以編碼的核酸序列之植物，有選擇性壓力。可用來透過視覺檢查以檢定轉型體之筛選型標誌，包含/9 一葡糖酶（GUS)(美國專利5,268,463 和5,599,670號），和綠螢光蛋白（GFP) (Niedz等人，1995，

Plant Cell Rep” 14 : 403)。 ’ ’ 適於將核酸序列引進到植物内用之重組載體，包含土壤春桿菌和根癌菌為基本之載體，諸如Ti和Ri質粒，包含例如 pBIN19 (Bevan，Nucl· Acid· Res” 1984, 22 ·· 8711-8721 )、 pGKB5 (Bouchez 等人，1993, C R Acad. Sci· Paris, Life Science 316 : 1188-1193 )、雙載體之 pCGN 系列（McBride 和5 Summerfelt，1990, Plant Mol. Biol·，14 ·· 269-276)，以及其他雙載體（例如美國專利4,940,838號）。八本發明重組表現載體可按照分子生物學專家公知的方法論製備。此項製備典型上涉及大腸桿菌的菌株，做為中間選 29 200526778 殖稍主。大腸桿函以及植物轉型載體的製備，可用通常已知技術完成，諸如限制消化、結合、凝谬電泳、DNA排序、聚合鍵反應（PCR)及其他方法論。各種選殖載體都可進行製備重組表現載體所需之必要步驟。在大腸桿菌内具有複製系統功能的載體當中，有諸如PBR322載體、pUC'系列^ 體、M13mp系列載體、pBluescript等。典型上，此等選殖載體含有標誌，容許選擇轉型細胞。核酸細胞可引進入此等載體内，而載體可引進入在適當培養基内成長之大腸桿菌内。重組表現載體可在細胞收穫和溶菌時，從細胞回收。再者，關於製造重組載體之一般入門’可以參見例如Sambrook等人《分子選殖之實驗室手冊》，Cold Spring Harbor實驗室出版社，1989,第3卷。製備包括能夠表現載脂蛋白的種軒之掉物按照本發明，將嵌合核酸序列引進植物細胞内，讓細胞成長為成熟植物，其中植物表現載脂蛋白多肽。按照此，可選擇任何植物品種或植物細胞。於此所用特殊細胞包含由阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana)、巴西堅果 (Betholettia excelsa)、萬麻豆（Riccinus communis)、挪子 (Cocus nucifera )、胡萎（Coriandrum sativum )、棉 (Gossypium spp. )、土豆（Arachis Hypogaea )、荷荷巴 (Simmondsia chinensis)、亞麻（Linum usitatissimum)、玉蜀黍（Zea mays)、芥子（Brassica spp·和 Sinapis alba)、油棕 (Elaeis guineeis)、橄欖（〇lea eurpaea)、油菜籽（Brassica SPP )、稻米（Oryza sativa)、紅花（Carthamus tinctorius)、大豆（Glycine max )、南瓜（Cucurbita maxima )、大麥 (Hordeum vulgare )、小麥（Traeticum aestivum )、青浮草 (Lemnaceae sp·)和葵花（Helianthus annuus )。按照較佳具體例，使用油籽植物之植物品種或植物細胞。於此可用的油軒植物包含花生（Arachis hypogaea)、齐 30 200526778 子（Brassica spp·和 Sinapis alba)、油菜籽（Brassica Spp·)、蠶丑（Cicer arietinum )、大豆（Glycine max )、棉 (Gossypium hirsutum)、葵花（Helianthus annuus)、（Lentil

Lens culinari )、亞麻（Linum usitatissimum )、白苜藉 (Trifolium repens)、橄稅（〇lea eurpaea)、油棕（Elaeis guineeis)、紅花（Carthamus tinctorius)和 narbon 豆（Vicia narbonesis ) ° 按照較佳具體例，使用阿拉伯芥、亞麻或紅花。把植物重組表現載體引進入植物細胞内之方法論，於此亦稱為「轉型」，在技術上已屬公知，典型上因選用的植物細

胞而異。把重組表現載體引進入細胞内之一般技術，包含電穿孔；化學媒介技術，例如CaCl2媒介核酸攝取；顆粒轟擊 (bidistics);使用天然感染性核酸序列，例如以病毒方式衍生的核序列、土壤桿菌或根癌菌衍生序列、聚乙二醇 (PEG)媒介核酸攝取、微注射，以及使用碳化石夕晶鬚。

在較佳具體例中，選用轉型方法論，可使嵌合核/酸序列整合於植物細胞基因組内，以植物細胞核基因組為佳。按照此，被視為特別需要，乃因使用如此方法論，會導致嵌合核 S文序列在有性生殖時，轉移至子代植物。在此方面可用之轉型方法，包含顆粒轟擊和土壤桿菌媒介方法。雙子葉植物品種之轉型方法論，已屬公知。一般使用土壤桿菌媒介轉型，因其效率高，且-般為許多（即使不是全 ϊ)ΐίΐ植物品種所能感受。土壤桿菌轉型一般涉及雙載 m轉移到適#土壤桿㈣株（· ehaU和 =4404) 與帶有重組雙載體的大腸桿菌菌株，或帶有

Hi載體移動至標的土壌桿韻株的大腸桿關株，進 c” ’或_土壌#_株之dna轉型（H〇fgen 等人，Nud. Acids. Res·，1988, 16 : 9877)。可用來將雙子葉植 31 200526778 物細胞轉型的其他技術，包含顆粒轟擊（Sanford，1988, Trends in Biotechn. 6 : 299-302);電穿孔（Fromm 等人，1985, Proc. Natl· Acad. Sci· USA, 82 : 5824_5828) ; PEG 媒介 DNA 攝取（Potrykus 等人，1985, Mol_ Gen· Genetics，199 : 169-177);微注射（Reich 等人，Bio/Techn·，1986, 4 : 1001-1004);以及碳化矽晶鬚（Kaeppler 等人，1990, Plant Cell Rep.， 9 : 415418)，或使用例如花浸法在植物内轉型（Clough和 Bent, 1998, Plant J·，16 : 735-743)。單子葉植物品種可用各種方法轉型，包含顆粒轟擊 (Christou 等人，1991，Biotechn. 9 : 957_962 ; Weeks 等人， Plant Physiol·，1993，102 : 1077-1084 ; Gordon-Kamm 等人， Plant Cell，1990,2 : 5603-618) ; PEG 媒介 DNA 攝取（歐洲專利0292 435和0392 225)，或土壤桿菌媒介轉型（Goto_

Fumiyuki 等人，1999, Nature-Biotech. 17 : 282-286)。正確植物轉型方法會因植物品種和選做轉型用細胞標的之植物細胞類型而稍有變化（例如種籽衍生細胞類型，像胚軸和子葉或胚組織）。如别述特佳具體例，使用紅花。獲得紅花轉型體之方法，參見Baker和Dyer (Plant Cell Rep” 1996, 16 : 106-110)。另外植物品種專用的轉型規約，可查《農林生物科技46 :轉基因作物》（YRS· Β_編），郎如辦出版社，紐約（1999)，以及《農林生物科技轉基因作物π》 (Y.P.S. Bajaj 編），Springer 出版社，紐約（2001)。在轉型之後，讓植物細胞成長，在微分組織，諸如芽和根生出時，成熟植物即告再生。典型上可再生複數植物。植物再生方法一般是有植物品種和細胞類之依賴性，為精於此道之士所知。關於植物組織培養物之進一步指導，可查例如《植物細胞和組織培養物》，1994, Vasi丨和孙0啊編^uwer 學術出版公司，以及《植物細胞培養物規約》（分子生物法 111 )，1999, Hall 編，Humana 出版社。 200526778 、在一要旨中，本發明提供包括载脂蛋白的植物種籽獲得方法。因此，本發明提供一種包括载脂蛋白的植物種籽之方法，包括： (a)提供嵌合核酸構造物，在5，至3,轉錄方向包括下列操作上連接成份： (I) 能夠控制在植物種籽細胞内表現之核酸序列；和 (II) 將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列； (b) 把嵌合核酸構造物引進入植物細胞内； (c) 讓植物細胞成長為成熟植物；以及 (d)從該植物獲得種籽，其中種籽包括載脂蛋白。種^可絲獲得子代植物賴群，各包括複數種軒表現 3L載脂蛋白。在較佳具體例中，總計種籽蛋白至少大約 0.25/〇為載月曰蛋白。更好是總計種籽蛋白至少大約〇5〇/。為載脂蛋白。最好是總計種籽蛋白至少大約1〇%為載脂蛋白❶ 在較佳具體例中，得複數轉型植物，成長，核酸序列存在而篩選，其在推定轉型體内之存在，在，用除草臟抗性觀之選擇性培養基上的成長來須;試，除草劑係直接施於植物，或利用南方氏DNA印跡法。知有嵌合核酸序列存在，即可選用轉型植物，以產生 ί致？ff _狀錢養，_包騎錢合核酸序 :多^2需讎複數轉基因種軒，以獲得轉

Uli，括有種籽’種籽包括有㈣脂蛋白加以編碼之嵌 s核酉夂序列。此外’-般需確保在植物内之純合性，双 5多肽之連續遺傳。純合型植物之選擇方法，為精於此^ ΐ 士Ϊ知。可_純合麵物之麟方法，包含單倍體细胞，組織之製備和轉型，接著是單倍體幼苗的再生，隨成-倍體植物，例如_ eolehine或微管分裂劑加以植物即可按照其他習知農業實務成長。處 200526778 在另一要旨中，本發明亦提供能夠結籽表現載脂蛋白之在本發明較佳具體例中，能夠結籽的植物包括喪合核酸序列，在5,至3,轉錄方向包括： (a) 能夠控制在操作上所連接植物種籽細胞内表現之第一核酸序列； (b) 將載月曰蛋白多肽加以編碼之第二核酸序列，其中種籽含有载脂蛋白。在較佳具體例中，嵌合核酸序列穩定整合於植物核基因組内。在又一要旨中，本發明提供植物種籽表現型載脂蛋白。在本發明較佳具體例中，植物種籽包括嵌合核酸序列，在5, 至3’轉錄方向包括·· (a) 能夠控制在操作上所連接植物種籽細胞内表現之第一核酸序列； (b) 將載脂蛋白多肽加以編碼之第二核酸序列。载脂蛋白多肽可以各種不同型式的種籽細胞呈現，包含，如胚軸，包含在胚根和胚葉内，而就單子鎌物品^ 3，包含穀物和玉米，係用在胚乳組織内。一旦已獲得植物，即可從植物萃取而獲得载脂蛋白，多少為純型。因此，本發明提供實質上純載脂蛋白之製法，包括·· (a) 提供嵌合核酸構造物，在5,至3,轉錄方向包括下列操作上連接成份·· (0能夠控制在植物種籽細胞内表現之核酸序列； (ii)將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列； (b) 把喪合核酸構造物引進入植物細胞内； (c) 讓植物細胞成長為成熟植物； (Φ從該植物獲得種籽，其中種籽包括載脂蛋白；和 (e)從植物種籽成份分離載脂蛋白，得實質上純載脂蛋 34 200526778 白為從種籽成份分離載脂蛋白，植物種籽可用任何粉碎法研磨，把種籽細胞膜和細胞壁實質上裂解。乾、濕研磨條件均可用（美國專利3,971,856號；Lawhon等人，1977, J.

Oil Chem. Soc·，63 ·· 533-534)。在此方面之適當研磨設備，包含膠磨機、盤磨機、IKA磨機、工業規模勻化器等。選用研磨設備視種籽類型和產量要求而定。固體種籽污物，諸如籽殼、纖維質材料、不溶醣、蛋白質和其他非水溶性污物，均可使用例如基於尺寸排除法’諸如過濾，或基於重力法，諸如離心，從種籽部份除去。在較佳具體例中，避免使用油萃取中常用之有機溶劑，諸如己烷，因為此等溶劑會損壞載脂蛋白多肽。正如本發明較佳具體例中所述，載脂蛋白製造方式是，容許載脂蛋白多肽與種籽油體關聯，因此，使用例如美國專利6，146,645號所述方法，在種籽粉碎後，製備包括 =白的種籽油體。m此本發明亦包含實質上純油體 =法包，如=濾技:及= 例如離子交換層析、尺寸排除騎、親和性層 (fplJ ) ； ΐ ( HPLC > ^ 實質上純載脂蛋白之較佳方法可用2由純化載脂蛋白製備，如此配方堪用葡編、二=a ί而言，純化載赌蛋白可與製藥上實皙卜站鄱牲疋攸轉基因植物種籽得天然型 2用载劑或稀釋劑混合，其量:施: 對雙治療患者無不㈣作用阳==療上有用效果’而脂蛋白重餘簡猶、分蝴他用= 200526778 f稀釋動，財效濃射以改善絲白配^宜配製成供單劑量投服。人體载蛋二樂上載脂蛋使用其他輸送模式，凡精於此道之巧白類似物或以體内或體外測試#料之外插法，即 °=規約，或定。又須知對任何特定主體方的人員之_靖，純靖特_量、3紅督投服配巧樂溶液浮液可包含例如無g 糖、、麟酸二約，或羧甲基纖維素。、乳垣水溶液、右旋糖水溶液、甘油、二_、乙=包:水、成溶液或懸浮液。㈣組成物可視需質’諸如潤乳化劑;㈣ parabens，抗虱化劑，諸如抗壞血酸和亞硫酸氫鈉土諸如乙二胺四乙酸(EDTA); pH緩衝劑，諸3酸J:二酸塩或磷酸塩緩衝劑；及其組合。載脂蛋白製劑之最後配方，一般視載脂定。，本發明製成的載脂蛋白可以任何所需方^== 之，腸外、口服和經鼻的輸迗型式，均可視為最模式。腸外製劑可容納於安瓶、用完即棄的注射哭、或多劑量的小瓶、由玻璃、塑膠或其他適當材料g成均^里實施例以下實施例是供說明之用，而非做為限制。實施例1 鈸脂蛋白Α·Ι殖糸之構诰

ApolO

ApolO (SEQ ID NO ·· 144)係設計來以種籽特異方式表現之殖系，其構造如第3(A)、3⑼和3(C)圖所示。參見^ 2 圖，ApolO殖系包含驅使融合蛋白（SEQ ID NO : 145)在成 36 200526778 · 熟Apo AI和GFP間表現之種籽特異啟動子和終止子（蛋白驗）。為構成此殖系，前向引物1186 (SEQ ID NO : 146) (5’_^^X£^CCtTGGCTAGTAAAGG-3’），從 GFP (由載體 pVS-GFP衍生的模板）開始，除去Ncol部位。在終止密碼子之後，逆向引物 1187 (SEQ ID NO : 147) (5，-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAnTTC-3’）添加PstI，Xbal和Hindlll部位。PCR片段結合入EcoRI 選殖載體Topo (Invitrogen)產生質粒G1 (第3(A)圖）。前向引物 1190 ( SEQ ID NO : 148 ) ( 5，-CCATGGgg CGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3’）把 Apo AI 的成熟序列放大，在基因開始加Ncol部位。逆向引物1189 (SEQ ID _ NO : 149 ) ( 5，_〇Q^ECCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG_ 3’）除去基因的終止密碼子，加BamHI部位，協助產生與 GFP (質粒G1)框内轉譯融合。此等引物的模板是pKS+為基礎之載體（Strategene)，含有人體Apo AI基因的整個寫碼序列。PCR片段結合於Topo選殖載體（Invitrogen)的EcoRI 部位，產生質粒M2。含有Apo AI成熟序列的質粒M2，以限制酵素Ncol和BamHI切斷。質粒G’l含GFP寫碼序列，以BamHI和Xbal切斷（見第3(B)圖）。M2和G，1的片段一同結合於質粒SBS2090的Ncol和Xbal部位（見第3(B) _ 圖），產生質粒2M4，質粒2M4以Ncol和Hindlll切斷，除去Apo ΑΙ-GFP融合序列盒，隨即使用片段選殖於雙載體 PSBS4006的Ncol/Hindlll部位（見第3(C)圖）。須知此質粒含有來自菜豆的々一蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom等人， 1983, Proc. Natl· Acad· Sc· USA 80 : 1897_1901)，以及 pat 基因’賦予宿主植物有phosphinothricine抵抗性（Wohlleben等人，1988, Gene 70 : 25-37)，以來自 Petroselinum crispum 的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck等人，1993, Plant. Mol.

Bio·，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。 37 200526778

Apoll

Apoll (SEQ ID NO ·· 150)係設計來以種籽特異方式表現之瘦糸’其構造如第3(A)、3(B)和3(C)圖所示。參見第2 圖，Apoll殖系包含驅使融合蛋白（SEq仍no : 151)在 Apo AI原和GFP間表現之種籽特異啟動子和終止子（蛋白鹼）。為構成此殖系，前向引物1186 (SEQ ID NO : 146) (5’-S^EffiCCtTGGCTAGTAAAGG-3，），從 GFP (由載體 pVS-GFP衍生的模板）開始，除去Nc〇I部位。在終止密碼子之後，逆向引物 1187 ( SEQ Π3 NO : 147 ) ( 5，-AAGCTTTC.TAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3’）添加PstI，Xbal和Hindlll部位。PCR片段結合入EcoRI 選殖載體Topo (Invitrogen)產生質粒G1 (第3(A)圖）。前向

引物 1190 ( SEQ ID NO : 148 ) ( 5，_£^^ggCGGCA TTTCTGGCAGCAAGATG-3’）把 Apo AI 原的序列放大，在基因開始加Ncol部位。逆向引物1189 (SEQ ID NO ·· 149) (5?-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3，)除去基因的終止密碼子，加BamHI部位，協助產生與gfp (質粒 G1 )轉譯融合。此等引物的模板是pKS+為基礎之載體 (Strategene)，含有人體Apo AI基因的整個寫碼序列。PCR 片段結合於Topo選殖載體（lnvitr〇gen)的EcoRI部位，產生質粒P2。含有Apo AI原序列的質粒P2，以限制酵素Nc〇I 和BamHI切斷。質粒G’l含GFP寫碼序列，以BamHI和 Xbal切斷（見第3(B)圖）。P2和G，1的片段一同結合於質粒 SBS2090的Ncol和Xbal部位（見第3(B)圖），產生質粒 2P5，質粒 2P5 以 Ncol 和 Hindlll 切斷，除去 Apo AI 原-GFP 融合序列盒，随即使用片段選殖於雙載體PSBS4006的Ncol /Hindlll部位（見第3(C)圖）。須知此質粒含有來自菜豆的蛋白驗啟動子/終止子（Slightom等人，1983, Proc. Natl. Acad. Sc· USA 80 : 1897-1901)，以及 pat 基因，賦予宿主植 38 200526778 物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，以來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/ 終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant Mol· Bio.，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。

Ap〇12

Apol2 (SEQ ID NO ·· 153)係設計來以種籽特異方式表現之殖系，其構造如第3(A)、3(B)和3(C)圖所示。參見第2 圖，Apol2殖系包含驅使融合蛋白（SEQ ID NO : 154)在油質蛋白（GJ· van Rooijen 等人，Plant Mol· Biol· 18 (6)，1177-1179 (1992))成熟Apo AI和GFP間表現之種籽特異啟動子和終止子（蛋白鹼）。為構成此殖系，前向引物1186 (SEQ ® ID NO ： 146) ( 5，_GGATCCCCtTGGCTAGTAAArTG_V )，從 GFP (由載體PVS_GFP衍生的模板）開始，除去Ncol部位。在終止密碼子之後，逆向引物1187 (SEQ ID NO : 147) (5，-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTrTTATAr.TTr--3’）添加PstI，Xbal和Hindlll部位。PCR片段結合入ecori 選殖載體Topo (Invitrogen)產生質粒G1 (第3(A)圖）。前向

引物 1190 ( SEQ ID NO : 148 ) ( 5，-ffi^〇ggCGGCA TTTCTGGCAGCAAGATG-3’）把 Apo AI 的序列放大，在基因開始加Ncol部位。逆向引物1189 (SEQ ID NO : 149) φ (5’-QQ^QcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3,）除去基因的終止密碼子，加BamHI部位，協助產生與GFP (質粒 G1)框内轉譯融合。此等引物的模板是pKS+為基礎之載體 (Strategene)，含有人體Apo AI基因的整個寫碼序列。PCR 片段結合於Topo選殖載體（Invitrogen)的EcoRI部位，產生質粒M2。含有Apo AI成熟序列的質粒M2，以限制酵素Ncol和BamHI切斷。質粒G’l含0??寫碼序列，以 BamHI和Xbal切斷（見第3(B)圖）。M2和G，1的片段一同結合於質粒SBS2090的Ncol和Xbal部位（見第3(B)圖）， 39 200526778 產生質粒2M4，質粒2M4以Ncol和Hindlll切斷，除去Apo AI-GFP融合序列盒，隨即使用片段選殖於雙載體pSBS4〇〇6 的Ncol/Hindlll部位（見第3(C)圖）。須知此質粒含有來自采旦的/9 一蛋白驗啟動子/終止子（Slightom等人，1983 Proc· Natl· Acad· Sc· USA 80 : 1897-1901)，控制阿拉伯芬油質蛋白基因的表現（G.J_ vanRooijen 等人，1992, Plant Mol. Biol. 18 (6)，1177-1179)，以供與Apo AI/GFP融合進行融合。質粒亦含有pat基因’賦予宿主植物有ph〇sphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988，Gene 70 : 25_37)，以來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol. Bio·，21 ·· 673-684)，供轉型為土壤桿菌。 ’、

