KR19990007901A - 식물에 의해 생성된 재조합 전십이지장 리파제 및 폴리펩티드유도체, 그의 제조 방법 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전십이지장 리파제를 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열, 또는 이 cDNA로부터 유도된 서열의 재조합 전십이지장 리파제 또는 폴리펩티드 유도체를 수득하기 위해 식물 세포를 형질전환시키기 위한 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유전적으로 변형된 식물 또는 그의 일부, 또는 이 식물 추출물, 또는 재조합 전십이지장 리파제 또는 생성 폴리펩티드 유도체의 식품 또는 의약 제조업 또는 산업에서의 용도에 관한 것이다.

Description

식물에 의해 생성된 재조합 전십이지장 리파제 및 폴리펩티드 유도체, 그의 제조 방법 및 그의 용도
본 발명은 식물에 의한 재조합 리파제, 특히 재조합 위장 리파제 및 리파제 활성을 갖는 이들의 다른 폴리펩티드 유도체 및 이들의 용도, 특히 비료 또는 산업적 적용을 위한 기능성 음식 또는 제약 조성물 또는 효소 제제에 관한 것이다.
개 위장 리파제 (DGL)는 아미노 말단 (NH2말단)에 신호 펩티드를 갖고 개의 위장의 기저부 점막의 중앙 세포에 의해 분비되는 분자량 약 50 킬로달톤 (kDa)의 379 아미노산의 당단백질이다 (Carriere F. et al., 1991).
인간 위장 리파제 (HGL)은 전구체의 형태로 천연 합성되고, 문헌 [Bodmer et al., 1987]에 기재되어 있다. 성숙 HGL 단백질은 379개의 아미노산으로 구성된다. 그의 신호 펩티드 (HGLSP)는 19개의 아미노산으로 구성된다.
이들 효소는 구성원의 일부가 이미 정제되고 몇몇 경우에는 클로닝도 된 전십이지장(preduodenal)으로 불리는 일군의 리파제에 속한다 (Docherty A.J.P. et al., 1985; Bodmer M.W. et al., 1987; Moreau H. et al., 1988; 유럽 특허 번호 제0 191 061호 및 동 제0 261 016호).
오랜 기간 동안 음식물의 지질의 가수분해는 췌장에서 생성된 효소의 작용에 의해 소장에서 발생한다고 생각되었다.
그러나, 트리글리세라이드의 가수분해는 전십이지장 효소의 간접적인 작용으로 위장에서 발생할 수 있다는 발견이 제안되었다 (Volhard, F., 1901; Shonheyder, F., and Volquartz, K., 1945). 이들 효소, 특히 개 위장 리파제는 이들 효소를 포유동물 췌장 리파제와 구분시키는 효소적 및 물리화학적 특성을 갖는다. 위장 및 췌장 리파제 사이의 이러한 차이는 본질적으로 분자량, 아미노산 조성, 펩신 내성, 기질 특이성, 최적 작용 pH 및 산 매질에서의 안정성에 관련된 것이다.
또한, 특정 조건 하에 시험관 내에서 장쇄 트리글리세라이드의 가수분해에 대한 위장 및 췌장 리파제 사이의 시너지 작용을 입증할 수 있다 (Gargouri, Y. et al., 1989).
환자가 전적으로 또는 부분적으로 췌장 외분비성 분비가 결여되어 음식의 가수분해에 필요한 효소 (아밀라제, 리파제, 프로테아제)가 결핍된 수개의 병리학적 상황(낭포성 섬유증, 췌장 외분비 부족)이 알려졌다. 장에서의 지방, 특히 트리글리세라이드 비흡수는 상기 환자에서의 지방설사의 매우 현저한 증가 및 젊은 환자에서의 체중 증가의 매우 현저한 저하에 의해 분명해진다. 이를 바로잡기 위해서 돼지 췌장 추출물을 상기 대상에게 식사시간에 투여한다. 상기 추출물의 치료 효능은 DGL의 장쇄 트리글리세라이드에 대한 작용의 특이성에 의해서 DGL의 동시 처방에 의해 크게 개선될 수 있다.
문헌 [Carriere et al. (1991)]은 DGL의 정제 및 NH2말단 서열의 결정에 대해 기술하고 있다. 상기 효소를 개의 위장에서 추출하는 방법도 상기 문헌에 기재되어 있다. 이 방법은 본질적으로 산성 매질 (pH 2.5) 중에서의 리파제의 가염 분리 (salting out)를 촉진하는 수용성 염의 존재 하에 상기 산 매질 중에 개의 위장을 침지시키는 것으로 이루어진다. DGL은 분자체 상에서의 여과 및 이온 교환 크로마토그래피의 단계에 의해 균질하게 정제할 수 있다. 상기 방법에 의해 수득한 정제된 DGL은, 6,000 달톤은 당에 대응하고 43,000은 단백질 부분에 대응하는 분자량 49,000 달톤의 당단백질이다.
개 위장의 획득이 곤란하기 때문에 실험실에서 또는 산업적으로 상기 방법을 개발하는 것이 어렵다. 이 때문에 개의 위장을 사용할 필요 없이 DGL을 다량 생성시킬 수 있는 방법을 발견할 필요가 존재한다.
유전공학을 사용한 방법에 의한 DGL의 산업적 생산의 도움으로 DGL의 뉴클레오티드 및 펩티드 서열이 결정되었다. 이 연구는 1993년 12월 16일에 출원된 국제 출원 공개 제94/131816호의 주제이었다.
상기 국제 출원 기술된 재조합 DGL의 생성 방법은 DGL을 생성시킬 수 있는 형질전환된 숙주 세포로서 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli, 이. 콜라이)를 사용하였다.
이. 콜라이에 의한 재조합 DGL의 생산 동안에 직면한 몇몇 문제, 특히 발효조 내에서 고비용으로 이. 콜라이를 대량 배양해야 하는 필요성 때문에 연구자들은 상기 DGL의 다른 생산 방법을 연구하였다.
포유동물 유전자의 발현에는 포유동물 세포가 보다 적합하다. 그러나, 이 세포의 사용에는 단백질의 성숙이라는 문제가 존재한다. 번역후 성숙을 실현하는 효소 장치는 한 조직, 기관 또는 종에서 다른 조직, 기관, 종에 따라 상이하다. 예를 들면, 혈장 단백질의 번역후 성숙은 인간 혈액에서 얻어진 것인지, 재조합 세포, 예를 들면 차이니즈 햄스터의 난소 세포에서 생성된 것인지, 또는 트랜스제닉 (transgenic) 동물의 우유에 존재하는 것인지에 따라 상이할 수 있다. 또한, 포유동물 세포를 사용하여 수득되는 낮은 발현 수준은 매우 대용량으로 시험관 내에서 고비용으로 배양할 것을 수반한다. 트랜스제닉 동물 (마우스, 양 및 소)의 우유 내의 재조합 단백질의 생산은 생산 비용을 절감시키고 발현 수준의 문제를 극복할 수 있게 한다. 그러나, 윤리적 문제 및 바이러스 및 서브바이러스 오염 (프리온)의 문제가 여전히 존재한다.
이러한 이유 때문에 포유동물 유전자의 식물 세포로의 도입(transgenesis)은 신규의 재조합 단백질을 저하된 생산 비용으로 바이러스 또는 서브바이러스 오염의 위험 없이 대량 생산할 수 있는 경로를 제공할 수 있다.
1983년에 몇몇 연구소는 이형 유전자를 식물 세포의 게놈 내에 도입하고 (Bevan et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983 a and b) 상기 유전적으로 변형된 세포로부터 트랜스제닉 식물을 생성시키는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 따라서, 식물의 모든 세포는 유성 수정에 의해 후손에게 전달되는 유전적으로 변형된 특성을 갖는다.
상기 연구의 결과로서 많은 연구팀들이 식물 세포 또는 트랜스제닉 식물에서의 포유동물의 재조합 단백질의 생산에 관심을 가졌다 (Barta et al., 1986; Marx, 1982). 이 분야에서의 매우 중요한 첫 번째 결과 중의 하나는 트랜스제닉 담배에서의 항체의 생산이었다 (Hiatt et al., 1989).
식물의 단백질 저장 부위인 종자에서 이형 단백질을 발현시키기 위해서 반데케르코브(Vandekerckhove) 연구팀은 leu-엔케팔린 코딩 서열을 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 2S 알부민 코딩 유전자에 융합시켰다. 이 구조체를 사용하여 종자에서 특이적으로 leu-엔케팔린을 전체 단백질 중 0.1%의 발현 수준으로 발현하는 트랜스제닉 평지를 만들었다. 1990년에 사이몬 (Sijmon)과 그 동료들은 인간 혈청 알부민 유전자를 담배 및 감자 세포에 도입하였다. 신호 펩티드의 기원 (인간 또는 식물)에 관계없이 인간 혈청 알부민이 전체 단백질 중 0.02%의 발현 수준으로 감자 잎, 줄기 및 괴경에서 수득되었다.
또한, 다른 포유동물 재조합 단백질이 식물에서 생성되었다: B형 간염의 표면 항원 (Mason et al., 1992), 인터페론 (De Zoeten et al., 1989; Edelbaum et al., 1992; Truve et al., 1993); 무린 항-스트렙토코커스 뮤탄스 항원, 우식증 물질 (Hiatt and Ma, 1992; Ma et al., 1994), scFV 항-암세포 항체 (Russel D., 1994), 항-포진 항체 (Russel D., 1994), 히루딘 (Moloney et al. 1994), 콜레라 독소 (Hein R. 1994) 및 인간 상피 성장 인자 (EGF) (Higo et al., 1993).
상기 모든 연구는 식물 세포에서의 포유동물 재조합 단백질의 생산이 가능하고 DNA 서열로부터 단백질 합성의 기작이 동물 세포 및 식물 세포에서 유사하다는 것을 입증하였다. 그러나, 식물과 동물 세포 사이에 일부 차이, 특히 폴리만노시드 글리칸의 글리칸 복합체로의 성숙 또는 신호 펩티드의 분해 부위에 상이함이 존재하여 활성 또는 충분히 활성인 포유동물 단백질을 식물 세포의 형질전환에 의해 수득할 수 있음을 보장할 수 없다.
본 발명자들은 적절한 재조합 뉴클레오티드 서열에 의해 형질전환된 식물 세포를 사용하여 재조합 DGL 또는 재조합 HGL, 또는 충분한 효소 활성을 갖는 DGL 또는 HGL에서 유도된 폴리펩티드를 산업적 규모로 생산할 수 있음을 입증하였다.
본 발명의 목적은 식물에 의해 포유동물의 산업적으로 사용할 수 있는 재조합 전십이지장 리파제, 구체적으로는 재조합 DGL 또는 HGL, 또는 충분한 효소 활성, 구체적으로는 리파제 활성을 갖는 DGL 또는 HGL에서 유도된 폴리펩티드의 신규 생성 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 수행하기 위한 수단, 특히 신규 재조합 뉴클레오티드 서열, 유전적으로 형질전환된 식물 세포, 유전적으로 형질전환된 생물 또는 식물의 일부 (잎, 줄기, 과실, 종자 또는 낟알, 뿌리) 및 이들 식물 또는 그 일부의 유전적으로 형질전환된 단편을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 효소 활성을 갖고 유전적으로 형질전환된 식물 세포 또는 식물로부터 수득되는 신규 포유동물 재조합 전십이지장 리파제(들), 또는 유도 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 특히 산업적 규모로 효소 반응을 수행하는데 사용할 수 있는 새로운 효소 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 특히 낭포성 섬유증과 같은 생물체의 리파제 생성의 결여에 관련된 병변의 치료를 위한 제약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 석유에서 유래한 연료보다 오염이 적고 생산 비용이 저렴한 이점을 갖는 새로운 연료, 소위 생체 연료를 제공하는 것이다.
하기 도면을 참고로 하여 본 발명을 설명한다.
도 1은 서열 중에서 1 내지 1,137에 존재하는 뉴클레오티드가 서열 2에 대응하는 도 2에 도시한 DGL을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 2는 서열 2에 대응하는 DGL의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 3은 도 1에 도시한 cDNA에서 유도된, 서열 1에 대응하는 뉴클레오티드 서열을 도시한 것으로서 상기 유도된 서열의 1 내지 1,137에 존재하는 뉴클레오티드가 서열 2에 대응하는 도 2에 도시한 DGL을 코딩한다.
도 4는 서열 중에서 47 내지 1240에 존재하는 뉴클레오티드가 398 아미노산의 HGL의 전구체를 코딩하고 104 내지 1240에 존재하는 뉴클레오티드가 379 아미노산의 성숙 HGL을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다.
도 5는 HGL의 아미노산 서열을 도시한 것으로서 HGL의 전구체는 1 내지 398에 존재하는 아미노산으로 이루어지고, 성숙 HGL은 20 내지 398에 존재하는 아미노산으로 구성된다.
도 6, 7 및 8은 본 발명에 따른 재조합 서열로 형질전환된 담배 크산티(Xanthi)의 잎 및 종자, 평지씨 및 토마토 잎 및 과실에 의해 생성된 재조합 폴리펩티드에 대한 웨스턴(western)형 면역검출 실험 결과를 도시한 것이다.
도 9 및 10은 각각 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동에 의한 분석 및 상기 겔의 니트로셀룰로스 멤브레인 상으로의 이전 및 담배 잎으로부터 정제된 DGL의 개 위장 항-리파제 항체로부터의 시현의 결과를 도시한 것이다.
도 11은 재조합 DGL의 글리칸 잔기의 멤브레인 상에서의 검출의 일례를 도시한 것이다.
도 12는 평지씨에서 정제된 DGL의 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기영동에 의한 분석을 도시한 것이다.
도 13, 14 및 15는 본 발명에 따라 형질전환된 종자로부터의 메틸 올레에이트의 제조에서 실시된 다양한 시험을 예시한 것이다.
본 발명은, 한편으로는 임의의 포유동물 전십이지장 리파제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 약 75% 이상, 특히 약 77% 내지 85%의 상동성을 갖고 아미노산 서열이 70% 이상, 특히 약 80% 내지 약 90%의 상동성을 가지며, 약 1 내지 약 5, 특히 약 1.5 내지 약 2의 pH에서 내산성 및 활성을 갖는 특성을 갖는 임의의 포유동물 전십이지장 리파제를 코딩하는 cDNA, 보다 구체적으로는 임의의 포유동물 위장 리파제를 코딩하는 cDNA 또는 전십이지장 리파제의 상기 특성을 갖는 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 전십이지장 리파제로부터 유도된 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA, 다른 한편으로는 식물 세포가 상기 cDNA에 의해 코딩되는 전십이지장 리파제를 생성하도록 하거나 상기 정의된 유도된 폴리펩티드를 생성하도록 하는 성분, 특히 식물 세포의 전사 기구에 의해 인식되는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열의, 형질전환된 식물 세포 또는 이 세포로부터 수득된 식물로부터 활성 효소 형태의 포유동물 재조합 전십이지장 리파제 또는 상기 정의된 1종 (이상의) 폴리펩티드(들)을 수득하기 위해 식물 세포를 형질전환시키기 위한 용도에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 한편으로는 도 2에 도시한 개 위장 리파제 (DGL)를 코딩하는 도 1에 도시한 cDNA, 또는 1종 (이상의) 뉴클레오티드(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 cDNA로부터 유도된, 도 2에 도시한 DGL의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 DGL로부터 유도된, 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드, 다른 한편으로는 식물 세포가 상기 cDNA 또는 상기 유도된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 생성하도록 하는 성분, 특히 식물 세포의 전사 기구 (보다 구체적으로는 식물 세포의 RNA 폴리머라제)에 의해 인식되는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열의, 형질전환된 식물 세포 또는 이 세포로부터 수득된 식물로부터 활성 효소 형태의 재조합 DGL 또는 상기 정의된 1종 (이상의) 유도된 폴리펩티드(들)을 수득하기 위해 식물 세포를 형질전환시키기 위한 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 도 1에 도시한 cDNA 또는 상기 정의된 유도된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
이러한 측면에서, 본 발명은 보다 구체적으로는 도 2에 도시한 개 위장 리파제 (DGL)를 코딩하는 도 1에 도시한 cDNA를 포함하는 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 보다 구체적으로는 상기 정의된 바와 같고 도 2에 도시한 개 위장 리파제 (DGL)를 코딩하는 도 1에 도시한 cDNA로부터 유도된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 상기 유도된 서열은 도 3에 도시한 서열이 유리하고, 도 1에 도시한 서열에서 위치 12의 뉴클레오티드 A가 뉴클레오티드 G로 치환되고 위치 13의 뉴클레오티드 T가 뉴클레오티드 C로 치환되고 위치 15의 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 T로 치환된 서열에 대응한다.
본 발명에 따른 재조합 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 재조합 폴리펩티드(즉, DGL 또는 상기 유도된 폴리펩티드)를 식물 세포의 특정 구획, 특히 소포체 또는 액포 내로, 또는 세포 외부로, 펙토셀룰로스성 벽 내로 또는 세포외 공간, 소위 아포플라즘 내로 지향하게 하는 기능을 하는 펩티드를 코딩하는 1종 (이상의) 서열(들)을 포함하는 것이 유리하다.
본 발명에서 식물 세포의 형질전환에 사용될 수 있는 전사 터미네이터로는 문헌 [Franck et al., 1980]에 기재된 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV)의 터미네이터 폴리A 35S 또는 노팔린을 갖는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 균주의 플라스미드 Ti의 노팔린 합성효소의 유전자의 3' 비코딩 영역에 대응하는 폴리A NOS 터미네이터 (Depicker et al., 1982)를 언급할 수 있다.
상기 특징에서 본 발명은 상기 cDNA 또는 그의 유도된 서열의 하류에 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S 또는 아그로박테리움 투메파시엔스의 터미네이터 폴리A NOS를 포함하는 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
본 발명에서 식물 세포의 형질전환에 사용할 수 있는 전사 프로모터로는 다음과 같은 프로모터를 언급할 수 있다:
- 본 발명에 따라 형질전환된 세포로부터 수득된 전체 식물에서 본 발명에 따라 재조합 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는, 문헌 [Kay et al., 1987]에 기술된 CaMV의 프로모터 35S 또는 유리하게는 이중가닥 프로모터 35S (pd35S),
- 본 발명에 따라 형질전환된 세포로부터 수득된 식물의 종자 (또는 낟알)에서만 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는, 문헌 [Depigny-This et al., 1992]에 기술된 무우의 크루시페린의 유전자의 프로모터 pCRU,
- 아라비돕시스 탈리아나의 낟알의 저장 단백질인 GEA1 및 GEA6의 유전자의 5' 비코딩 영역에 각각 대응하고 (Gaubier et al., 1993) 낟알에서의 특이적 발현을 가능하게 하는 프로모터 pGEA1 및 pGEA6,
- 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토핀 유전자의 프로모터의 3종의 전사 활성인자, 아그로박테리움 투메파시엔스의 만노핀 합성효소의 프로모터의 전사 활성인자 성분 및 만노핀 합성효소의 프로모터의 융합에 의해 생성되는 키메라(chimera) 프로모터인 수퍼-프로모터 pSP (PCT/US94/12946),
- 문헌 [McElroy et al., 1991]에 기재된 플라스미드 pAct1-F4에 포함된 벼의 악틴 인트론 뒤에 존재하는 벼의 악틴 프로모터에 (pAR-IAR),
문헌 [Reina et al., 1990]에 기재되고 옥수수 종자의 배젖에서의 발현을 가능하게 하는 플라스미드 pγ63에 포함된 옥수수 γzeine 유전자의 프로모터 (pγzeine).
상기 측면에서 본 발명은 상기 cDNA 또는 그의 유도된 서열의 상류에 CaMV의 이중가닥 프로모터 35S (pd35S) 또는 무우의 크루시페린 유전자의 프로모터 pCRU 또는 아라비돕시스 탈리아나의 프로모터 pGEA1 또는 pGEA6 또는 아그로박테리움 투메파시엔스의 수퍼-프로모터 pSP 또는 벼의 프로모터 pAR-IAR 또는 옥수수의 프로모터 pγzeine을 포함하는 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
본 발명에 사용되는 지향 펩티드를 코딩하는 서열은 식물, 인간 또는 동물에서 기원된 것일 수 있다.
