BG64320B1 - Рекомбинантни предуоденални липази и полипептидни производни, продуцирани от растения, метод за получаването и използването им - Google Patents

Рекомбинантни предуоденални липази и полипептидни производни, продуцирани от растения, метод за получаването и използването им Download PDF

Info

Publication number
BG64320B1
BG64320B1 BG101959A BG10195997A BG64320B1 BG 64320 B1 BG64320 B1 BG 64320B1 BG 101959 A BG101959 A BG 101959A BG 10195997 A BG10195997 A BG 10195997A BG 64320 B1 BG64320 B1 BG 64320B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
polypeptide
recombinant
lgc
plants
sequence
Prior art date
Application number
BG101959A
Other languages
English (en)
Other versions
BG101959A (bg
Inventor
Philippe Lenee
Veronique Gruber
Sylvie Baudino
Bertrand Merot
Claude Benicourt
Claire Cudrey
Original Assignee
Parke-Davis
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Parke-Davis filed Critical Parke-Davis
Publication of BG101959A publication Critical patent/BG101959A/bg
Publication of BG64320B1 publication Critical patent/BG64320B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6418—Fatty acids by hydrolysis of fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C10—PETROLEUM, GAS OR COKE INDUSTRIES; TECHNICAL GASES CONTAINING CARBON MONOXIDE; FUELS; LUBRICANTS; PEAT
    • C10L—FUELS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NATURAL GAS; SYNTHETIC NATURAL GAS OBTAINED BY PROCESSES NOT COVERED BY SUBCLASSES C10G, C10K; LIQUEFIED PETROLEUM GAS; ADDING MATERIALS TO FUELS OR FIRES TO REDUCE SMOKE OR UNDESIRABLE DEPOSITS OR TO FACILITATE SOOT REMOVAL; FIRELIGHTERS
    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6454—Glycerides by esterification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Настоящото изобретение се отнася до продуцирането от растения на рекомбинантни предуоденални липази, а именно рекомбинантни стомашни липази, и на други
полипептидни производни на последните, притежаващи липазна активност, както и до тяхното използване, а именно в качеството им на функционални храни или във фармацевтични състави или в ензимни препарати с агрохранително или индустриално приложение.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Кучешката стомашна липаза (LGC) е един гликопротеин с 379 аминокиселини (АА) с молекулно тегло около 50 килодалтона (kDa) синтезиран под формата на прекурсор съдържащ един сигнален пептид с аминотерминални краища (ИНг-терминал) и секретиран от медианните клетки на фундусната мукоза на стомаха на кучета (Carriere F. et al.,1991).
Човешката стомашна липаза (LGH) е природно синтезирана под формата на прекурсор и е описана в публикация на Bodmer, M.W. et al., 1987. Зрелият протеин LGH е съставен от 379 аминокиселини. Неговият сигнален пептид (PSLGH) е съставен от 19 аминокиселини.
Тези ензими принадлежат към фамилия липази, наречени ’’предуоденални”, някои членове на която вече са пречистени и в някои случаи дори клонирани (Docherty, A.J.P. et al., 1985; Bodmer, M.W. et al.,1987; Moreau, H. et al.,1988; EP № 0 191 061 и № 0 261 016).
В продължение на дълго време е прието, че хидролизата на хранителните липиди се извършва на нивото на тънките черва благодарение на действието на ензими произвеждани от панкреаса (Bernard, С., 1849).
Обаче, някои наблюдения навеждат на мисълта, че
хидролизата на триглицеридите би могла да надтъпва в стомаха, с помощта на предуоденални ензими (Volhard, F., 1901; Shonheyder,F., и Volquartz, К., 1945). Тези ензими и поспециално кучешката стомашна липаза имат ензимни свойства и физикохимични свойства, които се различават от панкреатичните липази на бозайниците. Тези разлики между стомашните липази и панкреатичните се отнасят по същество до следните: молекулни тегла, аминокиселинен състав, устойчивост спрямо пепсина, специфичност на субстрата, оптимално за действието pH и стабилност в кисела среда.
Освен това, in vitro, при някои условия може да се наблюдава синергизъм на действието между стомашните и панкреатичните липази при хидролизата на триглицериди с дълги вериги (Gargouri, Y. et al.. 1989).
Познати са няколко патологични състояния, (муковисцидоза, екзокринна панкреатична недостатъчност) когато пациентите са напълно или частично лишени от
екзокринна панкреатична секреция и следователно от ензимите необходими за хидролизата на храните (амилази, липази, протеази). Неабсорбирането на мазнините на нивото на тънките черва, а именно на триглицеридите с дълги вериги, води до твърде значително увеличение на стеатореята у пациентите и до твърде чувствително забавяне в наддаването на теглото у млади болни. За да се коригира това, на такива лица, по време на яденето се прилагат свински панкреасни екстракти. Терапевтичният ефект на тези екстракти би могъл да се подобри забележително, чрез едновременно предписване на LGC, благодарение на специфичността на действието й върху триглицериди с дълги вериги.
В статията на Carriere et al.,(1991) са описани пречистването и определянето на ИНз-крайната последователност на LGC. В тази публикация е описан също и метод за извличане на този ензим от кучешки стомаси. Този метод се състои по същество в подлагане на кучешки стомаси на мацерация в кисела среда (pH 2,5), в присъствието на водноразтворими соли благоприятстващи разпространяването на липазата в тази среда. Етапи на филтриране през молекулни сита и йонообменна хроматография, позволяват да се пречисти LGC до хомогенност. Пречистената LGC, получена по този метод, е един гликопротеин притежаващ молекулно тегло от 49 000 далтона, от които 6 000 отговарят на захари и
000 на протеиновата част.
Очевидни съображения за трудностите за доставяне на кучешки стомаси възпрепятстват всяко развитие на този метод, както на лабораторно ниво така и в индустриален мащаб. Оттук следва необходимостта за намиране метод, който да позволява произвеждането на LGC в големи количества, като се избегне използването на стомаси на кучета.
Нуклеотидната и пептидната последователности на LGC са определени, с цел да се произвежда промишлено LGC, чрез метод от областта на генетиката. Тези трудове съставляват предмета на международна патентна заявка
WO 94/13816 депозирана на 16 декември 1993.
Методът за производство на рекомбинантна LGC описан в тази международна заявка, претендира за Escherichia coli (E.coli) в качеството на клетка гостоприемник, трансформирана да може да произвежда LGC.
Известни трудности срещани при производството на рекомбинантна LGC посредством E.coli, а именно необходимостта да се култивират големи количества E.coli във ферментатор, с повишени разходи, е причина за търсенето на други методи за производтсво на тази LGC.
Клетките на бозайниците са, a priori, повече приспособени да експресират гени от бозайници. Тяхното използване, обаче, поставя проблеми с узряването на протеините. Групата ензими, която осъществява узряването след трансдукцията, се различава от една тъкан, един орган или един вид към друг. Например, съобщено е, че узряването след трансдукция, на плазмен протеин може да бъде
различно, когато е получен от човешка кръв или от рекомбинантни клетки, като клетките от яйчници на китайски хамстер или от млякото на трансгенно животно. От друга страна, слабите нива на експресия, получени с клетки на бозайници въвличат културите in vitro при големи обеми, в големи разходи. Продуцирането на рекомбинантни протеини в млякото на трансгенни животни (мишки, овце и крави) позволява да се намалят разходите за производство и да се преодолеят проблемите с нивото на експресия. Обаче, остават етичните проблеми и контаминациите с вируси и субвируси (приони).
Поради тези основания, трансгенезата на гени от бозайници в растителна клетка, би могла да предложи път за производство на големи количества от нови рекомбинантни протеини, с намалена производствена себестойност и без риск от контаминация с вируси и субвируси.
През 1983 г няколко лаборатории откриват, че е възможно да се пренесе хетерологов ген в генома на растителна клетка (Bevan et al., 1983; Herrera-Estrella et
al.,1983 а и b) и да се регенерират трансгенните растения, като се тръгне от генетично модифицираните клетки. Тогава всички клетки на растението притежават генетично модифицирания характер, който е предаден на поколенията чрез полово оплождане.
Благодерение на тези трудове, различни екипи се интересуват от продуцирането на рекомбинантни протеини от бозайници в растителни клетки или в трансгенни растения (Barta et al.,1986; Marx 1982). Един от първите действително значими резултати в тази област е продуцирането на антитела в трансгенни тютюневи растения (Hiatt et al., 1989).
За да се експресира един хетерологов ген в семената, място за складиране на протеини у растенията, Vandekerckhove и сътр. подлагат на сливане последователността кодираща за leu-енкефалин, в гена кодиращ за албумин 2S в Arabidopsis thaliana. С тази конструкция са произведени трансгенни растения рапица, които експресират leu-енкефалина специфично в семената, с ниво на експресия от порядъка на 0,1% от общия протеин. В 1990 г. Sijmons и сътр. пренасят гена на човешки серумен албумин в клетките на тютюн и картофи. Какъвто и да е произходът на сигналните пептиди (човешки или растителен), в листата, стеблата и грудките на картофа са получени количества от човешки серумен албумин от порядъка на 0,02 % от общите протеини.
Други рекомбинантни протеини от бозайници също са продуцирани от растения: повърхностният антиген на хепатит В (Mason et al.,1992), интерферони (De Zoeten et al.,1989; Edelbaum et al.,1992; Truve et al.,1993); антитяло от мишка анти-Streptococcus mutans, агент на зъбния кариес (Hiatt et Ма, 1992; Ма et al., 1994), фрагменти от антитела scFV анти-ракови клетки (Russel D., 1994), антитяло антиHerpes (Roussel D., 1994), хирудин (Moloney et al.,1994), холерния токсин (Hein R.,1994) и растежния фактор на човешка епидерма (E.G.F.)( Higo et al., 1993).
Като цяло тези изследвания показват, че продуцирането на рекомбинантни протеини на бозайници в клетките на растения е възможно и, че механизмите на синтезата на протеините, като се излиза от
последователностите на ДНК са подобни при животинските клетки и при растителните клетки. Някои различия съществуват все пак между растителните и животинските клетки, а именно в нивото на узряване на полиманозидните гликани в гликанни комплекси или още в нивото на сайтовете на разцепване на сигналните пептиди, като с това не позволяват да се гарантира получаването на протеини от бозайници активни или достатъчно активни, посредством трансформация на растителни клетки.
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО Настоящото изобретение се отнася до използването на растителни клетки трансформирани чрез подходяща рекомбинантна нуклеотидна последователност, за получаване на рекомбинантна LGC, или рекомбинантна LGH, като полипептидите получени от тях, проявяват ензимна активност достатъчна, за да могат да бъдат развити за
промишлено приложение.
Целта на настоящото изобретение е да осигури нов метод за получаване на рекомбинантни предуоденални липази от бозайници, и по-специално на рекомбинантни LGC или LGH от растения, като полипептидите получени от тях притежават ензимна активност и по-специално липазна активност, като тези рекомбинантни липази или техни полипептидни производни да могат да се използват промишлено.
Друга цел на настоящото изобретение е да осигури инструмент за задействане на такъв метод, а именно нови, рекомбинантни нуклеотидни последователности, растителни клетки трансформирани генетично, растения или части от растения (а именно листа, стебла, плодове, семена или зърна, корени) трансформирани генетично и фрагменти от тези растения или части на растения трансформирани генетично.
Изобретението има за цел също така да осигури нови рекомбинантни предуоденални липази от бозайници, или производен полипептид, ензимно активен и получен от растителни клетки или растения трансформирани генетично.
Изобретението има за цел също да създаде нови ензимни състави, които могат да бъдат използвани за
осъществяване на ензимни реакции, по-специално в индустриален мащаб.
Изобретението има за цел също да създаде нови фармацевтични състави, по-специално за лечение на патологии свързани с дефицит в продуцирането на липази в организма, като муковисцидоза.
Друга цел на настоящото изобретение е да създадат нови въглеводороди, наричани още биовъглеводороди, притежаващи предимството, че са по-малко замърсяващи
околната среда, отколкото въглеводородите производни на петрола, и че са с по-ниска себестойност.
Изобретението се илюстрира със следващото и при помощта на следните фигури:
- Фигура 1 представлява нуклеотидната последователност на кДНК, чиито нуклеотиди разположени в позиции 1 до 1137 кодират за LGC представена на фигура 2 и отговаряща на SEQ ID NO 2,
- Фигура 2 представлява аминокиселинната последователност на LGC и отговаряща на SEQ ID NO 2,
- Фигура 3 представя нуклеотидна последователност
получена от кДНК представена на фигура 1 и отговаряща на SEQ ID NO 1, като нуклеотидите разположени на позициите 1 до 1137 на производната последователност кодират за LGC такава каквато е представена на фигура 2 и отговаряща на SEQ ID NO 2,
- Фигура 4 представлява нуклеотидната последователност на кДНК, чиито нуклеотиди разположени в позиции 47 до 1240 кодират за прекурсора на LGH с 398 аминокиселини и нуклеотидите разположени в позициите 104 до 1240 кодират за зряла LGH с 379 аминокиселини,
- Фигура 5 представлява аминокиселинната последователност на LGH, като прекурсорът на LGH е ограничен от аминокиселините разположени в позициите 1 и 398, а зрялата LGH е ограничена от аминокиселините разположени в положенията 20 и 398,
- Фигури 6, 7 и 8 представят резултатите от експериментите за имунорегистриране на типа ’’Western” на рекомбинантните полипептиди продуцирани от листата и семената на тютюн Xanthi, семената на рапица и от листата и плодовете на домати, трансформирани с помощта на рекомбинантни последователности съгласно изобретението,
- Фигури 9 и 10 представят респективно анализ с електрофореза върху полиакриламиден гел и резултата от преноса на този гел върху нитроцелулозна мембрана и проявяване като се излиза от антитела анти-кучешка стомашна липаза, на LGC пречистена от тютюневи листа,
- Фигура 1 1 представя пример за откриване върху мембраната на гликанови остатъци от рекомбинантна LGC,
- Фигура 12 представя анализ на пречистена LGC
получена от семена на рапица,
- Фигури 13, 14 и 15 илюстрират различните опити извършени за получаване на олеинов метилестер, получен от семена, трансформирани съгласно изобретението.
Настоящото изобретение има за предмет използването на рекомбинантна нуклеотидна последователност съдържаща от една страна кДНК кодираща за всяка предуоденална липаза от бозайници, а именно липазите, чиито нуклеотидни последователности кодиращи за последните, показват помежду си процент на хомология наймалко около 75%, а именно най-малко от около 77% до 85 % и
чиито аминокиселинни последователности показват помежду си процент на хомология най-малко 70%, а именно от наймалко около 80% до около 90%, и притежаващи свойството да са киселиноустойчиви и да са активни при pH от около 1 до около 5, и по-специално при pH от около 1,5 до около 2, а именно кДНК кодираща за всяка стомашна липаза на бозайници или кДНК кодираща за всеки полипептид получен от горните предуоденални липази чрез прибавяне и/или премахване, и/или заместване на една (или повече) аминокиселини, като този производен полипептид притежава описаните тук по-горе свойства на предуоденалните липази, и от друга страна, елементите позволяващи на една растителна клетка да продуцира предуоденалната липаза кодирана от кДНК или да произвежда производен полипептид, какъвто е дефиниран тук по-горе, а именно промотор и терминатор на транскрипцията, разпознавани от транскрипционния апарат на растителните клетки, за трансформиране на растителните клетки, с оглед получаване, като се излиза от тези клетки или
растенията получени от тях, на рекомбинантна предуоденална липаза от бозайници, под формата на активен ензим, или на един (или няколко) полипептид(и) производен(ни) на последната, такива каквито са описани тук по-горе.
Предмет на настоящото изобретение е, поспециално, използването на рекомбинантна нуклеотидна последователност, съдържаща от една страна кДНК представена на фигура 1 и кодираща за кучешка стомашна липаза (LGC) представена на фигура 2, или нуклеотидна последователност получена от тази кДНК, а именно чрез прибавяне и/или премахване, и/или заместване на един (или няколко) нуклеотид(а), като тази производна последователност е способна да кодира за полипептид, чиято аминокиселинна последователност е идентична на тази на
LGC представена на фигура 2, или за полипептид получен от
LGC чрез прибавяне и/или премахване, и/или заместване на една (или повече) аминокиселини, като този производен
полипептид притежава липзна активност, и от друга страна, елементите позволяващи на тази растителна клетка да продуцира полипептида кодиран от кДНК или от производна последователност спомената по-горе, а именно промотор и терминатор на транскрипцията разпознавани от апарата за транскрипция на растителните клетки (и по-специално от РНК полимеразите на последните), за трансформиране на растителните клетки, с оглед получаване, като се излиза от тези клетки или от растения получени от последните, на рекомбинантна LGC под формата на активен ензим или на един (или повече) полипептид(и) производен(ни) на последните, както са дефинирани тук по-горе.
Изобретението се отнася също така до всяка рекомбинантна нуклеотидна последователност, както е описана тук по-горе, съдържаща като кДНК тази представена на фигура 1, или нуклеотидна последователност производна на последната така както е дефинирана тук по-горе.
В това си качество, изобретението има за предмет по-специално всяка рекомбинантна нуклеотидна последователност както е описана по-горе, съдържаща кДНК
представена на фигура 1 и кодираща за кучешка стомашна липаза (LGC) представена на фигура 2.
По специално, предмет на изобретението е всяка рекомбинантна нуклеотидна последователност както описаната тук по-горе, съдържаща нуклеотидна последователност получена от кДНК представена на фигура 1, като тази производна нуклеотидна последователност е такава каквато е дефинирана тук по-горе и кодираща за кучешка стомашна липаза(ЬСС) представена на фигура 2. Такава
производна последователност е изгодно тази, представена на фигура 3 и съответстваща на тази представена на фигура 1 , в която нуклеотидът А в позиция 12 е заместен с нуклеотида G, нуклеотидът Т в пложение 13 е заместен с нуклеотида С и нуклеотидът А в позиция 15 е заместен с нуклеотид Т.
Изгодно, рекомбинантните нуклеотидни последователности съгласно изобретението съдържат една (или повече) последователности кодиращи за един пептид отговорен за насочването на рекобинантните полипептиди от изобретението (а именно на рекомбинантната LGC или на горните производни полипептиди) в определен компартимент на растителната клетка, а именно в ендоплазмения ретикулум или във вакуолите. или пък дори към външната част на клетката, във вътрешната пекгоцелулозна стена или в извънклетъчното пространство наричано още апоплазма.
Между терминаторите на транскрипцията поддаващи се на използване за трансформация на растителните клетки в обхвата на настоящото изобретение, могат да се споменат терминаторът полиА 35S на вируса на мозайката по карфиола (CaMV), описан в статията на Franck et al.,1980, или терминаторът polyA NOS, който отговаря на некодиращата
област в 3' на гена на нопалин синтазата на плазмида Ti на
Agrobacterium tumefaciens щам с нопалин. (Depicker et ai.,
1982).
В това си качество, изобретението има за предмет
всяка рекомбинантна нуклеотидна последователност, такава както е описана тук по-горе, съдържаща в посоката на споменатата кДНК или на производната последователност, терминатор polyA 35S на CaMV или терминатор polyA NOS на Agrobacterium tumefaciens.
Между промоторите на транскрипцията, които могат да бъдат използвани за трансформацията на растителните клетки, в обхвата на настоящото изобретение, могат да се споменат:
- промотор 35S или изгодно определящият промотор двоен 35S (pd35S), като тези промотори позволяват експресията на рекомбинантните полипептиди от изобретението в цялото растение, получено от клетките трансформирани съгласно изобретението и са описани в статията на Kay et al., 1987,
- промотор pCRU на круцифериновия ген на репичката, позволяващ експресията на рекомбинантните полипетиди от изобретението единствено в семената (или зърната) на растението, което е получено от клетките трансформирани съгласно изобретението, и описан в статията на Depigny-This et al., 1992,
- промоторите pGEA1 и pGEA6 съответстващи на
некодиращата област 5' на гените на резервния протеин в зърната, GEA1 и GEA6, респективно, от Arabidopsis thaliana (Gaubier et al.,1993) и позволяващ специфична експресия в зърната,
- химеричния промотор суперпромотор pSP (PCT/US
94/12946), съставен от сливане на тройно повторение на активиращ транскрипционен елемент на промотора на гена на октопин синтазата от Agrobacterium tumefaciens, един активиращ транскрипционен елемент на промотора на гена на манопинсинтазата и на промотора манопинсинтаза от
Agrobacterium tumefaciens,
- актинов промотор на ориза последван от актинов интрон на ориза (pAR-IAR) съдържащ се в плазмида pAct1-F4 описан от McElroy et al.,(1991),
- промотор на гена на -/зейна на царевицата (рузеин) съдържащ се в плазмида ργ63 описан от Reina et al.,(1990), и позволяващ експресия в албумина на семената на царевицата.
В това си качество, изобретението има за предмет всяка рекомбинантна нуклеотидна последователност, както е описана тук по-горе, съдържаща срещу посоката на споменатата кДНК или на производната последователност, основен промотор двоен 35S (pd35S) от CaMV, или промотор
- 15 pCRU от круцифериновия ген на репичката, или промоторите pGEA1 или pGEA6 от Arabidopsis thaliana, или суперпромотор pSP от Agrobacterium tumefaciens, или промотор pAR-IAR от ориз, или промотор рузеин от царевица.
Последователностите кодиращи за насочващ пептид използвани в обхвата на настоящото изобретение, могат да бъдат от растителен, човешки или животински произход.
Между последователностите кодиращи за насочващ пептид от растителен произход могат да бъдат споменати:
- нуклеотидната последователност с 69 нуклеотида (посочена в примерите, които следват) кодираща за препептида (сигналния пептид) с 23 аминокиселини на спорамин А у батата, като този сигнален пептид позволява влизането на рекомбинантните полипептиди съгласно изобретението в системата на секреция на растителните клетки трансформирани съгласно изобретението (а именно главно в ендоплазмения ретикулум),
- нуклеотидна последователност с 42 нуклеотида (посочена в примерите, които следват) кодираща за Nкрайния пропетид за вакуолно насочване с 14 аминокиселини на спорамин А у батата, позволяващ акумулирането на рекомбинантните полипептиди от изобретението във вакуолите на растителните клетки трансформирани съгласно изобретението,
- нуклеотидна последователност с 1 1 1 нуклеотида (посочена в примерите, които следват), кодираща за препропептида с 37 аминокиселини на спорамин А съставен от N-крайната част към С-крайната част от 23 аминокиселини от сигналния пептид последвани от 14 аминокиселини на
пропептида, като този пропептид позволява влизането на рекомбинантните полипептиди съгласно изобретението в системата на секреция и тяхното натрупване във вакуолите на растителните клетки трансформирани съгласно изобретението, като и трите последователности са описани в статиите на Murakami et al., и Matsuoka et Nakamura, 1991,
- карбокситерминален пропетид на ечемичения лецитин описан по-специално в статиите на Schroeder et al., и Bednarek et Ralkhel, 1991.
Между последователностите кодиращи за насочващ пептид от човешки или животински произход, могат да бъдат споменати тези кодиращи за сигналния пептид на човешката стомашна липаза (LGH) така както е описана в Европейски патент № 0 191 061, или за този на стомашна липаза от заек (LGL) както е описана в заявка за Европейски патент № 0 542 629, която последователност е посочена в примерите, които следват, или за тази на човешка панкреасна липаза (LPH) или
още тази на кучешка стомашна липаза (LGC).
Между последователностите кодиращи за насочващ пептид, може да бъде спомената също тази, кодираща за тетрапептида KDEL и позволяваща насочване в ендоплазмения ретикулум.
В това си качество, изобретението има за предемет всяка рекомбинантна нуклеотидна последователност, такава както е описана тук по-горе, съдържаща последователност кодираща за целия или част от сигналния пептид такъв като този на спорамин А от батата, или този на LGH, или на LGL, или на LGC, като тази последователност кодира за един
сигнален пептид, който е разположен в рекомбинантната нуклеотидна последователност в обратна посока на споменатата кДНК или на производната последователност и по посока на използвания промотор, по такъв начин, че последната С-крайна аминокиселина на сигналния пептид да е свързана с първата N-крайна аминокиселина на полипептида кодиран от споменатата кДНК или нейната производна последователност, в протеина кодиран от рекомбинантната нуклеотидна последователност.
Предмет на изобретението е също всяка рекомбинантна нуклеотидна последователност както е описана тук по-горе, съдържаща последователност кодираща
за целия или част от пептида за вакуолно насочване, а именно този на спорамин А от батата, като тази последователност кодираща за пептид за вакуолно насочване, е разположена в рекомбинантната нуклеотидна последователност, между последователността кодираща за сигнален пептид и тази кодираща за споменатата кДНК или нейна производна последователност, по такъв начин, че първата N-крайна аминокиселина на пептида за вакуолно насочване да бъде свързана с последната С-крайна аминокиселина на сигналния пептид и че последната С-крайна аминокиселина на насочващия пептид да бъде свързана с първата N-крайна аминокиселина на полипептида кодиран от споменатата кДНК или нейната производна последователност в протеина кодиран от рекомбинантната нуклеотидна последователност.
Предмет на изобретението е също всяка рекомбинантна нуклеотидна последователност такава каквато е описана гук по-горе, съдържаща последователност кодираща за целия или част вакуолата, а именно този на последователност кодираща от пептида за насочване във ечемичения лецитин, като та за пептид за вакуолно насоч е разположена в рекомбинантната нуклеотидна последователност, по посоката на последователността кодираща за споменатата кДНК или нейната производна последователност, по такъв начин, че първата N-крайна аминокиселина на пептида за насочване във вакуолата, да бъде свързана с последната С-крайна аминокиселина на полипептида кодиран от споменатата кДНК или нейната
производна последователност, в протеина кодиран от рекомбинантната нуклеотидна последователност.
Изобретението има за предмет по-специално следните рекомбинантни нуклеотидни последователности:
- тази (означена pd35S-PS-LGC) съдържаща в посока 5 > 3' промотора pd35S от CaMV, последователността кодираща за сигналния пептид на спорамин А, като последната е последвана непосредствено от нуклеотидната последователност представена на фигура 3, след това от терминатора polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pd35S-PPS-LGC) съдържаща в посока 5'-> 3' промотора pd35S от CaMV, последователността кодираща за препропептида на спорамин А, като тази последната е непосредствено последвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 3, след това от терминатора polyA35S от CaMV,
- тази (означена pd35S-PSLGL-LGC) съдържаща в посока 5' > 3' промотора pd35S от CaMV, последователността кодираща за част от сигналния пептид на LGL (а именно за последователност съставена от 19 първи аминокиселини, посочена в примерите, които следват тук по-нататък, 9-те нуклеотида кодиращи за 3-те последни С-крайни аминокиселини, които са премахнати), като тази последната е непосредствено последвана от кДНК представена на фигура 1, след това от терминатора polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pCRU-PS-LGC) съдържаща в посока 5' -> 3' промотора pCRU на круциферина, последователността кодираща за сигналния пептид на спорамин А, като тази
последната е непосредствено последвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 3, след това от терминатора polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pCRU-PPS-LGC) съдържаща в посоката 5'3' промоторът pCRU на круциферина,
последоветилността кодираща за препропептида на спорамин
А, като тази последната е непосредствено следвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 3, след това терминатора polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pCRU-PSLGL-LGC) съдържаща в посоката 5'->3' промотора pCRU на круциферина, последователността кодираща за част от сигналния пептид LGL (както е описан тук по-горе), като последната е непосредствено следвана от кДНК представена на фигура 1, или на фигура 3, след това от терминатора polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pGEA1-PSLGL-LGL) съдържаща в посоката 5'->3' промотора pGEA1 от Arabidopsis thaliana, последователността кодираща за част от сигналния пептид на
LGL (както е описана тук по-горе), като последната е непосредствено следвана от кДНК представена на фигура 1, или на фигура 3, след това от терминатора polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pGEA6-PSLGL-LGC) съдържаща в посоката 5' >3' промотора pGEA6 от Arabidopsis thaliana,
последователността кодираща за част от сигналния пептид на LGL (както е описана тук по-горе), като последната е непосредствено следвана кДНК представена на фигура 1, или на фигура 3, след това от терминатора polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pAR-IAR-PSLGL-LGC) съдържаща в посоката 5'->3' промотора pAR-IAR от ориз, последователността кодираща за част от сигналния пептид на LGL (както е описано тук по-горе), като последната е непосредствено следвана от кДНК представена на фигура 1, или на фигура 3, след това от терминатора polyA 35S от CaMV, или от терминатора polyA NOS от Agrobacterium tumefaciens,
- тази (означена рузеин-PSLGL-LGC) съдържаща в посоката 5' >3' промотора рузеин от царевица, последователността кодираща за част от сигналния пептид на LGL (както е описана тук по-горе), като последната е непосредствено следвана от кДНК представена на фигура 1, или на фигура 3, след това от терминаторът polyA 35S от CaMV,
- тази (означена рузеин-PSLGL-LGC-KDEL) съдържаща в посоката 5' >3' промотора рузеин от царевица, последователността кодираща за част от сигналния пептид на LGL (както е описана тук по-горе), като последната е непосредствено следвана от кДНК представена на фигура 1, или на фигура 3, след това от последователността кодираща за тетрапептида KDEL, след това от терминатора polyA 35S от CaMV.
Изгодно, рекомбинантните нуклеотидни последователности съгласно изобретението, съдържат също
нуклеотидна последователност, която може да се използва като маркер на рекомбинантните последователности, а именно, за да се диференцират (и така да се селекционират) тези от растителните клетки, които са трансформирани чрез рекомбинантните последователности от тези, които не са.
За предпочитане, такава нуклеотидна последователност използвана в качеството на маркер на тези рекомбинатни последователности, се избира между гените с устойчивост към антибиотици, а именно гена с устойчивост към канамицин.
Освен това, изобретението има за предмет всеки вектор, а именно плазмиден, съдържащ рекомбинантна нуклеотидна последователност съгласно изобретението, вмъкнат в сайт несъществен за репликацията.
Изобретението се отнася също до всеки клетъчен гостоприемник, по-специално всяка бактерия като Agrobacterium tumefaciens, трансформирана чрез вектор, какъвто е дефиниран тук по-горе.
Предмет на настоящото изобретение е също всеки метод за получаване на рекомбинантна LGC под формата на активен ензим и/или на един (или повече) полипептид(и) получен(и) от последния, а именно чрез прибавяне и/или премахване, и/или заместване на една (или повече) аминокиселина(и), като този (или тези) производен(и) полипептид(и) показва липазна активност, който метод
се състои в:
- трансформация на растителни клетки, по начин, че да се интегрират в генома на тези клетки, една (или повече) рекомбинантни нуклеотидни последователности съгласно изобретението,
- при желание, получаване на трансформирани растения от трансформираните клетки,
- събиране на рекомбинантната LGC и/или производния полипептид (или полипептиди) споменат(и) погоре, продуциран(и) в трансформираните клетки или растения, а именно чрез екстракция, последвана, при желание от пречистване.
Според едно изпълнение на метода съгласно изобретението, трансформацията на растителните клетки може да се осъществи чрез пренасяне на рекомбинантната нуклеотидна последователност съгласно изобретението в протопластите, а именно чрез инкубиране на последните в разтвор на полиетиленгликол (PEG) в присъствието на двувалентни катиони (Са2+) съгласно метода описан в статията на Krens et al., 1982.
Трансформацията на растителните клетки може да се осъществи също чрез електропорация, а именно по метода описан в статията на Fromm et al., 1986.
Трансформацията на растителните клетки може да бъде осъществена също като се използва генно оръдие позволяващо изстрелване с голяма скорост на метални частици събрани от рекомбинантните нуклеотидни последователности съгласно изобретението, като така се доставят гените във вътрешността на клетъчното ядро, а именно по техниката описана в статията на Sanford, 1988.