Apol3

Apol3 (SEQ ID NO : 155)係設計來以種籽特異方式表現之殖系，其構造如第3(A)、3(B)和3(C)圖所示。參見第2 圖，Apol3殖系包含驅使融合蛋白（SEQ ID NO : 156)在油質蛋白Apo AI原和GFP間表現之種籽特異啟動子和終止子 (蛋白鹼）。為構成此殖系，前向引物1186 (SEQ Π3 NO : 146) ( 55-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-35)，從 GFP (由載體pVS-GFP衍生的模板）開始，除去Ncol部位。在終止密碼子之後，逆向引物1187 (SEQ ID NO : 147) (5，-AAGCJTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAnTTC-3’）添加PstI，Xbal和Hindlll部位。PCR片段結合入EcoRI 選殖載體Topo (Invitrogen)產生質粒G1 (第3(A)圖）。前向引物 1191 (SEQ ID NO : 152) (5MXATGGATGAA CCCCCCCAGAGCCCCTG-3，）把 Apo AI 原的序列放大，在基因開始加Ncol部位。逆向引物1189 (SEQ ID NO : 149) (5^GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-35)除去基因終止密碼子，加BamHI部位，協助產生與GFP (質粒 200526778 G1 )轉譯融合。此等引物的模板是PKS+為基礎之載體 (Strategene)，含有人體Apo AI基因的整個寫碼序列。pcr 片段各分別結合於Topo選殖載體（Invitrogen)的EcoRI部位’產生質粒P2。含有Apo AI原序列的質粒P2，以限制酵素Ncol和BamHI切斷。質粒G’l含GFP寫碼序列，以 BamHI和Xbal切斷（見第3(B)圖）。P2和G’l的片段一同結合於質粒SBS2090的Ncol和Xbal部位（見第3(B)圖），產生質粒2P5，質粒2P5以Ncol和Hindlll切斷，除去Apo AI 原-GFP融合序列盒，隨即使用片段選殖於雙載體 PSBS4006的Ncol/ Hindlll部位（見第3(C)圖）。須知此質粒含有來自菜豆的石一蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom等人, 1983, Proc· Natl· Acad· Sc· USA 80 ·· 1897_1901)，控制阿拉伯务油質蛋白基因的表現（GJ. vanRooijen等人，1992，Plant Mol. Biol· 18 (6)，1177-1179) ’ 供與 Apo AI / GFP 融合進行融合。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物有phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988，Gene 70 ·· 25-37)，以來自 PetiOselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant Mol. Bio” 21 : 673-684)，供棘型為土壤桿菌。

Apol5

Apol5 (SEQ ID NO : 157)係設計來以種籽特異方式表現之殖系，其構造如第3(A)、3(B)和3(D)圖所示。參見第2 圖，Apol5殖系包含驅使融合蛋白（SEq ID N〇 ·· 158)在成熟Apo AI和GFP間表現之種籽特異啟動子和終止子（蛋白鹼）。標定融合蛋白，使用菸草病毒相關序列（pRS)訊號肽’經由分泌通路表現（sijm〇ns等人，199〇 Bi〇/techn〇1〇gy， 8 · 217-221)。為構成此殖系，前向引物1186 (SEq IDN〇 ·· 146) (5 -GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3')，從 GFP (由載體pVS-GFP衍生的模板）開始，除去Nc〇I部位。在終止 41 200526778 密碼子之後，逆向引物1187 ( SEQ ID NO : 147 ) ( 5，- aagctttctagactgcagtcatgacttatttgtatagttc^ 3’）添加PstI，Xbal和Hindlll部位。PCR片段結合入EcoRI 選殖載體Topo (Invitrogen)產生質粒G1 (第3(A)圖）。前向引物 1190 (SEQ ID NO : 148) (5’-CCATGGggCGGCATTT CTGGCAGCAAGATG-3’）把Apo AI的成熟序列放大，在基因開始加Ncol部位。逆向引物1189 (SEQ ID NO : 149) (5^GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG^’ )除去基因之終止密碼子，加BamHI部位，協助產生與GFP (質粒 G1)框内轉譯融合。此等引物的模板是pKS+為基礎之載體 (Strategene)，含有人體Apo AI基因的整個寫碼序列。PCR 片段結合於Topo選殖載體（Invitrogen)的EcoRI部位，產生質粒M2。含有Apo AI成熟序列的質粒M2，以限制酵素Ncol和BamHI切斷。質粒G’l含GFP寫碼序列，以 BamHI和Xbal切斷（見第3⑼圖）。M2和G，1的片段一同結合於質粒SBS2090的Ncol和Xbal部位（見第3(B)圖），產生質粒2M4，質粒2M4以Ncol和Hindlll切斷，除去Apo ΑΙ-GFP融合序列盒，隨即使用片段選殖於雙載體pSBS4〇n 的Ncol/Hindlll部位（見第3(D)圖）。須知此質粒含有來自菜豆的/3 —蛋白驗啟動子/終止子（Slightom等人，1983,

Proc· Natl. Acad· Sc· USA 80 : 1897-1901 )，融合於 prs 訊號肽。質粒又含有pat基因，賦予宿主植物有ph〇Sphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988，Gene 70 : 25_37)，以來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol· Bio” 21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。 ^

Apo 16

Apol6 (SEQ Π) NO : 159)係設計來以種籽特異方式表現之殖系，其構造如第3(A)、3⑻和3(D)圖所示。參見第2 42 200526778 圖，Apol6殖系包含驅使融合蛋白（SEQ ID NO : 160)在 Apo AI原和GFP間表現之種籽特異啟動子和終止子（蛋白驗）。將融合蛋白標定，使用终草病毒相關序列（PRS)訊號肽，透過分泌通路表現（Sijmons等人，1990, Bio/technology， 8 : 217-221)。為構成此殖系，前向引物1186 (SEQ ID NO : 146) (55-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3,)，從 GFP (由載體pVS_GFP衍生的模板）開始，除去Ncol部位。在終止密碼子之後，逆向引物1187 (SEQ ID NO : 147) (55-AAGCJTTCTAGACTGCAGTCATGArTTATTTr.TATAGTTC-3’）添加PstI，Xbal和Hindlll部位。PCR片段結合入EcoRI 選殖載體Topo (Invitrogen)產生質粒G1 (第3(A)圖）。前向引物 1191 ( SEQ ID NO : 152 ) ( 5，-CCATGGATGAA CCCCCCCAGAGCCCCTG-3’）把 Apo AI 原的序列放大，在基因開始加Ncol部位。逆向引物1189 (SEQ ID NO ·· 149) (5’-Q^QQcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3,）除去基因的終止密碼子，加BamHI部位，協助產生與GFP (質粒 G1 )轉譯融合。此等引物的模板是pKS+為基礎之載體 (Strategene)，含有人體Apo AI基因的整個寫碼序列。PCR 片段各分別結合於Topo選殖載體（Invitrogen)的EcoRI部位’產生質粒P2。含有Apo AI原序列的質粒P2，以限制酵素Ncol和BamHI切斷。質粒G’l含GFP寫碼序列，以 BamHI和Xbal切斷（見第3(B)圖）。P2和G，1的片段一同結合於質粒SBS2090的Ncol和Xbal部位（見第3⑼圖），產生質粒2P5，質粒2P5以Ncol和Hindlll切斷，除去Apo AI原-GFP融合序列盒，隨即使用片段選殖於雙載體 PSBS4011的Ncol/ Hindlll部位（見第3(D)圖）。須知此質粒含有來自菜豆的冷一蛋白鹼啟動子/終止子（Slight〇m等人， 1983, Proc· Natl· Acad. Sc· USA ⑽：1897-1901 )，融合於 PRS訊號肽。質粒又含有pat基因，賦予宿主植物有 43 200526778 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，以來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol. Bio.，21 : 673- 684)，供轉型為土壤桿菌。 ’

Apol7

Apol7 (SEQ ID NO : 161)係設計來以組成方式表現之殖系’其構造如第4(A)圖所示。如第2圖，Apol7殖系包含驅使融合蛋白（SEQ ID NO : 162)在Apo AI和GFP間表現之組成型啟動子和終止子（泛蛋白）。為構成此殖系，質粒 2M4 (見第3(B)圖）以Ncol和PstI切斷，除去Apo AI-GFP 融合序列盒，將片段結合於質粒PKU03,的Ncol和PstI部位，產生質粒KU2M4。PKU03,質粒含油菜籽（B薦ica napus)油質蛋白基因，在Ncol和PstI切斷載體時除去，於香芹泛蛋白啟動子和泛蛋白終止子控制下，得Ap〇 M/GFp 融合構造物（Ρ· Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bio.，21 : 673-684 )。KU2M4質粒以Kpnl切斷，結合於雙載體 SBS3000的ΚρηΙ部份（見第4圖）。須知此質粒含有pat基因，賦予宿主植物有phosphinothricine抵抗性（Wohlleben等人，1988, Gene 70 : 25-37)，以來自 Petroselinum crispum 的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck等人，1993, Plant. Mol. ^ι〇·，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Ap〇17殖系含有成熟Apo ΑΙ-GFP轉譯融合，並且標定於胞質溶液。

Ado18a

Apol8a (SEQ ID NO : 163)係設計來以組成方式表現之殖系，其構造如第4圖所示。如第2圖，Apol8a殖系包含驅使融合蛋白（SEQ ID NO : 164)在Apo AI原和GFP間表現之組成巧啟動子和終止子（泛蛋白）。為構成此殖系，質粒 (見第3(B)圖）以Ncol和Pstl切斷，除去Apo AI原· GFP融合序列盒，將片段結合於質粒pKU〇3%价〇1和削 44 200526778 部位’產生質粒KU2P5。pKU03,質粒含油菜籽（Brassica napus)油質蛋白基因，在Nc〇i和PstI切斷載體時除去，於香芹泛蛋白啟動子和泛蛋白終止子控制下，得Ap〇 A!原/ GFP 融合構造物（p Kawalleck 等人，1993, plant μ〇1· Bio·， 21 : 673-684)。KU2P5質粒以ΚρηΙ切斷，結合於雙載體 SBS3000的ΚρηΙ部份（見第4圖）。須知此質粒含有pat基因’賦予宿主植物有phosphinothricine抵抗性（Wohlleben等人，1988, Gene 70 ·· 25-37)，以來自 Petroselinum crispum 的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck等人，1993, Plant. Mol. Bio, 21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Apol8a殖系含有成熟ΑροΑΙ原-GFP轉譯融合，並且標定於胞質溶液。

Ado18b

Apol8b (SEQIDNO : 163)係設計來以組成方式表現之殖系，其構造如第4⑻圖所示。如第2圖，Apol8b殖系包含驅動融合蛋白（SEQ ID NO : 164)在Apo AI原和GFP間表現之組成型啟動子和終止子（泛蛋白）。須知Ap〇i8a和 Apol8b二殖系均有驅動融合蛋白（SEq ID N〇 : ι64) 在Apo AI和GFP間表現之組成型啟動子（泛蛋白）。二殖系間之差異在於，Apol8a插入雙載體pSBS3000之ΚρηΙ 部份，含有pat基因，賦予宿主植物有phosphin〇thricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988，Gene 70 : 25_37)，由來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol· Bio.，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。相對地，Apol8b插入雙載體pSBS5001 (含有 pmi 基因）之 ΚρηΙ 部份（Miles 等人，1984, Gene 21 : 41- 48) ’為鱗甘露糖異構轉編碼’容許正面選擇含甘露糖之選擇培養基。pmi基因在來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子 / 終止子控制下（Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bio., 21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。為構成此殖系，Ap〇18a 200526778 雙載體以ΚρηΙ切斷，除去Apo AI原-GFP融合序列盒，將片段結合於質粒SBS5001之ΚρηΙ部位，供在土壤桿菌内表現。Apol8b殖系含Αρο ΑΙ原-GFP轉譯融合，並標定於胞質溶液。 Αρ〇19

Apol9 (SEQ ID NO : 165)係設計來以組成方式表現之瘦系’其構造如第5(A)和5(B)圖所示。參見第2圖，Apol9 殖系包含驅動融合蛋白（SEQ ID NO : 166)在Apo AI和 GFP間表現之組成型啟動子和終止子（泛蛋白）。融合蛋白使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，透過分泌途徑，為表現而標定（Sijmons 等人，1990，Bio/technology, 8 : 217-221)。為構成此殖系，使用Apol5為模板。前向引物1177 (SEQ ID NO : 167) (5，_GCAGCATTCATGAACTTCCTTAA GTCTTT CC-3’），把在開始密碼子含有BspHI部位的植物前序列（PRS)開始放大。逆向引物1178 (SEQ ID NO : 168) (5 ’，GGTGGTGGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3，）除去基因的終止密碼子，加BamHI部位，以助產生與GFP 之框内轉譯融合。二引物末端留下額外鹼基，以方便限制酵素消化。G1質粒（見第3(A)圖）以BamHI和PstI消化，供結合於pubiP+iS3,，後者含有來自Petrosdinum crispum 的泛蛋白啟動子和終止子（Kawalleck等人，1993, Plant. Mol. Bio., 21 ·· 673-684)。PRS-Apo AI PCR 片段以 BspHI 和 BamHI 消化，並以G1片段結合於質粒pUbiP+iS3,内，產生質粒19-6。質粒19-6以EcoRI消化，除去表現序列盒，序列盒再結合於質粒pKU03’内（第4(A)圖），於EcoRI部位間（除去現有序列盒），產生質粒KU19-6。KU19-6以ΚρηΙ消化，將片段結合於質粒SBS3000之ΚρηΙ部份（第5(B)圖）。須知此貝粒含pat基因’賦予宿主植物有phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988，Gene 70 : 25-37 )，以 46 200526778 來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol· Bio.，21 : 673-684)，供轉型為土壌桿菌。Apol9殖系含有成熟ApoAI-GFP轉譯融合，分別標定於分泌通路。

Apo20 / Ap〇20 (SEQ ID NO : 169)係設計來以組成方式表現之殖系’其構造如第5(A)和5(B)圖所示。參見第2圖，Apo20 殖系包含驅動融合蛋白（SEQ ID NO : 170)在Apo AI原和 GFP間表現之組成型啟動子和終止子（泛蛋白）。融合蛋白使用於草病毒相關序列（PRS)訊號肽，透過分泌系統，為表現而標定（Sijmons 等人，1990，Bio/technology，8 : Snail) 。為構成此殖系，使用 Αροΐό 為模板。前向引物 1177 (SEQ ID NO ： 167) (55-GCAGCATTCATGAACTTCCTTAA GTCTTT CC-3’），把在開始密碼子含有BSpHi部位的植物前序列（PRS)開始放大。逆向引物1178 (SEQ ID NO ·· 168) (5 ’-GGTGGTGGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG- 3 )除去基因的終止密碼子，加BamHI部位，以助產生與 GFP之框内轉譯融合。二引物末端留下額外鹼基，以方便限制酵素消化。G1質粒（見第3(A)圖）以和pstl消化供、纟。合於PubiP+iS3’，後者含有來自petroseiinum crispum的泛蛋白啟動子和終止子（Kawaneck等人，1993， Plant· Mol· Bio·，21 : 673-684)。PRS-Apo AI 原 PCR 片段以

BspHI和BamHI消化，並以G1片段結合於質粒pubip+iS3, 内，產生質粒20-11。質粒20-11以EcoRI消化，除去表現序列盒，序列盒再結合於質粒PKU03,内（第4(A)圖），於 EcoRi部位間（除去現有序列盒），產生質粒。 KU20-1^以ΚρηΙ消化，將片段結合於質粒SBS3〇〇〇之KpnI 部伤（第5(B)圖）。須知此質粒含ρ班基因，賦予宿主植物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohileben 等人，1988, Gene 7〇 ·· 47 200526778 25-37)，以來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bio.，21 : 673- 684)，供轉型為土壤桿菌。Apo20殖系含有成熟Ap〇 AI原_ GFP轉譯融合，分別標定於分泌通路。

Apo21

Apo21 (SEQ ID NO ·· 171)係種軒優勢的殖系，其構造如第 6圖所示。參見第2圖’ Apo21殖系包含驅動Ap〇 AI (SEQ ID NO : 172)表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白驗）。為構造此殖系，前向引物 1203 (SEQIDNO:173)(5，- GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3，），於成熟Apo AI開始，加Ncol部位。逆向引物1206 (SEQ ID φ

NO ·· 174 ) ( 5’-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGC TTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG-3，），在終止密碼子後加 Hindlll部位，加沉默突變，以除去第二灿〇1部位。二引物在5’末端含額外驗基，以方便限制酵素消化。pCR片段以 Ncol和Hindlll消化，並結合於質粒SBS2090，產生質粒5-3 (第6圖）。質粒5-3以Ncol和Hindlll消化，而將Apo AI 片段結合於SBS4006的Ncol/Hindlll部位（第3(C)圖）。 SBS4006含有來自菜豆的石一蛋白鹼啟動子/終止子 (Slightom 等人，1983, Proc_ Natl. Acad· Sc. USA 80 : · 1897-1901) ’ 和 pat 基因’賦予宿主植物有 ph〇Sphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol· Bio·，21 ·· 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Apo21係具有種籽特異性殖系，把Ap〇八1標定於胞質溶液。

Ap〇22

Apo22 (SEQ ID NO : 175)係種籽優勢的殖系，其構造如第7圖所示。參見第2圖，Apo22殖系包含驅動Apo AI原 48 200526778 (SEQ ID NO : 176)表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。為構造此殖系，前向引物1201 (SEQ ID NO : 177) (5’-GCAGCACCATGGggCGGCAITTC丁GGCAGCAAGATG-3’），於成熟Apo AI原開始，加Ncol部位。逆向引物1206 (SEQ ID NO ·· 174) (5，-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTG TTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG-3’），在終止密碼子後加Hindlll部位，加沉默突變，以除去第二xh〇l部位。二引物在5’末端含額外鹼基，以方便限制酵素消化。 PCR片段以Ncol和Hindlll消化，並結合於質粒SBS2090 (第3(B)圖），產生質粒4-2 (第7圖）。質粒4_2以Ncol和 Hindlll消化，而將Apo AI原片段結合於SBS4006的Ncol / φ Hindlll部位（第3(C)圖）。SBS4006含有來自菜豆的β 一蛋白鹼啟動子 / 終止子（Slightom 等人，1983, Proc. Natl. Acad.

Sc. USA 80 : 1897-1901 )，和pat基因，賦予宿主植物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol. Bio.，21 : 673- 684)，供轉型為土壤桿菌。Apo22係具有種籽特異性殖系，把Apo AI標定於胞質溶液。

Apo23

Apo23 (SEQ KD NO : 178)係種籽優勢的殖系，其構造 ® 如第6圖所示。參見第2圖，Apo23殖系包含驅動油質蛋白 Apo AI (SEQ ID NO : 179)表現之種籽優勢啟動子和終止子 (蛋白鹼）。為構造此殖系，前向引物1203 (SEQ Π3 NO :

173 ) ( 5，-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCC TG-3’），於成熟Apo AI開始，加Ncol部位。逆向引物1206 (SEQ ID NO : 174 ) ( 5，-GTGGTGAAGCTTTCACTGGG TGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG-35 )，在終止密碼子後加Hindlll部位，加沉默突變，以除去第二xh〇i 49 200526778 部位。二引物在5’末端含額外驗基，以方便限制酵素消化。 PCR片段以Ncol和Hindlll消化，並結合於質粒sbs2〇9〇，產生質粒5-3 (第6圖）。質粒5-3以Ncol和Hindlll消化，而將Apo AI片段結合於SBS4006的Ncol / Hindlll部位（第 3(C)圖）。SBS4008含有來自菜豆的召—蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom 等人，1983, Proc· Natl. Acad· Sc· USA 80 : 1897- 1901)，以控制阿拉伯芥油質蛋白基因之表現（GJ van

Rooijen 等人，1992, Plant Mol· Biol· 18 (6)，1177-1179)，並含有pat基因，賦予宿主植物有ph〇sphin〇thricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988，Gene 70 : 25_37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動鲁 (Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol. Bio·，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Apo23係具有種軒特異性殖系，把油質蛋白 Apo AI標定於油體。

Apo24

Apo24 (SEQ Π) NO : 180)係種籽優勢的殖系，其構造如第7圖所示。參見第2圖，Apo24殖系包含驅動油質蛋白 Apo AI (SEQ Π) NO : 181)表現之種籽優勢啟動子和終止子 (蛋白鹼）。為構造此殖系，前向引物1201 (SEQ ID NO : 177 ) ( 5，_GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAA · GATG-3’），於成熟Apo AI原開始，加Ncol部位。逆向引物攀 1206 ( SEQ ID NO ： 174 ) ( 59-GTGGTGAAGCTTTCACT GGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG-3。，在終止密碼子後加Hindlll部位，加沉默突變，以除去第二 Xhol部位。二引物在5’末端含額外鹼基，以方便限制酵素消化。PCR片段以Ncol和Hindlll消化，並結合於質粒 SBS2090，產生質粒4-2 (第7圖）。質粒4-2以Ncol和 Hindm消化，而將Apo AI原片段結合於SBS4008的Ncol /

Hindm部位（第3(C)圖）。SBS4008含有來自菜豆的石一蛋 50 200526778 白鹼啟動子 / 終止子（Slightom 等人，1983, Proc. Natl. Acad.