식물 기원의 지향 펩티드를 코딩하는 서열로는 다음을 들 수 있다:
- 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 본 발명에 따라 형질전환된 식물 세포의 분비계 (주로 소포체) 내로 도입시키는, 고구마의 스포라민 A의 23 아미노산의 프리펩티드 (신호 펩티드)를 코딩하는 69 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 (하기 실시예에 나타냄),
- 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 본 발명에 따라 형질전환된 식물 세포의 액포에 축적시키는, 고구마의 스포라민 A의 14 아미노산의 N-말단 액포 지향 프로펩티드를 코딩하는 42 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 (하기 실시예에 나타냄),
- 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 본 발명에 따라 형질전환된 식물 세포의 분비계에 도입시키고 액포에 축적시키는, 상기 신호 펩티드의 N말단부에서 C 말단부의 23 아미노산, 이어서 상기 프로펩티드의 14 아미노산으로 구성된 프리프로펩티드를 코딩하는 111 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 (하기 실시예에 나타냄), (상기 3개의 서열은 문헌 [Murakami et al., 1986 및 Matsuoka and Nakamura, 1991]에 기재되어 있음),
- 문헌 [Schoreder et al., 1993 및 Bednarek and Ralkhel, 1991]에 기재된 보리의 렉틴의 카르복시 말단 프로펩티드.
인간 또는 동물 기원의 지향 펩티드를 코딩하는 서열로는 유럽 특허 제0 191 061호에 기재된 인간 위장 리파제 (HGL)의 신호 펩티드 또는 하기 실시예에 나타낸 유럽 특허 출원 제0 542 629호에 기재된 토끼 위장 리파제 (RGL)의 신호 서열 또는 인간 췌장 리파제 (HPL)의 신호 서열 또는 개 위장 리파제 (DGL)의 신호 서열을 코딩하는 서열을 언급할 수 있다.
또한, 지향 펩티드를 코딩하는 서열로는 소포체로 지향하게 하는 테트라펩티드인 KDEL을 코딩하는 서열을 들 수 있다.
이러한 측면에서 본 발명은 고구마의 스포라민 A의 신호 펩티드 또는 HGL 또는 RGL 또는 DGL의 신호 펩티드와 같은 신호 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열을 포함하는 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것으로서, 신호 펩티드를 코딩하는 상기 서열이 상기 재조합 뉴클레오티드 서열 내에서 상기 cDNA 또는 그의 유도된 서열의 상류에 그리고 사용된 프로모터의 하류에 존재하여 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질에서 신호 펩티드의 최종 C-말단 아미노산이 상기 cDNA 또는 그의 유도된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 제1 N-말단 아미노산에 결합된다.
또한, 본 발명은 액포 지향 펩티드, 특히 고구마의 스포라민 A의 액포 지향 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열을 포함하는 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것으로서, 액포 지향 펩티드를 코딩하는 상기 서열이 상기 재조합 뉴클레오티드 서열 내에서 신호 펩티드를 코딩하는 서열과 상기 cDNA 또는 그의 유도된 서열을 코딩하는 서열 사이에 존재하여 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질에서 액포 지향 펩티드의 제1 N-말단 아미노산이 신호 펩티드의 최종 C-말단 아미노산에 결합하고, 상기 지향 펩티드의 최종 C-말단 아미노산이 상기 cDNA 또는 그의 유도된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 제1 N-말단 아미노산에 결합된다.
또한, 본 발명은 액포 지향 펩티드, 특히 보리의 렉틴의 액포 지향 펩티드의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열을 포함하는 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것으로서, 액포 지향 펩티드를 코딩하는 상기 서열이 상기 재조합 뉴클레오티드 서열 내에서 상기 cDNA 또는 그의 유도된 서열을 코딩하는 서열의 하류에 존재하여 상기 재조합 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질에서 액포 지향 펩티드의 제1 N-말단 아미노산이 상기 cDNA 또는 그의 유도된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 최종 C-말단 아미노산에 결합된다.
본 발명은 보다 구체적으로는 하기 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다:
- 5'→3' 방향으로 CaMV의 프로모터 pd35S, 스포라민 A의 신호 펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 3에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pd35S-PS-DGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 CaMV의 프로모터 pd35S, 스포라민 A의 프리프로펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 3에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pd35S-PPS-DGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 CaMV의 프로모터 pd35S, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (하기 실시예에 나타낸 마지막 3개의 C-말단 아미노산을 코딩하는 9개의 뉴클레오티드가 억압된 처음 19개 아미노산으로 구성된 서열), 이 서열 직후의 도 1에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pd35S-RGLSP-DGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 크루시페린의 프로모터 pCRU, 스포라민 A의 신호 펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 3에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pCRU-PS-DGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 크루시페린의 프로모터 pCRU, 스포라민 A의 프리프로펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 3에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pCRU-PPS-DGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 크루시페린의 프로모터 pCRU, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pCRU-RGLSP-DGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 아라비돕시스 탈리아나의 프로모터 pGEA1, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pGEA1-RGLSP-DGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 아라비돕시스 탈리아나의 프로모터 pGEA6, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pGEA6-RGLSP-DGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 벼의 프로모터 pAR-IAR, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S 또는 아그로박테리움 투메파시엔스의 터미네이터 폴리A NOS를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pAR-IAR-RGLSP-DGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 옥수수의 프로모터 pγzeine, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pγzeine-RGLSP-DGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 옥수수의 프로모터 pγzeine, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA, 테트라펩티드 KDEL을 코딩하는 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL로 칭함),
또한, 본 발명의 재조합 뉴클레오티드 서열은 특히 상기 재조합 서열에 의해 형질전환된 식물 세포와 형질전환되지 않은 세포를 구별 (및 선별)을 위해 상기 재조합 서열의 마커로서 사용할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 유리하다.
상기 재조합 서열의 마커로서 사용할 수 있는 뉴클레오티드 서열은 항생물질, 특히 카나마이신에 대한 내성을 갖는 유전자로부터 선택하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 그의 복제에 필수적이지 않은 부위에 삽입된 본 발명에 따른 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 특히 플라스미드 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 정의된 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포, 특히 세균, 예를 들면 아그로박테리움 투메파시엔스에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
- 본 발명에 따른 1종 (이상의) 재조합 뉴클레오티드 서열(들)이 식물 세포의 게놈 내에 통합되도록 식물 세포를 형질전환시키는 단계,
- 적합한 경우, 상기 형질전환된 세포로부터 형질전환된 식물을 생성시키는 단계,
- 상기 세포 또는 상기 형질전환된 식물에서 생성된 재조합 DGL 및(또는) 특히 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 재조합 DGL로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드(들)을 특히 추출에 의해, 적합한 경우 추출 후 정제에 의해 회수하는 단계
로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 활성 효소 형태의 재조합 DGL 및(또는) 상기 방법에 의해 재조합 DGL로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드(들)의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시형태에 따르면, 식물 세포의 형질전환은 본 발명의 재조합 뉴클레오티드를, 특히 원형질을 문헌 [Krens et al., 1982]에 기재된 방법에 따라 이가 양이온 (Ca2+)의 존재 하에 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 용액 중에서 배양한 후에 원형질에 도입함으로써 수행할 수 있다.
또한, 식물 세포의 형질전환은 특히 문헌 [Fromm et al., 1986]의 방법에 따라 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 실시할 수 있다.
식물 세포의 형질전환은 문헌 [Sanford, 1988]에 기재된 기술에 의해 본 발명에 따른 재조합 뉴클레오티드 서열로 코팅한 금속 입자를 고속도로 발사하여 유전자를 세포 핵 내로 전달하는 유전자 총을 사용하여 실시할 수도 있다.
식물 세포의 형질전환을 실시하기 위한 다른 방법은 문헌 [De La Penna et al., 1987]에 기재된 세포질 또는 핵 미세주입법이다.
본 발명의 상기 방법의 특히 바람직한 실시형태에 따르면, 식물 세포는 상기 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환되고 식물 세포를 감염시켜 상기 벡터의 게놈에 처음에 포함된 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 식물 세포의 게놈 내로 통합시킬 수 있는 세포 숙주를 식물 세포와 함께 위치시킴으로써 형질전환된다.
사용되는 상기 세포 숙주는 특히 문헌 [Bevan, 1984 및 An et al., 1986]에 기재된 방법에 따라 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 문헌 [Jouanin et al., 1987]에 기재된 방법에 따라 아그로박테리움 리조겐네스 (Agrobacterium rhizogenes)이다.
본 발며에서 형질전환될 수 있는 식물 세포로는 평지, 담배, 옥수수, 완두콩, 토마토, 당근, 밀, 보리, 감자, 대두, 해바라기, 상추, 벼 및 자주개자리를 언급할 수 있다.
본 발명의 상기 방법의 한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 형질전환된 식물 세포는 문헌 [Brodelius, 1988]에 기재된 방법에 따라 액체 배지, 또는 문헌 [Brodelius et al., 1979]의 방법에 따라 고정 형태로 시험관 내, 특히 생체 반응기 중에서, 또는 문헌 [Deno et al., 1987]의 방법에 따라 시험관 내에서 형질전환된 뿌리의 배양에 의해 배양된다.
이어서, 시험관 내에서 배양된 상기 형질전환된 세포에 의해 생성된 재조합 DGL 및(또는) 상기 정의된 유도된 폴리펩티드(들)는 상기 시험관 내 배양 배지로부터 추출, 및 적합한 경우 크로마토그래피에 의한 정제에 의해 회수된다.
본 발명에 따른 재조합 DGL 및(또는) 유도된 폴리펩티드(들)의 상기 제조 방법의 바람직한 실시형태에 따르면, 식물 세포의 형질전환 후에 적합한 배지 중에서 상기 형질전환된 세포를 배양함으로써 형질전환된 식물을 생성시키는 단계를 실시한다. 이와같이 수득된 전체 식물의 세포에서 생성된 재조합 DGL 및(또는) 유도된 폴리펩티드(들)은 전체 식물 또는 식물의 일부 (특히 잎, 줄기 또는 과실), 또는 상기 식물에 의해 성산된 종자에 대해 실시되는 추출, 이어서 적합한 경우 재조합 DGL 및(또는) 유도된 폴리펩티드(들)의 정제 단계에 의해 회수된다.
상기 방법에서 재조합 DGL 및(또는) 유도된 폴리펩티드(들)의 회수에 사용되는 형질전환된 식물은 적합한 배지 중에서의 본 발명의 형질전환된 세포의 배양에 의해 수득된 T0 세대의 식물, 또능 유리하게는 선행 세대의 식물의 자가수정에 의해 수득되고 본 발명의 재조합 뉴클레오티드 서열이 멘델 법칙에 따라 재생산되는 다음 세대 (T1, T2 등)의 식물이다.
본 발명 방법의 수행으로 수득되는 재조합 DGL로부터 유도되는 폴리펩티드로는 다음의 폴리펩티드를 언급할 수 있다:
- 도 2의 위치 55 내지 379의 아미노산으로 구성되고 서열 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열 4에 나타낸 폴리펩티드 (Δ54),
- 도 2의 위치 5 내지 379의 아미노산으로 구성되고 서열 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 서열 6에 나타낸 폴리펩티드 (Δ4).
보다 구체적으로는, 본 발명은 식물 세포의 형질전환 단계가 한편으로는 도 1에 도시한 cDNA를 포함하고 다른 한편으로는 RGL의 22 아미노산의 신호 펩티드, 유리하게는 RGL의 신호 펩티드의 처음 19 아미노산을 코딩하는 서열을 포함하는 상기 재조합 서열의 게놈 내로의 통합에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는, 도 2에 도시한 재조합 DGL의 제조, 및 적합한 경우 1종 (이상의) 유도된 폴리펩티드(들), 특히 상기 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)의 제조를 위한 상기 방법에 관한 것이다.
본 발명은 보다 구체적으로는,
- 적합한 배양 배지 상에 상기 재조합 뉴클레오티드 서열 pd35S-RGLSP-DGL를 포함하는 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스의 균주와 함께 위치시킴으로써 식물의 잎의 외식편(explant) 세포를 형질전환시키는 단계,
- 카나마이신을 포함하는 배지 상에서 형질전환된 외식편의 선별 단계,
- 적합한 배지 상에서 상기 형질전환된 외식편의 배양에 의해 상기 외식편으로부터 형질전환된 식물의 생성 단계,
- 적합한 완충액 중에서 상기 형질전환된 식물의 잎 및(또는) 종자 및(또는) 과실의 분쇄, 원심분리 및 효소 활성을 갖는 식물 추출물을 구성하는 상등액의 회수에 의한 재조합 DGL, 및 적합한 경우 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)의 추출 단계,
- 적합한 경우, 상기 단계 동안에 수득된 추출물로부터, 특히 상등액에 대해 크로마토그래피를 실시하여 재조합 DGL을 정제하여 재조합 DGL을 본질적으로 순수 형태로 제조하는 단계
로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 도 2에 도시한 재조합 DGL을 적합한 경우 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)와 함께 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법에서 수득된 추출물로부터, 특히 추출물의 상등액에 대해 실시하는 크로마토그래피에 의한 정제에 의해 본질적으로 순수한 형태의 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)의 상기 제조 방법의 용도에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 서열 pd35S-RGLSP-DGL로 형질전환된 세포가 가지과, 특히 담배 또는 토마토의 외식편 세포인 상기 방법의 실행에 의해 적합한 경우 본질적으로 순수한 형태의 상기 폴리펩티드 (Δ4)의 제조에 관한 것이다.
상기 방법의 한 실시형태에 따르면, 폴리펩티드 (Δ4)는 적합한 완충액 중에서 상기 형질전환된 담배 잎의 분쇄, 원심분리 및 상등액의 회수에 의해 상기 담배 잎으로부터의 추출에 의해 특이적으로 수득할 수 있다. 이어서, 폴리펩티드 (Δ4)는 상기 폴리펩티드 (Δ4)를 포함하는 상기 잎 추출물로부터 상기 상등액에 대한 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 식물 세포의 형질전환 단계가 한편으로는 도 3에 도시한 뉴클레오티드 서열을 포함하고 다른 한편으로는 상기 스포라민 A의 신호 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 서열의 식물의 게놈 내로의 통합에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 DGL 및(또는) 이로부터 유도된 상기 정의된 1종 (이상의) 폴리펩티드(들)의 제조를 위한 상기 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 수행으로 수득할 수 있는 재조합 폴리펩티드로부터 유도된 폴리펩티드로는 상기 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 언급할 수 있다.
본 발명은 보다 구체적으로는,
- 재조합 뉴클레오티드 서열 pd35S-PS-DGL 및(또는) pd35S-PPS-DGL을 포함하는 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스의 균주와 함께 위치시킴으로써 식물의 외식편 (특히 잎의 외식편) 세포를 형질전환시키는 단계,
- 카나마이신을 포함하는 배지 상에서 형질전환된 외식편의 선별 단계,
- 적합한 배지 상에서 상기 형질전환된 외식편의 배양에 의해 상기 외식편으로부터 형질전환된 식물의 생성 단계,
- 적합한 완충액 중에서 상기 형질전환된 식물의 잎 및(또는) 종자 및(또는) 과실의 분쇄, 원심분리 및 효소 활성을 갖는 식물 추출물을 구성하는 상등액의 회수에 의해 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)의 추출 단계,
- 적합한 경우, 상기 단계 동안에 수득된 추출물로부터, 특히 상등액에 대해 크로마토그래피를 실시하여 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 정제하여 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)을 본질적으로 순수 형태로 제조하는 단계
로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 상기 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)의 제조 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 형질전환된 세포가 가지과, 특히 담배 또는 토마토 잎의 외식편 세포인 상기 방법의 실행에 의해 상기 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 방법의 한 실시형태에 따르면, 폴리펩티드 (Δ54)는 적합한 완충액 중에서 상기 형질전환된 담배 종자의 분쇄, 원심분리 및 상등액의 회수에 의한 상기 담배 종자로부터의 추출에 의해 특이적으로 수득할 수 있다. 이어서, 폴리펩티드 (Δ54)는 상기 폴리펩티드 (Δ54)를 포함하는 상기 종자 추출물로부터 상기 상등액에 대한 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
본 발명은 보다 구체적으로는,
- 재조합 뉴클레오티드 서열 pCRU-PPS-DGL 및(또는) 서열 pCRU-PS-DGL 및(또는) 서열 pGEA1-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pGEA6-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pAR-IAR-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pγzeine-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL을 포함하는 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스의 균주와 함께 위치시킴으로써 식물의 외식편 세포를 형질전환시키는 단계,
- 카나마이신을 포함하는 배지 상에서 형질전환된 외식편의 선별 단계,
- 적합한 배지 상에서 상기 형질전환된 외식편의 배양에 의해 상기 외식편으로부터 형질전환된 식물의 생성 단계,
- 적합한 완충액 중에서 상기 형질전환된 식물의 종자의 분쇄, 원심분리 및 효소 활성을 갖는 식물 추출물을 구성하는 상등액의 회수에 의한 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)의 추출 단계,
- 적합한 경우, 상기 단계 동안에 수득된 추출물로부터, 특히 상등액에 대해 크로마토그래피를 실시하여 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 정제하여 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 본질적으로 순수 형태로 제조하는 단계
로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 상기 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)의 제조 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 형질전환된 세포가 평지 및 담배의 외식편 세포이고 폴리펩티드 (Δ54)를 형질전환된 종자의 분쇄에 의해 추출하는 상기 방법의 수행에 의해 상기 폴리펩티드 (Δ54)의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 방법에서 형질전환된 식물 세포는 담배, 평지, 옥수수, 완두콩, 토마토, 당근, 밀, 보리, 감자, 대두, 해바라기, 상추, 벼 및 자주개자리로부터 선택하는 것이 유리하다.
보다 구체적으로, 본 발명의 목적은
- 입자총을 사용하여 옥수수 캘러스에 충격을 가함으로써 재조합 뉴클레오티드 서열 pAR-IAR-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pγzeine-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL을 포함하는 플라스미드로 오수수 캘러스를 형질전환시키는 단계,
- 카나마이신과 같은 선별물질을 포함하는 배지 상에서 형질전환된 캘러스의 선별 단계,
- 적합한 배지 상에서 상기 형질전환된 캘러스의 배양에 의해 상기 캘러스으로부터 형질전환된 옥수수의 생성 단계,
- 적합한 완충액 중에서 상기 형질전환된 식물에 의해 생성된 종자의 분쇄, 원심분리 및 효소 활성을 갖는 식물 추출물을 구성하는 상등액의 회수에 의한 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)의 추출 단계,
- 적합한 경우, 상기 단계 동안에 수득된 추출물로부터, 특히 상등액에 대해 크로마토그래피를 실시하여 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 정제하여 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 본질적으로 순수 형태로 제조하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)의 제조 방법이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따라 안정적인 방식으로 그의 게놈 내에 통합된 상기 1종 (이상의) 재조합 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 유전적으로 형질전환된 식물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)와 같은 본 발명에 따른 1종 (이상의) 재조합 폴리펩티드(들)을 포함하고, 효소 활성, 특히 하기 정의되는 리파제 활성을 갖는 상기 트랜스제닉 식물 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따라 안정적인 방식으로 그의 게놈 내에 통합된 상기 1종 (이상의) 재조합 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 유전적으로 형질전환된 종자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)와 같은 본 발명에 따른 1종 (이상의) 재조합 폴리펩티드(들)을 포함하고, 효소 활성, 특히 하기 정의되는 리파제 활성을 갖는 상기 트랜스제닉 종자에 관한 것이다.
본 발명에 따라 형질전환된 종자는 본 발명에 따른 형질전환된 세포의 배양에 의해 생성된 상기 세대 T0의 식물 또는 (상기한 바와 같은) 선행 세대의 자가수정 또는 이종 교배에 의해 수득된 후손 세대 (T1, T2 등)의 유전적으로 형질전환된 식물로부터 수확한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따라 안정적인 방식으로 그의 게놈 내에 통합된 상기 1종 (이상의) 재조합 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전적으로 형질전환된 식물 또는 식물의 일부 (특히, 외식편, 줄기, 잎, 뿌리, 화분 등)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)와 같은 본 발명에 따른 1종 (이상의) 재조합 폴리펩티드(들)을 포함하고, 효소 활성, 특히 하기 정의되는 리파제 활성을 갖는 상기 트랜스제닉 식물 또는 식물의 일부에 관한 것이다.
보다 구체적으로 본 발명은 본 발명에 따라 상기 세포 또는 종자의 배양에 의해 수득되는 상기 형질전환된 식물에 관한 것이다.
본 발명에 따라 형질전환된 식물, 또는 식물의 일부는 담배, 평지, 옥수수, 완두콩, 토마토, 당근, 밀, 보리, 감자, 대두, 해바라기, 상추, 벼 및 자주개자리 또는 이들 식물의 일부로부터 선택하는 것이 유리하다.