Друг метод за трансформация на растителни клетки е този на микроинжекция, цитоплазмена или нуклеарна, както е описана в статията на De La Penna et al., 1987.
Съгласно едно особено предпочитано изпълнение на метода съгласно изобретението, растителните клетки се трансформират като последните се смесват с клетъчен гостоприемник, трансформиран посредством вектор съгласно изобретението, какъвто е описан тук по-горе, като клетката
гостоприемник, е способна да инфектира растителните клетки, с което позволява интегрирането в генома на последните на рекомбинантни нуклеотидни последователности
съгласно изобретението, първоначално съдържащи се в генома на вектора.
Изгодно, клетката гостоприемник, която се използва е Agrobacterium tumefaciens, а именно съгласно методите описани в статиите на Bevan 1984 и на An et al., 1986, или още Agrobacterium rhizogenes, именно по метода описан в статията на Juanin et al.,1987.
Между растителните клетки, които могат да бъдат трансформирани в обхвата на настоящото изобретение, могат да бъдат споменати тези на рапица, тютюн, царевица, грах, домати, моркови, жито, картофи, ечемик, соя, слънчоглед, маруля, ориз и люцерна.
Съгласно едно изпълнение на метода съгласно изобретението, растителните клетки трансформирани съгласно изобретението, се култивират in vitro, а именно в биореактори съгласно метода описан в статията на Brodelius, 1988, в течна среда, или по метода описан в статията на
Brodelius et al., 1979, в имобилизирана форма или още съгласно метода описан в статията на Deno et al., 1987, като
се процедира чрез култура от корени трансформирани in vitro.
Споменатите по-горе среди за култивиране in vitro след това се събират за екстрахиране, и при желание за пречистване, по-специално посредством хроматография, на рекомбинантната LGC и/или на производния(ите) полипептид(и), дефинирани тук по-горе, продуцирани от трансформираните клетки култивирани in vitro.
Съгласно едно предпочитано изпълнение на метода за получаване на рекомбинантна LGC и/или на производните полипептиди съгласно изобретението, трансформацията на
растителните клетки е последвана от етап на получаване на трансформирани растения, чрез култивиране на тези трансформирани клетки в подходяща среда. Рекомбинантната LGC и/или производният полипептид (или полипетиди) продуциран(и) в клетките на цялостните растения, получени по този начин, се събира(т) чрез екстракция на целите растения, или на части от тези растения (а именно на листата или стеблата или на плодовете), или още на семената получени от тези растения, като тази екстракция, при желание, се последва от етап на пречистване на рекомбинантната LGC и/или на производния полипептид или производните полипептиди.
Трансформираните растения използвани за натрупване на рекомбинантна LGC в обхвата на метода, са тези от поколението ТО, а именно тези получени от култура на трансформирни съгласно изобретението клетки, в подходяща среда, или изгодно клекти от следващите поколония (Т1,Т2 и
т.н.) получени чрез самооплождане на растенията от предходното поколение, и в които рекомбинантните нуклеотидни последователности съгласно изобретението са възпроизведени съгласно закона на Mendel.
Между полипептидите производни от рекомбинантната LGC, които могат да се получат в обхвата на изпълнение на метода съгласно изобретението могат да бъдат споменати:
- полипептид ограничен от аминокиселините разположени в положения 55 и 379 на фигура 2, означен още като полипептид (Δ54) и представен от SEQ ID NO 4, като този полипептид е кодиран от нуклеотидната последователност представена с SEQ ID NO 3,
- полипептид ограничен от аминокиселините разположени в положение 5 и 379 на фигура 2, означен още като полипептид (Δ4) и представен с SEQ ID NO 6, като този полипептид е кодиран от нуклеотидната последователност представена с SEQ ID NO 5.
Предмет на изобретението, по-специално е, всеки
метод като този описан тук по-горе за получаване на рекомбинантна LGC представена на фигура 2, и при желание получаване на един (или повече) производни полипептиди, а именно на полипептид (Δ54) и/или на полипептида (Δ4) споменати по-горе, като този метод се характеризира с това, че етапът на трансформация на растителните клетки се осъществява посредством интегриране в генома на последните, на рекомбинантна последователност както е описана по-горе, съдържаща от една страна ДНК представена на фигура 1 и от друга страна последователност кодираща за
сигналния пептид с 22 аминокиселини на LGL, изгодно тази кодираща за 19 първи аминокиселини на сигналния пептид на LGL.
Изобретението има за цел по-специално метод за получаване, както е описан тук по-горе, на рекомбинантната LGC представена на фигура 2, при желание заедно с полипептида (Δ54) и/или пептида (Δ4), характеризиращ се с това, че състои в:
- трансформация на клетки на експланти от листа на растение, чрез смесване на последните с щам на Agrobacterium tumefaciens трансформиран посредством плазмид както е описан тук по-горе, съдържащ рекомбинантната нуклеотидна последователност pd35S-PSLGL посочена по-горе в подходяща среда за култивиране,
- селекция на трансформираните експланти в среда съдържаща канамицин,
- получаване на трансформирани растения от трансформираните експланти посочени по-горе, чрез култивиране на последните в подходящи среди,
- екстрахиране на рекомбинантната LGC, и при желание на полипептида (Δ54) и/или на полипептида (Δ4), а именно посредством раздробяване на листата и/или зърната и/или плодовете на трансформираните растения в подходящ буфер, центрофугиране и събиране на надутаечната течност, съставляваща растителния екстракт с ензимна активност,
- при желание пречистване на рекомбинантната LGC от получения в предходния етап екстракт, а именно посредством хроматография на надутаечната течност, което води до получаване на рекомбинантна LGC в по същество чиста форма.
Предмет на изобретението е също използването на метода за получаване на полипептид (Δ54) или на полипептида (Δ4) в по същество чиста форма, чрез
пречистване на последните от екстракта получен по горния метод, а именно чрез хроматография на надутаечната течност от екстракцията.
По-специално, изобретението има за предмет получаване на полипептида (Δ4), при желание, в по същество чиста форма, посредством метода описан по-горе, в който трансформираните клетки с последователност pd35S-PSLGLLGC, са клетки от експланти от листата на Solanaceae, а именно на тютюн или домати.
Съгласно едно изпълнение на метода, полипептидът (Δ4) може да бъде по-специално получен чрез екстракция на листата на тютюневи растения трансформирани посочено по-горе, а именно чрез раздробяване както е на тези листа в подходящ буфер, центрофугиране и събиране на надутаечната течност. След това полипептидът
(Δ4) може да бъде пречистен от екстракта от листата, съдържащ полипептида (Δ4), чрез хроматография на надутаечната течност
По специално, предмет на изобретението е всеки метод, както е описан по-горе, за получаване на рекомбинантна LGC и/или един (или повече) полипептиди производни на последната, както са дефинирани тук по-горе, характеризиращ се с това, че етапът на трансформация на растителните клетки се осъществява посредством интегриране в генома на последните на последователност, съдържаща от една страна нуклеотидната последователност представена на фигура 3, и от друга страна, последователността кодираща за сигналния пептид на спорамин А, описан по-горе.
Между полипептидите производни на рекомбинантната LGC, които могат да се получат при осъществяване на метода описан тук по-горе, могат да бъдат споменати полипептидите (Δ54) и/или полипептидът (Δ4),
посочени и по-горе.
По специално, изобретението има за цел метод за получаване на рекомбинантна LGC и/или полипептида (Δ54) и/или полипептида (Δ4), който се състои в:
- трансформация на клетки от експланти от растение (а именно експланти от листата), чрез смесване на последните с щам на Aerobacterium tumefaciens трансформиран чрез плазмид, такъв какъвто е описан тук погоре, съдържащ рекомбинантна нуклеотидна последователност pd35S-PS-LGC и/или последователност
pd35S-PPS-LGC,
- селекция на трансформираните експланти в среда съдържаща канамицин,
- получаване на трансформирани растения от трансформираните експланти, чрез култивиране в подходящи среди,
- екстракция на рекомбинантната LGC и/или на полипептида (Δ54) и/или на полипептида (Δ4), именно чрез раздробяване, в подходящ буфер, на листата и/или зърната и/или на плодовете на трансформираните растения, центрофугиране и събиране на надутаечната течност представляваща растителния екстракт с ензимна активност,
- при желание, пречистване на рекомбинантната
LGC и/или на полипептида (Δ54) и/или на полипептида (Δ4) от екстракта получен от предходния етап, чрез хроматография на надутаечната течност, което води до получаването на рекомбинантната LGC и/или на полипептида (Δ54) и/или на полипептида (Δ4) в по същество чиста форма.
Изобретението цели по-специално метод за получаване на полипептида (Δ 54) и/или на полипептида (Δ4) споменати
по-горе, чрез изпълнение на описания тук по-горе метод, при който трансформираните клетки са клетки на експланти от листата на Solanaceae а именно от тютюн и домати.
Съгласно едно предпочитано изпълнение на метода съгласно изобретението, полипептидът (Δ54) може да бъде получен чрез екстракция на семената на тютюн
трансформирани както по-горе, именно чрез раздробяване на тези зърна в подходящ буфер, центрофугиране и събиране на надутаечната течност. След това полипептидът (Δ54) може да се пречисти от екстракта от семената, съдържащ полипептида (Δ54), а именно посредством хроматография на надутаечната течност.
Изобретението цели по-специално, метод за получаване на рекомбинантна LGC и/или на полипептида (Δ54) и/или на полипептида (Δ4), характеризиращ се с това, че се състои в:
- трансформоция на клетки от експланти от растение, чрез смесване на последните с щам на
Agrobacterium tumefaciens трансформиран посредством
плазмида както е описан тук по-горе, съдържащ последователност pCRU-PS-LGC и/или последователност pGEA1-PSLGL-LGC и/или последователност pGEA6-PSLGL-LGC и/или последователност py3enH-PSLGL-LGC-KDEL,
- селекция на трансформираните експланти в среда съдържаща канамицин,
- получаване на трансформирани растения от културата на последните в подходящи среди,
- екстракция на рекомбинантна LGC и/или на полипептид (Δ54) и/или на полипептид (Δ4), именно чрез раздробяване в подходящ буфер на семената на тези трансформирани растения, центрофугиране и събиране на надутаечната течност, съставляваща растителния екстракт с
ензимна активност,
- при желание, пречистване на рекомбинантната LGC и/или на полипептида (Δ54) и/или на полипетида (Δ4) от екстракта получен в предишния етап, имено чрез хрроматография на надутаечната течност, което води до получаване на рекомбинатната LGC и/или на полипептида (Δ54) и/или на полипетида (Δ4), в по същество чиста форма.
По-специално, изобретението има за предемет получаването на полипетид (Δ54), чрез използване на гореописания метод, при който трансформираните клетки са клетки от експланти на рапица или на тютюн и екстракцията на полипептида (Δ54) се осъществява именно чрез раздробяване на трансформираните семена.
Растителните клетки трансформирани по методите описани тук по-горе се избират изгодно между тези на тютюн, рапица, царевица, грах, домати, моркови, жито, ечемик,
картофи, соя, слънчоглед, маруля, ориз и люцерна.
Изобретението визира по-специално метод за получаване на рекомбинантна LGC и/или на полипептида (Δ54) и/или на полипептида (Δ4), характеризиращ се с това, че се състои в:
- трансформация на клетките на калус от царевица, чрез бомбардиране на последните с помощта на оръдие с частици, с плазмиди съдържащи рекомбинантна нуклеотидна последователност pAR-LAR-PSLGL-LGC и/или последователност pY3enH-PSLGL-LGC и/или последователност pyaenH-PSLGL-LGC-KDEL,
- селекция на трансформираните калуси в среда съдържаща селективно средство като канамицин,
- получаване на трансформирани растения от царевица като се излиза от трансформираните калуси, чрез култивиране на последните в подходящи среди,
- екстракция на рекомбинантната LGC и/или на полипептида (Δ54) и/или на полипептида (Δ4), посредством раздробяване в подходящ буфер на семената получени от трансформираните растения, центрофугиране и събиране на надутаечната течност, съставляваща растителния екстракт с ензимна активност,
- при желание, пречистване на рекомбинантната LGC и/или на полипептида (Δ54) и/или на полипептида (Δ4) от екстракта, получен при предходния етап, чрез хроматография на надутаечната течност, което води до получаването на рекомбинантна LGC и/или на полипетид (Δ54) и/или на полипептид (Δ4), в по същество чиста форма.
Изобретението има за предмет също всяка
растителна клетка трансформирана генетично, съдържаща една (или повече) рекомбинантна(и), нуклеотидна(и) последователност(и) както са описани тук по-горе, съгласно изобретението, интегрирани по стабилен начин в техния геном.
Изобретението се отнася също до всяка трансгенна растителна клетка, както е описана тук по-горе, съдържаща един (или повече) рекомбинантен(и) полипетид(и) съгласно изобретението, такива като рекомбинантна LGC и/или полипептид (Δ54) и/или полипептид (Δ4), като тази растителна клетка е означена още като растителна клетка с ензимна активност и по-специално с липазна активност, както е дефинирана тук по-нататък.
Изобретението има за предмет също генетично трансформирани семена, съдържащи една (или повече) рекомбинантна(и) нуклеотидна(и) последователност(и), както са описани тук по-горе, съгласно изобретението, интегрирани по стабилен начин в техния геном.
Изобретението се отнася също до трансгенни семена, описани тук по-горе, и съдържащи един (или повече) рекомбинантен(и) полипептид(и) съгласно изобретението, като рекомбинантна LGC и/или полипептид (Δ54) и/или полипептид (Δ4), като тези семена са означени още като семена с ензимна активност и по-специално с липазна активност, както е дефинирана тук по-нататък.
Трансформираните семена съгласно изобретението са тези събрани от растения трансформирани генетично съгласно изобретението, като тези трансформирани растения са или от поколението ТО споменато по-горе и получени чрез култивиране на клетки трансформирани съгласно изобретението, или тези от следващите поколения (Τι, Т2 и
т.н.), получени чрез самооплождане или чрез кръстосване на
растения от предшестващи поколения (както е посочено тук по-горе).
Изобретението има за предмет също растения или части от растения (именно експланти, стебла, листа, плодове, корени, полени, и пр.) трансформирани генетично, характеризиращи се с това, че съдържат една (или повече) рекомбинантна(и) нуклеотидна(и) последователност(и) както са описани тук по-горе, съгласно изобретението, интегрирани по стабилен начин в техния геном.
Растението се отнася също до трансгенни растения или части от растения, описани тук по-горе, съдържащи един (или повече) рекомбинантен(и) полипептид(и) съгласно изобретението, като рекомбинантна LGC и/или полипептид (Δ54) и/или полипептид (Δ4), като споменатите растения или части от растения са означани още растения или части от растения с ензимна активност и по-специално с липазна активност, както е дефинирано тук по-нататък.
Изобретението има за предмет по-специално, трансформираните растения, както са получени чрез култивиране на клетките или на семената както са описани тук по-горе, съгласно изобретението.
Растенията или частите от растения трансформирани съгласно изобретението изгодно се избират между рапица, тютюн, царевица, грах, домати, моркови, жито, ечемик, картофи, соя, слънчоглед, ориз, маруля, люцерна и цвеклоили части от тези растения.
Настоящото изобретение има за предмет всеки растителен екстракт с ензимна активност и по-специално с липазна активност дефинирана тук по-нататък, който е получен чрез изпълнение на някой от методите описани тук по-горе, съгласно изобретението, съдържащ в качеството на активни ензими един (или повече) рекомбинантен(и) полипептид(и), такива като рекомбинантна LGC и/или полипептид (Δ54) и/или полипептид (Δ4).
Липазната (или липолитична) активност на растенията или частите от растения и растителните екстракти с ензимна активност съгласно изобретението може да бъде изместена, по-специално по метода на Gargouri (Gargouri et al., 1986), като се използва триглицерид с къса верига (като трибутирин) като субстрат. Ензимната активност се дава в единици U, като една единица U отговаря на количеството необходим ензим, за да се освободи един цто! свободни мастни киселини за минута, при 37°С, при оптимални условия на pH.
Растителните екстракти с ензимна активност съгласно изобретението са изгодно такива, че тегловният процент на ензимно активните рекомбинантни полипептиди представлява около 0,1% до 20%, а имено 1 % до 15% спрямо общото тегло на протеините съдържащи се в тези екстракти, което отговаря в мерките за ензимната активност на от около 0,5 U за g свежо тегло (СТ) на листата до около 1000 U/g СТ на листата, имено около 10 U/g СТ до около 300 U/g СТ на листата, или още от около 1U/g СТ на зърната до около 5000U/g СТ, именно от около 10U/g СТ на зърната до около 1000U/g СТ на зърната.
Изобретението има по-специално за предмет растителни екстракти със следната ензимна активност:
* екстракти от листа, и/или плодове и/или зърна на растения, които са получени чрез трансформация на клетките на експланти от тези растения с последователност pd35SPSLGL-LGC, или последователност pd35S-PS-LGC, или последователност pd35S-PPS-LGC, съгласно някой от методите описани тук по-горе и съдържащи рекомбинантна LGC и/или полипептид (Δ54) и/или полипептид (Δ4), а именно:
- екстракт от листа от тютюн, получен чрез трансформация на клетки от експланти от листата на тютюна с последователност pd35S-PS-LGC, или последователност pd35S-PPS-LGC, съгласно гореописания метод и съдържащ полипептид (Δ54), заедно с полипептид (Δ4), като тегловният процент на сместа от тези полипептиди спрямо общото тегло на протеините съдържащи се в този екстракт, е от около 0,1% до около 20%, ензимната активност на който екстракт е от около 100U/g СТ до около 300 U/g СТ,
- екстракт от листата или от плодовете на домати, както са получени чрез трансформация на клетки от експланти от листата на домати с последователност pd35S-PS-LGC, или последователност pd35S-PPS-LGC, съгласно метода описан тук по-гори и съдържащ полипептид (Δ54), заедно с полипептид (Δ4), като тегловният процент на сместа от тези два полипептида спрямо общото тегло на протеините съдържащи се в този екстракт е от около 0,1% до около 20%, ензимната активност на екстракта е от около 100 U/g СТ до около 300 U/g СТ,
- екстракт от листа от тютюн, както е получен чрез
трансформация на клетки от експланти от листата на тютюна с последователност pd35S-PSLGL-LGC, съгласно метода описан тук по-горе и съдържащ полипептид (Δ4), като тегловният процент на този полипептид спрямо общото тегло на наличните протеини в екстракта е около 0,1% до около 20%, като ензимната активност на екстракта е около 100 U/g СТ до около 300 U/g СТ,
-екстрактът от семената на тютюна, както е получен чрез трансформация на клетки от експланти от листата на тютюна с последователността pd35S-PS-LGC или последователността pd35S-PPS-LGC, съгласно метода описан тук по-горе и съдържащ полипептида (Δ54), като тегловният процент на полипептида (Δ54) спрямо общото тегло на наличните протеини в споменатия екстракт е от около 0,1% до около 1%, като ензимната активност на споменатия екстракт е от около 10 U/g СТ до около 300 U/g СТ, * екстракти от зърната на растения както са получени чрез трансформация на клетки от експланти от тези растения с последователност pCRU-PS-LGC или последователност pCRU-PPS-LGC или последователност pGEA1-PSLGL-LGC или последователност pGEA6-PSLGL-LGC, съгласно някой от методите описани тук по-горе и съдържащи рекомбинантна LGC и/или полипептид (Δ54) и/или полипептид (Δ4), именно:
- екстракт от семена на рапица, както е получен чрез трансформация на клетки от експланти от листата на рапица с последователност pCRU-PS-LGC, или последователност pCRU-PPS-LGC, или последователност pGEA1-PSLGL-LGC, или последователност pGEA6-PSLGL-LGC, съгласно метода описан тук по-горе и съдържащ полипептид (Δ54), като тегловният процент на полипептида (Δ54) спрямо общото тегло на наличните протеини в този екстракт е от около 0,1% до около 1%, като ензимната активност на екстракта е от около 10 u/g СТ до около 1000 U/g СТ, * екстракти от семена на растения, както са получени чрез трансформация на клетки от експланти от тези растения с последователност pAR-IAR-PSLGL-LGC и/или последователност рузеин-PSLGL-LGC и/ или последователност
PY3enH-PSLGL-LGC-KDEL, съгласно някой от методите описани тук по-горе и съдържащи рекомбинантна LGC и/или полипептид (Δ54) и/или полипептид(Δ4), именно:
- екстракт от семена на царевицата, както е получен чрез трансформация на клетки от царевица (а именно от царевичен калус) с последователност pAR-IAR-PSLGL-LGC и/или последователност рузеин-PSLGL-LGC и/или последователност рузеин-PSLGL-LGC-KDEL, съгласно метода описан тук по-горе и съдържащ полипептид (Δ54), като тегловният процент на полипептида (Δ54) спрямо общото тегло на протеините налични в този екстракт е от около 0,1% до около 1%, като ензимната активност на екстракта е от около 10 U/g СТ до около 1000 U/g СТ.
Предмет на настоящото изобретение е също всяка рекомбинантна ензимно активна LGC, чиято аминокиселинна последователност е тази представена на фигура 2, или полипептиди получени от последната, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселина(и), като тези производни полипептиди показват липазна активност, както са получени в по същество
чиста форма, чрез изпълнение на някой от методите описани тук по-горе, съгласно изобретението, като тези методи обхващат етап на пречистване на рекомбинантните полипептиди съгласно изобретението, а именно чрез хроматография на ензимните екстракти описани тук по-горе.
В качеството на полипептиди производни на рекомбинантната LGC, изобретението има за предмет поспециално полипептидите (Δ54) и (Δ4) посочени по-горе тук, чиито молекулни маси са съответно около 37 kDa и около 49 kDa.
Под ензимно активна рекомбинантна LGC, или производни полипептиди показващи липазна активност, както са споменати тук по-горе, се разбира всеки рекомбинантен полипептид способен да показва липазна активност, както е измерена съгласно метода на Gargouri, споменат тук по-горе.
За илюстрация, рекомбинантните полипептиди съгласно изобретението показват липазна активност от около 10 U/mg от рекомбинантните полипептиди до около 1000 U/mg, за предпочитане от около 100 U/mg до около 600 U/mg.
Изобретението се отнася по-специално до рекомбинантна LGC такава както е получена чрез пречистване на ензимния екстракт от листа или семена на тютюн, като тези листа или семена са от трансформирани тютюневи растения, като самите те са получени от клетки от тютюн трансформирани с последователност pd35S-PSLGL-LGC съгласно метода описан тук по-горе, като тази рекомбинантна LGC показва липазна активност както е описана тук по-горе.
Изобретението има за предмет също полипептид (Δ54) и полипептид (Δ4), както са получени чрез пречистване от ензимния екстракт от листата и/или семената и/или плодовете на растения, а именно от Solanaceae като трансформирани тютюн или домати, като тези последните са получени от клетки на растения трансформирани с последователност pd35S-PS-LGC, или последователност pd35S-PPS-LGC, или последователност pd35S-PSLGL-LGC, съгласно метода описан тук по-горе, като тези рекомбинантни полипептиди (Δ54) и (Δ4) показват липазна активност такава
каквато е описана тук по-горе.
Изобретението се отнася също до полипептид (Δ54), какъвто е получен чрез пречистване от ензимния екстракт от семената на тютюна, или от този от семената на рапицата, като тези семена са съответно от трансформирани растения от тютюн или рапица, самите те получени съответно като се излиза от клетки на тютюн или на рапица трансформирани с последователност pCRU-PS-LGC, или последователност pCRUPPS-LGC, съгласно методите описани тук по-горе, като рекомбинантният полипептид (Δ54) показва липазна активност както е описана тук по-горе.
Изобретението има за предмет също полипептид (Δ54) и полипептид (Δ4) както са получени чрез пречистване от ензимния екстракт от семената на рапицата, като тези семена са от трансформирани рапични растения, самите те получени от клетки на рапица трансформирани с последователност pGEA1-PSLGL-LGC и/или последователност pGEA6-PSLGL-LGC, съгласно методите описани тук по-горе, като рекомбинантните полипептиди (Δ4) и (Δ54) показват липазна активност както е описана по-горе.
Изобретението има за предмет също полипептид
(Δ54) и полипептид (Δ4), такива каквито са получени чрез пречистване от ензимния екстракт от семената на царевицата, като тези зърна са от трансформирани царевични растения, а самите те са получени от клетки на царевица трансформирани с последователност pAR-IAR-PSLGL-LGC и/или последователност py3enH-PSLGL_LGC и/или последователност PY3enH-PSLGL-LGC-KDEL, съгласно методите описани тук погоре, като рекомбинантните полипептиди (Δ4) и (Δ54) показват липазна активност такава както е описана тук погоре.
Явните молекулни маси на полипептидите (Δ54) и (Δ4) съгласно изобретението са съответно 37 kDa и 49 kDa,
измерени чрез анализ на полиакриламиден гел и чрез имунодетекция след електропренос върху нитроцелулоза (тези методи са дадени в подробности в примерите, които следват за изпълнение на изобретението).
Изобретението се отнася до антитела насочени срещу рекомбинантните полипептиди съгласно изобретението и по специално тези насочени срещу рекомбинантната LGC съгласно изобретението и /или срещу полипептида (Δ54) и/или срещу полипептида (Δ4) споменати по-горе и способни също да разпознават LGH.
Такива антитела могат да бъдат получени чрез имунизиране на животно с тези полипептиди, последвано от събиране на образуваните антитела.
Разбира се от самосебе си, че това продуциране не е ограничено до поликлоналните антитела.
То се прилага също към всяко моноклонално антитяло продуцирано от всеки хибридом способен да бъде образуван по класическите методи, като се излиза от клетки от далака на животно, а именно мишки или плъхове, имунизирани срещу един от пречистените полипептиди от изобретението от една страна, и от друга страна, клетки от подходяща миелома и селекционирани по капацитета си да произвеждат моноклонални антитела разпознаващи горните полипептиди, първоначално приготвен за имунизация на животните, както и LGH.
Изобретението се отнася също до използването на
растения, части от растения, клетки от растения или семена трансформирани съгласно изобретението, за получаване на един (или повече) рекомбинантен(и) полипептид(и) съгласно изобретението, като рекомбинантната LGC или получените от нея полипептиди, както са дефинирани тук по-горе, а именно чрез осъществяване на един от методите от изобретението споменати по-горе, като тези рекомбинантни полипептиди са в по същество чиста форма или се съдържат в растителните екстракти с ензимна активност както са дефинирани тук погоре.
Изобретението има за предмет също използването в областта на храненето на човека или животните, на растения или части от растения с ензимна активност съгласно изобретението, или растителни екстракти с ензимна активност както са дефинирани тук по-горе или още рекомбинантни полипептиди съгласно изобретението, като рекомбинантна LGC или нейните производни полипептиди, както са дефинирани тук по-горе.
Изобретението се отнася по-специално до използването, в качеството на храни на растения или части от
растения, а именно листа, плодове, семена с ензимна активност съгласно изобретението.
В това си качество, изобретението има за предмет по-специално всяка храна съставена от растение с ензимна активност както е описана тук по-горе или от части от това растение, а именно листа или плодове или още семена получени от последните и способна(и) да покаже(ат) хранителни качества за човек или животно.
Изобретението се отнася също до всеки хранителен състав съдържащ едно (или повече) растение(я) с ензимна активност както са описани тук по-горе, и/или части от тези растения, а именно листа и/или семена и/или плодове от това (тези) растение(я) и/или един (или повече) расителен(ни) екстракт(и) с ензимна активност както са описани тук по-горе, и/или един (или повече) рекомбинантен(и) полипептид(и) от изобретението, при желание заедно с една (или повече) друга(и) ядлива(и) съставка(и).
Изгодно, растенията или частите от растения, съдържащи се в хранителния състав са под формата на раздробена маса.
Храните съгласно изобретението, означени още като функционални храни, или хранителните състави съгласно изобретението са по-специално предназначени да улеснят абсорбцията на животинските или растителни мазнини погълнати от здрав индивид или от засегнат от една или няколко патологии увреждащи или не размера на продукцията на стомашна и/или панкреасна липаза. В това си качество, храните или хранителните състави съгласно изобретението са използвани изгодно като хранителни допълнения.
Изобретението има също за предмет използването на растения или на части от растения, а именно листа и/или плодове и/или семена, или на растителни клетки с ензимна активност съгласно изобретението, или на растителни екстракти с ензимна активност както са дефинирани тук погоре, или също на рекомбинантни полипептиди съгласно изобретението като рекомбинантна LGC или нейните производни полипептиди както са дефинирани тук по-горе, за получаване на лекарства (или на фармацевтични състави) предназначени да улеснят абсорбцията на животински или растителни мазнини погълнати от здрав индивид или засегнат от една или повече патологии, увреждащи или не размера на продуциране на стомашна или панкреасна липаза.
По-специално, такива фармацевтични състави се използват изгодно при индивиди подложени на медицинско лечение, променящо механизма на абсорбция на мазнините или също при възрастни хора.
Фармацевтичните състави съгласно изобретението
са също по-специално предназначени за лечение на патологии свързани с недостиг на липази (именно на стомшна(и) и/или панкреасна(и) липаза(и)) в организма и по специално на патологии като муковисцидоза и екзокринна панкреасна недостатъчност.
Изобретението има по-специално за предмет всеки фармацевтичен състав съдържащ един (или повече) растителен(и) екстракт(и) с ензимна активност описан(и) тук по-горе и/или един (или повече) рекомбинантен(и) полипептид(и) съгласно изобретението, при желание, заедно с фармацевтично приемлив носител.
Изобретението има по-специално за предмет всеки фармацевтичен състав споменат по-горе, който съдържа рекомбинантнаЬСС и/или полипептид (Δ54) и/или полипептид (Δ4) в по същество чиста форма или под формата на ензимни екстракти както са описани тук по-горе.
Фармацевтичните състави съгласно изобретението се прилагат за предпочитане по орален път и се представят под формата на гелове, таблети или прахове за разреждане.
Дневната дозировка при човек изгодно е от около 200 mg до около 1000 mg , разпределена за предпочитане в моментите на главните яденета, когато споменатите фармацевтични състави съдържат ензимни екстракти, както са описани тук по-горе, и от около 100 mg до около 500 mg, когато споменатите фармацевтични състави съдържат рекомбинантни полипептиди съгласно изобретението, в по същество чиста форма.
Предмет на изобретението е също използването на растения или на части от растения, именно листа и/или плодове и/или семена, или на растителни клетки с ензимна активност съгласно изобретението, или на растителни екстракти с ензимна активност както са дефинирани тук погоре, или още на рекомбинантни полипептиди съгласно изобретението, като рекомбинантна LGC или нейни производни полипептиди както са дефинирани тук по-горе, за осъществяване на ензимни реакции в областта на индустрията, агрохранителната или агроиндустриалната, а именно в маслопреработващата промишленост, химията на липидите и млечната промишленост.
В това си качество, изобретението се отнася до всеки метод, а именно на ензимна биоконверсия или на биокатализа, чрез осъществяване на една или повече ензимни реакции в промишлената област, агрохранителната или агро индустриалната области, именно в маслопреработващата промишленост, химията на липидите и млечната промишленост, като тези ензимни реакции се извършват с помощта на растения, или на части на растения, а именно на листа и/или плодове, и/или семена, или на растителни клетки с ензимна активност съгласно изобретението, или на
растителни екстракти с ензимна активност както са дефинирани тук по-нагоре, или още на рекомбинантни полипептиди съгласно изобретението като рекомбинантна LGC или нейни производни полипептиди както са дефинирани тук
по-горе.
