SK140197A3 - Recombinant preduodenal lipases and polypeptide derivatives produced by plants, processes for obtaining them and their uses - Google Patents

Description

Rekombinantné preduodenálne lipázy a polypeptidové deriváty produkované rastlinami, spôsob ich získavania a použitia

Oblast techniky

Vynález sa týka rekombinantných preduodenáIných lipáz, najmä rekombinantných gastrických lipáz a ďalej polypeptidových derivátov týchto zlúčenín, vykazujúcich účinok lipázy, rovnako ako ich použitia, osobitne ako funkčná potrava alebo vo farmaceutických kompozíciách alebo v enzymatických formuláciách s agro-alimentárnymi alebo priemyslovými aplikáciami.

Doterajší stav techniky

Psia gastrická lipáza (LGC - lipase gastrique de chien) je glykoproteín 379 aminokyselín (AA) s molekulovou hmotnosťou zhruba 50 kilodaltonov (kDa), syntetizovaný vo forme prekurzoru, obsahujúceho na aminoterminálnom konci (NH₂-terminál) signálny peptid a vylučovaný mediánnymi bunkami sliznice žalúdku psa (Carriére F. a kol.,1991).

Ľudská gastrická lipáza (LGH - lipase gastrique humaine) je prirodzene syntetizovaná vo forme prekurzoru a je opísaná v publikácii Bodmer M.W. a kol. , 1987. Maturovaný proteín ludskej gastrickej lipázy je tvorený 379 aminokyselinami. Jeho signálny peptid sa skladá z 19 aminokyselín.

Tieto proteíny náležia do skupiny lipáz, nazývaných preduodenálne, jej niektoré členy už boli purifikované a niekedy dokonca klonované (Docherty A.J.P. a kol., 1985; Bodmer M.W. a kol., 1987; Moreau H. a kol., 1988; Európske patenty č. 0 191 061 a č. 0 261 016).

Po dlhý čas sa pokladalo za dokázané, že hydrolýza alimentárnych lipidov sa odohráva na úrovni tenkého čreva vďaka pôsobeniu enzýmov, produkovaných slinivkou brušnou (Bernard C., 1849).

Pozorovania však napriek tomu dovolujú predpokladať, že hydrolýza triglyceridov môže prebiehať v žalúdku pôsobením preduodenáIných enzýmov (Volhard, F. 1901; Shonheyder,

F. a Volquarts, K., 1945). Tieto enzýmy, a osobitne psí gastrická lipáza, majú enzymatické a fyzikálne-chemické vlastnosti, ktoré ich odlišujú od pankreatických lipáz cicavcov. Tieto rozdiely medzi pankreatickými a gastrickými lipázami spočívajú v zásade v nasledujúcich bodoch: molekulová hmotnosť, zloženie z aminokyselín, odolnosť proti pepsínu, špecificita substrátu, optimálne pH pôsobenie a stabilita v kyslom prostredí.

Naviac, in vitro a za istých podmienok, je možné preukázať synergiu pôsobenia medzi účinkami gastrických a pankreatických lipáz na hydrolýzu triglyceridov s dlhými reťazcami (Gargouri, Y. a kol., 1989).

Je známe viacej patologických situácií (mucoviscidóza, exokrinná pankreatická nedostatočnosť), kedy pacienti úplne alebo čiastočne postrádajú exokrinnú pankreatickú sekréciu a teda aj enzýmy, potrebné pre hydrolýzu potravy (amylázy, lipázy a proteázy). Absencia absorpcie tukov na intestinálnej úrovni, najmä absorpcia triglyceridov s dlhými reťazcami, sa prejavuje tým že sa u pacientov velmi významne zvýši steatorrhea a velmi citelne sa spomalí pribývanie na váhe u mladých pacientov. Na korekciu týchto porúch sú pacientom podávané pri jedle pankreatické extrakty ošípaných. Terapeutická účinnosť týchto extraktov môže byť velmi zvýšená súčasným podávaním gastrickej lipázy psa vďaka jej špecifickému účinku na triglyceridy s dlhými reťazcami.

V článku Carriére a kol. (1991) je opísaná purifikácia a určenie terminálnej sekvencie psej gastrickej lipázy. Spôsob, dovolujúci extrakciu tohto enzýmu z psieho žalúdku je v tejto publikácii tiež opísaný. Tento spôsob v zásade spočíva v tom, že sa psí žalúdok podrobí macerácii v kyslom prostredí (pH 2,5) v prítomnosti vo vode rozpustných solí, ulahčujúcich vylučovanie lipázy v tomto prostredí. Etapy filtrácie na molekulárnom site a chromatografia iónovou výmenou dovolujú purifikovať homogénnu psiu gastrickú lipázu. Purifikovaná psia gastrická lipáza, získaná týmto procesom, je glykoproteín s molekulovou hmotnosťou 49000 daltonov, z ktorých 6000 zodpovedá cukrom a 43000 proteínovej časti.

Zrejmé problémy pri získavaní psích žalúdkov zabraňujú akémukolvek rozvoju tohto spôsobu ako na úrovni laboratórnej , tak na úrovni priemyslovej. Odtial vyplýva nutnosť nájsť spôsob, ktorý by dovoloval produkciu psej gastrickej lipázy vo velkých množstvách a to bez použitia psích žalúdkov.

Nukleotidová a peptidová sekvencia psej gastrickej lipázy bola určená s cielom priemyslovej produkcie psej gastrickej lipázy pri použití metód génového inžinierstva. Tieto práce tvoria predmet medzinárodnej prihlášky vynálezu WO 94/13816, podanej 16. decembra 1993.

Spôsob produkcie rekombinantnej psej gastrickej lipázy, opísaný v tejto medzinárodnej prihláške nárokuje využitie Escherichia coli (E. coli) ako transformovanej hostitelskej bunky, ktorá môže produkovať psiu gastrickú lipázu.

Isté problémy, na ktoré sa narazilo pri výrobe rekom binantnej psej gastrickej lipázy pomocou E. coli, najmä nutnosť kultivovať značné množstvá E. coli vo fermentoroch, ktorá prináša zvýšené náklady, viedla vynálezcov k hľadaniu iných spôsobov produkcie tejto psej gastrickej lipázy.

Bunky cicavcov sú a priori lepšie adaptované na expresiu génov cicavcov. Ich použitie napriek tomu prináša problémy pri maturácii proteínov. Enzymatické súbory, ktoré realizujú post-translačnú maturáciu, sú rôzne a líšia sa v závislosti od tkaniva, orgánu a druhu. Napríklad bolo opísané, že post-translačná maturácia plazmatického proteinu môže byt rôzna, keď je proteín získaný z ľudskej krvi alebo keď je produkovaný rekombinantnými bunkami, ako sú napríklad ovariálne bunky čínskeho chrčka alebo v mlieku transgenického zvieratá. Krome toho nízka úroveň expresie, dosiahnutá v prípade použitia buniek cicavcov, implikuje používanie kultúr in vitro s veľmi veľkými objemami a teda s vysokými nákladmi. Výroba rekombinantných proteínov v mlieku transgenických zvierat (myš, ovca a krava) dovoľuje znížit prevádzkové náklady a prekonat problémy s úrovňou expresie. Napriek tomu zostávajú etické problémy a problémy s vírusovou a subvírusovou (priony) kontamináciou.

Z týchto dôvodov génový prenos génov cicavcov do rastlinnej bunky môže priniest spôsob výroby nových rekombinantných proteínov vo veľkých objemoch pri znížených prevádzkových nákladoch a bez rizika vírusovej a subvírusovej kontaminácie .

V roku 1983 rad laboratórií objavil, že je možné preniest heterologické gény do genómu rastlinnej bunky (Bevan a kol., 1983; Herrera-Estrella a kol., 1983 a a b) a regenerovať transgenické rastliny z geneticky modifikovaných buniek. Všetky rastlinné bunky vykazovali preto modifikovaný genetický charakter, ktorý je prenášaný na potomstvo pri pohlavnom oplodňovaní.

Vďaka týmto pracím sa rad skupín začal zaujímať o produkciu rekombinantných proteínov cicavcov v rastlinných bunkách alebo v transgenických rastlinách (Barta a kol., 1986; Marx, 1982). Jeden z prvých skutočne významných výsledkov v tejto oblasti bola výroba protilátok v transgenických rastlinách tabaku (Hiatt a kol., 1989).

Pre expresiu heterologického proteinu v semene, miestu uchovávania proteínov u rastlín, vložila skupina, ktorú viedol Vandekerckhove (1989), sekvenciu kódujúcu leu-enkefalín do génu, kódujúceho albumín 2S u Arabidopsis thaliana. Pomocou tohto konštruktu boli vytvorené rastliny transgenickej repky, ktoré exprimovali leu-enkefalín špecificky v semenoch pri úrovni expresie riadovo 0,1 % celkových proteínov. V roku 1990 Sijmons a spolupracovníci preniesli gén ludského sérového albumínu do buniek tabaku a zemiakov. Bez ohladu na pôvod signálnych peptidov (ľudské alebo rastlinné) bol dosiahnutý pomer ľudského sérového albumínu riadovo 0,02 % celkových proteínov, získaných v listoch, stonkách a hľuzách zemiakov.

Pomocou rastlín boli produkované aj ďalšie rekombinantné proteíny cicavcov; napríklad povrchový antigén hepatitídy B (Mason a kol., 1992); interferóny (De Zoeten a kol., 1989; Edelbaum a kol., 1992; Truve a kol., 1993); myšie protilátky anti-Streptococcus mutans, agens zubného kazu (Hiatt a Ma, 1992; Ma a kol., 1994), fragmenty protilátok scFV pôsobiacich proti rakovinovým bunkám (Russel D., 1994), protilátky anti-Herpes (Russel D., 1994), hirudín (Moloney a kol., 1994), cholerový toxín (Hein R., 1994) a rastový faktor ludského epidermu (E.G.F.) Higo a kol.,

1993).

Súbor týchto výskumov dovolil dokázať, že je možná výroba rekombinantných proteínov cicavcov v rastlinných bunkách a že mechanizmy tejto syntézy proteínov, vychádzajúce zo sekvencii DNA, sú podobné v bunkách živočíšnych a v bunkách rastlinných. Existujú však niektoré rozdiely medzi rastlinnými a živočíšnymi bunkami, najmä na úrovni maturácie polymannožidových glykánov na komplexné glykány alebo na úrovni miest štiepenia signálnych peptidov, čo nedovoľuje zaručiť získanie aktívnych alebo dostatočne aktívnych proteínov cicavcov transformáciou rastlinných buniek.

Podstata vynálezu

Vynález sa týka rekombinantnéj preduodenálnej lipázy a polypeptidových derivátov produkovaných rastlinami, spôsobu ich získavania a použitia.

Vynálezcovia preukázali, že použitie rastlinných buniek, transformovaných prostredníctvom vhodnej rekombinantnej nukleotidovej sekvencie dovoľuje získať rekombinantnú psiu gastrickú lipázu alebo rekombinantnú ľudskú gastrickú lipázu alebo odvodené polypeptidy týchto dvoch látok, vykazujúcu dostatočný enzymaticky účinok na to, aby boli vytvárané priemyslovým spôsobom.

Cieľom predkladaného vynálezu je podať nový spôsob výroby preduodenáIných rekombinantných lipáz cicavcov, najmä rekombinantnéj psej gastrickej lipázy a rekombinantnéj ľudskej gastrickej lipázy, s využitím rastlín, prípadne výroby polypeptidových derivátov uvedených lipáz, ktoré vykazujú enzymatický účinok, osobitne účinok lipázy, taký, že uvedené rekombinantné lipázy alebo ich polypeptidové deriváty môžu byť využívané priemyslovým spôsobom.

Ί

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je podať nástroje na uskutočnenie uvedeného spôsobu, najmä nové nukleotidové rekombinantné sekvencie, geneticky transformované rastlinné bunky, geneticky transformované rastliny alebo časti rastlín (najmä listy, stonky, plody, semená alebo zrná, korene) a geneticky transformované fragmenty uvedených rastlín a častí rastlín.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je podanie nových preduodenáIných rekombinantných lipáz cicavcov alebo ich polypeptidových derivátov, ktoré sú enzymaticky aktívne a také, že boli získané z geneticky transformovaných rastlinných buniek alebo rastlín.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnút nové enzymatické kompozície, ktoré môžu byť používané pri vykonávaní enzymatických reakcií, najmä reakcií uskutočňovaných v priemyslovom meradle.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je poskytnút nové farmaceutické kompozície, najmä kompozície použiteľné pri liečbe patológií, spojených s nedostatočnou produkciou lipáz organizmom pacienta, ako je napríklad mucoviscidóza.

Ďalším cieľom predkladaného vynálezu je podať nové palivá, označované tiež ako biopalivá, ktoré sú výhodné tým, že vytvárajú menej znečistenia ako palivá z ropy a majú nižšie výrobné náklady.

Vynález je ďalej bližšie vysvetlený prostredníctvom obrázkov, kde obr. 1 predstavuje nukleotidovú sekvenciu cDNA, ktorej nukleotidy, nachádzajúce sa v polohách 1 až 1137, kó8 dujú psiu gastrickú lipázu, znázornenú na obr. 2 a zodpovedajúcu sekvenciu SEQ ID NO 2, obr. 2 predstavuje sekvenciu aminokyselín psej gastrickej lipázy a zodpovedá sekvencii SEQ ID NO 2, obr. 3 predstavuje nukleotidovú sekvenciu odvodenú od sekvencie cDNA, znázornenej na obr. 1 a zodpovedajúcu sekvencii SEQ ID NO 1, pričom nukleotidy, nachádzajúce sa v polohách 1 až 1137 uvedenej odvodenej sekvencie kódujúcej psiu gastrickú lipázu, ktorá je znázornená na obr. 2 a zodpovedá sekvencii SEQ ID NO 2, obr. 4 predstavuje nukleotidovú sekvenciu cDNA, ktorej nukleotidy nachádzajúce sa v polohách 47 až 1240 kódujú prekurzor ľudskej gastrickej lipázy s 398 aminokyselinami a nukleotidmi, nachádzajúcu sa v polohách 104 až 1240, kódujú maturovanú ľudskú gastrickú lipázu s 379 aminokyselinami, obr. 5 predstavuje sekvencii aminokyselín ľudskej gastrickej lipázy, pričom prekurzor je ohraničený aminokyselinami, nachádzajúcimi sa v polohách 1 až 398 a maturovaná ľudská gastrická lipáza je ohraničená aminokyselinami, nachádzajúcimi sa v polohách 20 až 398, obr. 6, 7 a 8 predstavujú výsledky imunodetekčných pokusov typu Western s rekombinantnými polypeptidmi produkovanými listmi a semenami tabaku Xanthi, semenami repky a listmi a plodmi rajčiaku, transformovanými pomocou rekombinantných sekvencii podľa vynálezu, obr. 9 a 10 predstavujú jednotlivé výsledky analýzy pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli a dosiahnuté prenosom tohto gélu na nitrocelulózovú membránu a preukázanie purifikovanej psej gastrickej lipázy, získanej z listov tabaku, pomocou protilátok proti psej gastrickej lipáze, obr. 11 predstavuje príklad detekcie glykánových rezíduí rekombinantnej psej gastrickej lipázy na membráne, obr. 12 predstavuje analýzu purifikovanej psej gastrickej lipázy, získanej zo semien repky, pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli, obr. 13, 14 a 15 znázorňujú výsledky rôznych pokusov, uskutočňovaných v rámci získania metylesteru kyseliny olejovej zo semien, transformovaných podlá vynálezu.

Predmetom predkladaného vynálezu je použitie nukleotidovej rekombinantnej sekvencie obsahujúcej na jednej strane cDNA, kódujúcu všetky preduodenálne lipázy cicavcov, tzn. lipázy, ktorých nukleotidové sekvencie kódujúce uvedené lipázy vykazujú medzi sebou percento homológie aspoň okolo 75 %, najmä od asi 77 % až do asi 85 % homológie a ktorých sekvencie aminokyselín vykazujú medzi sebou percento homológie aspoň 70 %, osobitne od najmenej asi 80 % do asi 90 % homológie, vykazujú vlastnosť acidorezistencie a sú aktívne pri pH od okolo 1,5 do okolo 5, najmä pri pH od asi 1,5 do asi 2, osobitne cDNA kódujúca všetky gastrické lipázy cicavcov, alebo cDNA kódujúca všetky polypeptidy odvodené od hore uvedených preduodenáIných lipáz adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, pričom tento odvodený polypeptid vykazuje hore uvedené vlastnosti preduodenáIných lipáz a na druhej strane prvky, dovoľujúce rastlinnej bunke produkovať preduodenálnu lipázu, kódovanú uvedenou cDNA alebo produkovať odvodený polypeptid, taký, ktorý bol opísaný hore, najmä promotor a terminátor transkripcie, rozpoznávaný transkripčným mechanizmom rastlinných buniek, pre transformáciu rastlinných buniek s cieľom získať z uvedených rastlinných buniek alebo z rastlín, získaných s využitím týchto buniek, rekombinantnú preduodenálnu lipázu cicavcov vo forme aktívneho enzýmu alebo jeden alebo viacej polypeptidov, odvodených od uvedenej lipázy, takých, ktoré boli definované hore.

Predmetom predkladaného vynálezu je osobitne použitie rekombinantnej nukleotidovej sekvencie obsahujúcej na jednej strane cDNA, znázornenú na obr. 1 a kódujúcu psiu gastrickú lipázu (LGC), znázornenú na obr. 2 alebo nukleotidovú sekvenciu, odvodenú z tejto cDNA, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo a/alebo substitúciou jedného alebo viacerých nukleotidov, pričom táto sekvencia môže kódovať polypeptid, ktorého sekvencia aminokyselín je identická so sekvenciou aminokyselín psej gastrickej lipázy, znázornenej na obr. 2 alebo polypeptid odvodený z psej gastrickej lipázy adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, pričom tento odvodený polypeptid vykazuje účinok lipázy a na druhej strane prvky, dovoľujúce rastlinnej bunke produkovať polypeptid, kódovaný uvedenou cDNA alebo hore uvedenou odvodenou sekvenciou, najmä promotor a terminátor transkripcie, rozpoznávaný transkripčným mechanizmom rastlinných buniek (a najmä ich RNA polymerázami), pre transformáciu rastlinných buniek s cieľom získať z uvedených rastlinných buniek alebo z rastlín, získaných s využitím týchto buniek, rekombinantné psie gastrické lipázy vo forme aktívneho enzýmu alebo jeden alebo viacej polypeptidov, odvodených od uvedenej lipázy, takých, aké boli definované hore.

Predkladaný vynález sa tiež týka každej hore uvedenej rekombinantnej nukleotidovej sekvencie, obsahujúcej ako cDNA tu kyselinu, ktorá je znázornená na obr. 1 alebo nukleotidovú sekvenciu od nej odvodenú hore uvedeným spôsobom.

S ohladom na to je predmetom predkladaného vynálezu najmä každá rekombinantná nukleotidová sekvencia opísaná hore, obsahujúca cDNA, znázornenú na obr. 1 a kódujúcu psiu gastrickú lipázu (LGC), znázornenú na obr. 2.

Predmetom predkladaného vynálezu je osobitne ešte každá rekombinantná nukleotidová sekvencia, opísaná hore, obsahujúca nukleotidovú sekvenciu odvodenú od cDNA, znázornenej na obr. 1, pričom uvedená odvodená cDNA je taká, ako to bolo definované hore a kódujúcu psiu gastrickú lipázu (LGC), znázornenú na obr. 3. Jedna taká sekvencia je výhodne znázornená na obr. 3 a zodpovedá sekvencií, znázornenej na obr. 1, v ktorej bol nukleotid A v polohe 12 nahradený nukleotidom G, nukleotid T v polohe 13 bol nahradený nukleotidom C a nukleotid A v polohe 15 bol nahradený nukleotidom

T.

Výhodne obsahujú rekombinantné nukleotidové sekvencie podlá vynálezu jednu alebo viacej sekvencií, kódujúcich peptid, zodpovedný za smerovanie rekombinantných polypeptidov podlá vynálezu (tzn. rekombinantná psia gastrická lipáza alebo hore uvedené polypeptidy, z nej odvodené) v priestore, vymedzenom rastlinnou bunkou, najmä v endoplazmatickom retikulu alebo vo vakuolách, alebo dokonca zvonka bunky, v pektocelulárnej stene alebo v extracelulárnom priestore, nazývanom tiež apoplazma.

Medzi terminátory transkripcie, ktoré môžu byt používané na transformáciu rastlinných buniek podlá predkladaného vynálezu, je možné uviest terminátor polyA 35S vírusu mozaiky karfiolu (CaMV), opísaný v článku Franck a kol.,

1980 alebo terminátor polyA NOS, zodpovedajúci nekódujúcej oblasti v 3' génu nopalin syntázy plazmidu Ti kmeňa Agrobacterium tumefaciens (Depicker a kol., 1982).

S ohladom na to je predmetom vynálezu tiež každá rekombinantná nukleotidová sekvencia taká, aká bola opísaná hore, obsahujúca v prednej časti uvedenej cDNA alebo jej odvodenej sekvencie terminátor polyA 35S vírusu CaMV alebo terminátor polyA NOS Agrobacterium tumefaciens.

Medzi promotory transkripcie, ktoré je možné použit na transformáciu rastlinných buniek podlá predkladaného vynálezu je možné uviest:

promotor 35S alebo výhodne dvojitý konštitutívny promotor 35S (pd35S) vírusu CaMV, pričom tieto promotory dovolujú expresiu rekombinantných polypeptidov podlá vynálezu v rastline, získané s využitím transformovaných buniek podlá vynálezu a sú opísané v článku Kay a kol., 1987, promotor pCRU génu kruciferínu reďkovky, dovoľujúci expresiu rekombinantných polypeptidov podlá vynálezu výhradne v semenoch (alebo zrnách) rastliny, získané s využitím transformovaných buniek podlá vynálezu a opísaný v článku DepignyThis a kol., 1992, promotory pGEAl a pGEA6, zodpovedajúce nekódujúcej oblasti 5' génov rezervných proteínov obilia, GEA1 a GEA6, Arabindopsis thaliana (Gaubier a kol., 1993) a dovoľujúce špecifickú expresiu v zrnách, promotor, chimérický superpromotor pSP (PCT/US94/ 12946), konštituovaný fúziou trojnásobného opakovania transkripčného aktivačného prvku promotoru génu octopinsyntázy Agrobacterium tumefaciens, transkripčného aktivačného prvku promotoru génu mannopinsyntázy a promotoru mannopinsyntázy Agrobacterium tumefaciens, promotor aktínu ryže, nasledovaný intrónom aktínu ryže (pAR-IAR), obsiahnutý v plazmide pActl-F4, ktorý opísal McElroy a kol. (1991), promotor génu Tzeinu kukurice (pTzein), obsiahnutý v plazmide pg63, ktorý opísal Reina a kol. (1990), ktorý dovoľuje expresiu albumínu v semenoch kukurice.

S ohľadom na to je predmetom vynálezu tiež každá rekombinantná nukleotidová sekvencia, opísaná hore, obsahujúca v prednej časti uvedenej cDNA alebo jej odvodenej sekvencie dvojitý konštitutívny promotor 35S (pd35S) vírusu CaMV, alebo promotor pCRU génu kruciferínu reďkovky alebo promotory pGEAl a pGEA6 Arabindopsis thaliana alebo superpromotor pSP Agrobacterium tumefaciens alebo pAR-IAR rýže alebo promotor ρτζβΐη kukurice.

Sekvencia kódujúca peptid smerovania, používaný podľa predkladaného vynálezu, môže byt pôvodu rastlinného, ľudského alebo živočíšneho.

Ako sekvencie kódujúce peptid smerovania rastlinného pôvodu je možné uviesť:

- nukleotidovú sekvenciu 69 nukleotidov (opísanú v príkladoch, ktoré nasledujú), kódujúcu pŕepeptid (peptidový signál) s 23 aminokyselinami sporamínu A u sladkého zemiaku, pričom tento peptidový signál dovoľuje vstup rekombinantných polypeptidov podía vynálezu do systému sekrécie rastlinných buniek transformovaných podía vynálezu (to znamená hlavne do endoplazmatického retikula), nukleotidovú sekvenciu 42 nukleotidov (opísanú v príkladech, ktoré nasledujú), kódujúcu N-terminálny propeptid vakuolárneho smerovanie s 14 aminokyselinami sporamínu A u sladkého zemiaku, dovoľujúcu zhromažďovanie rekombinantných polypeptidov podía vynálezu vo vakuolách rastlinných buniek, transformovaných podía vynálezu, nukleotidovú sekvenciu 111 nukleotidov (opísanú v príkladoch, ktoré nasledujú), kódujúcu prepropeptid s 37 aminokyselinami sporamínu A, tvoreného od N-terminálnej časti k C-terminálnej časti 23 aminokyselinami hore uvedeného signálneho peptidu, nasledovanými 14 aminokyselinami hore uvedeného propeptidu, pričom uvedený prepropeptid dovoľuje vstup rekombinantných polypeptidov podía vynálezu do systému sekrécie a ich akumulácie vo vakuolách rastlinných buniek, transformovaných podía vynálezu, pričom hore uvedené tri sekvencie sú opísané v článkoch Maurakami a kol., 1986 a Matsuoka a Nakamura, 1991, karboxyterminálny propeptid lektínu jačmeňa, opísaný najmä v článkoch Schroeder a kol., 1993 a Bednarek a Ralkhel, 1991.

Medzi sekvenciami, kódujúcimi peptid smerovania pôvodu íudského alebo živočíšneho je možné citovať sekvencie kódujúce signálny peptid íudskej gastrické lipázy (LGH) tak, ako je to opísané v európskom patente č. 0 191 061 alebo signálny peptid králičej gastrickéj lipázy (LGL) tak, ako je to opísané v európskom patente č. 0 542 629, ktorých sekvencie sú uvedené v príkladoch, ktoré nasledujú alebo sekvencie kódujúce signálny peptid ludskej pankreatickej lipázy (LPH) alebo ešte signálny peptid psej gastrickej lipázy (LGC).

Ako sekvencie, kódujúce peptid smerovania, je tiež možné uviesť sekvenciu kódujúcu tetrapeptid KDEL a dovolujúcu smerovanie v endoplazmatickom retikulu.

S ohladom na to je predmetom vynálezu tiež každá nukleotidová rekombinantná sekvencia tak, ako bola opísaná hore, obsahujúca sekvenciu kódujúcu celý peptid alebo časť signálneho peptidu takého, ako je signálny peptid sporamínu A sladkého zemiaku alebo signálny peptid ľudskej gastrickej lipázy alebo signálny peptid králičej gastrickej lipázy alebo signálny peptid psej gastrickej lipázy, pričom táto sekvencia kóduje peptidový signál situovaný v uvedenej rekombinantnej nukleotidovej sekvencii a prednej časti uvedenej cDNA alebo v sekvencii z nej odvodenej a v zadnej časti použitého promotoru a to takým spôsobom, že posledné aminokyseliny C-konca signálneho peptidu sú viazané s prvou, aminokyselinou N-konca polypeptidu, kódovaného uvedenou cDNA alebo sekvenciou z nej odvodenej, v proteíne, kódovanom uvedenou rekombinantnou nukleotidovou sekvenciou.

Predmetom vynálezu je tiež každá rekombinantná nukleotidová sekvencia taká, aká bola opísaná hore, obsahujúca sekvenciu kódujúcu celý peptid vakuolového smerovania alebo jeho časť, najmä peptid sporamínu A sladkého zemiaku, pričom táto sekvencia sa v uvedenej rekombinantnej nukleotidovej sekvencii nachádza medzi sekvenciou, kódujúcou signálny peptid a sekvenciou kódujúcou uvedenú cDNA alebo sekvenciou z nej odvodenou a to takým spôsobom, že prvá aminokyselina N-konca peptidu vakuolárneho smerovania je viazaná na poslednú aminokyselinu C-konca signálneho peptidu a posledná aminokyselina C-konca uvedeného peptidu smerovania je viazaná na prvú aminokyselinu N-konca uvedeného polypeptidu kódo16 vaného uvedenou cDNA alebo sekvenciou z nej odvodenou v proteíne, kódovanom uvedenou rekombinantnou nukleotidovou sekvenciou.

Predmetom predkladaného vynálezu je tiež každá rekombinantná nukleotidové sekvencia taká, aká bola opísaná hore, obsahujúca sekvenciu, kódujúcu celý peptid vakuolového smerovania alebo jeho časť, najmä peptid lektínu jačmeňa, pričom táto sekvencia vakuolového smerovania sa v uvedenej rekombinantnej nukleotidovej sekvencii nachádza v zadnej časti sekvencie, kódujúcej uvedenú cDNA alebo sekvenciu z nej odvodenú a to takým spôsobom, že prvá aminokyselina N-konca peptidu vakuolárneho smerovania je viazaná na poslednú aminokyselinu C-konca polypeptidu kódovaného uvedenou cDNA alebo sekvenciou z nej odvodenou v proteíne, kódovanom uvedenou rekombinantnou nukleotidovou sekvenciou.

Predmetom vynálezu sú najmä nasledujúce rekombinantné nukleotidové sekvencie:

sekvencia (označená pd35S-PS-LGC), obsahujúca v smere 5'->3' promotor pd35S vírusu CaMV, sekvenciu kódujúcu signálny peptid sporamínu A, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pd35S-PPS-LGC), obsahujúca v smere 5'->3' promotor pd35S vírusu CaMV, sekvenciu, kódujúcu prepropeptid sporamínu A, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pd35S-PSLGL-LGC), obsahujúca v smere 5*->3’ promotor pd35S vírusu CaMV, sekvenciu, kódujúcu časť signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tzn.

sekvenciu, tvorenú 19 prvými aminokyselinami, uvedenú v príkladoch, ktoré nasledujú, z ktorej bolo odstránených 9 nukleotidov, kódujúcich posledné 3 aminokyseliny C-konca), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 a je nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pCRU-PS-LGC), obsahujúca v smere 5'->3' promotor pCRU kruciferínu, sekvenciu, kódujúcu signálny peptid sporamínu A, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pCRU-PPS-LGC), obsahujúca v smere 5'->3’ promotor pCRU kruciferínu, sekvenciu, kódujúcu prepropeptid sporamínu A, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pCRU-PSLGL-LGC), obsahujúca v smere 5'->3' promotor pCRU kruciferínu, sekvenciu, kódujúcu časť signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pGEAl-PSLGL-LGC), obsahujúca v smere 5'->3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekvenciu, kódujúcu časť signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo na obr.

a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pGEA6-PSLGL-LGC), obsahujúca v smere 5'->3' promotor pGEA6 Arabidopsis thaliana, sekvenciu, kódujúcu čaši signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo na obr.

a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pAR-IAR-PSLGL-LGC), obsahujúca v smere 5’->3' promotor pAR-IAR ryže, sekvenciu, kódujúcu čaši signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV alebo terminátorom polyA NOS Agrobacterium tumefaciens, sekvencia (označená pTzein-PSLGL-LGC), obsahujúca v smere 5'->3’ promotor ρτζβίη kukurice, sekvenciu, kódujúcu čaši signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pTzein-PSLGL-LGC-KDEL), obsahujúca v smere 5'->3' promotor pTzein kukurice, sekvenciu, kódujúcu čaši signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo na obr.

3, potom sekvenciou kódujúcou tetrapeptid KDEL a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV.

Výhodne rekombinantná nukleotidové sekvencie podlá vynálezu tiež obsahujú nukleotidovú sekvenciu, použiteľnú ako markér uvedených rekombinantných sekvencii, najmä na odlíšenie (a tým i selekciu) tých rastlinných buniek, ktoré sú transformované podlá vynálezu uvedenými rekombinantnými sekvenciami od rastlinných buniek, ktoré nie sú transformované.

Výhodne sú také nukleotidové sekvencie, použiteľné ako markér uvedených rekombinantných sekvencii, zvolené zo súboru, zahŕňajúceho gény odolnosti proti antibiotikom, najmä gény odolnosti proti kanamycínu.

Predmetom vynálezu je tiež každý vektor, najmä plazmidový vektor, obsahujúci rekombinantnú nukleotidovú sekvenciu podľa vynálezu, ktorá je vložená do miesta, ktoré nie je dôležité pre jeho replikáciu.

Vynález sa tiež týka každej hostiteľskej bunky, najmä baktérie ako je Agrobacterium tumefaciens, transformovanej vektorom, ako je vektor, opísaný hore.