Sc· USA 80 · 1897-1901 ) ’控制阿拉伯芥油質蛋白基因之表現 (GJ· van Rooijen 等人，1992，Plant Mol. Biol. 18 (6)，1177-1179)，並含有pat基因，賦予宿主植物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)’利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bio·，21 : 673- 684) ’供轉型為土壤桿菌。Apo24係具有種籽特異性殖系，把油質蛋白ΑροΑΙ原標定於油體。 Αρο25

Apo25 (SEQ ED NO : 182)係種籽優勢的殖系，其構造鲁如第6圖所示。參見第2圖，Apo25殖系包含驅動油質蛋白 /klipSdnet/Apo AI (SEQ Π) NO : 183)表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。此構造物具有klip8剪切序列（SEQ ID NO : 143)，以方便融合蛋白用凝乳酶剪切，為構造此殖系，前向引物 1203 (SEQ ID NO : 173) (5，-GCAGCACCAT GGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG_3’）’ 於成熟 Apo AI 開始，加 Ncol 部位。逆向引物 1206 (SEQ ID NO : 174) (5，- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTA CTCCTCcAGAGCG-3’）’在終止密碼子後加Hindlll部位，加沉默突變，以除去第二Xh〇I部位。二引物在5,末端含額外響鹼基，以方便限制酵素消化。PCR片段以Ncol和Hindlll消化，並結合於質粒SBS2090 (第3(B)圖），產生質粒5-3 (第6圖）。質粒5_3以Ncol和Hindlll消化，而將Apo AI 片段結合於SBS4010的Ncol/Hindlll部位（第7圖）。 SBS4010含有來自菜豆的万一蛋白鹼啟動子/終止子 (Slightom 等人，1983, Proc· Natl· Acad· Sc. USA 80 : 1897- 1901)，控制阿拉伯芥油質蛋白基因的表現（GJ van R〇〇ijen 等人，1992, Plant Mol· Biol. 18 (6)，1177_1179)和 klip8 剪切部 51 200526778 份，質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物有phosphin〇thricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988，Gene 70 ·· 25·37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol· Bi〇·，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Apo25係具有種籽特異性殖系，把油質蛋白 /kliP8/met/Ap〇 AI標定於油體，且使用klip8剪切序列純化。

Ap〇26

Apo26 (SEQ ID NO : 184)係種籽優勢的殖系，其構造如第7圖所示。參見第2圖，Αρ〇2ό殖系包含驅動油質蛋白 / klip84net/Ap〇 ΑΙ原（SEQ ID NO : 185 )表現之種籽優勢啟 ⑩ 動子和終止子（蛋白鹼）。此構造物具有kHp8剪切序列 (SEQ Π) NO : 143)，以方便融合蛋白用凝乳酶剪切，為構造此殖系，前向引物 1201 (SEQ ID NO : 177) (5，_GCAGC ACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3’），於 Apo AI原開始，加Ncol部位。逆向引物1206 (SEQ ID NO : 174 ) ( 5^GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTT ACTGTACTCCTCcAGAGCG_3’）’ 在終止密碼子後加 Hindlll 部位，加沉默突變，以除去第二Xh〇i部位。二引物在5,末端含額外鹼基，以方便限制酵素消化。PCR片段以Ncol和 Hindlll消化，並結合於質粒SBS2090 (第3⑼圖），產生質鲁粒4_2 (第7圖）。質粒4-2以Ncol和Hindlll消化，而將 met-Apo AI 原片段結合於 SBS4010 的 BspHI/Hindlll 部位 (第7圖）。SBS4010含有來自菜豆的泠一蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom 等人，1983, Proc· Natl. Acad. Sc. USA 80 ·· 1897_1901 )，控制阿拉伯芥油質蛋白基因之表現（GJ van

Rooijen 等人，1992, Plant Mol· Biol· 18 (6)，1177-1179)，和 klip8剪切部位。質粒又含有pat基因，賦予宿主植物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 52 200526778 25_37)，利用來自？_5—11111(^啊111的泛蛋白啟動子八级止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol· Bio·，21 ·· 67l 684)，供轉型為土壤桿菌。Apo26係具有種籽特異性殖系，把油質蛋白/klip8/met/Apo AI原標定於油體，並使 klip8剪切序列純化。

Ap〇27

斤八!)〇27(8£(^10術：186)係種籽優勢殖系，其構造如第8(A)圖所示。參見第2圖，Apo27使用阿拉伯芥油質蛋白序列，為表現而標定於油體（GJ· vanR〇〇ijen等人，1992 Plant Mol· Biol. 18 (6)，1177-1179)，並具有 klip8 剪切序列（SEQ ID NO : 143)，以方便融合蛋白用凝乳酶剪切。為構造此殖系，前向引物1200 ( SEQ ID NO : 188 )

(55-GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA -3’），加Xhol部份和額外核苷酸，以便Apo AI原開始時，在框内選殖於klip8 (SEQ ID NO ·· 143)剪切序列。逆向引物 1206 ( SEQ ID NO ·· 174 ) ( 5，-GTGGTGAAGCTTT CACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG-

3’），在終止密碼子後加Hindlll部位，加沉默突變，以除去第二Xhol部位。此等引物用之模板為Apo33質粒，含原型 Apo AI，無内部Xhol部位和另外Met殘基。PCR片段以 Xhol切斷，並結合於PKS+的XhoI/EcoRV部位，產生質粒 6-3。質粒6_3以Xhol和Hindlll切斷，並結合於雙載體 SBS4010 的 Xhol / Hindlll 部位（第 7 圖）。須知 SBS4010 含有來自菜豆的召一蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom等人， 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80 : 1897-1901 )，控制阿拉伯芥油質蛋白基因（GJ. vanRooijen 等人，1992, Plant Mol· Biol· 18 (6)，1177-1179)和klip8剪切部位的表現。質粒亦含有pat 基因，賦予宿主植物有phosphinothricine抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，利用來自 Petroselinum crispum 53 200526778 的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck等人1993 Plant Mol· Bio'21: 673-684)，供轉型為土壌桿菌。Ap〇27係種籽特異性殖系，把Apo AI標定於油體，並以剪切序列kiip8純

Ap〇27M

Apo27M (SEQ ID NO : 189)係種籽優勢的殖系，其構，如第8(B)圖所示。參見第2圖，Ap〇27M殖系包含驅動油貝蛋白 / klipS4nel/Apo AI-M ( SEQ ID NO : 190)之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。此構造物具有klip8剪切序列 (SEQ ID NO : 143)，以方便融合蛋白用凝乳酶剪切。為構成此殖系，前向引物 12〇2 ( 5 ’_GCAGCACTCGAGcaagttc φ GATGAACCCCCCCAGAGCCC_3’）（SEQ ID NO : 191)於 mat-ApoAI開始，加Xhol部位和額外核苷酸，以便利框内選殖於klip8剪切序列。前向引物I。5 ( 5，_cGCCAGt GCTTGGCCGCGCGCCTTG-3，）（SEQ ID NO : 192)係平端引物，使鹼基對從C突變至T，把Arg殘基變成Cys殘基。逆向引物 1206 ( 5 ^GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTT GAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG-35 ) ( SEQ ID NO : 174)，於終止密碼子之後加Hindlll，並加沉默突變，以除去第二Xhol部份。二引物都在5,末端含額外鹼基，以方便限制酵素消化。此等引物用模板係質粒P-10，在其Xh〇I 9 部位已有突變。雙鏈模板已利用Dpnl消化除去。PCR片段用Xhol和Hindlll消化，結合於質粒pKS+ Xhol / Hindlll部位，產生質粒ApoM。ApoM以Xhol和Hindlll消化，把片段結合於質粒SBS4010的Xhol/Hindlll部位（第7圖）， SBS4010含有來自菜豆的冷一蛋白鹼啟動子/終止子 (Slightom 等人，1983，Proc· Natl. Acad· Sc· USA 80 : 1897-1901)，控制阿拉伯芥油質蛋白基因（G.J· van Rooijen等人， 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6)，1177-1179)，以及 klip8 剪切 54 200526778 部位之表現。質粒亦含有pat基因，軾予宿主植物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol. Bio.，21 : 673- 684)，供轉型為土壤桿菌。Ap〇27M係種籽特異性殖系，把油質蛋白/klip8/met/Apo AI-Μ標定於油體，使用kHp8剪切序列純化。

Ap〇28

Apo28 (SEQ ID NO : 193)係種籽優勢的殖系，其構造如第9圖所示。參見第2圖，Apo28殖系包含驅動油質蛋白 / klipg^net/Apo AI 原（SEQ ID NO : 194)之種籽優勢啟動子 _ 和終止子（蛋白鹼）。為構成此殖系，前向引物1200 ( 5，· GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-39 ) (SEQ ID NO : 188 )於Apo AI原開始，加Xh〇i部位和額外核苷酸，以便利框内選殖於klip8剪切序列。前向引物12〇5

(5’_CCAAGCCCGCGCTaGAGGACCTCCG_3,）（ SEQ ID NO · 195)係平端引物，加沉默突變，以除去第一池〇1部位。逆向引物 1206 ( 55-GTGGTGMGCTTTCACTGGGTGTT GAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG-39 ) ( SEQ ID NO · 174) ’於終止密碼子之後加Hindlll，並加沉默突變，以除去第二Xhol部份。二引物都在5,末端含額外鹼基，以方 _ 便限制酵素消化。此等引物用模板係pKS+為基礎之載體 (Stmtagene)，含有人體Apo aj基因用之整個寫碼序列。雙鏈模板已利用Dpnl消化除去。PCR片段用％〇1和Hindm 消化，結合於質粒pKS+ Xhol/Hindlll部位，產生質粒p_ 1〇。P-10以Xhol和Hindlll消化，把片段結合於質粒 SBS4010+的 Xh〇I / Hindlll 部位（第 7 圖），須知 SBS4_ 含有來自菜豆的冷一蛋白鹼啟動子/終止子（slight〇m等人， 1983, Proc· Natl· Acad· Sc· USA 80 ·· 1897-1901 )，控制阿拉伯 55 200526778 芥油質蛋白基因（G.J· vanRooijen 等人，1992, Plant Mol.

Biol. 18 (6X 1177-1179)，以及klip8剪切部位之表現。質粒亦含有pat基因’賦予宿主植物有phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988，Gene 70 : 25_37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bio·，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Apo28係Apo AI原殖系，標定於油體，且可在klip8序列剪切。

Apo29

Apo29 (SEQ ID NO ·· 196)係種籽優勢殖系，其構造如第6圖所示。參見第2圖，Apo29殖系包含驅動pRS-Apo AI (SEQ ID NO : 197)表現的種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。Apo29使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽.，為表現而標定於分泌通路（Sijmons 等人，1990, Bio/technology, 8 : 217-221)。為構造此殖系，前向引物1203 (SEQ Π) NO : 173 ) ( 5，-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCC TG-3 )於成熟Apo AI開始，加Ncol部位。逆向引物1206 (SEQ ID NO : 174) (5，-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTG TTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG-3’）於終止密碼子後加Hindlll部位，加沉默突變，以除去第二χ^οΐ部位。二引物在5’末端含有額外鹼基，以方便限制酵素消化。 PCR片段以Ncol和Hindlll消化，並結合於質粒SBS2090，產生質粒5_3 (第6圖）。質粒5-3以Ncol和Hindlll消化，而Apo AI片段結合於SBS4011的Ncol/Hindlll部位（第 3D圖>SBS4011含來自菜豆的召—蛋白驗啟動子/終止子 (Slightom 等人，1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80 : 1897-

1901)，控制阿拉伯芥油質蛋白基因（GJ van Rooijen 等人， 1992, Plant Mol· Biol· 18 ⑹，1177-1179)和 PRS 訊號肽 (Sijmons 等人，1990, Bio/technology，8 : 217-221)的表 56 200526778 現。貝粒亦含有pat基因’賦予宿主植物有phospjjinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol· Bio” 21 ·· 673_684)，供轉型為土壌桿菌。Apo29係種籽特異性殖系，把Ap〇 AI標定於分泌通路。

Ap〇3Q ^ Ap〇30 (SEQ ID NO : 198)係種籽優勢殖系，其構造如第7圖所示。參見第2圖，Apo30殖系包含驅動PRS-Apo AI 原（SEQ ID NO : 199)表現的種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。ΑροΑΙ原使用菸草病毒相關序列（pRS)訊號肽，為修表現而標定於分泌通路（Sijmons等人，lPPi^Bio/technology, 8 : 217-221)。為構造此殖系，前向引物12〇1 (SEQ Π) NO : 177 ) ( 5’_GCAGC ACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAA GATG-3’），於Apo AI原開始，加Ncol部位。逆向引物1206 (SEQ ID NO ： 174 ) ( 55-GTGGTGAAGCTTTCACTGGG TGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG-3,）於終止密碼子後加Hindlll部位，加沉默突變，以除去第二xh〇i部位。二引物在5’末端含額外鹼基，以方便RE消化。PCR片段以Ncol和Hindlll消化，並結合於質粒SBS2090，產生質粒4_2 (第7圖）。質粒4-2以Ncol和Hindlll消化，而Apo 攀 AI片段結合於SBS4011的Ncol / Hindlll部位（第3D圖）。 SBS4011含來自莱丑的办—蛋白驗啟動子/終止子 (Slightom 等人，1983, Proc. Natl· Acad. Sc. USA 80 ·· ΙδΡΤ- βΟΙ)，控制阿拉伯芥油質蛋白基因（GJ· van Rooijen 等人， 1992, Plant Mol· Biol. 18 (6)，1177_1179)和 PRS 訊號肽 (Sijmons 等人，1990, Bio/technology, 8 : 217-221)的表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物有phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988，Gene 70 : 25_37)，利用來 57 200526778 自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol· Bio” 21 : 673_684)，供轉型為土壤桿菌。Apo30係種籽特異性殖系，把Apo AI原標定於分泌通路。

Apo31

Apo31 (SEQ ED NO : 200)係種籽優勢殖系，其構造如第8(A)圖所示。參見第2圖，Apo31殖系表示驅動PRS/D9 scFV/Apo AI (SEQIDNO : 201)融合蛋白表現的種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼>D9 ScFV/Apo AI使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路 (Sijmons 等人，1990，Bio / technology，8 : 217-221)。為構鲁造此殖系，前向引物1200 ( SEQ ID NO : 188 )

(S^GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA -3’)於Apo AI原開始，加Xh〇I部位。逆向引物1206 (SEQ ID NO ： 174 ) ( 55-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGA GCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG_3,）於終止密碼子後，加Hindlll部位，並加沉默突變，以除去第二xh〇I部位。此等引物用之模板為Apo33質粒，含有Apo AI原型，無内部Xhol部位和另外Met殘基。PCR片段以Xhol切斷，結合於pKS+的XhoI/EcoRV部位，產生質粒6-3。質粒6_3 _ 以Xhol和Hindlll切斷，並結合於雙載體SBS4055的Xhol /

Hindlll部位（第9圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的/3 — 蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom等人，1983, Proc. Natl. Acad·

Sc. USA 80 : 1897-1901)，控制框内融合於 D9 scFV / Apo AI 插段的PRS訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37) ’利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子 / 終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bio.，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Apo31係種籽特異性殖系， 58 200526778 把Apo AI標定於分泌通路，以油質蛋白D9 scFV抗體純化。

Apo32

Ap〇32 (SEQ ID NO : 202)係種籽優勢殖系，其構造如第9圖所示。參見第2圖，Apo32殖系表示驅動D9 scFV/

Apo AI原（SEQ ID NO : 203)表現的種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。為構造此殖系，前向引物12〇〇 (SEQ ID NO : 188 ) (5’-GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGC AAGA_3’)於Apo AI原開始，加Xhol部位。前向引物1205 (SEQ ID NO ： 195 ) ( 55-CCAAGCCCGCGCTaGAGGACC TCCG_3’）係平端引物，加沉默突變，以除去第一 Xhol部

位。逆向引物 1206 (SEQ ID NO : 174) (5，-GTGGTGAA · GCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAG AGCG-3’）於終止密碼子後，加Hindm部位，並加沉默突變，以除去第二Xhol部位。二引物均在5,末端含額外驗基，以方便限制酵素消化。此等引物用之模板為pKS+為基礎之載體（Stratagene)，含有人體Apo AI基因用整個寫碼序列。雙鏈模板利用Dpnl消化除去。PCR片段以Xh〇I和HindIII消化’結合於質粒pKS+ XhoI/EcoRV部位，產生質粒ρ_ι〇。質粒P-10以Xhol和HindIII消化，並將片段結合於質粒 SBS4055 的 Xhol / HindIII 部位（第 9 圖）。須知 SBS4055 含 _ 有來自菜豆的/5—蛋白鹼啟動子/終止子（S][ight〇m等人， 1983, Proc· Natl· Acad Sc· USA 80 : 1897-1901)，控制框内融合於D9 scFV抗體的PRS訊號序列表現。質粒亦含有胂基因，賦予宿主植物有phosphinothricine抵抗性（Wohlleben等人，1988, Gene 70 : 25-37)，利用來自 Petroselinum crispum 的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawaiieck等人，1993，Plant.

Mol· Bio·，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Ap〇32 係把

Apo AI原標定框内融合於油質蛋白抗體D9的分泌通路，以助純化。 59 200526778

Apo33

Apo33 (SEQ ID NO ·· 204)係種籽優勢殖系，其構造如第10圖所示。參見第2圖，Apo33殖系表示驅動PRS/D9 scFV/met/Apo AI (SEQ ID NO ·· 205)融合蛋白表現的種杆優勢啟動子和終止子（蛋白驗）。D9 ScFV/met/ Apo AI 使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons 等人，1990, Bio/technology，8 ·· 217-221)。

為構造此殖系，前向引物1203 (SEQ ID NO : 173) (5，-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3，)於成熟Apo AI原開始，加Ncol部位。逆向引物1206 ( SEQ ID NO : 174 ) ( 5，-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGC · TTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG_3，）於終止密碼子後，加Hindlll部位，並加沉默突變，以除去第二灿〇1部位。二引物均在5’末端含額外鹼基，以方便限制酵素消化。此等引物用之模板為P_10質粒，含有Apo AI原型，無内部xh〇l部位。PCR片段以Ncol和Hindlll消化，結合於pSBS2090的 Xhol / EcoRV部位，產生質粒20-2。質粒以Ncol和Hindlll 切斷，並結合於pSBS4010載體BspHI/Hindlll部位（第9 圖）。產生質粒4010+20-2。質粒以Xhol和Hindlll切斷，將片段結合於雙載體SBS4055的Xhol/Hindlll部位（第1〇麄圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的万一蛋白驗啟動子/終止子（Slightom 等人，1983，Proc· Natl· Acad· Sc· USA 80 : 1897-1901 )，控制框内融合於D9 scFV抗體的pRS訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37) ’利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bi〇.，21 : 67> 684)，供轉型為土壤桿菌。Ap〇33係種籽特異性殖系，把 Apo AI標定於分泌通路，並與油質蛋白抗體D9框内融合， 60 200526778 以助純化。

Ap〇34

Apo34 (SEQ ID NO : 206)係種籽優勢殖系，其構造如第10圖所示。參見第2圖，Apo34殖系表示驅動PRS/D9 scFV / met / Apo AI 原（SEQ ID NO : 207)融合蛋白表現的種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。D9 ScFV/met/Apo AI原使用菸草病毒相關序列（PRs)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons 等人，1990, Bio / technology，8 ·· 217-221)。為構造此殖系，前向引物1201 (SEq ID N〇 : 177) (5 ^GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3’）於Apo AI原開始，加Ncol部位。逆向引物1206 (SEQ ID NO ： 174) ( 5?-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGA GCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGCG-3’）於終止密碼子後，加Hindlll部位，並加沉默突變，以除去第二处〇1部位。二引物均在5’末端含額外鹼基，以方便限制酵素消化。此等引物用之模板為P-10質粒，含有Ap〇 A!原型，無内部 Xhol部位。PCR片段以Ncol和Hindlll消化，結合於 PSBS2090 的 Ncol/Hindlll 部位（第 3(B)圖），產生質粒 19- 2。質粒以Ncol和Hindlll切斷，將片段結合於SBS4010載體BspHI/Hindlll部位，產生質粒4〇1〇+19_2。質粒以Xhol 和Hindlll切斷，將片段結合於雙載體sBS4〇55'的％〇1/ Hindlll部位（第1〇圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的$ — 蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom等人，1983, Pr〇c _ Aead

Sc. USA 80 : 1897-1901)，控制框内融合於D9 SCFV抗體的 PRS訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)’利用來自petroseiinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動（KawaHeck 等人，1993, Plant Mol. Bi〇.，21 : 673、- 684)，供轉型為土壤桿菌。Ap〇34係種籽特異性殖系，把 61 200526778 met/Apo AI原標定於分泌通路，並與油質蛋白抗體D9框内融合，以助純化。

Apo35

Apo35 (SEQ ID NO : 208)係種籽優勢殖系，其構造如第8圖所示。參見第2圖，Apo35殖系包含驅動PRS/D9 scFV/Apo AI/KDEL (SEQ ID NO ·· 209)融合蛋白表現的種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。〇9 8〇?¥/八?0^1使用終草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons 等人，1990, Bicytechnology，8 ·· 217_221)，並使用 KDEL 保留訊號（Munro 和 Pelham, 1987, Cell 48 : 899-907) 把多肽保留於ER内。為構造此殖系，前向引物1200 (SEQ # ID NO ： 188 ) ( 55-GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCT GGCAGCAAGA-3’）於 Apo AI 原開始，加 KDEL 序列。逆向引物 1208 ( SEQ ID NO ·· 210 ) ( 5，-AAGCTTTCA tagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3，）於終止密碼子之前，加KDEL序列，於終止密碼子之後，加Hindlll部位。此等引物之模板為Apo33質粒，含Apo AI原型，無内部Xhol部位和另外Met殘基。PCR片段以Xhol切斷，結合於pKS+的XhoI/EcoRV部位，產生質粒8_5。質粒8-5用 Xhol和Hindlll切斷，結合於雙載體SBS4055的Xhol/ 龜 Hindlll部位（第9圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的/5 — 攀蛋白驗啟動子/終止子（Slightom等人，1983, Proc. Natl. Acad·

Sc. USA 80 : 1897-1901)，控制框内融合 D9 scFV 插段的 PRS 訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37 ) ’利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bio” 21 ·· 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Apo35為種籽特異性殖系，把 Apo AI標定於分泌通路，保留於ER内，以油質蛋白D9 62 200526778 scFV抗體純化。

Apo36

Apo36 (SEQ ID NO : 211)係種籽優勢殖系，其構造如第11圖所示。參見第2圖，Apo36殖系包含驅動PRS/D9 scFV / Apo AI 原 / KDEL ( SEQ ID NO : 212)融合蛋白表現的種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。D9 ScFV/Apo AI原使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons 等人，1990, Bio4echnology，8 : 217-221)，並使用 KDEL 保留訊號（Munro 和 Pelham，1987, Cell 48 : 899_ 907)把多肽保留於ER内。為構造此殖系，前向引物1200 (SEQ ID NO ： 188) (55-GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCA · TTTCTGGCAGCAAGA-3’）於 Apo AI 原開始，加 Xh〇I 部位和額外核苷酸，以方便框内選殖於klip8剪切序列。逆向引物 1208 ( SEQ ID NO : 210 ) ( 5 9-AAGCTTTCAtagctcatcttt CTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3’）於終止密碼子之前，加 KDEL序列’於終止密碼子之後，加Hindlll部位。此等引物之模板為P-10質粒（第9圖），含Apo AI原型，無内部 Xhol部位。PCR片段以Xhol和Hindlll切斷，結合於pKS+ 的Xhol / EcoRV部位，產生質粒7·12。質粒'12用Xhol和

Hindlll切斷，結合於雙載體SBS4055的部位 (第9圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的β一蛋白驗啟動 _ 子 / 終止子（Slightom 等人，1983, Proc. Natl· Acad. Sc. USA 80 : 1897-1901 )，控制框内融合D9 scFV插段的prs訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物有 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37) ’利用來自petroseiinum criSpUm的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bio” 21 : 673、- 684)，供轉型為土壤桿菌。Ap〇36為標定於分泌通路的却〇 AI原之種籽特異性表現殖系，與油質蛋白抗體D9框内融 63 200526778 合，因KDEL訊號肽而累積於内質網内。

Apo37

Apo37 (SEQ ID NO ·· 213)係種籽優勢殖系，其構造如第12圖所示。參見第2圖，Apo37殖系包含驅動PRS/D9 scFV/met/ApoAI/KDEL (SEQIDNO : 214)融合蛋白表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）°D9 ScFV/met/

Apo AI使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons 等人，1990, Biotechnology，8 ·· 217-221)，並使用 KDEL 保留訊號（Munro 和 Pelham, 1987, Cell 48 : 899907)，把多肽保留在ER内。為構造此殖系，前向引物 U03 (SEQ ID NO : 173) (5?-GCAGCACCATGGATGAA · CCCCCCCAGAGCCCCTG-3，）在成熟 Apo AI 開始，加 Ncol 部位。逆向引物 1208 (SEQ ID NO : 210) (5?-AAGCTTTCA tagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG_3，）於終止密碼子之前加KDEL序列，於終止密碼子之後加Hindlll部位。此等引物之模板為P-10質粒（第9圖），含Apo AI原型，無内部Xhol部位。把PCR片段結合於pKS+質粒之EcoRV部位，產生質粒10_2。質粒用Ncol和Hindlll切斷，把片段結合於SBS4010载體BspHI / Hindlll部位，產生質粒4010+10-2。質粒以Xhol和Hindlll切斷，把片段結合於雙載體 SBS4055 之 Xhol / Hindlll 部位（第 9 圖）。須知 SBS4055 含有來自菜豆的召一蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom等人， 1983, Proc· Natl· Acad· Sc· USA 80 : 1897-1901)，控制框内融合D9 scFV插段的PRS訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物phosphinothricine抵抗性（Wohlleben等人， 1988，Gene 70 : 25-37)，利用來自 Petroselinum crispum 的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck等人，1993, Plant. Mol.