본 발명은 효소 활성, 특히 하기 정의되는 리파제 활성을 갖고 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)와 같은 본 발명에 따른 1종 (이상의) 재조합 폴리펩티드(들)을 포함하는, 상기 본 발명 방법의 실시에 의해 제조된 식물 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 효소 활성을 갖는 식물 또는 식물의 일부 및 식물 추출물의 리파제 (또는 지방 분해) 활성은 기질로서 단쇄 트리글리세라이드 (예를 들면 트리부티린)을 사용하여 문헌 [Garouri et al., 1986]의 방법에 따라 측정할 수 있다. 효소 활성은 단위 (U)로 표시되고, 1 단위(U)는 최적 pH 조건 하에 37℃에서 1분 당 유리 지방산 1 μmol을 생성시키는데 필요한 효소의 양에 대응한다.
본 발명의 효소 활성을 갖는 식물 추출물은 약 0.5 U 내지 약 1,000 U/g (잎의 생 중량 (FM)), 특히 약 10 U/g (FW) 내지 약 300 U/g (FW), 또는 약 1 U 내지 약 5,000 U/g (종자의 FM), 특히 약 10 U/g (FW) 내지 약 1,000 U/g (FW)의 측정치에 대응하는, 효소 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드의 중량%가 상기 추출물에 존재하는 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1% 내지 20%, 특히 약 1% 내지 15%인 것이 유리하다.
보다 구체적으로, 본 발명은 효소 활성을 갖는 하기 식물 추출물에 관한 것이다:
* 상기 방법 중의 하나에 따라 서열 pd35S-RGLSP-DGL 또는 서열 pd35S-PS-DGL 또는 서열 pd35S-RGLSP-DGL 또는 서열 pd35S-PS-DGL 또는 서열 pd35S-PPS-DGL을 사용한 상기 식물의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된, 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 포함하는 식물의 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자의 추출물, 특히
- 상기 방법에 따라 서열 pd35S-PS-DGL 또는 서열 pd35S-PPS-DGL을 사용한 담배 잎의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된 담배 잎의 추출물로서 폴리펩티드 (Δ54)를 폴리펩티드 (Δ4)와 함께 포함하고, 폴리펩티드 (Δ54)와 폴리펩티드 (Δ4)의 혼합물의 중량%가 추출물 내에 존재하는 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1% 내지 약 20%이고 추출물의 효소 활성이 약 100 U/g (FW) 내지 약 300 U/g (FW)인 담배 잎의 추출물,
- 상기 방법에 따라 서열 pd35S-PS-DGL 또는 서열 pd35S-PPS-DGL을 사용한 토마토 잎의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된 토마토 잎 또는 과실의 추출물로서 폴리펩티드 (Δ54)를 폴리펩티드 (Δ4)와 함께 포함하고, 폴리펩티드 (Δ54)와 폴리펩티드 (Δ4)의 혼합물의 중량%가 추출물 내에 존재하는 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1% 내지 약 20%이고 추출물의 효소 활성이 약 100 U/g (FW) 내지 약 300 U/g (FW)인 토마토 잎 또는 과실의 추출물,
- 상기 방법에 따라 서열 pd35S-RGLSP-DGL을 사용한 담배 잎의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된 담배 잎의 추출물로서 폴리펩티드 (Δ4)를 추출물 내에 존재하는 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1% 내지 약 20 중량%로 포함하고 추출물의 효소 활성이 약 100 U/g (FW) 내지 약 300 U/g (FW)인 담배 잎의 추출물,
- 상기 방법에 따라 서열 pd35S-PS-DGL 또는 pd35S-PPS-DGL을 사용한 담배 잎의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된 담배 종자의 추출물로서 폴리펩티드 (Δ54)를 추출물 내에 존재하는 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1% 내지 약 1 중량%로 포함하고 추출물의 효소 활성이 약 10 U/g (FW) 내지 약 300 U/g (FW)인 담배 잎의 추출물,
* 상기 방법에 따라 서열 pCRU-PS-DGL 또는 서열 pCRU-PPS-DGL 또는 서열 pGEA1-RGLSP-DGL 또는 서열 pGEA6-RGLSP-DGL을 사용한 식물의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된, 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 포함하는 식물 종자의 추출물, 특히
- 상기 방법에 따라 서열 pCRU-PS-DGL 또는 서열 pCRU-PPS-DGL 또는 서열 pGEA1-RGLSP-DGL 또는 서열 pGEA6-RGLSP-DGL을 사용한 식물의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된 평지씨의 추출물로서 폴리펩티드 (Δ54)를 추출물 내에 존재하는 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1% 내지 약 1 중량%로 포함하고 추출물의 효소 활성이 약 10 U/g (FW) 내지 약 1,000 U/g (FW)인 평지씨의 추출물,
* 상기 방법에 따라 서열 pAR-IAR-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pγzeine-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL을 사용한 식물의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된, 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 포함하는 식물 종자의 추출물, 특히
- 상기 방법에 따라 서열 pAR-IAR-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pγzeine-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL을 사용한 평지 잎의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된 옥수수 종자의 추출물로서 폴리펩티드 (Δ54)를 추출물 내에 존재하는 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1% 내지 약 1 중량%로 포함하고 추출물의 효소 활성이 약 10 U/g (FW) 내지 약 1,000 U/g (FW)인 옥수수 종자의 추출물.
또한, 본 발명은 상기 효소 추출물에 대해 수행되는 크로마토그래피에 의한 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 정제 단계를 포함하는 상기 본 발명의 방법 중의 하나의 수행함으로써 본질적으로 순수 형태로 수득되는, 도 2에 도시한 아미노산 서열의 효소 활성 재조합 DGL, 또는 이로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.
상기 재조합 DGL로부터 유도된 폴리펩티드로서, 본 발명은 보다 구체적으로는 분자량이 각각 약 37 kDa 및 약 49 kDa인 상기 폴리펩티드 (Δ54) 및 (Δ4)에 관한 것이다.
효소 활성 재조합 DGL 또는 상기 리파제 활성을 갖는 유도된 폴리펩티드는 가고리(Gargouri)의 상기 문헌의 방법에 따라 측정되는 리파제 활성을 가질 수 있는 재조합 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해된다.
예를 들면, 본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드는 약 10 U/mg (재조합 폴리펩티드) 내지 약 1,000 U/mg, 유리하게는 약 100 U/mg 내지 약 600 U/mg의 리파제 활성을 갖는다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 상기 방법에 따라 서열 pd35S-RGLSP-DGL로 형질전환된 담배 세포로부터 수득된 형질전환된 담배로부터 유래한 담배 잎 또는 종자의 효소 추출물의 정제에 의해 수득되는, 상기 리파제 활성을 갖는 재조합 DGL에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 서열 pd35S-PS-DGL 또는 서열 pd35S-PPS-DGL, 또는 서열 pd35S-RGLSP-DGL로 형질전환된 식물 세포로부터 수득된 형질전환된 식물, 그 중에서도 가지과, 예를 들면 담배 또는 토마토의 잎 및(또는) 종자 및(또는) 과실의 효소 추출물의 정제에 의해 수득되는, 상기 리파제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드 (Δ54) 및 (Δ4)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 서열 pCRU-PS-DGL 또는 서열 pCRU-PPS-DGL로 형질전환된 담배 또는 평지 세포로부터 각각 수득된 형질전환된 담배 또는 평지로부터 유래하는 담배 종자 또는 평지씨 종자의 효소 추출물의 정제에 의해 수득되는, 상기 리파제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드 (Δ54)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 서열 pGEA1-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pGEA6-RGLSP-DGL로 형질전환된 평지 세포로부터 수득된 형질전환된 평지로부터 유래하는 평지씨의 효소 추출물의 정제에 의해 수득되는, 상기 리파제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드 (Δ54) 및 (Δ4)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 서열 pAR-IAR-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pγzeine-RGLSP-DGL 및(또는) 서열 pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL로 형질전환된 옥수수 세포로부터 수득된 형질전환된 옥수수로부터 유래하는 옥수수 종자의 효소 추출물의 정제에 의해 수득되는, 상기 리파제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드 (Δ54) 및 (Δ4)에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드 (Δ54) 및 (Δ4)의 외관상 분자량은 각각 폴리아크릴아미드 겔에서의 분석 및 니트로셀룰로스 상의 전기이동 후의 면역 검출에 의해 측정시에 (이 방법은 하기 본 발명의 실시예에서 상술됨) 37 kDa 및 49 kDa이다.
본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩티드에 대해 지향하는 항체, 보다 구체적으로는 본 발명에 따른 재조합 DGL 및(또는) 상기 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 상기 폴리펩티드 (Δ4)에 대해 지향하고, HGL도 인식할 수 있는 항체에 관한 것이다.
상기 항체는 상기 폴리펩티드로 동물을 면역처리한 후 형성된 항체를 회수하여 수득할 수 있다.
상기 생성물은 물론 폴리클로날 항체에 제한되지 않는다.
또한, 한편으로는 본 발명의 정제된 폴리펩티드 중의 하나에 대해 면역처리된 동물, 특히 마우스 또는 쥐의 비장 세포 및 다른 한편으로는 적합한 골수종 세포로부터 통상의 방법에 의해 형성될 수 있으며, 초기에 면역처리에 사용된 상기 폴리펩티드 및 HGL을 인식하는 모노클로날 항체를 생성시키는 능력에 따라 선별할 수 있는 하이브리도마에 의해 생성되는 모노클로날 항체에 적용된다.
또한, 본 발명은 본질적으로 순수한 형태이거나 상기 효소 활성을 갖는 식물 추출물에 포함된 상기 정의된 1종 (이상의) 재조합 폴리펩티드(들), 예를 들면 DGL 또는 그의 유도된 폴리펩티드의 제조를 위한 본 발명에 따른 형질전환된 식물, 식물의 일부, 식물 세포 또는 종자의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 효소 활성을 갖는 식물 또는 식물의 일부 또는 상기 정의된 효소 활성을 갖는 식물 추출물 또는 상기 정의된 재조합 DGL 또는 그의 유도된 폴리펩티드의 인간 또는 동물의 식품 분야에서의 용도에 관한 것이다.
보다 구체적으로 본 발명은 본 발명에 따른 효소 활성을 갖는 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎, 과실, 종자의 식품으로서의 용도에 관한 것이다.
상기 측면에서, 본 발명은 구체적으로 상기 효소 활성을 갖는 식물 또는 상기 식물에 의해 생성된 식물의 일부, 특히 잎 또는 과실 또는 종자를 포함하는, 인간 또는 동물이 섭취할 수 있는 특성을 갖는 식품에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 효소 활성을 갖는 1종 (이상의) 식물(들) 및(또는) 이 식물(들)의 일부, 특히 잎 및(또는) 종자 및(또는) 과실 및(또는) 1종 (이상의) 상기 효소 활성을 갖는 식물 추출물(들) 및(또는) 본 발명의 1종 (이상의) 재조합 폴리펩티드(들)을, 적합하게는 1종 (이상의) 다른 섭취가능 화합물(들)과 조합하여 포함하는 영양 조성물에 관한 것이다.
상기 영양 조성물에 포함되는 식물 또는 식물의 일부는 분말재의 형태가 유리하다.
본 발명에 따른 식품, 소위 기능성 식품 또는 본 발명에 따른 영양 조성물은 보다 구체적으로는 건강한 개체 또는 위장 및(또는) 췌장 리파제의 생성 수준에 영향을 주거나 주지 않을 수 있는 1종 이상의 병변으로 고통받는 개체에 의해 소화되는 동물성 또는 식물성 지방의 흡수를 촉진하려는 것이다. 이러한 측면에서 본 발명의 식품 또는 영양 조성물은 영양 보충물로서 사용하는 유리하다.
또한, 본 발명은 건강한 개체 또는 위장 및(또는) 췌장 리파제의 생성 수준에 영향을 주거나 영향을 주지 않을 수 있는 1종 이상의 병변으로 고통받는 개체에 의해 소화되는 동물성 또는 식물성 지방의 흡수를 촉진하기 위한 의약 (또는 제약 조성물)의 제조를 위한, 본 발명에 따른 효소 활성을 갖는 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자, 또는 식물 세포, 또는 상기 정의된 효소 활성을 갖는 식물 추출물, 또는 본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드, 예를 들면 재조합 DGL 또는 상기 정의된 그의 유도된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
특히, 상기 제약 조성물은 지방 흡수 기작을 변경시키는 의료 처치를 받는 개체 또는 연로자에 대해 사용하는 유리하다.
또한, 본 발명에 따른 제약 조성물은 보다 구체적으로는 개체에서의 리파제(특히 위장 및(또는) 췌장 리파제) 부족에 관련된 병변, 특히 낭포성 섬유증 및 췌장 외분비 부족과 같은 병변의 치료를 위한 것이다.
본 발명은 보다 구체적으로 상기 효소 활성을 갖는 1종 (이상의) 식물 추출물(들) 및(또는) 본 발명에 따른 1종 (이상의) 재조합 폴리펩티드를, 적합한 경우 제약상 허용되는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 본질적으로 순수한 형태 또는 상기 효소 추출물의 형태로 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 경구 투여하는 것이 바람직하고, 특히 캡슐제, 정제 또는 희석용 분말제의 형태로 투여된다.
인간에 대한 1일 투여량은 상기 제약 조성물이 상기 효소 추출물을 포함하는 경우에는 약 200 mg 내지 약 1,000 mg으로서 본 식사시간에 걸쳐서 분배되는 것이 바람직하고, 상기 제약 조성물이 본 발명에 따른 본질적으로 순수한 형태의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 경우에는 약 100 mg 내지 500 mg이다.
또한, 본 발명은 비료 또는 농업 관련 산업 분야의 산업, 특히 지방 산업, 지방화학 및 유산업에서의 효소 반응을 수행하기 위한, 본 발명에 따른 효소 활성을 갖는 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자, 또는 식물 세포, 또는 상기 정의된 효소 활성을 갖는 식물 추출물, 또는 본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드, 예를 들면 재조합 DGL 또는 상기 정의된 그의 유도된 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
상기 측면에서, 본 발명은 효소 반응이 본 발명에 따른 효소 활성을 갖는 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자, 또는 식물 세포, 또는 상기 정의된 효소 활성을 갖는 식물 추출물, 또는 본 발명에 따른 재조합 폴리펩티드, 예를 들면 재조합 DGL 또는 상기 정의된 그의 유도된 폴리펩티드에 의해 실시되는, 비료 또는 농업 관련 산업 분야의 산업, 특히 지방 산업, 지방화학 및 유산업에서의 1종 이상의 효소 반응의 수행에 의한 효소에 의한 생체 물질 전환(bioconversion) 또는 생체 촉매 작용(biocatalysis)의 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 상기 방법의 수행에 사용될 수 있고, 상기 정의된 효소 활성을 갖는 1종 (이상의) 식물 추출물(들) 및(또는) 본 발명에 따른 1종 (이상의) 재조합 폴리펩티드, 특히 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를, 적합한 경우 상기 산업적 용도에 사용할 수 있는 1종 (이상의) 첨가제(들) 또는 다른 효소(들)과 조합하여 포함하는 비료 또는 농업 관련 산업의 산업적 용도를 위한 효소 제제에 관한 것이다.
본 발명은 보다 구체적으로는 효소에 의한 생체 물질 전환 반응 또는 생체 촉매 작용 반응, 예를 들면 효소에 의한 가수분해 또는 에스테르기 이전 반응을 산업적 규모로 수행하기 위한, 본 발명에 따른 효소 활성을 갖는 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎, 및(또는) 과실, 및(또는) 종자, 또는 식물 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 효소 활성을 갖는 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎, 및(또는) 과실, 및(또는) 종자, 또는 식물 세포는 효소 공급원과 반응 기질 두개 모두로서 사용하는 것이 유리하다.
또한, 본 발명은 효소 공급원과 반응 기질 모두로서 사용할 수 있는 본 발명에 따른 효소 활성을 갖는 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎, 및(또는) 과실, 및(또는) 종자, 또는 식물 세포, 특히 재조합 DGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)를 포함하는 식물을 사용하는 생체 촉매 작용 반응에 관한 것이다.
본 발명은 보다 구체적으로는 생체 연료 제조를 위한 본 발명에 따른 효소 활성을 갖는 식물 또는 이 식물의 일부의 용도에 관한 것이다.
상기 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 형질전환된 식물의 전부 또는 일부의 분말재, 유리하게는 본 발명에 따른 형질전환된 평지, 해바라기, 대두 종자의 분말재에 대한 알콜, 특히 메탄올 또는 에탄올의 첨가, 및 특히 여과에 의한 생체 연료의 회수로 이루어지는 생체 연료의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법의 수행으로 수득되는 식물 지방산의 에스테르, 특히 올레산의 메틸 에스테르에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법의 수행으로 수득되는 생체 연료, 보다 구체적으로는 식물 지방산의 에스테르를 포함하는 상기 생체 연료에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 평지씨에 대한 상기 방법의 수행으로 수득되는 생체 연료, 보다 구체적으로는 올레산의 메틸 에스테르를 포함하는 상기 생체 연료에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 생물학적 시료에서 DGL 또는 HGL의 검출 또는 분석 방법을 수행하기 위한 본 발명의 재조합 폴리펩티드에 대해 지향하는 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 개체 내에 리파제의 과량 또는 그 반대로 불충분한 생성 또는 생성되지 않은 조건에 관련된 병변의 시험관 내 진단 방법을 수행하기 위한 상기 항체의 용도에 관한 것이다.
상기 환자로부터 채취한 생물학적 시료에 대해 수행되는 시험관 내 진단 방법은 상기 시료를 본 발명에 따른 1종 이상의 항체와 함께 위치시키는 단계, 이어서 검출 단계 중에 형성되는 항체-HGL 복합체의 검출 단계로 이루어진다.
상기 측면에서, 본 발명은 또한
- 유리하게는 방사선 또는 효소 방식으로 표지된 상기 항체, 및 상기 항체와 HGL 사이의 면역학적 반응의 수행에 유리한 배지의 구성을 위한 시약,
- 상기 항체와 HGL 사이에 형성된 면역학적 복합체의 검출을 가능하게 하는 시약
을 포함하는, 상기 시험관 내 검출 또는 진단 방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 한편으로는 도 5에 도시한 인간 위장 리파제 (HGL)를 코딩하는 도 2에 도시한 cDNA, 또는 1종 (이상의) 뉴클레오티드(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 cDNA로부터 유도된, 도 5에 도시한 HGL의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 HGL로부터 유도된, 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드, 다른 한편으로는 식물 세포가 상기 cDNA 또는 상기 유도된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 생성하도록 하는 성분, 특히 식물 세포의 전사 기구 (보다 구체적으로는 식물 세포의 RNA 폴리머라제)에 의해 인식되는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열의, 형질전환된 식물 세포 또는 이 세포로부터 수득된 식물로부터 활성 효소 형태의 재조합 HGL 또는 상기 정의된 1종 (이상의) 유도된 폴리펩티드(들)을 수득하기 위해 식물 세포를 형질전환시키기 위한 용도에 관한 것이다.
상기 측면에서, 본 발명은 DGL을 코딩하는 도 1 또는 도 3에 도시한 뉴클레오티드 서열이 HGL을 코딩하는 도 4에 도시한 뉴클레오티드로 치환된, 재조합 DGL의 제조를 위한 식물의 형질전환에서 상기한 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 하기 재조합 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다:
- 5'→3' 방향으로 아그로박테리움 투메파시엔스의 프로모터 pSP, HGL의 신호 펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 4에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pSP-HGLSP-HGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 아그로박테리움 투메파시엔스의 프로모터 pSP, HPL의 신호 펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 4에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pSP-HPLSP-HGL로 칭함),
- 5'→3' 방향으로 아그로박테리움 투메파시엔스의 프로모터 pSP, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 4에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pSP-RGLSP-HGL로 칭함).
또한, 본 발명은 상기한 HGL 및(또는) 그의 유도된 폴리펩티드를 코딩하는 상기 재조합 폴리펩티드 서열을 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 세포 숙주에 관한 것이다.
또한, 본 발명은
- 본 발명에 따른 1종 (이상의) 재조합 뉴클레오티드 서열(들)이 식물 세포의 게놈 내에 통합되도록 식물 세포를 형질전환시키는 단계,
- 적합한 경우, 상기 형질전환된 세포로부터 형질전환된 식물을 생성시키는 단계,
- 상기 세포 또는 상기 형질전환된 식물에서 생성된 재조합 HGL 및(또는) 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 재조합 HGL로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드(들)을 특히 추출에 의해, 적합한 경우 추출 후 정제에 의해 회수하는 단계
로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 활성 효소 형태의 재조합 HGL 및(또는) 상기 방법에 의해 재조합 HGL로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드(들)의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 도 4에 도시한 서열을 포함하는 상기 재조합 서열을 사용하여 상기 재조합 DGL 및(또는) 그의 유도된 폴리펩티드의 제조에서 기술한 방법의 수행으로 재조합 HGL을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법의 실시에서 수득될 수 있는 재조합 HGL로부터 유도된 폴리펩티드로는 다음의 폴리펩티드를 언급할 수 있다:
- 도 5의 위치 74 내지 398의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 (Δ54HGL),
- 도 5의 위치 24 내지 398의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 (Δ4HGL).