Predmetom predkladaného vynálezu je tiež akýkoľvek spôsob výroby psej gastrickej lipázy vo forme aktívneho enzýmu a/alebo jeden alebo viac polypeptidov, odvodených od tohto enzýmu, osobitne adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, pričom tento polypeptid vykazuje účinok lipázy a uvedený spôsob zahŕňa:

transformáciu rastlinných buniek takým spôsobom, že do genómu buniek je vložená jedna alebo viacej rekombinantných nukleotidových sekvencii podľa vynálezu, v prípade potreby je z rastlinných buniek, transformovaných hore uvedeným spôsobom, získaná transformovaná rastlina, rekombinantná psia gastrická lipáza a/alebo polypeptid alebo polypeptidy z nej odvodené, ako boli opísané hore, produkované uvedenými transformovanými rastlinnými bunkami alebo uvedenými transformovanými rastlinami, sú zhromaždené, najmä extrakciou, a v prípade potreby nasleduje etapa purifikácia.

Podlá jedného rozpracovania hore uvedeného spôsobu podlá vynálezu je transformácia rastlinných buniek uskutočnená transferom rekombinantnej nukleotidovej sekvencie podlá vynálezu do protoplastov, najmä po ich inkubácii v roztoku polyetylénglykolu (PEG) v prítomnosti divalentných katiónov (Ca²⁺) metódou, ktorú opísal Krens a kol., 1982.

Transformácia rastlinných buniek môže tiež byť realizovaná elektroporáciou, najmä podlá metódy, ktorý je opísaná v článku Fromm a kol., 1986.

Transformácia rastlinných buniek môže byt tiež realizovaná pomocou použitia génového dela, dovolujúceho vystreľovať velmi velkou rýchlosťou kovové častice, pokryté rekombinantnými nukleotidovými sekvenciami podlá vynálezu a takto dodávať gény do vnútra bunečného jadra, najmä spôsobom, opísaným v článku Sanford, 1988.

Iný spôsob transformácie rastlinných buniek je spôsob cytoplazmatickej alebo jadrovej mikroinjekcie, opísaný v článku De La Penna a kol., 1987.

Osobitne výhodný spôsob rozpracovania hore uvedeného spôsobu podlá vynálezu spočíva v transformácii rastlinných buniek ich umiestnením do prítomnosti bunečného hostiteľa transformovaného vektorom podlá vynálezu, ako bol opísaný hore, pričom uvedený bunečný hostite! je schopný infikovať uvedené rastlinné bunky tým, že dovoluje integráciu rekombinantných nukleotidových sekvencii, pôvodne obsiahnutých v genóme hore uvedeného vektoru, do genómu rastlinných buniek.

Výhodne je hore použitým uvedeným bunečným hostitelom Agrobacteríum tumefaciens a spôsob sa vykonáva najmä podlá metódy, opísanej v článku Bevan, 1984 a An a kol.,

1986 alebo Agrobacteríum rhizogenes a spôsob je uskutočňovaný najmä podlá článku Jouanin a kol., 1987.

Ako rastlinné bunky, schopné transformácie spôsobom podlá predkladaného vynálezu je možné citovať bunky repky, tabaku, kukurice, hrachu, rajčiaku, mrkve, pšenice, jačmeňa, zemiakov, sóje, slnečnice, šalátu, ryže a lucerny.

V jednom rozpracovaní hore uvedeného spôsobu podlá vynálezu sú rastlinné bunky, transformované podlá vynálezu, kultivované in vitro, najmä v bioreaktoroch spôsobom, ktorý bol opísaný v článku Brodelius, 1988, v tekutom prostredí, alebo spôsobom, ktorý bol opísaný v článku Brodelius a kol., 1979, v imobilizovanej forme alebo ešte spôsobom podlá článku Deno a kol., 1987, ktorý spracováva kultúru transformovaných koreňov in vitro.

Kultivačné prostredie in vitro, uvedené hore, je nakoniec odobrané a je z neho extrahovaná, a v prípade potreby aj purifikovaná, najmä chromatografiou, rekombinantná psia gastrická lipáza a/alebo z nej odvodený polypeptid alebo polypeptidy, opísané hore, produkované uvedenými transformovanými bunkami, kultivovanými in vitro.

Vo výhodnom rozpracovaní hore uvedeného spôsobu získania rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu alebo polypeptidov z nej odvodených podlá vynálezu je transformácia rastlinných buniek nasledovaná etapou získania transformovaných rastlín umiestnením uvedených transformovaných buniek do vhodného prostredia. Rekombinantná psia gastrická lipáza a/alebo polypeptid alebo polypeptidy z nej odvodené, produkované bunkami takto získaných celých rastlín sú získané extrakciou, aplikovanou na celé rastliny alebo na časti týchto rastlín (najmä na listy alebo na stonky alebo na plody) alebo tiež sú získané zo semien týchto rastlín a po tejto extrakcii v prípade potreby nasleduje etapa purifikácie rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu alebo polypeptidov z nej odvodených.

Transformované rastliny, použité na získanie rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu alebo polypeptidov z nej odvodených v rámci hore uvedeného spôsobu podía vynálezu sú rastliny generácie TO, to znamená rastliny získané z kultúry buniek transformovaných podía vynálezu vo vhodnom prostredí alebo výhodne rastliny generácií nasledujúcich (TI, T2 apod.), získaných samooplodnením rastlín predchádzajúcej generácie, v ktorých sa rekombinantné nukleotidové sekvencie podía vynálezu reprodukujú podía Mendelových zákonov.

Medzi polypeptidmi, odvodenými od rekombinantnej psej gastrickej lipázy, ktoré môžu byt získané uskutočňovaním spôsobu podía vynálezu je možné uviest:

polypeptid, obmedzený aminokyselinami, nachádzajúcimi sa v polohách 55 až 379 na obr. 2, označený ako polypeptid ( 54) a predstavovaný sekvenciou SEQ ID NO 4, pričom uvedený polypeptid je kódovaný nukleotidovou sekvenciou, označenou ako SEQ ID NO 3, polypeptid, obmedzený aminokyselinami, nachádzajúcimi sa v polohách 5 až 379 na obr. 2, označený ako polypeptid ( 4) a predstavovaný sekvenciou SEQ ID NO 6, pričom uvedený polypeptid je kódovaný nukleotidovou sekvenciou, označenou ako SEQ ID NO 5.

Predmetom vynálezu je osobitne každý spôsob, tak, ako bol opísaný hore, získania rekombinantnej psej gastrickej lipázy, znázornenej na obr. 2 a prípadne potreby získania jedného alebo viacerých odvodených polypeptidov, najmä polypeptidu (Δ54) a/alebo polypeptidu (Δ 4) uvedených hore, pričom uvedený spôsob sa vyznačuje tým, že etapa transformácie rastlinných buniek je realizovaná integráciou do genómu týchto rastlinných buniek rekombinantnej sekvencie, ktorá bola opísaná hore, obsahujúcej na jednej strane cDNA, znázornenú na obr. 1 a na druhej strane sekvenciu kódujúcu signálny peptid s 22 aminokyselinami králičej gastrickej lipázy, najmä sekvenciu kódujúcu prvých 19 aminokyselín signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy.

Vynález sa osobitne týka spôsobu výroby rekombinantnej psej gastrickej lipázy znázornenej na obr. 2, opísaného hore, v prípade potreby spojeného s polypeptidom (Δ54) a/alebo polypeptidom (Δ4) vyznačujúceho sa tým, že zahŕňa:

transformáciu buniek explantátov listu rastliny ich umiestnením do prítomnosti kmeňa Agrobacterium tumefaciens _f transformovaného plazmidom, opísaným hore, obsahujúceho rekombinantnú nukleotidovú sekvenciu pd35S-PSLGL-LGC uvedenú hore, v zodpovedajúcom kultivačnom prostredí, selekcie transformovaných explantátov v prostredí obsahujúcom kanamycín, získanie transformovaných rastlín z transformovaných explantátov, uvedených hore, ich kultiváciou vo vhodnom prostredí, extrakciu rekombinantnej psej gastrickej lipázy a v prípade potreby polypeptidu (Δ 54) a/alebo polypeptidu (Δ4), najmä rozdrvením listov a/alebo semien a/alebo plodov hore uvedených transformovaných rastlín vo vhodnom tlmivom roztoku, centrifugáciou a získaním supernatantu predstavujúceho rastlinný extrakt s enzymatickým účinkom, v prípade potreby purifikáciu rekombinantnej psej gastrickej lipázy z extraktu, získaného v predchádzajúcej etape, najmä chromatografiou supernatantu, čo vedie k získaniu rekombinantnej psej gastrickej lipázy vo forme v podstate čistej.

Predmetom vynálezu je tiež aplikácia hore uvedeného spôsobu výroby polypeptidu (Ä 54) alebo polypeptidu (Δ4) vo forme v podstate čistej vykonaním hore opísaného spôsobu výroby, v ktorom bunky transformované sekvenciou pd35S-PSLGL-LGC sú bunky explantátov listov luľkovitých rastlín, najmä tabaku alebo rajčiaku.

V jednom rozpracovaní hore uvedeného spôsobu podľa vynálezu môže byt polypeptid špecificky získaný extrakciou z listov hore uvedeného transformovaného tabaku, najmä rozdrvením týchto listov vo vhodnom tlmivom roztoku, centrifugáciou a získaním supernatantu. Polypeptid (/>4) môže byt následne purifikovaný z extraktu hore uvedených listov, obsahujúcich uvedený polypeptid (ä4), najmä chromatografiou z uvedeného supernatantu.

Predmetom vynálezu je osobitne každý spôsob, ako bol opísaný hore, získania rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo jedného alebo viacerých polypeptidov od tejto lipázy, tak, ako sú opísané hore, vyznačujúci sa tým, že etapa transformácie rastlinných buniek je vykonávaná integráciou do genómu uvedených rastlinných buniek sekvencie, obsahujúcej na jednej strane nukleotidovú sekvenciu znázor25 nenú na obr. 3 a na druhej strane sekvenciu kódujúcu signálny peptid sporamínu, opísaný hore.

Ako polypeptidy, odvodené od rekombinantnéj psej gastrickej lipázy, ktoré je možné získať uskutočňovaním spôsobu podlá vynálezu je možné uviesť polypeptid (254) a/alebo polypeptid (Δ4), uvedené hore.

Vynález sa osobitne týka spôsobu výroby rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (A 54) a/alebo polypeptidu (2 4) vyznačujúceho sa tým, že zahŕňa:

transformáciu buniek explantátov rastliny (najmä explantátov listov) ich umiestnením do prítomnosti kmeňa Agrobacterium tumefaciens, transformovaného plazmidom, opísaným hore, obsahujúceho rekombinantnú nukleotidovú sekvenciu pd35S-PS-LGC a/alebo pd35S-PPS-LGC, selekciu transformovaných explantátov v prostredí obsahujúcom kanamycín, získanie transformovaných rastlín z transformovaných explantátov, uvedených hore, ich kultiváciou vo vhodnom prostredí, extrakciu rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (254) a/alebo polypeptidu (24), najmä rozdrvením listov a/alebo semien a/alebo plodov hore uvedených transformovaných rastlín vo vhodnom tlmivom roztoku, centrifugáciou a získaním supernatantu predstavujúceho rastlinný extrakt s enzymatickým účinkom, v prípade potreby purifikáciu rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (A 54) a/alebo polypeptidu (24) z extraktu, získaného v predchádzajúcej etape, najmä chromatografiou supernatantu, čo vedie k získaniu rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (A 54) a/alebo polypeptidu (A4), vo forme v podstate čistej.

Predmetom vynálezu je najmä spôsob získania hore opísaného polypeptidu (A54) a/alebo polypeptidu (A 4) vykonaním hore opísaného spôsobu v ktorom transformované bunky sú bunky explantátov listov ľuľkovitých rastlín, najmä tabaku a rajčiaku.

Podľa jedného rozpracovania hore uvedeného spôsobu podľa vynálezu môže byť polypeptid (A 54) špecificky získaný extrakciou zo semien hore uvedeného transformovaného tabaku, najmä rozdrvením týchto semien vo vhodnom tlmivom roztoku, centrifugáciou a získaním supernatantu. Polypeptid (A54) môže byť následne purifikovaný z uvedeného extraktu semien, obsahujúceho uvedený polypeptid (A54), najmä chromatografiou hore uvedeného supernatantu.

Vynález sa osobitne týka spôsobu výroby rekombinantnej pej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu U 54) a/alebo polypeptidu (A 4) vyznačujúceho sa tým, že zahŕňa:

transformáciu buniek explantátov rastliny (najmä explantátov listov) ich umiestnením do prítomnosti kmeňa Agrobacterium tumefaciens, transformovaného plazmidom, opísaným hore, obsahujúceho rekombinantnú nukleotidovú sekvenciu pCRU-PPS-LGC a/alebo sekvenciu pCRU-PPS-LGC a/alebo sekvenciu pGEAl-PSLGL-LGC a/alebo sekvenciu pGEA6-PSLGL-LGC a/alebo sekvenciu pAR-IAR-PSLGL-LGC a/alebo sekvenciu pTzein-PSLGL-LGC a/alebo sekvenciu pTzein-PSLGL-LGC-KDEL, selekciu transformovaných explantátov v prostredí obsahujúcom kanamycín, získanie transformovaných rastlín z transformovaných explantátov, uvedených hore, ich kultiváciou vo vhodnom prostredí, extrakciu rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (Δ54) a/alebo polypeptidu (44), najmä rozdrvením semien hore uvedených transformovaných rastlín vo vhodnom tlmivom roztoku, centrifugáciou a získaním supernatantu predstavujúceho rastlinný extrakt s enzymatickým účinkom, v prípade potreby purifikáciu rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (Δ54) a/alebo polypeptidu (Δ4) z extraktu, získaného v predchádzajúcej etape, najmä chromatografiou supernatantu, čo vedie k získaniu rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (Δ54) a/alebo polypeptidu (44), vo forme v podstate čistej.

Predmetom vynálezu je osobitne spôsob získania hore opísaného polypeptidu (Δ54) uskutočnením hore opísaného spôsobu v ktorom transformované bunky sú bunky repky alebo tabaku a extrakcia polypeptidu (Δ54) je vykonávaná najmä rozdrvením transformovaných semien.

Transformované rastlinné bunky, použité pri spôsoboch opísaných hore sú najmä zvolené zo súboru, zahŕňajúceho bunky tabaku, repky, kukurice, hrachu, rajčiaku, jablka, mrkvy, pšenice, jačmeňa, zemiaku, sóji, slnečnice, šalátu, ryže a lucerny.

Vynález sa osobitne týka spôsobu výroby rekombinantnej psej gastrické lipázy a/alebo polypeptidu (Δ54) a/alebo polypeptidu (44) vyznačujúceho sa tým, že zahŕňa:

transformáciu buniek kalusu kukurice ich bombardovaním pomocou časticového dela plazmidmi, obsahujúcimi rekombinantnú nukleotidovú sekvenciu pAR-IAR-PSLGL-LGC a/alebo sekvenciu pTzein-PSLGL-LGC a/alebo sekvenciu ρτ zein-PSLGL-LGC-KDEL, selekciu transformovaného kalusu v prostredí obsahujúcom selekčné činidlo, ako je kanamycín, získanie transformovaných rastlín kukurice z trans formovaného kalusu, uvedeného hore, ich kultiváciou vo vhod nom prostredí, extrakciu rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (Δ54) a/alebo polypeptidu (44), najmä rozdrvením semien hore uvedených transformovaných rastlín vo vhodnom tlmivom roztoku, centrifugáciou a získaním super natantu predstavujúceho rastlinný extrakt s enzymatickým účinkom, v prípade potreby purifikáciu rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (Δ54) a/alebo polypeptidu (Δ4) z extraktu, získaného v predchádzajúcej etape, najmä chromatografiou supernatantu, čo vedie k získaniu rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (Δ54) a/alebo polypeptidu (Δ4) , vo forme v podstate čistej.

Predmetom vynálezu je tiež každá geneticky transformovaná rastlinná bunka, obsahujúca jednu alebo viac rekombinantných nukleotidových sekvencií podlá vynálezu opísaných hore, ktoré sú stálym spôsobom integrované do ich genómu.

Predmetom vynálezu je tiež každá transgenická rastlinná bunka, opísaná hore, obsahujúca jeden alebo viac rekombinantných polypeptidov podľa vynálezu, ako je rekombinantná psia gastrická lipáza a/alebo polypeptid (Λ 54) a/alebo polypeptid (Ä 4), pričom uvedená rastlinná bunka je naviac rastlinná bunka s enzymatickým účinkom, osobitne s účinkom lipázy, definovaným ďalej.

Predmetom vynálezu sú tiež geneticky transformované semená obsahujúce jednu alebo viac rekombinantných nukleotidových sekvencii podľa vynálezu opísaných hore, ktoré sú stálym spôsobom integrované do ich genómu.

Vynález sa tiež týka transgenických semien opísaných hore, obsahujúcich jeden alebo viac rekombinantných polypeptidov podľa vynálezu, ako je rekombinantná psia gastrická lipáza a/alebo polypeptid (Δ54) a/alebo polypeptid (A4), pričom uvedené semená sú naviac semená s enzymatickým účinkom, osobitne s účinkom lipázy, definovaným ďalej.

Semená transformované podľa vynálezu sú semená zobrané z rastlín geneticky transformovaných podľa vynálezu, pričom uvedené rastliny sú buď rastliny hore uvedenej generácie TO, získané kultiváciou buniek transformovaných podľa vynálezu, alebo rastliny nasledujúcich generácií (TI, T2 apod.), získané samooplodnením alebo krížením rastlín predchádzajúcich generácií (ako to bolo uvedené hore).

Predmetom vynálezu sú tiež geneticky transformované rastliny alebo časti rastlín (najmä explantáty, stonky, listy, plody, korene, peľ a podobne), vyznačujúci sa tým, že obsahujú jednu alebo viac rekombinantných nukleotidových sekvencií podľa vynálezu opísaných hore, ktoré sú stálym spôsobom integrované do ich genómu.

Vynález sa tiež týka transgenických rastlín alebo častí rastlín opísaných hore, obsahujúcich jeden alebo viac rekombinantných polypeptidov podía vynálezu, ako je rekombinantná psia gastrická lipáza a/alebo polypeptid (Δ54) a/alebo polypeptid (Δ4), pričom uvedené rastliny sú naviac rastliny s enzymatickým účinkom, osobitne s účinkom lipázy, definovaným d’alej.

Predmetom vynálezu sú osobitne hore uvedené transformované rastliny, získané kultiváciou buniek alebo semien podía vynálezu, opísaných hore.

Rastliny alebo časti rastlín, transformované podía vynálezu sú najmä zvolené zo súboru, zahŕňajúceho repku, tabak, kukuricu, hrách, rajčiak, mrkvu, pšenicu, jačmeň, zemiaky, sóju, slnečnicu, ryžu, šalát, lucernu a repu alebo časti týchto rastlín.

Predmetom vynálezu je každý rastlinný extrakt s enzymatickým účinkom a osobitne s účinkom lipázy, definovaným ďalej, získaný jedným z hore uvedených spôsobov podía vynálezu, obsahujúci ako účinný enzým jeden alebo viac rekombinantných polypeptidov podía vynálezu, ako je psia gastrická lipáza a/alebo polypeptid (Δ54) a/alebo polypeptid (Δ4).

Účinok lipázy (alebo lipolytický účinok) rastlín alebo častí rastlín a rastlinných extraktov podía vynálezu môže byt meraný najmä metódou podía Gargouriho (Gargouri a kol., 1986), využívajúcou ako substrát triglycerid s krát kym reťazcom (ako je tributyrid). Enzymatický účinok je opi sovaný v jednotkách U, kde jednotka U predstavuje množstvo enzýmu, nutného na uvoínenie jedného mmólu voíných mastných kyselín za minútu pri 37’C v podmienkach optimálneho pH.

Rastlinné extrakty s enzymatickým účinkom sú najmä tie extrakty, v ktorých hmotnostné percento enzymaticky účinných rekombinantných polypeptidov predstavuje zhruba od 0,1 % do 20 % a najmä od okolo 1 % do okolo 15 %, merané vzhľadom k celkovej hmotnosti proteínov, prítomných v uvedenom extrakte, čo zodpovedá miere enzymatického účinku od okolo 0,5 U na jeden gram čerstvej hmotnosti (PF) listov do okolo 1000 U na gram čerstvej hmotnosti listov, najmä účinku od okolo 10 U na jeden gram čerstvej hmotnosti (PF) listov do okolo 300 U na gram čerstvej hmotnosti listov alebo od okolo 1 U na jeden gram čerstvej hmotnosti semien do okolo 5000 U na gram čerstvej hmotnosti semien, najmä účinku od okolo 10 U na jeden gram čerstvej hmotnosti (PF) semien do okolo 1000 U na gram čerstvej hmotnosti listov.

Predmetom vynálezu sú osobitne rastlinné extrakty s nasledujúcim enzymatickým účinkom:

* extrakty listov a/alebo plodov a/alebo semien rastlín, získaných transformáciou buniek explantátov týchto rastlín sekvenciou pd35S-PSLGL-LGC alebo sekvenciou pd35SPS-LGC alebo sekvenciou pd35S-PPS-LGC jedným zo spôsobov opísaných hore a obsahujúcich rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a/alebo polypeptid (A54) a/alebo polypeptid (A4), najmä extrakt listov tabaku, získaný transformáciou buniek explantátov listov tabaku sekvenciou pd35S-PS-LGC alebo sekvenciou pd35S-PPS-LGC jedným zo spôsobov opísaných hore a obsahujúci polypeptid (Δ54) spolu s polypeptidom (Δ4), pričom hmotnostné percento zmesi týchto dvoch polypeptidov vzhladom k celkovej hmotnosti proteínov prítomných v uvedenom extrakte je od okolo 0,1 % do okolo 20 % a enzymatický účinok uvedeného extraktu je od okolo 100 U na gram čerstvej hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvej hmotnosti, extrakt listov alebo plodov rajčiaku, získaný transformáciou buniek explantátov listov rajčiaku sekvenciou pd35S-PS-LGC alebo sekvenciou pd35S-PPS-LGC jedným zo spôsobov opísaných hore a obsahujúci polypeptid (A 54) spolu s polypeptidom (Δ4), pričom hmotnostné percento zmesi týchto dvoch polypeptidov vzhíadom k celkovej hmotnosti proteínov prítomných v uvedenom extrakte je od okolo 0,1 % do okolo 20 % a enzymatický účinok uvedeného extraktu je od okolo 100 U na gram čerstvej hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvej hmotnosti, extrakt listov tabaku, získaný transformáciou buniek explantátov listov tabaku sekvenciou pd35S-PSLGL-LGC jedným zo spôsobov opísaných hore a obsahujúci polypeptid (Λ4), pričom hmotnostné percento tohto polypeptidu vzhíadom k celkovej hmotnosti proteínov prítomných v uvedenom extrakte je od okolo 0,1 % do okolo 20 % a enzymatický účinok uvedeného extraktu je od okolo 100 U na gram čerstvej hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvej hmotnosti, extrakt semien tabaku, získaný transformáciou buniek explantátov listov tabaku sekvenciou pd35S-PS-LGC alebo sekvenciou pd35S-PPS-LGC jedným zo spôsobov opísaných hore a obsahujúci polypeptid (Δ54), pričom hmotnostné percento tohto polypeptidu vzhíadom k celkovej hmotnosti proteínov prítomných v uvedenom extrakte je od okolo 0,1 % do okolo 1 % a enzymatický účinok uvedeného extraktu je od okolo 10 U na gram čerstvej hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvej hmotnosti, * extrakty semien rastlín, získaných transformáciou buniek explantátov týchto rastlín sekvenciou pCRU-PS-LGC alebo sekvenciou pCRU-PPS-LGC alebo sekvenciou pGEAl-PSLGLLGC alebo sekvenciou pGEA6-PSLGL-LGC jedným zo spôsobov opísaných hore a obsahujúcich rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a/alebo polypeptid (A54) a/alebo polypeptid (A4), najmä extrakt semien repky, získaný transformáciou buniek explantátov listov repky sekvenciou pCRU-PS-LGC alebo sekvenciou pCRU-PPS-LGC alebo sekvenciou pGEAl--PSLGL-LGC alebo sekvenciou pGEA6-PSLGL-LGC jedným zo spôsobov opísaných hore a obsahujúci polypeptid (Δ54), pričom hmotnostné percento tohto polypeptidu vzhladom k celkovej hmotnosti proteínov prítomných v uvedenom extrakte je od okolo 0,1 % do okolo 1 % a enzymatický účinok uvedeného extraktu je od okolo 10 U na gram čerstvej hmotnosti do okolo 1000 U na gram čerstvej hmotnosti, * extrakty semien rastlín, získaných transformáciou buniek explantátov týchto rastlín sekvenciou pAR-IAR-PSLGLLGC a/alebo sekvenciou pTzein-PSLGL-LGC a/alebo pTzeinPSLGL-LGC-KDEL jedným zo spôsobov opísaných hore a obsahujúcich rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a/alebo polypeptid (Δ54) a/alebo polypeptid (A4), najmä extrakt semien kukurice, získaný transformáciou kukurice (najmä buniek kalusu kukurice) sekvenciou pARIAR-PSLGL-LGC a/alebo sekvenciou pTzein-PSLGL-LGC a/alebo pizein-PSLGL-LGC-KDEL jedným zo spôsobov opísaných hore a obsahujúci polypeptid (A54), pričom hmotnostné percento tohto polypeptidu vzhladom k celkovej hmotnosti proteínov prítomných v uvedenom extrakte je od okolo 0,1 % do okolo 1 % a enzymatický účinok uvedeného extraktu je od okolo 10 U na gram čerstvej hmotnosti do okolo 1000 U na gram čerstvej hmotnosti.

Predmetom vynálezu je tiež každá enzymatický účinná rekombinantná psia gastrická lipáza, ktorej sekvencia amino34 kyselín je sekvencia, znázornená na obr. 2 alebo polypeptid odvodený od tejto lipázy, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, pričom tento polypeptid má účinok lipázy, také, že sú získané vo forme v podstate čistej uskutočnením jedného z hore opísaných spôsobov podía vynálezu, pričom tento spôsob zahŕňa etapu purifikácie rekombinantných polypeptidov podía vynálezu, najmä chromatografiou, vychádzajúci z enzymatických extraktov, opísaných hore.

Ako polypeptidy, odvodené od psej gastrickej lipázy, má vynález ako predmet polypeptid (Δ54) a polypeptid (Δ4), opísané hore, ktorých zodpovedajúce molekulové hmotnosti sú po radu zhruba 37 kDa a zhruba 49 kDa.

Pod pojmom rekombinantné enzymaticky účinná psia gastrická lipáza alebo odvodený polypeptid, vykazujúci účinok lipázy, ako boli uvedené hore, sa rozumie každý rekombinantný polypeptid, ktorý vykazuje účinok lipázy, tak ako je meraný metódou podía Gargouriho, uvedenou hore.

Pre ilustráciu je možné uviest, že rekombinantné polypeptidy podía vynálezu vykazujú účinok lipázy od okolo 10 U/mg rekombinántného polypeptidu do okolo 1000 U/mg, najmä od okolo 100 U/mg do okolo 600 U/mg.

Vynález sa týka osobitne rekombinantnej psej gastrickej lipázy, získanej purifikáciou enzymatického extraktu listov alebo semien tabaku, pričom tieto listy alebo semená pochádzajú z transformovaných rastlín tabaku, ktoré pochádzajú z buniek tabaku, transformovaných sekvenciou pd35SPSLGL-LGC spôsobom opísaným hore, pričom uvedená rekombinantná psia gastrická lipáza vykazuje účinok lipázy, ako bol opísaný hore.

Predmetom vynálezu sú tiež polypeptid (4 54) a polypeptid (44), získané purifikáciou enzymatického extraktu listov a/alebo semien a/alebo plodov rastlín, najmä luľkovitých rastlín, ako sú transformovaný tabak alebo rajčiak, pričom tieto sú samotné získané z rastlinných buniek transformovaných sekvenciou pd35S-PS-LGC alebo sekvenciou pd35SPPS-LGC alebo sekvenciou pd35S-PSLGL-LGC spôsobom opísaným hore, pričom uvedený polypeptid (454) a polypeptid (44) vykazujú účinok lipázy, ako bol opísaný hore.

Predmetom vynálezu je tiež polypeptid (454), získaný purifikáciou enzymatického extraktu semien tabaku alebo semien repky, pričom tieto semená pochádzajú z transformovaných rastlín tabaku respektíve repky, pričom tieto sú samotné získané z rastlinných buniek tabaku respektíve repky, transformovaných sekvenciou pCRU-PS-LGC alebo sekvenciou pCRU-PPS-LGC spôsobom opísaným hore, pričom uvedený rekombinantný polypeptid (454) vykazuje účinok lipázy, ako to bolo opísané hore.

Predmetom vynálezu sú tiež polypeptid (454) a polypeptid (44), získané purifikáciou enzymatického extraktu semien repky, pričom tieto semená pochádzajú z transformovaných rastlín repky, pričom tieto sú samotné získané z rastlinných buniek repky, transformovaných sekvenciou pGEAlPSLGL-LGC a/alebo sekvenciou pGEA6-PSLGL-LGC spôsobom opísaným hore, pričom uvedené rekombinantné polypeptidy (454) a (44) vykazujú účinok lipázy, ako to bolo opísané hore.

Predmetom vynálezu sú tiež polypeptid (454) a polypeptid (Δ4), získané purifikáciou enzymatického extraktu semien kukurice, pričom tieto zrná pochádzajú z transformovaných rastlín kukurice, pričom tieto sú samotné získané z rastlinných buniek kukurice, transformovaných sekvenciou pAR-IAR-PSLGL-LGC a/alebo sekvenciou pTzein-PSLGL-LGC a/alebo sekvenciou pTzein-PSLGL-LGC-KDEL spôsobom opísaným hore, pričom uvedené rekombinantné polypeptidy (A 54) a (A 4) vykazujú účinok lipázy, ako to bolo opísané hore.

Zdanlivé molekulové hmotnosti polypeptidov (a 54) a (A 4) podlá vynálezu sú 37 kDa, respektíve 49 kDa, pokial sú merané analýzou polyakrylovým gélom a imunodetekciou po elektroprenose na nitrocelulóze (táto metóda je detailne opísaná v príkladoch, ktoré nasledujú).

Vynález sa tiež týka protilátok proti rekombinantným polypeptidom podlá vynálezu a osobitne protilátok proti rekombinantnej psej gastrickej lipáze podlá vynálezu a/alebo proti polypeptidu (A 54) a/alebo proti polypeptidu (Δ4), uvedeným hore a schopných tiež rozpoznať ludskú gastrickú lipázu

Takéto protilátky môžu byť získané imunizáciou zvieraťa týmito polypeptidmi, nasledované získaním vzniknutých protilátok.

Rozumie sa samozrejme, že táto produkcia nie je obmedzená na polyklonálne protilátky.

Vynález sa tiež týka všetkých monoklonálnych protilátok, získaných každým hybridomom, ktorý je možné vytvoriť klasickými metódami zo splenických buniek zvieraťa, najmä myši alebo potkana, imunizované proti jednému z purifikovaných polypeptidov podlá vynálezu na jednej strane a z buniek vhodného myelomu na druhej strane a môže byt selektovaný vďaka svojej schopnosti produkovať monoklonálne protilátky, rozoznávajúce hore uvedené polypeptidy, na počiatku použité pre imunizáciu zvieraťa a ludskú gastrickú lipázu.

Vynález sa tiež týka použitia rastlín, častí rastlín, rastlinných buniek a semien, transformovaných spôsobom podľa vynálezu, pre získanie jedného alebo viacerých rekombinantných polypeptidov podľa vynálezu, ako je rekombinantná psia gastrická lipáza alebo polypeptidy z nej odvodené, ako boli definované hore, najmä pre vykonávanie jedného z hore uvedených spôsobov podľa vynálezu, pričom uvedené rekombinantné polypeptidy sú vo forme v podstate čistej alebo obsiahnuté v rastlinných extraktoch s enzymatickým účinkom, tak, ako boli definované hore.

Predmetom vynálezu je tiež použitie rastlín alebo častí rastlín s enzymatickým účinkom podľa vynálezu alebo rastlinných extraktov s enzymatickým účinkom, definovaných hore, alebo tiež rekombinantných polypeptidov podľa vynálezu, ako je rekombinantná psia gastrická lipáza alebo polypeptidy z nej odvodené, definované hore, pre výživu ľudí alebo zvierat

Vynález sa osobitne týka použitia rastlín alebo častí rastlín, najmä listov, plodov a semien s enzymatickým účinkom podľa vynálezu ako potravy.