Bio” 21 : 673-684)，供轉型成土壤桿菌。Apo37係把met/

Apo AI標定於分泌通路之殖系，與油質蛋白抗體D9框内融 64 200526778 合，因KDEL訊號肽而累積於内質網内。

Apo38

Apo38 (SEQ Π3 NO : 215)係種籽優勢殖系，其構造如第12圖所示。參見第2圖，Apo38殖系包含驅動PRS/D9 scFV / met / Apo AI 原 / KDEL ( SEQ ID NO : 216)融合蛋白表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。〇9 ScFV/ met/Apo AI原使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons等人，1990, Biotechnology，8 : 217-221)，並使用 KDEL 保留訊號（Munro 和 Pelham, 1987，

Cell 48 : 899-907)，把多肽保留在ER内。為構造此殖系，前向引物 1201 (SEQ ID NO : 177) (5?-GCAGCACCATGGgg · CGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3’）在成熟 Apo AI 開始，加 Ncol 部位。逆向引物 1208 (SEQ ID NO : 210) (5，-AAGCTTTCA tagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3,）於終止密碼子之前加KDEL序列，於終止密碼子之後加 Hindlll部位。此等引物之模板為p-ίο質粒（第9圖），含 Apo AI原型，無内部Xh〇l部位。把PCR片段結合於pKS+ 質粒之EcoRV部位，產生質粒9-2。質粒用Ncol和Hindlll 切斷，把片段結合於SBS4010載體BspHI/Hindlll部位，產生質粒4010+9-2。質粒以Xh〇I和Hindlll切斷，把片段結合 _ 於雙載體SBS4055之Xhol/Hindlll部位（第9圖）。須知攀 SBS4055含有來自菜豆的冷―蛋白鹼啟動子/終止子 (Slightom 等人，1983, Proc. Natl· Acad. Sc. USA 80 : ΙδΡΤ-βΟΙ) ，控制框内融合 D9 scFV 插段的 PRS 訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，利用來自 Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol· Bio·，21 : 673-684)，供轉型成土壤桿菌。Apo38係把met/Apo AI原標定於分泌通路 65 200526778 之殖系，與油質蛋白抗體D9框内融合，因KDEL訊號肽而累積於内質網内。

Apo39 AP〇39 (SEQ ID NO ·· 217)係種籽優勢殖系，其構造如第13圖所示。參見第2圖，Apo39殖系包含驅動PRS/D9 scFV/klip8/ApoAI (SEQIDNO : 218)融合蛋白表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。D9 ScFV/klip8/Apo AI 使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons 等人，1990, Biotechnology，8 : 217_221)，並使用 KDEL 保留訊號（Munro 和 Pelham，1987, Cell 48 : 899-907)，把多肽保留在ER内。此殖系有klip8剪切序列（SEQ φ ID NO : 143)，以方便融合蛋白用凝乳酶剪切。為構造此殖系，前向引物 1207 (SEQIDNO:219.)(5，- GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCCGCATTC-3?)在開始密碼子加Sail部位。逆向引物1206 (SEQ ID NO ·· 174) (55-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGT GTACTCCTCcAGAGCG-3’）於終止密碼子之後加Hindlll部份，並加沉默（放大klip8的開始）突變以除去第二Xh〇I部位。PCR反應用之模板為質粒Apo27 (第8(A)圖），PCR生成物以Sail和Hindlll切斷，結合於pKS+，產生質粒13-1。 · 質粒用Sail和Hindlll切斷，結合於質粒SBS4055之Xhol/

Hindlll部位（第9圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的/5 — 蛋白驗啟動子/終止子（Slightom等人，1983，？1*〇(；.灿11.八〇&(1·

Sc· USA80 : 1897_1901)，控制框内融合 D9scFV 插段的 PRS 訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 ·· 25-37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bio.，21 : 673-684)，供轉型成土壤桿菌。Apo39 係把 D9 SCFV / klip8 / Apo 66 200526778 AI標定於分泌通路之種籽優勢表現殖系，使用對油體上的油質蛋白具有親和性之D9 scFV抗體，達成Apo AI純化。使用把khp8部位剪切的凝乳酶，可將蛋白剪切。

Apo40 ^ AP〇4〇 (SEQ ID NO : 220)係種籽優勢殖系，其構造如第13圖所示。參見第2圖，Apo40殖系包含驅動PRS/D9 scFV/klip8/Apo AI 原（SEQ ID NO : 221)融合蛋白表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。D9 ScFV/klip8/

Apo AI原使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons 等人，1990, Bio4echnology，8 : 217-221) ’此殖系有klip8剪切序列（SEQ ID NO : 143)，以方便 _ 融合蛋白用凝乳酶剪切。為構造此殖系，前向引物1207 (SEQ ID NO ： 219) (5,-GCAGCAGTCGACtATGGCTGAG ATCACCCGCATTC-3’）序列，並於開始密碼子加Sail部位。逆向引物 1206 ( SEQ ID NO : 174 ) ( 5，-GTGGTG AAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCc AGAGCG-3’）在終止密碼子之後加Hindlll部位，並加沉默突變，以除去第二Xhol部份。PCR反應用之模板為質粒 Apo27 (第8(A)圖），PCR生成物以Sail和Hindlll切斷，結合於pKS+，產生質粒14-5。質粒用Sail和Hindlll切斷，結合於質粒SBS4055之Xhol/Hindlll部位（第9圖）。須知 SBS4055含有來自菜豆的冷一蛋白鹼啟動子/終止子 (Slightom 等人，1983, Proc. Natl· Acad. Sc. USA 80 : ΙδΡΤ-βΟΙ) ，控制框内融合 D9 scFV 插段的 PRS 訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物phosphinothricine抵抗性 (Wohlleben 等人，1988，Gene 70 ·· 25-37 )，利用來自 Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol· Bio” 21 : 673-684)，供轉型成土壤桿菌。Apo40係把D9 scFV/klip8/Apo AI原標定 67 200526778 於分泌通路之種籽較佳表現殖系，使用對油體上油質蛋白具有親和性的,D9 scFV抗體，達成Ap〇 AI原之純化。使用將 klip8部位剪切的凝乳酶，可將蛋白剪切。

Apo41 # Ap〇41 f SEQ ID NO : 212)係種籽優勢殖系，其構造如第14圖所示。參見第2圖，Ap〇41殖系包含驅動pRS/D9 scFV / klip8 / met / Apo AI ( SEQ ID NO ·· 223 )融合蛋白表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。D9 ScFV/kHp8/ met/Apo AI使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons等人，1990, Biotechnology，8 : 2Π·221)。此殖系具有klips剪切序列（SEq ][D N〇 ··，φ 以方便融合蛋白以凝乳酶剪切。為構造此殖系，前向引物 1207 ( SEQ ID NO ： 219 ) ( 5^GCAGCAGTCGACtATGGr TG^XJATCACCC GCATTC_3’）把 klip8 序列開始放大，於開始密碼子加Sail部位。逆向引物1206 (SEq ID N〇 : 174) (59-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGT GTACTCCTCcAGAGCG_3’）於終止密碼子後加Hindlll部位’並加沉默突變，除去第二χοΜ部位。PCR反應用模板為質粒Apo25 (第6圖）。PCR生成物以Sail和Hindlll切斷’結合於pKS+内，產生質粒ii-i。質粒以sail和Hindlll 贏切斷，結合於雙載體SBS4055的Xhol/Hindlll部位（第9 * 圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的点一蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom 等人，1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80 : 1897·1901)，控制框内融合D9 scFV插段的PRS訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物以phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，利用來自 Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol· Bio·，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Apo41是標定於分泌通路的D9 scFV/klip8 68 200526778

Apo AI的種軒優勢表現殖系。使用對油體上的油質 J ΪΪ，性的D9 SCFV抗體’達成me"AP“I的純。使用將klip8部位剪切的凝乳酶，可將蛋白剪切。

Apo42 # Apo42 f SEQ ID NO : 224)係種籽優勢殖系，其構造如弟14圖所不。參見第2圖，Apo42殖系包含驅動prs/D9 scFV / klip8 / met / Apo AI 原（SEQ Π) NO ·· 225 )融合蛋白表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。D9 ScFV/Wip8 γ met/Apo AI原使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons等人，199〇, Biotechnology, 8 · 217_221)。此殖系具有kjipg剪切序列（SEQ ID NO ·· 143)，以方便融合蛋白以凝乳酶剪切。為構造此殖系，前向引物 1207 (SEQ ID NO : 219) ( 5’-GCAGCAGTCGACtATGG CTGAGATCACCC GCATTC-3’）把 klip8 序列開始放大，於開始密碼子加Sail部位。逆向引物1206 (SEQ ID NO ·· 174) (5’-GTGGTG AAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGT GTACTCCTCcAGAGCG-3’）於終止密碼子後加Hindlll部位，並加沉默突變，除去第二Xohl部位。PCR反應用模板為質粒Apo26 (第7圖）。PCR生成物以Sail和Hindlll切斷，結合於pKS+内，產生質粒12_1。質粒以Sail和Hindlll 切斷，結合於雙載體SBS4055的Xhol/Hindlll部位（第9 圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的—蛋白驗啟動子/終止子（Slightom 等人，1983, Proc· Natl. Acad. Sc. USA 80 : 1897-1901)，控制框内融合D9 scFV插段的PRS訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物以ph〇Sphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988，Gene 70 : 25·37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol· Bio, 21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Αρο42是標定於分泌通路的D9 scFV/klip8 69 200526778 , 丄met/Apo AI原的種籽優勢表現殖系。使用對油體上的油質蛋白具有親和性的D9 scFV抗體，達成met/Ap() AI的純化。使用將klip8部位剪切的凝乳酶，可將蛋白剪切。

Ap〇43 # Apo43 (SEQ ID NO : 226)係種籽優勢殖系，其構造如弟13圖所示。參見第2圖，Apo43殖系包含驅動PRS/D9 scFV / klip8 / Apo AI / KDEL ( SEQ Π) NO : 227 )融合蛋白表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼hDp ScFV/klip8 ^po AI使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（Sijmons 等人，1990, Bkytechnology，8 : 217-221)，並使用 KDEL 保留訊號（Munro 和 Pelham，1987, Cell ⑩ 48 : 899-907)，把多肽保留在ER内。此殖系具有klip8剪切序列（SEQ DD NO : 143)，以方便融合蛋白以凝乳酶剪切。為構造此殖系，前向引物1207 (SEQ ID NO ·· 219) (5，-GCAGCAGTCGACtATGGC TGAGATCACCC GCATTC-3,）

把klip8序列開始放大，於開始密碼子加如〗部位。逆向引物 1208 ( SEQ ID NO : 210 ) ( 5 ?-AAGCTTTCAtagctcatcttt CTGGGTGTTGAGCTTCTTAG_3’）於終止密碼子前加 KDEL 序列，於終止密碼子後加Hindlll部位。PCR反應用模板為質粒Apo27 (第8(A)圖）。PCR生成物以Sail和Hindlll切斷，結合於pKS+内，產生質粒17-1。質粒以Sail和Hindlll切斷，結合於質粒SBS4055的Xhol / Hindlll部位（第9圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的冷―蛋白鹼啟動子/終止子 (Slightom 等人，1983, Proc· Natl. Acad. Sc. USA 80 : 1897-1901)，控制框内融合D9 scFV插段的PRS訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物以phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 ·· 25-37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol. Bio·，21 : 673_684)，供轉 70 200526778 型為土壞桿菌。AP〇43是標定於分泌通路的D9 scFV/ / Apo AI/KDEL的種籽優勢表現殖系。Ap〇43由於roEL 訊號肽而累積於ER内。使用對油體上的油質蛋白具有親和性的D9 scFV抗體’達成Apo AI的純化。使用將klip8部位剪切的凝乳酶，可將蛋白剪切。

Apo44 斤Apo44 f SEQ ID NO : 222)係種籽優勢殖系，其構造如第13圖所示。參見第2圖，Ap〇44殖系包含驅動prs/D9 scFV / klip8 / Apo AI 原 / KDEL ( SEQ ID NO : 229 )融合蛋白表現之種籽優勢啟動子和終止子乂蛋白鹼）。D9 ScFV/ klip8/Apo AI原/ KDEL使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽，為表現而標定於分泌通路（sijm〇ns等人，199〇,

Bkytechnology，8 : 217-221)，使用 KDEL 保留訊號:Munni 和 Pelham，1987，Cell 48 : 899_907)，把多肽保留在 ER 内。此殖系具有klip8剪切序列（SEQ ID NO ·· 143)，以方便融合蛋白以凝乳酶剪切。為構造此殖系，前向引物12〇7 (SEQ ID NO : 219) ( 5?-GCAGCAGTCGACtATGGr； TGAGATCACCC GCATTC_3’）序列於開始密碼子加Sail部位。逆向引物1208 (SEQ ID NO ： 210) (5?-AAGCTTTCAtagctcatcttt CTGGGTG TTGAGCTTCTTAG-3’）於終止密碼子前加KDEL序列，於終止密碼子後加Hindlll部位。PCR反應用模板為質粒Apo28 (第9圖）。PCR生成物以Sail和Hindlll切斷，結合於 pKS+内，產生質粒18-2。質粒以Sail和Hindlll切斷，結合於質粒SBS4055的Xhol/Hindlll部位（第9圖）。須知 SBS4055含有來自菜豆的/3 —蛋白鹼啟動子/終止子 (Slightom 等人，1983, Proc. Natl. Acad· Sc. USA 80 : 1897-1901)，控制框内融合D9 scFV插段的PRS訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物以phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，利用來 200526778 自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動 (Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol. Bio.，21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Apo44是標定於分泌通路的 / Apo AI原/KDEL的種籽優勢表現殖系。Ap〇44由於 KDEL訊號肽而累積於ER内。使用對油體上的油質蛋白具有親和性的D9 scFV抗體，達成Apo A!原的純化。使用將 klip8部位剪切的凝乳酶，可將蛋白剪切。

Apo45

Apo45 (SEQ ID NO : 230)係種軒優勢殖系，其構造如第14圖所示。參見第2圖，Apo45技系包含驅動PRS/D9 scFV/klip8 /met/ Apo AI/KDEL (SEQ ID NO ： 231) m · 合蛋白表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）C>D9 ScFV /klip8/met/Apo AI使用菸草病毒相關序列（PRS)訊號肽’為表現而標定於分泌通路（Sijmons等人，1990，

Biotechnology，8 ·· 217-221)，使用 KDEL 保留訊號（Munro 和 Pelham, 1987, Cell 48 : 899-907)，把多肽保留在 ER 内。此殖系具有klip8剪切序列（SEQ ID NO : 143),以方便融合蛋白以凝乳酶剪切。為構造此殖系，前向引物1207 (SEQ ID NO ： 219 ) ( 59-GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCC GCATTC-3’）把klip8序列開始放大，於開始密碼子加Sail · 部位。逆向引物 1208 ( SEQ Π3 NO : 210) ( 5，_AAGCTT TCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG_3,）於終止密碼子前加KDEL序列，於終止密碼子後加Hindlll部位。PCR 反應用模板為質粒Apo25 (第6圖）。PCR生成物以Sail和 Hindlll切斷，結合於pKS+内，產生質粒15-1。質粒以Sail 和Hindlll切斷，結合於雙載體SBS4055的Xhol/Hindlll 部位（第9圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的石一蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom等人，1983，？1^灿沈八〇3(18(：· USA 80 : 1897-1901 )，控制框内融合D9 scFV插段的PRS訊 72 200526778 號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物以 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)，利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白启支動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993，Plant· Mol. Bio。21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Apo45是標定於分泌通路的〇9 scFV/klip8/met/Apo AI/KDEL的種籽優勢表現殖系。

Apo45因KDEL訊號肽而累積於ER内。使用對油體上的油質蛋白具有親和性的D9scFV抗體，達成ΑροΑΙ的純化。使用將klip8部位剪切的凝乳酶，可將蛋白剪切。

Apo46

Apo46 (SEQ ID NO : 232)係種籽優勢殖系，其構造如 φ 第14圖所示。參見第2圖，Αρο46殖系包含驅動PRS/D9 scFV / klip8 / met / Αρο ΑΙ 原 / KDEL ( SEQ ED NO : 233 ) 融合蛋白表現之種籽優勢啟動子和終止子（蛋白鹼）。〇9 ScFV / klip8 / met / Αρο AI原使用菸草病毒相關序列 (PRS)訊號肽’為表現而標定於分泌通路（sijmons等人， 1990, Biotechnology，8 ·· 217-221)，使用 KDEL 保留訊號 (Munro 和 Pelham, 1987, Cell 48 : 899-907)，把多肽保留在 ER内。此殖系具有klip8剪切序列（SEQ ID NO : 143)，以方便融合蛋白以凝乳酶剪切。為構造此殖系，前向引物1207 (SEQ ID NO ： 219) (5?-GCAGCAGTCGACtATGGCTGAG ^ ATCACCC GCATTC-3’）把klip8序列開始放大，於開始密碼子加 Sail 部位。逆向引物 1208 (SEQ ID NO : 210) (5，-AAGCTT_TCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3，）於終止密碼子前加KDEL序列，於終止密碼子後加Hindlll 部位。PCR反應用模板為質粒Apo26 (第7圖）。PCR生成物以Sail和Hindlll切斷，結合於pKS+内，產生質粒16-4。質粒以Sail和Hindlll切斷，結合於雙載體SBS4055的Xhol / Hindlll部位（第9圖）。須知SBS4055含有來自菜豆的石 73 200526778 —蛋白鹼啟動子/終止子（Slightom等人，1983, Proc Natl Acad· Sc· USA 80 : 1897_1901 )，控制框内融合 D9 scFV 插段的PRS訊號序列表現。質粒亦含有pat基因，賦予宿主植物以 phosphinothricine 抵抗性（Wohlleben 等人，1988, Gene 70 : 25-37)’利用來自Petroselinum crispum的泛蛋白啟動子/終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant· Mol· Bio.，21 : 673、-

684)，供轉型為土壤桿菌。Apo46是標定於分泌通路的D9 sCFV/klip8/met/AP〇 AI原的種籽優勢表現殖系。使用對油體上的油質蛋白具有親和性的D9 scFV抗體，達成Ap〇 AI 的純化。使用將klip8部位剪切的凝乳酶，可將蛋白剪切。 Αρο47 外Apo47 (SEQ ID NO : 234)係種籽優勢殖系，其構造如第15圖所示。參見第2圖，Apo47殖系包含驅動玉米油質蛋白 /klip8/met/Apo AI (SEQ Π3 NO : 235)表現之種籽優勢啟動子和終止子（核網）。此構造物具有klip8剪切序列 (SEQ ID NO : 143)，以方便融合蛋白用凝乳酶剪切。為構造此殖系，使用前向引物1226 ( 5，-GCAGCACCATGG CTGATCACCACCG-35 ) ( SEQ ID NO ： 236 ) i來自 PSBS2377的玉米油質蛋白的寫碼序列放大，於基因開始加 Ncol部位，組合逆向引物id? ( 5，-GTGGTGAAGCTT AGACCCCTGCGCC-3’）（SEQ ID NO ·· 237)，除去基因的終止後碼子’加Hindlll部位，以協助與klip8 / met / Apo AI產生框内轉譯融合。來自Apo25的klip8/met/Apo AI的寫碼序列，使用前向引物 1228 ( 5?-GCAGCAAAGCTTATGG CTGAGATCAC-3’）（SEQ Π) NO : 238)放大，並在基因開始加 Hindlll 部位。逆向引物 mg ( 5?-GTGTGGGATCC TCACTGGGTGTTG_3’）（SEQ ID NO ·· 239)於終止密碼子後加BamHI部位。含玉米油質蛋白cDNA和kiip8/met/ Apo AI的PCR片段’結合於τ〇ρ〇選殖載體（jnvitr〇gen)的 74 200526778

EcoRI部位。質粒MzOleo以限制酵素Ncol和Hindlll切斷。質粒 klip8 / met / Apo AI 以 Hindlll 和 BamHI 切斷。MzOleo 和klip8/met/Apo AI的片段一同結合於質粒SBS5709的 Ncol和BamHI部位，產生質粒Ap〇47。pSBS5709含有來自 WO 01 / 16340的核網啟動子/終止子，旁側複數選殖部位。PSBS5709 亦含有 pmi 基因（Miies 等人，1984, Gene 21 ··

41*48)，為填甘露糖異構酶，得以正面選擇含選擇培養基的甘路糖。pmi基因是在來自petroseiinum crjSpUm的泛蛋白啟動子 / 終止子驅動（Kawalleck 等人，1993, Plant. Mol. Bio·， 21 : 673-684)，供轉型為土壤桿菌。Ap〇47是把玉米油質蛋白/klip8/met/Apo AI標定於油體的種籽特異性殖系，並使用klip8剪切序列純化。實際例2 -土壤桿逢和阿拉伯齐轉啼