Изобретението има за предмет по-специално ензимни препарати с промишлено предназначение, агрохранително или агроиндустриално, които могат да бъдат използвани в рамките на осъществяване на метод както е описан тук по-горе, които се състоят от един (или повече) растителен(и) екстракт(и) с ензимна активност, както са дефинирани тук по-горе и/или един (или повече) рекомбинантен(и) полипептид(и) съгласно изобретението, а именно рекомбинантна LGC и/или полипептид (Δ54) и/или полипептид (Δ4), при желание, заедно с една (или повече) добавка(и) и друг(и) ензим(и), които могат да бъдат използвани в рамките на гореспоменатото промишлено приложение.
Изобретението се отнася по-специално до използването на растения, или на части от растения, а именно
листа и/или плодове и/или семена или на растителни клетки с ензимна активност съгласно изобретението, за осъществяване, в индустриален масщаб на реакции на ензимна биоконверсия или на биокатализа, като хидролизи или ензимно трансестерифициране.
Изгодно, растенията с ензимна активност или частите от тези растения, а именно листа и/или плодове и/или семена, или растителни клетки съгласно изобретението, се използват едновременно в качеството си на ензимен източник и на реакционен субстрат.
Изобретението има за предмет също всеки метод за биокатализа, който използва растения или части от растения, а именно листа и/или плодове и/или семена или растителни клетки с ензимна активност съгласно изобретението и поспециално растения съдържащи рекомбинантна LGC и/или полипептид (Δ54) и/или полипептид (Δ4), като тези растения или части от растения се използват едновременно в качеството си на ензимен източник и на реакционен субстрат.
Изобретението се отнася по-специално до използването на растения с ензимна активност или на части от тези растения, съгласно изобретението, за получаване на биовъглеводороди.
В това си качество, настоящото изобретение има за предмет всеки метод за получаване на биовъглеводороди чрез прибавяне на алкохол, а именно на метанол или етанол към смлян материал от цели или части от растения трансформирани съгласно изобретението, изгодно към смлени зърна от рапица, слънчоглед или соя, трансформирани съгласно изобретението и събиране на биовъглеводорода, а
именно чрез филтриране.
Изобретението се отнася също до естери на растителни мастни киселини, като получените чрез осъществяване на горния метод, а именно метиловия естер на олеиновата киселина.
Изобретението има за предмет също всеки биовъглеводород, както е получен чрез осъществяване на някой метод, както е описан тук по-горе и по-специално всеки биовъглеводород, споменат по-горе, съдържащ естери на растителни мастни киселини.
Изобретението се отнася по-специално до всеки биовъглеводород, както е получен чрез осъществяване на горния метод, като се излиза от семена на рапица и обхващащ метилов естер на олеиновата киселина.
Изобретението обхваща също използването на горните антитела насочени срещу рекомбинантните полипептиди от изобретението, за осъществяване на метод за откриване или за определяне съдържанието на LGC или на LGH в биологична проба, която може да ги съдържа.
Изобретението се отнася по-специално до изпалзването на тези антитела за осъществяване на метод за диагностика in vitro на патологии свързани със свърхпроизводството или обратно, с недостиг, включително отсъствие на продукция на липаза в организма.
Този метод на диагностика in vitro, осъществен върху предварително взета от пациента биологична проба, обхваща етап на смесване на пробата с едно или повече антитела съгласно изобретението, последван от етап на откриване на евентуални комплекси антитяло-LGH, образувани в предходния етап.
В това си качество, изобретението се отнася също до прибор за осъществяване на метода за откриване или диагностика in vitro, споменат по-горе, който съдържа:
- антитела както са описани тук по-горе, изгодно маркирани по радиоактивен или ензимен път, както и реактивите за съставяне на благоприятна среда за извършване на имунологична реакция между тези антитела и LGH,
- реактиви позволяващи откриването на имунологични комплекси, образувани между тези антитела и LGH.
Настоящото изобретение има за предмет поспециално използването на рекомбинантна нуклеотидна последователност, съдържаща от една страна кДНК представена на фигура 4 и кодираща за човешка стомашна липаза (LGH) представена на фигура 5, или получена от тази кДНК нуклеотидна последователност, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на един (или повече) нуклеотид(и), като споменатата производна последователност е способна да кодира за един полипептид, чиято аминокиселинна последователност е идентична на тази на LGH представена на фигура 5, или за един полипептид получен от LGH, чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселина(и), като този производен полипептид показва липазна активност, и от друга страна, елементите позволяващи на една растителна клетка да произвежда полипептида,кодиран от споменатата кДНК или от една производна последователност спомената по-горе, а
именно един промотор и един терминатор на транскрипцията разпознавани от механизма на транскрипция у растителните клетки (и по-специално от РНК полимеразите на последните), за трансформация на клетките на растенията, с оглед на получаването, като се тръгне от тези клетки или от растения, получени от последните, на рекомбинантна LGC под формата на активен ензим или на един (или повече) полипептид(и) производен(и) на последната, както са дефинирани тук погоре.
В това си качество, изобретението се отнася до всяка рекомбинантна нуклеотидна последователност както е описана тук по-горе в рамките на трансформацията на растения, с оглед получаването на рекомбинантна LGC, в която нуклеотидната последователност кодираща за LGC и представена на фигура 1 или фигура 3, е заместена от нуклеотидна последователност кодираща за LGH и представена на фигура 4.
Изобретението има за предмет по-специално следните рекомбинантни нуклеотидни последователности:
- тази (означена pSP-PSLGH-LGH) съдържаща в посоката 5' > 3' промотор pSP от Agrobacterium tumefaciens, последователност кодираща за сигналния пептид на LGH, като тази последната е непосредствено последвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 4, след това от терминатора polyA 35S на CaMV,
- тази (означена pSP-PSLPH-LGH) съдържаща в посоката 5'->3' промотор pSP от Agrobacterium tumefaciens, последователност кодираща за сигналния пептид на LPH, като последната е непосредствено последвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 4, след това от терминатора polyA 35S на CaMV,
- тази (означена pSP-PSLGL-LGH) съдържаща в посоката 5'->3' промотор pSP от Agrobacterium tumefaciens, последователност кодираща за част от сигналния пептид на LGL (както е описана тук по-горе), като последната е непосредствено следвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 4, след това от терминатора polyA 35S на CaMV.
Изобретението се отнася също до векторите и клетките гостоприемници трансформирани от тези вектори, както са описани по-горе тук, и съдържащи рекомбинантните нуклеотидни последователности кодиращи за LGH и/или нейни производни полипептиди.
Настоящото изобретение има за предмет също всеки метод за получаване на рекомбинантна LGH под формата на активен ензим и/или на един (или повече)
полипетид(и) получени от последната, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселина(и), като този (или тези) производен(и) полипептид(и) показва(т) липазна активност, характеризиращ се с това, чесе състои в:
- трансформация на растителни клетки по начин, че да се интегрира в генома на тези клетки една (или повече) рекомбинантна(и) нуклеотидна(и) последователност(и) съгласно изобретението,
- при желание, получаването на трансформирани растения от трансформираните клетки,
- събиране на рекомбинантна LGH и/или на
полипептид (или полипептиди) споменат(и) по-горе, произведен(и) в тези трансформирани клетки или растения, а именно чрез екстракция, последвана при желание от пречистване.
Изобретението има по-специално за предмет всеки метод за произвеждане на рекомбинантна LGH чрез осъществяване на метод както е описан тук по-горе в рамките на произвеждане на рекомбинантна LGC и/или нейни производни полипептиди с помощта на рекомбинантна последователност съдържаща последователността представена на фигура 4.
Между полипептидите получени от рекомбинантната LGH, способни да бъдат получени в обхвата на метода съгласно изобретението, могат да бъдат споменати:
- полипептид ограничен от аминокиселините разположени в позиции 74 и 398 на фигура 5, означен още като полипептид (Δ54 LGH),
- полипептид ограничен от аминокиселините разположени в позициите 24 и 398 на фигура 5, означен още полипептид (A4LGH).
Изобретението се отнася по-специално до метод за получаване както е описан тук по-горе, на рекомбинантна LGH и/или на полипептид (Δ54 LGH) и/или на полипептид (A4LGH), характеризиращ се с това, че се състои в:
- трансформация на клетки от експланти от листата на растение, чрез смесване на последните с източник на Agrobacterium tumefaciens трансформиран посредством плазмид както е описан тук по-горе, съдържащ рекомбинантна нуклеотидна последователност pSP-PSLGH-LGH и/или pSP52
PSLPH-LGH и/или pSP-PSLGL-LGH, споменати по-горе, върху подходяща среда за култивране,
-селекция на трансформираните експланти върху среда съдържаща канамицин,
- получаване на трансформирани растения от трансформираните експланти споменати по-горе, чрез култивиране на последните в подходящи среди,
- екстракция на рекомбинантна LGH и/или на полипептид (A54LGH) и/или на полипептид (A4LGH), а именно чрез смилане на листата и/или на семената и/или на плодовете на трансформираните растения, в подходящ буфер, центрофугиране и събиране на надутаечната течност, която представлява растителния екстракт с ензимна активност,
- при желание, пречистване на рекомбинантната
LGH и/или на полипептида (Δ54 LGH) и/или на полипептида
(A4LGH) от екстракта получен в предходния етап, а именно чрез хроматография на надутаечната течност, което води до получаването на рекомбинантната LGH и/или на полипептида (A54LGH) и/или на полипептида (A4LGH) в по същество чиста форма.
Изобретението се отнася също така до всяко растение или част от това растение, а именно листа и/или плодове и/или семена, съдържащи една (или повече) рекомбинантна(и) нуклеотидна(и) последователност(и) както са описани тук по-горе, съгласно изобретението, интегрирани стабилно в техния геном.
Настоящото изобретение има за предмет всеки растителен екстракт с ензимна активност и по-специално с липазна активност дефинирана тук по-горе, който е получен
чрез осъществяване на един от методите описани тук по-горе в изобретението, който съдържа в качеството на активни ензими един (или повече) от рекомбинантните полипептиди съгласно изобретението, като рекомбинант LGH и/или полипептид (A54LGH) и/или полипептид (A4LGH).
Изобретението има по-специално за предмет екстракти от листа и/или семена на растенията, както са получени чрез трансформация на клетки от експланти от тези растения с последователност pSP-PSLGH-LGH, или последователност pSP-PSLPH-LGH, или последователност pSP-PSLGL-LGH, съгласно методите описани тук-по-горе и съдържащи рекомбинантна LGH и/или полипептид (A54LGH) и/или полипептид (A4LGH), а именно:
- екстракт от листа или семена на тютюн, както е получен чрез трансформация на клетки от експланти от листа на тютюн с последователност pSP-PSLGH-LGH, или последователност pSP-PSLPH-LGH, или последователност pSP-PSLGL-LGH, съгласно метода описан тук по-горе и съдържащ полипептид (A54LGH), заедно с полипептид (A4LGH), като тегловният процент на сместа от тези два полипептида по отношение на общото тегло на протеините налични в споменатия екстракт е от около 0,1% до около 20%, като ензимната активност на този екстракт е от около 100 U/g СТ до около 300 U/g СТ,
- екстракт от листа на тютюн, както е получен чрез трансформация на клетки от експланти от листата на тютюн с последователност pSP-PSLGL-LGH и съдържащ полипептида (A4LGH), като тегловният процент на този полипептид по отношение на общото тегло на протеините намиращи се в екстракта е от около 0,1% до около 20%, като ензимната активност на екстракта е от около 100 U/g СТ до около 300 U/g СТ.
Настоящото изобретение има за предмет също всяка рекомбинантна, ензимно активна LGH, чиято
аминокиселинна последователност е тази представена на фигура 5, или полипептид получен от последната, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселина(и) и по-специално полипептидите (A54LGH) и (A4LGH), като тези производни полипептиди показват липазна активност, както са получени в по същество чиста форма чрез изпълнение на един от методите описани тук в изобретението, като тези методи обхващат етап на пречистване на рекомбинантните полипептиди съгласно изобретението, а именно чрез хроматография на ензимните екстракти описани тук по-горе.
Както бе описано по-рано в обхвата на рекомбинантната LGC, изобретението има за предмет също:
- антитела поликлонални или моноклонални
насочени срещу рекомбинантната LGH или нейните производни полипептиди съгласно изобретението и тяхното използване както е описано тук по-горе,
- храни, или хранителни състави, или фармацевтични състави, или ензимни препарати с промишлено предназначение на базата на растения или на части от растения, а именно от листа и/или плодове и/или семена или от растителни клетки или от растителни екстракти с ензимна активност, както са дефинирани тук по-горе, или още от рекомбинантна LGH или от нейнипроизводни полипептиди съгласно изобретението,
- всеки метод за ензимна биоконверсия или за биокатализа или за получаване на биовъглеводороди, както са описани тук по-горе, като се излиза от рекомбинантната LGH или нейните производни полипептиди съгласно изобретението, или от растения, или от части от растения, а именно от листа и/или плодове и/или семена и/или от растителни екстракти с ензимна активност, както са дефинирани тук по-горе.
Изобретението е допълнително илюстрирано с подробно описание, което следва, за получаване на рекомбинантни нуклеотидни последователности такива каквито са описани тук по-горе, както и на трансформирани растения продуциращи рекомбинантни полипептиди съгласно изобретението, и на метод за получаване на биовъглерод.
I. КОНСТРУИРАНЕ НА ХИМЕРИЧНИ ГЕНИ, КОДИРАЩИ ЗА^ РЕКОМБИНАНТНИЯ ПРОТЕИН НА КУЧЕШКА СТОМАШНА
ЛИПАЗА И ПОЗВОЛЯВАЩИ ЕКСПРЕСИЯ В ЛИСТАТА И
СЕМЕНАТА НА SOLANACEAE
1-А) Конструиране на химерични гени кодиращи за рекомбинантна LGC и позволяващи експресия в тютюна
Експресията в листата и зърната на тютюна на гена кодиращ за кучешка стомашна липаза (LGC) изисква следните регулиращи последователности:
1. Определящ промотор, двоен 35S (pd35S) от CaMV (вирус на мозайката по карфиола).
Той отговаря на едно удвояване на последователностите активиращи транскрипцията разположена по посока на елемента ТАТА от естествения
промотор 35S ( Kay et al., 1987);
2. Последователност завършваща транскрипцията, терминатор polyA 35S, която отговаря на некодиращата област 3' от последователността на вируса с двойноверижна кръгова ДНК от мозайката по карфиола, произвеждаща транскрипта 35S (Franck et al.,1980).
Конструкциите на различни плазмиди чрез използване на техниките с рекомбинантна ДНК (Sambrook et al.,1989) произлизат от рВ1ОС4. Този двоен плазмид произлиза от pGA492 (An, 1986), който се съдържа между страните дясно и ляво; получават се от плазмида pTiT37 на Agrobacterium tumefaciens, върху неговата ДНК за трансфер, следните последователности:
- определящ промотор на гена nos кодиращ за нопалин синтаза (Depicker et al., 1982), кодираща последовтелност от гена nptll кодиращ за неомицин фосфотрансфераза II (Berg et Berg, 1983) делетирана от областта на 8 първи кодони, чийто кодон инициатор метионин ATG е слят към последователността от 14 първи кодони на кодиращата последователност на гена nos (Depicker et al., 1982), кодираща последователност на гена nos лишена от областта на 14 първи кодони, терминатор nos (Depicker et al., 1982), една област съдържаща мултиплени сайтове за клониране (наричана още полилинкер)(НтсПП-ХЬа1-Зас1-Нра1Kpnal-Clal-Bglll) предхождаща гена cat кодиращ за хлорамфеникол ацетилтрансферазата (Close et Rodriges, 1982), и завършващите последователности на гена 6 на плазмида pTiA6 на Agrobacterium tumefaciens (Liu et al., 1993). За да се елиминира квази-тоталността на кодиращата
последователност на гена cat, плазмидът pGA492 се смила двукратно с Sacl (сайт на рестрикция на полилинкера) и със Seal (сайт на рестрикция намиращ се в последователността на гена cat) след това се подлага на действието на ензима Т4 ДНК полимераза (New England Biolabs) съгласно препоръките на производителя. Лигирането на модифицирания плазмид (20 ng) се извършва в реакционна среда от 10 ml съдържаща 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham); 2,5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). ДНК от плазмидите на получените клонове, селекционирани върху 12 цд/т1 тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979 ) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. След това, сайта на рестрикция Hind III на плазмидната ДНК от задържания клон се модифицира в един сайт на рестрикция EcoRI с помощта на фофорилирания адаптатор Hindlll-EcoRI (Stratagene Cloning Systems). За да се осъществи тази модификация, 500 ng от плазмидната ДНК от задържания клон се смилат с Hindlll, дефосфорилират се чрез ензима алкална фосфатаза от тънките черва на телета (Boeringer Manheim) съгласно препоръките на производителя и се съутаяват в присъствието на 1500 ng ДНК адаптатор Hindlll-EcoRI, 1/10 обем натриев ацетат ЗМ pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min След центрофугиране при 12 000 g в продължение на 30 min, утаената ДНК се промива с 70% етанол, суши се, разбърква се отново в 8 ml вода, поставя се при 65°С в продължение на 10 min, след това се
лигира в присъствие на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и 2,5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. След инактивиране на Т4 ДНК лигазата при 65°С в продължение на 10 min реакционната смес от лигирането се смила с EcoRI, пречиства се чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, електроелуира се (Sambrook et al.,1989), утаява се в присъствието на 1/10 обем ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и на 2,5 обема абсолютен алкохол при -80°С в продължение на 30 min, цетрофугира се при 12000 g в продължение на 30 min, промива се с 70% етанол, след това се суши, след това се лигира както е описано тук по-горе. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 12 gg/ml тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира посредством ензимно смилане с Hindlll и EcoRI. Полученият бинерен плазмид, който притежава само последните 9 кодона на кодиращата последователност на гена cat и чийто сайт EcoRI е единствен, се нарича рВЮС4.
Касетата за експресия, съставена от промотора pd35S и от терминатора polyA 35S, се изолира като се тръгне от плазмида рЛТ163А. Плазмидът рЛТ163А, произлиза от плазмида рЛТ163, като самият той произлиза от плазмида рЛТбО (Guerineau et Mullineau, 1993). Плазмидът рЛТ163 притежава един кодон ATG между сайтовете Hindlll и Sall на полилинкера. За да се премахне този ATG и да се получи плазмид рЛТ163А, плазмидната ДНК рЛТ163 се смила двойно с Hindlll и Sall, пречиства се чрез електрофореза върху
агарозен гел 0,8%, електроелуира се (Sambrook et al.,1989), утаява се с 1/10 обем ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугира се при 12000 g в продължение на 30 min, промива се с 70% етанол, суши се, подлага се на действието на ензима Klenow (New England Biolabs) съгласно препоръките на производителя, депротеинизира се чрез екстракция с 1 обем фенол:хлороформ:изоамилов алкохол (25:24:1), след това с хлороформ:изоамилов алкохол (24:1), утаява се в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен алкохол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугира се при 12000 g в продължение на 30 min, промива се с 70% етанол, суши се и накрая се лигира в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и
2,5 U от ензима Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Бактерии Escherichia coli DH5a
преварително направени компетентни се трансформират (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 цд/т1 ампицилин се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. За да се изолира касетата за експресия съставена от промотора pd35S и терминатора polyA 35S (фрагмент SaclXhol), плазмидната ДНК на задържания клон рЛТ163А се смила с Sacl и Xhol. Фрагментът Sacl-Xhol, който носи касетата за експресия се пречиства чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, електроелуира се (Sambrook et al., 1989), утаява се в присъствието на 1/10 от обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен алкохол при -80°С в
продължение на 30 min, центрофугира се при 12000 g в продължение на 30 min, промива се с 70% етанол, суши се, след това се подлага на ензима Mung Bean нуклеаза (New England Biolabs) съгласно препоръките на производителя.Този пречистен инсерт (200 ng) се клонира в плазмидната ДНК на рВ1ОС4 (20 ng) смила се с EcoRI, обработва се с ензима Mung Bean Nuclease и се дефосфорилира с ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Mannheim) съгласно препоръките на производителя. Реакцията на лигиране се осъществява в 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5 U
ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни, се трансформират (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК на получените клонове, селекционирани върху 12 μΙ/ml тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Bimboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича рВ1ОС21.
Кучешка стомашна липаза (LGC) се синтезира природно под формата на прекурсор. Зрелият протеин LGC е съставен от 379 аминокиселини. Комплементарната ДНК на LGC се клонира в сайтовете Bglll и Sall на експресионния вектор pRU303 водещ до вектора pDGL5.303 описан в международна патентна заявка № WO 94/13816. Той се използува за конструирането на бинерните плазмиди рВ1ОС25 съдържащ PS-LGC и рВ1ОС26 съдържащ PPS-LGC или последователността кодираща за зрялата LGC и предхождана от тази кодираща за сигналния пептид (PS) или предпропептид (PPS т.е.един сигнален пептид последван от N-терминални последователности за насочване във вакуолите) от растителен произход, съответно. Последователностите PS и PPS, съставени съответно от 23 и 37 аминокиселини, са тези на един резервен протеин от грудковидните корени на батата: спорамин A (Murakami et al., 1986; Matsukoa et Nakamura, 1991).
За да се опрости сливанета между последователностите зряла LGC и тази на сигналите за насочване, PS или PPS, плазмидът pDGL5.303 се модифицира чрез вмъкване на един допълнителен рестрикционен сайт Hindlll в четвъртия и петия кодони на последователността зряла LGC чрез мутагенеза направлявана от PCR като се използват 2 олигодезоксинуклеотиди, 5' caggagatc TTG ТТТ GGA AAG СТТ CAT ССС 3' (съдържащ единствения сайт BgIII в плазмида и довеждащ допълнителния сайт Hindlll) и 5' CAT АТТ ССТ CAG CTG GGT АТС 3' (съдържащ единствен сайт Pvull в плазмида). Амплификацията на фрагмента Bglll-Pvull чрез PCR се осъществява в 100 μΙ реакционна среда съдържаща 10 μΙ буфер Taq ДНК полимераза х 10 ( 500 mM KCI, 100 тМ TrisHCI, pH 9,0 и 1% Triton х 100), 6 μΙ 25 тМ MgCI2, 3 μΙ 10 тМ dNTP (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), 100 pM от всеки от 2 олигодезоксинуклеотида описани тук по-горе, 5 ng ДНК матрица (експресионен вектор pRU303 съдържащ комплементарната на LGC ДНК), 2,5 U Taq ДНК полимераза (Promega) и 2 капки вазелиново масло. ДНК се денатурира при 94°С в продължение на 5 min, подлага се на 30 цикъла всеки състоящ се от 1 min денатурация при 94°С, 1 min хибридизация при 50°С и 1 min елонгация при 72°С, след това елонгацията при 72°С се продължава в продължение на 5 min Тази реакция PCR се осъществява в апарат ”DNA Thermal Cycler на Perkin Elmer Cetus. Маслото се отстранява чрез екстракция с хлороформ. След това, фрагментите от ДНК
съдържащи се в реакционната среда се утаяват в присъствието на 1/10 обем ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен алкохол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугират се при 12000 g в продължение на 30 min, промиват се с 70% етанол, сушат се и се смилат с 2-та рестрикционни ензима Bglll и Pvull. Фрагментите от смляна ДНК получени от PCR се пречистват посредством електрофореза върху агарозен гел 2%, електоелуират се (Sambrook et al., 1989), утаяват се в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугират се при 12000 g в продължение на 30 min, промиват се с 70% етанол, сушат се и след това се лигират с плазмидната ДНК на вектора pDGL5.303 двойно смляна с Bglll и Pvull, пречисена чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, елекроелуирана, подложена на утаяване с алкохол, сушена и дефосфорилирана с ензима алкална фосфатаза от телешки тънки черва (Boeringer Mannheim) съгласно препоръките на производителя. Лигирането се осъществява с 100 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 50 ng от смлените фрагменти от ДНК получени от амплификацията чрез PCR описана тук по-горе, в реакционна среда от 10 μΙ в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и на 2,5 U от ензима Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии
Escherichia coli предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове селекционирани на 50 цд/т! ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционните ензими. Плазмидната ДНК от някои задържани клонове се потвърждава чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съобразно метода на дидезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977). Въвеждането на този рестрикционен сайт Hind III не модифицира генетичния код на LGC. Действително природната последователност LGC AAA ТТА (Lys-Leu) става AAG СТТ (LysLeu). Резултантният плазмид е наречен рВ1ОС22 и съдържа последователността на зрелия протеин LGC съответстващ на:
LEU РНЕ GLY LYS LEU ----THR ASP ASN LYS АМВ agatcTTG TTG GGA AAG СТТ----АСА GAT ААТ AAG TAG TTTTAGA
Bglll Hindlll Xbal
едиствен рестрикционен сайт единствен
рестрикционен сайт
LEU: първи кодон на зрялата LGC, АМВ: стоп кодон
а) КОНСТРУИРАНЕ НА БИНЕРНИЯ ПЛАЗМИД
PBIOC25 СЪДЪРЖАЩ PS-LGC.
Плазмидът рВ1ОС22 се смила изцяло с Bglll и частично с Hindlll с цел да се премахне последователността кодираща полипептида Leu-Phe-Gly-Lys (4 първи аминокиселини) на зрелия протеин LGC. Тази последователност се замества с кодиращата за сигналния пептид PS с 23 аминокиселини ( ATG AAA GCC ТТС АСА СТС
GOT СТС TTC ТТА GCT СТТ ТСС СТС ТАТ СТС CTG ССС ААТ CCA GCC CAT ТСС) слято свързан с тази на 4 първи кодона от последователността кодираща за зрелия протеин LGC. (PS-4 първи кодона на зряла LGC”). Последователността ’’PS-4 първи кодони на зряла LGC” се амплифицира чрез PCR като се излиза от плазмида рМАТЮЗ (Matsuoka et Nakamura, 1991) с помощта на 2 олигодезоксинуклеотида следващи 5' caggagatctgATG AAA GCC ТТС АСА СТС GC 3' и 5' G ATG AAG СТТ TCC AAA CAA GGA ATG GGC TGG ATT GGG GAG G 3', като се следва начина на амплификация PCR описан тук по-горе в параграф I. След двойно ензимно смилане с Bglll и HincfIII, фрагментите ДНК получени от амплификацията PCR се пречистват чрез електрофореза на агарозен гел 2%, електроелуират се (Sambrook et al., 1989), утаяват се в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугират се при 12000 g в продължение на 30 min, промиват се с 70% етанол, сушат се и след това се лигират с плазмидната ДНК от рВЮС22 двойно смляна с Bglll и Hindlll, пречистена чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, електроелиурана (Sambrook et al.,1989), подложена на утаяване с алкохол, сушена и дефосфорилирана с ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim) съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 100 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 50 ng от фрагментите от смляна ДНК получени от амплификацията PCR описана тук по-горе в реакционна среда от 10 μΙ в присъствиета на на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и на 2,5 U от ензима Т4 ДНК лигаза (Amersham)
при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 gg/ml ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Плазмидната ДНК на някои задържани клонове се проверява чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977). Последователностите на PS и на зрял LGC се клонират като се поддържат четящите им фази отворени. Последователността от разцепването между последователностите PS и зряла LGC е Ser-Leu. Полученият плазмид се нарича рВ1ОС23. Като се тръгне от рВЮС23, се изолира фрагментът Bglll-Xbal носещ последователността на PS-LGC, чрез двойно ензимно смилане с Bglll и Xbal, пречистване чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, електроелуиране (Sambrook et al., 1989), утаяване с алкохол, сушене. След това този фрагмент от ДНК се обработва с ензим на Klenow съгласно препоръките на производителя и се лигира с плазмидната ДНК на рВЮС21 смляна в сайт Hindlll, обработена по Klenow и дефосфорилирана с ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim) съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 200 ng от фрагменти от ДНК съдържащи PS-LGC описани тук по-горе, в реакционна среда от 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), на 2 μΙ 50% полиетиленгликол
8000 и на 5 U от ензима Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 12 mg/ml тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият клон се нарича рВ1ОС25. Нуклеотидната последователност на фрагмента кодиращ за рекомбинантния протеин PS-LGC се потвърждава чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al.,1977). Плазмидната ДНК на бинерния вектор рВЮС25 се вкарва чрез директна трансформация в щама LBA4404 от Agrobacterium tumefaciens съгласно метода на Holster et al., 1978. Валидността на задържания клон се проверява чрез ензимно смилане на вкараната плазмидна ДНК.
Ь. КОНСТРУИРАНЕ НА БИНЕРНИЯ ПЛАЗМИД рВЮС26 ф СЪДЪРЖАЩ PPS-LGC
Плазмидът рВ1ОС22 се смила изцяло с Bglll и частично с Hindlll с цел да се премахне последователността кодираща полипептида Leu-Phe-Gly-Lys на зряла LGC. Тази последователност се замества с кодиращата за сигналния пептид PPS с 37 аминокиселини ( ATG AAA GCC ТТС АСА СТС GTC СТС ТТС ТТА GCT СТТ ТСС СТС ТАТ СТС CTG ССС ААТ CCA GCC CAT ТСС AGG ТТС ААТ ССС ATC CGC СТС ССС АСС АСА CAC GAA ССС GCC) слято свързана с тази на 4 първи кодона на зрелия протеин LGC ( ’’PPS-4 първи кодони на зрялия LGC ) Последователността ’’PPS-4-първи кодони на зрялата LGC”) се амплифицира посредством PCR като се тръгне от плазмида рМАТ 103 (Matsuoka et Nakamura, 1991) с помощта на 2 следващи олигодезоксинуклеотиди 5' садд agatctgATG AAA GCC ТТС АСА СТС GC 3' и 5' G ATG AAG СТТ
TCC AAA CAA GGC GGG ТТС GTG TGT GGT TG 3', като се следва методиката за амплификация с PCR описана тук погоре в параграф I. След двойно ензимно смилане с Bglll и Hindlll, фрагментите от ДНК получени от амплификацията PCR се пречистват чрез електрофореза върху агарозен гел 2%, електроелуират се (Sambrook et al., 1989), утаяват се в присъствие на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугират се при 12000 g в продължение на 12 Min, промиват се с етанол 70%, сушат се, след това се лигират с плазмидната ДНК от рВЮС22 двойно смляна с Bglll и Hindlll, пречистена чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, електроелуирана, подложена на утаяване с алкохол, сушена и дефосфорилирана с ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim) съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 100 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 50 ng от фрагментите от смляна ДНК произлязла от амплификацията PCR описана по-горе, в реакционна среда от 10 μΙ в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и
2,5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 mg/ml ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979), и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими.
Плазмидната ДНК от някои задържани клонове се потвърждава чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al.,1977). Последователностите на PPS и зряла LGC се клонират, като техните четящи фази се поддържат отворени. Последователността на разцепване между двете последователности е Ala-Leu. Полученият плазмид се нарича рВЮС24. Като се излезе от рВЮС24, фрагментът Bglll-Xbal, който носи последователността на PPS-LGC се изолира чрез двойно ензимно смилане с Bglll и Xbal, пречиства се чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуира се (Sambrook et al.,1989), утаява се с алкохол, суши се. След това този фрагмент от ДНК се обработва с ензима на Klenow, съгласно препоръките на производителя и се лигира с плазмидната ДНК от рВЮС21 смляна в сайта Hindlll, обработена по Klenow и дефосфорилирана с ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim) съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 200 ng от фрагментите ДНК съдържащи PPS-LGC описани тук погоре, в реакционна среда от 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50%-ен полиетиленгликол 8000 и 5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DHSoc, предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 12 цд/т1 тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с
рестрикционни ензими. Полученият клон се нарича рВ1ОС26. Нуклеотидната последователност на фрагмента кодиращ за рекомбинантния протеин PPS-LGC се потвърждава чрез секвенциониране с помощта на на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al.,1977). Плазмидната ДНК на бинерния вектор рВЮС26 се вкарва чрез директна трансформация в щам LBA4404 от Agrobacterium tumefaciens съгласно методиката на Holsters et al., (1978). Валидността на получения клон се проверява чрез ензимно смилане на въведената плазмидна ДНК.