Z tohto dôvodu je predmetom vynálezu osobitne každá potrava, tvorená rastlinou s enzymatickým účinkom, ako bola opísaná hore, alebo časť takej rastliny, najmä listy alebo plody alebo semená takejto rastliny a ktorá môže byť požívaná buď človekom alebo zvieraťom.

Vynález sa tiež týka každej jedlej alebo kŕmnej zmesi, obsahujúcej jednu alebo viacej rastlín s enzymatickým účinkom, tak, ako boli opísané hore a/alebo časti tejto rastliny alebo týchto rastlín, najmä ich listov a/alebo semien a/alebo plodov a/alebo jedného alebo viacerých rastlinných extraktov s enzymatickým účinkom, tak ako boli opísané hore a/alebo jedného alebo viacerých rekombinantných polypeptidov podlá vynálezu, v prípade potreby spolu s jednou alebo viacerými jedlými alebo kŕmnymi zložkami.

Výhodne sa rastliny alebo časti rastlín, obsiahnuté v hore uvedenej jedlej alebo kŕmnej zmesi, v uvedenej zmesi nachádzajú v rozdrvenom stave.

Pokrmy alebo krmivá podlá vynálezu, nazývané tiež funkčné pokrmy alebo krmivá alebo jedlé alebo kŕmne kompozície podlá vynálezu sú osobitne určené na to, aby uľahčovali absorpciu tukov živočíšneho alebo rastlinného pôvodu, ktoré požilo indivíduum, ktoré je buď zdravé alebo zasiahnuté jednou alebo viacerými patológiami, ktoré ovplyvňujú alebo neovplyvňujú úroveň produkcie gastrických a/alebo pankreatických lipáz. Z tohto dôvodu sú pokrmy a krmivá alebo jedlé alebo kŕmne zmesi podlá vynálezu najmä používané ako doplnky výživy.

Predmetom vynálezu je tiež použitie rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien, alebo rastlinných buniek s enzymatickým účinkom podlá vynálezu alebo rastlinných extraktov s enzymatickým účinkom, tak ako sú definované hore, alebo tiež rekombinantných polypeptidov podlá vynálezu, ako je psia gastrická lipáza alebo polypeptidy od nej odvodené spôsobom opísaným hore, na získanie liečiv (alebo farmaceutických kompozícií), určených na ulahčenie absorpcie tukov živočíšneho alebo rastlinného pôvodu, ktoré požilo indivíduum, ktoré je buď zdravé alebo zasiahnuté jednou alebo viacerými patológiami, ktoré ovplyvňujú alebo neovplyvňujú úroveň produkcie gastrických a/alebo pankreatických lipáz.

Takéto farmaceutické kompozície sú najmä používané u jedincov, ktorí sa podrobujú lekárskemu pôsobeniu, menia39 cemu mechanizmus absorpcie tukov alebo sú tiež používané u starých osôb.

Farmaceutické kompozície podlá vynálezu sú osobitne používané a určené pre liečbu patológií, viazaných k nedostatočnej úrovni lipáz (osobitne gastrickej lipázy alebo lipáz a/alebo pankreatickej lipázy alebo lipáz) v organizmu a osobitne u patológií ako je mucoviscidóza a exokrinná pankreatická nedostatočnosť.

Predmetom vynálezu je osobitne každá farmaceutická kompozícia, zahŕňajúca jeden alebo viacej rastlinných extraktov s enzymatickým účinkom, ako to bolo opísané hore a/alebo jeden alebo viacej rekombinantných polypeptidov podlá vynálezu, v prípade potreby v asociácii s farmaceutický prijatelným vehikulom.

Predmetom vynálezu je osobitne každá hore uvedená farmaceutická kompozícia, zahŕňajúca rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a/alebo polypeptid (Δ54) a/alebo polypeptid (44), vo forme v podstate čistej alebo vo forme rastlinných extraktov opísaných hore.

Farmaceutické kompozície podlá vynálezu sú výhodne podávané cestou orálnou a sú predkladané najmä vo forme kapsúl, tabliet alebo práškov, určených k rozpusteniu.

Denné dávkovanie u človeka je výhodne od zväčša 200 mg do zväčša 1000 mg, podávané výhodne v okamihu hlavného jedla, pokial uvedené farmaceutické kompozície obsahujú enzymatické extrakty, opísané hore a od zväčša 100 mg do zväčša 500 mg, pokial uvedené farmaceutické kompozície obsahujú rekombinantné polypeptidy podlá vynálezu vo forme v podstate čistej.

Predmetom vynálezu je tiež použitie rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien, alebo rastlinných buniek s enzymatickým účinkom pódia vynálezu alebo rastlinných extraktov s enzymatickým účinkom, ako boli definované hore, alebo rekombinantných polypeptidov podľa vynálezu, ako je rekombinantná psia gastrická lipáza alebo od nej odvodené polypeptidy také, ktoré boli definované hore, pre vykonávanie enzymatických reakcií v priemyslovej agroalimentárnej alebo poinohospodársko-priemyslovej oblasti, najmä v priemysle mastných látok, v lipochémii a mllekárstve.

Z tohto dôvodu sa vynález týka každého spôsobu, najmä enzymatickej biokonverzie alebo biokatalýzy, spočívajúceho v uskutočňovaní jednej alebo viacerých enzymatických reakcií v priemyslovej agroalimentárnej alebo poinohospodársko-priemyslovej oblasti, najmä v priemysle mastných látok, v lipochémii a mliekárstve, pričom uvedené enzymatické reakcie sú vykonávané s využitím rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien, alebo rastlinných buniek s enzymatickým účinkom pódia vynálezu alebo rastlinných extraktov s enzymatickým účinkom, ako boli definované hore alebo s využitím rekombinantných polypeptidov pódia vynálezu, ako je rekombinantná psia gastrická lipáza alebo od nej odvodené polypeptidy také, ktoré boli definované hore.

Predmetom vynálezu sú osobitne enzymatické prípravky určené pre priemyslovú, agroalimentárnu alebo poinohospodársko-priemyslovú oblasť, ktoré môžu byt použité v rámci uskutočňovania niektorého zo spôsobov opísaných hore a zahŕňajúce jeden alebo viaceré rastlinné extrakty s enzymatickým účinkom, tak ako boli opísané hore a/alebo jeden alebo viaceré rekombinantná polypeptidy pódia vynálezu, najmä rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a/alebo polypeptid (Ä54) a/alebo poly41 peptid (Δ 4), v prípade potreby spolu s jedným alebo viacerými aditívami alebo ďalším enzýmom alebo ďalšími enzýmami, ktoré môžu byt používané v rámci hore uvedenej priemyslovej aplikácie.

Vynález sa osobitne týka použitia rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien, alebo rastlinných buniek s enzymatickým účinkom podľa vynálezu pre vykonávanie v priemyslovom meradle reakciou enzymatickej biokonverzie alebo biokatalýzy, ako je napríklad hydrolýza alebo enzymatická transesterifikácia.

Výhodne sú rastliny s enzymatickým účinkom alebo časti týchto rastlín, najmä listy a/alebo plody a/alebo semená, alebo rastlinné bunky, získané spôsobom podľa vynálezu, používané súčasne ako enzymatický zdroj a ako reakčný substrát.

Predmetom vynálezu je tiež každý spôsob biokatalýzy, používajúci rastliny alebo časti rastlín, najmä listy a/alebo plody a/alebo semená alebo rastlinné bunky s enzymatickým účinkom a najmä rastliny obsahujúce rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a/alebo polypeptid (Δ54) a/alebo polypeptid (Δ4), v ktorom sú uvedené rastliny alebo uvedené časti rastlín používané súčasne ako enzymatický zdroj a ako reakčný substrát.

Vynález sa najmä týka použitia rastlín s enzymatickým účinkom alebo častí týchto rastlín podľa vynálezu pre získanie biopalív.

Z tohto dôvodu je predmetom predkladaného vynálezu získanie biopalív adíciou alkoholu, najmä metanolu alebo etanolu, k rozdrveným rastlinám alebo častiam rastlín, transformovaných podľa vynálezu, najmä k rozdrveným semenám repky, slnečnice alebo sóji, transformovaným podlá vynálezu, a získanie biopaliva, najmä filtráciou.

Vynález sa tiež týka esterov mastných kyselín rastlinného pôvodu, získaných uskutočňovaním hore opísaného spôsobu, najmä metylesterov kyseliny olejovej.

Vynález sa tiež týka všetkých biopalív, získaných uskutočňovaním spôsobu opísaného hore a najmä všetkých biopalív uvedených hore, obsahujúcich estery mastných kyselín rastlinného pôvodu.

Vynález sa osobitne týka všetkých biopalív získaných uskutočňovaním hore opísaného spôsobu, vychádzajúcich zo semien repky a obsahujúcich metylester kyseliny olejovej.

Vynález sa tiež týka použitia hore uvedených protilátok proti rekombinantným polypeptidom podlá vynálezu na uskutočnenie spôsobu metódy detekcie alebo dávkovania psej gastrickej lipázy alebo ludskej gastrickej lipázy v biologickej vzorke, ktorá ich môže obsahovať.

Vynález sa osobitne týka použitia uvedených protilátok na uskutočnenie spôsobu diagnózy in vitro patológií, viazaných na nadprodukciu alebo naopak na nedostatočnosť alebo dokonca absenciu produkcie lipáz v organizmu.

Tieto spôsoby diagnózy in vitro, vykonávané s využitím biologickej vzorky, odoberanej pacientovi, zahŕňajú etapu umiestnenia uvedenej vzorky do prítomnosti jednej alebo viacerých protilátok podlá vynálezu, nasledovanú etapou detekcie prípadných komplexov protilátka - ludská gastrická lipáza, vytvorených v priebehu predchádzajúcej etapy.

Z tohto dôvodu sa vynález tiež týka súpravy na vykonávanie spôsobu detekcie alebo diagnózy in vitro, uvedenej hore, zahŕňajúcej:

protilátky také, aké boli opísané hore, výhodne značené rádioaktívnym alebo enzymatickým spôsobom, rovnako tak ako reaktanty pre vytvorenie vhodného prostredia pre priebeh imunologickej reakcie medzi uvedenými protilátkami a ľudskou gastrickou lipázou,

- reaktanty, dovoľujúce detekciu imunologických komplexov vytvorených medzi uvedenými protilátkami a ľudskou gastrickou lipázou.

Predmetom vynálezu je osobitne použitie rekombinantnej nukleotidovej sekvencie, obsahujúcej na jednej strane cDNA, znázornenú na obr. 4 a kódujúcu ľudskú gastrickú lipázu (LGH), znázornenú na obr. 5 alebo nukleotidovú sekvenciu odvodenú od tejto cDNA, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jedného alebo viacerých nukleotidov, pričom uvedená sekvencia môže kódovať polypeptid, ktorého sekvencia aminokyselín je identická so sekvenciou aminokyselín ľudskej gastrickej lipázy, znázornenej na obr. 5 alebo polypeptid, odvodený z ľudskej gastrickej lipázy adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, pričom tento polypeptid vykazuje účinok lipázy, a na druhej strane prvky, dovoľujúce rastlinnej bunke produkovať polypeptid, kódovaný uvedenou cDNA alebo hore uvedenou odvodenou sekvenciou, najmä promotor a terminátor transkripcie, rozpoznávané transkripčným mechanizmom rastlinných buniek (a najmä RNA polymerázami uvedených rastlinných buniek), pre transformáciu rastlinných buniek za účelom získania s pomocou týchto buniek rekombinantné psie gastrické lipázy vo forme aktívneho enzýmu alebo jedného alebo viacerých polypeptidov, odvodených od tejto rekombinantnej lipázy, takých, ktoré boli definované hore.

Z tohto dôvodu sa vynález týka každej rekombinantnej nukleotidovej sekvencie, ako bola opísaná hore v rámci transformácie rastlín s cielom získania rekombinantnej psej gastrickej lipázy, v ktorej nukleotidová sekvencia kódujúca psiu gastrickú lipázu a znázornená na obr. 1 alebo na obr.

je nahradená nukleotidovou sekvenciou kódujúcou ludskú gastrickú lipázu a znázornenú na obr. 4.

Predmetom vynálezu sú osobitne nasledujúce rekombinantné nukleotidová sekvencie:

sekvencia (označená pSP-PSLGH-LGH), obsahujúca v smere 5'->3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekvenciu kódujúcu signálny peptid ludskej gastrickej lipázy, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 4 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pSP-PSLPH-LGH), obsahujúca v smere 5'->3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekvenciu kódujúcu signálny peptid ludskej pankreatickej lipázy, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 4 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvencia (označená pSP-PSLGL-LGH), obsahujúca v smere 5'->3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekvenciu kódujúcu signálny peptid králičej gastrickej lipázy (tak ako je opísaný hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 4 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV.

Vynález sa tiež týka vektorov a hostiteľských buniek, transformovaných týmito vektormi, tak ako je to opísané hore, a obsahujúcich hore uvedené rekombinantné nukleotidové sekvencie kódujúce ľudskú gastrickú lipázu a/alebo polypeptidy z nej odvodené.

Predmetom predkladaného vynálezu je tiež každý spôsob výroby rekombinantnej ľudskej gastrickej lipázy vo forme účinného enzýmu a/alebo jedného alebo viacerých polypeptidov, odvodených od tejto lipázy, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, pričom tento odvodený polypeptid alebo polypeptidy vykazujú účinok lipázy, vyznačujúci sa tým, že sa skladá z:

transformácie rastlinných buniek tým, že do genómu týchto buniek sa vloží jedna alebo viacej rekombinantných nukleotidových sekvencii podlá vynálezu, v prípade potreby získania transformovaných rastlín z hore uvedených transformovaných buniek, získania rekombinantnej ludskej gastrickej lipázy a/alebo hore uvedeného polypeptidu alebo polypeptidov, z nej odvodených, produkovaných v hore uvedených transformovaných bunkách alebo rastlinách a to najmä extrakciou, ktorá je v prípade potreby nasledovaná purifikáciou.

Predmetom vynálezu je osobitne každý spôsob výroby rekombinantnej ludskej gastrické lipázy vykonávaním spôsobu, opísaného hore v súvislosti s výrobou rekombinantneej psej gastrickej lipázy alebo od nej odvodených polypeptidov, pomocou hore uvedenej rekombinantnej sekvencie, zahŕňajúcej sekvenciu, znázornenú na obr. 4.

Medzi polypeptidmi, odvodenými od rekombinantnej íudskej gastrickéj lipázy, ktoré môžu byť získané v rámci uskutočňovania spôsobu podía vynálezu je možné uviesť:

polypeptid, obmedzený aminokyselinami, nacházdajúcimi sa v polohách 74 až 398 na obr. 5, ktorý je označovaný ako polypeptid (A54LGH), polypeptid, obmedzený aminokyselinami, nachádzajúcimi sa v polohách 24 až 398 na obr. 5, ktorý je označovaný ako polypeptid (h4LGH).

Vynález sa osobitne týka spôsobu takého, ako bol opísaný hore, pre výrobu rekombinantnej íudskej gastrickéj lipázy a/alebo polypeptidu (A54LGH) a/alebo polypeptidu (Á4LGH), vyznačujúceho sa tým, že zahŕňa:

transformáciu buniek explantátov listov rastliny ich umiestnením do prítomnosti kmeňa Agrobacterium tumefaciens, transformovaného plazmidom, opísaným hore, obsahujúceho rekombinantnú nukleotidovú sekvenciu pSP-PSLGH-LGH a/alebo sekvenciu pSP-PSLPH-LGH a/alebo sekvenciu pSPPSLGL-LGH uvedenú hore, vo vhodnom kultivačnom prostredí, selekciu transformovaných explantátov v prostredí obsahujúcom kanamycín,

- získanie transformovaných rastlín z transformovaných explantátov, uvedených hore, ich kultiváciou vo vhodnom prostredí, extrakciu rekombinantnej íudskej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (A54LGH) a/alebo polypeptidu (A4LGH), najmä rozdrvením listov a/alebo semien a/alebo plodov hore uvedených transformovaných rastlín vo vhodnom tlmivom roztoku centrifugáciou a získaním supernatantu predstavujúceho rastlinný extrakt s enzymatickým účinkom, v prípade potreby purifikáciu rekombinantnej ľudskej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (454LGH) a/alebo polypeptidu (A4LGH) z extraktu, získaného v predchádzajúcej etape, najmä chromatografiou supernatantu, čo vedie k získaniu rekombinantnej ľudskej gastrickej lipázy a/alebo polypeptidu (A54LGH) a/alebo polypeptidu (A4LGH), vo forme v podstate čistej.

Vynález sa tiež týka každej rastliny alebo časti tejto rastliny, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien, obsahujúcich jednu alebo viac rekombinantných nuklotidových sekvencii opísaných hore podľa vynálezu, ktoré sú stálym spôsobom integrované do ich genómu.

Predmetom vynálezu je tiež každý rastlinný extrakt s enzymatickým účinkom, osobitne s účinkom lipázy, definovaným hore, získaný vykonávaním jedného zo spôsobov opísaných hore, obsahujúci ako účinný enzým jeden alebo viacej rekombinantných polypeptidov podľa vynálezu, ako je rekombinantná ľudská gastrická lipáza a/alebo polypeptid (454LGH) a/alebo polypeptid (A4LGH).

Predmetom vynálezu sú osobitne extrakty z listov a/alebo semien rastlín, získané transformáciou buniek explantátov týchto rastlín sekvenciou pSP-PSLGH-LGH a/alebo sekvenciou pSP-PSLPH-LGH a/alebo sekvenciou pSP-PSLGL-LGH jedným z hore opísaných spôsobov, a obsahujúce rekombinantnú ľudskú gastrickú lipázu a/alebo polypeptid (Á54LGH) a/alebo polypeptid (A4LGH), najmä:

extrakt listov alebo semien tabaku, získaný transformáciou buniek explantátov listov tabaku sekvenciou pSP-PSLGH-LGH a/alebo sekvenciou pSP-PSLPH-LGH a/alebo sekvenciou pSP-PSLGL-LGH spôsobom opísaným hore a obsahujúci polypeptid (&54LGH) spolu s polypeptidom (A4LGH), pričom hmotnostné percento zmesi týchto dvoch polypeptidov vzhľadom k celkovej hmotnosti proteínov prítomných v uvedenom extrakte je od okolo 0,1 % do okolo 20 % a enzymatický účinok uvedeného extraktu je od okolo 100 U na gram čerstvej hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvej hmotnosti, extrakt listov tabaku, získaný transformáciou buniek explantátov listov tabaku sekvenciou pSP-PSLGL-LGH spôsobom opísaným hore a obsahujúci polypeptid (A4LGH), pričom hmotnostné percento tohto polypeptidu vzhľadom k celkovej hmotnosti proteínov prítomných v uvedenom extrakte je od okolo 0,1 % do okolo 20 % a enzymatický účinok uvedeného extraktu je od okolo 100 U na gram čerstvej hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvej hmotnosti.

Predmetom predkladaného vynálezu je tiež každá enzymaticky účinná rekombinantná ľudská gastrická lipáza, ktorej sekvencia aminokyselín je sekvencia, znázornená na obr. 5 alebo polypeptid, odvodený od tejto lipázy, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, a osobitne polypeptid (A54LGH) a polypeptid (Ä4LGH), pričom tieto odvodené polypeptidy vykazujú účinok lipázy, ktoré sú získané vo forme v podstate čistej uskutočňovaním jedného zo spôsobov podľa vynálezu, opísaných hore, pričom tieto spôsoby zahŕňajú etapu purifikácie rekombinantných polypeptidov podľa vynálezu, najmä chromatografiou hore opísaných enzymatických extraktov.

Ako bolo opísané hore v rámci opisu rekombinantnej psej gastrickej lipázy, predmetom vynálezu sú tiež:

polyklonálne a monoklonálne protilátky proti rekom· binantnej ľudskej gastrickej lipáze alebo polypeptidom od nej odvodeným podľa vynálezu a ich aplikácia, ako to bolo opísané hore, pokrmy a krmivá alebo jedlé a kŕmne zmesi alebo farmaceutické kompozície alebo enzymatické prípravky s priemyslovým určením na báze rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien alebo rastlinné bunky alebo rastlinné extrakty s enzymatickým účinkom také, aké boli opísané hore, alebo nakoniec rekombinantná ľudská gastrická lipáza alebo polypeptidy od nej odvodené podľa vynálezu, každý spôsob enzymatickej biokonverzie alebo biokatalýzy alebo výroby biopalív, ako boli opísané hore, vykonávaný na základe rekombinantnej ľudskej gastrickej lipázy alebo polypeptidov od nej odvodených podľa vynálezu alebo na základe rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien a/alebo na základe rastlinných extraktov s enzymatickými účinkami takými, aké boli opísané hore.

Príklady rozpracovania vynálezu

I. KONŠTRUKCIE CHIMÉRICKÝCH GÉNOV KÓDUJÚCICH REKOMBINANTNÉ PROTEÍNY PSEJ GASTRICKEJ LIPÁZY A DOVOĽUJÚCE EXPRESIU V LISTOCH A SEMENÁCH ĽUĽKOVITÝCH RASTLÍN

I-A) Konštrukcia chimérických génov kódujúcich rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a dovoľujúca expresiu v tabaku

Expresia génu kódujúceho psiu gastrickú lipázu (LGC) v listoch a semenách tabaku vyžaduje nasledujúce regulačné sekvencie:

1. dvojitý konštitutívny promotor 35S (pd35S) vírusu CaMV (vírus mozaiky karfiolu).

Tento promotor zodpovedá duplikácii aktivačnej sekvencie, umiestnenej pred prvkom TATA prírodného promotoru 35S (Kay a kol., 1987);

2. terminálnu sekvenciu transkripcie, terminátor polyA 35S, ktorý zodpovedá nekódujúcej oblasti 3' sekvencie vírusu s dvojvláknovou kruhovou DNA mozaiky karfiolu, produkujúcu transkript 35S (Franck a kol., 1980).

Konštrukcia rôznych plazmidov použitím techník rekombinantnej DNA (Sambrook a kol., 1989) vychádza z pBIOC4. Tento binárny plazmid je odvodený z pGA492 (An, 1986), ktorý obsahuje medzi pravým a ľavým okrajom, keď sa vychádza z plazmidu pTiT37 Agrobacterium tumefaciens, na svojej DNA, nasledujúce sekvencie:

konštitutívny promotor génu nos kódujúceho nopalinsyntázu (Depicker a kol., 1982), kódujúca sekvencia génu nptll kódujúca neomycín fosfotransferázu II (Berg a Berg, 1983) vynechaná z oblasti prvých 8 kodónov, medzi ktorými je kodón iniciátor metionín ATG a pripojená k sekvencií prvých 14 kodónov sekvencie kódujúcej gén nos (Depicker a kol., 1982), sekvencia kódujúca gén nos zbavená oblasti prvých 14 kodónov, terminátor nos (Depicker a kol., 1982), oblasť obsahujúca viacnásobné miesta klonovania (tiež nazývaná polylinker) (HindlII-Xbal-SacI-Hpal-KpnI-Clal-BglII) predchádzajúca génu cat, kódujúcemu chloramfenikol acetyltransferázu (Close a Rodriguez, 1982) a terminačné sekvencie génu 6 plazmidu pTiA6 Agrobacterium tumefaciens (Liu a kol., 1993). Pre elimináciu takmer celej kódujúcej sekvencie génu cat bol plazmid pGA492 dvojnásobne natrávený pomocou Sací (reštrikčné miesto polylinkeru) a Seal (reštrikčné miesto prítomné v sekvencií génu cat) a potom podrobený pôsobeniu enzýmu T4 DNA polymerázy (New England Biolabs) podlá odporúčania výrobca. Ligácia modifikovaného plazmidu (20 ng) bola vykonaná v reakčnom prostredí s 10 μΐ, obsahujúcom 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligázy x 10 (Amersham); 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri 14 °C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escheríchia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 μg/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Potom bolo reštrikčné miesto HindlII plazmidovej DNA získaného klonu modifikované v reštrikčnom mieste EcoRI pomocou fosforylovaného adaptoru HindlII-EcoRI (Stratagene Cloning Systems). Pre realizáciu tejto modifikácie bolo 500 ng plazmidovej DNA získaného klonu natrávených pomocou HindlII, defosforylovaných enzýmom alkalickej fosfatázy telacieho čreva (Boehringer Mannheim) podlá odporúčania výrobca a koprecipitovaných v prítomnosti 1500 ng DNA adaptoru HindlII-EcoRI, 1/10 objemu octanu sodného 3M pH 4,8 v 2,5 objemoch čistého etanolu pri -80°C počas 30 minút. Po centrifugácii pri 12000 g 30 minút bola precipitovaná DNA premývaná v 70% etanole, sušená, vybratá v 8 μΐ vody, privedená na 65°C počas 10 minút, potom ligováná v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri 14°C počas 16 hodín. Po inaktivácii T4 DNA ligázy pri 65°C 10 minút bola ligačná reakčná zmes natrávená pomocou EcoRI, purifikovaná elektroforézou na géli agarózy 0,8 %, elektrovymývaná (Sambrook a kol., 1989), precipitovaná v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri -80°C počas 30 minút, centrifugovaná pri 12000 g počas 30 minút, premývaná v 70% etanole, sušená a potom ligovaná ako je to opísané hore. Predbežne pripravené baktérie Escheríchia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, selektovaná na 12 μ9/πι1 tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením najmä pomocou Hindlll a EcoRI. Vzniknutý binárny plazmid, ktorý už obsahuje len 9 posledných kodónov sekvencie kódujúcej gén cat a ktorého miesto EcoRI je jediné, bol nazvaný pBIOC4.

Kazeta expresie, konštituovaná promotorom pd35S a terminátorom polyA 35S, bola izolovaná z plazmidu pJIT163á Plazmid pJIT163Áje odvodený z plazmidu pJIT163, ktorý samotný je odvodený z plazmidu pJIT60 (Guerineau a Mullineaux, 1993). Plazmid pJIT163 obsahuje kodón ATG medzi miestami Hindlll a Sali polylinkeru. Pre odstránenie tohto ATG a získanie plazmidu pJIT163A bola plazmidová DNA plazmidu pJIT163 dvojnásobne natrávená pomocou Hindlll a Sali, purifikovaná elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaná (Sambrook a kol., 1989), precipitovaná v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri -80°C počas 30 minút, centrifugovaná pri 12000 g počas 30 minút, premývaná v 70% etanole, sušená, podrobená pôsobeniu Klenowho enzýmu (New England Biolabs) podlá odporúčania výrobca, deproteinizovaná extrakciou 1 objemom zmesi fenol: chloroform: izoamylalkohol (25:24:1) a potom 1 objemom zmesi chloroform: izoamylalkohol (24:1), precipitovaná v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri -80°C počas 30 minút, centrifugovaná pri 12000 g počas 30 minút, premývaná v 70% etanole, sušená a nakoniec ligovaná v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a ana53 lyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Pre izoláciu kazety expresie konštituovanej promotorom pd35S a terminátorom polyA 35S (fragment Sacl-Xhol) bola plazmidová DNA získaného klonu pJIT163A natrávená pomocou Sací a Xhol. Fragment Sacl-Xhol, nesúci kazetu expresie bol purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), precipitovaný v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C počas 30 minút, centrifugovaný pri 12000 g počas 30 minút, premývaný v 70% etanole, sušený, podrobený pôsobeniu enzýmu Mung Bean Nuclease (New England Biolabs) podlá odporúčania výrobca. Tento purifikovaný inzert (200 ng) bol klonovaný do plazmidovej DNA pBIOC4 (20 ng), natrávanej EcoRI, ošetrený enzýmom Mung Bean Nuclease a defosforylovaný enzýmom alkalickej fosfatázy telacieho čreva (Boehringer Mannheim) podlá odporúčania výrobca. Reakcia ligácie bola vykonaná v 20 μΐ v prítomnosti 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligázci (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný PBIOC21.

Psia gastrická lipáza (LGC) je prirodzene syntetizovaná vo forme prekurzoru. Maturovaný proteín psej gastrické lipázy je tvorený 379 aminokyselinami. Komplementárna DNA psej gastrickej lipázy bola klonovaná do miest GblII a Sali vektoru expresie pRU303, vedúcemu na vektor pDGL5.303 opísaný v medzinárodnej patentovej prihláške č. WO 94/13816. Ten bol použitý pre konštrukciu binárnych plazmidov pBIOC25, ktorý obsahuje PS-LGC a pBIOC26, ktorý obsahuje PPS-LGC, kde sekvencia kódujúca maturovanú psiu gastrickú lipázu je predchádzaná sekvenciou kódujúcou signálny peptid (PS) alebo prepropeptid (PPS, to znamená signálny peptid, nasledovaný N-terminálnymi sekvenciami vakuolárneho smerovania) rastlinného pôvodu. Sekvencie PS a PPS, tvorené 23 respektíve 37 aminokyselinami, sú sekvencie rezervného proteínu zhluzovaných koreňov sladkého zemiaku: sporamínu A (Murakami a kol., 1986; Matsukoa a Nakamura, 1991).

Pre zjednodušenie fúzie medzi sekvenciou maturovanej psej gastrickej lipázy a sekvenciou signálov smerovania, PS a PPS, bol plazmid pDGL5.303 modifikovaný vložením doplnkového reštrikčného miesta Hindlll do štvrtého a piateho kodónu sekvencie maturovanej psej gastrickej lipázy mutagenézou, riadenou PCR s použitím 2 oligodesoxynukleotidov,

5' caggagaatc TTG TTT GGA AAG CTT CAT CCC 3' (obsahujúci jediné miesto BglII plazmidu a prinášajúci dodatkové miesto Hindlll) a

5' CAT ATT CCT CAG CTG GGT ATC 3' (obsahujúci jediné miesto PvuII plazmidu).