본 발명은 보다 구체적으로는,
- 적합한 배양 배지 상에 상기 재조합 뉴클레오티드 서열 pSP-HGLSP-HGL 및(또는) pSP-HPLSP-HGL 및(또는) pSP-RGLSP-HGL을 포함하는 상기 플라스미드에 의해 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스의 균주와 함께 위치시킴으로써 식물의 잎의 외식편 세포를 형질전환시키는 단계,
- 카나마이신을 포함하는 배지 상에서 형질전환된 외식편의 선별 단계,
- 적합한 배지 상에서 상기 형질전환된 외식편의 배양에 의해 상기 외식편으로부터 형질전환된 식물의 생성 단계,
- 적합한 완충액 중에서 상기 형질전환된 식물의 잎 및(또는) 종자 및(또는) 과실의 분쇄, 원심분리 및 효소 활성을 갖는 식물 추출물을 구성하는 상등액의 회수에 의한 재조합 HGL, 및 적합한 경우 폴리펩티드 (Δ54HGL) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4HGL)의 추출 단계,
- 적합한 경우, 상기 단계 동안에 수득된 추출물로부터, 특히 상등액에 대해 크로마토그래피를 실시하여 재조합 HGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54HGL) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4HGL)을 정제하여 재조합 HGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54HGL) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4HGL)을 본질적으로 순수한 형태로 제조하는 단계
로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 재조합 HGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54HGL) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4HGL)의 상기 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따라 안정적인 방식으로 그의 게놈 내에 통합된 상기 1종 (이상의) 재조합 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 식물 또는 식물의 일부, 특히, 잎, 및(또는) 과실, 및(또는) 종자에 관한 것이다.
본 발명은 효소 활성, 특히 하기 정의되는 리파제 활성을 갖고 활성 효소로서 재조합 HGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54HGL) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4HGL)와 같은 본 발명에 따른 1종 (이상의) 재조합 폴리펩티드(들)을 포함하는, 상기 본 발명 방법의 실시에 의해 제조되는 식물 추출물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 상기 방법 중의 하나에 따라 서열 pSP-HGLSP-HGL 및(또는) pSP-HPLSP-HGL 및(또는) pSP-RGLSP-DGL을 사용한 식물의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된, 재조합 HGL 및(또는) 폴리펩티드 (Δ54HGL) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4HGL)를 포함하는 식물의 잎 및(또는) 종자의 추출물, 특히
- 상기 방법에 따라 서열 pSP-HGLSP-HGL 및(또는) pSP-HPLSP-HGL 및(또는) pSP-RGLSP-HGL을 사용한 담배 잎의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된 담배 잎 또는 종자의 추출물로서 폴리펩티드 (Δ54HGL)를 폴리펩티드 (Δ4HGL)와 함께 포함하고, 폴리펩티드 (Δ54)와 폴리펩티드 (Δ4)의 혼합물의 중량%가 추출물 내에 존재하는 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1% 내지 약 20%이고 추출물의 효소 활성이 약 100 U/g (FW) 내지 약 300 U/g (FW)인 담배 잎 또는 종자의 추출물,
- 상기 방법에 따라 서열 pSP-RGLSP-HGL을 사용한 담배 잎의 외식편 세포의 형질전환에 의해 수득된 담배 잎의 추출물로서 폴리펩티드 (Δ4HGL)를 추출물 내에 존재하는 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1% 내지 약 20 중량% 포함하고 추출물의 효소 활성이 약 100 U/g (FW) 내지 약 300 U/g (FW)인 담배 잎의 추출물.
또한, 본 발명은 상기 효소 추출물에 대해 수행되는 크로마토그래피에 의한 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 정제 단계를 포함하는 상기 본 발명의 방법 중의 하나의 수행함으로써 본질적으로 순수 형태로 수득되는, 도 2에 도시한 아미노산 서열의 효소 활성 재조합 DGL, 또는 이로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 효소 추출물에 대해 수행되는 크로마토그래피에 의한 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 정제 단계를 포함하는 상기 본 발명의 방법 중의 하나의 수행함으로써 본질적으로 순수 형태로 수득되는, 도 5에 도시한 아미노산 서열의 효소 활성 재조합 HGL, 또는 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 HGL로부터 유도된, 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드, 특히 폴리펩티드 (Δ54HGL) 및 (Δ4HGL)에 관한 것이다.
재조합 DGL에서 상기한 바와 같이, 본 발명은 또한
- 본 발명에 따른 재조합 HGL 또는 그의 유도된 폴리펩티드에 대해서 지향하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 및 그의 상기한 용도,
- 본 발명에 따른 상기 정의된 효소 활성을 갖는 식물, 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자, 또는 식물 세포 또는 식물 추출물 또는 재조합 HGL 또는 그의 유도된 폴리펩티드를 기재로 한 산업적 목적의 식품 또는 영양 조성물 또는 제약 조성물,
- 본 발명에 따른 재조합 HGL 또는 그의 유도된 폴리펩티드, 또는 상기 정의된 효소 활성을 갖는 식물, 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자, 및(또는) 식물 세포 또는 식물 추출물로부터 실시되는 효소에 의한 생체 물질 전환 반응 또는 생체 촉매 작용, 또는 생체 연료 제제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 재조합 뉴클레오티드 서열 및 재조합 폴리펩티드를 생성시키는 형질전환된 식물의 제조 및 생체연료의 제조 방법은 하기 상세한 설명에서 예시될 것이다.
1. 개의 위장 리파제의 재조합 단백질을 코딩하고 가지과의 잎 및 종자에서 발현되는 키메라 유전자의 제작
I-A) 재조합 DGL을 코딩하고 담배에서 발현되는 키메라 유전자의 제작
개의 위장 리파제 (DGL)를 코딩하는 유전자의 담배 잎 및 종자에서의 발현은 하기의 조절 서열을 요구한다.
1. CaMV (꽃양배추 모자이크 바이러스)의 이중 구조 프로모터 35S (pd35S).
이는 전사를 활성화하는 서열의 이중체에 상응하고, 천연 프로모터 35S의 TATA 성분의 상류에 놓인다(케이 (Kay) 등 1987).
2. 꽃양배추 모자이크 바이러스의 서열의 전사체 35S를 생산하는 이중 가닥 환상 DNA의 3' 비코딩 영역에 대응하는 말단 전사 서열인 터미네이터 폴리A 35S (프랭크(Fanck) 등, 1980).
재조합 DNA 기술을 이용한 다양한 플라스미드의 제작은 pBIOC4로부터 유도된다(샘브룩 (Sambrook) 등, 1989). 이원 플라스미드는 pGA492 (앤 (An) 등, 1986)로부터 유도되고, 그의 수송 DNA 상에 아그로박테리움 투메파시엔의 플라스미드 pTiT37로부터 기원하는 하기 서열을 우측과 좌측 경계면 간에 함유한다:
노팔린 합성효소를 코딩하는 nos 유전자의 구조 프로모터 (데픽커 (Depicker) 등, 1982); 개시 코돈이 메티오닌 ATG인 첫번째 8개 코돈의 영역으로부터 결실되고 nos 유전자를 코딩하는 서열의 첫번째 14개 코돈의 서열에 융합되는(데픽커 등 (1982)) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(버그 앤드 버그 (Berg Berg), 1983)를 코딩하는 nptII 유전자를 코딩하는 서열 ; 첫번째 14개 코돈이 없는 nos 유전자를 코딩하는 서열; nos 터미네이터의 영역(데픽커 등, 1982); 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 cat의 유전자에 선행하는 다중 클로닝 부위 (또는 폴리링커라 명명) (HindIII-XbaI-SacI-HpaI-KpnI-ClaI-BglII) 영역 및 아그로박테리움 투메파시엔의 플라스미드 pTiA6의 유전자 6의 말단 서열 (리우 (Liu) 등, 1993). 실질적으로 cat의 유전자를 코딩하는 모든 서열을 제거하기 위하여, 플라스미드 pGA492를 SacI(폴리링커의 제한 부위)와 ScaI (cat 유전자의 서열 중 존재하는 제한 부위)에 의해 2회 소화시킨 후, 제조사의 지침에 따라 효소 T4 DNA 폴리머라제(뉴 잉글랜드 바이오랩스사)를 작용시켰다. 변형된 플라스미드 20 ng의 라이게이션은 14℃에서 16시간 동안 1 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제(ligase) × 10 (애머샴사), 2.5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)을 함유하는 반응 매질 10 ㎕에서 수행하였다. 미리 컴피턴트(compotent) 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한 (Hanahan) (1983)). 12 ㎍/㎖의 테트라사이클린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하고(비른보임 (Birnboim) 및 돌리 (Doly), 1979), 제한효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 인산화된 HindIII-EcoRI 어댑터 (스트라트젠 클로닝 시스템)를 사용하여 보유된 클론의 플라스미드 DNA의 HindIII 제한 부위를 EcoRI 제한 부위로 변형시켰다. 이 변형을 수행하기 위하여, 보유된 클론의 플라스미드 DNA 500 ng을 HindIII에 의해 소화시키고, 제조사의 지침에 따라 송아지 장의 알칼리성 포스파타제 효소(베링거 만하임)에 의해 탈인산화시키고, 1500 ng의 HindIII-EcoRI DNA 어댑터, 1/10 부피의 3M 아세테이트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5배 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 공침전시켰다. 12000 g에서 30분 동안 원심분리한 후, 침전된 DNA를 70% 에탄올로 세척하고, 건조시키고, 8 ㎕의 물에 담그고, 65℃에서 10분 동안 보관한 후, 1 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴) 및 2.5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)의 존재 하에 14℃에서 16시간 동안 라이게이션하였다. 65℃에서 10분동안 T4 DNA 리가제를 불활성화한 후, 라이게이션 반응 혼합물을 EcoRI에 의해 소화시키고, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출 (샘브룩 등 , 1989)하고, 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 침전시키고, 12000 g에서 30분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시킨 후, 상기와 같이 라이게이션하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 12 ㎍/㎖의 테트라사이클린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고(비른보임 및 돌리, 1979), HindIII 및 EcoRI에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 이와같이 생성된, cat 유전자를 코딩하는 서열의 마지막 9개 코돈만을 갖고 특유의 EcoRI 부위를 갖는 이원 플라스미드를 pBIOC4로 명명하였다.
프로모터 pd35S 및 터미네이터 폴리A 35S로 이루어진 발현 카셋트를 플라스미드 pJIT163Δ를 사용하여 단리하였다. 플라스미드 pJIT163Δ는 그 자체가 플라스미드 pJIT60 (구에리노 (Guerineau) 및 물리노(Mullineaux), 1993)으로부터 유도된 플라스미드 pJIT163으로부터 유도된다. 플라스미드 pJIT163은 폴리링커의 HindIII와 SalI 부위 간에 ATG 코돈을 소유한다. ATG를 억제하고 플라스미드 pJIT163Δ을 수득하기 위하여, 플라스미드 pJIT163 DNA를 HindIII 및 SalI에 의해 두번 소화하고, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출 (샘브룩, 1989)하고, 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 침전시키고, 12000 g에서 30분 동안 원심분리한 후, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시키고, 제조사의 지침에 따라 클레노우 효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스사)로 작용시키고, 1 부피의 페놀:클로로포름:이소아밀알콜 (25:24:1), 이어서 1부피의 클로로포름:이소아밀알콜 (24:1)로 추출하여 단백질을 제거하고, -80℃에서 30분 동안 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 침전시키고, 12000 g에서 30분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시키고, 최종적으로 1 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10(애머샴) 및 2.5 U의 효소 T4 DNA 리가제(애머샴)의 존재 하에 14℃에서 16시간 동안 라이게이션하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다 (하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고(비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 프로모터 pd35S 및 터미네이터 폴리A 35S로 이루어진 발현 카셋트(SacI-XhoI 단편)를 단리하기 위하여, 보유된 클론 PJIT163Δ의 플라스미드 DNA를 SacI 및 XhoI로 소화시켰다. 발현 카셋트를 갖는 SacI-XhoI 단편을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출 (샘브룩, 1989)하고, 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 침전시키고, 12000g에서 30분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시킨 후, 제조사의 지침에 따라 멍 빈(Mung Bean) 뉴클레아제 효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스사)로 작용시켰다. 이 정제된 삽입물 200 ng을, EcoRI에 의해 소화되고 효소 멍 빈 뉴클레아제에 의해 처리되고 제조사의 지침에 따라 송아지 장의 알칼리 포스파타제 효소 (베링거 만하임)에 의해 탈인산화된 pBIOC4의 플라스미드 DNA 20 ng 내로 클로닝하였다. 이 라이게이션 반응을 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴), 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌글리콜 8000 및 5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)의 존재 하에 20 ㎕ 중에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 12 ㎕/㎖의 테트라사이클린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고(비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 플라스미드를 pBIOC21로 명명하였다.
개의 위장 리파제 (DGL)은 천연적으로 전구체 형태로 합성된다. 성숙 DGL 단백질은 379개의 아미노산으로 이루어진다. DGL의 상보성 DNA를 발현 벡터 pRU303의 BglII 및 SalI 부위에 클로닝하여 국제 출원 공개 제WO94/13816호에 기재된 벡터 pDGL5.303를 생성시켰다. 이를 사용하여 PS-DGL를 함유하는 이원 플라스미드 pBIOC25 및 PPS-DGL을 함유하는 pBIOC26을 제작하고, 여기서 각각 식물 기원의 신호 펩티드 (PS) 또는 프리프로펩티드 (PPS, 즉 N-말단 액포 지향성 서열이 신호 펩티드 다음에 존재함)를 코딩하는 서열이 성숙 DGL을 코딩하는 서열에 우선한다. 각각 23개 및 37개의 아미노산으로 이루어진 PS 및 PPS 서열은 고구마의 괴근의 저장 단백질인 스포라민 A의 서열이다(무라카미(Murakami) 등, 1986; 마쯔코아(Matsukoa) 및 나까무라(Nakamura), 1991).
성숙 DGL의 서열과 지향성 신호 PS 또는 PPS의 서열 간의 융합을 쉽게 하기 위하여, 2-올리고데옥시뉴클레오티드, 5' caggagatcTTG TTT GGA AAG CTT CAT CCC 3' (플라스미드 내에 BglII 부위를 함유하고 보충적인 HindIII 부위를 제공함) 및 5' CAT ATT CCTCAG CTGGGT ATC 3' (플라스미드 내에 특유한 PvuII부위를 함유)를 사용하여 PCR에 의한 변이에 의한 성숙 DGL 서열의 4번째 및 5번째 코돈 내로 보충 HindIII 제한 부위를 도입함으로써 변형시켰다. PCR에 의한 BglIII-PvuII 단편의 증폭을 10 ㎕의 완충 taq DNA 폴리머라제 × 10 (500 mM KCl, 100 mM 트리스 HCl, pH 9.0 및 1% 트리톤 × 100), 6 ㎕의 25 mM MgCl2, 3 ㎕의 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP), 100 pM의 각각의 2-올리고데옥시뉴클레오티드, 5 ng의 매트릭스 DNA (DGL의 상보성 DNA를 포함하는 발현 벡터 pRU303), 2.5 U의 Taq DNA 폴리머라제 (프로메가) 및 2 방울의 바셀린 오일을 함유하는 반응 매질 100 ㎕에서 수행하였다. DNA를 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 1분의 변성, 50℃에서 1분의 혼성화를 각각 30회 수행한 후, 72℃에서 신장 반응을 5분 동안 수행하였다. 이 PCR 반응을 페르킨 엘머 세투스(PERKIN ELMER CETUS)의 DNA 열 순환기에서 수행하였다. 클로로포름을 사용하여 추출하고 오일을 제거하였다. 반응 매질에 함유된 DNA 단편을 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 침전시키고, 12000g에서 30분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시키고, 2개의 제한 효소 BglII 및 PvuII에 의해 소화시켰다. PCR에서 기원된 소화된 DNA 단편을 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제하고, 전기용출 (샘브룩, 1989)하고, 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 침전시키고, 12000g에서 30분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시킨 후, BglII 및 PvuII로 두번 소화되고 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제되고 전기용출되고 알콜 중에서 침전되고 건조되고 제조사의 지침에 따라 송아지 장의 알칼리 포스파타제 효소(베링거 만하임)에 의해 탈인산화된 벡터 pSGL5.303의 플라스미드 DNA로 라이게이션하였다. 라이게이션은 탈인산화된 벡터 100 ng 및 PCR 증폭으로부터 기원된 소화된 DNA 단편 50 ng을 사용하여 1 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴) 및 2.5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 상기 반응 매질에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다 (하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 보유된 클론의 일부 플라스미드 DNA를 파르마시아사에 의해 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 방법(생거 등, 1977)에 의해 서열분석함으로써 확인하였다. HindIII 제한 부위의 도입은 DGL의 유전 코드를 변형시키지 않는다. 실제로, 천연 DGL 서열 AAA TTA (Lys-Leu)는 AAG CTT (Lys-Leu)이 된다. 생성된 플라스미드를pBIOC22라 명명하고, 하기 상응하는 성숙 DGL 단백질의 서열을 포함한다.
LEU: 성숙 DGL의 제1 코돈, AMB: 정지 코돈
a. PS-DGL을 함유하는 이원 플라스미드 pBIOC25의 제작
성숙 DGL 단백질의 폴리펩티드 Leu-Phe-Gly-Lys (첫번째 4개의 아미노산)을 코딩하는 서열을 억제하기 위하여, 플라스미드 pBIOC22를 BglII에 의해 전반적으로, HindIII에 의해 부분적으로 소화시켰다. 이 서열을 성숙 DGL 단백질 (성숙한 SGL의 PS-첫번째 4개의 코돈)을 코딩하는 서열의 첫번째 4개의 코돈으로 융합되는 23개의 아미노산(ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC)의 신호 펩티드 PS를 코딩하는 서열로 치환하였다. 서열 성숙 DGL의 PS-첫번째 4개의 코돈을 상기 기재된 PCR 증폭 프로토콜에 따라 플라스미드 pMAT103을 사용하여(마쯔오까 및 나까무라, 1991), 2개의 올리고데옥시뉴클레오티드 5' caggagatctgATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' 및 5' G ATGAAG CTTTCC AAA CAA GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G 3'을 보조로 하여 PCR에 의해 증폭시켰다. BGlII 및 HindIII에 의한 이중 효소 분해 후, PCR 증폭으로부터 기원된 DNA 단편을 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동에 의해 정제하고, 전기용출 (샘브룩크, 1989)하고, 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 침전시키고, 12000g에서 30분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시킨 후, BglII 및 HindIII로 미리 소화되고 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제되고 전기용출 (샘브룩크, 1989)되고 알콜로 침전되고 건조되고 제조사의 지침에 따라 송아지 장의 알칼리 포스파타제 효소(베링거 만하임)에 의해 탈인산화된 pBIOC22의 플라스미드 DNA로 라이게이션하였다. 라이게이션은 상기 탈인산화된 벡터 100 ng 및 PCR 증폭으로부터 기원된 소화된 DNA 단편 50 ng을 사용하여 1 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴) 및 2.5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 보유된 클론의 일부 플라스미드 DNA를 파마시아사에 의해 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 방법(생거 등, 1977)에 의해 서열분석함으로써 확인하였다. PS 및 성숙 DGL의 서열을 클로닝하고, 이들의 오픈 리딩 프리엠(open reading frame)을 유지하였다. PS와 성숙 DGL 서열 간의 절단 서열은 Ser-Leu이다. 생성된 플라스미드를pBIOC23이라 명명하였다. pBIOC23으로부터 출발하여, PS-DGL 서열을 갖는 BglII-XbaI 단편을 BglII 및 XbaI에 의한 이중 효소 분해에 의해 단리하고, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출 (샘브룩크, 1989)하고, 알콜로 침전시키고, 건조시켰다. 이 DNA 단편을, 제조사의 지침에 따라 클레노우 효소로 처리되고 HindIII 부위가 소화되고 클레노우로 처리되고 송아지 장의 알칼리 포스파타제 효소에 의해 탈인산화된 pBIOC21의 플라스미드 DNA에 라이게이션시켰다. 라이게이션은 상기 탈인산화된 벡터 20 ng 및 PS-DGL을 함유하는 DNA 단편 200 ng을 사용하여 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴), 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌글리콜 8000 및 5U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 12 ㎍/㎖의 테트라사이클린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고(비른보임 및 돌리, 1979), 제한효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 클론을pBIOC25로 명명하였다. 재조합 단백질 PS-DGL을 코딩하는 단편의 뉴클레오티드 서열을 파마시아사에 의해 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 방법(생거 등, 1977)에 의해 서열분석함으로써 확인하였다. 이원 벡터 pBIOC25의 플라스미드 DNA를 홀스터 등 (1978)의 방법에 따라 아그로박테리움 투레파시엔의 균주 LBA4404내로 직접 형질전환에 의해 도입하였다. 보유된 클론의 유효성을 도입된 플라스미드 DNA의 효소 분해에 의해 확인하였다.
b. PPS-DGL을 함유하는 이원 플라스미드 pBIOC26의 제작
성숙 DGL 단백질의 폴리펩티드 Leu-Phe-Gly-Lys을 코딩하는 서열을 억제하기 위하여, 플라스미드 pBIOC22를 BglII에 의해 전체적으로, HindIII에 의해 부분적으로 소화시켰다. 이 서열은 성숙 DGL 단백질의 첫번째 4개의 코돈(성숙 DGL의 PPS-첫번째 4개의 코돈)의 서열에 융합되는 37개의 아미노산(ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC AGG TTC AAT CCC ATC CGC CTC CCC ACC ACA CAC GAA CCC GCC)의 신호 펩티드 PPS를 코딩하는 서열에 의해 치환되었다. 이 서열 성숙 DGL의 PPS-첫번째 4개의 코돈을 2개의 올리고데옥시뉴클레오티드 5' caggagatctgATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' 및 5' G ATGAAG CTTTCC AAA CAA GGC GGG TTC GTG TGT GGT TG 3'의 도움으로 상기 PCR 증폭 프로토콜에 따라 플라스미드 pMAT103 (마쯔오까 및 나까무라, 1991)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. BGlII 및 HindIII에 의한 이중 효소 분해 후, PCR 증폭으로부터 기원된 DNA 단편을 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고(샘브룩 등, 1989), 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 침전시키고, 12000g에서 30분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시킨 후, BglII 및 HindIII로 이중 소화되고 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제되고 전기용출되고 알콜로 침전되고 건조되고 제조사의 지침에 따라 소아지 장의 알칼리 포스파타제 효소(베링거 만하임)에 의해 탈인산화된 pBIOC22의 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 라이게이션은 탈인산화된 벡터 100 ng 및 PCR 증폭으로부터 기원된 50 ng의 소화된 DNA 단편을 사용하여 1 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴) 및 2.5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 상기 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고(비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다.