с. КОНСТРУИРАНЕ НА БИНЕРНИЯ ПЛАЗМИД рВ1ОС41 съдържащ PSLGL-LGC.
Стомашна липаза на заек се синтезира под формата на прекурсор съставен от сигнален пептид с 22 аминокиселини, разположен в ИНг-крайната част и предхождащ полипептидната последователност на зряла липаза, клонът pJO101 съдържащ завършена кДНК кодираща за заешка стомашна липаза и описан в Европейска патентна заявка № 92 403 055, регистрирана 12.11.92 от I'lnstitut de Recherche Jouveinal и озаглавена Нуклеинови киселини кодиращи за заешка стомашна липаза и производни полипептиди, тяхното използване за производство на тези полипептиди и фармацевтични състави на основата на последните”.
Подреждането на полипептидните последователности на кучешка стомашна липаза и на прекурсора на заешката стомашна липаза са показали, че последователността LFGK е представена в двата протеина. В полипептидната последователност на заешката липаза определена като се излезе от пречистения природен протеин
(Moreau et al., 1988), трите първи остатъка L, F и G отсъстват и съставляват част от сигналния пептид с 22 аминокиселини на LGL. Поради този факт, сигналния пептид на заешката стомашна липаза, лишен от тези три общи аминокиселини, се свързва чрез сливане със зрялата протеинова последователност на кучешката стомашна липаза. Нейната полипептидна последователност е съставена от 19 следващи аминокиселини: MWVLFMVAALLSALGTTHG.
Плазмидът рВЮС22 се смила тотално с Bglll и частично с Hindlll, с оглед да се премахне последователността кодираща полипептида Leu-Phe-Gly-Lys (4 първи аминокиселини) на зрелия протеин LGC. Тази последователност се замества с кодиращата за сигналния пептид PSLGL на заешката стомашна липаза с 19 аминокиселини (ATG TGG GTG СТТ ТТС ATG GTG GCA GCT TTG СТА ТСТ GCA СТТ GGA ACT АСА CAT GGT) слято свързана с тази на 4 първи кодона на протеина на зрялата LGC (’’PSLGL4 първи кодона на зряла LGC”). Последователността ’’PSLGL-4 първи кодони на зрялата LGC” се амплифицира с PCR като се излезе от плазмида pJO101 с помощта на 2 следващи олигодезоксинуклеотиди : 5' aggagatctcaacaATG TGGGTG СТТ ТТС ATG GTG 3' и 5' G ATG AAG СТТ ТСС AAA CAA ACC ATG
TGT AGT TCC AAG TG 3', като се спазва методиката за амплификация PCR описана тук по-горе в параграф I. След двойно ензимно смилане с Bglll и Hindlll, фрагментите от ДНК произлезли от амплификацията PCR се пречистват чрез електрофореза на агарозен гел 2 %, електроелуират се (Sambrook et al., 1989), утаяват се в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугират се при 12000 g в продължение на 30 min, промиват се с 70% етанол, сушат се и след това се лигират с плазмидната ДНК от рВЮС22 двойно смляна с Bglll и Hindlll, пречистена чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, електроелуирана (Sambrook et al., 1989), подложена на утаяване с алкохол, сушаена и дефосфорилирана чрез ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim), съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 100 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 50 ng от фрагментите от смляна ДНК продукт на амплификацията PCR описана тук по-горе, в реакционна среда 10 μΙ в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза (Amersham) и на 2,5 U от ензима Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5oc предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху среда съдържаща 50 цд/т1 ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Плазмидната ДНК на някои задържани клонове се проверява чрез секвенциониране с помощта на прибор за
секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977). Последователностите на PSLGL и на зрялата LGC се клонират като техните четящи фази се поддържат отворени (т.е. по такъв начин, че те образуват единствена, отворена четяща фаза). Последователността на разцепване между последователностите PSLGL и зряла LGC е Gly-Leu. Полученият плазмид се нарича рВЮС40. Като се излезе от рВЮС40, фрагментът Bglll-Xbal носещ последователността PSLGL-LGC се изолира чрез двойно ензимно смилане с Bglll и Xbal, пречистване чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, електроелуиране (Sambrook et al.,1989), утаяване с алкохол и сушене. След това този фрагмент от ДНК се обработва с ензима на Klenow съгласно препоръките на производителя и се лигира с плазмидната ДНК от рВ1ОС21 смляна в сайта Hindlll, обработена по Klenow и дефосфорилирана с ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim), съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 200 ng от фрагментите от ДНК съдържащи PSLGL-LGC описани тук погоре, в реакционна среда от 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersam), 2 μΙ 50 % полиетиленгликол 8000 и 5 U от ензима Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа.
Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни(НапаИап,1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху среда съдържаща 12 μg/ml тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doiy, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият клон се нарича рВ1ОС41. Нуклеотидната
последователност на фрагментите кодираща за рекомбинантния протеин PSLGL-LGC се потвърждава чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977). Плазмидната ДНК на бинерния вектор рВЮС41 се вкарва чрез директна трансформация в щам LBA4404 от Agrobacterium tumefaciens съгласно метода на Holsters et al.,(1978). Валидността на задържания клон се проверява чрез ензимно смилане на вмъкнатата плазмидна ДНК.
Ι-В) Конструиране на химерични гени кодиращи за рекомбинантната LGC и позволяващи експресия в домати
Конструкциите, които се използват са същите като тези за генетичната трансформация на тютюна, а именно плазмидите рВ1ОС25, рВЮС26 и рВ1ОС41.
II. КОНСТРУИРАНЕ НА ХИМЕРИЧНИ ГЕНИ
КОДИРАЩИ ЗА РЕКОМБИНАНТНИЯ ПРОТЕИН НА КУЧЕШКА СТОМАШНА ЛИПАЗА И ПОЗВОЛЯВАЩИ ЕКСПРЕСИЯ В СЕМЕНА НА РАПИЦА
а) Конструкция на бинерния плазмид рВЮС28 съдържащ промотора pCRU
Експресията в семена на рапица на кучешка стомашна липаза (LGC) изисква инсерция на кДНК кодираща за LGC между следните регулиращи последователности:
1. Промотора pCRU съответстващ на областта 5' некодираща, от гена на резервния протеин на семената, круциферин А от репички (Depigny-This et al., 1992) и позволяващ специфична експресия в семената.
2. Завършващата последователност на
транскрипцията, терминатора polyA 35S, който отговаря на областта 3' не кодираща, от последователността с кръгова двойноверижна ДНК на вируса на мозйката по карфиола, който произвежда транскрипта 35S (Franck et al., 1980).
За да се получи бинерен плазмид подобен на рВЮС21, но чийто промотор pd35S е заменен с промотора pCRU, се изолира фрагмента EcoRI обработен по KlenowBamHI”, който съдържа промотора pCRU, като се излезе от плазмида pBI22 1-CRURSP, произлязъл от рВ122 1 (продаван от Clontech), чрез заместване на промотора 35S с промотора pCRU.
Фрагментът ’’EcoRI обработен по Klenow-BamHI”, който носи промотора pCRU се пречиства чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, електроелуира се (Sambrook et al., 1989), подлага се на утаяване с алкохол, суши се и се лигира с плазмидна ДНК от рЛТ163 (описан в параграф I), смлян с Kpnl, третиран с Т4 ДНК полимераза (New England Biolabs) съгласно препоръките на производителя, след това смлян с BamHI, пречистен чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, електроелуиран (Sambrook et al., 1989), подложен на утаяване с алкохол, сушен и дефосфорилиран с ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim), съгласно препоръките на производителя. Лигирането се осъществява с 20 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 200 ng фрагменти от ДНК EcoRI обработени по Klenow-BamHI” описани тук по-горе, в реакционна среда от 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5 U ензим Т4
ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа.
Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху среда съдържаща 50 цд/т! ампицилин, се екстрахира
съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича рВЮС27.
Касетата за експресия, съставена от промотора pCRU и терминатора polyA 35S се изолира, като се излезе от рВЮС27, чрез тотално смилане Xhol последвано от частично смилане EcoRI. Тя се пречиства чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8%, електроелуира се (Sambrook et al., 1989), подлага се на утаяване с алкохол, суши се, обработва се по Klenow (New England Biolabs) съгласно препоръките на производителя и се лигира с плазмидната ДНК от рВЮС24 в сайта EcoRI, обработен по Klenow и дефосфорилиран посредством ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim) съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 200 ng от фрагментите от ДНК XholEcoRI описани тук по-горе, в реакционна среда 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50 % полиетиленгликол 8000 и 5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа.
Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a, предварително направени компетентни (Hanahan, 1983).
Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху среда съдържаща 12 цд/т1 тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича рВ1ОС28.
Ь) Конструиране на бинерния плазмид рВ1ОС29 съдържащ PPS-LGC
Изолирането на фрагмента Bglll-Xbal носещ последователността PPS-LGC като се излиза от рВЮС24 вече
е описано в l-A-b. Този фрагмент се лигира с плазмидната
ДНК от рВ1ОС28 в сайта EcoRI обработен по Klenow и дефосфорилиран с ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim) съгласно препоръките на производителя. Лигирането се осъществява с 20 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 200 ng фрагменти от ДНК Bglll-Xbal съдържаща PPS-LGC в реакционна среда от 20 μΙ в присъствието на буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху среда съдържаща 12 цд/т1 тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича рВ1ОС29. Нуклеотидната последователност на рекомбинантния протеин PPS-LGC се потвърждава чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977). Плазмидната ДНК на бинерния вектор рВЮС29 се вкарва чрез директна трансформация в щама LBA4404 от Agrobacterium tumefaciens съгласно метода на Holsters et al.,(1978).
Валидността на задържания клон се потвърждава чрез ензимно смилане на вмъкнатата плазмидна ДНК.
с) Конструиране на бинерните плазмиди рВЮС90 и рВ1ОС91 съдържащи промотора pGEAID.
Експресията в семена на рапица, на животински ген кодиращ за кучешка стомашна липаза (LGC), изисква следните регулиращи последователности:
1. Промотор pGEA1 отговарящ на некодиращата област 5' от гена на резерния протеин на семената, GEA1 от Arabidopsis thaliana (Gaubier et al.,1993) и позволяващ специфична експресия в семената;
2. Завършваща последователност на транскрипцията, терминатор polyA 35S, който отговаря на некодиращата област в 3' на последователността на вируса с кръгова, двойноверижна ДНК, на мозайката на карфиола произвеждаща транскрипта 35S (Franck et al., 1980).
За да се получи бинерният плазмид рВЮС90 подобен на рВ1ОС21, но на който промотора pd35S е заместен с промотора pGEAID, фрагментът Н i n d 111 - B a m ΗI обработен no Klenow, съдържащ промотора pGEA1, се изолира като се излезе от плазмида pGUS2-pGEA1. Клонът pGUS2pGEA1 произлязъл от рВ1221 чрез заместване на промотора p35S с промотора pGEA1, съдържа 2 ATG във фаза: ATG на гена GEA1 (Ет2) и ATG на гена gus. ATG на гена GEA1 се разрушава. Фрагментът от ДНК съдържащ се в сайта Sall и последователностите обратно от ATG на гена GEA1 на клона pGUS2-pGEA1 се аплифицира чрез PCR с помощта на 2 олигонуклеотида: 5' CAAACGTGTACAATAGCCC 3' и 5' CCCGGGGATCCTTTTTTG 3'. Температурата на хибридиране е адаптирана. Фрагментът амплифициран чрез PCR се смила с SAII и BamHI, пречиства се чрез електрофореза на агарозен гел 2%, електроелуира се (Sambrook et al., 1989), утаява се в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугира се при 12000 g в продължение на 30 min, промива се с 70% етанол, суши се и след това се лигира с плазмидната ДНК от pGUS2-GEA1 двойно смляна с Sall и BamHI, пречистена чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуирана (Sambrook et al., 1989), подложена на утаяване с алкохол, сушена. Лигирането се осъществява с 100 ng от вектора и 50 ng фрагменти от смляна ДНК резултат на амплификацията PCR, описана тук по-горе, в реакционна среда 10 μΙ в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и 2,5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5oc предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани на 50 цд/т1 ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира посредством ензимно смилане с рестрикционни ензими. Някои от задържаните клонове се потвърждават чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977).
Полученият клон се нарича pGUS-2-pGEA1 D.
Фрагментът Hindlll-BamHI носещ промотора pGEAID изолиран като се излезе от pGUS-2-pGEA1 D, третиран по Klenow съгласно препоръките на производителя (Biolabs), се пречиства чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуира се (Sambrook et al., 1989), подлага се на утаяване с алкохол, суши се и се лигира с плазмидната ДНК на рВ1ОС21 в сайтовете Kpnl и Hindlll третирани с ензима Т4 ДНК полимераза (Biolabs) съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания рВ1ОС21 и 200 ng от фрагментите от ДНК Xhol-EcoRI описани тук по-горе, в реакционна среда от 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 12 цд/т1 тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979), и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича рВЮС90.
За да се получи бинерният плазмид рВ1ОС91, експресионната касета ”pGEA1 D-tNOS”, изолирана като се излезе от pBSII-pGEA1 D, се вкарва в бинерния плазмид pSCV1.2, самият той получен чрез клониране на фрагмента Hindlll, носещ експресионната касета ”p35S-nptll-tNOS” описана от Fromm et al.,(1986) в сайта Hindlll на pSCV1 конструиран от Edwards G.A. в 1990, като се следват
обичайните методики за клониране.
Плазмидът pBSII-pGEA1D е получен на два етапа:
- от една страна, фрагментът Sacl-EcoRI носещ tNOS (терминатор на гена на нопалин синтазата) от Agrobacterium tumefaciens, обработен с ензима Т4 ДНК полимераза (Biolabs) съгласно препоръките на производителя и пречистен, се клонира в сайта EcoRV на pBSIISK+ продаван от Stratagene, дефосфорилиран с ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim), съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания вектор и 200 ng от фрагментите от ДНК съдържащи tNOS описани тук по-горе, в реакционна среда от 20 μΙ, в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a превдарително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 цд/т1 ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Някои от задържаните клонове се потвърждават чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al.,1977). Полученият плазмид се нарича pBSIItNOS.
- от друга страна, фрагментът носещ pGEAID двойно смлян с Hindlll, обработен с ензима на Klenow и BamHI, пречистен, се клонира в сайтовете ”Xbal обработен по
Klenow и BamHI” на плазмида pBSII-tNOS. Лигирането се извършва с 100 ng от вектора описан тук по-горе и 50 ng от фрагментите от ДНК описани тук по-горе, в реакционна среда 10 μΙ в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и 2,5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 μg/ml ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича pBSII-pGEA1 D.
След това, експресионната касета ”pGEA1D- tNOS” носена от фрагмента Xbal-Hindlll третиран по Klenow, се клонира в сайта Smal на pSCV1.2, дефосфорилиран с ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim), съгласно препоръките на производителя. Лигирането се осъществява с 20 ng от дефосфорилирания pSCV1.2 и 200 ng от фрагментите носещи експресионната касета ”pGEA1DtNOS”, в реакционна среда от 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5oc, предваретелно направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекциониране върху 50 μg/ml ампицилин се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича
pBI0C91.
d) Конструиране на бинерния плазмид рВЮС92 съдържащ промотора pGEA6D
Експресията в семена на рапица на животински ген, кодиращ за кучешка стомашна липаза (LGC), изисква следните регулиращи последователности:
1. Промотор pGEA6 отговарящ на некодиращата област 5' на гена на резервния протеин на семената, GEA6 от Arabidopsis thaliana (Gaubier et al.,1993) и позволяващ специфична експресия в семената;
2. Завършваща последователност на транскрипцията, терминатора polyA 35S, който отговаря на некодиращата област 3' от последователността на вируса с кръгова, двойноверижна ДНК, на мозайката по карфиола, произвеждаща транскрипта 35S (Franck et al., 1980).
За да се получи бинерният плазмид рВ1ОС92 подобен на рВ1ОС21, но на който промоторът pd35S е заместен от промотора pGEA6D, фрагментът EcoRI-BamHI обработен по Klenow, съдържащ промотора pGEA6 се изолира като се излезе от плазмида pGUS2-pGEA6. Клонът pGUS-2pGEA6, произлязъл от pUC18 съдържа 2 ATG във фаза: ATG на гена GEA6 ( Етб) и ATG на гена gus. ATG на гена GEA6 се разрушава. Фрагментът от ДНК намиращ се между сайта Accl и последователностити в обратна посока на ATG на гена GEA6 на клона pGUS-2-pGEA6 се амплифицра посредством PCR с помощта на 2 олигонуклеотида: 5' AAGTACGGCCACTACCACG 3' и 5' CCCGGGGATCCTGGCTC 3'. Температурата на хибридиране е адаптирана.
Фрагментът амплифициран чрез PCR се смила с Accl
и BamHI, пречиства се чрез електрофореза на агарозен гел 2%, електроелуира се (Sambrook et al., 1989), утаява се в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугира се при 12000 g в продължение на 30 min, промива се с 70% етанол, суши се, след това се лигира с плазмидната ДНК на pGUS-2-GEA6 двойно смляна с Accl и BamHI, пречистена чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуирана ( Sambrook et al., 1989), подложена на утаяване с алкохол, сушена. Лигирането се извършва с 100 ng от вектора описан тук по-горе и 50 ng от фрагментите на смляната ДНК получена от амплификацията PCR описана тук по-горе в реакционна среда от 10 μΙ в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и 2,5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С, в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 μg/ml ампицилин, се екстрахира по метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Някои от задържаните клонове се потвърждават чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977). Полученият клон се нарича pGUS-2PGEA6D.
Фрагментът EcoRI-BamHI носещ промотора pGEA6D изолиран като се тръгне от pGUS-2-pGEA6D, обработен по Klenow съгласно препоръките на производителя (Biolabs) се
пречиства чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуира се (Sambrook et al., 1989), подлага се на утаяване с алкохол суши се и се лигира в сайта Xhol обработен с ензима на Klenow на модифицираната плазмидна ДНК на рВ1ОС21. Модифицираният плазмид рВ1ОС21 се получава чрез двойно смилане с Hindlll обработен по Klenow и Kpnl от рВ1ОС21, за да се делетира фрагментът носещ промотора pd35S и да бъде заместен от фрагмента KpnlEcoRV носещ полилинкера съставен от сайтовете Kpnl-XholSall-Clal-Hindlll-BamHI-Smal-EcoRI-EcoRV на pSIISK+.
Лигирането се извършва с 20 ng от модифицирания и дефосфорилиран рВ1ОС21 и 200 ng от фрагментите от ДНК EcoRI-BamHI, описани тук по-горе, в реакционна среда от 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 12 μg/ml тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича рВ1ОС92.
е) Конструиране на бинерните плазмиди рВЮС93, рВ1ОС94, рВ1ОС95, рВ1ОС96 и рВ1ОС96 съдържащи PSLGLLGC
Плазмидът рВЮС40 е описан тук по-горе. Този плазмид съдържа фрагмента Bglll-Xbal носещ последователността PSLGL-LGC.
Този фрагмент се изолира чрез двойно ензимно смилане с Bglll и Xbal, пречиства се чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуира се, подлага се на утаяване с алкохол, суши се, обработва се по Klenow и се лигира с рВ1ОС28 (описан тук по-горе) смлян с EcoRI обработен по Klenow и дефосфорилиран; с рВЮС90 смлян с EcoRI обработен по Klenow и дефосфорилиран; с рВ1ОС91 смлян с Smal и дефосфорилиран; с рВЮС92 смлян с Hindlll обработен по Klenow и дефосфорилиран, за да се получат съответно рВЮС93, рВЮС94, рВЮС95 и рВЮС96.
Плазмидът рВЮС97 се получава в резултат на клонирането на фрагмента Kpnl-EcoRV носещ експресионната касета ”pGEA6D-PSLGL-LGC-t35S”, обработен с ензима Т4 ДНК полимераза, пречистен чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуиран, подложен на утаяване с алкохол, сушен и лигиран с pSCV1.2 смлян с Smal и дефосфорилиран. Експресионната касета ”pGEA6D-PSLGL-LGC-t35S” е изведена от рВЮС92.
III. КОНСТРУИРАНЕ НА ХИМЕРИЧНИ ГЕНИ КОДИРАЩИ ЗА РЕКОМБИНАНТНИЯ ПРОТЕИН НА ЧОВЕШКА СТОМАШНА ЛИПАЗА И ПОЗВОЛЯВАЩИ ОПРЕДЕЛЯЩАТА ЕКСПРЕСИЯ, НАПРИМЕР В ЛИСТА И СЕМЕНА НА ТЮТЮН
а) Конструиране на бинерния плазмид рВЮС82, съдържащ химеричния промотор суперпромотор pSP.
Експресията в листа на тютюн, на гена кодиращ за човешка стомашна липаза (LGH) изисква следните регулиращи последователности:
1. Химеричен промотор суперпромотор (pSP;
PCT/US94/1 2946). Той е съставен от тройно повторение на един активиращ транскрипционен елемент на промотора на гена на октопин синтазата на Agrobacterium tumefaciens, един
активиращ транскрипционен елемент на промотора на гена на манопин синтаза и от промотора манопин синтаза на Agrobacterium tumefaciens;
2. Завършваща последователност на транскрипцията, терминатора polyA 35S, който отговаря на некодиращата област в 3' от последователността на вируса с кръгова, двойноверижна ДНК, на мозайката у карфиола, произвеждаща транскрипта 35S (Franck et al.,1980).
За да се получи бинерен плазмид подобен на рВ1ОС21, но на който промотора pd35S е заместен с промотора pSP, се изолира фрагментът pvull-Sall подложен на действието по Klenow, съдържащ промотора pSP, като се тръгне от плазмида pBISN 1 ( PCT/US94/1 2946), пречиства се чрез електрофореза на агарозен гел 1%, електроелуира се (Sambrook et al.,1989), подлага се на утаяване с алкохол, суши се и се лигира с плазмидната ДНК от рВ1ОС81 двойно смляна с Kpnl и EcoRI подложена на действието на Т4 ДНК полимераза и дефосфорилирана чрез ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim), съгласно препоръките на производителя. Плазмидът рВЮС81 отговаря на рВЮС21, чийто сайт Xbal е делетиран. За да се направи това, плазмидът рВЮС21 се смила с Xbal, след това се подлага на действието на ензима на Klenow и се лигира чрез действието на Т4 ДНК лигаза.
Лигирането се осъществява с 20 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 200 ng от фрагментите от ДНК носеща pSP описани тук по-горе, в реакционна среда от 20 μΙ, в присъствието на 2 μΙ буфер Т4
ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50 % полиетиленгликол 8000 и 5U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии
Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни
(Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 12 цд/ml тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича рВ1ОС82.
Човешка стомашна липаза (LGH) се синтезира природно под формата на прекурсор, описан в публикацията на Bodmer et al.,1987. Зрелият протеин LGH е съставен от 379 аминокиселини. Неговият сигнален пептид (PSLGH) е съставен от 19 аминокиселини. Сайтът на разцепване между PSLGH и LGH е Gly-Leu.
Последователността, кодираща за прекурсора на
LGH се използва за конструиране на бинерните плазмиди рВЮС85 съдържащ PSLGH-LGH, рВЮС87 съдържащ PSLPHLGH и рВ1ОС89 съдържащ PSLGL-LGH, където последователността кодираща за LGH се предшества от тези кодиращи за нейния природен сигнален пептид PSLGH, сигналния пептид за човешка панкреасна липаза (PSLPH; Giller et al.,1992) и сигналния пептид на заешка стомашна липаза (PSLGL; вече описан по-рано; Европейски патент № 92.403055.4), респективно.
Последователността кодираща за прекурсора на LGH се изолира чрез двойно смилане с Pstl и Dral, пречиства се чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуира се
(Sambrook et al., 1989), утаява се в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугира се при 12000 g в продължение на 30 min, промива се с 70% етанол и се суши. След това се клонира в сайтовете Pstl и Spel ( подлага се на действието на ензима Т4 ДНК полимераза (Biolabs) съгласно препоръките на производителя) на плазмида pBSIISKT продаван от Stratagene. Лигирането се извършва с 100 ng от вектора и 50 ng от фрагментите от ДНК носеща последователността кодираща за прекурсора на LGH, описан тук по-горе, в реакционна среда от 10 μΙ в присъствието на буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и 2,5U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5oc предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани на 50 цд/т1 ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича рВ1ОС83.
Последователността кодираща за зряла LGH се модифицира чрез въвеждане на сайт BamHI, несъществуващ предварително, в деветия и десетия кодони, чрез мутагенеза управлявана от PCR като се използват 2 олигодезоксинуклеотида: 5' aaactgcaggctcgag TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT GAA GTG ACT ATG 3' (съдържащ сайтовете Pstl, Xhol и BamHI, единствени) и 5' AAT GGT GGT GCC CTG GGA ATG GCC AAC ATA GTG TAG CTG C 3' (съдържащ сайта Mscl единствен в плазмида pBIOC83).
Амплификацията PCR на фрагмента Pstl-Mscl се извършва в 100 μΙ реакционна среда съдържаща 10 μΙ буфер Taq ДНК полимераза х 10 (500 mM KCI, 100 тМ Tris-HCI, pH 9,0 и 1% Triton х 100), 6 μΙ 25 тМ MgCI2, 3 μΙ 10 тМ dNTP (dATP, dCTP.dGTP и dTTP), 100 pM от всеки οτ 2 олигодезоксинуклеотида описани тук по-горе, 5 ng ДНК матрица (вектор рВЮС83), 2,5 U Taq ДНК полимераза (Promega) и 2 капки вазелиново масло. ДНК се денатурира при 94°С в продължение на 5 min, подлага се на 3 цикъла всеки състоящ се от 1 min денатуриране при 94°С, 1 min хибридиране при 65°С и 1min елонгация при 72°С, след това
елонгацията при 72°С продължава в продължение на 5 min Тази реакция PCR се извършва в апарат “DNA Thermal Cycler “ на Perkin Elmer Cetus. Маслото се отстранява чрез екстракция с хлороформ. След това фрагментите от ДНК от реакционната среда се утаяват в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугират се при 12000 g в продължение на 30 min, промиват се с 70% етанол и се смилат с двата рестрикционни ензима Pstl и Mscl. Смлените фрагменти ДНК получени от амплификацията с PCR се пречистват чрез електрофорза на агарозен гел 2%, електроелуират се (Sambrook et al., 1989), утаяват се в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугират се при 12 000 g в продължение на 30 min, промиват се с 70% етанол, сушат се, след това се лигират с плазмидната ДНК от рВЮС 83 двойно смляна с Pstl и Mscl, пречистена чрез електрофореза върху агарозен гел 0,8 %, електроелуирана, подложена на утаяване с алкохол, сушена. Лигирането се извършва с 100 ng вектор и 50 ng от фрагментите смляна ДНК получени от амплификацията PCR, описана тук по-горе, в реакционна среда от 10 μΙ в присъствието на 1 μ| буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и
2,5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии
Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 цд/т! ампицилин, се екстрахира по метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly ,1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Някои от задържаните клонове се потвърждават чрез секвенциониране с помощта на пробор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977). Вмъкването на сайт на рестрикция BamHI не модифицира генетичния код на LGH. Действително природната последователност LGH GGA AGC (Gly-Ser) става GGA ТСС (Gly-Ser). Резултатнтният плазмид е наречен рВ1ОС84.
Ь) Конструиране на бинерния плазмид рВЮС85 съдържащ PSLGH-LGH
Фрагментът Pstl-Xbal носещ последователността PSLGH-LGH се изолира чрез двойно ензимно смилане с Pstl и Xbal, като се излезе от рВ1ОС83, пречиства се чрез електрофореза на агарозен гел 0,8 %, електроелуира се (Sambrook et al.,1989), подлага се на утаяване с алкохол и се суши. След това този фрагмент от ДНК се обработва с ензима Т4 ДНК полимераза (Biolabs) съгласно препоръките на
производителя и се лигира с плазмидната ДНК от рВЮС82 смляна в сайта Xbal, обработена по Klenow (Biolabs) и дефосфорилирана чрез ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim), съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания вектор и 200 ng от фрагментите ДНК съдържаща PSLGH-LGH, описани тук по-горе, в реакционна среда от 20 μΙ в присъствиетона 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amrsham)q 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5ct предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 12 цд/т1 тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият клон се нарича рВ1ОС85. Нуклеиновата последователност на фрагмента кодиращ за рекомбинатния протеин PSLGH-LGH се потвържава чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7 ™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977). Последователността на разцепване между последователностите PSLGH и зряла LGH е Gly-Leu.
Плазмидната ДНК от бинерния вектор рВЮС85 се вкарва чрез директна трансформация, в щама LBA4404 от Agrobacterium tumefaciens, съгласно метода на Holster et al.,(1978). Валидността на задържания клон се потвърждава чрез ензимно смилане на вмъкнатата плазмидна ДНК.
с) Конструиране на бинерния плазмид рВ1ОС86 съдържащ PSLPH-LGH.
Плазмидът рВ1ОС84 се смила двойно с Pstl и BamHI
с цел да се премахне последователността кодираща за сигналния пептид PSLGH и 8-те първи аминокиселини от зрелия протеин LGH (Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly). Тази последователност се замества с кодиращата за сигналния пептид PSLPH от 16 аминокиселини (ATG CTG ССА СТТ TGG ACT СТТ ТСА CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA) слято свърана с тази кодираща за първите 8 кодона на зрелия протеин LGH (“PSLPH-8 първи кодона на зрелия LGH”). Последователността “PSLPH-8 първи кодона на зрелия LGH” се амплифицира чрез PCR, като се тръгне от матрицата 5' aaactgcaggctcgagaacaATG CTG ССА СТТ TGG ACT СТТ TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGATTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' c помощта на 2 олигодезоксинуклеотида, 5' aaactgcaggctcgagaacaATG С 3' и 5' С AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT ТСС 3' като се следва методиката за амплификация PCR описана по-рано (виж параграф I тук погоре). Температурата на хибридиране е адаптирана. След двойно ензимно смилане с Pstl и BamHI, фрагментите от ДНК получени чрез амплификацията PCR се пречистват чрез електрофореза на агарозен гел 2%, електроелуират се (Sambrook et al., 1989), утаяват се в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугират се при 12000 g в продължение на 30 min, промиват се с 70% етанол, сушат се, след това се лигират с плазмидната ДНК от рВЮС84 двойно смляна с Pstl и BamHI, пречистена чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелиирана (Sambrook et al., 1989), подложена на утаяване с алкохол, сушена. Лигирането се извършва с 100 ng от вектора и 50 ng от смлените фрагменти от ДНК получени от амплификацията PCR, описани тук по-горе, в реакционна среда от 10 μΙ в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и 2,5U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии
Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни
(Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 цд/т1 ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly,1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Някои от задържаните клонове се потвърждават чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977).
Последователностите на PSLPH и на зрелия LGH се клонират като се поддържат отворени техните фази на четене (т.е. по такъв начин, че те да образуват една отворена фаза на четене). Последователността на разцепване между последователностите PSLPH и зрелия LGH е Gly-Leu. Полученият плазмид се нарича рВ1ОС86.