Amplifikácie fragmentu BglII-PvuII pomocou PCR boli vykonané v 100 ml reakčného prostredia, obsahujúceho 10 ml tlmivého roztoku Taq DNA polymerázy 10 (500 mM KC1, 100 mM Tris-Hcl, pH 9,0 a 1 % Triton 100), 6 μΐ 25 mM MgCl₂, 3 μΐ 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP a dTTP), 100 pM každého z hore opísaných dvoch oligodesoxynukleotidov, 5 ng DMA matrice (vektor expresie pRU303, obsahujúci komplementárnu DNA psej gastrickej lipázy) 2,5 U Taq DNA polymerázy (Promega) a 2 kvapky vazelínového oleja. DNA bola denaturovaná pri teplote 94°C počas 5 minút, podrobená 30 cyklom, pričom každý sa skladal z 1 minúty denaturácie pri teplote 94°C, 1 minúty hybridizácie pri teplote 50°C a 1 minúty elongácie pri teplote 72°C a potom elongácia pri teplote 72°C pokračovala 5 minút. Tato reakcia PCR bola vykonaná v prístroji DNA Thermal Cycler spoločnosti PERKIN-ELMER CETUS. Olej bol eliminovaný extrakciou v chloroformu. Potom boli fragmenty DNA, obsiahnuté v reakčnom prostredí, precipitované v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C počas 30 minút, centrifugované pri 12000 g počas 30 minút, premývané v 70% etanolu sušené a natrávené dvoma reštrikčnými enzýmami BglII a PvuII Natrávené fragmenty DNA, vzniknuté z PCR, boli purifikované elektroforézou na 2% agarózovom géli, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), precipitované v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C počas 30 minút, centrifugované pri 12000 g počas 30 minút, premývané v 70% etanolu, sušené a potom ligované do plazmidovej DNA vektoru pDGL5.303, dvojnásobne natráveného pomocou BglII a PvuII, purifikovanej elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývané, podrobené precipitácii v alkohole, sušené a defosforylované enzýmom alkalickej fosfatázy teľacieho čreva (Boehringer Mannheim) podľa odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 100 ng defosforylovaného vektoru, opísaného hore a 50 ng fragmentov natrávenej DNA, získanej z PCR amplifikácie, opísanej hore, v 10 μΐ reakčného prostredia v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Plazmidová DNA niektorých získaných klonov bola verifikovaná sekvenovaním s pomocou sekvenačnej súpravy T7™, predávanej spoločností Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Vloženie tohto reštrikčného miesta HindlII nemodifikuje genetický kód psej gastrickej lipázy. Prirodzená sekvencia psej gastrickej lipázy AAA TTA (Lys-Leu) sa totiž stane (AAG CTT (Lys-Leu). Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC22 a obsahuje sekvenciu maturovaného proteinu psej gastrickej lipázy, zodpovedajúcu:

LEU PHE GLY LYS LEU---THR ASP ASN LYS AMB agatcTTG TTT GGA AAG CCT---ACA GAT AAT AAG TAG TTCTAGA

BglII

HindlII

Xbal jediné reštrikčné miesta jediné reštrikčné miesto

LEU: prvý kodón maturovanej psej gastrickej lipázy,

AMB: stop-kodón.

a) KONŠTRUKCIA BINÁRNEHO PLAZMIDU pBIOC25, OBSAHUJÚCEHO PS-LGC

Plazmid pBIOC22 bol úplne natrávený pomocou BglII a čiastočne pomocou HindlII, aby bola odstránená sekvencia kódujúca polypeptid Leu-Phe-Gly-Lys (4 prvé aminokyseliny) maturovaného proteinu psej gastrickej lipázy. Táto sekvencia bola nahradená sekvenciou, kódujúcou signálny peptid PS s 23 aminokyselinami (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC) , pripojenými na aminokyseliny prvých štyroch kodónov v sekvencii, kódujúcej maturovaný proteín psej gastrickej lipázy (PS-4 prvé kodóny maturovanej psej gastrickej lipázy). Sekvencia PS-4 prvé kodóny maturovanej psej gastrickej li57 pázy bola amplifikovaná pomocou PCR, pri vyjdení z plazmidu pMAT103 (Matsuoka a Nakamura, 1991) pomocou dvoch nasledujúcich oligodesoxynukleotidov:

5' caggagggatctgATC AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' a

5' G ATG AAG CTT TCC AAA CAA GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G 3' pri postupu podľa protokolu amplifikácie PCR, ktorý bol opísaný hore v odseku I. Po dvojnásobnom enzymatickom natrávení pomocou BglII a HindlII boli fragmenty DNA, vyšlé z amplifikácie PCR, purifikované elektroforézou na agarózovom géli 2 %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), precipitované v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C počas 30 minút, centrifugované pri 12000 g počas 30 minút, premývané v 70% etanole, sušené, potom ligované do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC22, dvojnásobne natrávené pomocou BglII a HindlII, purifikované elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), podrobené precipitácii v alkohole, sušené a defosforylované enzýmom alkalickej fosfatázy teľacieho čreva (Boehringer Mannheim) podľa odporúčania výrobca. Ligácia bola uskutočnená s 100 ngjhore opísaného defosforylovaného vektoru a 50 ng natrávených fragmentov DNA, vzišlých z amplifikácie PCR, opísanej hore, v reakčnom prostredí 10 μΐ v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14’C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan,

1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým netrávením reštrikčnými enzýmami. Plazmidová DNA niektorých získaných klonov bola verifikovaná sekvenovaním pomocou sekvenačnej súpravy T7 , predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Sekvencie

PS a maturovanej psej gastrickej lipázy boli klonované, pričom ich čítacie rámce boli udržované otvorené. Miesto štiepenia medzi sekvenciami PS a maturovanou psou gastrickou lipázou je Ser-Leu. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC23. Vyjdením z pBIOC23 bol izolovaný fragment BglII-Xbal, nesúci sekvenciu PS-LGC, dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocou BglII a Xbal, purifikáciou elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaním (Sambrook a kol., 1989), alkoholickou precipitáciou a sušením. Potom bol tento DNA fragment ošetrený Klenowovým enzýmom podľa odporúčania výrobca a ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC21, natrávenej v mieste HindlII, ošetrenej podľa Klenowa a defosforylovanej enzýmom alkalickej fosfatázy teľacieho čreva (Boehringer Mannheim) podľa odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng defosforylovaného vektoru opísaného hore a 200 ng fragmentov DNA, obsahujúcich PS-LGC, opísaných hore, v 20 ml reakčného prostredia v prítomnosti 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 ml 50% polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 μg/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC25. Nukleotidová sekvencia fragmentov, kódujúcich rekombinantný proteín PS-LGC bola verifikovaná sekvenovaním pomocou sekvenačnej súpravy T7™, predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Plazmidová DNA binárneho vektoru pBIOC25 bola vložená priamou transformáciou do kmeňa LBA4404 Agrobacterium tumefaciens spôsobom podľa Holstersa a kol., (1978). Platnosť získaného klonu bola overená enzymatickým natrávením vloženej plazmidovej DNA.

b) KONŠTRUKCIA BINÁRNEHO PLAZMIDU pBIOC26, OBSAHUJÚCEHO PPS-LGC

Plazmid pBIOC22 bol úplne natrávený pomocou BglII a čiastočne pomocou Hindlll, aby bola odstránená sekvencia kódujúca polypeptid Leu-Phe-Gly-Lys matúrovaného proteinu psej gastrickej lipázy. Táto sekvencia bola nahradená sekvenciou, kódujúcou signálny peptid PPS s 23 aminokyselinami (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC AGG TTC AAT CCC ATC CGC CTC CCC ACC ACA CAC GAA CCC GCC) , pripojenými na aminokyseliny prvých štyroch kodónov v sekvencii, kódujúcej maturovaný protein psej gastrickej lipázy (PPS-4 prvé kodóny maturovanej psej gastrické lipázy). Sekvencia PPS-4 prvé kodóny maturovanej psej gastrickej lipázy bola amplifikovaná pomocou PCR, vyšlej z plazmidu pMAT103 (Matsuoka a Nakamura, 1991) pomocou dvoch nasledujúcich oligodesoxynukleotidov:

5' caggagatctgATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3 ' a

5' G ATG AAG CTT TCC AAA CAA GGC GGG TCC GTG TGT GGT TG 3' pri postupe podlá protokolu amplifikácie PCR, ktorý bol opísaný hore v odseku I. Po dvojnásobnom enzymatickom natrávení pomocou BglII a Hindlll boli fragmenty DNA, vyšlé z amplifikácie PCR, purifikované elektroforézou na agarózovom géli 2 %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), precipitované v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C počas 30 minút, centrifugované pri 12000 g počas 30 minút, premývané v 70% etanole, sušené, potom ligované do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC22, dvojnásobne natrávené pomocou BglII a Hindlll, purifikované elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), podrobené precipitácii v alkohole, sušené a defosforylované enzýmom alkalickej fosfatázy telacieho čreva (Boehringer Mannheim) podlá odporú60 čania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 100 ng hore opísaného defosforylovaného vektoru a 50 ng natrávených fragmentov DNA, vzišlých z amplifikácie PCR, opísanej hore, v reakčnom prostredí 10 μΐ v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami.

Plazmidová DNA niektorých získaných klonov bola verifikovaná sekvenovanim pomocou sekvenacnej súpravy T7^X , predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Sekvencie PPS a maturované psie gastrické lipázy boli klonované, pričom ich čítacie rámce boli udržované otvorené. Miesto štiepenia medzi sekvenciami PPS a maturovanou psou gastrickou lipázou je Ala-Leu. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC24. Vyjdením z pBIOC24 bol izolovaný fragment BglII-Xbal, nesúci sekvenciu PPS-LGC, dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocou BglII a Xbal, purifikáciou elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaním (Sambrook a kol., 1989), alkoholickou precipitáciou a sušením. Potom bol tento DNA fragment ošetrený Klenowovým enzýmom podlá odporúčania výrobca a ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC21, natrávenej v mieste HindlII, ošetrenej podlá Klenowa a defosforylovanej enzýmom alkalickej fosfatázy telacieho čreva (Boehringer Mannheim) podlá odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng defosforylovaného vektoru opísaného hore a 200 ng fragmentov DNA, obsahujúcich PPS-LGC, opísaných hore, v 20 μΐ reakčného prostredia v prítomnosti 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14’C počas 16 hodín.

Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 μ9/πι1 tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC26. Nukleotidová sekvencia fragmentov, kódujúcich rekombinantný proteín PPS-LGC bola verifikovaná sekvenovanim pomocou sekvenacnej súpravy T7 , predávanej spoločnosťou Pharmacia, metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Plazmidová DNA binárneho vektoru pBIOC26 bola vložená priamou transformáciou do kmeňa LBA4404 Agrobacterium tumefaciens spôsobom podía Holstersa a kol. (1978). Platnosť získaného klonu bola overená enzymatickým natrávením vloženej plazmidovej DNA.

c) KONŠTRUKCIA BINÁRNEHO PLAZMIDU pBIOC41, OBSAHUJÚCEHO PSLGL-LGC

Králičia gastrická lipáza bola syntetizovaná vo forme prekurzoru, skladajúceho sa zo signálneho peptidu s 22 aminokyselinami, nachádzajúceho sa na NH^-konci a predchádzajúceho polypeptidovú sekvenciu maturovanej lipázy.

Kloň pJOlOl, obsahujúci kompletnú cDNA kódujúcu králičiu gastrickú lipázu je opísaný v prihláške európskeho patentu č. 92 403 055.4, ktorú predložil 12.11.92 Inštitút de Recherche Jouveinal a ktorá sa nazýva Acides nukléiques codant pour la lipase gastrique de lapin et derivés polypeptidiques, leur utilisation pour la production de ces polypeptides, et compositions pharmaceutiques á base de ces derniers (Nukleové kyseliny, kódujúce králičiu gastrickú lipázu a odvodené polypeptidy, ich použitie pre výrobu týchto polypeptidov a farmaceutické kompozície na základe týchto polypeptidov).

Porovnanie polypeptidovej sekvencie psej gastrickej lipázy a prekurzoru králičej gastrickej lipázy ukázalo, že sekvencia LFGK sa nachádza v obidvoch proteínoch. V polypeptidovej sekvencii králičej lipázy, určenej na základe prirodzeného purifikovaného proteinu (Moreau a kol., 1988), chýbajú tri prvé rezíduá L,F a G a tvoria čaši signálneho peptidu s 22 aminokyselinami králičej gastrickej lipázy. Na základe toho bol signálny peptid králičej gastrickej lipázy, zbavený týchto troch prvých spoločných aminokyselín, fúzovaný do maturovanej proteínovej sekvencie psej gastrickej lipázy. Jeho polypeptidová sekvencia je tvorená nasledujúcimi 19 aminokyselinami; MWVLFMVAALLSALGTTHG.

Plazmid pBIOC22 bol teda úplne natrávený pomocou BglII a čiastočne pomocou HindlII, aby bola odstránená sekvencia kódujúca polypeptid Leu-Phe-Gly-Lys (4 prvé aminokyseliny) maturovaného proteinu psej gastrickej lipázy. Táto sekvencia bola nahradená sekvenciou, kódujúcou signálny peptid LSLGL králičej gastrickej lipázy s 19 aminokyselinami {ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT}, pripojenými na aminokyseliny prvých štyroch kodónov v sekvencii, kódujúcej maturovaný proteín psej gastrickej lipázy (PSLGL-4 prvé kodóny maturovanej psej gastrickej lipázy). Sekvencia PSLGL-4 prvé kodóny maturovanej psej gastrickej lipázy bola amplifikovaná pomocou PCR, vzišlá z plazmidu pJOlOl pomocou dvoch nasledujúcich oligodesoxynukleotidov;

5' aggagatctcaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG 3' a

5' G ATG AAG CTT TCC AAA ACC ATG TGT AGT TCC AAG TG 3 ' pri postupe podlá protokolu amplifikácie PCR, ktorý bol opísaný hore v odseku I. Po dvojnásobnom enzymatickom natrávení pomocou BglII a HindlII boli fragmenty DNA, vyšlé z amplifikácie PCR, purifikované elektroforézou na agarózovom géli %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), precipitované v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C počas 30 minút, centrifugované pri 12000 g počas 30 minút, premývané v 70% etanole, sušené, potom ligované do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC22, dvojnásobne natrávené pomocou BglII a HindlII, purif ikované elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), podrobené precipitácii v alkohole, sušené a defosforylované enzýmom alkalickej fosfatázy telacieho čreva (Boehringer Mannheim) podlá odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 100 ng hore opísaného defosforylovaného vektoru a 50 ng natrávených fragmentov DNA, vzišlých z amplifikácie PCR, opísanej hore, v reakčnom prostredí 10 μΐ v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan,

1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Plazmidová DNA niektorých získaných klonov bola verifikovaná sekvenovaním pomocou sekvenačnej súpravy T7™, predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Sekvencie PSLGL a maturovanej psej gastrickej lipázy boli klonované, pričom ich čítacie rámce boli udržované otvorené. Miesto štiepenia medzi sekvenciami PSLGL a matúrovanou psou gastrickou lipázou je Gly-Leu. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC40. Vyjdením z pBIOC40 bol izolovaný fragment BglII-Xbal, nesúci sekvenciu PSLGL-LGC, dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocou BglII a Xbal, purifikáciou elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaním (Sambrook a kol., 1989), precipitáciou v alkohole a sušením. Potom bol tento DNA fragment ošetrený Klenowovým enzýmom podlá odporúčania výrobca a ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC21, na64 trávenej v mieste HindlII, ošetrenej podlá Klenowa a defosforylovanej enzýmom alkalickej fosfatázy telacieho čreva (Boehringer Mannheim) podlá odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng defosforylovaného vektoru opísaného hore a 200 ng fragmentov DNA, obsahujúcich PSLGL-LGC, opísaných hore, v 20 μΐ reakčného prostredia v prítomnosti 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan,

1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 μg/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC41. Nukleotidová sekvencia fragmentov, kódujúcich rekombinantný proteín PSLGL-LGC bola verifikovaná sekveno> > TM 4 vamm pomocou sekvenacnej súpravy T7 , predávanej spoločnosťou Pharmacia, metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Plazmidová DNA binárneho vektoru pBIOC41 bola vložená priamou transformáciou do kmeňa LBA4404 Agrobacterium tumefaciens spôsobom podlá Holstersa a kol., (1978). Platnosť získaného klonu bola overená enzymatickým natrávením vloženej plazmidovej DNA.

II. KONŠTRUKCIE CHIMÉRICKÝCH GÉNOV KÓDUJÚCICH REKOMBINANTNÝ PROTEÍN PSEJ GASTRICKEJ LIPÁZY A DOVOĽUJÚCE EXPRESIU V SEMENÁCH REPKY

a) Konštrukcia binárneho plazmidu pBIOC28 obsahujúceho promotor pCRU

Expresia génu kódujúceho psiu gastrickú lipázu (LGC) v semenách repky vyžaduje vloženie cDNA,, kódujúcej psiu gastrickú lipázu medzi nasledujúce regulačné sekvencie:

1. promotor pCRU, zodpovedajúci nekódujúcej oblasti 5' génu rezervného proteínu semien, kruciferínu A reďkovky (DepignyThis a kol., 1992) a dovoľujúci špecifickú expresiu v semenách;

2. terminálna sekvencia transkripcie, terminátor polyA 35S, ktorý zodpovedá nekódujúcej oblasti 3' sekvencie vírusu s dvojvláknovou kruhovou DNA mozaiky karfiolu, produkujúci transkript 35S (Franck a kol., 1980).

Pre získanie binárneho plazmidu podobného pBIOC21, ale takého, že jeho promotor pd35S bol nahradený promotorom pCRU, bol izolovaný fragment EcoRI, ošetrený podľa KlenowaBamHI, obsahujúci promotor pCRU, z plazmidu pBI221-CRURSP, odvodeného z pBI221 (predávaného spoločnosťou Clontech) nahradením promotoru 35S promotorom pCRU.

Fragment EcoRI, ošetrený podľa Klenowa-BamHI, nesúci promotor pCRU bol purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), podrobený precipitácii v alkohole, sušený a ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pJIT163 (opísaného v paragrafu I.), natrávený pomocou Kpnl, ošetrený pomocou T4 DNA polymerázy (New England Biolabs) podľa odporúčania výrobca, potom natrávený pomocou BamHI, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), podrobený precipitácii v alkohole, sušený a defosforylovaný enzýmom alkalickej fosfatázy teľacieho čreva (Boehringer Mannheim) podľa odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng hore opísaného defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentov EcoRI, ošetrený podľa Klenowa-BamHI, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 20 μΐ, obsahujúcim 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené ba66 ktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii v prostredí, obsahujúcom 50 M-g/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBl0C27.

Kazeta expresie, konštituovaná promotorom pCRU a terminátorom polyA 35S, bola izolovaná z plazmidu pBIOC27 úplným natrávením pomocou Xhol, nasledovaným čiastočným natrávením pomocou EcoRI. Byla purifikovaná elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaná (Sambrook a kol., 1989), podrobená precipitácii v alkohole, sušená, podrobená pôsobeniu Klenowho enzýmu (New England Biolabs) podľa odporúčania výrobca a ligovaná do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC24 v mieste EcoRI, ošetrenom podľa Klenowa a defosforylovanom enzýmom alkalickej fosfatázy teľacieho čreva (Boehringer Mannheim) podľa odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng hore opísaného defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentov Xhol-EcoRI, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 20 μΐ v prítomnosti 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 μg/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný PBIOC28.

b) Konštrukcia binárneho plazmidu pBIOC29, obsahujúceho PPS-LGC

Izolácia fragmentu BglIII-Xbal, nesúceho sekvenciu PPS-LGC z plazmidu pBIOC24 bola už opísaná v I-A-b. Tento fragment bol ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC28 v mieste EcoRI, ošetrenom podía Klenowa a defosforylovanom enzýmom alkalickej fosfatázy (Boehringer Mannheim) podía odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng hore opísaného defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentov BglIII-Xbal, obsahujúcich PPS-LGC, v reakčnom prostredí 20 μΐ v prítomnosti tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amer sham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekci na 12 μg/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC29. Nukleotidová sekvencia rekombinantného proteínu PPS-LGC bola verifikovaná sekvenovanim pomocou sekvenacnej súpravy T7·¹· , predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Plazmidová DNA binárneho vektoru pBIOC29 bola vložená priamou transformáciou do kmeňa LBA4404 Agrobacterium tumefaciens spôsobom podía Holstersa a kol., (1978). Platnosť získaného klonu bola overená enzymatickým natrávením vloženej plazmidovej DNA.

c) Konštrukcia binárnych plazmidov pBIOC90 a pBIOC91 obsahujúcich promotor pGEAlD

Expresia živočíšneho génu kódujúceho psiu gastrickú lipázu (LGC) v semenách repky vyžaduje nasledujúce regulačné sekvencie:

1. promotor pGEAl, zodpovedajúci nekódujúcej oblasti 5' génu rezervného proteinu semien, GEA1 Arabidopsis thaliana (Gaubier a kol., 1993) a dovoľujúci špecifickú expresii v semenách;

2. terminálna sekvencia transkripcie, terminátor polyA 35S, ktorý zodpovedá nekódujúcej oblasti 3' sekvencie vírusu s dvojvláknovou kruhovou DNA mozaiky karfiolu, produkujúci transkript 35S (Franck a kol., 1980).

Pre získanie binárneho plazmidu pBIOC90, podobného pBIOC21, ale takého, že jeho promotor pd35S bol nahradený promotorom pGEAlD, bol izolovaný fragment HindlII-BamHI, ošetrený podlá Klenowa, obsahujúci promotor pGEAl, z plazmidu pGUS2-pGEAl. Kloň pGUS-2-pGEAl, odvodený z pBI221 nahradením promotoru p35S promotorom pGEAl, obsahuje 2 ATG vo fáze: ATG génu GEA1 (Em2) a ATG génu gus. ATG génu GEA1 bol deštruovaný. Fragment DNA, nachádzajúci sa medzi miestami Sali a sekvenciami pred ATG génu GEA1 klonu pGUS-2-pGEAl bol amplifikovaný pomocou PCR s pomocou nasledujúcich dvoch nukleotidov:

5' CAAACGTGTACAATAGCCC 3' a

5' CCCGGGGATCCTTTTTTG 3'.

Hybridizačná teplota bola upravená. Fragment, amplifikovaný pomocou PCR bol natrávený pomocou Sali a BamHI, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 2 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), precipitovaný v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C počas 30 minút, centrifugovaný pri 12000 g počas 30 minút, premývaný 70% etanolom, sušený a ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pGUS-2-GEAl, dvojnásobne natráveného pomocou Sali a BamHI, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol.,

1989), podrobený precipitácii v alkohole a sušený. Ligácia bola vykonaná s 100 ng vektoru a 50 ng DNA fragmentov vyšlých z amplifikace PCR, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 10 μΐ, obsahujúcom 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Niektoré získané klony boli verifikované sekvenovanim pomocou sekvenačnej súpravy T7 , predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Vzniknutý kloň bol nazvaný pGUS-2pGEAlD.

Fragment HindlII-BamHi, nesúci promotor pGEAlD, izolovaný z pGUS-2-pGEAlD, ošetrený podľa Klenowa podľa odporúčania výrobca (Biolabs), bol purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), podrobený precipitácii v alkohole, sušený a ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC21 v miestach KpnI a Hindlll, ošetrených enzýmom T4 DNA polymerácie (Biolabs) podľa odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng defosforylovaného pBIOC21 a 200 ng DNA fragmentov Xhol-EcoRI, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 20 μΐ, obsahujúcom 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) , 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14“C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 μg/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC90.

Plazmid pBSII-pGEAlD bol získaný v dvoch etapách:

najskôr bol fragment SacI-EcoRI, nesúci tNOS (terminátor génu nopalinsyntázy) Agrobacterium tumefaciens, ošetrený enzýmom T4 DNA polymeráza (Biolabs) podlá odporúčania výrobca a purifikovaný, klonovaný do miesta EcoRV pBSIISK+, predávaného spoločnosťou Stratagene, defosforylovaného enzýmom alkalickej fosfatázy telacieho čreva (Boehringer Mannheim) podlá odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentov, obsahujúcich tNOS, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 20 μΐ, obsahujúcom 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14 °C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Niektoré získané klony boli verifikované sekvenovaním pomocou sekvenačnej súpravy T7™, predávané spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC90.

okrem toho bol fragment nesúci pGEAlD dvojnásobne natrávený pomocou Hindlll, ošetreného Klenowovým enzýmom a BamlI, purifikovaný a klonovaný do miest Xbal, ošetrených podlá Klenowa a BamHI plazmidu pBSII-tNOS. Ligácia bola vykonaná s 100 ng hore opísaného vektoru a 50 ng hore opísaných DNA fragmentov, v reakčnom prostredí s 10 μΐ, obsahujúcom 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983).. Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μ9/ιη1 ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBSII-pGEAlD.

Potom bola kazeta expresie pGEAlD-tNOS, prenesená na fragment Xbal-HindlII, ošetrený podlá Klenowa, klonovaná do miesta Smal pSCV1.2, defosforylovaného enzýmom alkalickej fosfatázy telacieho čreva (Boehringer Mannheim) podlá odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng defosforylovaného pSCV1.2 a 200 ng DNA fragmentov, nesúcich kazetu expresie pGEAlD-tNOS, v reakčnom prostredí s 20 μΐ, obsahujúcom 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escheríchia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC91.

d) Konštrukcia binárneho plazmidu pBIOC92 obsahujúceho promotor pGEA6D

Expresia živočíšneho génu kódujúceho psiu gastrickú lipázu (LGC) v semenách repky vyžaduje nasledujúce regulačné sekvencie:

1. promotor pGEA6, zodpovedajúci nekódujúcej oblasti 5' génu rezervného proteínu semien, GEA6 Arabidopsis thaliana (Gaubier a kol., 1993) a dovolujúci špecifickú expresiu v semenách;

2. terminálne sekvencie transkripcie, terminátor polyA 35S, ktorý zodpovedá nekódujúcej oblasti 3' sekvencie vírusu s dvojvláknovou kruhovou DNA mozaiky karfiolu, produkujúci transkript 35S (Franck a kol., 1980).

Pre získanie binárneho plazmidu pBIOC92, podobného pBIOC21, ale takého, žé^jeho promotor pd35S bol nahradený promotorom pGEA6D, bol)izolovaný fragment EcoRI-BamHI, oše. f b trený podlá Klenowa, obsahujúci promotor pGEA6, z plazmidu pGUS2-pGEA6. Kloň pGUS-2-pGEA6 odvodený z pUC18, obsahuje 2 ATG vo fáze: ATG'génu GEA6 (Em6) a ATG génu gus. ATG génu GEA6 bol deštruovaný. Fragment DNA, nachádzajúci sa medzi miestom Accl a sekvenciami pred ATG génu GEA6 klonu pGUS-2pGEA6 bol amplifikovaný pomocou PCR s pomocou nasledujúcich dvoch nukleotidov:

5’ AAGTACGGCCACTACCACG 3' a

5' CCCGGGGATCCTGGCTC 3'.

Hybridizační teplota bola upravená. Fragment, amplifikovaný pomocou PCR bol natrávený pomocou Accl a BamHI, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 2 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), precipitovaný v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C a počas 30 minút, centrifugovaný pri 12000 g počas 30 minút, premývaný 70% etanolom, sušený a ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pGUS-2-GEA6, dvojnásobne natráveného pomocou Accl a BamHI, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), podrobený precipitácii v alkohole a sušený. Ligácia bola vykonaná s 100 ng hore opísaného vektoru a 50 ng natrávených DNA fragmentov vyšlých z amplifikácie PCR, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 10 μΐ, obsahujúcom 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobe73 ných selekcii na 50 μ9/πι1 ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Niektoré získané klony boli verifikované sekvenovaním pomocou sekvenačnej súpravy T7 , predávanej spolocnostou Pharmacia metodou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Vzniknutý kloň bol nazvaný pGUS-2-pGEA6D.

Fragment HindlII-BamHI, nesúci promotor pGEA6D, izolovaný z pGUS-2-pGEA6D, ošetrený podlá Klenowa podlá odporúčania výrobca (Biolabs), bol purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), podrobený precipitácii v alkohole, sušený a ligovaný do plazmidovej DNA modifikovaného plazmidu pBIOC21 v mieste Xhol, ošetrenom Klenowovým enzýmom. Modifikovaný plazmid pBIOC21 bol získaný dvojnásobným natrávením pBIOC21 pomocou Hindlll, ošetreným podlá Klenowa a KpnI pre vylúčenie fragmentu, nesúceho promotor pd35S a jeho nahradením fragmentom KpnI-EcoRV, nesúcim polylinker, miest Kpnl-XhoI-XalI-Clal-HindlII-BamHI-Smal-EcoRI-EcoRV plazmidu pBSIISK+. Ligácia bola vykonaná s 20 ng defosforylovaného modifikovaného pBIOC21 a 200 ng DNA fragmentov EcoRI-BamHI, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 20 μΐ, obsahujúcom 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) , 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 μg/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC92.

e) Konštrukcia binárnych plazmidov pBIOC93, pBIOC94, pBIOC95, pBIOC96 a pBIOC97, obsahujúcich PSLGL-LGC

- 74 Plazmid pBIOC40 bol opísaný hore. Tento plazmid obsahuje fragment BglII-Xbal, nesúci sekvenciu PSLGL-LGC.

Tento fragment bol izolovaný dvojnásobným natrávením pomocou BglII a Xbal, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), podrobený precipitácii v alkohole, sušený, ošetrený podía Klenowa a potom ligovaný do pBIOC28 (je opísaný hore), natráveného pomocou EcoRI, ošetreného podía Klenowa a defosforylovaného; do pBIOC90, natráveného pomocou EcoRI, ošetreného podía Klenowa a defosforylovaného; do pBIOC91, natráveného pomocou Smal, ošetreného podía Klenowa a defosforylovaného; do pBIOC92, natráveného pomocou HindlII, ošetreného podía Klenowa a defosforylovaného; čím boli získané pBIOC93, PBIOC93, pBIOC93, respektíve pBIOC93.

Plazmid pBIOC97 vznikne klonovaním fragmentu KpnlEcoRV, nesúceho kazetu expresie pGEA6D-PSLGL-LGC-t35S, ošetreného enzýmom T4 DNA polymeráza, purifikovaného elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaného, podrobeného precipitácii v alkohole, sušeného a ligovaného do pSCV1.2, natráveného pomocou Smal a defosforylovaného. Kazeta expresie pGEA6D-PSLGL-LGC-t35S pochádza z pBIOC92.

III. KONŠTRUKCIA CHIMÉRICKÝCH GÉNOV, KÓDUJÚCICH REKOMBINANTNÝ PROTEÍN ĽUDSKEJ GASTRICKEJ LIPÁZY A DOVOĽUJÚCA KONŠTITUTÍVNU EXPRESIU NAPRÍKLAD V LISTOCH A SEMENÁCH TABAKU

a) Konštrukcia binárneho plazmidu pBIOC82 obsahujúceho chimérický promotor SUPER-PROMOTOR pSP

Expresia génu kódujúceho íudskú gastrickú lipázu (LGH) v listoch tabaku vyžaduje nasledujúce regulačné sekvencie:

1. chimérický promotor superpromotor (pSP; PCT/US94/12946). Tento je tvorený trojnásobným opakovaním aktivačného transkripčného prvku promotoru génu octopinsyntázy Agrobacterium tumefaciens, aktivačného transkripčného prvku promotoru génu mannopinsyntázy a promotoru mannopinsyntázy Agrobacterium tumefaciens;

2. terminálne sekvencie transkripcie, terminátor polyA 35S, ktorý zodpovedá nekódujúcej oblasti 3' sekvencie vírusu s dvojvláknovou kruhovou DNA mozaiky karfiolu, produkujúci transkript 35S (Franck a kol., 1980).

Pre získanie binárneho plazmidu podobného pBIOC21, ale takého, že jeho promotor pd35S bol nahradený promotorom pSP, bol izolovaný fragment pvull-Sall, ošetrený podlá Klenowa, obsahujúci promotor pSP, z plazmidu pBISNl (PCT/US94/ 12946), purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 1 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), podrobený precipitácii v alkohole, sušený a ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pBIOCSl, dvojnásobne natráveňej pomocou KpnI a EcoRI, ošetrený pomocou T4 DNA polymerázy a defosforylovaný enzýmom alkalickej fosfatázy teľacieho čreva (Boehringer Mannheim) podľa odporúčania výrobca. Plazmid pBIOCSl zodpovedá plazmidu pBIOC21, ktorého miesto Xbal bolo vynechané. Aby to bolo dosiahnuté, je plazmid pBIOC21 natrávený pomocou Xbal, potom podrobený pôsobeniu Klenowho enzýmu a ligovaný pôsobením T4 DNA ligázy.

Ligácia bola vykonaná s 20 ng hore opísaného defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentov, nesúcich pSP, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 20 μΐ, obsahujúcom 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované

- 76 (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii v prostredí, obsahujúcom 12 p.g/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC82.

ľudská gastrická lipáza (LGH) bola prirodzene syntetizovaná vo forme prekurzoru, opísaného v publikácii Bodmer a kol., 1987. Maturovaný proteín ludskej gastrickej lipázy je tvorený 379 aminokyselinami. Jeho signálny proteín (PSLGH) sa skladá z 19 aminokyselín. Miesto štiepenia medzi PSLGH a ludskou gastrickou lipázou je Gly-Leu.

Sekvencia kódujúca prekurzor ludskej gastrickej lipázy bola použitá pre konštrukciu binárnych plazmidov pBIOC85, ktorý obsahuje PSLGH-LGH, pBIOC87, ktorý obsahuje PSLPH-LGH a PBIOC89, ktorý obsahuje PSLGL-LGH, v ktorých je sekvencia kódujúca ludskú gastrickú lipázu predchádzaná sekvenciou, kódujúcou jej prirodzený signálny peptid PSLGH, signálny peptid ludskej pankreatickej lipázy (PSLPH; Giller a kol., 1992), respektíve signálny peptid králičej gastrickej lipázy (PSLGL; opísaná hore; európsky patent č. 92.403055.4).

Sekvencia, kódujúca prekurzor ludskej gastrickej lipázy bola izolovaná dvojnásobným natrávením pomocou PstI a Dral, purifikáciou elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaním (Sambrook a kol., 1989), precipitáciou v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C počas 30 minút, centrifugáciou pri 12000 g počas 30 minút, premývaním 70% etanolom a sušením. Potom bola klonovaná v miestach PstI a Spel (podrobených pôsobeniu enzýmu T4 DNA polymeráza (Biolabs) podlá odporúčania výrobca) plazmidu pBSIISK+, predávaného spoločnosťou Stratagene. Ligácia bola vykonaná s

100 ng vektoru a 50 ng DNA fragmentov, nesúcich sekvencie, kódujúce prekurzor ludskej gastrické ligázy, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 10 μΐ v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC83.