全部實驗使用阿拉伯芥（Mbidopsis thaliana cv Columbia (C24))。種籽播在4吋钵内土壤混合物（三分之二 Redi 土和二分之一珠岩，pH=；67)或LeWe種籽公司所供應阿拉伯芥土壤混合物（珠岩、蛭石、泥媒、綠土陶， PH-5.5)的表面。讓幼苗成長到6一8葉的花形階段，直徑約 2.5公分。此等幼苗轉植到含上述土壤混合物的4吋缽，覆蓋 f窗簾材料，有五個1公分直徑洞孔，裁成網丨四角各一個，t央「個。蛛在4ΐ圓拱内放四天，供冷處理，隨後移 f 24C成長室内，在約15〇 μΕ和5〇%相對濕度，光照不 :。植物每隔2一3天洗水，每週施肥1% Peters 20-20-20。，言5株植物。植物到達約2公分高時，把主莖剪斷，促 32^三$成長。剪掉主莖4—5天後，植物準備接受土襄七，乐’貝粒轉型為電競爭性土壤桿菌EHAlm。蛛連二，f植物倒轉’以再懸浮過夜的500毫升土壤桿菌培養物（4的植物轉型載體）感染20秒。關鍵在於土壤桿菌含 75 200526778 5%蔗糖和〇·〇5%表面活性劑Silwet L-77 (Lehle Seeds)。绰隨即覆蓋透明塑膠拱頂歷24小時，以維持較高濕度。讓植物成長成熟，收穫種籽（未轉型和轉型）。為選擇轉基因線，將虛擬轉型種籽殺菌，以70%乙醇快洗，再20〇/〇商業用漂白粉洗 15分鐘’然後以ddH2〇淋洗至少4次。約1〇〇〇顆經殺菌的種籽，與0.6%頂級瓊脂混合，均勻分佈於半強M；S板上 (Murashige 和 Skoog，1962，Physiologia Plantarum 15 ·· 473-497) ’ 含〇·5%庶糖和 80 μΜ 除草劑 phosphinothricin (PPT) DL。板再放進成長室内，在24°C的光照是8小時暗和16小時壳。七至十天後，虛擬轉基因種籽綠了，繼續成長，而未轉型幼苗則慘白。生根後，虛擬轉基因幼苗個別轉移至钵 (個別植物每隔三天澆水，每隔五天施肥1% Peters 2〇_2〜 20)，讓其成長成熟。缽覆蓋轉基因塑膠圓拱三天，以保護敏感性幼苗。七天後，幼苗覆蓋Lehle種軒公司的種籽收集器，以防種籽散落損失。個別收穫此等轉基因植物的種籽，準備供分析。全葉萃取物贺備阿拉伯务葉用液氣冷束，在1·5毫升微離心管内，用鑽磨。加200-250吣0·5 M Tris-HCl，pH 7.5，把樣品倒在冰上。加20°fc) SDS至最後濃度2%，樣品煮沸5分鐘，萃取物在微離心管内以最大速度旋轉5分鐘。液體移到另一微離心管， f _20°C儲存。可溶性蛋白使用BCA蛋白質測定法（pierce) 量化，在15% SDS-PAGE上分析，接著利用蛋白質印跡法。使用抗Apo AI或抗GFP兔抗血清，做為主要抗體；而使用抗兔IgG〔 H+L〕-Ap去軛（Bio-Rad)做為次要抗體。全種籽萃取取大約40粒阿拉伯芥種籽（丁2種籽），在微離心管内的 50队緩衝液（50 mM Tris ΡΗ 7.5)中，使用Stir_Pak實驗室混合器研磨。隨即於樣品加2G% SDS至最後濃度為2%，樣 76 200526778 品煮沸5分鐘，以最大速度離心5分鐘。為加載於SDS-PAGE凝膠上，於樣品加SDS-PAGE 2X加載緩衝液（1〇〇 mM Tris pH 6.8, 20%丙三醇，4% SDS，2 mg / mL，溴酚藍，200 mM DTT)和1M DTT，煮沸5分鐘，以最大速度離心2分鐘。實施例3 1_白質印跡法分柄截脂番白表規組成型表現

Ap〇17 參見實施例1，Apol7 (SEQIDNO : 27)是成熟ΑροΑΙ 和GFP間之融合蛋白。使用泛蛋白啟動子和終止子，供構造鲁物之組成型表現。蛋白質印跡分析（第16 (Α)圖）使用多株 Αρο ΑΙ抗體，於12當中的9個殖系内，在全葉萃取物中，檢測到很低量（佔全葉蛋白的〇·1%以下）之Αρ〇ΑΙ/GFP融合蛋白，分子量大約55 kDa。然而Αρο17融合蛋白的實質表現（佔全種籽蛋白的至少1%)，在受測試的12殖系内有u 個，於全種籽萃取物内檢測得（第16 圖）大約為55 kDa 〇

Apol8a 參見實施例1，Apol8 ( SEQ ID NO : 29)是成熟Αρο ΑΙ 赢原和GFP間之融合蛋白。使用泛蛋白啟動子和終止子，供構馨造物表現。蛋白質印跡分析（第17 (a)圖）使用多株Αρο AI 抗體，於12當中的3個殖系内，在全葉萃取物中，檢測到很低量（佔全葉蛋白的0.1%以下）之Αρ〇 ΑΙ原/GFp融合蛋白，分子量大約56 kDa。然而Ap〇18融合蛋白的實質表現 (佔全種籽蛋白的至少1%)，在受測試的全部殖系内，於全種籽萃取物内檢測得（第17(B)圖）大約為56kDa。

Apol9 參見實施例 1，Apol9 (SEQ ID NO : 31)是 Αρο AI 和 77 200526778 GFP間、之融合蛋白。使用泛蛋白啟動子和終止子，供構造物表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白的表現標定於ER。 f白貝印跡分析（第18 (A)圖）使用多株Ap〇AI抗體，於12 $中的10個殖系内，在全葉萃取物中，檢測到很低量（佔全葉蛋白的0.1%以下）之ApoAI/GFP融合蛋白，分子量大約 58 kDa。然而Apol9融合蛋白的實質表現（佔全種籽蛋白的至少1°/〇) ’在受測試的18殖系内有17個，於全種籽萃取物内檢測得（第18⑼圖）大約為58kDa。

Ap〇20 參見實施例 1 ’ Ap〇20 (SEQ id NO : 35)是 Apo AI 原和GFP間之融合蛋白。使用泛蛋白啟動子和終止子，供構造物表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白的表現禅定 ER:蛋白質印跡分析（第19㈧圖）使用多株Ap〇 W抗體，' 於受測試12當中的3個殖系N，在全葉萃取物中，檢測到很低1 (佔全葉蛋白的0.1%以下）之Ap〇 AI原/GFP融合蛋白’分子量大、約59 kDa。然* Ap〇2〇融合蛋白的實質^現 (佔全種籽蛋白的至少1%)，在受測試的18殖系内有16 個，於全種籽萃取物内檢測得（第19 (印圖）大約 kDa °

種籽特異性表現 ApolO 參見實施例=A_ (SEQIDN0 : 1〇)係成熟Ap〇Ai 和GFP間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和終止子，供物的種籽特異性表現。蛋白質印跡分析（第2〇 ( f 多株GFP抗體，在受職的1()之7殖財，取物内的ApoAI/GFP融合蛋白，分子量大約55ω&。 Apoll 參見實(SEQIDN〇:16)係成熟 apoai 原和GFP間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和終止子，μ供構 78 200526778 造物的種籽特異性表現。蛋白質印跡分用多株GFP抗體，在受測試的14之1〇m20⑼圖）使 Λρο ΛΙ ^/GFp

Apol2 參見實施例1 ’ APol2 (SEQ ID NO :⑼係油質熟Apo AI * GFP間之融合蛋白。使啟子，供構造物的種㈣異性表現。蛋白f 圖）使用多株GFP抗體，在受測試的全部17 ()

全種籽萃取物⑽Apo AI/GFP融合蛋白，分子m kDa。 ^

Apol3 參見實施例卜AP〇13 (SEQ ID N〇 : 21)係油質蛋熟Apo AI原和GFP間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和線止子，供構造物的種籽特異性表現。蛋白質印跡分 ' (B)圖）使用多株GFP抗體，在受測試的全部18殖系中，測全種籽萃取物内的油質蛋白Ap〇 AI原/GFP融合|白，八子量大約75 kDa。 n

Apol5

參見實施例卜AP〇15 (SEQIDNO : 23)係成熟ApoAI 和GFP間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白'對^ 泌系統之標定表現。蛋白質印跡分析（第22 (A)圖）使用多株GFP抗體，在受測試1〇之9殖系中，檢測全種籽萃取物内的ApoAI/GFP融合蛋白，分子量大約58kDa。

Apol6 參見實施例1 ’ Ap〇16 (SEQIDNO : 25)係成熟ApoAI 原和GFP間之融合蛋白。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對 79 200526778 蛋白質印跡分析（第22⑻圖）使用二肉沾Λ几^/^文測4 13之10殖系f，檢測全種籽萃取物内的AP〇 AI原/ GFP融合蛋白，分子量大约5 9恤。 Apo21 參見貫施例 1，Apo21 ( SEQ ID NO ·· 37)係 Apo AI。使 f if驗ί動終止子，供構造物的種籽特異性表現。蛋白^厂跡^刀析（第23 (Α)圖）使用多株Αρ〇ΑΙ抗體，在全種籽，取物内檢測Apo ΑΙ蛋自。預計分子量大約烈恤。在受測试的12殖系中，以Apo AI抗體檢測許多不同蛋白，範圍 =25 kDa向上至55 kDa。可知Apo 的表現有損植物健康（即發育不良的長角果，和不結軒）。

Ap〇22

參見實施例 1，Ap〇22 (SEQ ID NO : 41)係.Apo AI 原。使用蛋白驗啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現。蛋白質印跡分析（第23 (B)圖）使用多株Αρ〇 Μ抗體，在全種籽萃取物内檢測Apo Μ蛋白。預計分子量大約29 kDa。在受測試的6殖系中，以Ap〇 AI抗體檢測許多不同蛋白旦範圍大約25 kDa向上至55 kDa。殖系22·3具有適當分子里之蛋白。可知Apo ΑΙ原的表現，與表現構造物Αρ〇21、 Αρ〇29和Αρο30對Αρο23之植物健康相較，對具有中間擬型的植物健康有損。 Αβ〇23 參見實施例1，Apo23 (SEQ ID NO : 44)係油質蛋白和 Apo AI間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和終止子，供構造，的種籽特異性表現。蛋白質印跡分析（第24 (A)圖^使用夕株Apo AI抗體’在受測試5之4殖系中，於全種籽萃取物内檢測油質蛋白/ΑροΑΙ融合蛋白，分子量大約47kDa。 Δβ〇24 參見實施例1，Apo24 (SEQ ID NO ·· 46)係油質蛋白和 200526778

Apo AI原間之融合蛋白。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現。蛋白質印跡分析（第24 (B)圖）使用多株Apo AI抗體，在受測試全部7殖系中，於全種籽萃取物内檢測油質蛋白/ΑροΑΙ融合蛋白，分子量大約48kDa。

Apo25 參見實施例1，Apo25 (SEQ ID NO : 48)係油質蛋白和 Apo AI (+Met)間之融合蛋白，有klip8剪切序列把二成份分開。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現。蛋白質印跡分析（第25 (A)圖）使用多株Apo AI'抗體，在受測试全部4殖糸中，於全種籽萃取物内檢測油質蛋白-klip8_ApoAI (+Met)融合蛋白，分子量大約51 kDa。 ♦

Apo26 參見實施例1，Apo26 (SEQ ID NO : 51)係油質蛋白和 Apo AI原（+Met)間之融合蛋白，有剪切序列把二成份分開。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現:蛋白質印跡分析（第25(B)圖）使用多株却^以^ 體’在夂測試全部11殖系中，於全種籽萃取物内檢測油質蛋白-klip8-Ap〇AI原（+Met)融合蛋白，分子量大約52kDa。

Ap〇28 參見實施例1，Apo28 (SEQ ID NO : 60)係油質蛋白和 _ Apo AI原間之融合蛋白，有kiip8剪切序列把二成份分開。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現。蛋，質印跡分析（第26(A)圖）使用多株ΑροΑΙ抗體，在受測試全部殖系中，於全種籽萃取物内檢測油質蛋白_klip8-ApoAI原融合蛋白，分子量大約52k〇a。

Ap〇29 參見實施例 1，Apo29 (SEQIDNO : 63)係 Apo AI。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物之種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供蛋白對分泌通路之標定表現。蛋白質印 81 200526778 跡分析（第26 (B)圖）使用多株Apo aj抗體物内檢測ΑροΑΙ蛋白。預計分子量大約31 種抒年取殖系中，只有-殖_罐白，圍。須知Apo AI的表現有損植物健康（即發 ^ 果，和不結籽）。 ^ 民的長角

Apo30 參見實施例 1，AP〇30 (SEQ ID NO : 65)係 Ad〇 Ατ 原。使用蛋㈣啟動子和終止子，供構造物之細j f 現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路二現。蛋白質印跡分析（第27圖）使用多株Ap〇 w抗^，^ 全種籽萃取物内檢測ΑροΑΙ蛋白。預計分子量大在受測試的13殖系中，有許多不同蛋白檢知具/ 巧，範圍大約25 kDa上至55 _。須知Αρ〇 μ原的表現J 損植物健康（即發育不良的長角果，和不結軒）。

Ap〇32

參見實施例 1 ’ AP〇32 ( SEQ ID NO : 69)係 D9 scFV 體和ΑροΑΙ關之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和終止子，供構造物的種浦異性表現，並使用pRS訊號肽，供融白對分泌通路之標定表現。蛋白質印跡分析（第28⑻圖）使用多株Apo AI抗體，在受測試全部5瘦系中，於全種取物内檢測D9 scFV-Apo AI原融合蛋白，分子量大約59 kDa 〇

Ap〇33 參見實施例 1 ’ AP〇33 ( SEQ ID N0 : 71)係 D9 scFV 抗體和Apo AI (+met)間之融合蛋白。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現，並使用pRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路之標定表現。蛋白質印跡分析（第28田) 圖）使用多株Apo AI抗體’在受測試8之^殖系中，於全種籽萃取物内檢測D9 seFV却j w (+met)融合蛋自，分子量 82 200526778 大約59kDa。

Apo34 參見實施例 1，Apo34 ( SEQ ID NO : 73 )係 D9 scFV 抗體和ApoAI原（+met)間之融合蛋白。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路之標定表現。蛋白質印跡分析（第29 圖）使用多株ApoAI抗體，在受測試7之6殖系中，於全種籽萃取物内檢測D9 scFV-Apo AI原（+met)融合蛋白，分子量大約59kDa。

Apo36 參見實施例卜Apo36 ( SEQ ID NO : 78)係D9 scFV抗籲體和Apo AI原間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路之標定表現，又使用KDEL保留訊號以保留多肽於ER内。蛋白質印跡分析（第3〇 (A)圖）使用多株Ap〇 AI抗體，在受測試的全部13殖系中，於全種籽萃取物内檢測D9 scFV-Apo AI S_KDEL融合蛋白，分子量大約60 kDa °

Ap〇37 參見實施例 1，Ap〇37 ( SEQ ID NO : 80)係 D9 scFV 抗 _ 體和Apo AI (+met)間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和終止子’供構造物的種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路之標定表現，又使用KDEL保留訊號以保留多肽於ER内。蛋白質印跡分析（第3〇(B)圖）使用多株 AP〇 AI抗體，在受測試的全部15殖系中，於全種籽萃取物内檢測D9 scFV_Apo AI (+met) _KDEL融合蛋白，分子量大約 59 kDa。 Λρο38 參見實施例 1，Ap〇38 (SEQ IDNO ·· 82)係 D9 scFV抗 83 200526778 體和ΑροΑΙ原（+met)間之融合蛋白。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物的種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路之標定表現，又使用KDEL保留訊號以保留多肽於ER内。蛋白質印跡分析（第31A圖）使用多株Apo AI抗體，在受測試的11之9殖系中，於全種籽萃取物内檢測D9scFV-ApoAI原（+met) -KDEL融合蛋白，分子量大約60kDa。

Apo39 參見實施例 1，Apo39 ( SEQ ID NO : 83 )係 D9 scFV 抗體、KLIP8和Apo AI間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和終止子’供構造物的種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路之標定表現，又使用KLIP8為可剪切的接頭。蛋白質印跡分析（第31B圖）使用多株ApoΛΙ抗體，在受測試的全部12殖系中，於全種籽萃取物内檢測D9 scFV_ KLIP8-ApoAI融合蛋白，分子量大約55kDa。 Λρο40 參見實施例 1，Apo40 (SEQ ID NO ·· 87)係 D9 scFV抗體和Apo AI原間之融合蛋白，有|^ρ8剪切序列將二成份分開。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物之種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路的標定表，:蛋白質印跡分析（第32(A)圖）使用多株Ap〇AI抗體，文測試的13之12殖系中，於全種籽萃取物内檢測 scI^kliP8-AP〇AI原融合蛋白，分子量大約63k〇a。

Ap〇41 參見實施例卜AP〇41 (SEQIDNO ·· 89)係D9scFV抗成二乂(+咖〇間之融合蛋白，* _剪切序列將二。使用蛋白驗啟動子和終止子，供構造物之種轩特 ^ =現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋掉疋表現。蛋白質印跡分析（第32⑼圖）使用多株Ap〇 = 84 200526778 體，在受測試的9之8殖系中，於全種籽萃取物内檢測D9 scFV-klip8-ApoAI (+met)融合蛋白，分子量大約 63k〇a。 Apo42 參見實施例 1，Apo42 (SEQ ID NO : 91)係 D9 scFV 抗體和Apo AI原（+met)間之融合蛋白，有ωρ8剪切序列將二成份分開。使用蛋白鹼啟動子和終止子，供構造物之種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路的標定表現。蛋白質印跡分析（第33 (Α)圖）使用多株Αρο ΑΙ 抗體，在受測試的全部13殖系中，於全種籽萃取物内檢測 D9 scFV-klip8_Apo ΑΙ原（+met)融合蛋白，分子量大約64 kDa 〇

Apo44 參見實施例 1，Apo44 ( SEQ ID NO : 95 )係 D9 scFV 抗體和Αρο ΑΙ原間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和終止子，供構造物之種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路的標定表現，又使用KDEL保留訊號，把多肽保留在ER内。蛋白質印跡分析（第34(Α)圖）使用多株Αρ〇 ΑΙ抗體，在受測試的15之4殖系中，於全種籽萃取物内檢測D9 scFV-Αρο ΑΙ原-KDEL融合蛋白，分子量大約64 kDa 〇

Ap〇45 參見實施例 1，Apo45 ( SEQ ID NO : 97)係 D9 scFV 抗體和Αρο AI (+met)間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和終止子，供構造物之種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽，供融合蛋白對分泌通路之標定表現，又使用KDEL保留訊號，把多肽保留在ER内。蛋白質印跡分析（第34(B)圖）使用多株Αρο AI抗體，在受測試的全部12殖系中，於全種籽萃取物内檢測D9 scFV-Αρο AI (+met) -KDEL融合蛋白，分子量大約63 kDa。 85 200526778

Apo46 „例！，Ap〇46 (SEQ ID N0 : 99)係 D9 scFv 抗 f tipo^L原（+mei)間之融合蛋白。使用蛋白驗啟動子和造物之種籽特異性表現，並使用PRS訊號肽， a，對分泌通路之標定表現，又使用咖£保留訊號，，夕肽保留在ER内。蛋白質印跡分析（第35⑷圖）使^夕株Apo AI抗體，在受測試的u之1〇殖系中，於全種籽萃取物内檢測D9 SCFV-AP〇 AI原（+met) -kdel融合蛋白’分子量大約64 kDa。實施例4 羞II蛋白定域之番白質印跡公析按上述進行油體單離（van Rooijen & M〇1〇ney，1995)， =變如下。簡言之，取250毫克乾成熟種籽，表面以7〇0/〇乙醇殺菌]用無菌水淋洗二次，磷酸塩緩衝液一次（1〇〇磷酸塩緩衝液pH 8,和〇·5 M NaCl)。洗後，種籽再懸浮於礙酸塩緩衝液内供分析之用，再用殺菌研缽和杵槌磨。磨後，樣品移到離心瓶内，在rT以1〇〇〇〇 g離心15分鐘。離心後丄從水相（AQ)除去含油體的脂肪墊，移至1 5 mL微離心f [油體再懸浮於嚴格度低的磷酸塩緩衝液（1〇〇磷酸垣緩衝液pH 8,和〇·5 M NaCl)。樣品在4°C，以10,000 g 離心15分鐘，除去下層液。測試下層液（pw)和磷酸塩洗過，油體（PO)内載脂蛋白之存在。油體隨即再懸浮於嚴格性尚的尿素緩衝液内（8M尿素在1〇〇 mM碳酸鈉緩衝液内， pH 8)。樣品在4°C，於1〇5〇〇〇 g離心15分鐘，除去下層液。下層液（UW)和尿素洗過的油體（uo)，測試載脂蛋白之存在。須知油體經低、高嚴格度洗液處理，以除去與油體關聯之蛋白質，油質蛋白抵抗高嚴格度洗液，與油體部份保 ^ °取250 mg乾種籽在4 mL微粒體研磨緩衝液内（0.5 Μ 嚴糖，〇·2 M Hepes-NaOH緩衝液，ΡΗ 7.4)，用研缽和杵槌磨成 86 200526778 ，液粒體部份⑽。漿液在代，以ι〇，離心 =^巴上層液移至新管内，於4°c，以_〇〇 g離心2 棘赋離,讀子進行超離^。丸細絲體研磨缓 ,以瓜圓g快速離心5分鐘，再懸浮於爪15 微粒體研磨緩衝液内，在-20°C儲存。未標定構造物

⑽H第 36A ®，（Ap0ll)原和成熟（AP〇10) Apo AI-: 口，無額外標定訊號，在不同部份檢驗。AP〇1〇顯示雖d在所有細胞部份均檢測到成熟ApoAI-GFP融合蛋白，但呈^更多蛋自累積在用磷贿緩衝液和尿素洗液部份洗過的油體。此表示雖然ApolO不擁有對油體的親和性，但高嚴格度洗液即足以從油體表面加以除去。Ap〇n表示Ap〇 Μ天然原^列存在，把ApoAI_GFP融合蛋自標定於油體部份，其程度較失去肽原者更大，而即使用到高嚴格度洗液，蛋白仍結合於油體。呈現Ap〇 AI肽原有「固著」序列的作用，把Ap〇 AI原保留在油體表面。在此等部份可檢測得複數低分子帶，可以降解生成物。座體標定之楫i告物