보유된 클론의 일부 플라스미드 DNA를 파마시아사에 의해 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 방법(생거 등, 1977)에 의해 서열분석함으로써 확인하였다. PPS 및 성숙 DGL의 서열을 클로닝하고, 이들의 오픈 리딩 프리엠을 유지하였다. 두개의 서열간의 절단 서열은 Ala-Leu이다. 생성된 플라스미드를pBIOC24로 명명하였다. pBIOC24로부터 출발하여 PPS-DGL 서열을 갖는 BglII-XbaI 단편을 BglII 및 XbaI에 의한 이중 효소 분해에 의해 단리하고, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고(샘브룩크, 1989), 알콜로 침전시키고, 건조시켰다. 이 DNA 단편을, 제조사의 지침에 따라 클레노우 효소로 처리하고, HindIII 부위에서 소화되고 클레노우로 처리되고 송아지 장의 알칼리 포스파타제 효소(베링거 만하임)로 탈인산화된 pBIOC21의 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 탈인산화된 벡터 20 ng 및 PPS-DGL을 함유하는 DNA 단편 200 ng을 사용하여 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴) 및 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌글리콜 8000 및 5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다 (하나한, 1983). 12 ㎍/㎖의 테트라사이클린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 클론을pBIOC26으로 명명하였다. 재조합 단백질 PPS-DGL을 코딩하는 단편의 뉴클레오티드 서열을 파마시아사에 의해 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 방법(생거 등, 1977)에 의해 서열분석함으로써 확인하였다. 이원 벡터 pBIOC26의 플라스미드 DNA를 홀스터 등의 방법에 따라 (1978) 아그로박테리움 투메파시엔의 균주 LBA4404로 직접 형질전환하여 도입하였다. 수득된 클론의 유효성은 도입된 플라스미드 DNA의 효소 분해에 의해 확인되었다.
c. RGLSP-DGL 함유 이원 플라스미드 pBIOC41의 제작
토끼 위장 리파제는 NH2-말단에 위치하고 성숙한 리파제의 폴리펩티드 서열에 선행하는 22개의 아미노산의 신호 펩티드로 이루어진 전구체 형태로 합성된다. 토끼의 위장 리파제를 코딩하는 완전 cDNA 함유 클론 pJO101은 Institut de Recherche Jouveinal에 의해 1992년 12월 11에 출원된 유럽 특허 출원 제92 403 055.4호에 발명의 명칭 토끼 위장 리파제를 코딩하는 핵산 및 폴리펩티드 유도체, 이 폴리펩티드의 생산을 위한 용도 및 이를 기재로 한 제약 조성물에 기록되어 있다.
개의 위장 리파제의 폴리펩티드 서열의 배열 및 토끼의 위장 리파제의 전구체의 폴리펩티드 서열의 배열은 서열 LFGK가 두개의 단백질에 존재함을 입증하였다. 정제된 천연 단백질로부터 측정된 토끼 리파제의 폴리펩티드 서열에서, 첫번째 3개의 잔기 L, F 및 G는 없고, RGL의 22개의 아미노산의 신호 펩티드의 일부를 형성한다. 그 결과, 이 공통적인 3개의 아미노산이 없는 토끼의 위장 리파제의 신호 펩티드를 개의 위장 리파제의 성숙한 단백질 서열에 융합시켰다. 폴리펩티드 서열은 19개의 아미노산 MWVLFMVAALLSALGTTHG로 이루어진다.
성숙 DGL 단백질의 폴리펩티드 Leu-Phe-Gly-Lys (첫번째 4개의 아미노산)을 코딩하는 서열을 억제하기 위하여, 플라스미드 pBIOC22를 BglII에 의해 전체적으로, HindIII에 의해 부분적으로 소화시켰다. 이 서열은 성숙 DGL 단백질의 첫번째 4개의 코돈 (성숙 DGL의 RGLSP-첫번째 4개의 코돈)의 아미노산에 융합된 19개의 아미노산의 토끼의 위장 리파제의 신호 펩티드 RGLSP (ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT)를 코딩하는 서열로 치환되었다. 상기 PCR 증폭 프로토콜에 따라 2개의 올리고데옥시뉴클레오티드 5' aggagatctcaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG 3' 및 5' G ATGAAG CTTTCC AAA CAA ACC ATG TGT AGT TCC AAG TG 3'의 도움으로 플라스미드 pJO101을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. BGlII 및 HindIII에 의한 이중 효소 분해 후, PCR 증폭으로 기원된 DNA 단편을 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고 (샘브룩크 등, 1989), 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 침전시키고, 12000g에서 30분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시킨 후, BglII 및 HindIII로 이중 소화되고 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제되고 전기용출되고 알콜로 침전되고 건조되고 제조사의 지침에 따라 소아지 장의 알칼리 포스파타제 효소(베링거 만하임)에 의해 탈인산화된 pBIOC22의 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 라이게이션은 상기 탈인산화된 벡터 100 ng 및 PCR 증폭으로부터 기원된 소화된 DNA 단편 50 ng을 사용하여 1 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴) 및 2.5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고(비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 보유된 클론의 일부 플라스미드 DNA를 파마시아사에 의해 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 방법(생거 등, 1977)에 의해 서열분석함으로써 확인하였다. RGLSP 및 성숙 DGL의 서열을 이들의 오픈 리딩 프리엠을 유지하면서 클로닝하였다 (즉 이들은 특유한 오픈 리딩 프레임으로 이루어짐). RGLSP와 성숙 DGL 서열간의 절단 서열은 Gly-Leu이다. 생성된 플라스미드를pBIOC40로 명명하였다. pBIOC40으로부터 출발하여 RGLSPS-DGL 서열을 갖는 BglII-XbaI 단편을 BglII 및 XbaI에 의한 이중 효소 분해에 의해 단리하고, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고 (샘브룩크, 1989), 알콜로 침전시키고, 건조시켰다. 이 DNA 단편을 제조사의 지침에 따라 클레노우 효소로 처리하고, HindIII 부위에서 소화되고 클레노우로 처리되고 송아지 장의 알칼리 포스파타제 효소(베링거 만하임)로 탈인산화된 pBIOC21의 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 상기 탈인산화된 벡터 20 ng 및 RGLSP-DGL을 함유하는 DNA 단편 200 ng을 사용하여 라이게이션을 수행하였다. 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴), 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌글리콜 8000 및 5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 12 ㎍/㎖의 테트라사이클린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 클론을pBIOC41로 명명하였다. 재조합 단백질 RGLSP-DGL을 코딩하는 단편의 뉴클레오티드 서열을 파마시아사에 의해 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 방법(생거 등, 1977)에 의해 서열분석함으로써 확인하였다. 이원 벡터 pBIOC41의 플라스미드 DNA를 홀스터 등의 방법에 따라 (1978) 아그로박테리움 투메파시엔의 균주 LBA4404로 직접 형질전환하여 도입하였다. 보유된 클론의 유효성은 도입된 플라스미드 DNA의 효소 분해에 의해 확인되었다.
I-B) 재조합 DGL을 코딩하고 토마토에서 발현되는 키메라 유전자의 제작
사용된 제작물은 담배의 유전적 형질전환에 사용된 것과 동일한 플라스미드 pBIOC25, pBIOC26 ALC pBIOC41이다.
II. 개의 위장 리파제의 재조합 단백질을 코딩하고 평지씨에서 발현되는 키메라 유전자의 제작
a) 프로모터 pCRU 함유 이원 플라스미드 pBIOC28의 제작
평지씨에서 개의 위장 리파제 (DGL)의 발현은 하기 조절 서열 사이에 DGL을 코딩하는 cDNA의 삽입을 요구하였다.
1. 무우의 종자의 저장 단백질인 CRUCIFERIN A 유전자의 비코딩 영역 5'에 상응하고(데피그니-디스(Depigny-This) 등, 1992), 종자에서 특이적 발현을 가능하게 하는 프로모터 pCRU,
2. 꽃양배추 모자이크 바이러스의 서열의 전사체 35S를 생산하는 이중 가닥 환상 DNA의 3' 비코딩 영역에 대응하는 말단 전사 서열인 터미네이터 폴리A 35S (프랭크(Fanck) 등, 1980).
pBIOC21과 유사하나, 프로모터 pd35S가 프로모터 pCRU에 의해 치환된 이원 플라스미드를 획득하기 위하여, pBI221(데피그니-디스 등, 1992)에 의해 시판됨)로부터 유도된 플라스미드 pBI221-CRURSP를 사용하여 프로모터 pCRU 함유 단편 클레노우-BamHI로 처리된 EcoRI을 단리하였다. 프로모터 pCRU로 프로모터 35S를 치환함으로써, 이 플라스미드 pBI221-CRURSP는 pBI221로부터 유도된다 (클론테크로부터 시판됨).
프로모터 pCRU를 갖는 단편 클레노우-BamHI 처리된 EcoRI을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고 (샘브룩 등, 1989), 알콜로 침전시키고, 건조시킨 후, KpnI로 소화되고 제조사의 지침에 따라 T4 DNA 폴리머라제(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 처리되고 BamHI로 소화되고 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제되고 알콜로 침전되고 건조되고 제조사의 지침에 따라 송아지 장의 알칼리 포스파타제 효소(베링거만하임)에 의해 탈인산화된 pJIT163(상기됨)의 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 이 라이게이션은 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴), 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌글리콜 8000 및 5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 상기 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 플라스미드를pBIOC27로 명명하였다.
프로모터 pCRU 및 터미네이터 폴리A 35S로 이루어진 발현 카셋트를 pBIOC27을 사용하여 XhoI에 의해 전체적으로 소화하고, EcoRI에 의해 부분적으로 소화함으로써 단리하였다. 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고(샘브룩크, 1989), 알콜로 침전시키고, 건조시킨 후, 제조사의 지침에 따라 클레노우 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 처리하고, 제조사의 지침에 따라 송아자 장의 알칼리 포스파타제 효소 (베링거 만하임)에 의해 탈인산화된 pBIOC24의 플라스미드 DNA의 EcoRI 부위에 라이게이션하였다. 이 라이게이션은 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴), 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌글리콜 8000 및 5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 12 ㎍/㎖의 테트라사이클린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 플라스미드를pBIOC28로 명명하였다.
b) PPS-DGL 함유 이원 플라스미드 pBIOC29의 제작
pBIOC24를 사용하여 서열 PPS-DGL을 갖는 BglII-XbaI 단편의 단리는 이미 I-A-b에 기재되어 있다. 이 단편을 클레노우로 처리되고 제조사의 지침에 따라 송아지 장의 알칼리 포스파타제 효소(베링거 만하임)에 의해 탈인산화된 pBIOC28의 플라스미드 DNA의 EcoRI 부위에 라이게이션하였다. 이 라이게이션은 상기 탈인산화된 벡터 20 ng 및 PPS-DGL 함유 BglII-XbaI DNA 단편 200 ng을 사용하여 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴), 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌글리콜 8000 및 5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 12 ㎍/㎖의 테트라사이클린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 플라스미드를pBIOC29로 명명하였다. 재조합 단백질 PPS-DGL의 뉴클레오티드 서열을 파마시아사에 의해 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디디데옥시뉴클레오티드 방법 (생거 등, 1977)에 의해 서열분석함으로써 확인하였다. 이원 벡터 pBIOC29의 플라스미드 DNA를 홀스터 등의 방법에 따라 (1978) 아그로박테리움 투메파시엔의 균주 LBA4404로 직접 형질전환하여 도입하였다. 보유된 클론의 유효성은 도입된 플라스미드 DNA의 효소 분해에 의해 확인되었다.
c) pGEA1D 프로모터 함유 이원 플라스미드 pBIOC90 및 pBIOC91의 제작
평지씨에서 개의 위장 리파제 (DGL)를 코딩하는 동물 유전자의 발현은 하기 조절자 서열을 요구하였다.
1. 아라비돕시스 탈리아나의 종자의 저장 단백질 GEA1의 유전자의 비코딩 영역 5'에 상응하고(가우비어(Gaubier) 등, 1993), 종자에서 특이적 발현을 가능하게 하는 프로모터 pGEA1,
2. 꽃양배추 모자이크 바이러스의 서열의 전사체 35S를 생산하는 이중 가닥 환상 DNA의 3' 비코딩 영역에 대응하는 말단 전사 서열인 터미네이터 폴리A 35S (프랭크(Fanck) 등, 1980).
pBIOC21과 유사하나, 프로모터 pd35S가 프로모터 pGEA1D에 의해 치환된 이원 플라스미드 pBIOC90을 획득하기 위하여, 플라스미드 pGUS2-pGEA1을 사용하여 프로모터 pGEA1을 함유하며 클레노우로 처리된 단편 HindIII-BamHI를 단리하였다. 프로모터 pGEA1에 의해 프로모터 35S를 치환함으로써, pBI221로부터 유도된 클론 pGUS-2-pGEA1은 프레임에 2개의 ATG, 유전자 GEA1 (Em2)의 ATG 및 유전자 gus의 ATG를 함유한다. 유전자 GEA1의 ATG를 파괴하였다. SalI 부위와 클론 pGUS-2-pGEA1의 유전자 GEA1의 ATG의 상류 서열 사이에 함유된 DNA 단편을 2개의 올리고뉴클레오티드 5'CAAACGTGTACAATAGCCC 3' 및 5' CCCGGGGATCCTTTTTTG 3'을 사용하여 증폭시켰다. 혼성화 온도를 조절하였다. PCR에 의해 증폭된 단편을 SalI 및 BamHI에 의해 소화시키고, 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고 (샘브룩 등, 1989), 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 침전시키고, 12000g에서 30분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하고, SalI 및 BamHI에 의해 이중 소화되고 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제되고 전기용출되고 알콜로 침전되고 건조된 pGUS-2-GEA1의 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 라이게이션은 벡터 100 ng 및 상기 PCR 증폭으로부터 기원된 소화된 DNA 단편 50 ng을 사용하여 1 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴) 및 2.5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다 (하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 보유된 특정 클론을 파마시아사에 의해 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디디데옥시뉴클레오티드 방법 (생거 등, 1977)에 의해 서열분석함으로써 확인하였다. 생성된 클론을pGUS-2-pGEA1D로 명명하였다.
pGUS-2-pGEA1D로부터 단리되고 제조사 (바이오랩스)의 지침에 따라 클레노우로 처리된 pGEA1D를 갖는 HindIII-BamHI 단편을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고 (샘브룩크, 1989), 알콜로 침전시키고, 건조시키고, 제조사의 지침에 따라 T4 DNA 폴리머라제 (바이오랩스)로 처리된 pBIOC21의 플라스미드 DNA의 KpnI 및 HindIII 부위에 라이게이션하였다. 이 라이게이션은 탈인산화된 pBIOC21 20 ng 및 상기 XhoI-EcoRI DNA 단편 200 ng을 사용하여 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴), 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌글리콜 8000 및 5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다 (하나한, 1983). 12 ㎍/㎖의 테트라사이클린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고(비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 플라스미드를pBIOC90로 명명하였다.
이원 플라스미드 pBIOC91을 얻기 위하여, 통상의 클로닝 방법에 따라 에드워드(Edwards G.A., 1990)에 의한 제작된 pSCV1의 HindIII 부위에 프롬 등 (1986)에 의해 기술된 발현 카셋트 p35S-nptII-tNOS를 갖는 HindIII 단편을 클로닝하여 얻은 이원 플라스미드 pSCV1.2 내에 pBSII-pGEA1D로부터 단리된 발현 카셋트 pGEA1D-tNOS를 도입하였다.
플라스미드 pBSII-pGEA1D는 두단계로 제조하였다.
- 한편으로는, 제조사의 지침에 따라 효소 T4 DNA 폴리머라제 (바이오랩스)로 처리되고 정제된 아그로박테리움 투메파시엔의 tNOS (노팔린 합성 효소 유전자의 터미네이터)를 갖는 SacI-EcoRI 단편을 제조사의 지침에 따라 송아지 장의 알칼리 포스파타제 효소 (베링거 만하임)에 의해 탈인산화된 pBSIISK+(스트라타겐)의 EcoRV 부위에 클로닝하였다. 라이게이션은 탈인산화된 벡터 20 ng 및 tNOS를 함유하는 DNA 단편 200 ng을 사용하여 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴), 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌글리콜 8000 및 5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고(비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 보유된 특정 클론을 파마시아사에서 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 방법 (생거 등, 1977)에 의해 서열분석하여 확인하였다. 생성된 플라스미드를pBSII-tNOS로 명명하였다.
- 다른 한편, HindIII에 의해 이중 소화되고 효소 클레노우 및 BamHI으로 처리되고 정제된 pGEA1D를 갖는 단편을 플라스미드 pBSII-tNOS의 클레노우로 처리된 XbaI 및 BamHI 부위에 클로닝하였다. 라이게이션은 상기 벡터 100 ng 및 상기 DNA 단편 50 ng을 사용하여 1 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴) 및 2.5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다(하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고(비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 플라스미드를pBSII-pGEA1D로 명명하였다.
이어서, 클레노우로 처리된 XbaI-HindIII 단편에 의해 운반되는 발현 카셋트 pGEA1D-tNOS를 제조사의 지침에 따라 송아지 장의 알칼리 포스파타제 효소에 의해 탈인산화된 pSCV1.2의 SmaI 부위에 클로닝하였다. 라이게이션은 탈인산화된 pSCV1.2 20 ng 및 발현 카셋트 pGEA1D-tNOS를 갖는 단편 200 ng을 사용하여 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴), 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌 글리콜 8000 및 5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다 (하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 플라스미드를pBIOC91로 명명하였다.
d) pGEA6D 프로모터 함유 이원 플라스미드 pBIOC92의 제작
평지씨에서 개의 위장 리파제 (DGL)를 코딩하는 동물 유전자의 발현은 하기 조절 서열을 요구하였다.