Sekvencia kódujúca matúrovanú ludskú gastrickú lipázu bola modifikovaná vložením miesta BamHI, ktoré predtým neexistovalo, do deviateho a desiateho kodónu riadenou mutagenézou pomocou PCR s využitím dvoch oligonukleotidov:

5' aaactgcaggctcgag TTG TTTGGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT GAA GTG ACT ATG 3' (obsahujúci miesta PstI, Xhol a BamHI)

5' AAT GGT GGT GCC CTG GGA ATG GCC AAC ATA GTG TAG CTG C 3' (obsahujúci miesto MscI, ktoré je jediné v plazmide pBIOC83)

Amplifikácia PCR fragmentu Pstl-MscI bola vykonaná v 100 ml reakčného prostredia, obsahujúceho 10 μΐ tlmivého roztoku Taq DNA polymeráza 10 (500 mM KC1, 100 mM Tris-Hcl, pH 9,0 a 1 % Triton 100), 6 μΐ 25 mM MgCl₂, 3 μΐ 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP a dTTP), 100 pM každého z hore opísaných dvoch oligodesoxynukleotidov, 5 ng DMA matrice (vektor pBIOC83) 2,5 U Taq DNA polymerázy (Promega) a 2 kvapky vazelínového oleja. DNA bola denaturovaná pri teplote 94°C počas 5 minút, podrobená 30 cyklom, pričom každý sa skladal z 1 minúty denaturácie pri teplote 94°C, 1 minúty hybridizácie pri teplote 65°C a 1 minúty elongácie pri teplote 72°C a potom elongácia pri teplote 72°C pokračovala počas minút. Táto reakcia PCR bola vykonaná v prístroji DNA Thermal Cycler spoločnosti PERKIN-ELMER CETUS. Olej bol eliminovaný extrakciou v chloroformu. Potom boli fragmenty DNA, obsiahnuté v reakčnom prostredí, precipitované v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C počas 30 minút, centrifugované pri 12000 g počas 30 minút, premývané v 70% etanole, sušené a natrávené dvoma reštrikčnými enzýmami PstI a MscI. Natrávené fragmenty DNA, vzniknuté z PCR, boli purifikované elektroforézou na agarózovom géli 2 %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), precipitované v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C počas 30 minút, centrifugované pri 12000 g počas 30 minút, premývané v 70% etanole, sušené a potom ligované do plazmidovej DNA vektoru pBIOC83, dvojnásobne netráveného pomocou pstl a MscI, purifikované elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývané, podrobené precipitácii v alkohole a sušené. Ligácia bola vykonaná s 100 ng vektoru a 50 ng fragmentov natrávenej DNA, vzišlej z PCR amplifikácie, opísanej hore, v 10 μΐ reakčného prostredia v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Plazmidová DNA niektorých získaných klonov bola verifikovaná sekvenovaním s pomocou sekvenačnej súpravy T7·¹· , predávanej spolocnostou Pharmacia metodou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Vloženie reštrikčného miesta BamHI nemodifikuje genetický kód ludskej gastrickej lipázy. Prirodzená sekvencia ludskej gastrickej lipázy GGA AGC (Gly-Ser) sa totiž stane GGA TCC (Gly-Ser). Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC84.

b) Konštrukcia binárneho plazmidu pBIOC85, obsahujúceho PSLGH-LGH

Fragment Pstl-Xbal, nesúci sekvenciu PSLGH-LGH bol izolovaný dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocou PstI a Xbal z pBIOC83, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), podrobený precipitácii v alkohole a sušený. Potom bol tento fragment DNA ošetrený pôsobením enzýmu T4 DNA polymeráza (Biolabs) podľa odporúčania výrobca a ligovaný do plazmatickej DNA plazmidu pBIOC82 natráveného v mieste Xbal, ošetrenom podľa Klenowa (Biolabs) a defosforylovaného enzýmom alkalickej fosfatázy (Boehringer Mannheim) podľa odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentov BglIII-Xbal, obsahujúcich PSLGH-LGH, opísaných hore, v reakčnom prostredí 20 μΐ v prítomnosti 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) , 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 ug/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý kloň bol nazvaný pBIOC85. Nukleotidová sekvencia rekombinantného proteínu PPS-LGC bola verifikovaná sekvenovaním pomocou sekvenačnej súpravy T7™, predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Sekvencia štiepenia medzi sekvenciami PSLGH a maturovanej ľudskej gastrickej lipázy je Gly-Leu. Plazmidová DNA binárneho vektoru pBIOC85 bola vložená priamou transformáciou do kmeňa LBA4404 Agrobacteriunt tumefaciens spôsobom podľa Holstersa a kol., (1978). Platnosť získaného klonu bola overená enzymatickým natrávením vloženej plazmidovej DNA.

c) Konštrukcia binárneho plazmidu pBIOC86, obsahujúceho PSLPH-LGH

Plazmid pBIOC84 bol dvojnásobne natrávený pomocou PstI a BamHI, aby bola suprimovaná sekvencia, kódujúca signálny peptid PSLGH a 8 prvých aminokyselín maturovaného proteínu ludskej gastrickej lipázy (Leu-Phe-Gly-Lys-LeuHis-Pro-Gly). Táto sekvencia bola nahradená sekvenciou, kódujúcou signálny peptid PSLPH s 16 aminokyselinami (ATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA), pripojenou k sekvencii, kódujúcej 8 prvých kodónov maturovaného proteínu ludskej gastrickej ligázy (PSLPH - 8 prvých kodónov maturovanej ludskej gastrickej lipázy). Sekvencia PSLPH - 8 prvých kodónov maturovanej ludskej gastrickej lipázy bola amplifikovaná PCR z matrice

5' aaactgcaggctcgagaacaATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' pomocou dvoch oligodesoxynukleotidov,

5' aaactgcaggctcgagaacaATG C 3' a

5' C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3' , podlá protokolu PCR amplifikácie, opísaného hore (viď paragraf I, hore). Hybridizačná teplota bola upravená. Po dvojnásobnom enzymatickom natrávení pomocou PstI a BamHI boli fragmenty, amplifikované pomocou PCR, purifikované elektroforézou na agarózovom géli 2 %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), precipitované v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C a počas 30 minút, centrifugované pri 12000 g počas 30 minút, premývané 70% etanolom, sušené a ligované do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC84, dvojnásobne natráveného pomocou PstI a BamHI, purifikované elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), podrobené precipitácii v alkohole a sušené. Ligácia bola vykonaná s 100 ng vektoru a 50 ng natrávených DNA fragmentov vyšlých z amplifikácie PCR, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 10 μΐ, obsahujúcom 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligázy 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligázy (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μ9/πι1 ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Niektoré získané klony boli verifikované sekvenovaním pomocou sekvenačnej súpravy T7™, predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Sekvencie PSLPH a maturovanej ludskej gastrickej lipázy boli klonované, pričom ich čítacie rámce boli udržované otvorené. Miesto štiepenia medzi sekvenciami PSLPH a matúrovanou ludskou gastrickou lipázou je Gly-Leu. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC86.

Fragment Pstl-Xbal, nesúci sekvenciu PSLPH-LGH, bol izolovaný z pBIOC86 dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocou PstI a Xbal, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), podrobený precipitácii v alkohole a sušený. Potom bol tento fragment DNA ošetrený enzýmom T4 DNA polymeráza (Biolabs) podlá odporúčania výrobca a ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC82, natráveného v mieste Xbal, ošetrenom podlá Klenowa a defosforylovaným enzýmom alkalickej fosfatázy z telacieho čreva (Boehringer Mannheim) podlá odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng defosforylovaného vektoru, opísaného hore, a 200 ng DNA fragmentov obsahu82 júcich PSLPH-LGH, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 20 ml, obsahujúcom 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 μg/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC87. Nukleotidová sekvencia fragmentu, kódujúceho PSLPH-LGH bola verifikovaná sekvenovanim pomocou sekvenacnej súpravy T7 , predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Plazmidová DNA binárneho vektoru pBIOC87 bola vložená priamou transformáciou do kmeňa LBA4404 Agrobacterium tumefaciens spôsobom podľa Holstersa a kol., (1978). Platnosť získaného klonu bola overená enzymatickým natrávením vloženej plazmidovej DNA.

d) Konštrukcia binárneho plazmidu pBIOC89, obsahujúceho PSLGL-LGH

Plazmid pBIOC84 bol dvojnásobne netrávený pomocou PstI a BamHI, aby bola suprimovaná sekvencia, kódujúca signálny peptid PSLGH a 8 prvých aminokyselín maturovaného proteínu ľudskej gastrickej lipázy (Leu-Phe-Gly-Lys-LeuHis-Pro-Gly). Táto sekvencia bola nahradená sekvenciou, kódujúcou signálny peptid PSLGL s 19 aminokyselinami (ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT), pripojenou k sekvencii, kódujúcej 8 prvých kodónov maturovaného proteínu ľudskej gastrickej ligázy (PSLGL - 8 prvých kodónov matúrovanéj ľudskej gastrickej lipázy). Sekvencia PSLGL - 8 prvých kodónov matúrovanéj ľudskej gastrické lipázy bola amplifikovaná pomocou PCR z matrice

5' aaactgcaggctcgagaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA ttc CCT G 3' s pomocou dvoch oligodesoxynukleotidov,

5' aaactgcaggctcgagaacaATG TGG 3' a ’ C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3 ' , podľa protokolu PCR amplifikácie, opísaného hore (pozri paragraf I, hore). Hybridizačná teplota bola upravená. Po dvojnásobnom enzymatickom natrávení pomocou PstI a BamHI boli fragmenty, amplifikované pomocou PCR, purifikované elektroforézou na agarózovom géli 2 %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), precipitované v prítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého etanolu pri teplote -80°C a počas 30 minút, centrifugované pri 12000 g počas 30 minút, premývané 70% etanolom, sušené a ligované do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC84, dvojnásobne natráveného pomocou PstI a BamHI, purifikované elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývané (Sambrook a kol., 1989), podrobené precipitácii v alkohole a sušené. Ligácia bola vykonaná s 100 ng vektoru a 50 ng natrávených DNA fragmentov vyšlých z amplifikácie PCR, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 10 μΐ, obsahujúcom 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligázy 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligázy (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Niektoré získané klony boli verifikované sekvenovaním pomocou sekve84 načnej súpravy T7™, predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Sekvencie PSLGL a maturovanej íudskej gastrickej lipázy boli klonované, pričom ich čítacie rámce boli udržované otvorené.

Miesto štiepenia medzi sekvenciami PSLGL a maturovanou ľudskou gastrickou lipázou je Gly-Leu. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC88.

Fragment Pstl-Xbal, nesúci sekvenciu PSLGL-LGH, bol izolovaný z pBIOC88 dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocou PstI a Xbal, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný (Sambrook a kol., 1989), podrobený precipitácii v alkohole a sušený. Potom bol tento fragment DNA ošetrený enzýmom T4 DNA polymeráza (Biolabs) podía odporúčania výrobca a ligovaný do plazmidovej DNA plazmidu pBIOC82, natráveného v mieste Xbal, ošetrenom podía Klenowa a defosforylovanom enzýmom alkalickej fosfatázy z teíacieho čreva (Boehringer Mannheim) podía odporúčania výrobca. Ligácia bola vykonaná s 20 ng defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentov obsahujúcich PSLGL-LGH, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 20 μΐ, obsahujúcom 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri teplote 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidová DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 12 μg/ml tetracyklínu, bola extrahovaná metódou alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC89. Nukleotidová sekvencia fragmentu, kódujúceho rekombinantný proteín PSLGL-LGH bola verifikovaná sekvenovaním pomocou sekvenacnej súpravy T7 , predávanej spoločnosťou Pharmacia metódou didesoxynukleotidov (Sanger a kol., 1977). Plazmidová DNA binárneho vektoru pBIOC89 bola vložená priamou transformáciou do kmeňa LBA4404 Agrobacterium tumefaciens spôsobom podlá Holstersa a kol., (1978). Platnosť získaného klonu bola overená enzymatickým natrávením vloženej plazmidovej DNA.

IV. KONŠTRUKCIE CHIMÉRICKÝCH GÉNOV KÓDUJÚCICH REKOMBINANTNÚ PROTEÍNY PSEJ GASTRICKEJ LIPÁZY A DOVOĽUJÚCE EXPRESIU V SEMENÁCH KUKURICE

a) Konštrukcia plazmidov pBIOC98 a pBIOC99, obsahujúcich PSLGL-LGC a dovolujúcich konštitutívnu expresiu v semenách kukurice

Konštitutívna expresia živočíšneho génu, kódujúceho psiu gastrickú lipázu (LGC) v semenách kukurice, vyžaduje nasledujúce regulačné sekvencie:

1. jeden z dvoch promotorov, dovolujúcich konštitutívnu expresiu:

promotor aktínu ryže, nasledovaný intrónom aktínu ryže (pAR-IAR), obsiahnutý v plazmide pActl-F4, ktorý opísal McElroy a kol. (1991);

konštitutívny dvojitý promotor 35S (pd35S) vírusu CaMV (vírus mozaiky karfiolu). Tento promotor zodpovedá duplikácii aktivačnej sekvencie transkripcie, nachádzajúcej sa pred prvkom TATA prirodzeného promotoru 35S (Kay a kol. ,

1987);

2. jeden z dvoch terminátorov:

terminačná sekvencia transkripcie, terminátor polyA

35S, ktorý zodpovedá nekódujúcej oblasti v 3' sekvencii vírusu s dvojvláknovou kruhovou DNA mozaiky karfiolu, produkujúci transkript 35S (Franck a kol, 1980);

terminačná sekvencia transkripcie, terminátor polyA NOS, ktorý zodpovedá nekódujúcej oblasti v 3 génu nopalinsyntázy plazmidu TI Agrobacterium tumefaciens kmeňa (Depicker a kol. , 1982).

Plazmid pBIOC98, v ktorom bola sekvencia, kódujúca PSLGL-LGC umiestnená pod kontrolu pAR-IAR, bola získaná klonovaním fragmentu BglII-Xbal, nesúceho sekvenciu, kódujúcu PSLGL-LGC v miestach Ncol a Sali v pBSII-pAR-IAR-tNOS.

Fragment BglII-Xbal, nesúci sekvenciu kódujúcu PSLGL-LGC, bol izolovaný z pBIOC40 (opísaného hore) dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocou BglII a Xbal, purifikovaný elektroforézou na agarózovom géli 0,8 %, elektrovymývaný, podrobený precipitácii v alkohole, sušený, potom ošetrený Klenowovým enzýmom. Plazmid pBSII-pAR-IARtNOS bol dvojnásobne natrávený pomocou Sali a Ncol, purifikovaný, ošetrený enzýmom Mung Bean Nuclease (Biolabs) a defosforylovaný enzýmom telacej alkalickej fosfatázy (Boehringer Mannheim) podlá odporúčania výrobca. Ligácia bola realizovaná s 20 ng defosforylovaného vektoru a 200 ng fragmentov DNA, obsahujúcich sekvenciu, kódujúcu PSLGL-LGC, opísanú hore, v reakčnom prostredí s 20 μΐ v prítomnosti 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escheríchia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidická DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná pomocou metódy alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami. Vzniknutý plazmid bol nazvaný pBIOC98.

Plazmid pBSII-pAR-IAR-tNOS vznikol klonovaním pBSII-tNOS do miest Eco01091, ošetrené podlá Klenowa a KpnI fragmentu SnaBI-KpnI, nesúceho sekvencie zodpovedajúce pAR-IAR-počiatok sekvencie kódujúci gén gus, izolovaného z plazmidu pActl-F4. Ligácia bola realizovaná s 100 ng vektoru a 50 ng fragmentov DNA, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 10 μΐ v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidická DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná pomocou metódy alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami.

Plazmid pBSII-tNOS bol získaný klonovaním fragmentu SacI-EcoRI, nesúceho sekvenciu tNOS, izolovanú z pBI121, pre dávaného spoločnosťou Clontech, do defosforylovaného miesta EcoRV pBSIISKt, ktorý je predávaný spoločnosťou Stratagene, dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocou Sací a EcoRV, vystavený purifikácii elektroforézou na agarózovom géli 2 % a ošetrený enzýmom T4 DNA polymeráza. Ligácia bola realizovaná s 20 ng defosforylovaného vektoru a 200 ng fragmentov DNA, obsahujúcich sekvencie tNOS, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 20 μΐ v prítomnosti 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidická DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná pomocou metódy alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami.

Plazmid pBIOC99, v ktorom je sekvencia, kódujúca PSLGL-LGC pod kontrolou pd35S, bol získaný klonovaním fragmentu KpnI-BamHI, nesúceho sekvenciu, zodpovedajúcu pd35S88

PSLGL-LGC, izolovanú z pBIOC41, opísaného hore, do miest KpnI a BamHI plazmidu pBSII-t35S. Ligácia bola realizovaná s 100 ng vektoru a 50 ng fragmentov DNA, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 10 μΐ v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidická DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná pomocou metódy alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami.

Plazmid pBSII-t35S bol získaný klonovaním fragmentu

Smal-EcoRV, nesúceho sekvenciu t35S, izolovanú z pJIT163 (opísaného hore), do defosforylovaného miesta Spel, ošetreného podľa Klenowa, plazmidu pBSIISK, predávaného spoločnosťou Stratagene, dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocou Smal a EcoRV a podrobený purifikácii elektroforézou na géli agarózy 2 %. Ligácia bola realizovaná s 20 ng vektoru a 200 ng fragmentov DNA, obsahujúcich sekvenciu t35S, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 20 μΐ v prítomnosti 2 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 ml polyetylénglykolu 8000 a 5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri 14’C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5a boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidická DNA získaných klonov, podrobených, selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná pomocou metódy alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčnými enzýmami.

b) Konštrukcia plazmidov pBIOClOO a pBIOClOl, obsahujúcich PSLGL-LGC, respektíve PSLGL-LGC-KDEL a dovoľujúcich expresiu v albuménu semien kukurice

Expresia živočíšneho génu, kódujúceho psiu gastrickú lipázu (LGC), v albuménu semien kukurice vyžaduje nasledujúce regulačné sekvencie:

1. promotor génu Tzein kukurice (pizein), obsiahnutého v plazmide pg63, ktorý opísal Reina a kol., 1990. Plazmid pg63 pochádza z klonovania pTzeinu do miest Hindlll a Xbal plazmidu pUC18, ktorý obsahuje medzi miestami Hindlll a EcoRI kazetu expresie p35S-gus-tNOS pBI221, predávaného spoločnosťou Clontech. Dovoluje expresiu v albuménu semien kukurice.

2. terminálna sekvencia transkripcie, terminátor polyA NOS, ktorý zodpovedá nekódujúcej oblasti v 3' génu nopalin syntáza plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens kmeň (Depicker a kol, 1982).

Plazmid pBIOClOO, v ktorom je sekvencia kódujúca PSLGL-LGC umiestnená pod kontrolu pTzeinu, bol získaný klonovaním fragmentu Xbal, ošetrený podlá Klenowa - BglII, izolovaného z pBIOC40 (opísaného hore), do miest Sací, ošetrené enzýmom T4DNA polymeráza a BamHI, plazmidu pg63. Ligácia bola realizovaná s 100 ng vektoru a 50 ng fragmentov DNA, opísaných hore, v reakčnom prostredí s 10 μΐ v prítomnosti 1 μΐ tlmivého roztoku T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzýmu T4 DNA ligáza (Amersham) pri 14°C počas 16 hodín. Predbežne pripravené baktérie Escherichia coli DH5 boli transformované (Hanahan, 1983). Plazmidická DNA získaných klonov, podrobených selekcii na 50 μg/ml ampicilínu, bola extrahovaná pomocou metódy alkalickej lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzovaná enzymatickým natrávením reštrikčními enzýmami. Vzniknutý kloň bol nazvaný pBIOClOO.

Plazmid pBIOClOl vznikol substitúciou fragmentu Ncoll-AflII v pBIOClOO fragmentom Ncol-AflII, nesúcim sekvenciu, kódujúcu tetrapeptid KDEL (dovoíujúci smerovanie v endoplazmatickom retikule), umiestnený pred stop-kodón, získaný PCR amplifikáciou spôsobom, opísaným hore. Dva oligonukleotidy, použité v tejto reakcii boli:

5' AAT CAC TTG GAC TTT ATC TGG Gcc atg gAT GCC 3’ (jediné miesto Ncol) a

5' AAT ctt aag AAA CTT TAT TGC CAA ATG TTT GAA CGA TCG GGG AAA TTC GAC GCG TCT AGA ACT ATA GCT CAT CCT TAT TAT CTG TTC CCA TCA TGG 3' (sekvencie, kódujúce KDEL a jediné miesto AflII) .

Teplota hybridizácie bola 70°C. Klonovanie bolo uskutočnené hore opísaným spôsobom.

V. PRÍKLAD ZÍSKANIA TRANSGENICKÝCH RASTLÍN REPKY

Semená jarnej repky (Brassica napus, kultivar Westar alebo Limagrain) sú dezinfikované počas 40 minút v roztoku Domestos 15 %. Po 4 premývaní v sterilnej vode sú semená ponechané klíčiť v množstve 20 semien v nádobke s priemerom 7 cm a výške 10 cm v minerálnom prostredí Murashige a Skoog (Sigma M 5519) s 30 g/l sacharózy a solidifikované agarovým gélom 6 g/l. Tieto nádobky sú umiestnené do kultivačnej komory pri teplote 26°C s fotoperiódou 16h/8h a s intenzitou osvetlenia radovo 80 mE.m^-2.S^-1.

Po 5 dňoch klíčenia sú klíčne listy sterilné odobrané odlomením každej listovej stopky zhruba 1 mm pod klíčnym listom.

Paralelne bola realizovaná predkultúra Agrobacterium tumefaciens, kmeň LBA4404, obsahujúci plazmid pBIOC29 (alebo pBIOC25), tzn. plazmid pGAZE, do ktorého bola vložená sekvencia, kódujúca smerovací signál PPS (alebo PS) pod kontrolou promotoru pCRU (alebo pd35S), v Erlenmeyerovej banke 50 ml počas 36 hodín pri 28°C v 10 ml bakteriálneho prostredia 2YT (Sambrook a kol., 1989), doplnenom antibiotikami, užitočnými pre selekciu použitého kmeňa.

Táto predkultúra slúžila na naočkovanie na 1 % novej bakteriálnej kultúry, pripravenej za rovnakých podmienok. Po 14 hodinách kultivácie bola kultúra centrifugovaná 15 minút pri 3000 g a baktérie boli vybraté v ekvivalentnom objemu tekutého prostredia pre tvorbu zárodkov. Táto suspenzia bola distribuovaná do Petriho misiek s priemerom 5 cm po 5 ml na jednu misku.

Zvolený koniec listovej stopky bol ponorený na niekolko sekúnd do takto pripraveného roztoku agrobaktérií a potom bola listová stopka ponorená niekoľko milimetrov do regeneračného prostredia. Toto prostredie s rovnakým základným zložením ako prostredie pre tvorbu zárodkov a obsahujúce navyše 4 mg/1 benzylaminopurínu (BAP), fytohormónu, ktorý podporuje neoformáciu výhonkov. Desa£ explantátov (klíčny list s listovou stopkou) bolo umiestnených na kultiváciu do Petriho misky s priemerom 9 cm (Greiner, referencia 664102).

Po dvoch dňoch kultivácie v rovnakých podmienkach ako pri klíčení, sú explantáty premiestnené do misiek phytatray (Sigma, referencia P1552), obsahujúcich predchádzajúce prostredie, doplnené selektívnom činidlom: 45 mg/1 siričitanu kanamycínu (Sigma, referencia K4000) a bakteriostatikom: zmesou 1/6 (hmotnostné) draselnej soli kyseliny klavulánovej a 5/6 sodnej soli amoxicilínu (injektovateľný augmentín) v množstve 600 mg/1.

Ešte dvakrát sú explantáty v intervaloch 3 týždne sterilné premiestnené do nového prostredia za rovnakých podmienok.

Zelené výhonky, ktoré sa objavili ku koncu druhého alebo tretieho obdobia, boli oddelené od explantátov a kultivované oddelene v priehľadných nádobách s priemerom 5 cm a výškou 10 cm, ktoré obsahovali rovnaké prostredie ako predtým, ale zbavené BAP. Po 3 týždňoch kultivácie bola stonka transformovaného výhonku oddelená a výhonok bol premiestnený do nádoby s čerstvým prostredím. Po troch alebo štyroch týždňoch boli korienky dostatočne vyvinuté na to, aby rastlina mohla byť umiestnená do fytotrónu. Výhonky, ktoré neboli zelené alebo zakorenené boli odstránené. Tieto rastliny boli potom prenesené do kvetináčov o strane 7 cm, naplnených zemou (norma NF U44551: 40 % hnedá rašelina, 30 % presiaty humus a 30 % piesok), nasýtené vodou. Po dvoch týždňoch aklimatizácie vo fytotróne (teplota 21°C, fotoperióda 16h/8h a 84 % relatívna vlhkosť) boli rastlinky presadené do nádob s priemerom 12 cm, naplnených rovnakou zemou, obohatenou o hnojivo (Osmocote, v množstve 4 g/l zeme) a potom prenesené do skleníku (trieda S2), regulovaného na 18°C s denným zavlažovaním vodou (2 minúty).

Ked sa objavili kvety, boli umiestnené do vreciek (Crispac, referencia SM 570y 300mm<700 mm), aby sa zabránilo kríženiu.

Ked šešule dozreli, boli zobrané, usušené a vymlátené. Získané semena slúžila na určenie biochemického účinku. Selekcia transgenického potomstva sa uskutočnila klíčením v prostredí, obsahujúcom síran kanamycínu v množstve 100 až 150 mg/1 (podľa genotypu). Operačné podmienky boli rovnaké ako podmienky opísané hore s tým rozdielom, že klíčenie pre93 biehalo v sklenenej rúre s jediným semenom. Iba rastlinky, ktoré vyvinuli sekundárne korene v priebehu prvých troch týždňov boli aklimatizované vo fytotróne pred ich umiestnením do skleníku.

VI. PRÍKLAD ZÍSKANIA TRANSGENICKÝCH ĽUĽKOVITÝCH RASTLÍN

a) Získanie transgenických rastlín tabaku

Rastliny tabaku, použité pre pokus s transformáciou (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC a PBD6) boli kultivované in vitro v základnom prostredí Murashige a Skoog (1962), ku ktorému boli pridané vitamíny Gamborg a kol., (1968, Sigma, referencia M0404), sacharóza 20 g/l a agar (Merck) 8 g/l. pH prostredia bolo upravené na 5,8 roztokom uhličitanu draselného pred autoklávovaním pri 120°C počas 20 minút. Rastlinky tabaku boli každých 30 dní premiestnené na nové množivé prostredie MS20.

Všetky kultúry in vitro boli pestované v klimatizovanom prostredí za nasledujúcich podmienok:

intenzita osvetlenia 30 mE.m .S ^x, fotoperióda hodín;

termoperióda 26°C vo dne, 24°C v noci.

Použitá transformačná technika bola odvodená od techniky, ktorú opísal Horsch a kol. (1985).

Predkultúra Agrobacterium tumefaciens, kmeň LBA4404, obsahujúci plazmidy pBIOC29 alebo pBIOC26 alebo pBIOC25 bola pestovaná 48 hodín pri teplote 28°C za miešania v prostredí LB (Sambrook a kol., 1989), do ktorého boli pridané zodpovedajúce antibiotiká (rifampicín a tetracyklín). Predkultúra bola potom zriedená na jednu päťdesiatu v rovnakom prostredí a kultivovaná v rovnakých podmienkach. Po jednej noci bola kultúra centrifugovaná (10 minút, 3000 g), baktérie boli vybraté v ekvivalentnom objeme tekutého prostredia MS30 (30 g/l sacharózy) a táto suspenzia bola zriedená na jednu desiatu.

Explantáty zhruba 1 cm² boli odrezané z listov rastliniek opísaných hore. Potom boli umiestnené do kontaktu s bakteriálnou suspenziou počas 1 hodiny a potom rýchlo sušené na filtračnom papieru a umiestnené do prostredia kokultúry (MS30, pevné).

Po dvoch dňoch boli explantáty prenesené do Petriho misiek v regeneračnom prostredí MS30, obsahujúcom selekčné činidlo, kanamycín (200 mg/1), bakteriostatikum, augmentín (400 mg/1) a hormóny, potrebné pre indukciu výhonkov (BAP, mg/1 a ANA, 0,1 mg/1). Premiestnenie explantátov do rovnakého prostredia bolo vykonané po 2 týždňoch kultivácie. Po ďalších 2 týždňoch boli výhonky premiestnené do Petriho misiek na prostredie zložené z média MS20, ku ktorému bol pridaný kanamycín a augmentín. Po 15 dňoch boli výhonky redukované na polovinu. Zakorenenie trvá zhruba 20 dní, v ktorých môžu byt rastliny klonované alebo prenesené do skleníku.

b) Získanie transgenických rastlín rajčiaku

Semená rajčiaku, kultivar UC82B boli sterilizované v Domestos 10 % počas 15 minút a premývané trikrát v sterilnej vode. Posledné premývanie trvalo 10 minút za miešania.

Takto sterilizované semená boli umiestnené za účelom klíčenia do prostredia MSSV/2 (základné prostredie Murashige a Skoog (1962, Sigma, referencia M6899)./2, ku ktorému boli pridané vitamíny, Nitsch (Tomas a Pratt, 1981), šacha95 róza 30 g/l, agar (Merck) 8 g/l, pH 5,9, počas 7 alebo 8 dní v klimatizovanej komore (svetelná intenzita 30 mE.m^-2.s^_1, fotoperióda 16h/8h, 26°C).

Použitá technika transformácie bola odvodená od techniky Fillatti a kol., (1987).

Predkultúra Agrobacterium tumefaciens, kmeň LBA4404 obsahujúci plazmidy pBIOC25 alebo pBIOC26 bola pestovaná 48 hodín pri teplote 28°C za miešania v prostredí LB do ktorého boli pridané zodpovedajúce antibiotiká (rifampicín a tetracyklín) . Predkultúra bola potom zriedená na jednu päťdesiatu v rovnakom prostredí a kultivovaná v rovnakých podmienkach jednu noc. Meralo sa DO pri 600nm a kultúra bola centrifugovaná (10 minút, 3000 g) a vybratá v tekutom prostredí KCMS (opísanom v publikácii Fillatti a kol., 1987), aby sa DO pri 600 nm rovnalo 0,8.

Zlepšenie tejto techniky bolo vykonané v niektorých etapách protokolu Fillati a kol., (1987).

Predkultúra explantátov a kokultúra boli pestované rovnako, ako je to opísané v Fillati a kol., (1987) s tou vý nimkou, že do prostredia KCMS bolo doplnené acetosyringonom (200 mM).

Premývacie prostredie 2Z bolo zmenené pridaním cefotaximu 500 mg/1 namiesto karbenicilínu. Prostredie pre vývin, ktoré bolo použité, sa skladalo zo základného média Murashige a Skoog (Sigma MS6899), ku ktorému boli pridané vitamíny Nitsch, sacharóza 20 g/l, kanamycín 50 mg/1, augmentín 200 mg/1, ANA 1 mg/1 a zeatín 0,5 mg/1.

VII. ZÍSKANIE TRANSGENICKÝCH RASTLÍN KUKURICE

a) Kalus kukurice, jeho získanie a použitie ako ciel genetickej transformácie

Genetická transformácia kukurice, bez ohladu na to, ktorá metóda je použitá (elektroporácia, Agrobacterium, mikrovlákná, časticové delo), vyžaduje všeobecne použitie buniek, nerozdelených v rýchlych deleniach, ktoré si ponechávajú schopnosť regenerácie celých rastlín. Tento typ buniek vytvára delivý embryogénny kalus (typ II) kukurice.

Tento kalus, získaný z nezrelých zárodkov genotypu Hl II alebo (A188 B73) podlá spôsobu a v prostrediach, opísaných Armstrongom (Maize Handbook; (1984) M. Freeling, V. Walbot Eds.; str. 665-671). Takto získaný kalus bol pomnožený a uchovávaný postupným premiestňovaním každých pätnásť dní v iniciačnom prostredí.