Като се тръгне от рВ1ОС86, фрагментът Pstl-Xbal носещ последователността PSLPH-LGH се изолира чрез двойно ензимно смилане с Pstl и Xbal, пречиства се чрез електрофорза на агарозен гел 0,8%, електроелуира се (Sambrook et al., 1989), подлага се на утаяване с алкохол и се суши. След това, този фрагмент от ДНК се обработва с ензима Т4 ДНК полимераза (Biolabs) съгласно препоръките на производителя и се лигира с плазмидната ДНК от рВ1ОС82 смляна в сайта Xbal, обработен се по Klenow (Biolabs) и дефосфорилиран чрез ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringr Manheim), съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания вектор описан тук по-горе и 200 ng от фрагментите от ДНК съдържаща PSLPH-LGH описани тук погоре, в реакционна среда 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5U еним Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 12 μg/ml тетрациклин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly,
1979)
и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият клон е наречен рВ1ОС87. Нуклеиновата последователност на фрагмента кодиращ за рекомбинантния протеин PSLPH-LGH се потвърждава чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от
Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977). Плазмидната ДНК на бинерния вектор рВЮС87 се вкарва чрез директна трансформация в щама LBA4404 от Agrobacterium tumefaciens съгласно метода на Holsters et al.,(1978). Валидността на задържания клон се проверява чрез ензимно смилане на вмъкнатата плазмидна ДНК.
d) Конструиране на бинерния пламид рВ1ОС89 съдържащ PSLGL-LGH
Плазмидът рВ1ОС84 се смила двойно с Pstl и BamHI
с цел да се премахне последователността кодираща за сигналния пептид PSLGH и 8-те първи аминокиселини на зрелия протеин LGH (Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly). Тази последователност се заменя с кодиращата за сигналния пептид PSLGL с 19 аминокиселини (ATG TGG GTG СТТ ТТС ATG GTG GCA GCT TTG СТА ТСТ GCA СТТ GGA ACT АСА CAT GGT) слято сварзана с тази кодираща за 8-те първи кодона на зрелия протеин LGH (“PSLGL-8 първи кодона на зрелия LGH”). Последователността “PSLGL-8 първи кодона на зрелия LGH” се амплифицира чрез PCR като се излезе от матрицата 5' aaactgaggctcgagaacaATG TGG GTG СТТ ТТС ATG GTG GCA GCT TTG СТА TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGTTTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' c помощта на 2 олигодезоксинуклеотида, 5 aaactgcaggctcgagaacaATG TGG 3' и 5' C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3', като се следва методиката за амплификация с PCR описана по-горе (виж параграф I тук по-горе). Температурата на хибридиране е адаптирана. След двайно ензимно смилане с Pstl и BamHI, фрагментите от ДНК получени от амплификацията PCR се пречистват чрез електрофореза на агарозен гел 2%, електроелуират се (Sambrook et al.,1989), утаяват се в присъствието на 1/10 обема ЗМ натриев ацетат pH 4,8 и 2,5 обема абсолютен етанол при -80°С в продължение на 30 min, центрофугират се при 12000 g в продължение на 30 min, промиват се с 70% етанол, сушат се, след това се лигират с плазмидната ДНК от рВ1ОС84 двойно смляна с Pstl и BamHI, пречистена чрез
електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуирана (Sambrook et al., 1989), подложена на утаяване с алкохол, сушена. Лигирането се извършва с 100 ng от вектора и 50 ng от фрагментите от ДНК смлени, получени от амплификацията PCR, описана тук по-горе, в реакционна среда от 10 μΙ в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и
2,5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 цд/т1 ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979)
и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Някои от задържаните клонове се потвърждават чрез секвенциониране с помащта на прибора за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al.,1977). Последователностите на PSLGL и на зрелия LGH се клонират като се поддържат техните четящи фази отворени (тоест по тъкъв начин, че те да образуват една единствена отворена четяща фаза). Последователността на разцепване между последователностите PSLGL и зрелия LGH е Gly-Leu. Полученият плазмид се нарича рВЮС88.
Като се излезе от рВ1ОС88, фрагментът Pstl-Xbal носещ последователността PSLGL-LGH се изолира чрез двойно ензимно смилане с Pstl и Xbal, пречиства се чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуира се (Sambrook et al.,1989), подлага се на утаяване с алкохол и се суши. След това този фрагмент от ДНК се обработва с ензима
Т4 ДНК полимераза (Biolabs) съгласно препоръките на производителя и се лигира с плазмидната ДНК от рВ1ОС82, смляна в сайта Xbal, обработена по Klenow (Biolabs) и
дефосфорилирана чрез ензима алкална фосфатаза от телешки черва (Boeringer Manheim) съгласно препоръките на производителя. Лигирането се осъществява с 20 ng от дефосфорилирания вектор и 200 ng от фрагментите от ДНК съдържащи PSLGL-LGH описани тук по-горе, в реакционна среда 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа.
Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани
върху 12 цд/т1 тетрациклин, се екстрахира по метода за алкално лизиране (Birnboim et al., 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият клон се нарича рВ1ОС89. Нуклеиновата последователност на фрагмента кодиращ за рекомбинантния протеин PSLGL-LGH се потвърждава чрез секвенциониране с помощта на прибор за секвенциониране Т7™ продаван от Pharmacia, съгласно метода за дидезоксинуклеотидите (Sanger et al., 1977).
Плазмидната ДНК на бинерния вектор рВЮС89 се вкарва чрез директна трансформация в щама LBA4404 от Agrobacterium tumefaciens съгласно метода на Holster et al.,(1978).
ВалидноРта на задържания клон се потвърждава чрез ензимно смилане на вмъкнатата плазмидна ДНК.
IV. КОНСТРУИРАНЕ НА ХИМЕРИЧНИ ГЕНИ
КОДИРАЩИ ЗА РЕКОМБИНАНТНИЯ ПРОТЕИН НА КУЧЕШКА СТОМАШНА ЛИПАЗА И ПОЗВОЛЯВАЩИ ЕКСПРЕСИЯ В СЕМЕНА НА ЦАРЕВИЦА
а) Конструиране на пламидите рВ1ОС98 и рВ1ОС99 съдържащи PSLGL-LGC и позволяващи определяща експресия в семена на царевица
Определящата експресия на животински ген в семена на царевица, кодиращ за кучешка стомашна липаза (LGC) изисква следните регулативни последователности:
1. Един от двата промотора позволяващи опрделяща експресия:
- актинов промотор от ориз последван от актинов интрон от ориз (pAR-IAR) съдържащ се в плазмида pAct1-F4 описан от McElroy et al.,(1991);
- определящ промотор двоен 35S (pd35S) от CaMV (вируса на мозайката у карфиола). Той отговаря на едно удвояване на последователностите активиращи транскрипцията, разположени в посока срещу елемента ТАТА на природния промотор 35S (Kay et al., 1987);
2. Един от двата терминатора:
- последователност завършваща транскрипцията, терминатор polyA 35S, която отговаря на некодиращата област в 3' от последователността на вируса с кръгова двойноверижна ДНК от мозайката у карфиола, произвеждаща транскрипта 35S (Franck et al.,1980);
- последователност завършваща транскрипцията, терминатор polyA MOS, който отговаря на некодиращата област в 3' на гена за нопалин синтаза на плазмида Ti от
Agrobacterium tumefaciens щам c нопалин (Depicker et al., 1982).
Плазмидът pBIOC98, където последователността кодираща за PSLGL-LGC е поставена под контрола на pAR-IAR, се получава чрез клониране на фрагмента Bglll-Xbal носещ последователността кодираща за PSLGL-LGC в сайтовете “Ncol и Sall” на pBSII-pAR-IAR-tNOS.
Фрагментът Bglll-Xbal носещ последователността кодираща за PSLGL-LGC се изолира, като се излезе от рВЮС40 (описан тук по-горе) чрез двойно ензимно смилане с Bglll и Xbal, пречиства се чрез електрофореза на агарозен гел 0,8%, електроелуира се, подлага се на утаяване с алкохол, суши се, след това се обработва с ензима на Klenow. Плазмидът pBSII-pAR-IAR-tNOS се смила двойно с Sall и Ncol, пречиства се, третира се с ензима Mung Bean Nuclease (Biolabs) и се дефосфорилира чрез ензима телешка алкална фосфатаза (Boeringer Manheim), съгласно препоръките на производителя. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания вектор и 200 ng от фрагментите ДНК, съдържащи последователността кодираща за PSLGL-LGC, описани тук по-горе, в реакционна среда от 20 μΙ в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С в продължение на 16 часа.
Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 цд/т1 ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез
100 ензимно смилане с рестрикционни ензими. Полученият плазмид се нарича рВ1ОС98.
Плазмидът pBSII-pAR-IAR-tNOS резултат от клонирането в сайтовете “Есо01091 обработен по Klenow и
Kpnl” на pBSII-tNOS последователността последователността излезе от плазмида от фрагмента SnaBI-Kpnl носещ отговаряща на “pAR-IAR-начало на кодираща за гена gus” се изолира като се pActl-F4. Лигирането се извършва с 100 ng от вектора и 50 ng от фрагментите от ДНК, описани тук погоре , в реакционна среда от μΙ смилат се в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и 2,5 U ензим Т4
ДНК
14°С в продължение на 16 часа.
Трансформират се бактерии
Escherichia coli DH5oc предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 μg/ml ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира
чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими.
Плазмидът pBSII-tNOS се получава чрез клониране в сайта EcoRV, дефосфорилиран на pBSIISKT продаван от Stratagene, на фрагмента Sacl-EcoRI носещ последователността tNOS, изолиран като се тръгне от рВИ 21, продаван от Clontech, чрез двойно ензимно смилане с Sacl и EcoRV, подлага се на пречистване чрез електрофореза на агарозен гел 2 % и се обработва с ензима Т4 ДНК полимераза. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания вектор и 200 ng от фрагментите ДНК, съдържащи последователността tNOS, описани тук по-горе, в реакционна среда 20 μΙ, в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК
1
лигаза х 10 (Amersham), 2 μΙ 50% полиетиленликол 8000 и 5U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С, в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 μρ/ηηΙ ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими.
Плазмидът рВЮС99, където последователността кодираща за PSLGL-LGC е поставена под контрола на pd35S се получава чрез клониране в сайтовете “Kpnl и ВатНГ на плазмида pBSII-t35S от фрагмента Kpnl-BamHI носещ последователността отговаряща на “pd35S-PSLGL-LGC” изолирана като се излезе от рВ1ОС41, описан тук по-горе.
Лигирането се извършва с 100 ng от вектора и 50 ng от фрагментите ДНК описани тук по-горе, в реакционна среда 10 μΙ смлени в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и 2,5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при
14°С, в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии
Escherichia coli DH5oc, предварително направени компетентни (Hanahan, 1983).
Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 μg/ml ампицилин се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими.
Плазмидът pBSII-t35S се получава чрез клониране в сайта Spel обработен по Klenow, дефосфорилиран, от плазмида pBSIISK+ продаван от Stratagene, на фрагмента Smal-EcoRV носещ последователността t35S изолиран като се
102
излезе от рЛТ163 (описан тук по-горе) чрез двойно ензимно смилане с Smal и EcoRV, подлага се на пречистване чрез електрофореза на агарозен гел 2%. Лигирането се извършва с 20 ng от дефосфорилирания вектор и 200 ng от фрагментите от ДНК съдържащи последователността t35S, описани тук погоре, в реакционна среда от 20 μΙ, в присъствието на 2 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham), 2μΙ 50% полиетиленгликол 8000 и 5U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С, в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5a, предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 дд/т1 ампицилин, се екстрахира съгласно метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез ензимно смилане с рестрикционни ензими.
Ь) Конструиране на плазмидите рВЮСЮО и рВ10С101 съдържащи PSLGL-LGC и PSLGL-LGC-KDEL респективно и позволяващи експресия в албумина на семена на царевица.
Експресирането в албумина на царевични семена, на животински ген кодиращ за кучешка стомашна липаза, (LGC) изисква следните регулаторни последователности:
1. Промотор на гена узеин на царевицата (рузеин) съдържащ се в плазмида рубЗ описан в Reina et al.,1990. Плазмидът рубЗ се получава в резултат на клониране на рузеин в сайтовете Hindlll и Xbal на един плазмид pUC18 затварящ между сайтовете Hindlll и EcoRI експресионната касета “p35S-gus-tNOS” на рВ122 1 продаван от Clontech. Той позволява експресия в албумина на семената на царевица.
103
2. Завършваща последователност на транскрипцията, терминатор polyA NOS, която отговаря на некодиращата област в 3' на гена на нопалин синтазата на плазмида Ti на Agrobacterium tumefaciens, щам с нопалин (Depicker et al.,1982).
Плазмидът рВЮСЮО, където последователността кодираща за PSLGL-LGC е поставена под контрола на рузеина, се получава чрез клониране в сайтовете “Sacl обаботен с ензима Т4 ДНК полимераза и BamHI” на плазмида ργ63, на фрагмента “Xbal обработен по Klenow-Bglll” изолиран като се излезе от рВЮС40 (описан тук по-горе). Лигирането се извършва с 100 ng от вектора и 50 ng от фрагментите от ДНК описани тук по-горе, в реакционна среда от 10 μΙ, в присъствието на 1 μΙ буфер Т4 ДНК лигаза х 10 (Amersham) и
2,5 U ензим Т4 ДНК лигаза (Amersham) при 14°С, в продължение на 16 часа. Трансформират се бактерии Escherichia coli DH5oc, предварително направени компетентни (Hanahan, 1983). Плазмидната ДНК от получените клонове, селекционирани върху 50 μρ/ιτιΙ ампицилин, се екстрахира по метода за алкално лизиране (Birnboim et Doly, 1979) и се анализира чрез смилане с рестрикционни ензими. Полученият клон се нарича рВЮСЮО.
Плазмидът рВЮС101 се получава в резултат на заместване на фрагмента Ncol-Aflll от рВЮСЮО с фрагмента Ncol-Aflll носещ последователноста кодираща за тетрапетида KDEL (който позволява адресиране в ендоплазмения ретикулум) поставен преди стоп кодона получен от амплификацията PCR, съгласно методиките описани тук погоре. Двата олигодезоксинуклеотида използвани при гази
104 реакция са: 5' ААТ CAC TTG GAG ТТТ ATC TGG Gcc atg gAT GCC 3' (сайт Ncol единствен) и 5' ААТ ctt aag AAA CTT TAT TGC CAA ATG TTT GAA CGA TOG GGG AAA TTC GAC GOG ICT AGA ACT ATA GCT CAT CCT TAT CTG TTC CCA TCA TGG 3' (последователност кодираща за KDEL и единствен сайт AfIII). Температурата на хибридиране е 70°С. Клонирането се извършва както е описано по-преди.
V.ПРИМЕР ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ТРАНСГЕННИ
РАСТЕНИЯ ОТ РАПИЦА
Семена от пролетна рапица (Brassica napus cv WESTAR или линия Limagrain) се дезинфектират в продължение на 40 минути в 15% ратвор на Domestos. След 4 промивания със стерилна вода, семената се оставят да поникнат, по 20 зърна в саксия от 7 cm диаметър и 10 cm височина, върху минерална среда на Murashige и Skoog (Sigma Μ 5519) с 30 g/l захароза и втвърдена с аргалгел 5 g/l. Тези саксии се поставят в камера за култивиране при 26°С, с фотопериод 16h/8h и с интензитет на осветление от порядъка на 80 μΕ m'2S'1.
След 5 дни на поникване, семеделите се вземат стерилно, като се прерязва всяка дръжка на около 1 mm над гнездото на семедела.
Успоредно, се осъществява предварителна култура от Agrobacterium tumefacens щам LBA4404, който съдържа плазмида рВЮС29 ( или рВЮС25), а именно плазмида pGAZE в който е вмъкната последователността кодираща за кучешка сгамашна липаза, слято свързана с тази кодираща за сигнал за насочване PPS (или PS) под контрола на промотора pCRU (или pd35S), в ерленмайерова колба от 50 ml, в продължение
105 на 36 часа при 28°С в 10 ml бактериална среда 2YT (Sambrook et al., 1989) допълнена с антибиотиците полезни за селекцията на използвания щам.
Тази предварителна култура служи за засяване с
1%, на нова бактериална култура, изпълнена при същите
условия. В края на 14 h културата се центрофугира 15 min при 3000 g и бактериите се поставят отново в еквивалентен обем гечна среда за поникване. Тази суспензия се разпределя в панички на Петри с 5 cm диаметър по 5 ml/паничка.
Отрязаният край на дръжките се потапя за няколко секунди в така приготвения разтвор на агробактерии, след това дръжката се потапя на няколко милиметра в средата за регенерация. Тази среда има същия основен състав както средата за поникване плюс 4 mg/ml бензиламинопурин (ВАР), фитохормон благоприятстващ новоформирането на пъпките. Десет експланти (семедели с дръжки) се поставят в култура в панички на Петри с диаметър 9 cm (Greiner лит. 664102 ).
След 2 дни на съкултура при същите условия на
околна среда както за поникването, експлантите се пикират отново в панички фитатрей (Sigma лит. Р1552) съдържащи предходната среда, допълнена със средство за селекциониране: 45 mg/ml канамицин сулфат (Sigma лит.К4000) и бактериостатик: смес от 1/6 (по тегло) калиева сол на клавуланова киселина и 5/6 натриева сол на амоксицилина (Augmentin за инжекции) по 600 mg/ml.
Два пъти последователно, на интервали от 3 седмици, експлантите се пикират отново стерилно, в нова среда при същите условия.
Появилите се зелени пъпки в края на второто или
106
третото разсаждане, се отделят от експланта и се поставят по отделно в култура, в прозрачни саксии с диаметър 5 cm и 10 cm височина, които съдържат същата среда както предишната, но не съдържаща ВАР. След 3 седмици на култивиране, стеблото на трансформираната пъпка се срязва и пъпката се разсажда в саксия с прясна среда. В края на третата или четвъртата седмица, коренчетата са достатъчно развити, за да позволят аклиматизиран™ на кълна във фитотрон. Пъпките, които не са зелени или не са вкоренени, се отстраняват. След това, тези кълнове се пресаждат в панички със страни 7 cm и напълнени с пръст (стандарт NF U44551: 40% кафяв торф, 30 % пресяти папратови и 30% пясък) наситена с вода. След две седмици на аклиматизация във фитотрона (температура 21°С, фотопериод 16h/8h и 84% относителна влажност), кълновете се пренасят в саксии с диаметър 12 cm, напълнени със същата пръст, обогатена със бавнодействащ тор (Osmocote, по 4 g/l почва), след това се пренасят в парник (клас S 2) регулиран на 18°С, с две оросявания дневно с вода, по 2 минути.
Още от появяването на цветовете, последните се затварят в сакчета (Crispac, лит. SM 570у 300 mm*700 mm) по начин, че да се възпрепятства кръстосаното опрашване.
Когато шушулките узреят, те се събират, сушат и след това се разчупват. Получените семена служат за определяне на биохимичната активност. Селекцията на трансгенното поколение се извършва чрез поникване върху среда съдържаща канамицин сулфат по 100 до 150 mg/ml (според генотипа).Условията на работа са идентични на тези описани тук по-горе, като поникването се извършва в
107
стъклени епруветки с едно единствено семе в епруветка. Само кълновете развиващи вторични корени в първите три седмици се аклиматизират във фитотрон преди да се прехвърлят в парник.
VI. ПРИМЕРИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ТРАНСГЕННИ
РАСТЕНИЯ SOLANACEAE
а) Получаване на трансгенни растения от тютюн Тютюневите растения, използвани за опитите за трансформиране (Nicotiana tabacum var.Xanthi NC и PBD6), се култивират in vitro върху среда на основата на Murashige et Skoog (1962), допълнена с витамините на Gamborg et al., (1968, Sigma лит.М0404), със захароза по 20 g/l и с агар (Merck) по 8 g/l. pH на средата се довежда до 5,8 с разтвор на калиев хидроксид, преди автоклавиране при 120°С в
продължение на 20 min. Кълновете от тютюн се пресаждат, чрез издънки от междувъзлията, всеки 30 дни върху тази среда за размножаване MS20.
Всички култури in vitro се осъществяват в климатичен пояс, с условията дефинирани тук по-долу:
- интензитет на осветление 30 )iE.m'2.S'1; фотопериод от 16 h;
- термопериод от 26°С през деня, 24°С през нощта.
Използваната техника на трансформиране е производна на тази на Horsch et al.,(1985).
Приготвя се предварителна култура от Agrobacterium tumefaciens щам LBA4404, съдържащ плазмидите рВЮС29 или рВЮС26 или рВЮС25, в продължение на 48 h при 28°С при разклащане, в среда LB (Sambrook et al., 1989) допълнена с подходящи антибиотици
108
(рифампицин и тетрациклин). След това предварителната култура се разрежда 50 кратно в същата среда и се култивира при същите условия. След една нощ, културата се центрофугира (10 min, 3000 g), бактериите се поставят в еквивалентен обем течна среда MS30 (30 g/l захароза) и тази суспензия се разрежда десетократно.
Експланти с около 1 cm2, се изрязват от кълновете описани тук по-горе. След това те се поставят в контакт със суспензията от бактерии в продължение на 1 h, след което се сушат бързо върху филтърна хартия и се поставят върху среда за съкултура (MS30 твърда).
След 2 дни, експлантите се пренасят в панички на Петри, върху среда за регенерация MS30, съдържаща селективно средство, канамицин (200 rng/l), бактериостатик аугментин (400 mg/l) и необходимите хормони за предизвикване на пъпки (ВАР, 1 mg/l и ANA,0,1 mg/l). Извършва се пресаждане на експлантите върху същата среда, след 2 седмици култивиране. След още две седмици, пъпките се пресаждат в панички на Петри, върху среда за развитие, съставена от средата MS20 допълнена с канамицин и аугментин. След 15 дни, пъпките се пикират до половината. Вкореняването отнема около 20 дни, в който срок кълновете могат да бъдат клонирани чрез издънки от междувъзлята или извадени в парник.
Ь) Получаване на трансгенни растения от домати
Семена от домати cv. UC82B се стерилизират в Domestos 10% 15 min и се промиват 3 пъти със стерилна вода. Последното промиване се извършва в продължение на 10 min при разклащане.
109
Така стерилизираните растения се поставят за поникване върху среда MSSV/2 (среда на основата на Murashige и Scoog (1962, Sigma лит. М6899)/2 допълнена с витамините на Nitsch (Thomas и Pratt, 1981), със захароза по 30 g/l, с arap (Merck) по 8 g/l, pH 5,9, в продължение на 7 или 8 дни в климатизирана камера (интензитет на осветлението 30 u.E.m2. S'1, фотопериод от 16 h/8h, 26°С).
Използваната техника за трансформация е производна на тази на Fillati et al.,(1987).
Предварителна култура от Agrobacterium tumefaciens щам
LBA 4404, съдържащ плазмидите рВ1ОС25 или рВ1ОС26, се приготвя в продължение на 24h при 28°С, при разклащане в
среда LB, допълнена с подходящи антибиотици (рифампицин и тетрациклин). Предварителната култура след това се разрежда 50 кратно в същата среда и се култивира при същите условия, в продължение на една нощ. Измерва се оптичната плътност при 600 nm, агробактериите се центрофугират (10 min,3000 g) и се поставят в течна среда KCMS (описана в публикацията на Fillati et al.,1987). по такъв начин, че да се получи оптическа плътност при 600 nm от 0,8.
Технически подобрения са внесени в някои етапи на методиката на Fillati et al., 1987.
Предварителното култивиране на експлантите и съкултурата се осъществяват както е описано от Fillati et al., 1987, с изключение на това, че средата KCMS е допълнена с ацетосирингон (200 тМ).
Средата за промиване 2Z се различава по прибавянето на цефотаксим по 500 mg/l вместо карбеницилин. Използваната среда за развитие, е съставена
10 от среда на основата на
Murashige et Scoog (Sigma MS 6899), допълнена c витамините на Nitsch със захароза по 20 g/l, с канамицин по 50 mg/l, с аугментин по 200 mg/l с ANA по 1 mg/l и със зеатин по 0,5 mg/l.
VII. ПОЛУЧАВАНЕ НА ТРАНСГЕННИ РАСТЕНИЯ ОТ
ЦАРЕВИЦА
а) Получаване и използване на калус от царевица, като мишена за генетична трансформация.
Генетичната трансформация на царевицата, какъвто и да е метода, който се използва (електропорация, Agrobacterium, микрофибри, обстрел с частици ), изисква найобщо използването на недиференцирани клетки в бързо делене, които са запазили способност за регенериране на цялостните растения. Този тип клетки съставлява ронливия ембриогенен калус (наречен тип II) от царевица.
Тези калуси се получават като се излезе от незрели ембриони от генотип HI II или (А188 х В73) съгласно метода и средите описани от Armstrong (Maize Handook;(1994) M.Freeling, V.Walbot Eds.;pp.665-671). Така получените калуси се размножават и се поддържат чрез последователни пресявания, през всичките петнадесет дни, върху средата за инициране.
След това, кълновете се регенерират, като се тръгне от тези калуси, като се модифицира хормоналното и осмотичното равновесие на клетките, съгласно метода описан от Vain et al..(Plant Cell Tissue and Organ Culture (1989,18:143151). Тези растения след това се аклиматизират в парник, където могат да бъдат кръстосани или самоопрашвани.
b) Използване на обстрел с частици за генетична трансформация на царевица.
Предходният параграф описва получаването и регенерирането на клетъчни линии необходими за трансформацията; тук се описва метод за генетична трансформация, водещ до стабилно интегриране на модифицираните гени в генома на растението. Този метод почива на използването на обстрел с частици, идентичен на този описан от J.Finer (Plant Cell Report (1992) 1 1:323-328); клетките мишени са фрагменти от калуси, описани в параграф 1. Тези фрагменти с повърхност 10 до 20 mm2 се разполагат 4 h преди обстрела по 16 фрагмента в паничка, в центъра на панички на Петри, съдържащи среда за култивиране, идентична на средата за инициране, допълнена с 0,2М манитол +0,2М сорбитол. Плазмидите носещи гените за вмъкване се пречистват на колона Qiagen®, като се спазват указанията на производителя.След това, те се утаяват върху частици от волфрам (М10) като се следва метода описан от Klein (Nature (1987)327:70-73). Така обвитите частици се
изстрелват към клетките мишени с помощта на оръдие и съгласно метода описан от J.Finer (Plant Cell Report (1992) 1 1:323-328).
Паничките c калуси бомбардирани по този начин, след това се запечатват с помощта на Scellofrais®, след това се култивират на тъмно при 27°С. Първото пресаждане се прави след 24h, след това на всеки петнадесет дни, в продължение на 3 месеца, върху среда идентична на средата за инициране, допълнена със селективно средство, чиято природа и концентрация могат да варират съобразно гена
12 който се използва (виж параграф 3). Селективните средства, които могат да се използват, най-общо се състоят от активните съставки на някои хербициди (Basta®, Round up®) или някои антибиотици (Хигромицин, Канаицин...).
След три месеци или понякога по-късно, се получават калуси, чийто растеж не се инхибира от средствата за селекция, обикновено и главно съставени от клетки, които са резултат от делението на клетка, която е интегрирала в своя генетичен патримониум едно или няколко копия на гена от селекцията. Честотата на получаване на такива калуси е около 0,8 калуса на бомбардирана паничка.
Тези калуси се идентифицират, индивидуализират, уголемяват, след което се култивират така, че да се регенерират кълновете (виж параграф а). За да се избегне смесване с клетки, които не са трансформирани, всички тези операции се извършват върху среда за култивиране, съдържаща средството за селекция.
Така регенерираните растения се аклиматизират, след това се култивират в парник, където могат да бъдат кръстосвани или самооплождани.
VIII. АНАЛИЗ НА ЕКСПРЕСИЯТА НА КУЧЕШКА СТОМАШНА ЛИПАЗА В ТРАНСГЕННИ ТЮТЮНЕВИ РАСТЕНИЯ
а) Методика
Методиката за екстрахиране на липазата, като се излиза от листа на тютюн взети за проба от растенията в парник, е следната: 1 g листа (свежо тегло) се смилат в течен азот, след това при 4°С в 5 ml буфер Tris-HCI 25 mM pH 7,5, допълнен с EDTA 1тМ и с меркаптоетанол 10 mM (буфер А) или буфер глицин-НС! 25 mM pH 3, допълнен с EDTA 1 тМ, с
13
β-меркаптоетанол 10 mM. Triton Х-100 0,2% и NaC! 250 тМ (буфер В). Общата смляна маса се центрофугира незабавно при 4°С, в продължение на 15 min, при 10000 д.
За семена от тютюн, екстракцията се извършва в буфер В по 0,1 д семена в 4 ml буфер.
Липазната активност се определя с помощта на рНстат по титриметричния метод на Gargouri et al.,(1986) при който използваният субстрат е трибутирин. Емулсията от трибутирин (4 ml за 30 ml емулсия) се осъществява на турбинна бъркалка в присъствието на жлъчни соли (1,04 g/l), говежди албумин (0,1 g/l) и NaCI (9 g/l). Определянето се състои в неутрализиране на маслената киселина освободена под действието на липазата, посредством разтвор на натриев хидроксид, с pH по предписание от 5,5 и при 37°С. Една липазна единица отговаря на количеството ензим, което предизвиква освобождаването на един микромол мастни киселини за 1 min при 37°С и в оптимални условия на pH (5,5). Естествената кучешка стомашна липаза (пречистена) има спецефична активност от 570 единици/mg протеин. Липазната активност може да бъде измерена на цялата смляна маса, на утайката или на надутаечната течност от центрофугирането.
На надутаечната течност от центрофугирането (буфер А), се извършва определяне на общото количество разтворими протеини, съгласно метода на Bradford (1976).
Извършва се също сандвичев ELISA анализ (Carrie et al.,1993) на надутаечната течност с 2 популации гюликлонални антитела анти-LGC естествена. Първата популация включва антитела, реагиращи с човешка стомашна
14 липаза и пречистени по афинитет, като се излиза ог тоталния антисерум върху човешка стомашна липаза нанесена на колона Affigel 10 (Aoubala et al.,1993). Тези антитела се използват за покриване на ямките на плаки за ELISA, в концентрация от 1 цд/т1. Втората популация обхваща антителата, които не разпознават човешка стомашна липаза. Те се пречистват последно на колона от Sepharose свързани с протеин А и след това с биотин. Фиксирането на антителата се проявява посредство конюгат стрептавидин/пероксидаза,
чиято ензимна активност се открива посредством субстрат офенилендиамин. Получените резултати имат качествена стойност и са отбелязани с помощта на символите + и -.
Добивът от екстракцията може да бъде подобрен, като се прибави в буфера за екстракция, повърхностно активно вещество от типа на CHAPS (3-(3-холамидопропил)диметиламонио-1-пропансулфонат) (Sigma). Действително, в такъв случай добивите от екстракцията в надутаечната течност се увеличават с около 100% (виж таблица 1).
ТАБЛИЦА 1
Липазна активност (U/g СТ) в екстрактите получени като се излезе от 4 тютюневи растения получени от генетична трансформация с рВЮС25 в присъствие на 1% CHAPS.
Растения NaCI 0,2M/EDTA NaCI 0,2M/EDTA
1 mM pH 3,0 1тМ pH 3,0 +
CHAPS 1%
1 80 112
2 40 104
3 43 109
4 54 92
15
b) Експресия c растителни сигнални пептиди, определяния в листата и семената на тютюн, трансформиран с рВЮС25 и рВЮС26; тест ELISA.
Резултатите получени с 98 растения ТО на генотипа Xanthi (стадий на 15 до 20 листа) са дадени в таблица 2. Всички определяния са извършени със смляна маса от листа или от семена преди центрофугирането. За всяко конструиране, измерените активности показват голяма променливост, според трансформираните растения. Около 20 % от растенията нямат никаква активност или тя е твърде слаба, за да бъде открита. Средните и максималните активности са дадени на таблица 2.
Количествата на общи протеини са подобни за трите конструирания със средно 7 и 8 mg/g СТ в листа и 34,31 и 38 mg/g СТ в семена.
Средната липазна активност в листа трансформирани с конструкцията рВЮС26 е 34 U/g СТ т.е. 0.8% от експресията спрямо общите протеини. В семената
средната активност е 36 U/g СТ, т.е. 0,2%. Максималната получена активност от трансформираните растения е 146 U/g СТ (листа; 2,5% от експресията) и 148 U/g СТ (семена; 0,7% от експресията).