Apo AI_GFP融合蛋白與油體緊密相關之型態，亦可見於油體標定之構造物（第36B圖）。（却〇13)原和成熟 (Apol2) Apo ΑΙ-GFP融合，係框内融合於油^ 末端，用做對油體之標定訊號。參見前述未標定Αρ〇 ΑΙ原^ GFP融合’蛋白主要與磷酸塩和尿素洗過油體部份關聯。'在此等部份亦可檢測得複數較低分子量帶，表示對油體關聯份有些獨特，以致累積可能降解的生成物。泌糸統標定之構造物添加把蛋白標定於分泌通路的PRS訊號肽（Sijm〇ns等人，1990, Biotechnology，8 ·· 217-221)，做為框内轉譯融合於 (Apol6)原和成熟（Ap〇15)型之 Apo AI-GFP (第 37 87 200526778 ’這會造成融合蛋自分祕植物細胞的細胞外間隙如。然而，檢驗二構造物的細胞部份時，在所有部份 f 1 IfApGAKiFP融合蛋白，而在油體部份檢測到更多。檢驗Ponceau-S染色的免疫印跡時（第37圖上半）， 2體部，亦觀察到重組融合蛋白大小的帶狀。Ap〇 w天列存在，並不表示與縣細胞部侧聯的分泌融合蛋 ^所，變。植物前相辨識訊號（PRS)肽呈麟Ap〇 w 肽原的「固著」特性發生干擾。葉部的組成刑表锊檢驗組成型表現未標定和分泌原型和成熟型Ap() M-GFP 之葉組織，以測定Ap〇AI_GFP融合蛋白是否可累積於不生成油的組織。葉組織從轉基因植物線勻化（如實施例2所述），組成型表現未標定（Apol8)原和成熟（Ap〇i7)，以及分泌 (i\po20)原和成熟（Ap〇l9)型Apo AI-GFP，用於&疫g卩跡法另4足野生型（c24)植物取又葉材料，做為負面對照，並從UR2 (泛蛋白驅動的油質蛋e-GFp)植物和UG_14”(、泛蛋白驅動之GFP)植物，供葉表現之正面對照。利用SDS_ PAGE分成相似量的蛋白，利用免疫印跡法，以抗GFp抗體檢測ApoAI-GFP融合蛋白（第38圖下半）。在非轉型線檢測到微弱帶，而利用抗GFP抗體，可在免疫印跡上輕易檢測到泛蛋白驅動的GFP (UG-14)和油質蛋白-GFP (UR2)二者融合。然而，雖然利用臈的p㈣eau_s 染色，可見到免疫印跡上載錄相似量的葉蛋白（第38圖上半），但任何Apo ΑΙ-GFP融合蛋白構造物均未檢測到帶狀。在免疫印跡的背景檢測到的微弱帶，可能因與Rubisc〇交又反應性之故，Rubisco是葉組織中所見最主要蛋白（RJ Spreitzer 和 ME Salvucci (2002)《Rubisco :更佳酵素之龄構調節性互動及可能性》，Annu Rev. Plant Biol 53 : 449«475)，’ 按照分子量標誌，在免疫印跡的Ponceau_S染色圖上，利用 88 200526778 大小即可看出。盤赶内未標定而分泌Apo AI之種籽特異性袅規從全種籽萃取物内顯示有些累積無論是原型或成熟Ap〇 AI蛋白的A世帶Apo AI轉基因植物，各選取一轉基因線。在虛擬轉基因的植物線當中，只有下述一線顯示任何蛋白表現：Apo21 (未標定成熟Apo AI)、Apo22 (未標定Apo AI 原）和Apo29 (分泌之成熟Apo AI);對Apo30 (分泌Apo AI原）發現二線。含有構造物Apo23和Apo24的所有轉基因植物線，顯示表現和累積油質蛋白-Apo AI融合蛋白。利用 SDS_PAGE分成類似量的蛋白，並利用免疫印跡法，以抗 Apo AI抗體檢測Apo AI蛋白（第39圖）。從非轉型植物鲁 (c24)製備相似蛋白萃取物，包含供免疫印跡用的負面對照。只有在Apo22-3線（未標定Apo AI原），觀察到單獨供 Apo AI表現的帶狀正確大小（預定分子量對成熟Ap〇以為 28.3 kDa，對 Apo AI 原為 29·3 kDa)。在 Apo21-ll (未標定成熟Apo AI)内檢測到的優越帶，是不正確大小，雖然在 Apo29-ll (分泌之成熟Apo AI)和Apo30-14 (分泌之Ap〇 AI原）檢測到只有微小帶，卻無一為正確大小。然而，對於油質蛋白融合Apo23-ll (油質蛋白一成熟Apo aj)和 ΑΡ〇_24-ό (油質蛋白一Ap〇 AI原）二者而言，重大量的Ap〇 AI融合蛋白是利用抗Ap〇 w抗體檢測，亦可在触⑵如七染着色的免疫印跡（上半圖）内檢測。一圭標定AdoAI ΓΑρο22) T3種籽之亞細胞定域未標定Apo ΑΙ蛋白原型（Αρο22)的種籽特異性表現，及其與特異性細胞部份之關聯，是在成熟種籽内檢驗（第仙圖）。種籽按上述勻化和處理，而細胞部份經免疫印跡法，以抗體對ΑροΑΙ。Αρο22_3顯示ΑροΑΙ原天然序列的存在，把 Apo ΑΙ蛋白標定於油體部份，而蛋白需要高嚴格度洗液，從油體除去蛋白。有些蛋白亦可在水相内檢測，表示並非全部 89 200526778

Ap〇原蛋白均與油體關聯分子量帶，可為降解生成物。。在此等部份可檢測到複數較低貞微術

Am/ίΐ用解纖微鏡，在培氏皿内的無菌水下，從孰錄龢，从你長角果解剖不成熟胚。用顯微鏡玻片蓋輕壓不成二肉種軒外皮除去胚。胚用吸量管移到u mL微離心 ί 到ΐ後容量為1祉。在最後濃度1 _l使用、=子探針）。在稀釋尼羅紅内之胚，於室溫黑暗中保二;IA志刀^\胚在無菌水中琳洗三次，在水中裝在玻片上供顯 =/外科小刀單純切下少部份葉（GW)，於水中用 /月盍裝在顯微鏡玻4 ± ’製備葉表皮細胞^放置葉區段，使下面表皮朝上（較不會干擾自身螢光葉綠體）。士阿拉解胚分析所有GFp依賴性妓，把葉表皮細胞 7中裝好’供顯微觀察，並用Zeiss LSM 510雷射掃描同焦點顯微鏡（Edmonton, AB)加以檢驗。為同時檢測GFp和尼羅紅’使用線依序單一追縱模式，以488謂和543 nm光的AOTF控制激發，分別設定在2〇%和1〇〇%。使用pi肪_

Appochromat 63x4.4 Oil DIC物鏡，有5X掃描伸縮。針孔調到最佳，對波道2 (綠色）在94 μηι，而波道1 (紅色）在 106 μηι °

所得顯微照片見第42至45圖。未標定Αρο ΑΙ原一GFP ，合（Apoll)和尼羅紅染色油體間之共同定域（以黃色表示）’可見第41 (D-F)圖。在Apol2 (即使用油質蛋白標定於油體的GFP所融合成熟Αρο，見第41圖之CM)和Apol3 (即使用油質蛋白標定於油體的GFP所融合Αρο AI原，見弟42圖之A-C)間’亦可共同定域（用黃色表示）。未標定 Αρο ΑΙ原一GFP融合（Αρο18)和尼羅紅染色油體間之共同定域（用黃色表示）明顯（第43圖之D-F)。Αρο ΑΙ-GFP融 90 200526778 合蛋白fAp〇19)和油體間，未見共同定域（第43圖G-Η)在弟44圖中，葉内未顯示共同定域。總之，在無油體標定（即油質蛋白）情況下，只在胚内（於中性脂ί存在下）而且只在細胞質内表現Αρο ΑΙ原肽時，觀察到Ap〇 aj 共同定域（即分泌時則不）。實施例6 表現阿拉伯签覆赶的Αρ〇25,26，：28之剪切和HPLC公析 APi>_25，Apo2^Jg Αρ〇28重組蛋白之剪士刀按照前述進行油體之單離（van R〇〇ijen & Moloney， 1995)，有I列改變。簡言之，取25〇 mg乾成熟種籽，表面用70%乙醇殺菌，用無菌水淋洗二次，磷酸塩緩衝液一次修 (100 mM磷酸塩緩衝液pH 8，有〇 5 M NaCl)。洗後，種籽再懸浮於鱗酸塩緩衝液内，供分析之用，再用殺菌過的研缽和杵槌磨。磨後，樣品移到離心瓶，在RT以1〇〇〇〇 g離心 15分鐘。離心後，含油體的脂肪墊移到15 mL微離心管，再懸浮於尿素緩衝液内（8 Μ尿素在1〇〇 mM碳酸納内，pH 8)。樣品在4°C，以10,000 g離心15分鐘，把下層液除去。脂肪墊再懸浮於無菌ddH2〇内，在4°C以10,000 g離心15分鐘，除去下層液。油體再懸浮於15 μί無菌ddH20内，在4 °C黑暗中儲存。於含1〇〇 mM磷酸塩緩衝液pH 4.5的20 μΐ^ _ 反應谷罝内’在37C進行剪切反應2小時，最後的蛋白酶對油體蛋白比為1 : 100。樣品反應如下··將20 gg純化

Apo25，Apo26或Apo28，組合2 μι 1M磷酸塩緩衝液pH 4.5 (农後濃度100 mM)、2 μΐ^凝乳酶（〇·ΐ μθμΐ)，以無菌 ddH2〇調至最後容量20 μί。2小時後，剪切反應經離心15 分鐘，從脂肪墊除去下層液，各相分析重組蛋白質。 Αρο25.Αρο26和Αρο28利用反相層妍法紬〆h 大約取1000 pg的Apo25, Apo26或Apo28，利用凝乳酶在37t：剪切2小時。俟剪切反應完成後，反應在4°C，以 91 200526778 10,000 g離心15分鐘，回收下層液。脂肪墊再懸於尿素緩衝液（8 Μ尿素在0.1 mM碳酸鈉緩衝液内，pH 8)，離心15分鐘。回收下層液或洗液，又重複洗淨三次，每次回收下層液，匯集於15 mL Falcon管内。在尿素洗滌完成後，洗液全份放入1.5 mL微離心管内，離心15分鐘，除去任何污染的油體殘餘。回收下層液，使用〇·2微米過濾器過濾入新的15 mL Falcon 管内。VYDAC 214ΤΡ54 C4 氧化矽 5 微米（Grace Vydac，Anaheim，CA)反相層析管柱（〇·24 X 25 cm)，在緩衝液A (10%乙腈和0.1%三氟乙酸）内，以2mL/min的流量加以平衡。匯集的凝乳酶所剪切Apo25, Apo26或Apo28尿素下層液，裝載於管柱上。對管柱施以0至60°/◦緩衝液B (95% 乙腈，0.1%三氟乙酸）的線型梯度，洗提Apo AI，使用Apo AI (US Biological，型號A2299-10)做為標準，以供比較來

自Apo25, Apo26和Apo28的剪切生成物。收集19.6,至20.8, (各 0.2’= 0.4 mL)。比較在 214, 254, 280 和 326 nm 的 DAD 微量之相對強度，表示在19.5-21.0,區域内洗提物料，最能代表Apo AI多肽（第45A圖）。與先前注射〇·〇2〇 mL的相同樣品相較，強度峰值亦提高。為了純化Apo25 (油質蛋白-klip8-Apo A^metl)之剪切生成物，從7至25,各收集凝乳酶處理部份@1 mL。主要多肽峰值在20.5,（第45B圖），剛好比所擬hApo AI標準稍後0.2’。為了純化Apo26 (油質蛋白-klip8-Apo AI原(met))之剪切生成物，收集7至25,之部份各1 mL。主要多肽峰值在18,（第45C圖），比所擬hApo AI 標準早2.4。為純化Apo28 (油質蛋白·1<ΐίρ8-Αρο AI原）之剪切生成物，收集7至25’之部份各1 mL。主要多肽峰值在 18’（第45D圖），比所擬hApo AI標準早2·4,，但與Apo26 運轉相似。皙譜測定法質譜係Doug Olson (加拿大國家研究委員會植物生物科 92 200526778 技學院生物分析光譜測定組，Saskatoon, SK )對飛翔 (MALDI-TOF)質譜儀器（美國加州佛斯特市應用生物系统公司）的應用生物系統航行者—DE STR間質協助雷射解吸附電離時間的要求。樣品是使用在30%乙腈/ 7〇〇/。水/ 〇 1%

TFA内飽和的Sinapinic acid間質，點樣在〇pi_T〇F maldi插段（加州佛斯特市應用生物系統公司）上。離子以 +20 kV加速，質量以線型模式檢測，使用馬心肌紅蛋白，做，外部校準符。純化重組成熟Apo25蛋白的電噴電離質譜測疋法’付为子質里28,325 Da，比所計算分子量28,319 Da多 g Da。觀察值與預期值間之差異，可能因樣品有限，導致訊號對雜訊比下降，和準確性降低。成熟Ap0 的預期分子量籲為28，187 Da，但因額外Met殘基存在，剪切之重組成熟Ap〇 AI蛋白的分子量增加。純化的標準μ蛋白亦利質譜測定法分析，在25,969 Da和22,815 Da擁有二分明峰值。、= 二觀^值均比預期值28,187 Da大降；然而，此二主要較低分子量係先前對免疫印跡所觀察。此項分子量降低容易造成人體和重組蛋白的洗提型態稍有不同，如所見。實施例7 紅花的轉剞此項轉型規約與Τ· K· Orlilcowska等人（（1995) Plant Cell，Tissue and Organ Culture 40 : 85-91)綱要相似，但對於· 把S_317轉型和使用ph〇Sphinothricin做為選擇性標誌兩方，:有所修飾和改進。把無損、無破或無病的S—317加州紅化變種的種籽，在0.1% HC〗2内去雜質12分鐘，接著用殺菌水淋洗4-5次。殺菌種籽在1%嚴糖和〇·25% Gdrite之Ms 培養基（Τ· Murashige Τ·和 F Skoog F (1962) Physiol· Plant_ =:473-497)上，於黑暗中發芽。從冷凍甘油存料，在具有抗生素選擇的5毫升AB最少液體培養基内，開始土壌桿菌培養物，在28°C成長48小時。此培養物整份在具有供轉型 93 200526778 選擇的5 ml Luria液體培養基内成長過夜。6—8他的細菌細，用AB培養基洗二次，補充到最後細胞密度〇4

k發芽賴苗除去生長兩天的子葉，浸在製備的土壤桿 i細胞内，平板接中在3%蔗糖、4 μΜ N6_苄基腺嘌呤 (BA)和0.8 μΜ萘乙酸（NAA)之Ms培養基上。板在黑暗狀態下保溫於21°C。三天後，移到具有· mg/L timent^ 的同樣培養基。三天後，把外植體放到添加α5 mg/L phosphinothricin的選擇性培養基上。讓芽繼續抽長，每週把外植體移到無植物激素的MS培養基上，但為kn〇3基礎量的兩倍。把從起始外植體抽長到超過1〇 _的芽切除，在選擇上個別成長。為供生根，把代表虛擬轉基因組織的綠芽放在具有2%蔗糖、10 μΜ f朵丁酸和〇·5 μΜ NAA的MS培養基上。把生根的芽移到排水良好的少土壤混合料，在高濕度和12小時光照下成長。 … 實施例8 此項轉型程序類似J. Dong和A· McHughen (Plant Cell

Reports (1991) 10 ·· 555-560 )、J· Dong 和 A· McHughen (Plant Sciences (1993) 88 : 61_71)以及]Vllynarova 等人 (Plant Cell Reports (1994) 13 : 282-285)的綱要。把無損、無破或無病的亞麻種軒’在70%乙醇溶液内去雜質5一7分鐘’接著在50%漂白液内用Tween 20 (每1〇〇 ml 3—4滴）處理25分鐘，繼續攪拌。種籽以殺菌蒸餾水淋洗5一7次。去雜質的種籽放在洋紅甕内，在具有2%蔗糖和0.3% Gelrite® 的 MS 培養基（τ· Murashige 和 F Skoog (1962) Physiol. Plant. 15 : 473-497)，於光照下發芽。為了轉型，讓土壤桿菌培養物在AB液體培養基内成長過夜，加適當抗生素供選擇。把6 一8 ml過夜細胞洗二次，再懸浮於5 ml AB液體培養基内；把此料2 ml加到98 ml誘導培養基（MS基礎培養基），具有 94 200526778 3，嚴糖、5 μΜ 6-¥胺基嗓呤（BA)和〇25 _ “—苹乙酸（ΝΑΑ)，調節至最後〇〇60〇為1〇。 ’ 體:在製備的土壌桿菌細胞溶液内接種約 till其2巧輕Ϊ攪動板卜2次)。感染期後，從液體 ^種心養基除去外植體，轉印在無g濾紙上。把15—2〇外植體平板接種在_培養板⑽（).7%_凝_導培養基上。用塑膠包裝紙把板密封，在光照狀態（23_24<t )下，把才直，共同培養48小時。二天後，把鮮綠分生組織的外植體移到3 300 ml/L Timentin (預選培養基）的同樣培養基，用塑膠包裝紙包裝。王天後，把培養物移到含1〇 mg/L DL ρρτ的上述培養基（選擇1)。板用Parafllm®包裝，在光照狀態下，保溫於24JC。每二星期移動培養基，保持在此培養基二個 ^為供芽抽長，每二星期把培養物糊洋紅甕⑽選擇培，土 II上（MS基礎培養基，含2%蔗糖，5〇〇 mg/L Mgs緩衝液 ’ 300mg/LTimentin 和 l〇mg/LDLPPT)。苟存選擇的虛擬轉型芽，為深綠色，個別種植於選擇H培養基上，經7二 10天形成強_根。把錄的芽糊姆_^溫室土壤混合物，幼苗用清潔塑膠杯覆蓋，使適應水土。為使成熟，把活潑成長的植物移到1加命蛛，有排水良好的土壤混合物，並在溫室狀況下成長。 a 口雖然本發明已參見目前認為較佳具體例加以說明，惟須知本發明不限於揭示具體例。反之，本發明旨在涵蓋所附申請專利範圍之精神和範圍内包含之各種修飾和等效配置。所有出版物、專利和專利申請案在此均全文列入參考，至一如各出版物、專利或專利申請案均特殊和個別考所列之同樣程度。 4 序列搞要 SEQ ID NO : 1和2分別規定人體Apo Ai原蛋白的核苷酸序列和推衍的胺基酸序列。 95 200526778 SEQ ID NO : 3和4分別規定人體Apo AI Milano蛋白的核苷酸序列和推衍的胺基酸序列。 SEQ ID NO : 5和6分別規定人體Apo AI Paris蛋白的核苷酸序列和推衍的胺基酸序列。 SEQ ID NO : 7和8係表1中所列已知人體載脂蛋白序列。 SEQ ID NO : 9-24係表1中所列已知載脂蛋白八]岸列。 SEQ ID NO ·· 25-34係表1中所列已知載脂蛋白A4V序列。 SEQ ID NO : 35-54係表1中所列已知載脂蛋白ε序列。 SEQ ID NO : 56 規定阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana)硫