1. 아라비돕시스 탈리아나의 종자의 저장 단백질 GEA6의 유전자의 비코딩 영역 5'에 상응하고(가우비어(Gaubier) 등, 1993), 종자에서 특이적 발현을 가능하게 하는 프로모터 pGEA6,
2. 꽃양배추 모자이크 바이러스의 서열의 전사체 35S를 생산하는 이중 가닥 환상 DNA의 3' 비코딩 영역에 대응하는 말단 전사 서열인 터미네이터 폴리A 35S (프랭크(Fanck) 등, 1980).
pBIOC92와 유사하지만 프로모터 pd35S가 프로모터 pGEA6D에 의해 치환된 이원 플라스미드를 획득하기 위하여, 플라스미드 pGUS2-pGEA6을 사용하여 pGEA6를 함유하며 클레노우로 처리된 단편 EcoRI-BamHI을 단리하였다. pUC18로부터 유도된 클론 pGUS-2-pGEA6은 2개의 ATG, 즉 유전자 GEA6 (Em6)의 ATG 및 유전자 gus의 ATG를 함유한다. 유전자 GEA6의 ATG를 파괴하였다. AccI 부위와 클론 pGUS-2-pGEA6의 유전자 GEA6의 ATG의 상류 서열 간에 함유된 DNA 단편을 2개의 올리고뉴클레오티드 5' AAGTACGGCCACTACCACG 3' 및 5' CCCGGGGATCCTGGCTC 3'을 사용하여 증폭시켰다. 혼성화 온도를 조절하였다.
PCR에 의해 증폭된 단편을 AccI 및 BamHI에 의해 소화시키고, 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고 (샘브룩 등, 1989), 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 2.5 부피의 무수 에탄올의 존재 하에 -80℃에서 30분 동안 침전시키고, 12000g에서 30분 동안 원심분리하고, 70% 에탄올로 세척하고, 건조시킨 후, AccI 및 BamHI에 의해 이중 소화되고 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제되고 전기용출되고 알콜로 침전되고 건조된 pGUS-2-GEA6의 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 라이게이션은 상기 벡터 100 ng 및 상기 PCR 증폭으로부터 기원된 소화된 DNA 단편 50 ng을 사용하여 1 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴) 및 2.5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다 (하나한, 1983). 50 ㎍/㎖의 암피실린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 보유된 특정 클론을 파마시아사에 의해 시판되는 T7 (등록상표) 서열분석 키트를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 방법 (생거 등, 1977)에 의해 서열분석함으로써 확인되었다. 생성된 클론을pGUS-2-pGEA6D로 명명하였다.
pGUS-1-pGEA6D로부터 단리되고 제조사(바이오랩스)의 지침에 따라 클레노우로 처리된 프로모터 pGEA6D를 갖는 EcoRI-BamHI 단편을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고(샘브룩크, 1989), 알콜로 침전시키고, 건조시킨 후, 클레노우 처리된 변형 pBIOC21의 플라스미드 DNA의 XhoI 부위에 라이게이션하였다. 프로모터 pd35S를 갖는 단편을 결실시키고, 그 대신에 pBSIISK+의 KpnI-XhoI-SalI-ClaL-HindIII-BamHI-SmaI-EcoRI-EcoRV 부위의 폴리링커를 갖는 KpnI-EcoRV 단편으로 치환하기 위하여, 클레노우 및 KpnI로 처리된 HindIII에 의한 pBIOC21의 이중 소화에 의해 변형 플라스미드 pBIOC21을 얻었다.
라이게이션은 탈인산화된 pBIOC21 20 ng 및 EcoRI-BamHI DNA 단편 200 ng을 사용하여 2 ㎕의 완충 T4 DNA 리가제 × 10 (애머샴), 2 ㎕의 50% 폴리에틸렌글리콜 8000 및 5 U의 효소 T4 DNA 리가제 (애머샴)가 존재하는 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 수행하였다. 미리 컴피턴트 처리된 세균 에셔리키아 콜리 DH5α를 형질전환시켰다 (하나한, 1983). 12 ㎍/㎖의 테트라사이클린 상에서 선별된 수득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법에 의해 추출하고 (비른보임 및 돌리, 1979), 제한 효소에 의한 효소 분해에 의해 분석하였다. 생성된 플라스미드를pBIOC92로 명명하였다.
e) RGLSP-DGL 함유 이원 플라스미드 pBIOC93, pBIOC94, pBIOC95, pBIOC96 및 pBIOC97의 제작
플라스미드 pBIOC40은 상기와 같다. 이 플라스미드는 서열 RGLSP-DGL을 갖는 단편 BglII-XbaI를 함유한다.
이 단편을 BglII 및 XbaI에 의한 이중 효소 분해에 의해 단리하고, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고, 알콜로 침전시키고, 건조시키고, 클레노우로 처리한 후, 클레노우로 처리된 EcoRI에 의해 소화되고 탈인산화된 pBIOC28(상기됨)에, 클레노우로 처리된 EcoRI에 의해 소화되고 탈인산화된 pBIOC90에, SmaI에 의해 소화되고 탈인산화된 pBIOC91에, 클레노우로 처리된 HindIII에 의해 소화되고 탈인산화된 pBIOC92에 각각 라이게이션하여 pBIOC93, pBIOC94, pBIOC95 및 pBIOC96을 각각 생산하였다.
플라스미드 pBIOC97은 발현 카셋트 pGEA6D-RGLSP-DGL-t35S를 갖는 단편 KpnI-EcoRV를 효소 T4 DNA 폴리머라제에 의해 처리하고, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하고, 전기용출하고, 알콜로 침전시키고, 건조시킨 후, SmaI에 의해 소화되고 탈인산화된 pSCV1.2에 라이게이션하여 클로닝함으로써 생성된다. 상기 발현 카셋트 pGEA6D-RGLSP-DGL-t35S는 pBIOC92로부터 기원된다.
III. 인간 위장 리파제의 재조합 단백질을 코딩하며, 예를 들어 담배잎 및 담배종자에서 컨스티튜티브(constitutive) 발현을 가능하게 하는 키메라 유전자의 제작.
a) 키메라 프로모터인 수퍼-프로모터 (SUPER-PROMOTER) pSP를 포함하는 이원 플라스미드 pBIOC82의 제작.
인간 위장 리파제 (HGL)를 코딩하는 유전자를 담배잎에서 발현시키기 위해서 하기의 조절 서열이 필요하였다:
1. 키메라 프로모터인 수퍼-프로모터 (pSP; PCT/US94/12946). 상기 프로모터는 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토핀 합성효소 유전자 프로모터의 세 가지 전사 활성인자 성분, 아그로박테리움 투메파시엔스의 만노핀 합성효소 유전자 프로모터의 전사 활성인자 성분 및 만노핀 합성효소 프로모터를 융합시킴으로써 구성된다.
2. 꽃양배추 모자이크 바이러스의 서열의 전사체 35S를 생산하는 이중 가닥 환상 DNA의 3' 비코딩 영역에 대응하는 말단 전사 서열인 터미네이터 폴리A 35S (프랭크(Fanck) 등, 1980).
프로모터 pd35S를 프로모터 pSP로 대체한, pBIOC21과 유사한 이원 플라스미드를 수득하기 위하여, 클레노우로 반응시킨, 프로모터 pSP를 포함하는 pvuII-SalI 단편을 플라스미드 pBISNI (PCT/US94/12946)를 사용하여 단리시켰으며, 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제하였고, 전기용출하였으며 (Sambrook 등, 1989), 알콜로 침전시켜 건조시켰으며 KpnI 및 EcoRI으로 이중 절단한, DNA T4 폴리머라제로 처리하고 제조업자의 지시대로 송아지 장의 알칼린 포스파타제 효소 (베링거 만하임)로 탈인산화한 pBIOC81 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. pBIOC81 플라스미드는 삭제된 pBIOC21의 XbaI 위치에 해당한다. 이를 수행하기 위하여, pBIOC21 플라스미드를 XbaI으로 절단하였으며, 이어서 클레노우 효소를 처리하여 T4 DNA 리가제의 작용으로 라이게이션시켰다.
상술한 탈인산화 벡터 20 ng 및 상술한 pSP를 갖는 DNA 단편 200 ng을 사용하여 T4 DNA 리가제의 10배 완충액 2 ㎕ (애머샴), 50% 폴리에틸렌 글리콜 8000 2 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 5 U의 존재하에 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 (Escherichia coli) DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 12 ㎍/ml의 테트라사이클린 상에서 선별하여 획득한 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다. 그 결과물인 플라스미드를 pBIOC82라 명명하였다.
인간 위장 리파제 (HGL)는 Bodmer 등의 1987년도 출판물에 기술되어 있듯이 천연적으로 전구물질의 형태로 합성된다. 성숙 HGL 단백질은 379개의 아미노산으로 구성된다. 상기 단백질의 신호 펩티드 (HGLSP)는 19개의 아미노산으로 이루어진다. HGLSP와 HGL 사이의 제한효소 위치는 Gly-Leu이다.
HGL을 코딩하는 서열 앞에 각각 천연 신호 펩티드 HGLSP, 인간 췌장 리파제의 신호 펩티드 (HPLSP; Giller 등, 1992) 및 토끼 위장 리파제의 신호 펩티드 (RGLSP; 이미 이전에 기술되어 있음; 유럽 특허 출원 제92.403055.4)를 코딩하는 것들이 존재하는, HGLSP-HGL을 포함하는 pBIOC85, HPLSP-HGL을 포함하는 pBIOC87 및 RGLSP-HGL을 포함하는 pBIOC89의 이원 플라스미드를 제작하는 데 HGL 전구물질을 코딩하는 서열을 사용하였다.
HGL의 전구물질을 코딩하는 서열을 PstI 및 DraI으로 이중 분해하여 단리시켰으며, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하였고, 전기용출하였으며 (Sambrook 등, 1989), pH가 4.8인 3 M 소듐 아세테이트 1/10 부피 및 무수 에탄올 2.5 부피 존재하에 -80℃에서 30분 동안 침전시켰고, 12000 g에서 30분 동안 원심분리하였으며, 70% 에탄올로 세척하여 건조시켰다. 이어서, 상기 서열을 스트라타겐 (Stratagene)이 판매하는 pBSIISK＋ 플라스미드의 PstI 및 SpeI 위치에 클로닝하였다 (제조업자의 지시에 따라 T4 DNA 폴리머라제 (바이오랩스) 효소가 작용하게 하였음). 벡터 100 ng 및 상술한 HGL의 전구물질을 코딩하는 서열을 갖는 DNA 단편 50 ng을 사용하여, T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 1 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 2.5 U의 존재하에 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 50 ㎍/ml의 암피실린 상에서 선별하여 획득한 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다. 그 결과물인 플라스미드를 pBIOC83이라 명명하였다.
5' aaactgcaggctcgag TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT GAA GTG ACT ATG 3' (특유한 PstI, XhoI 및 BamHI 위치를 포함함) 및 5' AAT GGT GGT GCC CTG GGA ATG GCC AAC ATA GTG TAG CTG C 3' (특유한 MscI 위치를 pBIOC83 플라스미드 내에 포함함)의 두 가지 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용하여 PCR로 직접 돌연변이 생성(directed mutagenesis)을 실시하여, 이전에 존재하지 않았던 BamHI 위치를 아홉번째 및 열번째 코돈 내에 도입함으로써 성숙 HGL을 코딩하는 서열을 변경하였다.
10배의 Taq DNA 폴리머라제 완충액 10 ㎕ (500 mM KCl, pH가 9.0인 100 mM Tris-HCl 및 1% 트리톤 x100), 25 mM MgCl26 ㎕, 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 3 ㎕, 상술된 두 가지 올리고데옥시-뉴클레오티드 각각 100 pM, 매트릭스 DNA (pBIOC83 벡터) 5 ng, Taq DNA 폴리머라제 (Promega) 2.5 U 및 바셀린유 2 방울을 함유하는 100 ㎕의 반응 매질에서 PstI-MscI 단편을 PCR로 증폭시켰다. DNA를 94℃에서 5분 동안 변성시켰으며, 94℃에서의 변성 1분, 65℃에서의 혼성화 1분 및 72℃에서의 신장 1분으로 각각 구성된 30회의 사이클을 실시하고, 이어서 72℃에서의 신장을 5분 동안 지속하였다. 이 PCR 반응은 퍼킨 엘머 세투스사의 DNA 열 순환기에서 수행하였다. 클로로포름으로 추출함으로써 오일을 제거하였다. 이어서 반응 매질에 포함되어 있는 DNA 단편을 pH가 4.8인 3 M 소듐 아세테이트 1/10 부피, 및 무수 에탄올 2.5 부피 존재하에서 -80℃에서 30분 동안 침전시켰으며, 12000 g에서 30분 동안 원심분리하였고, 70% 에탄올로 세척하였으며, 건조시켜 PstI 및 MscI의 두 가지 제한효소로 절단하였다. PCR 증폭물로부터 유래한 절단된 DNA 단편을 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제하였으며, 전기용출하였고 (Sambrook 등, 1989), pH가 4.8인 3 M 소듐 아세테이트 1/10 부피, 및 무수 에탄올 2.5 부피 존재하에서 -80℃에서 30분 동안 침전시켰으며, 12000 g에서 30분 동안 원심분리하였고, 70% 에탄올로 세척하였으며, 건조시켰고 이어서 PstI 및 MscI으로 두 번 절단하여 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제한, 전기용출하여 알콜로 침전시키고, 건조시킨 pBIOC83 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 벡터 100 ng 및 상술된 PCR 증폭물로부터 유래한 절단된 DNA 단편 50 ng을 사용하여 T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 1 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 2.5 U의 존재하에 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 50 ㎍/ml의 암피실린 상에서 선별하여 획득한 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다. 파마시아사가 판매하는 T7 (등록상표) 염기서열 결정 키트를 사용, 디데옥시뉴클레오티드 방법 (Sanger 등, 1977)으로 염기서열 결정을 실시하여 보유된 클론의 몇 가지를 확인하였다. BamHI 제한효소 위치의 도입으로 HGL의 유전자 코드가 변경되지 않는다. 사실상, 천연 HGL 서열인 GGA AGC (Gly-Ser)가 GGA TCC (Gly-Ser)가 된다. 생성 플라스미드를 pBIOC84라 명명하였다.
b) HGLSP-HGL을 포함하는 이원 플라스미드 pBIOC85의 제작.
HGLSP-HGL의 서열을 갖는 PstI-XbaI 단편을 pBIOC83을 PstI 및 XbaI으로 두 번 효소적으로 절단하여 단리시켰으며, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하였고, 전기용출하였으며 (Sambrook 등, 1989), 알콜로 침전시켜 건조시켰다. 이어서, 제조업자의 지시대로 이 DNA 단편을 T4 DNA 폴리머라제 효소(바이오랩스)로 처리하였으며, 제조업자의 지시대로 클레노우 (바이오랩스)로 처리하고 송아지 췌장 알칼린 포스파타제 효소 (베링거 만하임)로 탈인산화시킨, EcoRI 위치에서 절단된 pBIOC82 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 상기 탈인산화 벡터 20 ng 및 상기 HGLSP-HGL을 포함하는 DNA 단편 200 ng을 사용하여 T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 2 ㎕, 50% 폴리에틸렌 글리콜 8000 2 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 5 U의 존재하에 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 균주를 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 12 ㎍/ml의 테트라사이클린 상에서 선별하여 획득한 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다. 생성 클론을 pBIOC85라 명명하였다. 파마시아사가 판매하는 T7 (등록상표) 서열 분석 키트를 사용, 디데옥시뉴클레오티드 방법(Sanger 등, 1977)으로 서열 분석을 실시하여 HGLSP-HGL 재조합 단백질을 코딩하는 단편의 핵산 서열을 확인하였다. HGLSP와 성숙 HGL 사이의 제한 서열은 Gly-Leu이다. 이원 벡터인 pBIOC85 플라스미드 DNA를 Holsters 등의 방법 (1978)에 따라 균주 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 내로 직접적으로 형질전환시켜 도입하였다. 보유된 클론의 유효성을 도입된 플라스미드 DNA의 효소 분해로 확인하였다.
c) HPLSP-HGL을 포함하는 이원 플라스미드 pBIOC86의 제작.
pBIOC84 플라스미드를 PstI 및 BamHI으로 두 번 절단하여 신호 펩티드 HGLSP 및 성숙 HGL 단백질의 첫 번째 8개의 아미노산 (Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly)을 코딩하는 서열을 억제하였다. 상기 서열을, 성숙 HGL 단백질의 첫 번째 8개 코돈을 코딩하는 서열에 융합된 HPLSP 신호 펩티드의 16개의 아미노산을 코딩하는 서열 (ATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA) (HPLSP-성숙 HGL의 첫 번째 8개의 코돈)로 치환하였다. 이전에 기술한 PCR 증폭 프로토콜을 따라 (상기 단락 I 참조), 5' aaactgcaggctcgagaacaATG C 3' 및 5' C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3'의 두 가지 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용하여 5' aaactgcaggctcgagaacaATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' 매트릭스로부터 PCR에 의해 HPLSP-성숙 HGL의 첫 번째 8개의 코돈 서열을 증폭시켰다. 혼성화 온도를 조절하였다. PstI 및 BamHI에 의한 두 번의 효소적 절단 후에, PCR 증폭물로부터 유래한 DNA 단편을 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제하였으며, 전기용출시켰고 (Sambrook 등, 1989), pH가 4.8인 3 M 소듐 아세테이트 1/10 부피 및 무수 에탄올 2.5 부피 존재하에서 -80℃에서 30분 동안 침전시켰으며, 12000 g에서 30분 동안 원심분리하였고, 70% 에탄올로 세척하였으며, 건조시켰고, 이어서 PstI 및 BamHI으로 두 번 절단하여 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제하고, 전기용출한 (Sambrook 등, 1989), 알콜로 침전시켜 건조시킨 pBIOC84 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 벡터 100 ng 및 상술된 PCR 증폭물로부터 유래한 절단된 DNA 단편 50 ng을 사용하여, T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 1 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 2.5 U의 존재하에 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 균주를 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 50 ㎍/ml의 암피실린 상에서 선별하여 획득한 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다. 파마시아사가 판매하는 T7 (등록상표) 서열 분석 키트를 사용, 디데옥시뉴클레오티드 방법 (Sanger 등, 1977)으로 서열 분석을 실시하여 보유된 클론의 몇 가지를 확인하였다. 오픈 리딩 프레임을 유지하는 HPLSP 및 성숙 HGL 서열이 클로닝되었다 (즉, 특유한 오픈 리딩 프레임을 구성함). HPLSP 서열과 성숙 HGL 서열 사이의 제한 서열은 Gly-Leu이다. 생성 플라스미드를 pBIOC86이라 명명하였다.
HPLSP-HGL 서열을 갖는 PstI-XbaI 단편을 BIOC86을 PstI 및 XbaI으로 두 번 효소적으로 절단하여 단리시켰으며, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하였고, 전기용출하였으며 (Sambrook 등, 1989), 알콜로 침전시켜 건조시켰다. 이어서, 이 DNA 단편을 제조업자의 지시대로 T4 DNA 폴리머라제 (바이오랩스)로 처리하였으며, 제조업자의 지시대로 클레노우 (바이오랩스)로 처리하고 송아지 췌장 알칼린 포스파타제 효소 (베링거 만하임)로 탈인산화시킨, EcoRI 위치에서 절단된 pBIOC82 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 상기 탈인산화 벡터 20 ng 및 상기 HPLSP-HGL을 포함하는 DNA 단편 200 ng을 사용하여 T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 2 ㎕, 50% 폴리에틸렌 글리콜 8000 2 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 5 U의 존재하에 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 12 ㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 배지상에서 선별하여 획득한 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다. 생성 클론을 pBIOC87이라 명명하였다. 파마시아사가 판매하는 T7 (등록상표) 서열 분석 키트를 사용, 디데옥시뉴클레오티드 방법 (Sanger 등, 1977)으로 서열 분석을 실시하여 HPLSP-HGL 재조합 단백질을 코딩하는 단편의 핵산 서열을 확인하였다. 이원 벡터인 pBIOC87 플라스미드 DNA를 Holsters 등의 방법 (1978)에 따라 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 주 내로 직접적으로 형질전환시켜 도입하였다. 보유된 클론의 유효성을 도입된 플라스미드 DNA의 효소 분해로 확인하였다.
d) RGLSP-HGL을 포함하는 이원 플라스미드 pBIOC89의 제작.
pBIOC84 플라스미드를 PstI 및 BamHI으로 두 번 절단하여 신호 펩티드인 HGLSP 및 성숙 HGL 단백질의 첫 번째 8개의 아미노산 (Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly)을 코딩하는 서열을 억제하였다. 상기 서열을 성숙 HGL 단백질의 첫 번째 8개 코돈을 코딩하는 서열에 융합된 RGLSP 신호 펩티드의 19개의 아미노산을 코딩하는 서열 (ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT) (RGLSP-성숙 HGL의 첫 번째 8개의 코돈)로 교환하였다. 이전에 기술한 PCR 증폭 프로토콜을 따라 (상기 단락 I 참조), 5' aaactgcaggctcgagaacaATG TGG 3' 및 5' C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3'의 두 가지 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용하여 5' aaactgcaggctcgagaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' 매트릭스로부터 PCR로 RGLSP-성숙 HGL의 첫 번째 8개의 코돈 서열을 증폭시켰다. 혼성화 온도를 조절하였다. PstI 및 BamHI에 의한 이중 효소 절단 후에, PCR 증폭물로부터 유래한 DNA 단편을 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제하였으며, 전기용출시켰고 (Sambrook 등, 1989), pH가 4.8인 3 M 소듐 아세테이트 1/10 부피 및 무수 에탄올 2.5 부피 존재하에서 -80℃에서 30분 동안 침전시켰으며, 12000 g에서 30분 동안 원심분리하였고, 70% 에탄올로 세척하였으며, 건조시켰고, 이어서 PstI 및 BamHI으로 두 번 절단하여 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제하여 전기용출한 (Sambrook 등, 1989), 알콜로 침전시켜 건조시킨 pBIOC84 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 벡터 100 ng 및 상술된 PCR 증폭물로부터 유래한 절단된 DNA 단편 50 ng을 사용하여, T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 1 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 2.5 U의 존재하에 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 50 ㎍/ml의 암피실린 상에서 선별하여 획득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다. 파마시아사가 판매하는 T7 (등록상표) 서열 분석 키트를 사용, 디데옥시뉴클레오티드 방법 (Sanger 등, 1977)으로 서열 분석을 실시하여 보유된 클론의 몇 가지를 확인하였다. 오픈 리딩 프레임을 유지하는 RGLSP 및 성숙 HGL 서열을 클로닝하였다 (즉, 상기 서열이 특유한 오픈 리딩 프레임을 구성함). RGLSP 서열과 성숙 HGL 서열 사이의 제한 서열은 Gly-Leu이다. 생성 플라스미드를 pBIOC88이라 명명하였다.