Rastlinky boli potom regenerované z kalusu kukurice, modifikovala sa hormonálna a osmotická rovnováha buniek metódou, ktorú opísal Vain a kol. (Plánt Celí Tissue and Organ Culture (1989, 18:143-151). Tieto rastliny boli potom aklimatizované v skleníku, kde mohli byt krížené alebo samooplodnené.

b) Použitie časticového dela pre genetickú transformáciu kukurice

Predchádzajúci paragraf opísal spôsob získania a regenerácie bunečných línií, nutných na transformáciu. Teraz tu bude opísaná metóda, vedúca k stabilnej integrácii modifikovaných génov do genómu rastliny. Táto metóda spočíva v použití časticového dela, identického delu, ktoré opísal J. Finer (Plánt Celí Report (1992) 11: 323-328). Bunečné

- 97 ciele sú fragmenty, ktoré obsahuje kalus, opísané v paragrafe 1. Tieto fragmenty s povrchom od 10 do 20 mm² boli 4 hodiny pred bombardovaním uložené, v počte 16 fragmentov do stredu Petriho misky, obsahujúcej kultivačné prostredie, identické iniciačnému prostrediu, do ktorého bolo pridaných 0,2 M mannitolu a 0,2 M sorbitolu. Plazmidy, nesúce gény, ktoré majú byt vložené, boli purifikované na kolóne Qiagen r, podľa inštrukcií výrobca. Potom boli precipitované na častice volfrámu (M10), postupovalo sa pritom podľa protokolu, ktorý opísal Klein (Náture (1987) 327:70-73). Takto pokryté častice boli vystreľované na bunečné ciele pomocou časticového dela a podľa protokolu, ktorý opísal J. Finer (Plánt Celí Report (1992) 11:323-328).

Misky, obsahujúce kalus, bombardované týmto spôsobom, boli potom utesnene pomocou Scellofrais¹^ a potom kultivované v tme pri 27°C. Prvé premiestnenie bolo vykonané po 24 hodinách, potom každých pätnásť dní počas 3 mesiacov na identické prostredie, ku ktorému bolo pridané selekčné činidlo, ktorého povaha a koncentrácia môže závisieť od použitého génu (pozri paragraf 3). Použiteľné selekčné činidlá sú všeobecne zložené z niektorých herbicídov (Basta^R, Round up^R) alebo niektorých antibiotík (hygromycín, kanamycín a podobne).

Po 3 mesiacoch a niekedy aj skôr sa získa kalus, ktorého.rast nie je inhibovaný selekčným činidlom, obyčajne prevážne zložený z buniek, ktoré vznikli z delenia bunky, ktorá do svojej génovej výbavy integrovala jednu alebo viacej kópií selektovaného génu. Frekvencia získania takého kalusu je zhruba 0,8 kalus na jednu bombardovanú misku.

Tento kalus bol identifikovaný, oddelený, amplifikovaný a potom kultivovaný tak, aby vznikli rastlinky (pozri paragraf a). Aby sa vylúčila všetka interferencia s netrans98 formovanými bunkami, boli všetky operácie uskutočňované v kultivačnom prostredí, obsahujúcom selekčné činidlo.

Takto regenerované rastlinky boli aklimatizované a potom kultivované v skleníku alebo mohli byť krížené alebo samooplodnené.

VIII. ANALÝZA EXPRESIE PSEJ GASTRICKEJ LIPÁZY V TRANSGENICKÝCH RASTLINÁCH TABAKU

a) Protokol

Protokol extrakcie lipázy z listov tabaku, odobraných z rastlín v skleníku je nasledujúci: 1 cj listov (čerstvá hmotnost) bol rozdrvený v tekutom dusíku a potom pri 4°C v 5 ml tlmivého roztoku Tris-Hcl 25 mM pH 7,5, doplnenom EDTA lmM a merkaptoetanolom 10 mM (tlmivý roztok A) alebo v tlmivom roztoku glycín-HCl 25 mM pH 3, doplnenom EDTA lmM, β-merkaptoetanolu 10 mM, Tritonom X-100 0,2 % a NaCi 250 mM (tlmivý roztok B). Celková drvina bola okamžite centrifugovaná pri 4°C počas 15 minút pri 10000 g.

V prípade semien tabaku bola extrakcia vykonávaná v tlmivom roztoku B v množstve 0,1 g semien na 4 ml tlmivého roztoku.

Účinok lipázy bol určený pomocou pH-STATu titrimetrickou metódou Gargouriho a kol., (1986), v ktorej použitý substrát bol tributyrid. Emulzia tributyridu (4 ml na 30 ml emulzie) bola realizovaná vírením v prítomnosti solí (1,04 g/1) hovädzieho albumínu (0,1 g/1) a NaCi (9 g/1). Určovanie spočívalo v neutralizácii uvolňovanej kyseliny maslovej, uvoľňovanej pod pôsobením lipázy roztokom hydroxidu sodného pri pH s hodnotou 5,5 a pri teplote 37°C. Jednotka lipázy zodpovedá množstvu enzýmu, ktorý vyvolá uvolnenie jedného mikromolu mastných kyselín za 1 minútu pri 37°C za podmienok optimálneho pH (5,5). Prirodzená (purifikovaná) psia gastrická lipáza má špecifickú aktivitu 570 jednotiek/mg proteínu.

Účinok lipázy môže byť meraný pre celkovú drvinu, usadeninu alebo supernatant centrifugácie.

Pre supernatant centrifugácie (tlmivý roztok A) je dávkovanie celkových rozpustných proteínov realizované metódou podľa Bradforda (1976).

Sendvičový test ELISA (Carriére a kol., 1993) bol tiež vykonaný na supernatant centrifugácie s dvoma populáciami polyklonálnych protilátok proti prirodzenej psej gastrickej lipáze. Prvá populácia zahŕňala protilátky, reagujúce s ľudskou gastrickou lipázou a bola purifikované afinitou z úplného antiséra na ľudskú gastrickú lipázu, naočkovaného na kolóne Affigel 10 (Aoubala a kol., 1993). Tieto protilátky sú používané na pokrytie doštičiek ELISA pri koncentrácii 1 mg/ml. Druhá populácia zahŕňala protilátky, ktoré neznajú ľudskú lipázu. Sú neskoršie purifikované na kolóne Sepharose, viazané na proteín A a potom viazané na biotín. Fixácia protilátok je dvojica streptavidin/peroxidáza, ktorej enzymatický účinok je preukázaný prostredníctvom substrátu o-fenyléndiamínu. Získané výsledky majú kvalitatívnu hodnotu a sú zaznamenané pomocou symbolov + a - .

Výťažok extrakcie môže byť zlepšený pridaním detergentu typu CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimetylamónio-l-propán sulfonán) (SIGMA) do extrakčného tlmivého roztoku. V tomto prípade sa totiž výťažky extrakcie v supernatante zvýšia zhruba o 100 % (viď tabuľka 1).

100

Tabulka 1

Účinok lipázy (U/gPF) v extrakte, získanom z 4 rastlín tabaku, vzniknutého genetickou transformáciou s pBIOC25, v prítomnosti CHAPS 1 %.

Rastlina č.	NaCI 0,2 M/ EDTA 1 mM pH 3,0	NaCI 0,2 M/ EDTA 1 mM pH 3,0 + CHAPS 1%
1	80	112
2	40	104
3	43	109
4	54	92

b) Expresia rastlinných signálnych peptidov; dávky v listoch a semenách transformovaného tabaku s pBIOC'25 a pBIOC26; test ELISA

Získané výsledky pre 98 rastlín TO genotypu Xanthi (štádium 15 až 20 listov) sú podané v tabulke 2. Všetky dávky boli realizované v drvnine listov a semien pred centrifugáciou. Pre každý konštrukt vykazoval meraný účinok velkú variabilitu v závislosti od transformantu. Zhruba 20 % rastlín nemalo žiadny účinok alebo účinok, ktorý bol príliš slabý, aby mohol byt odhalený. Stredné účinky a maximálne účinky sú podané v tabulke 2.

Množstvá úplných proteínov sú podobné pre 3 konštrukty so strednou hodnotou 7 až 8 mg/g čerstvej hmotnosti v listoch a 34, 31 a 38 mg/g čerstvej hmotnosti v semenách.

101

Stredný účinok lipázy v listoch transformovaných konštruktom pBIOC26 bol 34 U na gram čerstvej hmotnosti, to znamená 0,8 % expresia vzhľadom k úplným proteínom. V semenách bol stredný účinok 36 U na gram čerstvej hmotnosti, to znamená 0,2 %. Maximálny účinok, dosiahnutý pri jednom z transformantov bol 146 U na gram čerstvej hmotnosti (listy,

2,5 % expresie) a 148 U na gram čerstvej hmotnosti (semená, 0,7 % expresie).

Enzymatické účinky, analyzované u rastlín, transformovaných pomocou konštruktu pBIOC25 sú podobné. Stredný účinok lipázy bol 34 U na gram čerstvej hmotnosti (0,8 % expresie) a maximálny účinok 134 U na gram čerstvej hmotnosti (3 % úplných proteínov). V semenách bol stredný účinok 42 U na gram čerstvej hmotnosti (0,3%) a maximálny účinok 159 U na gram čerstvej hmotnosti (1 %).

Pre rastliny transformované konštruktom pBIOC29 nebola pozorovaná žiadna aktivita v listoch (promotor špecifický na semená). V semenách bol stredný účinok 12 U na gram čerstvej hmotnosti (0,1 % expresie) a maximálny účinok 137 U na gram čerstvej hmotnosti (0,7 %).

Expresie v listoch a semenách pre jednu transformačnú udalosť sú všeobecne dobre korelované.

Výsledky testov ELISA súhlasia všeobecne tiež s výsledkami určovania enzymatického účinku, tzn. rastlina vykazujúca účinok lipázy dáva pozitívny výsledok v teste ELISA.

Výsledky získané neskôr s rovnakými rastlinami ukazujú, že účinok lipázy je náchylný k zmenám v priebehu vývinu rastliny. Tak rastlina, ktorej expresia vzhľadom

102 k úplným proteínom bola 3 % v štádiu 12 až 15 listov dávala expresiu 6 % pri neskoršom mereni (staršia rastlina po kvetu)

Tabulka 2

Expresia lipázy v listoch a semenách tabaku Xanthi

KONŠTRUKT	ORGÁN	ÚPLNÝCH PROTEÍNOV mg/g PF min-max (stred)	ÚČINOK LIPÁZY
U/g PF min-max (stred)	Expresia (% úplných proteínov) min-max (stred)
pBIOC26	Listy	3-15	0-145,6	0-2,5
	(n=34)	(7)	(34,4)	(0,8)
	Semená	24-43	0-147,6	0-0,7
	(n=34)	(34)	(36,3)	(0,2)
pBIOC25	Listy	3-18	0-133,5	0-3
	(n=35)	(8)	(34)	(0,8)
	Semená	17-43	0-158,5	0-1
	(n=35)	(31)	(41,9)	(0,3)
PBIOC29	Semená	29-55	0-137,4	0-0,7
	(n=34)	(38)	(11,8)	(0,1)

PF - čerstvá hmotnosť (poids frais);

min - hodnota, získaná pre najmenej exprimujúcu transformačnú udalosť;

103 max - hodnota, získaná pre najviacej exprimujúcu transformačnú udalosť;

n - počet analyzovaných transformačných udalostí.

c) Expresia so signálnym peptidom králičej gastrickej lipázy; skúmanie účinku lipázy v listoch tabaku

Výsledky získané s 44 rastlinami TO genotypov Xanthi a pBD6 (štádium 15 až 20 listov) sú nasledujúce:

Merania boli všetky vykonávané v drvnine z listov pred centrifugáciou. Analyzované účinky vykazovali veíkú variabilitu v závislosti od transformantu. Zhruba 20 % rastlín nemalo žiadny účinok alebo účinok príliš slabý na to, aby bol zistený. Stredný účinok lipázy v transformovaných listoch s konštruktom pBIOC41 bol 38 U na gram čerstvej hmotnosti pre genotyp Xanthi a 48 U na gram čerstvej hmotnosti pre genotyp PBD6. Maximálne účinky boli 152, respektíve 226 U na gram čerstvej hmotnosti.

IX. ANALÝZA EXPRESIE PSEJ GASTRICKEJ LIPÁZY V TRANSGENICKÝCH RASTLINÁCH RAJČIAKU

a) Protokol

Protokol extrakcie lipázy z listov a plodov rajčiaku je podobný protokolu, ktorý bol uvedený u listov tabaku, s výnimkou, že lg čerstvého materiálu je vybratý v 4 ml tlmivého roztoku B. Účinok lipázy je určený spôsobom, opísaným pri listoch tabaku.

b) Meranie dávky u plodov rajčiaku

Boli analyzované plody tridsiatich primárnych transf ormantov.

104

Účinok lipázy, meraný u rajčiaku sa menil v závislosti od plodu u rovnakého transformantu. Bol v priemeru 5 U na gram čerstvej hmotnosti pre zrelé plody a 35 5 U na gram čerstvej hmotnosti pre zelené plody, nezávisle na testovanom konštrukte (pBIOC25 alebo pBIOC26).

Stojí za povšimnutie, že v priebehu dozrievania plodu účinok klesá. Napríklad pre daný primárny transformant bol účinok lipázy 132 5 U na gram čerstvej hmotnosti pre zelený plod s priemerom 10 mm, 44 5 U na gram čerstvej hmotnosti pre červeno-zelený plod s priemerom 33 mm a 36 5 U na gram čerstvej hmotnosti pre červený plod s priemerom 45 mm.

X. IMUNODETEKCIA TYPU WESTERN REKOMBINANTNEJ PSEJ GASTRICKEJ LIPÁZY

a) Psia gastrická lipáza, exprimovaná v listoch a semenách transgenického tabaku a repky

a.l) Expresia s rastlinnými signálnymi peptidmi; imunodetekcia v listoch a semenách tabaku a repky transformovaných pomocou pBIOC25, pBIOC26 a pBIOC29.

Pokusy s imunodetekciou typu western (prenosy

Western - western-blots) (Renart a Sandovbal, 1984) s psou gastrickou lipázou boli vykonávané na proteínoch listov tabaku a semien tabaku a repky, extrahovaných tlmivými roztokmi A a B (pozri extrakčný protokol opísaný hore).

Na vykonávanie týchto pokusov boli extrahované proteíny (30 mg úplných proteinov na vzorku) najskôr separované na polyakrylamidovom géli, denaturujúcom na 12,5 % technikou, ktorú opísal Laemmli U.K. (1970) a potom prenesené na nitrocelulózovú membránu. Polyklonálne protilátky proti psej lipáze, získané z morčaťa, boli používané ako sonda a pre105 ukazovanie bolo uskutočnené prostredníctvom protilátky anti-IgG morčaťa, značkovanej alkalickou fosfatázou.

Porovnávacím proteínom bola prírodná psia gastrická lipáza (L.C. obr.6), ktorá migruje vo forme jediného pásu s zdanlivou molekulovou hmotnosťou zhruba 50 kDa. Migrácia psej gastrickej lipázy je mierne spozdená v prítomnosti extraktu z listov netransformovaného tabaku (obr. 6, LC+T).

Žiadny pás nebol detektovaný v proteínových extraktoch listov a semien netransformovaného tabaku a repky. Lipáza produkovaná v listoch tabaku sa objavuje vo forme 2 pásov. Kvantitatívne významnejší pás má zdanlivú molekulovú hmotnost zhruba 37 kDa a zodpovedá hore uvedenému polypeptidu (A54). Minoritný pás má zdanlivú molekulovú hmotnost zhruba 49 kDa a zodpovedá polypeptidu (a 4) uvedenému hore (obr. 6, F). V proteínových extraktoch semien je viditelný len pás s nižšou molekulovou hmotnosťou (obr. 6,

GT a GC).

a.2) Expresia so signálnymi peptidmi králičej gastrickej lipázy; imunodetekcia v listoch a semenách tabaku, transformovaného pomocou pBIOC41

Prenosy Western (Renart a Sandoval, 1984) boli vykonané s proteínmi listov a semien transformovaného tabaku, extrahovanými v tlmivom roztoku B (pozri extrakčný protokol, uvedený hore). Extrahované proteíny boli najskôr separované na denaturujúcom polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE) technikou, ktorú opísal Laemmli (1970) a potom prenesené na nitrocelulózovú membránu. Polyklonálna protilátka proti psej lipáze, získaná z morčaťa, bola používaná ako sonda a preukazovanie bolo vykonané pomocou protilátky proti morčati, označenej alkalickou fosfatázou.

106

Príklady prenosov Western u listov tabaku sú znázornené na obr. 7. Porovnávací proteín je psia gastrická lipáza, ktorá migruje vo forme jediného pásu so zdanlivou molekulovou hmotnosťou zhruba 50 kDa. Žiadny pás nebol detektovaný u proteínových extraktov z listov netransformovaného tabaku (T). Lipáza, produkovaná v extrakte listov, sa prezentuje vo forme jedného majoritného pásu so zdanlivou molekulovou hmotnosťou zhruba 49 kDa a zodpovedá hore uvedenému polypeptidu (Δ 4).

V semenách tabaku, transformovaného konštruktom pBIOC41, sa rekombinantná lipáza prezentuje v rovnakej forme v listoch.

b) Psia gastrická lipáza v proteínovom extrakte listov transformovaného tabaku: pokus s deglykozyláciou

Protokol extrakcie proteínov pre pokus s deglykozyláciou je nasledujúci: 0,5 g listov (čerstvá hmotnosť) bolo rozdrvených v tekutom dusíku a potom pri teplote 4°C v 1 ml denaturačného tlmivého roztoku (fosforečnanový tlmivý roztok 100 mM pH 7,5, doplnený 1 % β-merkaptoetanolom, 25 mM EDTA a 1 % SDS). Drvina bola centrífugovaná pri teplote 4°C počas 15 minút pri 10000 g. Supernatant bol inkubovaný počas 5 minút pri teplote 100°C, aby došlo k denaturácii proteínov, potom centrifugovaný počas 2 minút pri 10000 g. Supernatant bol potom zriedený na jednu desatinu v deglykozylačnom tlmivom roztoku (fosforečnanový tlmivý roztok 100 mM pH 7,5, doplnený 1 % β-merkaptoetanolom, 25 mM EDTA, 1 % SDS a 1 % oktylglykozidom). Do supernatantu je pridaný enzým (N-glykozidáza F, PNGáza Boehringer) v množstve 1 U na 100 μΐ supernatantu. Pre každú vzorku je vytvorená porovnávacia vzorka bez enzýmu. Deglykozylácia porovnávacieho proteínu (psia alebo králičia gastrická lipáza) sa vykonáva za rovnakých podmienok. Rôzne proteínové vzorky sú inkubované pri

107 teplote okolia počas 8 hodín. Proteíny sú potom separované elektroforézou na polyakrylamidovom géli a prenesené na nitrocelulózovú membránu spôsobom, opísaným v predchádzajúcom paragrafu.

Z výsledkov western-blots vyplýva, že gastrická lipáza, používaná ako porovnávacia vzorka, má zdanlivú molekulovú hmotnost zhruba 50 kDa. Po deglykozylácii jej zdanlivá molekulová hmotnost nie je väčšia ako zhruba 43 kDa.

Lipáza produkovaná v listoch tabaku sa po inkubácii bez PNGázy za podmienok opísaných hore prezentuje vo forme 3 pásov so zdanlivými molekulovými hmotnosťami 49 kDa (polypeptid [Δ4]), 37 kDa (polypeptid [Δ54]) a 28 kDa. Pás s molekulovou hmotnosťou 28 kDa je bezpochyby výsledkom proteolýzy, ktorá prebieha behom inkubácie počas 8 hodín pri teplote okolia. Po deglykozylácii sa molekulové hmotnosti 3 pásov znížia o zhruba 1 až 2 kDa, čo dokazuje, že proteíny, produkované v listoch tabaku sú glykozylované.

c) Psia gastrická lipáza exprimovaná v listoch a plodoch transgenického rajčiaku

Imunodetekčné pokusy typu Western s psou gastrickou lipázou boli vykonané pre proteíny z listov a plodov rajčiaku, extrahované tlmivým roztokom B (pozri extrakčný protokol, opísaný hore). Na urobenie týchto pokusov boli extrahované proteíny (15 μg a 6 μg úplných rozpustných proteínov pre listy, respektíve plody) separované na denaturujúcom polyakrylamidovom géli, ako to bolo opísané v paragrafu X.a.

Porovnávacím proteínom bola prírodná gastrická lipáza (stopa 4, obr. 8), ktorá migruje vo forme jediného pásu so zdanlivou molekulovou hmotnosťou zhruba 50 kDa.

108

Žiadny pás nebol detektovaný u proteínových extraktov listov a plodov netransformovaných rajčiakov.

Lipáza produkovaná v listoch a plodoch rajčiaku sa prezentuje vo forme 2 pásov, bez ohladu na použitý konštrukt (pBIOC25 alebo pBIOC26). Kvantitatívne významnejší pás má zdanlivú molekulovú hmotnost zhruba 37 kDa a zodpovedá hore uvedenému polypeptidu (δ 54). Minoritný pás má zdanlivú molekulovú hmotnost zhruba 49 kDa a zodpovedá hore uvedenému polypeptidu (a 4) (obr. 8).

XI. PURIFIKÁCIA PSEJ GASTRICKEJ LIPÁZY Z RASTLÍN

a) Purifikácia psej gastrickej lipázy z listov tabaku

Účinok psej gastrickej lipázy, produkovanej v listoch tabaku bol určený titrometrickou metódou, nastavené pH sa rovnalo 5,5 a teplota 37°C, používal sa prístroj pH-stat (Mettler-Toledo-DL25) a tributyrid ako substrát: 1 ml tributyridu bol emulzifikovaný v 29 ml vodného roztoku NaCl 0,15 M za vírenia. Určovanie bolo vykonávané neutralizáciou kyseliny maslovej, uvolňované pôsobením lipázy, pridaním hydroxidu sodného 0,02 N, zatial čo emulzia bola udržovaná pod intenzívnym mechanickým miešaním. Jedna jednotka lipázy zodpovedá 1 mikromolu mastnej kyseliny, uvolnenej za minútu za uvedených podmienok pH a teploty.

Po prvej etape chromatografie bol pokusnou vzorkou 0,5 ml preukázaný účinok lipázy na emulziu tributyridu v 29 ml roztoku 0,15 M NaCl, 2 mM taurodeoxycholátu sodného a 1,5 μΜ hovädzieho albumínového séra, postupovalo sa podlá metódy, ktorú opísal Gargouri a kol., (1986).

109

Jeden gram lyofilizovaných listov bol rozdrvený pri teplote 4°C v 30 ml glycínového tlmivého roztoku 20 mM pH

2,5 a ponechaný za mierneho miešania 15 minút. Počas macerácie bolo pH udržované na 2,5 pridaním IN HCl. Maceračný produkt bol centrifugovaný pri 15000 g počas 5 minút. pH supernatantu bolo upravené na 4 pridaním IN NaOH. Po filtrácii na zariadení MIRACLOTH (Calbiochem) bol celý supernatant prenesený na kolónu živice vymeňujúcu katióny (živica SSepharose Fast Flow - Pharmacia) s 10 ml (priemer 1,6 cm), vyváženej v tlmivom roztoku octanu sodného 20 mM pH 4,0, NaCl 20 mM s prietokom 1 ml za minútu. Boli zhromaždené frakcie 2 ml. Po priechodu supernatantu bola kolóna premývaná 40 ml ekvilibračného tlmivého roztoku. Proteíny, zadržané kolónou boli vymývané podía nasledujúceho protokolu:

lineárny gradient tlmivého roztoku octanu sodného 20 mM pH 4,0 od 20 mM do 210 mM NaCl počas 30 minút pre vymytie prvého súboru pikov proteínov, ktoré nevykazujú účinok lipázy, test je vykonávaný na vzorkách 1 ml, plató pri 210 mM NaCl počas 20 minút, lineárny gradient tlmivého roztoku octanu sodného 20 mM pH 4,0 od 210 mM do 500 mM NaCl počas 30 minút pre vymytie druhého súboru pikov. V priebehu tohto druhého gradientu boli vymyté proteíny s účinkom lipázy, merané vo vzorkách 0,5 ml, pri iónovej sile medzi 300 a 400 mM.

Aktívne frakcie boli zlúčené, koncentrované pomocou koncentračnej bunky OMEGACELL s limitom molekulovej hmotnosti 30 kDa (Filtron Technology Corporation).

Koncentrát bol dialyzovaný 12 hodín proti tlmivému roztoku Tris-HCl 10 mM pH 8 a potom aplikovaný na kolónu živice vymeňujúcej anióny (MonoQ HR 5/5 s priemerom 0,5 cm

110 a výškou 5 cm - Pharmacia), vyváženej tlmivým. roztokom Tris-HCl 10 mM pH 8. Účinok lipázy sa meril na vzorkách 0,5 ml. Prietok bol udržiavaný na hodnote 1 ml za minútu, čo zodpovedalo tlaku 2,0 MPa. Po vymytí nezadržanej frakcie a premývaní kolóny 10 ml tlmivého roztoku Tris-HCl 10 mM pH 8 bol aplikovaný lineárny gradient s iónovou silou od 0 do 400 mM NaCl za 60 minút. Proteiny s účinkom lipázy boli vymývané pri iónovej sile situovanej okolo 100 mM a 200 mM.

Aktívne frakcie boli zlúčené, koncentrované pomocou koncentračnej bunky OMEGACELL s limitom molekulovej hmotnosti 30 kDa (Filtron Technology Corporation). Koncentrát predstavoval purifikovanú formu psej gastrickej lipázy, extrahovanej z listov tabaku.

Určenie koncentrácie proteínov bolo vykonané metódou, ktorú opísal Bradford M. (1976), zo supernatantu koncentrátu a metódou podía Lowry O.H. (1951) pre roztoky po prvej chromatografii iónovej výmeny.

Rôzne etapy purifikácie boli analyzované elektroforézou na denaturujúcom polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE

12,5 %) technikou, ktorú opísal Laemmli U.K. (1970). Proteíny, ktoré boli týmto spôsobom separované na polyakrylamidovom géli boli na jednej strane preukázané farbením modrosťou a na druhej strane prenesené na nitrocelulózovú membránu technikou polosuchého elektroprenosu (Transblot SD, BIORAD) v tlmivom roztoku Tris Base 20 mM, glycín 150 mM a etanol 20 % pri 2,3 mA na cm² membrány. Rekombinantná psia gastrická lipáza prenesená na nitrocelulózovú membránu bola preukázaná imunodetekciou podlá nasledujúceho protokolu;

označenie cielového proteinu polyklonálnou protilátkou proti psej gastrickej lipáze, získanej u morčaťa a zriedené na 1/5000 v tlmivom roztoku PBS s pridaním prá111 škového mlieka, delipidovaného na 5 %, a 0,1 % Tween 20 počas 1 hodiny pri teplote okolí, premývanie membrány v troch po sebe nasledujúcich kúpeloch tlmivého roztoku PBS s pridaním práškového mlieka, delipidovaného na 1 %, a 0,1 % Tween 20 počas 10 minút pre každý kúpel, označenie protilátkami proti morčati spojenými s peroxidázou (Sigma) v zriedení 1/2000 v tlmivom roztoku PBS s pridaním práškového mlieka, delipidovaného na 1 %, a 0,1 % Tween 20 počas 1 hodiny pri teplote okolia, premývanie membrány v troch po sebe nasledujúcich kúpeloch tlmivého roztoku PBS s pridaním práškového mlieka, delipidovaného na 1 %, a 0,1 % Tween 20 počas 10 minút pre každý kúpel, preukázanie pôsobením peroxidázy na 4-chloro-lnaftolu (Sigma) v prítomnosti H₂O₂, ktorá vytvorí modré zafarbenie, stále v čase.

Lipáza, produkovaná v listoch, sa prezentuje v dvoch pásoch o zhruba 49 kDa (polypeptid ( 4)) a 37 kDa (polypeptid ( 54)).

b) Variant purifikácie psej gastrickej lipázy z listov tabaku

Účinok psej gastrickej lipázy, produkovanej v listoch tabaku bol určený titrimetrickou metódou, ktorú opísal Gargouri a kol., (1986) s pomocou pH-statu (METTLER-TOLEDO DL25).

112

Určovanie triglyceridov s krátkym reťazcom bolo vykonané s využitím tributyridu ako substrátu: 1 ml tributyridu bol emulzifikovaný v 29 ml vodného roztoku 0,15 M NaCl, 1,5 μΜ hovädzieho albumínového séra (BSA) a 2 mM taurodeoxycholátu sodného (NaTDC). Nastavené pH bolo 5,0 a teplota 37°C.

Určovanie spočívalo v neutralizácii kyseliny maslovej , uvolňovanej pôsobením lipázy pridaním hydroxidu sodného 0,02 N, zatial čo emulzia bola intenzívne mechanicky miešaná.

Určovanie triglyceridov s dlhým reťazcom bolo urobené tak, že ako substrát bola použitá vodná emulzia 30 % purifikovaného sójového oleja, 1,2 % purifikovaných fosfolipidov z vajiec, 1,67 % bezvodého glycerolu (Intralipid™ % - Pharmacia AB Stockholm, Švédsko). Desať ml tejto suspenzie bolo emulzifikovaných v 20 ml vodného roztoku NaCl 0,15 M, BSA 30 mM a CaCl₂ 3,5 mM. Nastavené pH malo hodnotu 4,0 a teplota bola rovná 37°C.

Určovanie spočívalo v neutralizácii mastných kyselín, uvoľňovaných pôsobením lipázy pridaním hydroxidu sodného 0,2 N po skoku pH z 4 na 9, zatial čo emulzia bola intenzívne mechanicky miešaná.

Jednotka lipázy zodpovedá jednému mikromolu mastnej kyséliny, uvolnenej za minútu v definovaných podmienkach pH a teplote pre každý substrát.

Dva gramy lyofilizovaných listov boli rozdrvené pri 4°C v 60 ml NaCl 0,2 M, pH 3 a ponechané za mierneho miešania počas 15 minút pri teplote 4°C. V priebehu tejto macerácie bolo pH udržované na 3 adíciou IN HCl. Produkt macerácie (homogenizát) bol centrifugovaný pri 10000 g počas

113 minút. Po filtrácii na MIRACLOTH (Calbiochem) a filtre MILLIPORE 0,45 μ, bolo celé množstvo supernatantu injektované na kolónu živice, vymenujúcej katióny (RESOURCE S 6 ml

Pharmacia - 16 mm 30 mm), vyváženú tlmivým roztokom octan sodný 20 mM, NaCi 0,2 M pH 3 pri prietoku 8 ml/min (240 cm/h).

Po priechodu nezadržanej frakcie bola kolóna premývaná 30-násobkom svojho objemu ekvilibračného tlmivého roztoku. Proteíny, zadržané na kolóne boli vymývané lineárnym gradientom tlmivého roztoku octan sodný 20 mM pH 3 a od 0,2 M NaCi do 0,5 M NaCi v siedmich objemoch kolóny. Boli odoberané frakcie 4 ml.

Proteíny s účinkom lipázy, meraným zo vzoriek 0,5 ml, boli vymývané pri iónovej sile 0,35 M NaCi.

Aktívne frakcie boli zlúčené a koncentrované koncentračnou bunkou OMEGACELL (Filtron Technology Corporation) s limitnou molekulovou hmotnosťou 30 kDa.

Určenie koncentrácie proteínov bolo vykonané metódou, ktorú opísal Lowry O.H. (1951).

Príklad polyakrylamidového gélu a výsledku prenosu tohto gélu na nitrocelulózovú membránu a preukázanie pomocou protilátok proti psej gastrickej lipáze sú ukázané na obr. 9 a 10. Preukázanie bolo uskutočnené pôsobením peroxidázy na Luminol v prítomnosti aktivátoru (ECL Western blotting - AMERSHAM LIFE SCIENCE) a impresiou fotografického filmu.

Prítomnosť glykánových rezíduí na proteínu bola určená nasledujúcim protokolom:

114 imobilizácia proteinu na nitrocelulózovej membráne,

- pôsobenie jodistanom špecifická reakcia so streptavidinom, viazaným na alkalickú fosfatázu farebná reakcia alkalickej fosfastázy (GLYCOTRACK OXFORD GLYLOSYSTEM)

Príklad membrány detekcie glykánových rezíduí je ukázaný na obr. 11.

Čistota frakcií je zaistená vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou.

Chromatograf WATERS 625 LC

Detektor s diódovou lištou WATERS 991

Kolóna VYDAC C4

Podmienky vymývania

Čas (τη/'η)	Prietok (ml/min)	% A	% B
0	1	100	0
35	1	40	60
40	1	40	60
45	1	20	80
50	1	100	0

115

Tlmivý roztok A: 89,9 % H₂0 10 acetonitrilu, 0,1 % kyseliny trifluóroctovej

Tlmivý roztok B: 100 % acetonitrilu

Tabuľka purifikácie: rekombinantná psia gastrická lipáza

	Celkových jednotiek*	mg proteínov	Špecifický účinok	Faktor purifikácie	Výťažok
Homogenát	3200	/	/	/	/
Supernatant 2800	230	13	1	88 %
Výstup S	1600	6	250	20	50 %

* Jednotiek tributyridu

Porovnanie špecifických účinkov prírodnej pse~i gastrickej lipázy (n-LGC) a rekombinantnej psej gastrickej lipázy (r-LGC)

	n-LGC*	r-LGC extrahovaná z listov tabaku
Tributyrid	570 U/mg	250 U/mg
Intralipid 30 %	1000 U/mg	950 U/mg

* referencia: Carriére a kol. (1991) Eur. J. Biochem. 202. 75-83 .