Ензимните активности анализирани при растенията трансформирани с конструкцията рВЮС25 са подобни. Средната активност в листата е 34 U/g СТ (0,8% от експресията) и максималната активност е 134 U/g СТ (3% от общите протеини). В семената средната активност е 42 U/g СТ (0,3%) и максималната активност 159 U/g СТ (1%).
За растенията трансформирани с конструкцията
16 рВЮС29, не се открива никаква активност в листата (промотор семена-специфичен). В семената средната активност е 12 U/g СТ (0,1% ог експресията), а максималната активност 137 U/g СТ (0,7%).
Експресията в листата и семената от едно и също събитие на трансформация е най-общо добре съотносима.
Резултатите от ELISA анализите се съгласуват също
с тези от определянето на ензимната активност, т.е. когато едно растение показва липазна активност то дава и положителен резултат при тесга ELISA.
Резултатите получени по-късно върху тези същите растения, показват че липазната активност е податлива на вариране, в хода на развитието на растението. Дейтвително, растение, чиято експресия спрямо общите протеини е от 3% при стадий 12-15 листа, дава експресия от 6 % през време на по-късно определяне (по-възрастно растение вече цъфнало).
17
ТАБЛИЦА 2
Експресия на липаза в листата и семената на тютюн Xanthi
Общо 1 протеин ί mg/g CT 1 Липазна активност
U/g С Г Експресия (% общ
протеин)
конструкция орган min-max min-max min-max
/средно) (средно) (средно)
листа 3 - 15 0 -145,6 1 - 2,5
рВЮС26 (п=34) (7) (34,4) (0,8)
семена 24 - 43 0 - 147,6 0-0,7
(п=34) (34) (36,3) (0,2)
листа 3 _ 18 0-133,5 0-3
рВЮС25 (п=35) (В) (34) (0,8)
семена 17 - 35 1 - 158,5 0-1
(п=35) (31) (41,9) (0,3)
рВЮС29 семена 29 - 55 г 0 - 137,4 0-0,7 1
(п = 29) (38) (11,8) (0,1)
СТ = свежо тегло; min - стойност получена за събитие на трансформация експресираща най-малко; max = стойност получена за събитие на трансформация експресираща най-много; η = брой анализирани събития на трансформация.
с) Експресия със сигналния пептид на LGL;
определяния на липазната активност върху листата на тютюн.
Резултатите получени с 44 растения ТО от генотипа
Xanthi и pBD6 (стадий 15 до 20 листа) са следните:
Определянето на количествата се извършва на смлени листа, преди центрофугирането. Анализираните активности показват голяма променливост, според трансформираните растения. Около 20 % от растенията нямат никаква активност или имат активност твърде слаба, за да бъде открита. Средната липазна активност в листата трансформирани с конструкцията рВ1ОС41е 38 U/g СТ за генотипа Xanhi и 48 U/g за генотипа PBD6. Максималните активности са съответно 152 и 226 U/g СТ.
IX. АНАЛИЗ НА ЕКСПРЕСИЯТА НА КУЧЕШКА
СТОМАШНА ЛИПАЗА В ТРАНСГЕННИ РАСТЕНИЯ ДОМАТИ
a) Методика
Методиката за екстрахиране на липаза, като се излиза от листата и плодовете на домати, е подобна на тази описана за листата на тютюна, с изключение, че 1 g от свежия материал се поставя в 4 ml буфер В. Липазната активност се определя както е описано за листата на тютюна.
b) Определяне в плодовете на домати
Анализирани са плодовете на тридесет първично трансформирани растения.
Липазната активност, определена в плодовете е променлива, съобразно плодовете на едно и също трансформирано растение. Тя е средно 5 U/g СТ за зрелите плодове и 35 U/g СТ за зелените плодове, независимо от изпитваната конструкция (рВ1ОС25 или рВ1ОС26).
За отбелязване е, че в хода на узряването на плода, активността намалява. Например, за дадено първично трансформирано растение, липазната активност е 132 U/g СТ за зелен плод с диаметър 10 mm , 44 U/g СТ за червено-зелен плод с диаметър 33 mm и 36 U/g СТ за червен плод с диаметър 45 mm.
X. ИМУНООТКРИВАНЕ ОТ ТИПА “WESTERN” HA
PEKOMБИHAHTHA LGC
a) LGC експресирана в листата и семената на
трансгенни тютюн и рапица
а.1) Експресия с растителни сигални пептиди; имунооткриване в листата и семената на тютюна и на рапицата, трансформирани с рВЮС25, рВЮС26 и рВЮС29.
Опитите за имунооткриване от типа “western” (Western-blots) (Renart et Sandoval, 1984) на кучешката стомашна липаза се извършват върху протеините на листа на тютюн и семена на тютюн и рапица, екстрахирани с буферите А и В (виж методиката за екстракция тук по-горе). За осъществяването на тези опити, екстрахираните протеини (30 цд общи протеини за проба) най-напред се разделят на денатуриращ полиакриламиден гел 12,5%, по техниката на Laemli U.K.(1970), след това се пренасят на нитроцелулозна мембрана. Поликлонално антилипазно антитяло получено от
морско свинче се използва като сонда и откриването се извършва посредством антитяло анти-lgG от морско свинче, маркирано с алкална фосфатаза.
Протеинът свидетел е естествена кучешка стомашна липаза (L.C. Фиг.6), която мигрира под формата на единствена ивица, с явна молекулна маса около 50 kDa. Миграцията на кучешката стомашна липаза е леко забавена, в присъствието на екстракт от нетрансформирани листа на тютюн. (Фиг.6, LC+T).
Никаква ивица не се открива в протеинови екстракти от нетрансформирани листа и семена от тютюн и рапица. Липазата продуцирана в листата на тютюна, се явява
120
под формата на 2 ивици. Ивицата, количествено по-голяма, има явна молекулна маса от около 37 kDa и отговаря на полипептида (Λ54) споменат по-горе. По-малката ивица има явна молекулна мас от около 49 kDa и отговаря на полипептида (Δ4) споменат по-горе)(Фиг,6, F). В протеиновите екстракти от семената се вижда само ивицата с по-ниска молекулна маса.(Фиг.6, GT и GC).
а.2) Експресия със сигналния пептид на LGL; имунооткриване в листата и семената на тютюн, трансформирани с рВЮС4 1
Осъществява се Western-блотинг (Renart et Sandoval, 1984) върху протеините на листата и семената на тютюн, екстрахирани с буфер В (виж методиката за екстракция тук по-горе). Екстрахираните протеини най-напред се разделят на денатуриращ полиакриламиден гел (SDS-PAGE) съгласно техниката на Lemli (1970) след това се пренасят на нитроцелулозна мембрана. Поликлонално антилипазно кучешко антитяло, получено от морско свинче, се използва
като сонда и откриванто се извършва посредством антитяло анти-морско свинче, маркирано с алкална фосфатаза.
Пример с Western-блотиране на листата на тютюн е показан на фигура 7. Протеинов свидетел е кучешка стомашна липаза, която мигрира под формата на единствено петно с явна молекулна маса ог около 50 kDa. Никаква ивица не се открива в протеиновите екстракти от нетрансформираните листа на тютюна (Т). Липазата продуцирана в екстрактите от листата се представя под формата на една по-голяма ивица с явна молекулна маса от около 49 kDa и отговаря на полипептида (Λ4) споменат по-горе.
121
В семената на тютюн трансформиран с конструкцията рВЮС41, рекомбинантната липаза е представена под същата форма както в листата.
b) LGC в екстракт от протеините на листата на трансформиран тютюн; опит за дегликозилиране.
Методиката за екстракция на протеини за опита за дегликозилиране е следната: 0,5 g листа (свежо тегло) се смилат в течен азот, след това при 4С в 1 ml денатуриращ буфер (фосфатен буфер 100 mM pH 7,5, допълнен с бетамеркагпоетанол 1%, EDTA 25 mM и SDS 1%). Смляната маса се центрофугира при 4°С в продължение на 15 минути при 10000 д. Надутаечната течност се инкубира в продължение на 5 min при 1 00 С, за да се осъществи денатурацията на протеините, след това се центрофугира 2 min при 10000 д. След това надутаечната течност се разрежда 10 кратно в буфер за дегликозилиране (фосфатен буфер 100 mM, pH 7,5 допълнен с бета-меркаптоетанол 1%. EDTA 25 mM, SDS 0,1% и октилглюкозид 1%). Прибавя се ензима (N-глюкозидаза F, PNGase Boeringer) по 1 U за 100 μΙ надутаечна течност. От всяка проба се приготвя по един свидетел без ензим. Дегликозилирането на протеина-свидетел (стомашна липаза от куче или заек) се извършва в същите условия. Различните протеинови проби се инкубират при стайна температура в продължение на 8 часа. След това протеините се разделят чрез електрофореза на полиакриламиден гел и се пренасят на нитроцелулозна мембрана, както е описано в предходния параграф.
Според резултатите от “Western-блотиране,:, иползуваната като свидетел стомашна липаза има явна
122
молекулна маса от около 50 kDa. След дегликозилирането, нейната явна молекулна маса не е повече от около 43 kDa.
Липазата продуцирана в листата на тютюна, след инкубиране без PNGase в условията описани тук по-горе, е представена под формата на 3 ивици с явни молекулни маси 49 (полипетид (Δ4), 37 (полипептид (Δ54) и 28 kDa. Ивицата с молекулна маса 28 kDa е без съмнение резултат от протеолиза настъпваща през време на инкубирането 8 часа при стайна температура. След дегликозилирането, молекулните маси на трите ивици се намаляват с около ί до 2 kDa, което показва,че протеините продуцирани в листата на тютюна са гликозилирани.
с) LGC експресирана в плодовете на трансгенни домати
Опитите за имунооткриване от типа “Wstern” на кучешка стомашна липаза се изпълняват върху протеините от листата и плодовете на домати екстрахирани с буфер В (виж методиката за екстракция тук по-горе). За извършването на опитите, екстрахираните протеини (15 дд и 6 дд от общите разтворими протеини за листата и плодовете, съответно) се разделят на денатуриращ полиакриламиден гел както е описано в параграф Х.а).
Протеинът-сведетел е природна стомашна липаза (писта 4, фиг.8), която мигрира под формата на само една ивица с явна молекулна маса от около 50 kDa.
Никаква ивица не се открива в протеиновите ектракти от листата и плодовете на нетрансформираниге домати.
Липазата продуцирана в листата и плодовете на
123
доматите е представена под формата на две ивици, каквато и конструкция да се използва (рВ1ОС25 или рВ1ОС26). Поголямата ивица има явна молекулна маса от около 37 kDa и отговаря на полипептида (Δ54) споменат по-горе. По-малката ивица има явна молекулна маса от около 49 kDa и отговаря на полипептида (Δ4) споменат по-горе (Фиг. 8).
XI. ПРЕЧИСТВАНЕ НА КУЧЕШКА СТОМАШНА ЛИПАЗА ОТ РАСТЕНИЯ
а) Пречистване на LGC като се излиза от листата на тютюн
Активността на кучешката стомашна липаза продуцирана в листата на тютюна се определя съгласно един титриметричен метод, pH по предписание е определено на 5,5 и температурата на 37°С с помощта на рН-стат (MettlerToledo-DL25), като се използва трибутирин за субстрат: 1 ml трибутирин се емулгира в 29 ml воден разтвор на NaCl 0,15 М, на турбинна бъркалка. Определянето се състои в неутрализиране на маслената киселина освободена под действието на липазата, чрез прибавяне на основа 0,02 N, докато емулсията се поддържа чрез силно механично разбъркване. Една единица липаза отговаря на 1 микромол мастна киселина освободена за една минута при тези условия на pH и на температура.
След първия етап на хроматография, липазната активност се проявява върху емулсия от 1 ml трибутирин в 29 ml разтвор 0,15 М на NaCl , 2 М натриев тауродезоксихолат и
1,5 μΜ говежди серумен албумин подобно на определянето описано от Gargouri et а!.,(1986).
Един грам лиофилизирани листа се смилат при 4сС в
24 ml глицинов буфер 20 mM pH 2,5 и се оставя под леко разбъркване в продължение на 15 минути. През време на мацерацията pH се поддържа при 2,5 чрез прибавяне на IN HCI. Продуктът от мацерацията се центрофугира при 15000 g в продължение на 5 минути. Стойността на pH на надутаечната течност се довежда до 4 чрез прибавяне на NaOH 1N. След филтриране на MIRACLOTH (Calbiochem), цялото количество на
надутаечната течност се нанася на колона с катионообменна смола (смола S-Sepharose Fast Flow-Pharmacia) 10 ml (диаметър 1,6 cm) еквилибрирана c буфер натриев ацетат 20 mM pH 4,0, NaCI 20 тМ с дебит 1 ml за минута. Събират се фракции по 2 ml. След преминаването на надутаечната течност, колоната се промива с 40 ml от буфера за еквилибриране. Задържаните на колоната протеини се елуират съгласно следващата тук методика:
- линеен градиент от буфер натриев ацетат 20 гпМ. pH 4,0 от 20 тМ до 210 тМ NaCI за 30 минути за елуиране на един първи сбор от протеинови пикове несъдържащи липазната активност, като изследването се прави с проби от 1
- плато при 210 mM NaCI в продължение на 20 минути,
- линеен градиент от буфер натриев ацетат 20 тМ, pH 4,0 от 210 тМ до 500 тМ в продължение на 30 минути за елуиране на втори сбор от пикове. Липазната активност изместена върху проби от по 0.5 ml, се елуира през време на този втори градиент, с йонна сила разположена между 300 и 400 тМ.
Активните фракции се събират, концентрират се
125 посредс!вом концентрационна клетка OMEGACELL в ι раници на молекулните маси от 30 kDa (Filtron Technology Corporation).
Концентратът се диализира спрямо буфер Tris-HCI тМ pH 8, след това се нанася на колона с анионообменна смола (MonoQ HR 5/5 с диаметър 0,5 cm и височина 5 стPharmacia) еквилибрирана в буфер Tris-HCI 10 тМ pH 8.
Липазната активност се измерва на проби от по 0,5 ml.
Дебитът се поддържа на 1 ml за минута, с налягане 2,0 МРа
След елуиране на незадържаната фракция и промиване на
колоната с ml буфер Tris-HCI 10 mM pH
8, се прилага линеен градиент с йонна сила от 400 mM NaCI pd 60 минути.
Липазната активност се елуира с йонна сила разположена между 100 тМ и 200 тМ.
Активните фракции се събират и се концентрират на клетка за концентриране OMEGACELL с граници на молекулните маси 30 k.Da. Концентратът представлява пречистената форма на стомашна липаза на куче,
екстрахирана от листата на тютюна.
Определянето на концентрацията на протеини се извършва съгласно метода на Bradford М. (1976) на концентрираните надутаечни течности и съгласно метода на Lowry О.Н. (195 1) за разтворите след първата йонообменна хроматография.
Различните етапи на пречистване се анализират чрез електрофореза на денатуриращ полиакриламиден гел (SDS-PAGE 12,5%) по техниката на Laemli U.K. (1970). 1 ака разделените върху полиакриламидния гел протеини, се проявяват от една страна чрез оцветяване с кумаси-синьо и
26 от друга чрез пренасяне на нитроцелулозна мембрана, по техниката на полусух електропренос (Transblot SD, Biorad) във буфер Tris-база 20 тМ, глицин IЬО тМ и етанол 20%, по 2,3 mA на cm2 от мембраната. Рекомбинантната кучешка стомашна липаза пренесена върху нитроцелулозна мембрана се проявява чрез имунооткриване съгласно следващата методика:
антитяло свинче и
- маркиране на протеина мишена с поликлонално анти-кучешка стомашна липаза, получена от морско разредена до 1/5000 в буфер PBS, допълнен с обезмаслено мляко на прах до 5% и Tween 20 до 0,1% в продължение на 1 час при стайна температура,
- промиване на мембраната в три последователни бани с буфер PBS допълнен с обезмаслено мляко на прах до
1% и Tween 20 до 0,1% в продължение на 10 минути за всяка баня
- маркиране с антитяло анти-морско свинче свързано с пероксидаза (Sigma) разредено до 1/2000 буфер
PBS, допълнен с обезмаслено мляко на прах до 1% и до 0, 1% в продължение на 1 час при стайна температура,
- промиване на мембраната в гри последователи и бани с буфер PBS, допълнен с обезмаслено мляко на прах до
1% и Tween 20 до 0,1 %, в продължение на баня.
на пероксидазата върху 4-хлоро-1-нафтол (Sigma) в присъствието на Н2О2 се получи синьо оцветяване, стабилно във времето.
Липазата продуциране в листата е представена под формата на две ивици с около 49 kDa (полипептид (А4)) и 37
127 (полипептид (Δ54)) kDa.
b) Вариант на пречистване на LGC от листата на тютюн.
Активността на кучешката стомашна липаза продуцирана в листата на тютюн се определя по титриметричните методи описани от Gargouri et al., (1986) с помощта на рН-стат (Mettler-Toledo DL25).
Определянето върху триглицериди с къси вериги се
извършва като се използва трибутирин като субстрат: 1 ml трибутирин се емулгира в 29 ml воден разтвор на NaCI 0, 15 uM и натриев тауродезоксихолат (NaTDC) 2 mM. Стойността на pH по предписание се фиксира на 5,0. температурата на
37°С.
Определянето се състои в неутрализиране на маслената киселина, освободена под действието на липазата, чрез прибавяне на натриев хидроксид 0,02 N, като емулсията се поддържа чрез силно механично разбъркване.
Определянето върху триглицеридите с дълги вериги се извършва като се използва за субстрат водна емулсия с 30 % пречистено соево масло, 1,2 % пречистени яйчни фосфолипиди, 1,67 % безводен глицерол (intraiipid гм 30%Pharmacia AB Stockholm, Sweden). Десет ml от тази суспензия се емулгират в 20 ml воден разтвор от NaCI 0,15 М, BSA 30 μΜ и СаСЬ 3.5 mM. Стойността на pH по предписание се фиксира на 4,0, температурата на 37°С.
Определянето се състои в неутрализиране на мастните киселини, освободени под действието на липазата, чрез прибавяне на 0,2 N натриев хидроксид след скок на pH от 4 на 9, като емулсията се поддьржа чрез силно механично
128 разбъркване.
Една единица липаза отговаря на един микромол освободена мастна киселина за една минута при определените условия на pH и на температура, за всеки от субстратите.
Два грама лиофилизирани листа се смилат при 4°С в ml NaCI 0,2 М, pH 3 и се оставят при леко разбъркване 15 минути при 4°С. През време на тази мацерация, pH се поддържа на 3 чрез прибавяне на НС! 1N. Продуктът от мяцерацията (хомогенат) се центрофугира при 10000 g 10 минути. След филтриране на MIRACLOTH (Calbiochem) и филтър MILLIPORE 0,45 μ, цялото количество на надутаечната течност се инжектира на колона с кагионообменна смола (RESOURCE S 6 ml - Pharmacia-16 mm вътрешен диаметър х 30 mm) еквилибрирана в буфер натриев ацетаг 20 mM, NaCI 0,2
М pH 3 с
След преминаването на незадържаната фракция, колоната се промива с 30 пъти по-голям буфера за еквилибриране. Задържаните протеини на
колоната, се елуират с линеен от буфер от натриев ацетат 20 mM pH 3, 0,2 М NaCI
NaCI в 7 обема на колоната.
Събират се фракции
Липазната активност измерена елуира при йонна сила 0,35 М or NaCI.
Активните фракции се събират и концентрират на клетка за концентриране OMEGACELL (Filtron Technology
Corporation ) c граница на молекулните маси от 30 kDa
Определянето на концентрацията на протеини се извършва съгласно метода на Lowry О.Н. (1951).
29
Пример за полиакриламиден гел и резултатът от прехвърлянето на този гел върху нитроцелулозна мембрана и
проявяването като се излиза ог антитела анти-кучешка стомашна липаза са показани (фиг.9 и 10). Проявяването е извършено посредством действието на пероксидаза върху Luminol в присъствието на активатор (ECL Western-blotting, Amersham Life Science) и запечатване на фотографски филм.
- присъствието на гликанови остатъци върху протеина се определя съгласно следната методика:
- имобилизиране на протеина върху нитроцелулозната мембрана
- обработване с перйодат
- специфична реакция със стрептавадин свързан с алкална фосфатаза,
- цветна реакция на алкалната фосфатаза (GLYCOTRACK-OXFORD GLYLOSYSTEM).
Пример на мембрана за откриване на гликанови остатъци е показан на фиг. 11.
Чистотата на фракциите се осигурява посредством високоефективна течна хроматография.
Хроматограф WATERS 625 LC. Колона VYDAC С4
Условия за елуиране:
ί Време Дебит % A % В
(min) (ml/min)
ι 0 j i 1 100 0
..................“ 35 ............... ΐ ι..... _L_ ................ 1 ......- 40 60
i 4 ! ! i 1 40 60
. 45 [ 1 50..... Ί 1 20 80
..................ί ............. Too 0
30
Времена А: 8У,У % Ацетонитрил, 0,1% трифлуороцетна киселина
Времена В: 100 % Ацетонитрил.
Таблица за пречистването: Рекомбинантна LGC
................- j Единици* [ mg Специ- ' Фактор на ί Добив
i I общо I протеини ί ί ι фична 1 1 пречистване ί I ί
I . .ι............................ i / ] активност ι
_________________________________i_ Хомогенат ' 3200 ή................/.......~ / 7 ................. ί ι 7 i
Надутаечна i течност i Изходна суровина S ! 2800 ί 230 ΐ 13 1 1 i ; 8 8 %
1600 ί 6 I 250 20 ι 50% i
Трибутиринови единици
Сравнени специфични активности на природна кучешка стомашна липаза(п-1_СС) и рекомбинантна кучешка стомашна липаза (r-LGC)
ί i ! n-LGCr r-LGC екстракт от
ί ί i листа на тютюн
I Трибутирин 570 U/rng 250 U/mg
Intralipide 30% ’ 1000 U/mg f 950 U/rng * Лит.: Carriere et al. ,(1991) Eur. J. Biochem., 202,75-83.
c) Пречистване на LGC получена от семена на рапица
Активността на рекомбинантната LGC продуцирана в семена на рапица се определя по същия начин както в случая на екстракция като се излиза от листата.
131
Два грама семена от рапица се смилат в течен азот.
Полученото брашно се обезмаслява с хексан, чрез първична мацерация при 4 С, при внимателно разбъркване в продължение на 12 часа. Цялото количество се декантира, хексанът се отстранява. Брашното се промива два пъти с 100 ml хексан, при леко разбъркване в продължение на 1/2 час при 4°С, за всяко промиване. Хексанът се отстранява чрез декантиране. Брашното се суши на ротационен изпарител (HEIDOLPH 94200). Обезмасленото брашно се съхранява при -20°С.
Екстракцията на LGC се извършва като се излезе от обезмасленото брашно при 4°С във воден разтвор на NaCL 0,2 М pH 3 (HCI 1 N), в продължение на 30 минути, по 2 ml воден разтвор за 0,1 g брашно. Полученото след мацерацията се центрофугира при 10000 g в продължение на 10 минути при 4С.
Утайката се отстранява. Надутаечната течност представлява екстрактът от семената.
Екстрактът от семената се диализира спрямо буфер от натриев ацетат 10 mM ,рН 4, NaCi 140 тМ, KCI 3 тМ, след това се нанася на имуноафинитетна колона съставена от поликлонални антитела анти-кучешка стомашна липаза, получени от морско свинче, свързани със смола (хидразид Avidgel-BIOPROBE INTERNATIONAL, Inc.).
Времето на контакт на смолата с екстракта от семената е 30 минути при 4°С, при леко разбъркване. След това смолата се промива с 10 обема на колоната ацетатен буфер 10 mM, pH 4, NaCl 150 mM, KCI 3 тМ. LGC се елуира с 5 обема на колоната буфер глицин 0,2 М, pH 2,8, NaCl 150
132
mM. Събраните фракции имат обем равен на един обем на колоната и съдържат 1/20 обема о/о буфер Tris 1М pH 9. Анализът чрез електрофореза на полиакриламиден тел в денатурираща среда (виж фиг.12) показва един протеин с молекулна маса от около 37 kDa.
XII. СИНТЕЗА НА ЕСТЕРИ НА МАСТНИ КИСЕЛИНИ
Опитите се извършват с нетрансформирани семена на рапица, като липазата се внася:
- или под формата на имобилизиран ензимен npenapai (лигюзим N0V0) или свободна (заешка стомашна липаза (JO 4002)).
- или под формата на семена от тютюн, трансформирани с гена на кучешката стомашна липаза (тютюн Т 14-44 0,85% експресия).
Реакциите на естерифициране се провеждат при
С в продължение на 16 часа в стъклени флакони затворени херметично, поставени на платформа за разклащане (250 об/мин.) Органичният разтворител, който се използва е хексан, в който мастните киселини са разтворими. Прибавя се метанол в стехиометрично съотношение спрямо теоретичното количество на триглицерол, съдържащо се в семената на рапицата.
Главната съставка на мастните киселини от семената на рапицата е олеиновата киселина, също свидетеля избран за сравнение е метилов естер на олеиновата киселина. Проследяването на синтезата се извършва чрез тънкослойна хроматография (ССМ). Подвижният разтворител е смес от хексан, диетилов етер, вода (70:10:1). Проявяването на плаките се извършва на горещо, след напръскване със
133 сярна киселина (5%) в етанол.
В един първи опит, към 0,2 g масло от рапица (0,22 mmol) се прибавя 27 μΙ метанол (0,66 mmol) и 0,02 g липозим: никакво петно не се проявява на нивото на свидетеля метилов естер на олеиновата киселина (Фигура 13, колона 2).
Във втория опит, маслото от рапица се заменя с 0,5 g семена от рапица смлени на сухо и се прибавя 1 ml хексан: има синтеза на метилов естер (Фигура 13, колона 5).
В следващите опити, условията от тук по-горе се повтарят със следните изменения: количеството на липозима се намалява на 0,
006 g и липозимът се заменя със заешка стомашна липаза (0,007 g от JO 4002).
Има синтеза на метилов естер на олеиновата киселина липозима, но няма в присъствието на JO 4002 ( Фигура 14.
колона 2).
Накрая, в последните опити липазата се внася от трансформирани семена на тютюн (1д семена от тютюн).
Появява се характеризиращото петно за метиловия естер
(Фигура 1 5, колона 3). В заключение, резултатите описани тук по-горе,
показват, че когато се смесят екстракти от семената на рапица, алкохол и рекомбинантна кучешка стомашна липаза продуцирана от трансгенни тютюни, се получава реакция на естерифициране, която води до синтезата на метилов естер, който може да бъде използван като биовъглеводород.
Легенда на фигурите:
- Фигура 1: нуклеотидна последователност на кДНК кодираща за LGC;
- фигура 2: аминокиселинна последователност на
134
LGG,
- фигура 3: нуклеотидна последователност производна на кДНК кодираща за LGC и кодираща за LGC представена на фигура 2,
- фигура 4: нуклеотидна последователност на кДНК кодираща за LGH, и аминокиселинна последователност на
LGH,
- фигура 5: аминокиселинна последователност на
I G Н,
- фигура 6: имунооткриване на рекомбинантните полипептиди продуцирани от листата и семената на тютюн Xanthi, и семена на рапица, трансформирани с конструкциите рВЮС26, рВ1ОС25 и рВ1ОС29; Е, скала на молекулните маси; LG, кучешка стомашна липаза; F, листа от тютюн и GT, семена от тютюн трансформирани с конструкцията pBIOC25; GC, семена от рапица, трансформирани с конструкцията рВ1ОС29; Т, нетрансформирани листа от тютюн,
- фигура 7: имунооткриване на рекомбинантни полипептиди продуцирани от листата на тютюн, трансформирани с конструкциите рВ1ОС25 и рВЮС41; Е, скала на молекулните маси; LC, кучешка стомашна липаза; 1 и 3, листа на тютюн трансформирани с конструкцията рВЮС41; 2, листа от тютюн трансформирани с конструкцията рВ1ОС25;
Т, нетрансформирани листа от тютюн,
- фигура 8; имунооткриване на рекомбинантни полипептиди продуцирани от листата и плодовете на домати, трансформирани с конструкциите рВ1ОС25 и рВ1ОС26:
Т1; нетрансформирани плодове от домати и 3: трансформирани плодове от домати
135
2. трансформирани листа от домати
Е: скала на молекулните маси
LC: кучешка стомашна липаза
Т2: нетрансформирани листа от домати.
- фигура 9: анализ чрез електрофореза на полиакриламиден гел в денатурираща среда (SDS PAGE)
1: екстракт от семената на рапица
2: рекомбинантна кучешка стомашна липаза получена от листата на тютюн
3: природна кучешка стомашна липаза
4: скала на молекулните маси
-фигура 10: имунологично проявяване на предходния анализ след пренос на нитроцелулозна мембрана
1: природна кучешка стомашна липаза
2: рекомбинантна кучешка стомашна липаза, получена от листата на тютюн
3: екстракт от семената на рапица
- фигура 1 1: проявяване на наличието на гликанови
остатъци като се излиза от полиакриламиден гел след пренос на нитроцелулозна мембрана : екстракт от семената на рапица
2: рекомбинантна кучешка стомашна липаза получена от листата на тютюна
3: природна кучешка стомашна липаза
- фигура 12: SDS-PAGE анализ на имунопречистването на r-DGL получена в семената на рапица
1: природна кучешка стомашна липаза
2: рекомбинантна кучешка стомашна липаза до 6: незадържани фракции елуирани от колоната за имунопречистване
фигура 13: проявяване на тънкослойнохроматографска плака: I: масло от рапица, няма ензим; 2: масло от рапица + липозим; 3: метилов естер на олеиновата киселина; 4: семена от рапица, без ензим 5: семена от рапица + липозим,
- фигура 14: проявяване на тънкослойно хроматографска плака: 1 и 4: семена от рапица без ензим; 2: семена от рапица + JO 4002; 3: метилов естер на олеиновата киселина; 5: семена от рапица + липозим,
- фигура 15: проявяване на плака от ССМ: 1:
моноолеин, диолеин, триолеин; 2: метилов естер на олеиновата киселина; 3: семена от рапица + трансформирани семена от тютюн.
137
ЛИТЕРАТУРА
An et al. Plant Physiol., 81, 301-305 (1986).
An G„ Plant Physiol., 81, 86-91 (1986).
Aoubala M., Daniel C., De Caro A., Ivanova M.G., Him M., Sarda L. et Verger R., Eur. J. Biochem. 211, 99-104 (1993).
Barta et al., Plant Mol. Biol., 6, 347-357 (1986).
Bednarek S. Y. et Ralkhel N. V., The Plant Cell, 3, 1195-1206 (1991).
Berg D.E., Berg C.M., Biotechnology, 1, 417-435 (1983).
Bernard C., C.R. Acad. Sci., 28, 249-253 (1849).
Bevan et al., Nature, 304, 184-187 (1983).
Bevan M., Nucleic Acids. Res., 12, 8711-8721 (1984).
Birnboim H.C., Doly J., Nucl. Acids. Res., 7, 1513-1523 (1979).
20 Bodmer M.W. et al., Biochem Biophys.Acta, 909, 237-244 (1987).
Bradford M., Anal Biochem., 72, 248 (1976).
Brodelius et al., FEBS Letters, 103, 93-97 (1979).
Brodelius, In: Moo-Young M. (Ed), Bioreactor Immobilized Enzymes and Cells: Fundamentals and Applications, Elsevier, Londres (1988).
Carriere et al., Eur. J. Biochem., 202, 75-83 (1991).
Carriere F., Laugier R., Barrowman J.A., Douchet I., Piymenko N. et Verger R., Scand. J. Gastroenterology, 28, 443-454 (1993).
Close J.J., Rodriguez R.L., Gene, 20, 305-316 (1982).