RGLSP-HGL의 서열을 갖는 PstI-XbaI 단편을 pBIOC88을 PstI 및 XbaI으로 두 번 효소적으로 절단하여 단리시켰으며, 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 정제하였고, 전기용출하였으며 (Sambrook 등, 1989), 알콜로 침전시켜 건조시켰다. 이어서, 제조업자의 지시대로 이 DNA 단편을 T4 DNA 폴리머라제 효소 (바이오랩스)로 처리하였으며, 제조업자의 지시대로 클레노우 (바이오랩스)로 처리하고 송아지 췌장 알칼린 포스파타제 효소 (베링거 만하임)로 탈인산화시킨, XbaI 위치에서 절단된 pBIOC82 플라스미드 DNA에 라이게이션하였다. 상기 탈인산화 벡터 20 ng 및 RGLSP-HGL을 포함하는 DNA 단편 200 ng을 사용하여 T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 2 ㎕, 50% 폴리에틸렌 글리콜 8000 2 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 5 U의 존재하에 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 12 ㎍/ml의 테트라사이클린 상에서 선별하여 획득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다. 생성 클론을 pBIOC89라 명명하였다. 파마시아사가 판매하는 T7 (등록상표) 서열 분석 키트를 사용, 디데옥시뉴클레오티드 방법 (Sanger 등, 1977)으로 서열 분석을 실시하여 RGLSP-HGL 재조합 단백질을 코딩하는 단편의 핵산 서열을 확인하였다. 이원 벡터인 pBIOC89 플라스미드 DNA를 Holsters 등의 방법 (1978)에 따라 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 주 내로 직접적으로 형질전환시켜 도입하였다. 보유된 클론의 유효성을 도입된 플라스미드 DNA의 효소 분해로 확인하였다.
IV. 개 위장 리파제의 재조합 단백질을 코딩하며 옥수수 종자에서 발현되는 키메라 유전자의 제작.
a) RGLSP-DGL을 포함하고 옥수수 종자에서 컨스티튜티브 발현을 하게 하는 pBIOC98 및 pBIOC99 플라스미드의 제작.
옥수수 종자에서 개 위장 리파제 (DGL)를 코딩하는 동물 유전자를 컨스티튜티브하게 발현시키기 위하여 하기의 조절 서열이 필요하였다:
1. 컨스티튜티브 발현을 가능하게 하는 하기 두가지 프로모터 중 하나:
- McElroy 등 (1991)이 기술한 pAct1-F4 플라스미드에 포함되어 있는 벼 액틴 인트론이 뒤에 존재하는 벼 액틴 프로모터 (pAR-IAR);
- CaMV (꽃양배추 모자이크 바이러스)의 이중 컨스티튜티브 프로모터 35S (pd35S). 상기 프로모터는 천연 35S 프로모터의 TATA 성분으로부터 상류에 위치하는 전사를 활성화시키는 서열의 이중체에 해당한다 (Kay 등, 1987);
2. 두 가지 터미네이터 중 하나
- 꽃양배추 모자이크 바이러스의 서열의 전사체 35S를 생산하는 이중 가닥 환상 DNA의 3' 비코딩 영역에 대응하는 말단 전사 서열인 터미네이터 폴리A 35S (프랭크(Fanck) 등, 1980).
- 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 균주의 Ti 플라스미드의 노팔린 합성효소 유전자의 3' 비코딩 서열 부위에 대응하는, 말단 전사 서열인 터미네이터 폴리A NOS (Depicker 등, 1982).
pBSII-pAR-IAR-tNOS의 NcoI 및 SalI 부위에서 RGLSP-DGL을 코딩하는 서열을 갖는 BglII-XbaI 단편을 클로닝함으로써 RGLSP-DGL을 코딩하는 서열이 pAR-IAR의 제어 하에 위치하는 pBIOC98 플라스미드를 수득하였다.
RGLSP-DGL을 코딩하는 서열을 포함하는 BglII-XbaI 단편을 BglII 및 XbaI으로 두 번 효소 절단하여 pBIOC40으로부터 단리시켰으며 (상기에 기술되어 있음), 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제하였고, 전기용출하였으며, 알콜로 침전시켜 건조시켰으며, 이어서 클레노우 효소를 처리하였다. pBSII-pAR-IAR-tNOS 플라스미드를 SalI 및 NcoI으로 두 번 절단하였으며, 정제하였고, 멍 빈 뉴클레아제 효소 (바이오랩스)로 처리하였으며, 제조업자의 지시대로 송아지 장의 알칼린 포스파타제 효소 (베링거 만하임)로 탈인산화하였다. 탈인산화 벡터 20 ng 및 상기 RGLSP-DGL을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 단편 200 ng을 사용하여 T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 2 ㎕, 50% 폴리에틸렌 글리콜 8000 2 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 5 U의 존재하에 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 배지에서 선별하여 획득한 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다. 생성 플라스미드를 pBIOC98이라 명명하였다.
pBSII-pAR-IAR-tNOS 플라스미드는 pActl-F4 플라스미드로부터 단리시킨 gus 유전자를 코딩하는 서열의 pAR-IAR-개시부에 대응하는 서열을 갖는 SnaBI-KpnI 단편의 pBSII-tNOS의 클레노우 및 KpnI으로 처리된 Eco01091 부위에 클로닝함으로써 수득된다. 벡터 100 ng 및 상기 DNA 단편 50 ng을 사용하여, T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 1 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 2.5 U의 존재하에 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 50 ㎍/ml의 암피실린을 포함하는 배지 상에서 선별하여 획득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다.
pBSII-tNOS 플라스미드는 스트라타겐이 판매하는 pBSIISK＋의 탈인산화시킨 EcoRV 부위에 SacI 및 EcoRV에 의한 이중 효소 분해에 의해 클론테크사가 판매하는 pBI121로부터 단리되고 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제되고 T4 DNA 폴리머라제 효소로 처리된 tNOS 서열을 갖는 SacI-EcoRI 단편을 클로닝함으로써 수득하였으다. 탈인산화된 벡터 20 ng 및 상기 tNOS 서열을 포함하는 DNA 단편 200 ng을 사용하여 T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 2 ㎕, 50% 폴리에틸렌 글리콜 8000 2 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 5 U의 존재하에 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 배지 상에서 선별하여 획득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다.
상기 pBIOC41로부터 단리한 pd35S-RGLSP-DGL에 대응하는 서열을 갖는 KpnI-BamHI 단편를 pBSII-t35S 플라스미드의 KpnI 및 BamHI 부위에 클로닝함으로써 RGLSP-DGL을 코딩하는 서열이 pd35S 제어 하에 존재하는 pBIOC99 플라스미드를 수득하였다. 벡터 100 ng 및 상기 DNA 단편 50 ng을 사용하여 T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 1 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 2.5 U의 존재하에 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 50 ㎍/ml의 암피실린을 포함하는 배지 상에서 선별하여 획득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다.
SmaI 및 EcoRV 효소에 의한 두 번의 절단으로 pJIT163으로부터 단리하고 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 정제한 t35S 서열을 갖는 SmaI-EcoRV 단편 (상기에 기술되어 있음)를 스트라타겐사가 판매하는 pBSIISK＋ 플라스미드의 클레노우로 처리된 탈인산화된 SpeI 부위에 클로닝함으로써 pBSII-t35S 플라스미드를 수득하였다. 탈인산화 벡터 20 ng 및 상기 t35S 서열을 포함하는 DNA 단편 200 ng을 사용하여, T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 2 ㎕, 50% 폴리에틸렌 글리콜 8000 2 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 5 U의 존재하에 반응 매질 20 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 50 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 배지 상에서 선별하여 획득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다.
b) 각각 RGLSP-DGL 및 RGLSP-DGL-KDEL을 포함하고 옥수수 종자의 배젖에서 발현되게 하는 pBIOC100 및 pBIOC101 플라스미드의 제작
개 위장 리파제 (DGL)를 코딩하는 동물 유전자를 옥수수 종자의 배젖에서 발현시키는 데 하기의 조절 서열이 필요하였다:
1. Reina 등 (1990)이 기술한 pγ63 플라스미드에 포함되어 있는 옥수수의 γzeine 유전자 프로모터 (pγzeine). HindIII과 EcoRI 부위 사이에 클론테크사가 판매하는 pBI221의 p35S-gus-tNOS 발현 카세트를 포함하는 pUC18 플라스미드의 HindIII 및 XbaI 부위에 pγzeine를 클로닝하여 pγ63 플라스미드를 수득한다. 상기 플라스미드는 옥수수 종자의 배젖에서 발현하게 된다.
2. 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 균주의 Ti 플라스미드의 노팔린 합성효소 유전자의 3' 비코딩 서열 부위에 대응하는, 말단 전사 서열인 터미네이터 폴리A NOS (Depicker 등, 1982).
pBIOC40으로부터 단리시킨 클레노우로 처리된 XbaI-BglII 단편 (상기에 기술되어 있음)를 pγ63 플라스미드의 T4 DNA 폴리머라제 효소로 처리된 SacI 및 BamHI 부위에 클로닝함으로써 RGLSP-DGL을 코딩하는 서열이 pγzeine 제어 하에 위치하는 pBIOC100 플라스미드를 수득하였다. 벡터 100 ng 및 상기 DNA 단편 50 ng을 사용하여 T4 DNA 리가제의 10배 완충액 (애머샴) 1 ㎕ 및 T4 DNA 리가제 효소 (애머샴) 2.5 U의 존재하에 반응 매질 10 ㎕에서 14℃에서 16시간 동안 라이게이션을 실시하였다. 미리 컴피턴트하게 만든, 에셔리키아 콜리 DH5α 세균을 형질전환시켰다 (Hanahan, 1983). 50 ㎍/ml의 암피실린을 포함하는 배지 상에서 선별하여 획득된 클론의 플라스미드 DNA를 알칼리 용해법으로 추출하였으며 (Birnboim 및 Doly, 1979) 제한 효소에 의한 효소 분해로 분석하였다. 생성 클론을 pBIOC100이라 명명하였다.
상기에 기술되어 있는 프로토콜에 따라 PCR로 증폭시켜 획득한 정지 코돈 앞에 위치하는 KDEL 테트라펩티드를 코딩하는 서열 (소포체로 지향하게 함)을 갖는 NcoI-AflII 단편으로 pBIOC100의 NcoI-AflII 단편을 치환하여 pBIOC101 플라스미드를 수득한다. 상기 반응 동안 사용된 두 가지 올리고데옥시뉴클레오티드는 5' AAT CAC TTG GAC TTT ATC TGG Gcc atg gAT GCC 3' (특유한 NcoI 부위) 및 5' ATT ctt aag AAA CTT TAT TGC CAA ATG TTT GAA CGA TCG GGG AAA TTC GAC GCG TCT AGA ACT ATA GCT CAT CCT TAT TAT CTG TTC CCA TCA TGG 3' (KDEL 및 특유한 AflII 부위를 코딩하는 서열)이었다. 혼성화 온도는 70℃였다. 이전에 기술한 바와 같이 클로닝을 수행하였다.
V. 트랜스제닉 평지의 제조예
스프링 평지 (브라씨카 나푸스 씨브이 웨스타 (Brassica napus cv WESTAR) 또는 리마그라인 스톡 (Limagrain stock))의 종자를 15% 도메스토스 (Domestos) 용액 중에서 40분 동안 소독한다. 살균수로 4회 헹군 후, 수크로스 30 g/ℓ를 갖고 5 g/ℓ의 아가 겔로 응고시킨 무라시게 (Murashige) 및 스쿡 (Skoog)의 무기질 배지 (Sigma M 5519)에서 직경이 7 cm이고 높이가 10 cm인 포트 당 종자 20개의 양으로 종자를 발아시킨다. 이 포트를 80 μE m-2S-1의 광도 하에서 광주기를 16시간/8시간으로 하여 26℃의 성장실에 둔다.
발아 5일 후, 멸균 조건 하에서 자엽 마디의 약 1 mm 위의 잎꼭지를 모두 자름으로써 자엽을 제거한다.
동시에, pBIOC29 (또는 pBIOC25), 즉 pCRU (또는 pd35S) 프로모터의 제어 하에서의 지향 신호 PPS (또는 PS)를 코딩하는 서열에 융합된 개 위장 리파제를 코딩하는 서열이 삽입되어 있는 pGAZE 플라스미드를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스 주 LBA4404를, 사용된 균주의 선별에 사용될 수 있는 항생제가 보충된 10 ml의 세균 배지 2YT (Sambrook 등, 1989)가 들어있는 50 ml 원뿔형 플라스크에서 28℃에서 36시간 동안 예비배양한다.
상기 예비배양액을 동일 조건 하에서 제조하는 새로운 세균 배양액에 1% 양으로 접종하는 데 사용한다. 14시간 후에, 배양액을 3000 g에서 15분 동안 원심분리하며 동일한 부피의 발아용 액체 배지에 현탁시킨다. 이 현탁액을 직경이 5 cm인 페트리 디쉬에 5 ml/디쉬의 양으로 나눈다.
상기와 같이 제조된 아그로박테리아 용액에 잎꼭지의 절단한 말단을 수초간 침지시키고 이어서 잎꼭지를 재생용 배지 내로 수 밀리미터 밀어넣는다. 상기 배지는 싹의 신형성 (neoformation)을 촉진하는 식물 호르몬인 벤질-아미노-퓨린 (BAP)이 4 mg/l로 첨가되어 있는 발아용 배지와 동일한 기본 조성을 갖는다. 직경이 9 cm인 페트리 디쉬 (Greiner 참조 번호 664102) 당 10개의 외식편 (잎꼭지를 갖는 자엽)을 성장시킨다.
발아용과 동일한 환경 조건 하에서 함께 배양한 지 2일 후에, 선별용 제제인 카나마이신 설페이트 (Sigma, 참고번호 K4000) 45 mg/l 및 세균 발육 저지용인 클라불란산의 칼륨염 1/6 (중량으로)과 아목시실린의 나트륨염 (오그멘틴 (Augmentin), 주사 가능) 5/6의 혼합물을 600 mg/l의 양으로 보충한 이전의 배지를 함유하는 피타트레이 (Phytatray) 박스 (Sigma, 참고번호 P1552) 내로 외식편을 옮겨 심는다.
그 이후의 3주 간격의 두번의 이식에 대해 동일한 조건 하에서 새로운 배지 상에 무균 조건 하에서 외식편을 이식한다.
두 번째 또는 세 번째 옮겨 심은 마지막에 나타난 녹색 싹을 외식편으로부터 분리하여 BAP가 결여된 것을 제외하고는 이전의 배지와 동일한 배지를 함유하는 직경이 5 cm이고 높이가 10 cm인 투명 포트에서 개별적으로 성장시킨다. 3주 동안 성장시킨 후 형질전환된 싹의 줄기를 절단하여 그 싹을 새로운 배지의 포트에 옮겨 심는다. 3 내지 4주 후에 뿌리가 충분히 발달되어 식물 생장 조절실에서 묘목이 새 환경에 순응하게 한다. 녹색이 아니거나 뿌리가 없는 싹을 제거한다. 이어서 물로 포화된 토양 (표준 NF U44511: 갈색 토탄 40%, 체질된 히스 30% 및 모래 30%)을 채운 면이 7 cm인 접시 내로 이 묘목을 옮겨 심는다. 식물 생장 조절실 (온도 21℃, 광주기 16시간/8시간 및 상대 습도 84%)에서의 2주간의 새 환경 순응 후, 서서히 작용하는 (slow-acting) 비료 (오스모코트 (Osmocote)를 4 g/l (토양)의 양으로)로 비옥하게 한 동일 토양으로 채운 직경이 12 cm인 포트에 묘목을 옮기고, 이어서 매일 2회 2분 동안 관수하고 18℃에서 조절되는 온실 (S2 종류)로 옮긴다.
꽃이 나타나면, 이 꽃들을 이화 수정을 방지하는 방식으로 백 (Crispac, 참고번호 SM 570y 300 mm*700mm)에 둔다.
꼬투리가 성숙기에 이르렀을 때, 이 꼬투리를 추수한 후, 건조시키고 이어서 분쇄한다. 수득된 종자를 생화학적 활성 분석용으로 사용한다. 트랜스제닉 자손을 100 내지 150 mg/l의 카나마이신 설페이트 (유전자형에 의존적임)를 포함하는 배지 상에서 발아시킴으로써 선별한다. 발아를 튜브 당 1개의 종자로 유리 튜브에서 수행하는 것을 제외하고, 작용 조건은 상기에서 기술한 것과 동일하다. 온실로 옮기기 전에 첫번째 3주 동안 2차 뿌리가 발달한 묘목만을 식물 생장 조절실에서 순응시킨다.
VI. 트랜스제닉 가지과 식물의 제조예.
a) 트랜스제닉 담배의 제조
Gamborg 등 (1968)에 따른 비타민 (Sigma 참고번호 M0404), 수크로스 20 g/l 및 아가 (Merck) 8 g/l이 첨가된, 무라시게 및 스쿡의 기본 배지 (1962)에서 형질전환 실험에 사용할 담배 (니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 변종 크산티 엔씨 (Xanthi NC)및 PBD6)을 실험실에서 배양한다. 120℃에서 20분 동안 멸균하기 전에, 가성칼륨 용액으로 배지의 pH를 5.8로 조절한다. 매 30일마다 상기 증식용 배지 MS20에 절간에서 절단한 담배 묘목을 옮겨 심는다.
모든 실험실 배양을 하기와 같이 정의된 조건 하의 기후적으로 조절된 챔버에서 수행한다:
- 광도 30 μE.m-2.S-1; 광주기 16시간;
- 낮 동안 26℃이고, 밤에 24℃인 온도 주기.
사용된 형질전환 기술은 Horsch 등 (1985)으로부터 유래한 것이다.
pBIOC 29 또는 pBIOC 26 또는 pBIOC25 플라스미드를 포함하는, 아그로박테리움 투메파시엔스 주 LBA4404를 적절한 항생제 (리팜피신 및 테트라사이클린)가 첨가된 LB 배지 (Sambrook 등, 1989)에서 교반하면서 28℃에서 48시간 동안 예비배양한다. 이어서 예비배양액을 동일 배지에서 50배 희석시키고 동일 조건 하에서 배양한다. 하룻밤 후에, 배양액을 원심분리하고 (3000 g, 10분), 세균을 동량의 액체 배지 MS30 (30 g/l의 수크로스)에 현탁시켜 이 현탁액을 10배 희석시킨다.
상기에서 기술한 묘목 잎으로부터 약 1 cm2의 외식편을 절단한다. 상기 외식편을 그 후 세균 현탁액에 1시간 동안 접촉하게 하며 이어서 여과지에서 빨리 건조시키고 공배양(coculture)용 배지 (고체 MS30)에 둔다.