116

c) Purifikácia psej gastrickej lipázy zo semien repky

Účinok rekombinantnej psej gastrickej lipázy produkovanej v semenách repky bol určený rovnakým spôsobom, ako v prípade extrakcie z listov.

Desať gramov semien repky sa rozdrvilo v tekutom dusíku. Získaná múka bola delipidováná v hexáne prvou maceráciou pri teplote 4°C za miešania počas 12 hodín. Všetko bolo dekantované a hexán bol eliminovaný. Múka bola premývaná dvakrát 100 ml hexánu za mierneho miešania počas 1/2 hodiny pri teplote 4°C pre každé premývanie. Hexán bol eliminovaný dekantáciou. Múka bola sušená v rotačnom odparovači (HEIDOLPH 94200). Delipidováná múka bola uchovávaná pri teplote -20°C.

Extrakcia psej gastrickej lipázy bola vykonaná z delipidovanej múky maceráciou pri teplote 4°C vo vodnom roztoku 0,2 M NaCI pH 3 (IN HCI) počas 30 minút v objeme 2 ml vodného roztoku na 0,1 g múky. Výsledok macerácie bol centrifugovaný pri 10000 g počas 10 minút pri teplote 4‘C.

Usadenina bola eliminovaná. Supernatant je tvorený extraktom zo semien repky.

Extrakt zo semien bol dialyzovaný proti tlmivému roztoku octanu sodného 10 mM pH 4, NaCI 140 mM, KC1 3 mM, a potom bol aplikovaný na imunoafinitnú kolónu, tvorenú polyklonálnymi protilátkami proti psej gastrickej lipáze, získanými u morčaťa a viazanými na živicu (hydrazid Avidgel - BIOPROBE INTERNATIONAL, Inc.)

Kontakt živica-extrakt semien trval 30 minút pri teplote 4°C za mierneho miešania. Živica potom bola premývaná objemami kolóny tlmivého roztoku octanu sodného 10 mM, pH

117

4, NaCI 150 mM, KC1 3 mM. Psia gastrická lipáza bola vymývaná 5 objemami kolóny tlmivého roztoku glycín 0,2 M, pH 2,8, NaCI 150 mM. Odoberané frakcie mali rovnaký objem, ktorý sa rovnal jednému objemu kolóny a obsahovali jednu dvadsatinu objemové tlmivého roztoku Tris IM pH 9. Analýza elektroforézou na polyakrylamidovom géli v denaturujúcom prostredí (viď obr. 12) ukazuje proteín s molekulovou hmotnosťou zhruba 37 kDa.

XII. SYNTÉZA ESTERU MASTNÝCH KYSELÍN

Pokusy boli realizované s netransformovanými semenami repky, pričom lipáza bola dodaná:

buď vo forme imobilizovaného enzymatického prípravku (lipozym (NOVO)) alebo voíného enzymatického prípravku (králičia gastrická lipáza (JO 4002)), alebo vo forme transformovaných semien tabaku s génom psej gastrickej lipázy (tabak T14-44 0,85 % expresie).

Reakcia esterifikácie bola vykonávaná pri teplote 37°C počas 16 hodín v sklenených fíašiach, hermeticky uzatvorených a umiestnených na trepačke (250 otáčok/min). Použité organické rozpúšťadlo je hexán, v ktorom sú mastné kyseliny rozpustné. Je pridaný metanol v stechiometrickom pomere vzhíadom k teoretickému množstvu triacylglycerolu, obsiahnutému v semenách repky.

Hlavná zložka mastných kyselín repky je kyselina olejová, referenčná porovnávacia látka je metylester kyseliny olejovej. Sledovanie syntézy sa vykonáva chromatografiou na tenkej vrstve (CCM). Migračné rozpúšťadlo je zmes hexánu, dietyléteru a vody (70:10:1). Vyvolávanie dosiek sa uskutočňuje za tepla po pulverizácii kyselinou sírovou (5 %) v etanole.

118

V prvom pokuse bolo pridaných do 0,2 g repkového oleja (0,22 mmolu) 27 μΐ metanolu (0,66 mmolu) a 0,02 g lipozymu: na úrovni referenčného metylesteru kyseliny olejovej sa neobjavila žiadna škvrna (obr. 13, stĺpec 2).

V druhom pokuse bol repkový olej nahradený 0,5 g semien repky, rozdrvených za sucha a bol pridaný 1 ml hexánu: došlo k syntéze metylesteru (obr. 13, stĺpec 5).

V dalších pokusoch boli opakované hore uvedené podmienky s nasledujúcimi zmenami: množstvo lipozymu bolo znížené na 0,006 g a lipozym bol nahradený králičou gastrickou lipázou (0,007 g JO 4002). Došlo k syntéze metylesteru kyseliny olejovej v prítomnosti lipozymu, ale nie v prítomnosti JO 4002 (obr. 14, stĺpec 2).

Nakoniec, v poslednom pokuse, bola dodaná lipáza v semenách transformovaného tabaku (1 g semien tabaku). Objavila sa charakteristická škvrna metylesteru (obr. 15, stĺpec 3).

Z uvedeného vyplýva, že hore opísané výsledky dokazujú, že ked sú súčasne použité semená repky, alkohol a rekombinantná psia gastrická lipáza, produkovaná transgenickým tabakom, dôjde k reakcii esterifikácie, ktorá vedie k syntéze metylesteru, ktorý môže slúžiť ako biopalivo.

Opis obrázkov:

obr. 1: nukleotidová sekvencia cDNA, kódujúca psiu gastrickú lipázu, obr. 2: sekvencia aminokyselín psej gastrickej lipázy,

119 obr. 3: nukleotidová sekvencia odvodená od cDNA, kódujúca psiu gastrickú lipázu a kódujúca psiu gastrickú lipázu z obr. 2, obr. 4: nukleotidová sekvencia cDNA, kódujúca ľudskú gastrickú lipázu a sekvencie aminokyselín ľudskej gastrickej lipázy, obr. 5: sekvencia aminokyselín ľudskej gastrickej lipázy, obr. 6: imunodetekcia rekombinantných polypeptidov, produkovaných listmi a semenami tabaku Xanthi a semien repky, transformovaných konštruktami pBIOC26, pBIOC25 a pBIOC29; E, škála molekulových hmotností; LG, psia gastrická lipázä; F, listy tabaku a GT, semená tabaku, transformovaného konštruktom pBIOC25; GC, semená repky, transformované konštruktom pBIOC29; T, listy netransformovaného tabaku, obr. 7: imunodetekcia rekombinantných polypeptidov, produkovaných listmi tabaku, transformovaného konštruktom pBIOC25 alebo pBIOC41; E, škála molekulových hmotností; LG, psia gastrická lipáza; 1 a 3, listy tabaku, transformovaného konštruktom pBIOC41; 2, listy tabaku, transformovaného konštruktom pBIOC25; T, listy netransformovaného tabaku, obr. 8: imunodetekcia rekombinantných polypeptidov, produkovaných listmi a plodmi rajčiaku, transformovaných konštruktom pBIOC25 a pBIOC26:

TI: netransformovaný plod rajčiaku, a 3: plody transformovaného rajčiaku,

2: listy transformovaného rajčiaku,

E: škála molekulových hmotností,

120

LC: psia gastrická lipáza,

T2: listy netransformovaného rajčiaku, obr. 9: analýza elektroforézou na polyakrylamidovom géli v denaturujúcom prostredí (SDS-PAGE),

1: extrakt semien repky,

2: rekombinantná psia gastrická lipáza, produkovaná listmi tabaku,

3: prírodná psia gastrická lipáza,

4: škála molekulových hmotností, obr. 10: imunologický výsledok predchádzajúcej analýzy po prenose na nitrocelulózovú membránu,

1: prírodná psia gastrická lipáza,

2: rekombinantná psia gastrická lipáza, produkovaná listmi tabaku,

3: extrakt semien repky, obr. 11: zisťovanie prítomnosti glykánových rezíduí pomocou polyakrylového gélu po prenose na nitrocelulózovú membránu,

1: extrakty semien repky,

2: rekombinantná psia gastrická lipáza, produkovaná listmi tabaku,

3: prírodná psia gastrická lipáza, obr. 12: analýza SDS-PAGE imunopurifikáciou r-DGL, produkovanej v semenách repky,

1: prírodná psia gastrická lipáza,

2: rekombinantná psia gastrická lipáza, až 6: nezadržané frakcie, vymývané z imunopurifikačnej kolóny, obr. 13: vyvolanie dosky chromatografie na tenkej vrstve (CCM); 1: repkový olej, bez enzýmu, 2: repkový

121 olej 1 lipozym; 3: metylester kyseliny olejovej;

4: semená repky, bez enzýmu; 5: semená repky 1 lipozym, obr. 14: vyvolanie dosky chromatografie na tenkej vrstve (CCM); 1 a 4 semená repky bez enzýmu; 2 semená repky + JO 4002; 3: metylester kyseliny olejovej; 5: semená repky + lipozym, obr. 15: vyvolanie dosky chromatografie na tenkej vrstve (CCM); 1: monooleín, dioleín, trioleín; 2: metylester kyseliny olejovej; 3: transformované semená repky + semená tabaku.

BIBLIOGRAFICKÉ REFERENCIE

An a kol., Plánt Physiol., 81, 301-305 (1986).

An a kol., Plánt Physiol., 81, 86-91 (1986).

Aoubala M., Daniel C., De Čaro A., Ivanova M.G., Hirn M., Sarda L. a Verger R., Eur. J. Biochem. 211, 99-104 (1993).

Barta a kol., Plánt Mol. Biol., 6, 347-357 (1986).

Bednarek S.Y. a Ralkhel N.V., The Plánt Celí, 3, 1195-1206 (1991).

Berg D.E., Berg C.M., Biotechnology, 1, 417-435 (1983).

Bernard C., C.R. Acad. Sci. 28, 249-253 (1849).

Bevan a kol., Náture, 304, 184-187 (1983).

Bevan M., Nucleic Acids. Res., 12, 8711-8721 (1984).

122

Birnboim C., Doly J., Nucl. Acids. Res., 7, 1513-1523 (1979).

Bodmer M.W. a kol., Biochem Biophys. Acta, 909, 237-244 (1987) .

Bradford M., Anál Biochem., 72, 248 (1976).

Brodelius a kol., FEBS Letters, 103, 93-97 (1979).

Brodelius, v: Moo-Young M. (Ed), Bioreactor Immobilized Enzymes and Cells: Fundamentals and Applications, Elsevier, Londýn (1988).

Carriére a kol., Eur. J. Biochem., 202, 75-83 (1991).

Carriére F., Laugier R., Barrowman J.A., Douchet J., Piymenko N. a Verger R., Scand. J. Gastroenterology, 28, 443-454 (1993).

Closa J.J., Rodriguez R.L., Gene, 20, 305-316 (1982).

De La Penna a kol., Náture, 325, 274-276 (1987).

Deno a kol., J. Plánt. Physiol., 131, 315-322 (1987).

Depicker a kol., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-573 (1982).

Depigny-This a kol., Plánt. Mol. Biol., 20, 467-479 (1992).

De Zoeten a kol., Virology, 172, 213-222 (1989).

123

Docherty A.J.P. a kol., Nucl. Ac. Res., 13, 1891-1903 (1985).

Edelbaum a kol., J. of Interferon Research/ 12, 449-453 (1992).

Franck a kol., Celí, 21, 285-294 (1980).

Fillatti J.J., Kiser J., Rosa R. a Comai L., Biotechnológie, 5, 726-730 (1987).

Gamborg O.L., Miller R.A. a Ojima K., Exp. Celí. Res., 50, 151-158 (1968).

Gargouri Y., Pietroni G., Riviére C., Sauniére J-F., Lowe P.A., Sarda L. a Verger R., Gastroenterology, 91, 919-925 (1986).

Gargouri Y. a kol., Biochem. Biophys. Act., 1006, 255-271 (1989) .

Gaubier a kol., Mol. Gen. Genet., 238, 409-418 (1993).

Giller a kol., J. Biol. Chem., 267, 16509-16516 (1992).

Guerineau F., Mullineaux P., Plánt Molecular Biology LABFAX, Groy R.R.D. (Ed), Nios. Scientific Publishers, Blackwell Scientific Publications, 121-147 (1993).

Hanahan D., J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983).

Hein R., International Meeting of Production of Recombinant Proteins in Plants, Leicester, str. 22 (1994).

124

Herrera-Estrella a kol., Náture, 303, 209-213 (1983a).

Herrera-Estrella a kol., EMBO J., 2, 987-995 (1983b).

Hiatt a Ma, FEBS, 307, 71-75 (1992).

Hiatt a kol., Náture, 342, 76-79 (1989).

Higo a kol., Biosci. Biochem., 57, 1477-1481 (1993).

Holsters a kol., Mol. Gen. Genet., 163, 181-187 (1978).

Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D. a Rogers S.G., Science, 227, 1229-1231 (1985).

Jouanin a kol., Plánt Sci. 53, 53-63 (1987).

Kay a kol., Science, 236, 1299-1302 (1987).

Laemmli U.K., Náture, 227, 680-685 (1970).

Liu a kol., Mol. Plánt. Microb. Interactions, 6, 144-156 (1993) .

Lowry O.H., J. Biol. chem., 173, 265-275 (1951).

Ma a kol., International Meeting of Production of Recombinant Proteins in Plants, Leicester, str. 39-40 (1994).

McElroy a kol., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160 (1991).

Marx, Science, 216, 1305-1307 (1982).

Mason a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11745-11749 (1992).

125

Matsuoka K., Nakamura K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 834-838 (1991).

Moloney a kol., International Meeting of Production of Recombinant Proteins in Plánt, Leicester, str. 36-38 (1994)

Moreau H. a kol., Biochem. Biophys. Act. , 960¹, 268-293 (1988) .

Murakami a kol., Plánt Mol. Biol., 7, 343-355 (1986).

Murashige T. a Skoog F., Physiol. Planetarum, 15, 473-497 (1962).

Ni a kol., Plánt J., 7, 661-676 (1995).

Reina a kol., Nucleic Acid Research, 18, 6426 (1990).

Renart J. a Sandoval J.V., Meth. Enzymol., 104, 455-460 (1984) .

Russel D., International Meeting of Production of Recombinant Proteins in Plants, Leicester, str. 43 (1994).

Sambrook a kol., Molecular Cloning Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Sanford J.C., Trends in Biotechnology, 6, 299-302 (1988).

Sanger a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977)

Schroeder M.R., Borkhsenious O.N., Matsuoka K., Nakamura K. a Ralkhel N.V., Plánt Physiol. 101, 451-458 (1993).

126

Shonheyder F. a Volquatz K., Acta Physiol. Scand., 9, 57-67 (1945).

Sijmons a kol., Biotechnology, 8, 217-221 (1990).

Thomas B.R. a Pratt D., Theor.Appl.Genet., 59, 215-219 (1981).

Truve a kol., Biotechnology, 11, 1048-1052 (1993).

Vandekerckhove a kol., Biotechnology, 7, 929-932 (1989).

Volhard F., Z. Klin. Med., 42, 414-429 (1901).

127

ZOZNAM SEKVENCII (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATEĽ:

(A)	MENO:	BIOCEM S.A.
(B)	ULICA:	24, avenue des Landais
(C)	MESTO:	AUBIERE
(E)	ŠTÁT:	FRANCIA
(F)	POŠTOVÝ KÓD: 63170
(A)	MENO:	INŠTITÚT DE RECHERCHE JOUVEINAL
(B)	ULICA:	3-9, rue de la Loge
(C)	MESTO:	FRESNES
(E)	ŠTÁT:	FRANCIA
(F)	POŠTOVÝ KÓD: 94265 CEDEX

(ii) NÁZOV VYNÁLEZU: REKOMBINANTNÉ PREDUODENÁLNE LIPÁZY A POLYPEPTIDOVÉ DERIVÁTY PRODUKOVANÉ RASTLINAMI, SPÔSOB ICH ZÍSKAVANIA A POUŽITIA (iii) POČET SEKVENCIÍ: 6 (iv) FORMA VHODNÁ PRE POČÍTAČOVÉ SPRACOVANIE (A) DRUH NOSIČA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC compatible (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Release #1.0,

Version #1.25 (OEB)

128 (vi) ÚDAJE TÝKAJÚCE SA PREDCHÁDZAJÚCEJ PRIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PODANIA: FR 9504754 (B) DÁTUM PODANIA: 20. apríla 1995 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DÚŽKA: 1528 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURÁCIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA pre mRNA (ix) DOPLNKOVÁ CHARAKTERISTIKA:

(A) MENO/KÚÚČ: CDS (B) POLOHA: 1..1137 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:

TTG

TTT

GGA

AAG

CTT

CAT

CCC

ACA

AAC

CCT

GAA

GTG

ACC

ATG

AAT

ATA

Leu

Phe

Gly

Lys

Leu

His

Pro

Thr

Asn

Pro

Glu

Val

Thr

Met

Asn

íle

1

5

10

15

AGT

CAG

ATG

ATC

ACC

TAC

TGG

GGA

TAC

CCA

GCT

GAG

GAA

TAT

GAA

GTT

Ser

Gin

Met

íle

Thr

Tyr

Trp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Glu

Glu

Tyr

Glu

Val

20

25

30

GTG ACC GAA GAC GGT TAT ATC CTT GGG ATC GAC AGA ATT CCT TAT GGG 144

129

Val Thr Glu Asp Gly Tyr íle Leu Gly íle Asp Arg íle Pro Tyr Gly

AGG AAA AAT TCA GAG AAT ATA GGC CGG AGA CCT GTT GCA TTT TTG CAA 192

Arg Lys Asn Ser Glu Asn íle Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gin

CAC GGT TTG CTC GCA TCA GCC ACA AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC 240

His Gly Leu Leu Ala Ser Ala Thr Asn Trp íle Ser Asn Leu Pro Asn

AAC AGC CTG GCC TTC ATC CTG GCC GAC GCC GGG TAC GAC GTG TGG CTG 288

Asn Ser Leu Ala Phe íle Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Val Trp Leu

GGG AAC AGC AGG GGC AAC ACC TGG GCC AGG AGG AAT CTG TAC TAC TCG 336

Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser

100

105

110

CCC GAC TCC GTC GAA TTC TGG GCT TTC AGC TTT GAC GAG ATG GCT AAA 384

Pro Asp Ser Val Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys

115

120

125

130

TAT GAC CTT CCC GCC ACC ATT GAC TTC ATC TTG AAG AAA ACG GGA CAG 43 2

Tyr Asp Leu Pro Ala Thr íle Asp Phe íle Leu Lys Lys Thr Gly Gin

130

135

140

GAC AAG CTA CAC TAC GTT GGC CAT TCC CAG GGC ACC ACC ATT GGT TTC 480

Asp Lys Leu His Tyr Val Gly His Ser Gin Gly Thr Thr íle Gly Phe

145

150

155

160

ATC GCC TTT TCC ACC AAT CCC AAG CTG GCG AAA CGG ATC AAA ACC TTC 528 íle Ala Phe Ser Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg íle Lys Thr Phe

165

170

175

TAT GCA TTA GCT CCC GTT GCC ACC GTG AAG TAC ACC GAA ACC CTG TTA 576

Tyr Ala Leu Ala Pro Val Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu

180

185

190

AAC AAA CTC ATG CTC GTC CCT TCG TTC CTC TTC AAG CTT ATA TTT GGA 624

Asn Lys Leu Met Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu íle Phe Gly

195

200

205

AAC AAA ATA TTC TAC CCA CAC CAC TTC TTT GAT CAA TTT CTC GCC ACC 67 2

Asn Lys íle Phe Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gin Phe Leu Ala Thr

210

215

220

131

GAG GTA n;e Tee cGC GAG ACG GTG GAT CTC CTC TGC AGC AAC GCC CTG 7 20

Glu Val Cys Ser Arg Glu Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Asn Leu

225

230

235

240

TTT ATC ATT TGT GGA TTT GAC ACT ATG AAC TTG AAC ATG AGT CGC TTG 768

Phe íle íle Cys Gly Phe Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu

245

250

255

GAT GTG TAT CTG TCA CAT AAT CCA GCA GGA ACA TCG GTT CAG AAC GTG 816

Asp Val Tyr Leu Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gin Asn Val

260

265

270

CTC CAC TGG TCC CAG GCT GTT AAG TCT GGG AAG TTC CAA GCT TTT GAC 864

Leu His Trp Ser Gin Ala Val Lys Ser Gly Lys Phe Gin Ala Phe Asp

275

280

285

TGG GGA AGC CCA GTT CAG AAC ATG ATG CAC TAT CAT CAG AGC ATG CCT 912

Trp Gly Ser Pro Val Gin Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met Pro

290

295

300

CCC TAC TAC AAC CTG ACA GAC ATG CAT GTG CCA ATC GCA GTG TGG AAC 960

Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr Asp Met His Val Pro íle Ala Val Trp Asn

305

310

315

320

132

GGT	GGC AAC	GAC	TTG	CTG GCC GAC	CCT CAC GAT GTT GAC	CTT TTG CTT	1008
Gly	Gly Asn	Asp	Leu	Leu Ala Asp	Pro His Asp Val Asp	Leu Leu Leu
			325		330	335
TCC	AAG CTC	CCC	AAT	CTC ATT TAC	CAC AGG AAG ATT CCT	CCT TAC AAT	1056
Ser	Lys Leu	Pro	Asn	Leu íle Tyr	His Arg Lys íle Pro	Pro Tyr Asn
		340			345	350
CAC	TTG GAC	TTT	ATC	TGG GCC ATG	GAT GCC CCT CAA GCG	GTT TAC AAT	1104
His	Leu Asp	Phe	íle	Trp Ala Met	Asp Ala Pro Gin Ala	Val Tyr Asn
	355			360	365
GAA	ATT GTT	TCC	ATG	ATG GGA ACA	GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT 11
Glu	íle Val	Ser	Met	Met Gly Thr	Asp Asn Lys

TATTCTTTTA TTGTTCCAAA ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCATGTTTGA 1217

GACACGGTGA TTGTTCCCAT GGTTTTGATT TCAGAAATGT GTTAGCATCA ACAATCTTTC 1277

CATTGGTAAT TTTTGAATTT AAAATGATTT TTAAATTTGG GGCATCTGGG TGGCTCAGTT 1337

GGCTAAGTCG TCTGCCTTGG CTTAAGTCAT GATCTCGGGG TCCTAGGATG GAGCCTTGTG 1397

TCTGGGCTCC TGCCGGGGCG GGGGTCTGCT TCTCCTCCTG CTGCTCCCCC CTGCTGCTGT 1457

GTGCACACAC GCTCTCTCTC TCTCAAATAA ATAAATAAAT AAATACTTAA TAAAATAAAA 1517

AAAAAAAAAA A 1528

133 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 379 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) KONFIGURÁCIA:lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 2:

Leu 1

Phe

Gly

Lys Leu His 5

Pro Thr Asn

Pro 10

Glu

Val

Thr

Met

Asn 15

íle

Ser

Gin

Met

íle

Thr

Tyr

Trp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Glu

Glu

Tyr

Glu

Val

20

25

30

Val

Thr

Glu

Asp

Gly

Tyr

íle

Leu

Gly

íle

Asp

Arg

íle

Pro

Tyr

Gly

35

40

45

Arg

Lys

Asn

Ser

Glu

Asn

íle

Gly

Arg

Arg

Pro

Val

Ala

Phe

Leu

Gin

50

55

60

His

Gly

Leu

Leu

Ala

Ser

Ala

Thr

Asn

Trp

íle

Ser

Asn

Leu

Pro

Asn

65

70

75

80

Asn

Ser

Leu

Ala

Phe

íle

Leu

Ala

Asp

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp

Leu

134

Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser

100

105

110

Pro Asp Ser Val Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys

115

120

125

Tyr Asp Leu Pro Ala Thr íle Asp Phe íle Leu Lys Lys Thr Gly Gin

130

135

140

Asp Lys Leu His Tyr Val Gly His Ser Gin Gly Thr Thr íle Gly Phe

145

150

155

160 íle Ala Phe Ser Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg íle Lys Thr Phe

165

170

175

Tyr Ala Leu Ala Pro Val Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu

180

185

190

Asn Lys Leu Met Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu íle Phe Gly

195

200

205

Asn Lys íle Phe TLr Pro His His Phe Phe Asp Gin Phe Leu Ala Thr

210

215

220

135

Glu Val Cys Ser Arg Glu Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu

225 230 235 240

Phe íle íle Cys Gly Phe Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu

245 250 255

Asp Val Tyr Leu Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gin Asn Val

260 265 270

Leu His Trp Ser Gin Ala Val Lys Ser Gly Lys Phe Gin Ala Phe Asp

275 280 285

Trp Gly Ser Pro Val Gin Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met Pro

290 295 300

Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr Asp Met His Val Pro íle Ala Val Trp Asn

305 310 315 320

Gly Gly Asn Asp Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu

325

330

335

Ser Lys Leu Pro Asn Leu íle Tyr His Arg Lys íle Pro Pro Tyr Asn

340

345

350

136

His Leu Asp Phe íle Trp Ala Met Asp Ala Pro Gin Ala Val Tyr Asn

355 360 365

Glu íle Val Ser Met Met Gly Thr Asp Asn Lys

370 375 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1048 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvojitá (D) KONFIGURÁCIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (génomická) (ix) DOPLNKOVÁ CHARAKTERISTIKA:

(A) MENO/KĹÚČ: CDS (B) POLOHA: 1..975 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 3:

ATA GGC CGG AGA CCT GTT GCA TTT TTG CAA CAC GGT TTG CTC GCA TCA 48 íle Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gin His Gly Leu Leu Ala Ser

10 15

GCC ACA AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC AAC AGC CTG GCC TTC ATC 96

Ala Thr Asn Trp íle Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Phe íle

137

CTG GCC GAC GCC GGG

Leu Ala Asp Ala Gly

ACC TGG GCC AGG AGG

Thr Trp Ala Arg Arg

TGG GCT TTC AGC TTT

Trp Ala Phe Ser Phe

ATT GAC TTC ATC TTG íle Asp Phe íle Leu

GGC CAT TCC CAG GGC

Gly His Ser Gin Gly

100

TAC	GAC	GTG	TGG	CTG	GGG
Tyr	Asp	Val	Trp	Leu	Gly
		40
AAT	CTG	TAC	TAC	TCG	CCC
Asn	Leu	Tyr	Tyr	Ser	Pro
	55
GAC	GAG	ATG	GCT	AAA	TAT
Asp	Glu	Met	Ala	Lys	Tyr
70					75
AAG	AAA	ACG	GGA	CAG	GAC
Lys	Lys	Thr	Gly	Gin	Asp
				90
ACC	ACC	ATT	GGT	TTC	ATC
Thr	Thr	íle	Gly	Phe	íle
			105

AAC AGC AGG GGC AAC 146

Asn Ser Arg Gly Asn

GAC TCC GTC GAA TTC 192

Asp Ser Val Glu Phe

GAC CTT CCC GCC ACC 240

Asp Leu Pro Ala Thr

AAG CTA CAC TAC GTT 288

Lys Leu His Tyr Val

GCC TTT TCC ACC AAT 336

Ala Phe Ser Thr Asn

110

CCC AAG CTG GCG AAA CGG ATC AAA ACC TTC TAT GCA TTA GCT CCC GTT 384

138

Pro Lys Leu Ala Lys Arg íle Lys

115 120

GCC ACC GTG AAG TAC ACC GAA ACC

Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr

130 135

CCT TCG TTC CTC TTC AAG CTT ATA

Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu íle

145 150

CAC CAC TTC TTT GAT CAA TTT CTC

His His Phe Phe Asp Gin Phe Leu

165

ACG GTG GAT CTC CTC TGC AGC AAC

Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn

180

GAC ACT ATG AAC TTG AAC ATG AGT

Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser

195 200

AAT CCA GCA GGA ACA TCG GTT CAG

Thr Phe Tyr Ala Leu Ala Pro Val

125

CTG TTA AAC AAA CTC ATG CTC GTC 432

Leu Leu Asn Lys Leu Met Leu Val

140

TTT GGA AAC AAA ATA TTC TAC CCA 480

Phe Gly Asn Lys íle Phe Tyr Pro

155 160

GCC ACC GAG GTA TGC TCC CGC GAG 528

Ala Thr Glu Val Cys Ser Arg Glu

170 175

GCC CTG TTT ATC ATT TGT GGA TTT 576

Ala Leu Phe íle íle Cys Gly Phe

185 190

CGC TTG GAT GTG TAT CTG TCA CAT 624

Arg Leu Asp Val Tyr Leu Ser His

205

AAC GTG CTC CAC TGG TCC CAG GCT 672

139

Asn Pro Ala Gly Thr

210

GTT AAG TCT GGG AAG

Val Lys Ser Gly Lys

225

AAC ATG ATG CAC TAT

Asn Met Met His Tyr

245

GAC ATG CAT GTG CCA

Asp Met His Val Pro

260

GCC GAC CCT CAC GAT

Ala Asp Pro His Asp

275

ATT TAC CAC AGG AAG íle Tyr His Arg Lys

Ser Val Gin Asn Val Leu

215

TTC CAA GCT TTT GAC TGG

Phe Gin Ala Phe Asp Trp

230 235

CAT CAG AGC ATG CCT CCC

His Gin Ser Met Pro Pro

250

ATC GCA GTG TGG AAC GGT íle Ala Val Trp Asn Gly

265

GTT GAC CTT TTG CTT TCC

Val Asp Leu Leu Leu Ser

280

ATT CCT CCT TAC AAT CAC íle Pro Pro Tyr Asn His

His Trp Ser Gin Ala

220

GGA AGC CCA GTT CAG 720

Gly Ser Pro Val Gin

240

TAC TAC AAC CTG ACA 768

Tyr Tyr Asn Leu Thr

255

GGC AAC GAC TTG CTG 816

Gly Asn Asp Leu Leu

270

AAG CTC CCC AAT CTC 864

Lys Leu Pro Asn Leu

285

TTG GAC TTT ATC TGG 912

Leu Asp Phe íle Trp

290

295

300

140

GCC ATG GAT GCC CCT CAA GCG GTT TAC AAT GAA ATT GTT TCC ATG ATG 960

Ala Met Asp Ala Pro Gin Ala Val Tyr Asn Glu íle Val Ser Met Met

305 310 315 320

GGA ACA GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT TATTCTTTTA TTGTTCCAAA 1015

Gly Thr Asp Asn Lys

325

ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCA 1048 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DÍiŽKA: 325 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) KONFIGURÁCIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 4:

íle Gly Arg Rrg Pro Val Ala Phe Leu Gin His Gly Leu Leu Ala Ser

10 15

Ala Thr Asn Trp íle Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Phe íle

141

Leu Ala Asp Ala Gly Sr Asp Val Trp Leu Gly Asn Ser Arg Gly Asn

Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Sr Sr Ser Pro Asp Ser Val Glu Phe

Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala Thr íle Asp Phe Ile Leu Lys Lys Thr Gly Gin Asp Lys Leu His Tyr Val

Gly His Ser Gin Gly Thr Thr Ile Gly Phe íle Ala Phe Ser Thr Asn

100

105

110

Pro Lys Leu Ala Lys Arg Ile Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala Pro Val

115

120

125

Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met Leu Val

130

135

140

Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu íle Phe Gly Asn Lys Ile Phe Tyr Pro

145

150

155

160

142

His His Phe Phe Asp Gin Phe Leu Ala Thr Glu Val Cys Ser Arg Glu

165

170

175

Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe íle íle Cys Gly Phe

180

185

190

Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu Asp Val Tyr Leu Ser His

195

200

205

Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gin Asn Val Leu His Trp Ser Gin Ala

210

215

220

Val Lys Ser Gly Lys Phe Gin Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro Val Gin