De La Penna et al., Nature, 325, 274-276 (1987).
Deno et al., J. Plant. Physiol., 131, 315-322 (1987).
138
Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-573 (1982).
Depigny-This et al., Plant. Mol. Biol., 20, 467-479 (1992).
De Zoeten et al.. Virology, 172, 213-222 (1989).
Docherty A.J.P. et al., Nucl. Ac. Res., 13, 1891-1903 (1985).
Edelbaum et al., J. of Interferon Research, 12, 449-453 (1992).
io
Franck et al. Cell, 21, 285-294 (1980).
Fillatti J.J., Kiser J., Rose R. et Comai L., Biotechnologie, 5, 726-730 (1987).
Gamborg O.L., Miller R.A. et Ojima K., Exp. Cell. Res., 50, 151-158 (1968).
Gargouri Y., Pieroni G., Riviere C., Sauniere J-F., Lowe P.A., Sarda
L. et Verger R., Gastroenterology, 91, 919-925 (1986).
Gargouri Y. et al., Biochem. Biophys. Act., 1006, 255-271 (1989).
Gaubier et al., Mol. Gen. Genet., 238, 409-418 (1993).
Giller et al., J. Biol. Chem., 267, 16509-16516 (1992).
Guerineau F., Mullineaux P., Plant Molecular Biology LABFAX, Groy R.R.D. (Ed), Nios. Scientific Publishers, Blackwell Scientific
Publications, 121-147 (1993).
Hanahan D„ J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983).
Hein R., International Meeting of Production of Recombinant Proteins in
Plants, Leicester, p. 22 (1994).
Herrera-Estrella et al., Nature, 303, 209-213 (1983a).
139
Herrera-Estrella et al., EMBO J., 2, 987-995 (1983b).
Hiatt et Ma, FEBS, 307, 71-75 (1992).
Hiatt et al., Nature, 342, 76-79 (1989).
Higo et al., Biosci. Biochem., 57, 1477-1481 (1993).
Holsters et al., Mol. Gen. Genet., 163, 181-187 (1978).
io
Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D. et Rogers S.G., Science, 227, 1229-1231 (1985).
Jouanin et al., Plant Sci., 53, 53-63 (1987).
Kay et al., Science, 236, 1299-1302 (1987).
Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685 (1970).
Liu et al., Mol. Plant Microb. Interactions, 6, 144-156 (1993).
Lowry O.H., J. Biol. Chem., 173, 265-275 (1951).
Ma et al., International Meeting of Production of Recombinant Proteins 25 in Plants, Leicester, p. 39-40 (1994).
McElroy et al., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160 (1991).
Marx, Science, 216, 1305-1307 (1982).
Mason et al.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11745-11749 (1992).
Matsuoka K., Nakamura K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 834-838 (1991).
Moloney et al.. International Meeting of Production of Recombinant Proteins in Plant, Leicester, p. 36-38 (1994).
140
Moreau H. etal., Biochem. Biophys. Act., 960, 268-293 (1988).
Murakami et al., Plant Mol. Biol., 7, 343-355 (1986).
Murashige T. et Skoog F., Physiol. Plantarum, IS, 473-497 (1962).
Ni et al., Plant J., 7, 661-676 (1995).
Reina et al., Nucleic Acid Research, 18, 6426 (1990).
Renart J. et Sandoval I.V., Meth. Enzymol., 104, 455-460 (1984).
Russel D., International Meeting of Production of Recombinant Proteins in Plants, Leicester, p. 43 (1994).
i5
Sambrook et al., Molecular Cloning Laboratory Manual, 2n<1 Edition,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Sanford J.C., Trends in Biotechnology, 6, 299-302 (1988).
Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977).
Schroeder M. R., Borkhsenious Ο. N., Matsuoka K., Nakamura K. et Ralkhel N. V., Plant Physiol., 101, 451-458 (1993).
Shonheyder F., et Volquartz K., Acta Physiol. Scand., 9, 57-67 (1945).
Sijmons et al., Biotechnology, 8, 217-221 (1990).
Thomas B.R. et Pratt D., Theor. Appl. Genet., 59, 215-219 (1981).
Truve et al., Biotechnology, 11, 1048-1052 (1993).
Vandekerckhove et al., Biotechnology, 7, 929-932 (1989).
Volhard F., Z. Klin. Med., 42, 414-429 (1901).
141
Списък на последователностите (1) Обща информация:
(i) Заявител:
(A) Име: Biocem S.A.
(B) Улица: 24, Avenue des Landais (C) Град: Aubiere (E) Страна: Франция (F) Пощенски код: 63170 (A) Име: Institut de Recherche Jouveinal (B) Улица: 3-9, rue de la Loge (C) Град: Fresnes (E) Страна: Франция (F) Пощенски код: 94265 CEDEX
(ii) Заглавие на изобретението: Рекомбинантни предуоденални липази и производни полипептиди продуцирани от растения, методи за тяхното получаване и използуването им.
(iii) Брой на последователностите: 6
(iv) Форма за четене от ординатора:
(A) Тип на поддържане: Флопи диск (B) Ординатор: IBM PC съвместим (C) Система за използване: PC-DOS/MS-DOS (D) Логическа схема: Patent In Release #1,0, Version #1,25 (OEB) (vi) Данни за предишната заявка:
(A) Номер на подаване: FR 9504754 (B) Дата на подаване: 20-Апр-1995 (2) Информация за SEQ ID NO: 1:
(i) Характеристика на последователностите (A) Дължина: 1528 основни двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Брой на разклонения: проста (D) Конфигурация: Линейна (ii) Тип на молекула: ДНК за РНК (ix) Допълнителна характеристика:
(A) Име/Ключ: CDS (B) Местоположение: 11137 (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 1:
GGA AAG СГГ CAT CCC АСА AAC CCT GAA GTG ACC ATG AAT ATA48
Leu Phe Gly Lys Leu His Pro Thr Asn Pro Glu Vai Thr Met Asn He 1 5 10is
142
AGT CAG Ser Gin 5 GTG ACC ATG Met GAA Glu 35 ATC lie 20 GAC Asp ACC TAC TGG GGA TAC CCA GCT GAG GAA TAT GAA GTT Vai GGG Gly 96 144
Thr Tyr Trp Gly Tyr 25 Pro ATC He Ala Glu Glu Tyr Glu 30
GGT Gly TAT ATC CTT GGG GAC Asp AGA ATT CCT Pro TAT Tyr
Vai Thr Tyr lie Leu 40 Gly Arg He 45
10 AGG AAA AAT TCA GAG AAT ATA GGC CGG AGA CCT GTT GCA TTT TTG CAA 192
Arg Lys Asn Ser Glu Asn He Gly Arg Arg Pro Vai Ala Phe Leu Gin
50 55 60
CAC GGT TTG CTC GCA TCA GCC ACA AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC 240
15 His Gly Leu Leu Ala Ser Ala Thr Asn Trp He Ser Asn Leu Pro Asn
65 70 75 80
AAC AGC CTG GCC TTC ATC CTG GCC GAC GCC GGG TAC GAC GTG TGG CTG 288
Asn Ser Leu Ala Phe He Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Vai Trp Leu
20 85 90 95
GGG AAC AGC AGG GGC AAC ACC TGG GCC AGG AGG AAT CTG TAC TAC TCG 336
Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser
100 105 110
25
CCC GAC TCC GTC GAA TTC TGG GCT TTC AGC TTT GAC GAG ATG GCT AAA 384
Pro Asp Ser Vai Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys
115 120 125
30 TAT GAC CTT CCC GCC ACC ATT GAC TTC ATC TTG AAG AAA ACG GGA CAG 432
Tyr Asp Leu Pro Ala Thr He Asp Phe He Leu Lys Lys Thr Gly Gin
130 135 140
GAC 35 Asp 145 AAG Lys CTA CAC Leu His TAC GTT GGC CAT TCC CAG GGC ACC ACC ATT lie GGT Gly TTC Phe 160 480
Tyr Vai 150 Gly His Ser Gin Gly 155 Thr Thr
ATC GCC TTT TCC ACC AAT CCC AAG CTG GCG AAA CGG ATC AAA ACC TTC 528
He Ala Phe Ser Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg He Lys Thr Phe
40 165 170 175
TAT GCA TTA GCT CCC GTT GCC ACC GTG AAG TAC ACC GAA ACC CTG TTA 576
Tyr Ala Leu Ala Pro Vai Ala Thr Vai Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu
180 185 190
45
AAC AAA CTC ATG CTC GTC CCT TCG TTC CTC TTC AAG CTT ATA TTT GGA 624
Asn Lys Leu Met Leu Vai Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu lie Phe Gly
195 200 205
50 AAC AAA ATA TTC TAC CCA CAC CAC TTC TTT GAT CAA TTT CTC GCC ACC 672
Asn Lys He Phe Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gin Phe Leu Ala Thr
210 215 220
GAG GTA TGC TCC CGC GAG ACG GTG GAT CTC CTC TGC AGC AAC GCC CTG 720
55 Glu Vai Cys Ser Arg Glu Thr Vai Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu
225 230 235 240
143
ттт Phe 5 ATC ATT TGT GGA Gly 245 TTT GAC ACT ATG AAC TTG AAC ATG AGT CGC TTG Leu 768
lie lie Cys Phe Asp Thr Met Asn 250 Leu Asn Met Ser Arg 255
GAT GTG TAT CTG TCA CAT AAT CCA GCA GGA ACA TCG GTT CAG AAC GTG 816
Asp Vai Tyr Leu Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Vai Gin Asn Vai
I π 260 265 270
СТС CAC TGG TCC CAG GCT GTT AAG TCT GGG AAG TTC CAA GCT TTT GAC 864
Leu His Trp Ser Gin Ala Vai Lys Ser Gly Lys Phe Gin Ala Phe Asp
275 280 285
15 TGG GGA AGC CCA GTT CAG AAC ATG ATG CAC TAT CAT CAG AGC ATG CCT 912
Trp Gly Ser Pro Vai Gin Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met Pro
290 295 300
ccc TAC TAC AAC CTG ACA GAC ATG CAT GTG CCA ATC GCA GTG TGG AAC 960
20 Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr Asp Met His Vai Pro He Ala Vai Trp Asn
305 310 315 320
GGT GGC AAC GAC TTG CTG GCC GAC CCT CAC GAT GTT GAC CTT TTG CTT 1008
Gly Gly Asn Asp Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Vai Asp Leu Leu Leu
25 325 330 335
TCC AAG CTC CCC AAT CTC ATT TAC CAC AGG AAG ATT CCT CCT TAC AAT 1056
Ser Lys Leu Pro Asn Leu lie Tyr His Arg Lys He Pro Pro Tyr Asn
340 345 350
30
CAC TTG GAC TTT ATC TGG GCC ATG GAT GCC CCT CAA GCG GTT TAC AAT 1104
His Leu Asp Phe He Trp Ala Met Asp Ala Pro Gin Ala Vai Tyr Asn
355 360 365
35 GAA ATT GTT TCC ATG ATG GGA ACA GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT 1157
Glu lie Vai Ser Met Met Gly Thr Asp Asn Lys
370 375
TATTCTTTTA 40 TTGTTCCAAA ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCATGTTTGA 1217
GACACGGTGA TTGTTCCCAT GGTTTTGATT TCAGAAATGT GTTAGCATCA ACAATCTTTC 1277
CATTGGTAAT TTTTGAATTT AAAATGATTT TTAAATTTGG GGCATCTGGG TGGCTCAGTT 1337
45 GGCTAAGTCG TCTGCCTTGG CTTAAGTCAT GATCTCGGGG TCCTAGGATG GAGCCTTGTG 1397
TCTGGGCTCC TGCCGGGGCG GGGGTCTGCT TCTCCTCCTG CTGCTCCCCC CTGCTGCTGT 1457
GTGCACACAC GCTCTCTCTC TCTCAAATAA ATAAATAAAT AAATACTTAA TAAAATAAAA 1517
ΆΆΆΆΑΆΆΆΆΆ. A 152Е (2) Информация за SEQ ID N0: 2:
(i) Характеристики на последователността:
(А) Дължина: 379 аминокиселини
- 144 (В) Тип: аминокиселина (D) Конфигурация: Линейна (ii) Тип на молекула: протеин (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 2:
Leu Phe Gly Lys Leu His Pro Trp Thr Asn Pro Glu Val Thr Met Asn He
1 10 Ser Gin Met He 20 5 Thr Tyr 10 15
Gly Tyr Pro Ala Glu Glu Tyr Glu Val
25 30
Vai Thr Glu Asp Gly Tyr He Leu Gly lie Asp Arg He Pro Tyr Gly
15 35 40 45
Arg Lys Asn Ser Glu Asn He Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gin
50 55 60
20 His Gly Leu Leu Ala Ser Ala Thr Asn Trp He Ser Asn Leu Pro Asn
65 70 75 80
Asn Ser Leu Ala Phe He Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Val Trp Leu
85 90 95
25
Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser
100 105 110
Pro Asp Ser Vai Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys
30 115 120 125
Tyr Asp Leu Pro Ala Thr He Asp Phe He Leu Lys Lys Thr Gly Gin
130 135 140
35 Asp Lys Leu His Tyr Val Gly His Ser Gin Gly Thr Thr He Gly Phe
145 150 155 160
lie Ala Phe Ser Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg He Lys Thr Phe
165 170 175
40
Tyr Ala Leu Ala Pro Val Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu
180 185 190
Asn Lys Leu Met Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu lie Phe Gly
45 195 200 205
Asn Lys lie Phe Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gin Phe Leu Ala Thr
210 215 220
50 Glu Vai Cys Ser Arg Glu Thr Val Asp i Leu Leu i Cys Ser Asn i Ala l Leu
225 230 235 240
Phe lie He Cys Gly Phe : Asp Thr Met Asn Leu Asn i Met . Ser Arg Leu
245 250 255
55
Asp Vai Tyr Leu Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Vai Gin Asn Vai
260 265 270
145
Leu His Trp Ser 275 Gin Ala Vai Lys Ser 280 Gly Lys Phe Gin 285 Ala Phe Asp
5 Trp Gly Ser Pro Vai Gin Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met Pro
290 295 300
Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr Asp Met His Vai Pro He Ala Vai Trp Asn
305 310 315 320
10
Gly Gly Asn Asp Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Vai Asp Leu Leu Leu
325 330 335
Ser Lys Leu Pro Asn Leu lie Tyr His Arg Lys He Pro Pro Tyr Asn
15 340 345 350
His Leu Asp Phe He Trp Ala Met Asp Ala Pro Gin Ala Vai Tyr Asn
355 360 365
20 Glu lie Vai Ser Met Met Gly Thr Asp Asn Lys
370 375 (2) Информация за SEQ ID NO: 3:
(i) Характеристики на последователността:
(A) Дължина: 1048 основни двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Брой разклонения : двойна (D) Конфигурация: Линейна
(Н) Тип на молекула: ДНК (геномна) (ix) Допълнителни характеристики (A) Име/Ключ: CDS (B) Местоположение: 1...975 (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 3:
ATA GGC CGG AGA CCT GTT GCA TTT TTG CAA CAC GGT TTG CTC GCA TCA 48
He Gly 1 Arg Arg Pro 5 Vai Ala Phe Leu Gin 10 His Gly Leu Leu Ala 15 Ser
45 GCC ACA AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC AAC AGC CTG GCC TTC ATC 96
Ala Thr Asn Trp 20 He Ser Asn Leu Pro 25 Asn Asn Ser Leu Ala 30 Phe He
CTG GCC GAC GCC GGG TAC GAC GTG TGG CTG GGG AAC AGC AGG GGC AAC 144
50 Leu Ala Asp 35 Ala Gly Tyr Asp Vai 40 Trp Leu Gly Asn Ser 45 Arg Gly Asn
ACC TGG GCC AGG AGG AAT CTG TAC TAC TCG CCC GAC TCC GTC GAA TTC 192
Thr 55 Trp 50 Ala » Arg Arg Asn Leu 55 Tyr Tyr Ser Pro Asp 60 Ser Vai Glu Phe
146
240
TGG Trp 65 5 ATT lie GCT Ala GAC Asp TTC AGC Phe Ser TTC ATC TTT Phe TTG Leu 85 GAC GAG Asp Glu 70 AAG AAA Lys Lys ATG GCT AAA TAT GAC CTT CCC GCC Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala ACC Thr 80 GTT Val
ACG GGA CAG 75 CAC His TAC Tyr 95
GAC AAG CTA Leu
Phe He Thr Gly Gin 90 Asp Lys
10GGC CAT TCC CAG GGC ACC ACC ATT GGT TTC ATC GCC TTT TCC ACC AAT
Gly His Ser Gin Gly Thr Thr He Gly Phe He Ala Phe Ser Thr Asn
100 105 HO
CCC AAG CTG GCG AAA CGG ATC AAA ACC TTC TAT GCA TTA GCT CCC GTT
15 Pro Lys Leu Ala Lys Arg lie Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala Pro Val
115 120 125
GCC ACC GTG AAG TAC ACC GAA ACC CTG TTA AAC AAA CTC ATG CTC GTC
Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met Leu Val
20 130 135 140
CCT TCG TTC CTC TTC AAG CTT ATA TTT GGA AAC AAA ATA TTC TAC CCA
Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu He Phe Gly Asn Lys lie Phe Tyr Pro
145 150 155 160
25
CAC CAC TTC TTT GAT CAA TTT CTC GCC ACC GAG GTA TGC TCC CGC GAG
His His Phe Phe Asp Gin Phe Leu Ala Thr Glu Val Cys Ser Arg Glu
165 170 175
30 ACG GTG GAT CTC CTC TGC AGC AAC GCC CTG TTT ATC ATT TGT GGA TTT
Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe He He Cys Gly Phe
180 185 190
GAC ACT ATG AAC TTG AAC ATG AGT CGC TTG GAT GTG TAT CTG TCA CAT
35 Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu Asp Val Tyr Leu Ser His
195 200 205
288
336
384
432
480
528
576
624
672
AAT CCA GCA GGA АСА TCG GTT CAG AAC GTG СТС CAC TGG TCC CAG GCT
Asn 40 Pro Ala 210 Gly Thr Ser Val 215 Gin Asn Val Leu His 220 Trp Ser Gin Ala
GTT AAG TCT GGG AAG TTC CAA GCT TTT GAC TGG GGA AGC CCA GTT CAG
Val Lys Ser Gly Lys Phe Gin Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro Val Gin
225 230 235 240
45
AAC ATG ATG CAC TAT CAT CAG AGC ATG CCT CCC TAC TAC AAC CTG ACA
Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr
245 250 255
50 GAC ATG CAT GTG CCA ATC GCA GTG TGG AAC GGT GGC AAC GAC TTG CTG
Asp Met His Val Pro He Ala Val Trp Asn Gly Gly Asn Asp Leu Leu
260 265 270
GCC GAC CCT CAC GAT GTT GAC CTT TTG CTT TCC AAG CTC CCC AAT CTC
55 Ala Asp Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro Asn Leu
275 ) 280 285
720
768
816
864
147
912
АТТ ТАС He Туг 290 CAC His AGG Arg AAG Lys ATT CCT CCT TAC AAT CAC TTG GAC TTT ATC TGG
lie Pro 295 Pro Tyr Asn His Leu Asp 300 Phe lie Trp
5 GCC ATG GAT GCC CCT CAA GCG GTT TAC AAT GAA ATT GTT TCC ATG ATG
Ala Met Asp Ala Pro Gin Ala Val Tyr Asn Glu He Val Ser Met Met
305 310 315 320
GGA АСА GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT TATTCTTTTA TTGTTCCAAA
10 Gly Thr Asp Asn Lys
325
ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCA (2) Информация за SEQ ID NO: 4:
(i) Характеристики на последователността:
(A) Дължина: 325 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (C) Конфигурация: Линейна (ii) Тип на молекула: протеин
He 1 (xi) Gly Arg Описание на Ala последователността : SEQ ID N): 4 Leu Ala Ser 15
Arg Pro Val 5 Phe Leu Gin 10 His Gly Leu
30 Ala Thr Asn Trp 20 He Ser Asn Leu Pro 25 Asn Asn Ser Leu Ala 30 Phe lie
Leu 35 Ala Asp 35 Ala Gly Tyr Asp Val 40 Trp Leu Gly Asn Ser 45 Arg Gly Asn
Thr Trp 50 Ala Arg Arg Asn Leu 55 Tyr Tyr Ser Pro Asp 60 Ser Val Glu Phe
Trp 40 65 Ala Phe Ser Phe Asp 70 Glu Met Ala Lys Tyr 75 Asp Leu Pro Ala Thr 80
He Asp Phe He Leu 85 Lys Lys Thr Gly Gin 90 Asp Lys Leu His Tyr 95 Val
45 Gly His Ser Gin 100 Gly Thr Thr He Gly 105 Phe lie Ala Phe Ser 110 Thr Asn
Pro 50 Lys Leu 115 Ala Lys Arg He Lys 120 Thr Phe Tyr Ala Leu 125 Ala Pro Val
Ala Thr 130 Val Lys Tyr Thr Glu 135 Thr Leu Leu Asn Lys 140 Leu Met Leu Val
Pro 55 145 Ser Phe Leu Phe Lys 150 Leu He Phe Gly Asn 155 Lys lie Phe Tyr Pro 160
960
1015
1048
148
His His Phe Phe Asp 165 Gin Phe Leu Ala Thr 170 Glu Vai Cys Ser Arg 175 Glu
5 Thr Vai Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe He He Cys Gly Phe
180 185 190
Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu Asp Vai Tyr Leu Ser His
195 200 205
10
Asn Pro Ala Gly Thr Ser Vai Gin Asn Vai Leu His Trp Ser Gin Ala
210 215 220
Vai Lys Ser Gly Lys Phe Gin Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro Vai Glh
15 225 230 235 240
Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr
245 250 255
20 Asp Met His Vai Pro He Ala Vai Trp Asn Gly Gly Asn Asp Leu Leu
260 265 270
Ala Asp Pro His Asp Vai Asp Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro Asn Leu
275 280 285
25
lie Tyr His Arg Lys lie Pro Pro Tyr Asn His Leu Asp Phe lie Trp
290 295 300
Ala Met Asp Ala Pro Gin Ala Vai Tyr Asn Glu He Vai Ser Met Met
30 305 310 315 320
Gly Thr Asp Asn Lys
325 (2) Информация за SEQ ID NO: 5:
(i) Характеристики на последователността:
(A) Дължина: 1198 основни двойки (B) Тип: Нуклеинова киселина (C) Брой разклонения: двойна (D) Конфигурация: Линейна (ii) Тип на молекула: ДНК (геномна) (ix) Допълнителни характеристики:
(A) Име/Ключ: CDS (B) Местоположение: 1....1125 (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO:
СТ“1' °ΑΤ ссс АСА ААС ССТ GAA GTG ACC ATG ААТ АТА AGT CAG ATG АТС
Leu His Pro Thr Asn Pro Glu Vai Thr Met Asn He Ser Gin Met lie 15 10 15
149
ACC TAC TGG GGA TAC CCA GCT GAG GAA TAT GAA GTT GTG ACC GAA GAC 96 144
Thr Tyr c Trp Gly Tyr Pro Ala Glu Glu Tyr Glu Val Val Thr Glu 30 Asp TCA Ser
20 25
GGT Gly TAT Tyr ATC CTT GGG lie Leu Gly 35 ATC GAC AGA ATT CCT TAT GGG AGG AAA Lys AAT Asn
He Asp Arg 40 He Pro Tyr Gly Arg 45
10 GAG AAT ATA GGC CGG AGA CCT GTT GCA TTT TTG CAA CAC GGT TTG CTC 192
Glu Asn He Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gin His Gly Leu Leu
50 55 60
GCA TCA GCC ACA AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC AAC AGC CTG GCC 240
Ala Ser Ala Thr Asn Trp He Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala
70 75 80
TTC Phe 20 ATC CTG GCC GAC GCC GGG TAC GAC GTG TGG CTG GGG AAC AGC AGG 288
He Leu Ala Asp 85 Ala Gly Tyr Asp Val 90 Trp Leu Gly Asn Ser Arg 95
GGC AAC ACC TGG GCC AGG AGG AAT CTG TAC TAC TCG CCC GAC TCC GTC 336
Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Asp Ser Val
25 100 105 110
GAA TTC TGG GCT TTC AGC TTT GAC GAG ATG GCT AAA TAT GAC CTT CCC 384
Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro
115 120 125
30 GCC ACC ATT GAC TTC ATC TTG AAG AAA ACG GGA CAG GAC AAG CTA CAC 432
Ala Thr He Asp Phe He Leu Lys Lys Thr Gly Gin Asp Lys Leu His
130 135 140
TAC GTT GGC CAT TCC CAG GGC ACC ACC ATT GGT TTC ATC GCC TTT TCC 480
35 Tyr Val Gly His Ser Gin Gly Thr Thr He Gly Phe He Ala Phe Ser
145 150 155 160
ACC AAT CCC AAG CTG GCG AAA CGG ATC AAA ACC TTC TAT GCA TTA GCT 528
Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg He Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala
40 165 170 175
CCC GTT GCC ACC GTG AAG TAC ACC GAA ACC CTG TTA AAC AAA CTC ATG 576
Pro Val Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met
45 180 185 190
CTC GTC CCT TCG TTC CTC TTC AAG CTT ATA . TTT GGA AAC AAA ATA TTC 624
Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu lie Phe Gly Asn Lys He Phe
195 200 205
50 TAC Tyr CCA Pro 210 CAC CAC TTC TTT GAT CAA Gin TTT CTC GCC ACC Thr 220 GAG GTA TGC Cys TCC Ser
His His Phe Phe Asp 215 Phe Leu Ala Glu Val
CGC GAG ACG GTG GAT CTC CTC TGC AGC AAC GCC CTG TTT ATC ATT TGT
55 Arg Glu Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe He He Cys
225 230 235 240
672
72C
150
GGA Gly TTT GAC ACT ATG AAC TTG AAC ATG AGT CGC TTG GAT GTG TAT Tyr 255 CTG Leu 768
Phe Asp Thr Met 245 Asn Leu Asn Met Ser Arg 250 Leu Asp Vai
5 TCA CAT AAT CCA GCA GGA ACA TCG GTT CAG AAC GTG CTC CAC TGG TCC 816
Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Vai Gin Asn Vai Leu His Trp Ser
260 265 270
CAG GCT GTT AAG TCT GGG AAG TTC CAA GCT TTT GAC TGG GGA AGC CCA 864
10 Gin Ala Vai Lys Ser Gly Lys Phe Gin Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro
275 280 285
GTT CAG AAC ATG ATG CAC TAT CAT CAG AGC ATG CCT CCC TAC TAC AAC 912
Vai Gin Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn
15 290 295 300
CTG ACA GAC ATG CAT GTG CCA ATC GCA GTG TGG AAC GGT GGC AAC GAC 960
Leu Thr Asp Met His Vai Pro lie Ala Vai Trp Asn Gly Gly Asn Asp
305 310 315 320
20
TTG CTG GCC GAC CCT CAC GAT GTT GAC CTT TTG CTT TCC AAG CTC CCC 1008
Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Vai Asp Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro
325 330 335
25 AAT CTC ATT TAC CAC AGG AAG ATT CCT CCT TAC AAT CAC TTG GAC TTT 1056
Asn Leu lie Tyr His Arg Lys lie Pro Pro Tyr Asn His Leu Asp Phe
340 345 350
ATC TGG GCC ATG GAT GCC CCT CAA GCG GTT TAC AAT GAA ATT GTT TCC 1104
30 lie Trp Ala Met Asp Ala Pro Gin Ala Vai Tyr Asn Glu lie Vai Ser
355 360 365
ATG ATG GGA ACA GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT TATTCTTTTA 1155
Met Met Gly Thr Asp Asn Lys
370 375
TTGTTCCAAA ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCA (2) Информация за SEQ ID NO: 6:
(i) Характеристики на последователността:
(A) Дължина: 375 аминокиселини (B) Тип: аминокиселина (D) Конфигурация: линейна
1198 (И) Тип на молекула: протеин (xi) Описание на последователността: SEQ ID NO: 6:
Leu 1 His Pro Thr Asn Pro Glu Vai Thr Met Asn lie Ser Gin Met He
5 10 15
Thr Tyr Trp Gly Tyr Pro Ala Glu Glu Tyr Glu Vai Vai Thr Glu Asp
55 20 25 30
151
Gly Tyr lie Leu Gly lie Asp Arg lie Pro Tyr Gly Arg Lys Asn Ser 45
35 40
5 Glu Asn lie Gly Arg Arg Pro Vai Ala Phe Leu Gin His Gly Leu Leu
50 55 60
Ala Ser Ala Thr Asn Trp He Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala
65 70 75 80
10
Phe lie Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Vai Trp Leu Gly Asn Ser Arg
85 90 95
Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Asp Ser Vai
15 100 105 110
Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro
115 120 125
20 Ala Thr He Asp Phe lie Leu Lys Lys Thr Gly Gin Asp Lys Leu His
130 135 140
Tyr Vai Gly His Ser Gin Gly Thr Thr He Gly Phe He Ala Phe Ser
145 150 155 160
25
Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg He Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala
165 170 175
Pro Vai Ala Thr Vai Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met
30 180 185 190
Leu Vai Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu He Phe Gly Asn Lys He Phe
195 200 205
35 Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gin Phe Leu Ala Thr Glu Vai Cys Ser
210 215 220
Arg Glu Thr Vai Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe He He Cys
225 230 235 240
40
Gly Phe Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu . Asp Vai Tyr Leu
245 250 255
Ser His Asn 45
Gin Ala Vai
275
Pro Ala Gly Thr
260
Lys Ser Gly Lys
Ser Vai Gin Asn Vai
265
Phe Gin Ala Phe Asp
280
Leu His Trp Ser
270
Trp Gly Ser Pro
285
Vai
Gin Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met 290 295
Pro Pro Tyr Tyr Asn
300
Leu 305 Thr Asp Met His Vai 310 Pro
55 J 1
Leu Leu Ala Asp Pro His Asp
325
He Ala Vai Trp Asn Gly Gly Asn Asp
315 320
Vai Asp Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro
330 335
152
Asn Leu He Tyr 340 His Arg Lys He Pro 345 Pro Tyr Asn His Leu 350 Asp Phe
5 lie Trp Ala 355 Met Asp Ala Pro Gin 360 Ala Vai Tyr Asn Glu 365 He Vai Ser
Met Met 370 Gly Thr Asp Asn Lys 375

Claims (43)

1. Използване на рекомбинантна нуклеотидна последователност, която съдържа от една страна кДНК кодираща за всяка предуоденална липаза, която кДНК включва последователности притежаващи процент на хомология най-малко 75 %, по-специално 77% до 85%, и чиито аминокиселинни последователности имат процент на хомология най-малко 70 %, по-специално 80% до 90%, и притежават свойството да са киселиноустойчиви и да са активни при pH от около 1 до 5, и по-специално при pH от около 1.5 до около 2, и от друга страна елементи, които позволяват растителна клетка да продуцира предуоденалната липаза, кодирана от тази кДНК, или да продуцира производен полипептид, както е описан тук по-горе, по-специално промотор и терминатор на транскрипцията, разпознати от транскрипционния механизъм на растителните клетки, за трансформация на растителни клетки с цел получаване от тези клетки или от растения получени от тях, на рекомбинантна предуоденална липаза на бозайници в активна ензимна форма или един (или повече) полипептид(и), производен(и) на последната, както е описано по-горе.