氧化還原蛋白之核酸序列。 >，L SEQ ID NO : 57規定可溶性綠螢光蛋白之核酸序列。 SEQIDNO : 58規定PRS訊號序列之胺基酸序列。 SEQ ID NO : 59-116係表3中所列已知油質蛋白油體蛋白序列。 SEQ ID NO : 117-129係表3中所列已知約結合蛋白油體蛋白序列。 SEQ ID NO : 130-137係表3中所列已知固醇結合去氫酵素油體蛋白序列。 SEQ ID NO : 138規定已知阿拉伯芥油質蛋白油體蛋白序 SEQIDNO · 139規定已知油菜籽（Brassicanapus)油質蛋白油體蛋白序列。 ' SEQIDNO : 140規定已之阿拉伯芥鈣結合蛋白油體核酸序列。 SEQIDNO · 141規定已之阿拉伯芥转結合蛋白油體蛋白核酸序列。 200526778 SEQ ID NO : 142規定已知固醇結合去氫酵素油體蛋白核酸序列。 SEQIDNO ·· 143規定klip8剪切序列用之核苷酸序列。 SEQ ID NO : 144和145分別規定ApolO殖系的核苷酸序列和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 146規定前向引物1186之核苦酸序列，與 GFP的5,區相輔，並設計來除去Ncol部位。 SEQ ID NO : 147規定逆向引物1187之核苷酸序列，與 GFP的3’區相輔，其設計是在終止密碼子後，加PstI、Xhol 和Hindlll部位。 SEQ ID NO : 148規定前向引物1190之核苷酸序列，與成熟Apo AI的5’區相輔，其設計是在基因開始加Ncol部位。 SEQ ID NO : 149規定逆向引物1189之核苷酸序列，與成熟Apo AI的5’區相輔，其設計是在除去基因的終止密碼子，並加BamHI部位，以助產生與GFP之框内轉譯融合。 SEQ ID NO : 150和151分別規定Apoll殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 152規定前向引物1191之核苷酸序列，與 Apo AI原之5’區相輔’其設計在於基因開始加Ncol部位。 SEQ ID NO : 153和154分別規定Apol2殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 155和156分別規定Apol3殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 157和158分別規定Apol5殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 159和160分別規定Apol6殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO ·· 161和162分別規定Apol7殖系的核苷酸 200526778 和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 163和164分別規定Apol8殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 165和166分別規定Apol9殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 167規定前向引物1177之核苷酸序列，與 PRS/Apo AI (殖系Apol5)的5’區相輔，其設計在於把在開始密碼子含有BspHI部位的植物預序列（PRS)開始加以放大。 SEQ ID NO : 168規定逆向引物1178之核苷酸序列，與 Apo AI的3’區相輔，其設計在於除去基因的終止密碼子，並加BamHI部位，以助產生與GFP框内轉譯融合。 SEQ ID NO : 169和170分別規定Apo20殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO ·· 171和172分別規定Apo21殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 173規定前向引物1203的核苷酸序列，與 Apo AI的5’區相輔，其設計在於成熟Apo AI開始時加Ncol 部位。 SEQ ID NO : 174規定逆向引物1206的核苷酸序列，與 Apo AI的3’區相輔，其設計在於終止密碼子後加Hindlll部位。 SEQ ID NO : 175和176分別規定Apo22殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 177規定前向引物1201的核苷酸序列，與 Apo AI原的5’區相輔，其設計是在Apo AI原開始加Ncol部位。 SEQ ID NO : 178和179分別規定Apo23殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 98 200526778 SEQ ID NO : 180和181分別規定Apo24殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 182和183分別規定Apo25殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 184和185分別規定Apo26殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 186和187分別規定Apo27殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 188規定前向引物1200的核苷酸序列，與成熟Apo AI的5’區相輔，其設計是在Apo AI原開始時加 Xhol部位，和額外核苷酸以方便框内選殖於klip8剪切序列 · 内。 SEQ ID NO : 189和190分別規定Apo 27M殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 191規定前向引物1202的核苷酸序列，與人體Apo AI的5’區相輔，其設計在將人體Apo AI序列放大，於mat-Apo AI開始加Xhol部位，和額外核普酸，以方便框内選殖於klip8剪切序列内。 SEQ ID NO : 192規定前向引物1225之核苷酸序列係平端引物，使驗基對從C突變至T，把Arg殘基改變為Cys殘 φ 基，因而產生Apo-Milano突變。 SEQ ID NO : 193和194分別規定Apo28殖系之核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 195規定前向引物1205的核苷酸序列，與 Apo All原的5’區相辅，設計成平端引物，加沉默突變，以除去第一 Xhol部位。 SEQ ID NO : 196和197分別規定Apo29殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 198和199分別規定Apo30殖系的核苷酸 99 200526778 和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 200和201分別規定Apo31殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 202和203分別規定Apo32殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 240和205分別規定Apo33殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 206和207分別規定Αρο34殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 208和209分別規定Αρο35殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 210規定逆向引物1208的核苷酸序列，與 Apo AI原的3’區相輔，其設計是在終止密碼子之前加KDEL 序列，並在終止密碼子之後加Hindlll部份。 SEQ ID NO : 211和212分別規定Apo36殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 213和214分別規定Apo37殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 215和216分別規定Apo38殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 217和218分別規定Apo39殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 219規定前向引物1207之核苷酸序列，與 klip8剪切序列之5’區相輔，其設計在將klip8序列開始放大，並在開始密碼子加Sail部位。 SEQ ID NO : 220和221分別規定Apo40殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 222和223分別規定Apo41殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 100 200526778 SEQ ID NO ·· 224和225分別規定Apo42殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO ·· 226和227分別規定Apo43殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 228和229分別規定Apo44殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 230和231分別規定Apo45殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 232和233分別規定Apo46殖系的核苷酸和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 234和235分別規定Apo47殖系的核苷酸鲁和推衍胺基酸序列。 SEQ ID NO : 236規定前向引物1226的核苷酸序列，與玉米油酸蛋白序列的5’區相輔，其設計在於把玉米油酸蛋白序列放大，並在開始密碼子加Ncol部位。 SEQ ID NO · 237規定前向引物1227的核苦酸序列，與玉米油酸蛋白序列的3’區相輔，其設計在於把玉米油酸蛋白放大，除去基因的終止密碼子，並加Hindlll，以助產生與 klip8 / mat Apo AI的框内轉譯融合。 SEQ ID NO : 238規定前向引物1228的核苷酸序列，與鲁 Apo25殖系的5’區相輔，其設計在於把Ap〇25序列放大，並於開始密碼子加Sail部位。 SEQ ID NO ·· 239規定逆向引物1229的核苷酸序列，與 Apo25殖系的3’區相輔，其設計在於把Ap〇25序列放大，並於終止密碼子之後加BamHI部位。 SEQIDNO : 240規定單鏈油體D9scFv的胺基酸序列。 101 200526778 表1 ··已知載脂蛋白序列之例 SEQUENCE ID· NO. η------— 載脂蛋白源（編號）載脂蛋白Α·Ι 1 Human (NM 000039, BC005380, J00098, M11791, M27875, M29068, X00566, X01038, X02162, X07496) 9 Danio redo (NP 571203) 10 Rattus norvegicus (P04639) 11 Bos taurus (P15497) 12 Mus musculus (Q00623) 13 Ovis aries (AAB57840) 14 Sus scrofa (P18648) 15 Cyprinus carpio (CAC34942) 16 Gallus gallus (AAA48593) 17 Oryctolagus cuniculus (P09809) 18 Macaca fascicularis (P15568) 19 Cotumix japonica (P32918) 20 Canis familiaris 〇P02648) 21 Tupaia belangeri (018759) 22 Anas platyrhynchos (042296) 23 Papio anubis (AAA35380) 24 Macaca mulatto (P14417) 載脂蛋白A-IV 7 Human (NM 0000482, J02758, M10373, M13654, M14566, M14642, X13629, P0672) 25 Rattus norvegicus (AAA85909) 26 Mus musculus (P06728) 27 Mus musculus castaneus (AAA37216) 28 Sus scrofa (046409) 29 Papio anubis (Q28758) 30 Macaca fascicularis (P33621) 31 Pan troglodytes (154248) 32 Papio sp. (A47141) 33 Gillichthys mirabilis (AAG13299) 34 Oryctolagus cuniculus (AAB34783) 載脂蛋白A-V 241 Mus musculus (NM__080434) 102 200526778 242 Rattus norvegicus (NM_080576) 243 Homo sapiens (NP一443200) 244 Mus musculus (BC011198) 245 Homo sapiens (AY555191) 246 Homo sapiens (AY422949) 247 Mus musculus (AF327059) 248 Homo sapiens (AF202890) 249 Homo sapiens (AF202889) 250 Rattus norvegicus (AF202888) 251 Rattus norvegicus (AF202887) 載脂蛋白E 8 Human (NM 000041, AF050154, AF261279, BC003557, K00396, M10065, M12529, X00199, X92000, Z70760) 35 Rattus norvegicus (P02650) 36 Danio rerio (042364) 37 Bos Taurus (Q03247) 38 Mus musculus (P08226) 39 Canis familiaris (P18649) 40 Saimiri sciureus (Q28995) 41 Macaca mulatto (Q28502) 42 Sus scrofa (P18650) 43 Oryctolagus cuniculus (P18287) 44 Papio anubis (P05770) 45 Macaca fascicularis (P10517) 46 Cavia porcellus (P23529) 47 Zalophus californianus (JC5566) 48 Ovis sp. QC6549) 49 Pongo pygmaeus (AAG28580) 50 Hylobates lar (AAG28581) 51 Gorilla gorilla (AAG28579) 52 Pan troglodytes (AAG28578) 53 Tupaia glis (AAG21401) 54 Oncorhynchus mykiss (CAB65320) 55 Scophthalmus maximus (CAB65356)

103 200526778 表2 :已知載脂蛋白突變和變化例點突變蛋白突變參考 Apo AI Glul98Lys Strobl W et al., Pediatr Res. 1988 Aug;24(2):222-8 Apo AI Gly26Arg Vigushin DM et al. Q J Med. 1994 Mar;87(3):149-54 Apo AI Leu60Arg Soutar AK et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Aug 15;89(16):7389-93 Apo AI Vall56Glu Cho KH and Jonas A. J Biol Qiem. 2000 Sep l;275(35):26821-7 Apo AI Baltimore ArglOLeu Ladias JA et al., Hum Genet 1990 Apr;84(5):439-45 Apo AI Giessen Prol43Arg Utermann G et al., Eur J Biochem. 1984 Oct 15;144(2):325-31 Apo AI Fukuoka GlullOLys Takada Y et al., Biochim Biophys Acta. 1990 Apr 2;1043(2):169-76. Apo AI Fin Argl59Leu Miettinen HE et al. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1997 Jan;17(l):83-90 Apo AI Milano Argl73Cys Cheung MC et al·, Biochim Biophys Acta. 1988 May 2;960(l):73-82 Apo AI Paris Argl51Cys Bruckert E et al., Atherosclerosis. 1997 Jan3;128(l):121-8 Apo AV Vall53Met Cysl85Gly Hubacek et al. Physiol. Res. 2004. 53:225-228 Apo AV Thrl31Cys Serl9Trp Hubacek et al. Clin. Genet. 2004. 65: 126-130 Apo E Argl36Cys Hubacek JA et al. Physiol Res. 2002;51(l):107-8 Apo E*5 Gln204Lys, Cysll2Arg, or Glu212Lys Scacchi R. et al. Hum Biol. 2003 Apr;75⑵:293-300; Feussner et al., J Lipid Res. 1996 Aug;37(8):1632-45 Apo El Lysl46Glu Mann WA et al., J Qin Invest 1995 Aug;96(2):1100-7 Apo E2 Argl36Cys Feussner G. et al. Eur J Clin Invest 1996 Jan;26 ⑴:13-23 Apo E2 Argl42Leu Richard P et al. Atherosclerosis. 1995 Jan 6;112(l):19-28

104 200526778

Apo E2 Arg25Cys Matsunaga et al. Kidney Int. 1999 Aug;56(2):421-7 Apo E2 Lysl46Gln Smit M et al., J Lipid Res. 1990 Jan;31(l):45-53 Apo E2 Christchurch Argl36Ser Wardell MR et al. J Clin Invest. 1987 Aug;80(2):483«90. Apo E3 Argl36Cys Walden CC et al. J Qin Endocrinol Metab. 1994 Mar;78(3):699-704 Apo E3 Argl36His Minnich A et al. J Lipid Res. 1995 Jan;36(l):57-66. Apo E5-Frankfurt Gln81Lys, Cysll2Arg Ruzicka V et al. Electrophoresis. 1993 Oct;14(10):1032-7 缺失突變蛋白突變參考 Apo AI nichinan Glu235 deletion Han et al. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1999 Jun;19(6):1447-55 Apo AI Lys 107 deletion Amarzguioui M et el. Biochem Biophys Res Commun. 1998 Jan 26;242⑶ 534-9 移碼突變蛋白突變參考 Apo AI Sasebo partial gene duplication, tandem repeat of bases 333 to 355 from the 5’end of exon 4 resulting with premature termination after amino acid 207 Moriyama K et al. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1996 Dec;16(12):1416-23 化學突變蛋白突變參考 Apo AI sulfoxidized Met-112 and Met-148 residues and the corresponding reduced form Jonas A et al· TBiochim Biophys Acta. 1993 Feb 24;1166(2-3):202-10 105 200526778 表3:已知油體蛋白序列例

SEQ. ID NO· 油體蛋白模體 (胺基酸序列識別符） {核酸序列識別符} 油質蛋白 59 (A84654) Arabidopsis thaliana probable oleosin 60 (AAA87295) Arabidopsis thaliana oleosin {Gene L40954} 61 (AAC42242) Arabidopsis thaliana oleosin {Gene AC005395} 62 (AAF01542) Arabidopsis thaliana putative oleosin {Gene AC009325} 63 (AAF69712) Arabidopsis thaliana F27J15.22 {Gene AC016041} 64 (AAK96731) Arabidopsis thaliana oleosin-like protein {Gene AY054540} 65 (AAL14385) Arabidopsis thaliana AT5g40420/MP012_130 oleosin isoform {GeneAY057590} 66 (AAL24418) Arabidopsis thaliana putative oleosin {Gene AY059936} 67 (AAL47366) Arabidopsis thaliana oleosin-like protein {Gene AY064657} 68 (AAM10217) Arabidopsis thaliana putative oleosin {Gene AY081655} 69 (AAM47319) Arabidopsis thaliana AT5g40420/MP012J30 oleosin isoform {Gene AY113011} 70 (AAM63098) Arabidopsis thaliana oleosin isoform {Gene AY085886} 71 (AA022633) Arabidopsis thaliana putative oleosin {Gene BT002813} 72 (AA022794) Arabidopsis thaliana putative oleosin protein {Gene BT002985} 73 (AAO42120) Arabidopsis thaliana putative oleosin {Gene BT004094} 74 (AAO50491) Arabidopsis thaliana putative oleosin {Gene BT004958} 75 (AA063989) Arabidopsis thaliana putative oleosin {Gene BT005569} 76 (AAQ56108) Arabidopsis lyrata subsp. Lyrata Oleosin. {Gene AY292860} 77 (BAA97384) Arabidopsis thaliana oleosin-like {Gene AB023044} 78 (BAB02690) Arabidopsis thaliana oleosin-like protein {Gene AB018114} 79 (BAB11599) Arabidopsis thaliana oleosin, isoform 21K {Gene AB006702} 80 (BAC42839) Arabidopsis thaliana putative oleosin protein {Gene AK118217} 81 (CAA44225) Arabidopsis thaliana oleosin {Gene X62353} 82 (CAA63011) Arabidopsis thaliana oleosin, type 4 {Gene X91918} 83 (CAA63022) Arabidopsis thaliana oleosin, type 2 {Gene X91956} 84 (CAA90877) Arabidopsis thaliana oleosin {Gene Z54164} 85 (CAA90878) Arabidopsis thaliana oleosin {Gene Z54165} 86 (CAB36756) Arabidopsis thaliana oleosin, 18.5 K {Gene AL035523} 87 (CAB79423) Arabidopsis thaliana oleosin, 18.5 K {Gene AL161562} 88 (CAB87945) Arabidopsis thaliana oleosin-like protein {Gene AL163912} 89 (P29525) Arabidopsis thaliana oleosin 18.5 kDa {Gene X62353, CAA44225, AL035523, CAB36756, CAB36756, CAB79423, Z17738, S22538} 106 200526778

90 (Q39165) Arabidopsis thaliana Oleosin 21.2 kDa (Oleosin type 2). {Gene L40954, AAA87295, X91956, CAA63022, Z17657, AB006702, BAB11599, AY057590, AAL14385, S71253 91 (Q42431) Arabidopsis thaliana Oleosin 20.3 kDa (Oleosin type 4) {Gene Z54164, CAA90877, X91918, CAA63011, AB018114, BAB02690, AY054540, AAK96731, AY064657, AAL47366, AY085886, AAM63098, Z27260, Z29859, S71286 92 (Q43284) Arabidopsis thaliana Oleosin 14.9 kDa. {Gene Z54165, CAA90878, AB023044, BAA97384, Z27008, CAA81561} 93 (S22538) Arabidopsis thaliana oleosin, 18.5 K 94 (S71253) Arabidopsis thaliana oleosin, 21 K 95 (S71286) Arabidopsis thaliana oleosin, 20 K 96 (T49895) Arabidopsis thaliana oleosin-like protein 97 (AAB22218) Brassica napus oleosin napll 98 (AAD24547) Brassica oleracea oleosin 99 (CAA43941) Brassica napus oleosin BN-ΠΙ {Gene X63779} 100 (CAA45313) Brassica napus oleosin BN-V {Gene X63779} 101 (P29109) Brassica napus Oleosin Bn-V (BnV) {Gene X63779, CAA45313, S25089) 102 (P29110) Brassica napus Oleosin Βη-ΙΠ (ΒηΠΙ) {Gene X61937, CAA43941, S22475) 103 (P29111) Brassica napus Major oleosin NAP-Π {Gene X58000, CAA41064, S70915) 104 (S22475) Brassica napus oleosin ΒΝ-ΙΠ 105 (S50195) Brassica napus Oleosin 106 (T08134) Brassica napus Oleosin-like 107 (AAB01098) Daucus carota oleosin 108 (T14307) carrot oleosin 109 (A35040) Zea mays oleosin 18 110 (ΑΑΑ67699)Ζββ mays oleosin KD18 {Gene J05212} 111 (AAA68065) Zea mays 16 kDa oleosin {Gene U13701} 112 (AAA68066) Zea mays 17 kDa oleosin {Gene U13702} 113 (P13436) Zea mays OLEOSIN ZM-I (OLEOSIN 16 KD) (LIPID BODY-ASSOCIATED MAJOR PROTEIN) {Gene U13701, AAA68065, M17225, AAA33481, A29788} 114 (P21641) Zea mays Oleosin Zm-Π (Oleosin 18 kDa) (Lipid body-associated protein L2) {Gene J05212, AAA67699, A35040} 115 (S52029) Zea mays oleosin 16 116 (S52030) Zea mays oleosin 17 鈣結合蛋白 117 (XP_467656) putative caleosin [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]. 107 200526778 118 (BAD16161) putative caleosin [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]. {Gene AP005319} 119 (NP_973892) caleosin-related family protein [Arabidopsis thaliana].{Gene I NM_202163} 120 (NP_564996) caleosin-related family protein [Arabidopsis thaliana].{Gene NM—105736} 121 (NP__564995) caleosin-related family protein [Arabidopsis thaliana}{Gene NM一105735} 122 (NP_200335) caleosin-related family protein / embryo-specific protein, putative [Arabidopsis thaliana]. {Gene NM_124906} 123 (NP_173739) caleosin-related [Arabidopsis thaliana].{Gene NM__102174} 124 (NPJ73738) caleosin-related family protein [Arabidopsis thaliana]{Gene NM_102173} 125 (AAQ74240) caleosin 2 [Hordeum vulgare].{Gene AY370892} 126 (AAQ74239) caleosin 2 [Hordeum vulgare].{Gene AY370891} 127 (AAQ74238) caleosin 1 [Hordeum vulgare].{Gene AY370890} 128 (AAQ74237) caleosin 1 [Hordeum vulgare].{Gene AY370889} 129 (AAF13743) caleosin [Sesamum indicum].{Gene AF109921} 固醇結合去氫酵素 130 (XP_465935) putative steroleosin [Oryza sativa (japonica cultivar-group)]. {GeneXM^465935} 131 (XP_465933) putative steroleosin [Oryza sativa (japonica cultivar-group)].{Gene XM^.465933} 132 (AAT77030) putative steroleosin-B [Oryza sativa (japonica cultivar-group)].{Gene AC096856} 133 (BAD23084) putative steroleosin [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] {GeneAP004861} 134 (BAD23082) putative steroleosin [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] {Gene AP004861} 135 (AAM46847) steroleosin-B [Sesamum indicum]. {Gene AF498264} 136 (AAL13315) steroleosin [Sesamum indicum]. {Gene AF421889} 137 (AAL09328) steroleosin [Sesamum indicum]. {Gene AF302806}

108 200526778 【圖式簡單說明】第1圖(A)為人類載脂蛋白A-I (Apo AI)的核苷酸序列 (SEQ ED NO : 1)和推衍胺基酸序列（SEQ ED NO : 2)(感謝 Dr· Norman Wong，Calgary Alberta 提供）（編號 NM—000039)。黑體殘基代表前序列訊號肽，劃線殘基表示序列原。（B)為天然變種Apo AIMilan。（R173C)的核苷酸序列 (SEQ ID NO : 3)和推衍胺基酸序列（SEQ ID NO : 4)。黑體/斜體殘基代表突變胺基酸。（C)為天然變種Apo AI Paries (R151C)的核苦酸序列（SEQ Π3 NO ·· 5)和推衍胺基酸序列（SEQ ID NO : 6)。黑體/斜體殘基代表突變胺基酸。第2圖簡單圖示在阿拉伯芥轉基因植物中為載脂蛋白 ⑩

Apo AI表現而產生的全部雙構造物。（a)構造物標定於植物細胞内之胞質溶液。（B)構造物標定於植物細胞内之油體。（〇βΕ) 構造物標定於分泌通路。（D和Ε)構造物含保留在内質網内的另外KDEL序列。（Q構造物含Αρο μ前序列或成熟Αρ〇 AI。（Ε)構造物含可剪切序列，供釋出Αρ〇 ΑΙ原或成熟Αρ〇 AI。圖例說明各構造物内所含啟動子類型、訊號肽和寫碼序列。第3(A)圖簡略圖示Apo AI-GFP轉譯融合構造物内所用 GFP寫碼區之選殖策略。第3(B)圖簡略圖示Apo AI原和成熟寫碼區以及種軒特異馨性Apo ΑΙ-GFP轉譯融合構造物之選殖策略。 /' 第3(C)圖簡略圖示產生雙載體之選殖策略，用於將Ap〇 AI^GFP之種籽特異性胞質溶液和油體為基礎的標定所用土壤桿菌EHAiy細胞轉型，Ap〇l〇和Apoll分別含有標定於胞質洛液之成熟和原型Apo ΑΙ-GFP。Apol2和Apol3分別含有標定於油體之原型和成熟Apo AKJFP轉譯融合。第3(D)圖簡略表示產生雙載體之選殖策略，用於將細 ΑΙ-GFP之種籽特異性分泌通路標定所用土壤桿菌eha細 109 200526778 胞轉型。ΑΡο15和Apol6分別含有標定於分泌通路孰原型Apo AI-GFP轉譯融合。第4(A)圖簡略圖示產生雙载體之選殖策略，用於將 AI-GFP組成型胞質溶液標定用之土壤桿菌EHA1〇1細胞轉型。第4⑼圖簡略圖# Apo AI-GFP組成型胞質溶液標定之選殖策略，AP〇18b含有標定於胞質溶液之Ap〇 AI原―GFp 轉譯融合。第5(A)圖簡略圖示Apo AI原、型和成熟寫碼區之選殖策略，以及ApoAI-GFP轉譯融合蛋白之組成型表現。第5(B)圖簡略圖示產生雙載體之選殖策略，用於將Ap〇 AI-GFP組成型分泌通路標定用之土壤桿菌EHA1〇1細胞轉型。AP〇19和AP〇20分別含有標定於分泌通路的成熟和原型 ApoAI_GFP轉譯融合。第6圖簡略圖示成熟型Apo AI寫碼區之選殖策略。 Apo21供種軒特異性標定於胞質溶液，Ap〇23供種籽特異性標定於油體，Ap〇25供種籽特異性標定於油體，並以剪^刀系列klip8和Apo29純化，供種籽特異性標定於分泌通路。

第7圖簡略圖示原型Apo AI寫碼區之選殖策略。Apo22 供種籽特異性標定於胞質溶液，Ap〇24供種軒特異性標定於油體。Ap〇30供種籽特異性標定於分泌通路，而Ap〇26供種籽特異性標定於油體，並以剪切序列klip加以純化。第8(A)圖簡略圖示除去内部部位，並含有kdel 訊號肽的Apo AI原型寫碼區之選殖策略。Ap〇27供種籽特異性標定於油體，做為與油質蛋白之框内融合。Αρ〇31和 Apo35二者均標定於分泌通路，Ap〇31和Apo35與油質蛋白抗體D9框内融合，Apo35因KDEL訊號肽而累積於内質網0 第8(B)圖簡略圖示原型Apo AIMilan。寫碼區之寫碼策略。 110 200526778