225

230

235

240

Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr

245

250

255

Asp Met His Val Pro íle Ala Val Trp Asn Gly Gly Asn Asp Leu Leu

260

265

270

Ala Asp Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro Asn Leu

275

280

285 íle Tyr His Arg Lys íle Pro Pro Tyr Asn His Leu Asp Phe íle Trp

290

295

300

143

Ala Met Asp Ala Pro Gin Ala Val Tyr Asn Glu íle Val Ser Met Met

305 310 315 320

Gly Thr Asp Asn Lys

325 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1198 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvojitá (D) KONFIGURÁCIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) DOPLNKOVÁ CHARAKTERISTIKA:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) POLOHA: 1..1125

	(Xi)	OPIS SEKVENCIE:	SEQ ID	NO:	5:
CTT	CAT	CCC ACA AAC CCT	GAA GTG	ACC	ATG	AAT	ATA	AGT	CAG	ATG	ATC 48
Leu	His	Pro Thr Asn Pro	Glu Val	Thr	Met	Asn	íle	Ser	Gin	Met	íle
1		5			10					15

ACC TAC TGG GGA TAC CCA GCT GAG GAA TAT GAA GTT GTG ACC GAA GAC 96

144

Thr Tyr Trp Gly Tyr Pro Ala Glu Glu Tyr Glu Val Val Thr Glu Asp

25 30

GGT TAT ATC CTT GGG ATC GAC AGA ATT CCT TAT GGG AGG AAA AAT TCA 144

Gly Tyr íle Leu Gly íle Asp Arg íle Pro Tyr Gly Arg Lys Asn Ser

40 45

GAG AAT ATA GGC CGG AGA CCT GTT GCA TTT TTG CAA CAC GGT TTG CTC 192

Glu Asn íle Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gin His Gly Leu Leu

55 60

GCA TCA GCC ACA AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC AAC AGC CTG GCC 240

Ala Ser Ala Thr Asn Trp íle Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala

70 75 80

TTC ATC CTG GCC GAC GCC GGG TAC GAC GTG TGG CTG GGG AAC AGC AGG 288

Phe íle Leu Ala Asp

GGC AAC ACC TGG GCC

Gly Asn Thr Trp Ala

100

Ala	Gly	Tyr	Asp	Val	Trp
				90
AGG	AGG	AAT	CTG	TAC	TAC
Arg	Arg	Asn	Leu	Tyr	Tyr

105

Leu Gly Asn Ser Arg

TCG CCC GAC TCC GTC 336

Ser Pro Asp Ser Val

110

GAA TTC TGG GCT TTC AGC TTT GAC GAG ATG GCT AAA TAT GAC CTT CCC 384

145

Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro

115

120

125

GCC ACC ATT GAC TTC ATC TTG AAG AAA ACG GGA CAG GAC AAG CTA CAC 432

Ala Thr íle Asp Phe íle Leu Lys Lys Thr Gly Gin Asp Lys Leu His

130

135

140

TAC GTT GGC CAT TCC CAG GGC ACC ACC ATT GGT TTC ATC GCC TTT TCC 480

Tyr Val Gly His Ser Gin Gly Thr Thr íle Gly Phe íle Ala Phe Ser

145

150

155

160

ACC AAT CCC AAG CTG GCG AAA CGG ATC AAA ACC TTC TAT GCA TTA GCT 528

Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg íle Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala

165

170

175

CCC GTT GCC ACC GTG AAG TAC ACC bAA ACC CTG TTA AAC AAA CTC ATG 576

Pro Val Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met

180

185

190

CTC GTC CCT TCG TTC CTC TTC AAG CTT ATA TTT GGA AAC AAA ATA TTC 624

Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu íle Phe Gly Asn Lys íle Phe

195

200

205

146

TAC CCA CAC CAC TTC TTT GAT CAA TTT CTC GCC ACC GAG GTA TGC TCC 672

Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gin Phe Leu Ala Thr Glu Val Cys Ser

210

215

220

CGC GAG ACG GTG GAT CTC CTC TGC AGC AAC GCC CTG TTT ATC ATT TGT 720

Arg Glu Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe íle íle Cys

225

230

235

240

GGA TTT GAC ACT ATG AAC TTG AAC ATG AGT CGC TTG GAT GTG TAT CTG 768

Gly Phe Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu Asp Val Tyr Leu

245

250

255

TCA C AT AAT CCA GCA GGA ACA TCG GTT CAG AAC GTG CTC CAC TGG TCC 816

Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gin Asn Val Leu His Trp Ser

260

265

270

CAG GCT GTT AAG TCT GGG AAG TTC CAA GCT TTT GAC TGG GGA AGC CCA 864

Gin Ala Val Lys Ser Gly Lys Phe Gin Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro

275

280

285

GTT CAG AAC ATG ATG CAC TAT CAT CAG AGC ATG CCT CCC TAC TAC AAC 912

Val Gin Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn

290

295

300

147

CTG ACA GAC ATG CAT GTG CCA ATC GCA GTG TGG AAC GGT GGC AAC GAC 960

Leu Thr Asp Met His Val Pro íle Ala Val Trp Asn Gly Gly Asn Asp

305 310 315 320

TTG CTG GCC GAC CCT CAC GAT GTT GAC CTT TTG CTT TCC AAG CTC CCC 1008

Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro

325 330 335

AAT CTC ATT TAC CAC AGG AAG ATT CCT CCT TAC AAT CAC TTG GAC TTT 1056

Asn Leu íle Tyr His Arg Lys íle Pro Pro Tyr Asn His Leu Asp Phe

340 345 350

ATC TGG GCC ATG GAT GCC CCT CAA GCG GTT TAC AAT GAA ATT GTT TCC 1104 íle Trp Ala Met Asp Ala Pro Gin Ala Val Tyr Asn Glu íle Val Ser

355 360 365

ATG ATG GGA ACA GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT TATTCTTTTA 1155

Met Met Gly Thr Asp Asn Lys

370 375

TTGTTCCAAA ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCA 1198

148 (2) INFORMÁCIE PRE SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DÍiŽKA: 375 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) KONFIGURÁCIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 6:

Leu

His

Pro

Thr

Asn

Pro

Glu

Val

Thr

Met

Asn

íle

Ser

Gin

Met

íle

1

5

10

15

Thr

Tyr

Trp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Glu

Glu

Tyr

Glu

Val

Val

Thr

Glu

Asp

20

25

30

Gly

Tyr

íle

Leu

Gly

íle

Asp

Arg

íle

Pro

Tyr

Gly

Arg

Lys

Asn

Ser

35

40

45

Glu

Asn

íle

Gly

Arg

Arg

Pro

Val

Ala

Phe

Leu

Gin

His

Gly

Leu

Leu

50

55

60

Ala

Ser

Ala

Thr

Asn

Trp

íle

Ser

Asn

Leu

Pro

Asn

Asn

Ser

Leu

Ala

65

70

75

80

Phe

íle

Leu

Ala

Asp

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp

Leu

Gly

Asn

Ser

Arg

149

Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Asp Ser Val

100

105

110

Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro

115

120

125

Ala Thr Ile Asp Phe Ile Leu Lys Lys Thr Gly Gin Asp Lys Leu His

130

135

140

Tyr Val Gly His Ser Gin Gly Thr Thr íle Gly Phe Ile Ala Phe Ser

145

150

155

160

Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg Ile Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala

165

170

175

Pro Val Ala Thr Val Lys Sr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met

180

185

190

Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu Ile Phe Gly Asn Lys íle Phe

195

200

205

Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gin Phe Leu Ala Thr Glu Val Cys Ser

210

215

220

Arg Glu Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe íle íle Cys

225

230

235

240

150

Gly Phe Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu Asp Val Tyr Leu

245 250 255

Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gin Asn Val Leu His Trp Ser

260 265 270

Gin Ala Val Lys Ser Gly Lys Phe Gin Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro

275 280 285

Val Gin Asn Met Met His Tyr His Gin Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn

290 295 300

Leu Thr Asp Met His Val Pro íle Ala Val Trp Asn Gly Gly Asn Asp

305 310 315 320

Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro

325 330 335

Asn Leu íle Tyr His Arg Lys íle Pro Pro Tyr Asn His Leu Asp Phe

340 345 350 íle Trp Ala Met Asp Ala Pro Gin Ala Val Tyr Asn Glu íle Val Ser

355 360 365

Met Met Gly Thr Asp Asn Lys

Claims (33)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použitie rekombinantnej nukleotidovej sekvencie, obsahujúcej na jednej strane cDNA kódujúcu všetky preduodenálne lipázy cicavcov, to znamená lipázy také, že nukleotidové sekvencie, ktoré ich kódujú, vykazujú medzi sebou percento homológie aspoň okolo 75 %, najmä od okolo 77 % do okolo 85 % a že ich sekvencie aminokyselín vykazujú medzi sebou percento homológie aspoň okolo 70 %, osobitne od okolo 80 % do okolo 90 % a vykazujú vlastnosť, odolnosti proti kyslému prostrediu a sú účinné pri pH od asi 1 do asi 5 a a najmä pri pH od asi 1,5 do asi 2, najmä cDNA kódujúca všetky gastrické lipázy cicavcov alebo cDNA kódujúca všetky polypeptidy, odvodené od uvedených preduodenáIných lipáz adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, pričom tento polypeptid vykazuje hore uvedené vlastnosti preduodenáIných lipáz, a obsahujúcej na druhej strane prvky, dovoľujúce rastlinnej bunke produkovať preduodenálne lipázy, kódované uvedenou cDNA alebo produkovať odvodený polypeptid, definovaný hore, najmä promotor a terminátor transkripcie, rozpoznávané transkripčným mechanizmom rastlinných buniek, pre transformáciu rastlinných buniek za účelom získania s pomocou týchto buniek alebo s pomocou rastlín, získaných z týchto buniek, rekombinantné preduodenálne lipázy cicavcov vo forme účinného enzýmu alebo jedného alebo viacerých polypeptidov, odvodených od tejto lipázy takých, aké boli definované hore.
2. 2. Použitie podľa nároku 1 rekombinantnej nukleotidovej sekvencie, obsahujúcej na jednej strane cDNA, znázornenú na obr. 1 a kódujúcu psiu gastrickú lipázu (LGC) znázornenú na obr. 2 alebo nukleotidovú sekvenciu odvozenú od tejto cDNA, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jedného alebo viacerých nukleotidov, pričom uvedená odvodená sekvencia môže kódovať polypeptid, ktorého sekven152 cia aminokyselín je identická sekvencií psej gastrickej lipázy, znázornenej na obr. 2 alebo polypeptid odvodený od psej gastrickej lipázy adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín a tento odvodený polypeptid vykazuje účinok lipázy, a obsahujúcej na druhej strane prvky, dovolujúce rastlinnej bunke produkovať polypeptid, kódovaný uvedenou cDNA alebo hore uvedenou odvodenou sekvenciou, najmä promotor a terminátor transkripcie, rozpoznávanej transkripčným mechanizmom rastlinných buniek, pre transformáciu rastlinných buniek za účelom získania s pomocou týchto buniek alebo s pomocou rastlín, získaných z týchto buniek, rekombinantné psie gastrické lipázy vo forme účinného enzýmu alebo jedného alebo viacerých polypeptidov, odvodených od tejto lipázy takých, aké boli definované hore.
3. 3. Použitie podlá nároku 1 rekombinantnej nukleotidovej sekvencie, obsahujúcej na jednej strane cDNA, znázornenú na obr. 4 a kódujúcu ludskú gastrickií lipázu (LGH) znázornenú na obr. 5 alebo nukleotidovú sekvenciu odvodenú od tejto cDNA, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jedného alebo viacerých nukleotidov, pričom uvedená odvodená sekvencia môže kódovať polypeptid, ktorého sekvencia aminokyselín je identická sekvencií ludskej gastrickej lipázy, znázornenej na obr. 5 alebo polypeptid odvodený od ludskej gastrickej lipázy adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín a tento odvodený polypeptid vykazuje účinok lipázy, a obsahujúcej na druhej strane prvky, dovoľujúce rastlinnej bunke produkovať polypeptid, kódovaný uvedenou cDNZk alebo hore uvedenou odvodenou sekvenciou, najmä promotor a terminátor transkripcie, rozpoznávanej transkripčným mechanizmom rastlinných buniek, pre transformáciu rastlinných buniek za účelom získania s pomocou týchto buniek alebo s pomocou rastlín, získaných z týchto buniek, rekombinantné ludské gastrické lipázy vo forme účinného enzýmu alebo jedného alebo viacerých

   153 polypeptidov, odvodených od tejto lipázy takých, aké boli definované hore.
4. 4. Rekombinantná nukleotidová sekvencia, vyzná· čujúca sa tým, že obsahuje na jednej strane cDNA, znázornenú na obr. 1 a kódujúcu psiu gastrickú lipázu (LGC) znázornenú na obr. 2 alebo nukleotidovú sekvenciu odvodenú od tejto cDNA, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jedného alebo viacerých nukleotidov, ako je sekvencia znázornená na obr. 3, pričom uvedená odvodená sekvencia môže kódovať polypeptid, ktorého sekvencia aminokyselín je identická sekvencii psej gastrickej lipázy, znázornenej na obr. 2 alebo polypeptid odvodený od psej gastrickej lipázy adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín a tento odvodený polypeptid vykazuje účinok lipázy a tým, že obsahuje na druhej strane prvky, dovoľujúce rastlinnej bunke produkovať polypeptid , kódovaný uvedenou cDNA alebo hore uvedenou odvodenou sekvenciou, najmä promotor a terminátor transkripcie, rozpoznávanej transkripčným mechanizmom rastlinných buniek.
5. 5. Rekombinantná nukleotidová sekvencia, vyzná čujúca sa tým, že obsahuje na jednej strane cDNA, znázornenú na obr. 4 a kódujúcu ľudskú gastrickú lipázu (LGH) znázornenú na obr. 5 alebo nukleotidovú sekvenciu odvodenú od tejto cDNA, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jedného alebo viacerých nukleotidov, pričom uvedená odvodená sekvencia môže kódovať polypeptid, ktorého sekvencia aminokyselín je identická sekvencii ľudskej gastrickej lipázy, znázornenej na obr. 5 alebo polypeptid odvodený od ľudskej gastrickej lipázy adíciou a/ alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín a tento odvodený polypeptid vykazuje účinok lipázy a tým, že obsahuje na druhej strane prvky, dovoľujúce rastlinnej bunke produkovať polypeptid, kódovaný uvedenou

   154 cDNA alebo hore uvedenou odvodenou sekvenciou, najmä promotor a terminátor transkripcie, rozpoznávanej transkripčným mechanizmom rastlinných buniek.
6. 6. Rekombinantná nukleotidová sekvencia pódia nároku 4 alebo nároku 5,vyznačujúca sa tým, že obsahuje v prednej časti uvedenej cDNA alebo sekvencie od nej odvodenej, terminátor polyA 35S vírusu mozaiky karfiolu (CaMV) alebo terminátor polyA NOS Agrobacterium tumefaciens, v zadnej časti uvedenej cDNA alebo sekvencie od nej odvodenej, promotor alebo dvoj itý konštitutívny promotor 35S (pd35S) vírusu CaMV alebo promotor pCRU génu kruciferínu reďkovky alebo promotor pGEAl alebo pGEA6 Arabidopsis thaliana alebo chimérický promotor pSP Agrobacterium tumefaciens alebo promotor pAR-IAR ryže alebo promotor pizein kukurice.
7. 7. Rekombinantná nukleotidová sekvencia podlá jedného z nárokov 4 až 6, vyznačujú c a sa tým, že obsahuje sekvenciu kódujúcu peptid, zodpovedajúcu za smerovanie rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo odvodeného polypeptidu alebo polypeptidov do určeného priestoru rastlinnej bunky.
8. 8. Rekombinantná nukleotidová sekvencia podlá jedného z nárokov 4, 6a7,vyznačujúca sa tým, že je zvolená zo súboru zahŕňajúceho:

   sekvenciu (označenú pd35S-PS-LGC), obsahujúcu v smere 5'->3' promotor pd35S vírusu CaMV, sekvenciu kódujúcu signálny peptid sporamínu A, ktorá je okamžite nasledovaná

   155 nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvenciu (označenú pd35S-PPS-LGC), obsahujúcu v smere 5'->3' promotor pd35S vírusu CaMV, sekvenciu, kódujúcu prepropeptid sporamínu A, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvenciu (označenú pd35S-PSLGL-LGC), obsahujúcu v smere 5'->3' promotor pd35S vírusu CaMV, sekvenciu, kódujúcu časť signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvenciu (označenú pCRU-PS-LGC), obsahujúcu v smere 5'->3’ promotor pCRU kruciferínu, sekvenciu, kódujúcu signálny peptid sporamínu A, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvenciu (označenú pCRU-PPS-LGC), obsahujúcu v smere 5*->3’ promotor pCRU kruciferínu, sekvenciu, kódujúcu prepropeptid sporamínu A, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvenciu (označenú pCRU-PSLGL-LGC), obsahujúcu v smere 5'->3' promotor pCRU kruciferínu, sekvenciu, kódujúcu časť signálneho peptidu králičej gastrické lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV,

   156

   - sekvenciu (označenú pGEAl-PSLGL-LGC), obsahujúcu v smere 5’->3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekvenciu, kódujúcu čast signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo na obr.

   3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvenciu (označenú pGEA6-PSLGL-LGC), obsahujúcu v smere 5'->3' promotor pGEA6 Arabidopsis thaliana, sekvenciu, kódujúcu čast signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo na obr.

   3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvenciu (označenú pAR-IAR-PSLGL-LGC), obsahujúcu v smere 5'->3' promotor pAR-IAR ryže, sekvenciu, kódujúcu čast signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV alebo terminátorom polyA NOS Agrobacterium tumefaciens, sekvenciu (označenú pTzein-PSLGL-LGC), obsahujúcu v smere 5’->3' promotor pizein kukurice, sekvenciu, kódujúcu čast signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo na obr. 3 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvenciu (označenú pTzein-PSLGL-LGC-KDEL), obsahujúcu v smere 5'->3’ promotor pTzein kukurice, sekvenciu, kódujúcu čast signálneho peptidu králičej gastrickej lipázy (tak, ako bola opísaná hore), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 1 alebo na obr.

   157

   3, potom sekvenciu kódujúcu tetrapeptid KDEL a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV.
9. 9. Rekombinantné nukleotidové sekvencie podlá jedného z nárokov 5 až 7,vyznačujú c e sa tým, že sú zvolené zo súboru zahŕňajúceho:

   sekvenciu (označenú pSP-PSLGH-LGH), obsahujúcu v smere 5'->3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekvenciu kódujúcu signálny peptid ludskej gastrickej lipázy, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 4 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvenciu (označenú pSP-PSLPH-LGH), obsahujúcu v smere 5'->3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekvenciu kódujúcu signálny peptid ludskej pankreatickej lipázy, ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 4 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV, sekvenciu (označenú pSP-PSLGL-LGH), obsahujúcu v smere 5'->3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekvenciu kódujúcu signálny peptid králičej gastrickej lipázy (tak ako je opísaná v nároku 8), ktorá je okamžite nasledovaná nukleotidovou sekvenciou znázornenou na obr. 4 a nakoniec ukončená terminátorom polyA 35S vírusu CaMV,
10. 10. Vektor, najmä plazmid, obsahujúci nukleotidovú sekvenciu podlá jedného z nárokov 4, 6, 7 a 8 v mieste, ktoré nie je podstatné pre jeho replikáciu.
11. 11. Vektor, najmä plazmid, obsahujúci nukleotidovú sekvenciu podlá jedného z nárokov 5, 6, 7 a 9 v mieste, ktoré nie je podstatné pre jeho replikáciu.

    158
12. 12. Hostiteíská bunka, najmä baktéria ako Agrobacterium tumefaciens, transformovaná vektorom podlá nároku 10 alebo 11.
13. 13. Spôsob výroby rekombinantnej psej gastrickej lipázy vo forme aktívneho enzýmu alebo jedného alebo viacerých polypeptidov, odvodených od tejto lipázy, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, pričom tieto polypeptidy vykazujú účinok lipázy, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    transformáciu rastlinných buniek, najmä pomocou hostitelskej bunky podlá nároku 12, ktorá je samotná transformovaná vektorom podlá nároku 10, takým spôsobom, že do genómu buniek je vložená rekombinantná nukleotidová sekvencia podlá jedného z nárokov 4, 6, 7 a 8, v prípade potreby získanie transformovanej rastliny z uvedených transformovaných buniek, získanie rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo hore uvedeného polypeptidu alebo polypeptidov z nej odvodených, produkovanej alebo produkovaných uvedenými transformovanými bunkami alebo rastlinami, najmä extrakciou, nasledovanou v prípade potreby etapou purifikácie.
14. 14. Spôsob výroby rekombinantnej ludskej gastrickej lipázy vo forme aktívneho enzýmu alebo jedného alebo viacerých polypeptidov, odvodených od tejto lipázy, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, pričom tieto polypeptidy vykazujú účinok lipázy, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:

    159 transformáciu rastlinných buniek, najmä pomocou hostitelskej bunky podía nároku 12, ktorá je samotná transformovaná vektorom podía nároku 11, takým spôsobom, že do genómu buniek je vložená rekombinantná sekvencia podlá jedného z nárokov 5, 6, 7 a 9,

    - v prípade potreby získanie transformovanej rastliny z uvedených transformovaných buniek,

    - získanie rekombinantnej ludskej gastrickej lipázy a/alebo hore uvedeného polypeptidu alebo polypeptidov z nej odvodených, produkovanej alebo produkovaných uvedenými transformovanými bunkami alebo rastlinami, najmä extrakciou, nasledovanou v prípade potreby etapou purifikácie.
15. 15. Rastliny alebo časti rastlín, najmä listy a/alebo plody a/alebo semená a/alebo rastlinné bunky, geneticky transformované, vyznačujúce sa tým, že obsahujú jednu alebo viacej rekombinantných nukleotidových sekvencii podlá jedného z nárokov 4 až 9, ktoré sú stálym spôsobom integrované do ich genómu a v prípade potreby rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a/alebo rekombinantná ludskú gastrickú lipázu a/alebo jeden alebo viac polypeptidov, odvodených od týchto lipáz a že sa jedná o rastliny alebo časti rastlín, najmä listy a/alebo plody a/alebo semená a/alebo rastlinné bunky s enzymatickým účinkom a najmä s účinkom lipázy, zvolené najmä zo súboru zahŕňajúceho repku, tabak, kukuricu, hrach, rajčiak, mrkvu, pšenicu, jačmeň, zemiaky, sóju, slnečnicu, šalát, ryžu, lucernu, repu alebo časti týchto rastlín.
16. 16. Enzymaticky aktívna rekombinantná psia gastrická lipáza, ktorej sekvencia aminokyselín je znázornená na obr.

    2 alebo polypeptidy odvodené od uvedenej lipázy, najmä adíciou a/alebo supresiou a/alebo substitúciou jednej alebo

    160 viacerých aminokyselín, ako je polypeptid obmedzený aminokyselinami, nachádzajúcimi sa v polohách 55 až 379, označovaný ako polypeptid (Δ54) a/alebo polypeptid, obmedzený aminokyselinami, nachádzajúcimi sa v polohách 5 až 379 na obr. 2, označovaný ako polypeptid (Δ4), pričom uvedené polypeptidy vykazujú účinok lipázy, získanej vo forme v podstate čistej vykonávaním spôsobu podía nároku 13, pričom tento spôsob zahŕňa etapu purifikácie rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo hore uvedených odvodených polypeptidov, najmä chromatografiou získaných enzymatických extraktov.
17. 17. Enzymatický aktívna rekombinantná ludská gastrická lipáza, ktorej sekvencia aminokyselín je znázornená na obr. 5 alebo polypeptidy odvodené od uvedenej lipázy, najmä adíciou a/alebo supresioiu a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, ako je polypeptid obmedzený aminokyselinami, nachádzajúcimi sa v polohách 74 až 398 na obr.

    5, označovaný ako polypeptid (ô54LGH) a/alebo polypeptid, obmedzený aminokyselinami, nachádzajúcimi sa v polohách 24 až 398 na obr. 5, označovaný ako polypeptid (yS4LGH), pričom uvedené polypeptidy vykazujú účinok lipázy, získanej vo forme v podstate čistej vykonávaním spôsobu podía nároku 14, pričom tento spôsob zahŕňa etapu purifikácie rekombinantnej psej gastrickej lipázy a/alebo hore uvedených odvodených polypeptidov, najmä chromatografiou získaných enzymatických extraktov.
18. 18. Rastlinný extrakt s enzymatickým účinkom, získaný vykonávaním spôsobu podía nároku 13, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a/alebo jeden alebo viacej polypeptidov, odvodených od tejto lipázy, ako je polypeptid (54) a/alebo polypeptid ( 4), definované v nároku 16.

    161
19. 19. Rastlinný extrakt s enzymatickým účinkom, získaný vykonávaním spôsobu podlá nároku 14, vyznačujúci sa tým, že obsahuje rekombinantnú ludskú gastrickú lipázu a/alebo jeden alebo viacej polypeptidov, odvodených od tejto lipázy, ako je polypeptid ( 54LGH) a/alebo polypeptid ( 4LGH), definované v nároku 17.
20. 20. Rastlinný extrakt s enzymatickým účinkom podlá nároku 18 alebo nároku 19,vyznačujúci sa tým, že hmotnostné percento enzymatický účinných rekombinantných polypeptidov predstavuje od okolo 0,1 % do 20 % a najmä od okolo 1 % do okolo 15 %, merané vzhladom k celkovej hmotnosti proteínov, prítomných v uvedenom extrakte, čo zodpovedá miere enzymatického účinku od okolo 0,5 U na jeden gram čerstvej hmotnosti (PF) listov do okolo 1000 U na gram čerstvej hmotnosti listov, najmä účinku od okolo 10 U na jeden gram čerstvej hmotnosti (PF) listov do okolo 300 U na gram čerstvej hmotnosti listov alebo od okolo 1 U na jeden gram čerstvej hmotnosti semien do okolo 5000 U na gram čerstvej hmotnosti semien, najmä účinku od okolo 10 U na jeden gram čerstvej hmotnosti (PF) semien do okolo 1000 U na gram čerstvej hmotnosti semien.
21. 21. Použitie rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien a/alebo buniek, geneticky transformovaných, podlá nároku 15 alebo rekombinantnej psej gastrickej lipázy alebo polypeptidov, odvodených od tejto lipázy podlá nároku 16 alebo rekombinantnej ludskej gastrickej lipázy alebo polypeptidov, odvodených od tejto lipázy podlá nároku 17 alebo enzymatických extraktov podlá jedného z nárokov 18 až 20, pre získanie liečiv, určených na uľahčenie absorpcie rastlinných alebo živočíšnych tukov, ktoré požilo indivíduum, ktoré je buď zdravé alebo zasiahnuté jednou alebo viacerými patológiami, ktoré ovplyvňujú alebo neovplyvňujú úroveň produkcie gastrických a/alebo pan162 kreatických lipáz, najmä indivíduum, ktoré sa podrobuje lekárskemu pôsobeniu, meniacemu mechanizmus absorpcie tukov alebo stará osoba a osobitne pre získanie liečiv, určených na liečbu patológií, viazaných k nedostatočnej úrovni lipáz (najmä gastrickej lipázy alebo lipáz a/alebo pankreatickej lipázy alebo lipáz) v organizmu a najmä u patológií ako je mucoviscidóza a exokrinná pankreatická nedostatočnosť.
22. 22. Farmaceutická kompozícia, vyznačuj úca sa t ý m, že zahŕňa rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a/alebo rekombinantnú íudskú gastrickú lipázu a/alebo jeden alebo viac polypeptidov, odvodených od týchto lipáz podlá nároku 16 alebo podlá nároku 17 a/alebo jeden alebo viac enzymatických extraktov podlá jedného z nárokov 18 až 20, v prípade potreby v asociácii s farmaceutický prijatelným vehikulom.
23. 23. Použitie rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien a/alebo rastlinných buniek, geneticky transformovaných, podlá nároku 15, alebo rekombinantnej psej gastrickej lipázy alebo polypeptidov, odvodených od tejto lipázy podlá nároku 16 alebo rekombinantnej ludskej gastrickej lipázy alebo polypeptidov, odvodených od tejto lipázy podlá nároku 17 alebo enzymatických extraktov podlá jedného z nárokov 18 až 20, pre získanie ludskej potravy alebo krmiva pre zvieratá, najmä funkčnej potravy alebo krmiva určeného najmä na ulahčenie absorpcie živočíšnych alebo rastlinných tukov, ktoré požilo indivíduum, ktoré je buď zdravé alebo zasiahnuté jednou alebo viacerými patológiami, ktoré ovplyvňujú alebo neovplyvňujú úroveň produkcie gastrických a/alebo pankreatických lipáz.
24. 24. Funkčná potrava alebo krmivo, vyznačujúca sa tým, že zahŕňa jednu alebo viac rastlín a/alebo častí tejto alebo týchto rastlín podía nároku 15

    163 a/alebo rekombinantnú psiu gastrickú lipázu a/alebo rekombinantnú ľudskú gastrickú lipázu a/alebo jeden alebo viac polypeptidov, odvodených od týchto lipáz podľa nároku 16 alebo podľa nároku 17 a/alebo jeden alebo viac enzymatických extraktov podľa jedného z nárokov 18 až 20.
25. 25. Použitie rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien a/alebo rastlinných buniek, geneticky transformovaných, podľa nároku 15, alebo rekombinantnej psej gastrickej lipázy alebo polypeptidov, odvodených od tejto lipázy podľa nároku 16 alebo rekombinantnej ľudskej gastrickej lipázy alebo polypeptidov, odvodených od tejto lipázy podľa nároku 17 alebo enzymatických extraktov podľa jedného z nárokov 18 až 20, pre uskutočňovanie enzymatických reakcií v priemyslovej agroalimentárnej alebo poľnohospodársko-priemyslovej oblasti, najmä v priemysle mastných látok, v lipochémii a mliekárstve.
26. 26. Spôsob, najmä enzymatická biokonverzia alebo biokatalýza, vykonávanie jednej alebo viacerých enzymatických reakcií v priemyslovej, agroalimentárnej alebo poľnohospodársko-priemyslovej oblasti, najmä v priemysle mastných látok, v lipochémii a mliekárstve, pričom uvedené enzymatické reakcie sú vykonávané s využitím rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien a/alebo rastlinných buniek, geneticky transformovaných, podľa nároku 15, alebo rekombinantnej psej gastrickej lipázy alebo polypeptidov, odvodených od tejto lipázy podľa nároku 16 alebo rekombinantnej ľudskej gastrickej lipázy alebo polypeptidov, odvodených od tejto lipázy podľa nároku 17 alebo enzymatických extraktov podľa jedného z nárokov 18 až 20.
27. 27. Enzymatické prípravky určené pre priemyslovú, agroalimentárnu alebo poľnohospodársko-priemyslovú oblasť, ktoré môžu byť použité v rámci uskutočňovania spôsobu podľa

    164 nároku 26 a zahŕňajúce jeden alebo viaceré rastlinné extrakty s enzymatickým účinkom podía jedného z nárokov 18 až 20 a/alebo rekombinantná psiu gastrickú lipázu a/alebo rekombinantnú íudskú gastrickú lipázu a/alebo jeden alebo viac polypeptidov, odvodených od týchto lipáz podía nároku 16 alebo 17.
28. 28. Použitie rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien a/alebo rastlinných buniek, geneticky transformovaných, podía nároku 15, pre vykonávanie v priemyslovom meradle reakcií enzymatickej biokonverzie alebo biokatalýzy, ako sú napríklad hydrolýzy alebo enzymatická transesterifikácia.
29. 29. Spôsob uskutočňovania biokatalýzy, používajúci rastliny alebo časti rastlín, najmä listy a/alebo plody a/alebo semena a/alebo rastlinné bunky, geneticky transformované, podía nároku 15, v ktorom sú uvedené rastliny alebo uvedené časti rastlín alebo bunky alebo semená používané súčasne ako enzymatický zdroj a ako reakčný substrát.
30. 30. Použitie rastlín alebo častí rastlín, najmä listov a/alebo plodov a/alebo semien a/alebo rastlinných buniek, geneticky transformovaných, podía nároku 15, pre získanie biopaliva.
31. 31. Spôsob získania biopalív adíciou alkoholu, najmä metanolu alebo etanolu, k rozdrveným rastlinám alebo častiam rastlín, geneticky transformovaným, podía nároku 15 a získaním biopalív, najmä filtráciou.
32. 32. Estery mastných kyselín rastlinného pôvodu, získané uskutočňovaním spôsobu podía nároku 31, najmä metylester kyseliny olejovej.

    165
33. 33. Biopalivo, získané uskutočňovaním spôsobu podía nároku 31 a obsahujúce estery mastných kyselín rastlinného pôvodu, najmä metylester kyseliny olejovej.