2. Използване съгласно претенция 1, на рекомбинантна нуклеотидна последователност, която съдържа от една страна кДНК представена на фигура 1 и кодираща за кучешка стомашна липаза (LGC), представена на фигура 2, или нуклеотидна последователност произлязла от тази кДНК, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на
154 един (или повече) нуклеотид(и), като споменатата производна последователност е способна да кодира за полипептид, чиято аминокиселинна последователност е идентична на тази на LGC, представена на фигура 2, или за полипептид, произлязъл от LGC чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселина(и), като този производен полипептид показва липазна активност, и от друга страна, елементите позволяващи на една растителна клетка да продуцира полипептида кодиран от кДНК или от производната последователност, а именно промотор и терминатор на транскрипцията разпознати от механизма на транскрипция на растителните клетки, за трансформиране на клетките на растения с цел получаване, като се излиза от тези клетки или от растения получени от тях, на рекомбинантна LGC под формата на активен ензим или на един (или повече) полипептид(и) произлязъл (и) от последната какъвто (каквито) е (са) описан(и) тук по-горе.00
3.
Използване съгласно претенция 1 на
155 рекомбинантна нуклеотидна последователност, която съдържа от една страна кДНК представена на фигура 4 и кодираща за човешка стомашна липаза (LGH) представена на фигура 5, или нуклеотидна последователност произлязла от таза кДНК, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на един (или повече) нуклеотид(и), като тази производна последователност е способна да кодира за полипептид, чиято аминокиселинна последователност е идентична на тази на LGH представена на фигура 5, или за полипептид произлязъл от LGH чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселина(и), като този производен полипетид показва липазна активност, и от друга страна, елементите позволяващи на една растителна клетка да продуцира полипептида кодиран от кДНК или от производната последователност, а именно промотор и терминатор на транскрипцията разпознати от механизма на транскрипция на растителните клетки, за трансформация на клетки на растения с цел получаване от тези клетки или от растения получени от последните, на LGH под формата на активен ензим, или на един (или повече) полипептид(и) производен(и) на последната, какъвто(каквито) е(са) описан(и) тук по-горе.
4. Рекомбинантна нуклеотидна последователност, характеризираща се с това, че съдържа от една страна кДНК представена на фигура 1 и кодираща за кучешка стомашна липаза (LGC) представена на фигура 2, или нуклеотидна последователност произлязла от тази кДНК, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на един (или повече) нуклеотид(и), такава като нуклеотидната последователност представена на фигура 3, като
156 производната последователност е способна да кодира за полипептид, чиято аминокиселинна последователност е идентична на тази на LGC представена на фигура 2, или за полипетид произлязъл от LGC чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселина(и), като този производен полипептид показва липазна активност, и от друга страна, елементите позволяващи на една растителна клетка да продуцира полипептида кодиран от кДНК или от производната последователност, а именно промотор и терминатор на транскрипцията разпознати от механизма на транскрипция на растителните клетки.
5. Рекомбинантна нуклеотидна последователност, характеризираща се с това, че съдържа от една страна кДНК представена на фигура 4 и кодираща за човешка стомашна липаза (LGH) представена на фигура 5, или нуклеотидна последователност произлязла от тази кДНК, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на един (или повече) нуклеотид(и), като производната последователност е способна да кодира за полипетид чиято аминокиселинна последователност е идентична на тази на LGH представена на фигура 5, или за полипептид произлязъл от LGH чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселина(и), като този производен полипептид показва липазна активност, и от друга страна, елементите позволяващи на една растителна клетка да продуцира полипептида кодиран от тази кДНК или от производната последователност, а именно промотор и терминатор на транскрипцията, разпознати от механизма на транскрипция на
157 растителните клетки.
6. Рекомбинантна нуклеотидна последователност съгласно претенция 4 или претенция 5, характеризираща се с това, че съдържа:
- по посока на кДНК или на нейната производна последователност терминатор polyA 35 S от вируса на мозайката по карфиола (CaMV), или терминатор polyA NOS от Agrobacterium tumefaciens,
- срещу посоката на кДНК, или на нейната производна последователност промотор 35S, или определящ промотор двоен 35S (pd35S) от CaMV, или промотор pCRU от круцифериновия ген на репичките, или промотор pGEA1 или pGEA6 от Arabidopsis thaliana, или химеричен промотор pSP от Agrobacterium tumefaciens, или промотор pAR-IAR от ориз, или промотор рузеин от царевица.
7. Рекомбинантна нуклеотидна последователност съгласно някоя от претенциите 4 до 6, характеризираща се с това, че съдържа последователност кодираща за пептид отговорен за насочването на рекомбинантната LGC и/или на производния(ите) пептид(и), в един компартимент определен от растителната клетка.
8. Рекомбинантни нуклеотидни последователности съгласно някоя от претенциите 4, 6 и 7, характеризиращи се с това, че са избрани между следните:
- тази (означена pd35S-PS-LGC) съдържаща в посоката 5' -» 3' промотор pd35S от CaMV, последователност кодираща за сигналния пептид на спорамин А, като тази последната е непосредствено следвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 3, след това от
158 терминатор poiyA 35S от CaMV,
- тази (означена pd35S-PPS-LGC) съдържаща в посоката 5' -> 3' промотор pd35S от CaMV, последователност кодираща за препропептида на спорамин А, като тази последната е непосредствено следвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 3, след това терминатор polyA 35 S от CaMV,
- тази (означена pd35S-PSLGL-LGC) съдържаща в посоката 5' -> 3' промотор pd35S от CaMV, последователност кодираща за част от сигналния пептид на LGL (а именно за последователност съставена от 19 първи аминокиселини, посочени в примерите, 9-те нуклеотиди кодиращи за 3-те последни С-крайни аминокиселини, които са премахнати), като последната е непосредствено следвана от кДНК представена на фигура 1, след това от терминатор polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pCRU-PS-LGC) съдържаща в посоката 5' -> 3' промотор pCRU от круциферина, последователност кодираща за сигналния пептид на спорамин А, като таза последната е непосредствено следвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 3, след това от терминатор polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pCRU-PPS-LGC) съдържаща в посоката 5' -> 3' промотор pCRU на круциферина, последователност кодираща за препропептида на спорамин А, като тази последната е непосредствено следвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 3, след това от терминатор polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pCRU-PSLGL-LGC) съдържаща в
159 посоката 5' -> 3' промотор pCRU на круциферина, последователност кодираща за част от сигналния пептид на LGL (както е описан тук по-преди), като тази последната е непосредствено следвана от кДНК представена на фигура 1 или на фигура 3, след това от терминатор polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pGEA1-PSLGL-LGC) съдържаща в посоката 5'->3' промотор pGEA1 от Arabidopsis thaliana, последователност кодираща за част от сигналния пептид на LGL (както е описана тук по-горе), като тази последната е непосредствено следвана от кДНК представена на фигура 1, или на фигура 3, след това от терминатор polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pGEA6-PSLGL-LGC) съдържаща в посоката 5'-> 3' промотор pGEA6 от Arabidopsis thaliana, последователност кодираща за част от сигналния пептид на LGL (както е описана тук по-горе), като последната е непосредствено следвана от кДНК показана на фигура 1, или на фигура 3, след това от терминатор polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pAR-IAR -PSLGL-LGC) съдържаща в посоката 5' -> 3' промотор pAR-IAR от ориза, последователност кодираща за част от сигналния пептид на LGL (както е описана тук по-горе), като тази последната е непосредствено следвана от кДНК представена на фигура 1 или на фигура 3, след това от терминатор polyA 35S от CaMV, или терминатор polyA NOS от Agrobacterium tumefaciens,
- тази (означена py3enH-PSLGL-LGC) съдържаща в посоката 5' -> 3' промотор рузеин от царевицата, последователност кодираща за част от сигналния пептид на
LGL (както е описана по-горе), като тази последната е последвана непосредствено от кДНК представена на фигура 1
160 или на фигура 3, след това от терминатор polyA 35S от CaMV,
- тази (означена рузеин-PSLGL-LGC-KDEL) съдържаща в посоката 5' -> 3' промотор рузеин от царевицата, последователност кодираща за част от сигналния пептид на LGL ( както е описана тук по-горе), като тази последната е следвана непосредствено от кДНК представена на фигура 1 или на фигура 3, след това последователността кодираща за тетрапептида KDEL, след това от терминатор polyA 35S от CaMV.
9. Рекомбинантни нуклеотидни последователности съгласно някоя от претенциите 5 до 7, характеризиращи се с това, че са избрани между следните:
- тази (означена pSP-PSLGH-LGH) съдържаща в посоката 5' 3' промоторът pSP от Agrobacterium tumefaciens, последователност кодираща за сигналния пептид на LGH, като тази последната е непосредствено следвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 4, след това от терминатор polyA 35S от CaMV,
-тази (означена pSP-PSLPH-LGH) съдържаща в посоката 5' -> 3' промотор pSP от Agrobacterium tumefaciens, последователност кодираща за сигналния пептид на LPH, като тази последната е непосредствено следвана от нуклеотидната последователност представена на фигура 4, след това от терминатор polyA 35S от CaMV,
- тази (означена pSP-PSLGL-LGH) съдържаща в посоката 5' -> 3' промотор pSP от Agrobacterium tumefaciens, последователност кодираща за част от сигналния пептид на LGL ( акава както е описана в претенция 8), като тази последната е непосредствено следвана от нуклеотидната
161 последователност представена на фигура 4, след това от терминатор polyA 35S от CaMV.
10. Вектор, по-специално плазмиден, съдържащ нуклеотидна последователност съгласно някоя от претенциите
4.6, 7 и 8, в сайт несъществен за нейната репликация.
11. Вектор, по-специално плазмиден, съдържащ нуклеотидна последователност съгласно някоя от претенциите
5.6, 7 и 9, в сайт несъществен за нейната репликация.
12. Клетъчен гостоприемник, по-специално бактерия като Agrobacterium tumefaciens, трансформирана посредством вектор съгласно претенция 10 или претенция 11.
13. Метод за получаване на рекомбинантна LGC под формата на активен ензим, или на един (или повече) полипептид(и) произлязъл(и) от последната, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселини, като този(или тези) призводен(и) полипептид(и) показва(т) липазна активност, характеризиращ с това, че състои в:
- трансформация на растителни клетки, а именно с помощта на клетъчен гостоприемник съгласно претенция 12, самият той трансформиран посредством вектор съгласно претенция 10, по такъв начин, че да се интегрира в генома на тези клетки рекомбинантна последователност съгласно някоя от претенциите 4,6,7 и 8,
- при желание получаване на трансформирани растения като се излезе от трансформираните клетки,
- събиране на рекомбинантната LGC и/или на производния(те) полипептид(и) продуциран(и) в тези клетки или трансформираните растения, чрез екстракция,
162 последвана, при желание, от пречистване.
14. Метод за получаване на рекомбинантна LGH под формата на активен ензим, или на един (или повече) полипептид(и) произлязъл(и) от последната, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселини, като този(или тези) производен(и) полипептид(и) показват липазна активност, характеризиращ се с това, че се състои в:
- трансформация на растителни клетки, а именно с помощта на клетъчен гостоприемник съгласно претенция 12, самият той трансформиран посредством вектор съгласно претенция 11, по начин, че да се интегрира в генома на тези клетки рекомбинантна последователност съгласно някоя от претенциите 5, 6, 7 и 9,
- при желание, получаване на трансформирани растения като се излезе от трансформираните клетки,
- събиране на рекомбинантната LGH и/или на производния(ите) полипептид продуцирани в трансформираните клетки или растения чрез екстракция, последвана, при желание, от пречистване.
15. Растения или части от растения, а именно листа и/или плодове и/или семена и/или клетки от растения трансформирани генетично, характеризиращи се с това, че съдържат една (или повече) рекомбинантна(и) нуклеотидна(и) последователност(и) съгласно някоя от претенциите 4 до 9, интегрирана(и) по стабилен начин в техния геном и при желание, на рекомбинантна LGC и/или LGH и/или един (или повече) производен(и) полипептид(и), означен(и) още като растения или части от растения, а именно листа и/или
163 плодове и/или семена и/или клетки на растения, с ензимна активност и по-специално с липазна активност, избрани от рапица, тютюн, царевица, грах, домати, моркови, жито, ечемик, картофи, соя,слънчоглед, марула, ориз, люцерна и захарно цвекло или части от тези растения.
16. Рекомбинантна ензимно активна LGC, чиято аминокиселинна последователност е тази представена на фигура 2, или полипептиди получени от последната, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселини, такава като полипептида ограничен от аминокиселините разположени в позициите 55 и 379, наречен още полипептид (Δ54), и/или полипептида ограничен от аминокиселините разположени в позиции 5 и 379 на фигура 2, наречен още полипептид (Δ4), като тези производни полипептиди показват липазна активност, както са получени в по същество чиста форма по метода съгласно претенция 13, като този метод обхваща етап на пречистване на рекомбинантната LGC и/или на производния(ите) полипептид(и), а именно посредством хроматография на получените ензимни екстракти.
17. Рекомбинантна ензимно активна LGH, чиято аминокиселинна последователност е тази представена на фигура 5, или полипетиди получени от последната, а именно чрез прибавяне и/или премахване и/или заместване на една (или повече) аминокиселина(и), каквито са полипептидът ограничен от аминокиселините разположени в положения 74 и 398 на фигура 5, означен още като полипептид (Δ54 LGH), и/или полипептидът ограничен от аминокиселините разположени в положение 24 и 398 на фигура 5, означен още
164 като (A4LGH), като тези производни полипептиди показват липазна активност, както са получени в по същество чиста форма по метода съгласно претенция 14, като този метод обхваща етап на пречистване на рекомбинантната LGC и/или на производния(ите) полипептид(и), а именно чрез хроматография на получените ензимни екстракти.
18. Растителен екстракт с ензимна активност, такъв като получения по метода съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че съдържа рекомбинантната LGC и/или един (или повече) производен(и) полипептид(и) такива като полипептид (Δ54) и/или полипептид (Δ4) дефинирани в претенция 16.
19. Растителен екстракт с ензимна активност, какъвто е получен по метода съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че съдържа рекомбинантната LGH и/или един (или повече) производен(и) полипептид(и) като полипептид (Δ54 LGH) и/или полипептид (A4LGH) дефинирани в претенция 17.
20. Растителен екстракт с ензимна активност съгласно претенциите 18 или 19, характеризиращ се с това, че тегловният процент на рекомбинантните ензимно активни полипептиди представлява от около 0,1% до 20%, поспециално от около 1% до около 15%, спрямо общото тегло на протеините намиращи се в тези екстракти, което отговаря на мерките за ензимна активност от около 0,5 U за g свежо тегло (СТ) на листата до около 1000 U/g СТ на листата, поспециално от около 10 U/g СТ до около 300 U/g СТ на листата или още от около 1 U/g СТ на семената до около 5000 U/g СТ, по-специално от около 10 U/g СТ на семената до около 1000
165
U/gCT на семената.
21. Използване на растения или части от растения, а именно листа и/или плодове и/или семена или растителни клетки, генетично трансформирани съгласно претенция 15, за получаването на лекарствени средства предназначени за улесняване абсорбцията на животински и растителни мазнини, погълнати от здрав индивид или от индивид страдащ от една или повече патологии засягащи или не размера на продуциране на стомашна и/или панкреасна липаза, по-специално при индивиди подложени на медицинско лечение променящо механизма на абсорбция на мазнините или също при възрастни лица, по-специално за получаване на лекарствени средства предназначени за лечение на патологии, свързани с недостиг на липази (а именно на стомашна и/или панкреасна липаза) в организма, и поспециално на патологии като муковисцидоза и екзокринна панкреатична недостатъчност.
22. Използване на рекомбинантна DGL или на полипептиди получени от последната съгласно претенция 16, за получаване на лекарствени средства предназначени за улесняване абсорбцията на животински и растителни мазнини погълнати от здрав индивид или от индивид страдащ от една или повече патологии засягащи или не размера на продуциране на стомашна и/или панкреасна липаза, по-специално при индивиди подложени на медицинско лечение променящо механизма на абсорбция на мазнините или също при възрастни лица, по-специално за получаване на лекарствени средства предназначени за лечение на патологии, свързани с недостиг на липази (а именно на стомашна и/или панкреасна липаза) в организма, и по-специално на патологии като муковисцидоза и екзокринна панкреатична недостатъчност.
166
23. Използване на рекомбинантна HGL или на полипептиди получени от последната съгласно претенция 17, за получаване на лекарствени средства предназначени за улесняване абсорбцията на животински и растителни мазнини погълнати от здрав индивид или от индивид страдащ от една или повече патологии засягащи или не размера на продуциране на стомашна и/или панкреасна липаза, по-специално при индивиди подложени на медицинско лечение променящо механизма на абсорбция на мазнините или също при възрастни лица, по-специално за получаване на лекарствени средства предназначени за лечение на патологии, свързани с недостиг на липази (а именно на стомашна и/или панкреасна липаза) в организма, и по-специално на патологии като муковисцидоза и екзокринна панкреатична недостатъчност.
24. Използване на ензимни екстракти съгласно претенции 18 до 20, за получаване на лекарствени средства предназначени за улесняване абсорбцията на животински и растителни мазнини погълнати от здрав индивид или от индивид страдащ от една или повече патологии засягащи или не размера на продуциране на стомашна и/или панкреасна липаза, поспециално при индивиди подложени на медицинско лечение променящо механизма на абсорбция на мазнините или също при възрастни лица, поспециално за получаване на лекарствени средства предназначени за лечение на патологии, свързани с недостиг на липази (а именно на стомашна и/или панкреасна липаза) в организма, и по-специално на патологии като муковисцидоза и екзокринна панкреатична недостатъчност.
25. Фармацевтичен състав, характезириащ се с това, че съдържа рекомбинантна LGC и/или LGH и/или един (или повече) полипептид(и)
167 производни на последните съгласно претенция 16 или претенция 17, и/или един (или повече) ензимни екстракти съгласно някоя от претенциите 18 до 20, при желание заедно с фармацевтично приемлив носител.
26. Използване на растения или части от растения, а именно листа и/или плодове и/или семена и/или клетки от растения, трансформирани генетично съгласно претенция 15, за получаване на храни, а именно на функционални храни, по-специално предназначени да улесняват абсорбцията на животински или растителни мазнини погълнати от здрав индивид или от засегнат от една или повече патологии засягащи или не размера на продуциране на стомашна и/или панкреасна липаза.
27. Използване на рекомбинантна DGL или на полипептиди получени от последната съгласно претенция 16, за получаване на храни, поспециално на функционални храни, по-специално предназначени за улесняване абсорбцията на животински и растителни мазнини погълнати от здрав индивид или от индивид страдащ от една или повече патологии засягащи или не размера на продуциране на стомашна и/или панкреасна липаза.
28. Използване на рекомбинантна HGL или на полипептиди получени от последната съгласно претенция 17, за получаване на храни, поспециално на функционални храни, по-конкретно предназначени за улесняване абсорбцията на животински и растителни мазнини погълнати от здрав индивид или от индивид страдащ от една или повече патологии засягащи или не размера на продуциране на стомашна и/или панкреасна липаза.
168
29. Използване на ензимни екстракти съгласно всяка от претенции 18 до 20, за получаване на храни, по-специално на функционални храни, поконкретно предназначени за улесняване абсорбцията на животински и растителни мазнини погълнати от здрав индивид или от индивид страдащ от една или повече патологии засягащи или не размера на продуциране на стомашна и/или панкреасна липаза.
30. Функционални храни, характеризиращи се с това, че съдържат едно (или повече) растение(я) и/или части от това (тези) растение(я), съгласно претенция 15, и/или рекомбинантна LGC и/или LGH и/или един (или повече) полипептид(и) получени от последните съгласно претенция 16 или претенция 17 и/или един (или повече) ензимен(и) екстракт(и) съгласно някоя от претенциите 18 до 20.
31. Използване на растения или части от растения, а именно листа и/или плодове и/или семена и/или клетки от растения, трансформирани генетично съгласно претенция 15, за провеждане на ензимни реакции в областта на промишлеността, агрохранителната или агроиндустриалната, поспециално в маслопреработвателната промишленост, липидната химия и в -млечната промишленост.
32. Използване на рекомбинантна DGL или на полипептиди получени от последната съгласно претенция 16, за провеждане на ензимни реакции в областта на промишлеността, агрохранителната или агроиндустриалната, по-специално в маслопреработвателната промишленост, липидната химия и в млечната промишленост.
169
33. Използване на рекомбинантна HGL или на полипептиди получени от последната съгласно претенция 17, за провеждане на ензимни реакции в областта на промишлеността, агрохранителната или агроиндустриалната, по-специално в маслопреработвателната промишленост, липидната химия и в млечната промишленост.
34. Използване на ензимни екстракти съгласно всяка от претенции 18 до 20, за провеждане на ензимни реакции в областта на промишлеността, агрохранителната или агроиндустриалната, по-специално в маслопреработвателната промишленост, липидната химия и в млечната промишленост.
35. Метод, по-специално за ензимна биоконверсия или за биокатализа, чрез провеждане на една или повече ензимни реакции в областта на агрохранителната или агроиндустриалната, по-специално в маслопреработвателната промишленост, липидната химия и млечната промишленост, характерициращ се с това, че тези ензимни реакции се извършват посредством растения или части от растения, а именно листа и/или плодове и/или семена и/или клетки от растения, трансформирани генетично, съгласно претенция 15. -
36. Метод, по-специално за ензимна биоконверсия или за биокатализа, чрез изпълнение на една или повече ензимни реакции в областта на агрохранителната или агроиндустриалната, по-специално в маслопреработвателната промишленост, липидната химия и млечната промишленост, характерициращ се с това, че тези ензимни реакции се извършват посредством рекомбинантна DGL или на полипептиди получени
170 от последната съгласно претенция 16.
37. Метод, по-специално за ензимна биоконверсия или за биокатализа, чрез изпълнение на една или повече ензимни реакции в областта на агрохранителната или агроиндустриалната, по-специално в маслопреработвателната промишленост, липидната химия и млечната промишленост, характерициращ се с това, че тези ензимни реакции се извършват посредством рекомбинантна HGL или на полипептиди получени от последната съгласно претенция 17.
38. Метод, по-специално за ензимна биоконверсия или за биокатализа, чрез изпълнение на една или повече ензимни реакции в областта на агрохранителната или агроиндустриалната, по-специално в маслопреработвателната промишленост, липидната химия и млечната промишленост, характерициращ се с това, че тези ензимни реакции се извършват посредством ензимни екстракти съгласно всяка от претенции 18 до 20.
39. Ензимни препарати с промишлено, агрохранително или агроиндустриално предназначение, които могат да бъдат използвани в обхвата на метода съгласно претенция 35 и които съдържат един (или повече) растителен(и) екстракт(и) с ензимна активност съгласно някоя от претенциите 18 до 20, и/или рекомбинантна LGC и/или LGH и/или един (или повече) полипептид(и) получени от последните съгласно претенция 16 или претенция 17.
40. Използване на растения или части от растения, а именно листа и
171 /или плодове и/или семена и/или клетки от растения, трансформирани генетично съгласно претенция 15, за осъществуване в индустриален мащаб на реакции на ензимна биоконверсия или биокатализа като хидролизи или ензимно трансестерифициране.
41. Метод за биокатализа, характеризиращ се с това, че се използват растения или части от растения, а именно листа и/или плодове и/или семена и/или клетки от растения, трансформирани генетично съгласно претенция 15, като тези растения, или фрагменти, или клетки, или семена се използват едновременно в качеството им на ензимен източник и субстрат на реакцията.
42. Използване на растения, или на части от растения, а именно листа и/или плодове и/или семена и/или клетки от растения, трансформирани генетично, съгласно претенция 15, за получаване на биовъглеводороди.
43. Метод за получаване на биовъглеводород, характеризиращ се с това, че се прибавя алкохол, а именно метанол или етанол, към смляна маса от цели или части от растения, трансформирани генетично, съгласно претенция 15, за събиране на биовъглеводорода, по-специално чрез филтриране.
BG101959A 1995-04-20 1997-10-10 Рекомбинантни предуоденални липази и полипептидни производни, продуцирани от растения, метод за получаването и използването им BG64320B1 (bg)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9504754A FR2733249B1 (fr) 1995-04-20 1995-04-20 Lipase gastrique de chien recombinante et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations
PCT/FR1996/000606 WO1996033277A2 (fr) 1995-04-20 1996-04-19 Lipases preduodenales recombinantes et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG101959A BG101959A (bg) 1998-07-31
BG64320B1 true BG64320B1 (bg) 2004-09-30

Family

ID=9478306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG101959A BG64320B1 (bg) 1995-04-20 1997-10-10 Рекомбинантни предуоденални липази и полипептидни производни, продуцирани от растения, метод за получаването и използването им

Country Status (26)

Country Link
US (2) US6573431B1 (bg)
EP (1) EP0822988B1 (bg)
JP (2) JP4077875B2 (bg)
KR (1) KR19990007901A (bg)
CN (1) CN1185178A (bg)
AR (1) AR004482A1 (bg)
AT (1) ATE313632T1 (bg)
AU (1) AU718905B2 (bg)
BG (1) BG64320B1 (bg)
BR (1) BR9608011A (bg)
CA (1) CA2218418A1 (bg)
CZ (1) CZ330997A3 (bg)
DE (1) DE69635611T2 (bg)
ES (1) ES2256858T3 (bg)
FR (1) FR2733249B1 (bg)
HU (1) HUP9801438A3 (bg)
IL (1) IL117955A0 (bg)
MX (1) MX9707973A (bg)
NZ (1) NZ307579A (bg)
PL (1) PL186586B1 (bg)
RU (1) RU2235129C2 (bg)
SK (1) SK140197A3 (bg)
TR (1) TR199701207T1 (bg)
UA (1) UA73267C2 (bg)
WO (1) WO1996033277A2 (bg)
ZA (1) ZA963146B (bg)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2759857B1 (fr) * 1997-02-27 1999-04-30 Biocem Nouvelles utilisations de la sterilite male chez les plantes
FR2774379B1 (fr) * 1998-01-30 2002-03-29 Groupe Limagrain Holding Procede de production, par des cellules vegetales, d'alpha 1-antitrypsine et de ses variantes, et produits contenant l'alpha-antitrypsine ainsi obtenue
FR2777155B1 (fr) 1998-04-09 2000-06-23 Meristem Therapeutics Semences et plantes dont le pouvoir germinatif est detruit par l'absence totale ou partielle d'au moins une reserve energetique indispensable a la germination
FR2810667B1 (fr) * 2000-06-23 2004-09-03 Warner Lambert Co Procede d'isolement et de purification d'une proteine, et proteine obtenue
US7288124B2 (en) 2004-09-08 2007-10-30 L'oreal S.A. Heteroaromatic binuclear black direct dyes
KR20080038131A (ko) 2005-07-18 2008-05-02 프로탈릭스 리미티드 생물학적으로 활성인 거대분자의 점막 또는 장관 투여
FR3036119B1 (fr) * 2015-05-15 2019-04-19 Universite De Picardie Jules Verne Procede de production de proteines d'interet a partir d'une structure vegetale
CN112480233B (zh) * 2020-12-14 2022-05-27 上海交通大学 一种生物活性肽iahpklgkrir及其制备方法和应用
CN115669542B (zh) * 2022-11-04 2023-08-25 西北农林科技大学 一种植物组织培养脱毒方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3150988A1 (de) * 1980-12-30 1982-08-05 Institut Français du Pétrole, 92502 Rueil-Malmaison, Hauts-de-Seine Brennbare kompositionen, die alkohole und fettsaeureester enthalten und insbesondere als dieseltreibstoffe brauchbar sind
US5538868A (en) * 1984-02-08 1996-07-23 Cetus Oncology Corporation Recombinant ricin toxin fragments
GB8421210D0 (en) * 1984-08-21 1984-09-26 Celltech Ltd Polypeptide and polypeptide composition
GB2188057B (en) * 1986-02-04 1990-03-07 Inst Penyelidikan Minyak Kelap Transesterification of fats and oils
FR2603804B1 (fr) * 1986-09-17 1989-10-27 Jouveinal Sa Lipases et extraits lipasiques, leur procede de preparation et leur application en therapeutique
WO1991006661A1 (en) * 1989-11-03 1991-05-16 Opta Food Ingredients, Inc. Lipase-catalyzed in situ generation of mono- and di-glycerides
NZ237549A (en) * 1990-03-23 1993-06-25 Gist Brocades Nv Production of enhanced levels of enzymes in the seeds of transgenic plants and the use of these seeds
DK162790D0 (da) * 1990-07-06 1990-07-06 Novo Nordisk As Plantecelle
DK0596979T3 (da) * 1991-08-01 2002-05-13 Large Scale Biology Corp Rekombinante nucleinsyrer fra plantevirus
FR2683549B1 (fr) * 1991-11-13 1994-11-18 Jouveinal Inst Rech Acides nucleiques codant pour la lipase gastrique de lapin et derives polypeptidiques, leur utilisation pour la production de ces polypeptides, et compositions pharmaceutiques a base de ces derniers.
FR2699179B1 (fr) * 1992-12-16 1995-01-06 Jouveinal Inst Rech Acides nucléiques codant pour la lipase gastrique de chien et dérivés polypeptidiques, leur utilisation pour la production de ces polypeptides, et compositions pharmaceutiques à base de ces derniers.
IS4130A (is) * 1993-03-01 1994-09-02 Ab Astra Ný fjölpeptíð
FR2722798B1 (fr) * 1994-07-25 1996-09-13 Toulouse Inst Nat Polytech 1procede de production d'acides gras2plantes oleagineuses

Also Published As

Publication number Publication date
WO1996033277A3 (fr) 1996-11-28
BR9608011A (pt) 1999-01-05
WO1996033277A2 (fr) 1996-10-24
NZ307579A (en) 1999-11-29
CN1185178A (zh) 1998-06-17
CZ330997A3 (cs) 1998-03-18
ZA963146B (en) 1997-01-22
BG101959A (bg) 1998-07-31
TR199701207T1 (xx) 1998-02-21
KR19990007901A (ko) 1999-01-25
US20040072317A1 (en) 2004-04-15
ES2256858T3 (es) 2006-07-16
US6573431B1 (en) 2003-06-03
HUP9801438A2 (hu) 1998-10-28
AU718905B2 (en) 2000-04-20
JPH11504207A (ja) 1999-04-20
PL322874A1 (en) 1998-03-02
AU5696796A (en) 1996-11-07
PL186586B1 (pl) 2004-01-30
JP2007325590A (ja) 2007-12-20
FR2733249A1 (fr) 1996-10-25
FR2733249B1 (fr) 1997-06-06
CA2218418A1 (fr) 1996-10-24
SK140197A3 (en) 1998-07-08
AR004482A1 (es) 1998-12-16
MX9707973A (es) 1998-08-30
ATE313632T1 (de) 2006-01-15
IL117955A0 (en) 1996-08-04
EP0822988A2 (fr) 1998-02-11
DE69635611T2 (de) 2006-09-14
UA73267C2 (en) 2005-07-15
JP4077875B2 (ja) 2008-04-23
RU2235129C2 (ru) 2004-08-27
HUP9801438A3 (en) 2000-11-28
EP0822988B1 (fr) 2005-12-21
DE69635611D1 (de) 2006-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0557469B1 (en) Plant medium-chain thioesterases
US5639790A (en) Plant medium-chain thioesterases
US5455167A (en) Medium-chain thioesterases in plants
US5807893A (en) Plant thioesterases and use for modification of fatty acid composition in plant seed oils
US8334254B2 (en) Recombinant lactoferrins, methods of production from plants and uses thereof
JP6096114B2 (ja) 植物種子の飽和脂肪酸含量の低減
KR20150037771A (ko) 식물 세포에서 장쇄 다중불포화 지방산의 생성
CA2081122A1 (en) Plant thioesterases
JP2007325590A (ja) 植物によって生産される組換え前十二指腸リパーゼおよびペプチド誘導体、それらの取得方法およびそれらの用途
FR2754827A1 (fr) Lipases pancreatiques et/ou colipases recombinantes et polypeptides dervies produits par les plantes, leurs procedes d&#39;obtention et leurs utilisations
AU2015201328B2 (en) Lowering saturated fatty acid content of plant seeds
US20170145433A1 (en) Lowering saturated fatty acid content of plant seeds