Apo27M供Apo AIMilan。種籽特異性標定於油體，做為鱼油皙蛋白框内融合。〃貝第9圖簡略圖示除去内部灿〇1部位的原型Ap〇 A〗寫碼區之選殖策略。Apo28標定於油體且可在klip8序列剪切，把

Apo AI標定於分泌通路之Ap〇32框内融合於油質蛋白抗 D9。第10圖簡略圖示原型和成熟型Apo AI寫碼區之選殖策略’除去内部Xh〇I部位，在寫碼區開始含有另外Met殘基。Apo34 (Apo AI原）和Apo33 (成熟Apo AI)標定於分泌通路，並與油質蛋白抗體D9框内融合。第11圖簡略圖示原型Apo AI寫碼區之選殖策略，内部鲁 Xhol部位含有KDEL訊號肽。Apo36標定於分泌通路，並與油質蛋白抗體D9框内融合，因KDEL訊號肽而累積於内/質網。、第12圖簡略圖示原型和成熟型Apo AI寫碼區之選殖策略’除去内部Xhol部份，含有在寫碼區開始的另外Met殘基’以及KDEL訊號肽。Apo38和Apo37標定於分泌通路，且與油質蛋白抗體D9框内融合，因KDEL訊號肽而累積於内質網。、、第13圖簡略圖示原型和成熟型Apo AI寫碼區以及蛋白酶剪切部位之選殖策略。Ap〇43，Ap〇44，Ap〇39和Ap〇4〇標定鲁於分泌通路，與油質蛋白抗體D9框内融合。Apo43和 Apo44因KDEL訊號肽而累積於内質網。苐14圖簡略圖示在寫碼區開始含有另外Met殘基的原型和成熟型Apo AI寫碼區和蛋白酶剪切部位之選殖策略。 Apo42，Apo46，Apo41和Apo45標定於分泌通路，與油質蛋白抗體D9框内融合。Apo46和Apo45因KDEL訊號肽而累積於内質網。、弟15圖簡略圖示在寫碼區開始含有另外Met殘基的成熟 111 200526778 型Apo AI寫碼區和蛋白酶剪切部位之選殖策略。却與玉米油質蛋白框内融合，供標定於油體。第16圖為具有多株Ap〇 AI抗體的全葉蛋白(A) (25pg) 和全種籽蛋白(B) (5〇pg)之蛋白質印跡。Ap〇17係ubi-mat_ Apo AI-GFP構造物。c24葉（25jLlg)和種籽蛋白（5〇飓）用做負面對照，而〇.5咫人體血清蛋白用做正面對照。第17圖為具有多株Ap〇 AI抗體的全葉蛋白(a) (25pg) 和全種軒蛋白(B) (50pg)之蛋白質印跡。Ap〇18係ubi-Ap〇 AI原-GFP構造物。c24葉（25μ§)和種籽蛋白（5〇昭）用做負面對照，而〇.5pg人體血清蛋白用做正面對照。

第18圖為具有多株Ap〇 AI抗體的全葉蛋白(A) (25pg) 和全種籽蛋白⑼（5〇pg)之蛋白質印跡。Ap〇19為也_ n^Apo AI-GFP構造物。c24葉（25呢）和種籽蛋白 (5〇pg)用做負面對照，而〇 5咫人體血清蛋白用做正面對照0 第19圖為具有多株Apo…抗體的全葉蛋白(A) (25咫) 和全種籽蛋白(B) (5〇pg)之蛋白質印跡。Ap〇2〇為咖士处 Apo A^、_GFP構造物。c24葉（25μ§)和種軒蛋白（5〇呢) 用做負面對照’而G#g人體血清蛋白舰正面對照。

第2〇圖為具有多株GFP抗體的全種籽蛋白（SOpg) ^ 蛋白質印跡。（A)Apol〇為pha_mat-Ap〇…心卯構造物c (^)Apoll為pha-Apo μ原_GFp構造物。種籽蛋g 用做負面對照’而2〇〇 ng純化GFP蛋白用做正3 對照。第21圖為具有多株GFp抗體的全種籽蛋白〇 ^ 蛋白質印跡。⑷細12為Pha_&f蛋自_mat_APG AI_GFP f (B)Apol3為pha_油質蛋白部j μ原_GFp構造物c c24種軒蛋白（5〇μ§)用做負面對照，而·⑼純化〇白用做正面對照。 112 200526778 第22圖為具有多株GFP抗體的全種籽蛋白（5〇飓）之蛋白質印跡。〇\)Apol5 為 pha-PRS_mat_Ap〇 AI-GFP 構造物。（B)Apol6 為 pha-PRS-Apo AI 原-GFP 構造物。c24 種籽蛋白（50μ§)用做負面對照，而200 ng純化GFp蛋白用做正面對照。第23圖為具有多株Apo AI抗體的全種籽蛋白（5〇阳）之蛋白質印跡。（A)Apo21 為 pha-mat-Apo AI。（B)Ap〇22 為 pha-Apo AI原。c24種籽蛋白（50飓）用做負面對照，而〇.5Pg人體血清蛋白用做正面對照。第24圖為具有多株Apo AI抗體的全種籽蛋白（5〇昭）之蛋白質印跡。（A)Ap〇23 為 pha-oleomat-Apo AI。⑹Αρο24 為pha-oleo-Apo ΑΙ原。c24種軒蛋白（5〇gg)用做負面對照，而0.5pg人體血清蛋白用做正面對照。第25圖為具有多株Apo AI抗體的全種籽蛋白（5〇昭）之蛋白質印跡。（A)AP〇25為pha-〇leo七岭mat_Ap〇 AI(+Met卜（Β)Αρο2ό 為 pha-ole〇-klip8_Apo AI 原(+Met) 〇 c24 種籽蛋白（50pg)用做負面對照，而〇·5μ§人體血清蛋白用做正面對照。第26圖為具有多株Αρο ΑΙ抗體的全種籽蛋白（5〇咫）之蛋白質印跡。（Α)Αρο28為pha_〇leo七iip8_Ap〇 μ原。 (Β)Αρο29 為 pha-PRS-mat-Apo ΑΙ。C24 種籽蛋白（5〇吨)、用做負面對照，而〇.5pg人體血清蛋白用做正面對照。第27圖係具有多株Apo AI抗體的全種籽蛋白（5叫g) 之蛋白質印跡。（A)Apo30為pha-PRS-Apo AI原。C24種籽蛋白（50pg)用做負面對照，而〇.5pg人體血清蛋白用做正面對照。第28圖係具有多株Apo AI抗體的全種軒蛋白（5〇呢）之蛋白質印跡。（A)Apo32 為 pha-PRS-D9 scFv-Apo AI 原。 (Β)Αρ〇33 為 pha-PRS_D9 scFv_mat-Apo AI(+met)。c24 種穿子蛋 200526778 白（5〇pg)用做負面對照，而〇.5pg人體血清蛋白用做正面對照。第29圖係具有多株Apo AI抗體的全種籽蛋白（5〇邶）之蛋白質印跡。（A)Apo34 為 pha-PRS-D9 scFv_Apo AI 原 (+met) ° 第30圖係具有多株Apo AI抗體的全種籽蛋白（5〇呢）之蛋白質印跡。（A)Apo36 為 pha-PRS_D9 scFv-Apo AI 原- KDEL ° (B)Apo37 為 pha-PRS_D9 scFv_mat_Ap〇 AI(+met> KDEL。C24種籽蛋白（50pg)用做負面對照，而a5|ug人體血清蛋白用做正面對照。第31圖係具有多株Apo AI抗體的全種籽蛋白（5〇|Llg) 之蛋白質印跡。（A)Apo38 為 pha-PRS-D9 scFv_Ap〇 AI 原 (+met)_KDEL。c24種籽蛋白（5〇pg)用做負面對照，而〇.5pg人體血清蛋白用做正面對照。（B)Ap〇29為pha_pRS D9 scFv-KLIP8-Apo AI。野生型種籽用做負面對照，而得自正常人體血漿（US Bi〇l〇gicais)的3呢人體Ap〇 AI用做正面對照。

第32圖係具有多株Apo AI抗體的全種籽蛋白（5〇呢）之蛋白質印跡。（A)Ap〇40 為 Pha-PRS-D9 SCFV-klip8_Apo AI 原。（B)Apo41 為 pha-PRS-D9 scFv-klip8-Ap〇 AI(+met)。c24 種籽蛋白（50pg)用做負面對照，而〇.5gg人體血清蛋白用做正面對照。第33圖係具有多株Ap〇 AI抗體的全種籽蛋白（5〇JLlg) 之蛋白質印跡。（A)AP〇42 為 Pha-PRS-D9 scFV-kiip8_Apo AI 原(+met)。c24種籽蛋白（5〇|Llg)用做負面對照，而〇·5阳人體血^清蛋白用做正面對照。第34圖係具有多株Αρ〇 ΑΙ抗體的全種籽蛋白（5〇Jig) 200526778 之蛋白質印跡。（A)Ap〇44 為 pha-PRS-D9 scFv-klip8-Apo AI 原-KDEL。（B)Apo45 為 pha-PRS-D9 scFv-klip8-mat-Apo f (+met)。c24種籽蛋白（50μ§)用做負面對照，而〇5咫人體血清蛋白用做正面對照。第35圖係具有多株Αρ〇 ΑΙ抗體的全種籽蛋白（5〇JLlg) 之蛋白質印跡。（A)AP〇46 為 pha-PRS-D9 scFv-klip8_Apo AI 原(+met)-KDEL。c24種籽蛋白（5〇咫）用做負面對照，而人體血清蛋白用做正面對照。

第36圖係檢驗與種籽特異性細胞部份關聯的未標定和油，標定Apo AI-GFP。使用多株Apo aj抗體以及從水相 ^AQ)部份單離的大約等量總蛋白（5〇JLlg)、油體之磷酸塩 (PW)和尿素（UW)洗液（分別為p〇和u〇，大約2〇略的，用總油體），以及取自成熟種籽的微粒體（ER)部份，進行蛋白質印跡分析。免疫印跡的P〇nceau-S染色，顯示加載於凝膠上之相對蛋白量（上半圖）。人體血清（〇5飓）用做Apo AI表現之正面對照。（A)Ap〇1〇為Ap〇 m gfp。 AP〇ll 為 Apo AI 原 _GFP。（B)Apol2 為油質蛋白-Apo AI-GFP’而Ap〇13為油質蛋白-ΑροΑΙ原-GFP。

^第37圖係檢驗與種籽特異性細胞部份關聯的分泌原型和成熟型Apo AI_GFP。使用抗Αρο ΑΙ抗體以及從水相（Aq) 部份單離的大約等量總蛋白（50咫）、油體的磷酸塩（pw) 素（UW)洗液（p〇和u〇分別大約20pg的總油體蛋白）’以及取自成熟種籽的微粒體（ER)部份，進行蛋白質 I7跡刀析。免疫印跡的p〇nceau-S染色，顯示加載於凝膠上之相對蛋白量（上半圖）。人體血清（〇.5jIg)用做Ap〇八1表現的正面對照。Apol5 為 PRS-Apo AI-GFP。Apol6 為 PRS-ApoAI 原第38圖係葉内Apo AI-GFP轉譯融合構造物之組成型表現。使用抗GFP抗體以及從葉單離的大約等量總蛋白 115 200526778 (50μ§)進行蛋白質印跡分析。免疫印跡之p〇nceau_s染色，表示加載於凝膠上之相對蛋白量（上半圖）。野生型 (c24)植物用做GFP表現的負面對照。純化gfp蛋白（2〇〇 ng)用做GFP之正面對照。包含UG-14和UR2做為葉中累積的GFP蛋白之正面對照。預期質量如下·· Ap〇17 = 554 kDa ; Apol8 = 56.4 kDa ; Αρο19 = 58·3 kDa ; Apo20 = 59.3 kDa ; UG，14=26.8 kDa ; UR2=50 kDa。苐39圖係種軒内未標定而分泌Ap〇 AI的種籽特異性表現。使用抗Apo AI抗體以及從成型種籽單離的大約等量總蛋白（50pg)進行蛋白質印跡分析。免疫印跡之p〇nceau_s染色，表示加載於凝膠上之相對蛋白量（上半圖）。野生型眷 (c24 )植物用做Apo AI表現的負面對照。人體血清 (〇.5pg)用做Apo AI表現的正面對照。預期質量如下： Apo21=28.3 kDa ； Apo22=39.32 kDa ； Apo23=46.9 kDa ；

Apo24 = 47.8 kDa ； Apo25 = 51.5 kDa ； Apo26 = 52.5 kDa ；

Apo27 —51.3 kDa ； Apo28 = 52.3 kDa ； Apo29 = 31.3 kDa ；

Apo30=32.2 kDa 〇 “第40圖係檢驗Αρο22·3 (未標定Apo AI原）T3世代種籽^亞細胞部份。使用抗Ap〇 A!抗體以及從水相（Aq)部份單離的大約等量總蛋白（5〇飓）、取自成熟種籽的油體之酸塩（PW)和尿素（UW)洗液（PO和UO，分別大約 _ 20pg的所用總油體）。免疫印跡之p〇nceau-S染色顯示凝膠上所加載相對蛋白量（上半圖）。人體血清（〇5jag)用做〇 AI表^之正面對照。分子量大小列在左侧。第41圖係以尼羅紅染色的後期子葉階段胚細胞内所表現 Apo AI-GFP種籽特異性構造物之同焦點顯微照片。（八_ C)Apol〇為融合於GFp的未標定成熟Ap〇 w。（D f)Amu 為融合於^FP的未财Apo AI原。（G_I)Apol2為融合於 GFP的成熟ΑροΑΙ，使用油質蛋白標定於油體。（1攔）綠波 116 200526778 道H 3攔）合併波道。條線y H®細尼羅紅純的後脏葉階段胚 Apo ΑΙ-GFP種軒特显料m“A 也門所表現 γλα η也-二哥”生構、物之同焦點顯微照片。（A-0^)013為融合於GFP的Αρ〇 μ原^‘ 油體。㈣Α_為融合於GFp的成熟Αρ〇 5蛋^苡 H (G-I)AP016為融合於GFP的Αρ0 Μ原，標定於& 綠波道。（2搁）紅波道。（3攔）合併波道。條線= 5μπι。第43圖係以尼羅紅染色的後期子葉階段胚細胞内組成型表現未標定而分泌AP〇AI_GFP融合蛋白之同焦點顯微日召片。 (A-C)AP〇17為融合於GFP之未標定成熟Ap〇 w。（d_ F)Apol8為融合於GFP的未標定Apo AI原。（G-H)Apol9為融合於GFP之成熟Apo AI，標定於分泌通路。（J_L)Ap〇2〇為融合於GFP之Apo AI原，標定於分泌通路。ο攔）綠波道。（2攔）紅波道。(3欄）合併波道。條線彳第44圖係在葉表皮細胞内所表現Ap〇 ΑΙ-GFP組成型構造物之同焦點顯微照片。（A-C)Apol7為融合於GFP的未標定成熟Apo AI。（D_F)Apol8為融合於GFP之未標定Ap〇 ^ 原。（G-H)Apol9為融合於GFP之成熟Apo AI，標定於分泌通路。（J_L)Apo20為融合於GFP之Apo AI原，標定於分泌通路。（1欄）綠波道。（2欄）紅波道。（3攔）合併波道。條線= 5μηι。第45圖係Αρο25，Αρο26和Αρο28利用反相層析法純化。（Α)Αρο ΑΙ 標準之 HPLC 痕跡。（Β)Αρο25 之 HPLC 痕跡。（C)Apo26 之 HPLC 痕跡。（D)Apo28 之 HPLC 痕跡。所用個別波長包含214,254,280和326 nm。 m 200526778 【主要元件符號說明】現而產生的全ί雙^:轉為u白—w表疋於为泌通路。（D和E)構造物可含保留在内質網内的另^ KDEL序列。（〇構造物含Apo A!前序列或成熟Ap〇 aj。構造物含可剪切序列，供釋出Apo AI原或成熟Ap〇 AI。圖例說明各構造物内所含啟動子類型、訊號肽和寫碼序列。

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Claims

200526778 h、申請專利範圍： 1· 一種植物中載脂蛋白之表現方法，包括： (a) 提供嵌合核酸構造物，在5,至3,轉錄方向操作上連接成份： ①能夠控制植物細胞表現之核酸序列；和 (ii)將截脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列； (b) 把嵌合核酸引進到植物細胞内；以及 (C)讓植物細胞成長為能夠結籽之成熟植物，其中植物表現載脂蛋白者。 2.如申請專概圍第1項之方法，其帽合核基因組整合狀況下，引進人植物細軸者。係在 3·如申請專利範圍第1或2項之方法，1由種籽細胞者。 x項之方法’其中该植物細胞係 4·如申請專利範圍第卜2《3項之方在植物細胞内表現的核酸序列，係種㈣勢啟動子控制 5.如中請專利範圍第4項之方法，其巾種籽優蛋白驗（phaseolin)啟動子者。動子係 6·如申請專利顧第i或2項之物細胞内表現的核酸序列，係組成型啟/者^夠控制在植 7.如申請專利範圍第6項之方法，甘泛蛋白啟動子者。去其中该組成型啟動子係 8·如申請專利範圍第1項之方、本甘丄山人 ==以=框連接於將载脂蛋 9.如申請專利範圍第8項之方味< 特異性者。去，其中鉍定型多肽係植物 10·如申請專利範圍第8項植物特異性者。 <方法，其中穩定型多肽係非 11.如申請專利範圍第9項之心万去，其中該植物特異性穩定 1】9 200526778 自包含油質蛋白、鈣社人f /、中该油體蛋白係選利以白=二氫=者。結合蛋白和固醇結合去氣酵*，係由=蛋白、約 thalania)者。拉伯介（Arabidopsis 白為1利第11項之方法’其中該硫氧化還原蛋法’其_植物特異性〜單鏈抗體或其片段者。 Ά項之方法，其中該非植物特異性 ΐΐΐ，係取適化密碼子，使在植翻得最絲現者。 SEQ==範圍第15項一便=======紐，射單驗體能夠方 19.如申請專利範圍第15項之方法與油體蛋白特麵聯者。早鍵机體月匕夠赫申圍/15項之方法，其中該單鍵抗體係單 fvj几體，月b夠與取自阿拉伯芬⑽咖）之18奶白特殊關聯者。 sEQ=:=範圍第15項之方法’其中該單鏈抗體係申ΐ專利ff第8項之方法’其中該穩㈣多狀係經由可剪切接頭，連接至載脂蛋白者。 μ 2i.it 2利範圍第22項之方法，其中該可剪切接頭係减乳酶序列原者。其巾錢乳酶序列原 120 200526778 25_如申請專利範圍第丨項包括標定訊號’能夠把載脂蛋白彳^ ’其中嵌合核酸序列又泡者。曰‘弋於ER或ER衍生貯存小 26.如申請專利範圍第25項小泡者。、法，其中該ER衍生貯存 27·如申請專利範圍第25項之太生# ^ 羧基末端ER保留模體者。、，/、中該標定訊號包括 28·如申明專利範圍第27項之方法，且留模體係KDEL者。，、宁羧基末糕ER保

標定於質外體者。 μ i娜載^蛋白多肽，其中訊號肽係菸草病 ’其中該PR-S訊號序 30·如申請專利範圍第29項之方法毒相關蛋白（PR-S)訊號序列者。 31·如申清專利範圍第3〇項之方法列係 SEQIDNO : 58 者。利範圍第1項之方法，其中把«蛋白加以辨^的^序列係選自-組核酸序列，包含人體載脂蛋白、人體载月θ蛋白原、豬_蛋白、豬_蛋白原、牛_蛋白、牛载脂蛋白原者。

33·如申請專纖圍第〗項之方法，其中把載脂蛋白加以、、扁碼的核酸序列，係最適於植物密碼子用途者。 34·—種包括載脂蛋白的植物種籽之取得方法，包括·_ (a)提供嵌合核酸構造物，在5,至3,轉錄方向包括下列操作上連接成份： (i) 能夠控制在植物種籽細胞内表現之核酸序列；和 (ii) 將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列； (b) 將嵌合核酸構造物引進到植物細胞内； (c) 讓植物細胞成長為成熟植物，並從該植物取得組 121 200526778 織，其中種籽包括載脂蛋白；以及 (Φ從該植物取得種籽，其中種籽包括載脂蛋白者。 35·~種植物，包括嵌合核酸序列，在5,至3,轉錄方向包括： ⑻能夠控制在操作上相連植物内表現的第一核酸序列； (c)把載脂蛋白多肽加以編碼之第二核酸序列，其中植物含載脂蛋白者。 36·如申請專利範圍第35項之植物，其中嵌合核酸序列係整合於植物核基因組内者。 37·如申請專利範圍第1項之方法，其中所用植物為阿拉嘗伯芥或紅花植物者。 38·一種植物種籽，包括嵌合核酸序列，在5,至3,轉錄方向包括： (a)能夠控制在操作上連接的植物種籽内表現之第一核酸序列； (c)把載脂蛋白多肽加以編碼之第二核酸序列者。 39.—種組成物，包括實質上純油體，包括從植物取得之載脂蛋白者。 11〇二翻酸序歹,J ’把連接於核酸序列之载脂蛋白加以編碼’匕括能夠控制在植物細胞内表現之核酸者。係種=i__4G奴核_，其_物細胞 4Z如申請專利範圍第41項之核酸序列，其中能夠植物細胞内表現之該核酸序列，係種籽優勢啟動子者。工 43·如申請專利範圍第42項之核酸序列，其啟動子係蛋白鹼啟動子者。馒勢 44·如申請專利範圍第43項之妨妒良方丨，甘+ 植物内表現之該核酸序列，係組成^動子者:^控制在 122 200526778 泛蛋4白利範圍第44項之核酸序列，其中該啟動子係 ^ 46·:種適於在植物細胞内表現之重組表現载體請專利範圍第1至45項之核酸序列者。包括申 47· —種實質上純載脂蛋白之製法，包括·· (a)提供嵌合核酸構造物，在5’至3’轉錄方向包括下列操作上連接成份： ①月&夠控制在植物種籽細胞内表現之核酸序列；和 ⑻將載脂蛋白多肽加以編碼之核酸序列； (b) 將後合核酸構造物引進入植物細胞内； (c) 讓植物細胞成長為成熟植物； (d) 從該植物取得種籽，其中種籽包括載脂蛋白；和 (e) 從植物種籽成份分離載脂蛋白，取得實質上純載脂蛋白者。 48·如申請專利範圍第1_38項製成之植物，用於取得實質上純載脂蛋白者。

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