2일 후, 선별 제제인 카나마이신 (200 mg/l), 박테리오스타틱인 오그멘틴 (400 mg/l), 및 싹의 유도에 필요한 호르몬 (1 mg/l의 BAP, 및 0.1 mg/l의 ANA)을 함유하는 재생용 배지 MS30의 페트리 디쉬로 묘목을 옮긴다. 2주 동안 성장시킨 후, 동일 배지에 묘목을 옮겨 심는다. 추가의 2주 후에, 카나마이신 및 오그멘틴이 첨가된 MS20 배지로 구성된, 발달용 배지가 있는 페트리 디쉬에 싹을 옮겨 심는다. 15일 후에, 싹의 절반을 옮겨 심는다. 뿌리가 나는 데 약 20일이 걸리는 데, 그 마지막에 묘목을 절간에서 절단하여 클로닝할 수 있거나 온실에서 묘목에 싹이 트게 할 수 있다.
b) 트랜스제닉 토마토의 제조.
토마토 종자 cv. UC82B를 10% 도메스토스로 15분 동안 살균하고 살균수로 3회 헹군다. 마지막 헹굼은 교반하면서 10분 동안 수행한다.
상기와 같이 살균된 종자를 Nitsch에 따른 비타민 (Thomas 및 Pratt, 1981), 사카로스 30 g/l, pH가 5.9인 아가 (Merck) 8 g/l이 첨가된 무라시게 및 스쿡의 기본 배지 (1962, Sigma 참고번호 M6899/2)인 MSSV/2 배지에서, 기후적으로 조절된 챔버 (광도 30 μE. m-2, s-1, 광주기 16시간/8시간, 26℃) 내에서 7일 또는 8일 동안 발아시킨다.
사용된 형질전환 기술은 Fillatti 등 (1987)의 것으로부터 유래한다.
pBIOC 25 또는 pBIOC 26 플라스미드를 포함하는, 아그로박테리움 투메파시엔스 주 LBA4404를, 적절한 항생제 (리팜피신 및 테트라사이클린)가 첨가된 LB 배지에서 교반하면서 28℃에서 24시간 동안 예비배양한다. 이어서 예비배양액을 동일 배지로 50배 희석시키고 동일 조건 하에서 하룻밤 배양한다. OD를 600 nm에서 측정하며, 아그로박테리아를 원심분리하고 (3000 g, 10분) KCMS 액체 배지 (Fillatti 등의 출판물에 기술되어 있음, 1987)에 현탁시켜 600 nm에서의 OD 0.8을 획득한다.
개선된 기술을 Fillatti 등이 1987년에 기술한 프로토콜의 몇몇 단계에서 사용하였다.
아세토시린곤 (200 mM)을 KCMS 배지에 보충한 것을 제외하고는 묘목의 예비배양 및 공배양을 Fillatti 등이 1987년에 기술한 바와 같이 수행하였다.
2Z 세척용 배지는 카르베니실린 대신에 세포탁심 500 mg/l을 첨가했다는 점에서 다르다. 사용된 발달용 배지는 Nitsch에 따른 비타민, 사카로스 20 g/l, 카나마이신 50 mg/l, 오그멘틴 200 mg/l, ANA 1 mg/l 및 제아틴 0.5 mg/l가 첨가된 무라시게 및 스쿡의 기본 배지 (Sigma MS6899)로 구성된다.
VII. 트랜스제닉 옥수수의 제조
a) 유전자 형질전환을 위한 표적으로서의 옥수수 캘러스의 제조 및 용도.
사용하는 방법 (일렉트로포레이션, 아그로박테리움, 미세섬유, 미립자 총)이 무엇이든, 옥수수를 유전적으로 형질변형시키려면 일반적으로 완전한 식물을 재생시킬 능력을 보유한 빠르게 분열하는 미분화 세포를 사용해야 한다. 이런 형태의 세포로는 부서지기 쉬운 옥수수의 배 캘러스 (II형으로 불림)가 있다.
H1 II 유전자형의 미성숙 배로부터 또는 Amstrong이 기술한 방법 및 배지 (Malze Handbook; (1994) M. Freeling, V. Walbot Eds.; pp. 665-671)에 따른 (A188 x B73)로부터 캘러스를 수득한다. 상기 방식으로 획득된 캘러스는 매 15일마다 시작 배지에 연속적으로 이식함으로써 증식시키고 유지한다.
이어서 Vain 등이 기술한 방법에 따라 세포의 호르몬 및 삼투 균형을 변경시킴으로써 묘목을 상기 캘러스로부터 재생시킨다 (Plant Cell Tissue and Organ Culture (1989), 18: 143-151). 이어서 상기 식물을 온실에서 순응시켜 교배될 수 있게 하거나 자가 수분될 수 있게 한다.
b) 옥수수의 유전자 형질전환을 위한 미립자 총의 용도
상기 단락에서 형질전환에 필요한 세포 계열의 제조 및 재생이 기술되어 있으며, 변경된 유전자가 식물의 게놈 내로 안정하게 삽입되게 하는 유전자 형질전환 방법을 여기에서 기술한다. 상기 방법은 J. Finer가 기술한 것과 동일한 미립자 총의 사용에 의존적이며 (Plant Cell Report (1992) 11: 323-328), 표적 세포는 단락 1에 기술되어 있는 캘러스 단편이다. 표면적이 10 내지 20 mm2인 상기 단편을 포격 4시간 전에 0.2 M의 만니톨 ＋ 0.2 M의 소르비톨이 첨가된 시작 배지와 동일한 배양용 배지를 함유하는 페트리 디쉬의 중앙에 디쉬 당 16개의 단편 비율로 정렬시켰다. 도입시킬 유전자를 갖는 플라스미드를 제조업자의 지시에 따라 퀴아겐 (등록상표, Qiagen) 컬럼 상에서 정제한다. 이어서 플라스미드를 Klein이 기술한 방법 (Nature (1987) 327: 70-73)에 따라 텅스텐 미립자 (M10) 상에 침전시킨다. 그와 같이 코팅된 미립자를 건을 사용하여 J. Finer가 기술한 방법 (Plant Cell Report (1992) 11: 323-328)에 따라 표적 세포를 향해 발사한다.
이어서 그와 같이 피격된 캘러스 디쉬를 셀로프라이스 (등록상표, Scellofrais)를 사용하여 밀봉하며 이어서 암실에서 27℃에서 배양한다. 첫 번째 식재를 24시간 후에, 이어서 3개월 동안 매 15일마다, 사용된 유전자에 따라 형과 농도가 변화할 수 있는 선별 제제가 첨가된 시작 배지와 동일한 배지 상에 실시한다 (단락 3). 일반적으로 사용할 수 있는 선별용 제제는 특정 제초제 (바스타 (등록상표, Basta), 라운드 업 (등록상표, Round up)) 또는 특정 항생제 (히그로마이신, 카나마이신 등)의 활성 화합물로 구성된다.
3개월 후 또는 때로 더 일찍, 선별용 제제에 의해 성장이 저해되지 않는 캘러스가 수득되며, 일반적으로 그리고 대부분 유전자 풀 내로 1 카피 이상의 선별 유전자가 삽입된 세포의 분열로부터 유래하는 세포들로 구성된다. 그와 같은 캘러스가 수득되는 빈도는 피격 디쉬 당 약 0.8 캘러스이다.
상기 캘러스를 확인하며, 개개화하여, 증폭시키고 이어서 배양하여 묘목을 재생시킨다 (단락 a를 참조바람). 형질전환되지 않은 세포에 의한 모든 방해를 피하기 위하여 상기의 모든 작업을 선별용 제제를 포함하는 배양용 배지 상에서 수행한다.
그와 같이 재생된 식물을 순응시키고 이어서 온실에서 재배하여 교배 또는 자가수분될 수 있게 한다.
VIII. 트랜스제닉 담배에서 개 위장 리파제의 발현에 대한 분석
a) 프로토콜
온실내의 식물에서 채취한 담배 잎으로부터 리파제 추출을 위한 프로토콜은 아래와 같다.
1 g의 잎 (생 중량)을 액체 질소에서 분쇄한 다음 1 mM EDTA 및 10 mM 메르캅토에탄올을 첨가한 pH 7.5인 25 mM 트리스 HCl 완충액 (완충액 A) 또는 1 mM EDTA, 10 mM β-메르캅토에탄올, 0.2% 트리톤 X-100 및 250 mM NaCl을 첨가한 pH 3의 25 mM 글리신-HCl 완충액 (완충액 B) 5 ml에 4℃로 두었다. 총 분쇄 물질을 10,000 g에서 15분간 4℃에서 즉시 원심분리하였다.
담배 종자에 대하여, 완충액 4 ml 당 종자 0.1 g의 양으로 완충액 B에서 추출을 수행하였다.
기질로서 트리부티린을 사용하는, 가르고우리 (Gargouri) 등 (1986)에 의한 적정법에 의한 pH-STAT을 이용하여 리파제 활성을 측정하였다. 담즙산염 (1.04 g/ℓ), 소 알부민 (0.1 g/ℓ) 및 NaCl (9 g/ℓ)의 존재 하에 볼텍스로 트리부티린 (30 ml의 에멀젼 당 4 ml)의 에멀젼을 제조하였다. 분석은 5.5로 조절된 pH 및 37℃에서 리파제의 작용하에서 유리된 부티르산의 탄산나트륨 용액에 의한 중화를 포함하였다. 리파제 1 단위는 최적 pH (5.5)에서 37℃에서 1분 동안 1 마이크로몰 지방산의 유리를 야기하는 효소량에 대응하였다. 천연 (정제된) 개 위장 리파제는 570 단위/mg의 단백질에 대해 특정 활성을 가진다. 총 분쇄 물질, 침전물 또는 원심분리한 상등액에서 리파제 활성을 측정할 수 있다.
브래드포드 (Bradford) (1976)의 방법으로 원심분리한 상등액 (완충액 A)에 대한 총 가용성 단백질 분석을 실시하였다.
또한, 천연 항-DGL 폴리클로날 항체의 2개 군을 사용하여 원심분리된 상등액에 대한 샌드위치 엘리사 시험 (Sandwich ELISA test) (Carriere et al., 1993)을 수행하였다. 제1군은 인간 위장 리파제와 반응하고 아피겔(Affigel) 10 (Aoubala et al., 1993)의 칼럼 상에서 그래프트된 인간 위장 리파제에 대한 총 항혈청을 사용하는 친화도에 의해 정제되는 항체를 포함한다. 이들 항체는 1 ㎕/ml의 농도로 엘리사 플레이트의 웰을 코팅하기 위해 사용되었다. 제2군은 인간 리파제를 인식하지 못하는 항체를 포함한다. 이들 항체는 단백질 A에 결합한 후 비오틴에 결합된 세파로스 칼럼 상에서 순차적으로 정제하였다. 항체의 고정은 효소 활성이 기질 o-페닐렌디아민을 이용해서 입증되는 스트렙타비딘/퍼록시다제 접합체의 간접적인 수단에 의해 검출되었다. 생성된 결과는 정성치이고 + 및 - 기호를 사용하여 기록하였다.
추출 수율은 CHAPS 유형의 세제 (3-(3-콜라미도프로필)디메틸-암모니오-1-프로판 술포네이트) (SIGMA)를 추출 완충액에 첨가함으로써 향상시킬 수 있었다. 이 경우에, 실제로 상등액에서의 추출 수율은 약 100%로 증가하였다 (표 1 참고).
1% CHAPS의 존재하에서, pBIOC25를 사용한 유전적 형질전환으로부터 유래하는 4개의 담배에서 생성된 추출물에서의 리파제 활성 (U/gFW).
식물 NaCl 0.2 M/EDTA 1 mMpH 3.0 NaCl 0.2 M/EDTA 1 mMpH 3.0 + 1% CHAPS
1 80 112
2 40 104
3 43 109
4 54 92
b) 식물 신호 펩티드를 사용한 발현; pBIOC25 및 pBIOC26으로 형질전환된 담배 잎 및 종자에 대한 분석; 엘리사 시험.
유전자형 크산티의 98 T0 식물 (15 내지 20엽 단계)에서 얻은 결과를 표 2에 나타내었다. 모든 분석은 원심분리 전에 잎 또는 종자의 분쇄 혼합물 상태에서 실시하였다. 각 구조체에 대해, 측정된 활성은 형질전환체에 따른 폭 넓은 다양성을 나타낸다. 약 20%의 식물이 활성이 없거나 너무 약해서 활성이 검출되지 않았다. 평균 활성 및 최대 활성을 표 2에 나타내었다.
총 단백질량은 3개 구조체에 대해 잎의 FW가 7 및 8 mg/g 및 종자의 FW가 34, 31 및 38 mg/g으로 유사하였다.
구조체 pBIOC26으로 형질전환된 잎에서 리파제 평균 활성은 총 단백질에 대해 0.8% 발현인, 34 U/g(FW)이었다. 종자에서, 평균 활성은 0.2%라고 볼 수 있는, 36 U/g(FW)이었다. 형질전환체 중 하나에서 생성된 최대 활성은 146 U/g(FW) (잎; 2.5% 발현) 및 148 U/ FWg (종자; 0.7% 발현)이었다.
구조체 pBIOC25로 형질전환된 식물에서 분석한 효소적 활성은 유사하였다. 잎에서 평균 활성은 34 U/g(FW) (0.8% 발현)이고 최대 활성은 134 U/g(FW) (총 단백질의 3%)이었다. 종자에서, 평균 활성은 42 U/g(FW)이고 최대 활성은 159 U/g(FW) (1%)이었다.
구조체 pBIOC29로 형질전환된 식물의 잎에서 활성은 검출되지 않았다 (종자 특이성 프로모터). 종자에서, 평균 활성은 12 U/g(FW) (0.1% 발현)이고 최대 활성은 137 U/g(FW) (0.7)이었다.
동일한 형질전환의 잎 및 종자에서 발현은 일반적으로 적절히 관련되어 있었다.
또한 엘리사 시험의 결과는 효소 활성에 대한 분석 결과와 동일하였고 이는 리파제 활성을 가지는 식물이 엘리사 시험에서 양성 결과임을 시사한다.
이어서 이들 동일한 식물에서 얻은 결과는 리파제 활성이 식물의 분화 과정에서 다양할 수 있음을 나타낸다. 사실, 총 단백질에 대한 발현이 12 내지 15엽 단계에서 3%인 식물이 뒤이은 분석 동안 (보다 노령인 개화한 식물)에 6%의 발현을 나타낸다.
크산티 담배의 잎 및 종자에서 리파제의 발현.
구조체 유기체 총 단백질 리파제 활성 발현 (총 단백질에 대한 %)
mg/g(FW) U/g(FW)
최소-최대 (평균) 최소-최대 (평균) 최소-최대 (평균)
pBIOC26 잎 (n=34) 3-15 (7) 0-145.6 (34.4) 0-2.5 (0.8)
종자 (n=34) 24-43 (34) 0-147.6 (36.3) 0-0.7 (0.2)
pBIOC25 잎 (n=35) 3-18 (8) 0-133.5 (34) 0-3 (0.8)
종자 (n=35) 17-35 (31) 0-158.5 (41.9) 0-1 (0.3)
pBIOC29 종자 (n=29) 29-55 (38) 0-137.4 (11.8) 0-0.7 (0.1)
FW; 생 중량최소; 최소 발현하는 형질전환으로 얻은 값최대; 최대 발현하는 형질전환으로 얻은 값n; 분석한 형질전환의 수
b) RGL의 신호 펩티드로 발현; 담배 잎에서의 리파제 활성에 대한 분석.
유전자형 크산티 및 pBD6 (15 내지 20엽 단계)의 44 T0 식물에서 얻은 결과는 아래와 같다.
모든 분석은 원심분리 전에 분쇄한 잎 혼합물로 실시하였다. 분석한 활성은 형질전환체에 따른 폭 넓은 다양성을 나타낸다. 약 20%의 식물이 활성을 나타내지 않거나 너무 약해 활성이 검출되지 않았다. 구조체 pBIOC41로 형질전환된 잎에서 리파제 평균 활성은 유전자형 크산티에 대해 FW g 당 38 U이었고 유전자형 PBD6에 대해 FW g 당 48 U이었다. 최대 활성은 각각 FW g 당 152 및 226 U였다.
IX. 트랜스제닉 토마토에서 개 위장 리파제의 발현에 대한 분석.
a) 프로토콜
토마토 잎 및 과실로부터 리파제의 추출을 위한 프로토콜은 생 물질 1 g을 4 ml의 완충액 B에서 취한 것을 제외하고는, 담배 잎에서 설명된 것과 유사하였다. 리파제 활성을 담배 잎에서 설명된 것과 같이 측정하였다.
b) 토마토 과실에서의 분석
30개의 1차 형질전환체의 과실을 분석하였다.
과실에서 분석한 리파제의 활성은 동일 형질전환체를 위한 과실에 따라 다양하였다. 시험된 구조체 (pBIOC25 또는 pBIOC26)에 대해 독립적으로, 익은 과실에대해서는 평균 FW g 당 5 U 및 덜 익은 과실에 대해서는 FW g 당 35 U이었다.
과실이 익는 동안 활성이 감소하였다는 것을 주목하여야 한다. 예를 들어, 주어진 1차 형질전환체에 있어서, 리파제 활성은 지름 10 mm의 녹색 과실 FW g 당 132 U, 지름 33 mm의 적녹색 과실 FW g 당 44 U 및 지름 45 mm의 적색 과실 FW g 당 36 U이었다.
X. 재조합 DGL의 웨스턴 유형에 대한 면역 검출.
a) 트랜스제닉 담배 및 평지 잎 및 종자에서 발현된 DGL.
a.1) 식물 신호 펩티드로 발현; pBIOC25, pBIOC26 및 pBIOC29에 의해 형질전환된 담배 및 평지 잎 및 종자에서의 면역 검출.
담배 잎 및 담배의 단백질 및 완충액 A 및 B (위의 추출 프로토콜을 참고)로 추출한 평지씨에서 개 위장 리파제에 대한 웨스턴 유형 (western blots) (Renart 및 Sandoval, 1984)의 면역 검출 실험을 실시하였다. 이들 실험을 수행하기 위해, 추출된 단백질 (시료당 총 단백질 30 ㎍)을 먼저 라엠리 U.K. (1970)의 기술에 따른 12.5% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리한 다음 니트로셀룰로스 멤브레인 상으로 전이하였다. 기니아 피그에서 생성한 항-개 리파제 폴리클로날 항체를 프로브로 사용하고 알칼리 포스파타제로 표지된 기니아 피그의 항-IgG 항체를 사용하여 검출하였다.
약 50 kDa의 외견 분자량에서 단일 밴드의 형태로 이동하는 대조 단백질은 천연 개 위장 리파제이다 (LC. 도 6). 개 위장 리파제의 이동은 비형질전환된 담배 잎의 추출물이 존재할 경우 약간 지연되었다 (도 6, LC + T).
비형질전환된 담배 및 평지 잎 및 종자의 단백질 추출물에서 밴드는 검출되지 않았다. 담배 잎에서 생성된 리파제는 2개의 밴드를 형성하였다. 양적으로 가장 큰 밴드는 약 37 kDa의 외견 분자량을 가지고 이는 상기 언급된 폴리펩티드 (Δ54)에 대응하였다. 보다 작은 밴드는 약 49 kDa의 외견 분자량을 가지고 이는 상기 언급된 폴리펩티드 (Δ4)에 대응하였다 (도 6, F). 종자의 단백질 추출물에서, 오직 보다 작은 분자량의 밴드가 육안으로 관찰되었다 (도 6, GT 및 GC).
a.2) RGL의 신호 펩티드로 발현; pBIOC41로 형질전환된 담배 잎 및 종자에서의 면역 검출.
완충액 B (위의 추출 프로토콜을 참고)로 추출된 담배 잎 및 종자의 단백질에서 웨스턴 블롯 (Renart 및 Sandoval, 1984)을 실시하였다. 추출된 단백질을 먼저 라엠리 (1970)의 기술에 따른 변성 폴리아크릴아미드 겔 (SDS-PAGE) 상에서 분리한 다음 니트로셀룰로스 멤브레인 상으로 전이하였다. 기니아 피그에서 생성한 항-개의 리파제 폴리클로날 항체를 프로브로 사용하고 알칼리 포스파타제로 표지된 항-기니아 피그 항체를 사용하여 검출하였다.
담배 잎에 대한 웨스턴 블롯의 실시예를 도 7에서 나타내었다. 약 50 kDa의 외견 분자량에서 단일 밴드의 형성으로 이동하는 대조 단백질은 개 위장 리파제이다. 담배 (T)의 비형질전환된 잎의 단백질 추출물에서 밴드는 검출되지 않았다. 잎 추출물에서 생성된 리파제는 약 48 내지 49 kDa의 외견 분자량에서 주밴드를 형성하고, 이는 상기 언급된 폴리펩티드 (D4)에 일치하였다.
구조체 pBIOC41로 형질전환된 담배 종자에서, 재조합 리파제는 잎에서와 동일한 형태이다.
b) 형질전환된 담배 잎의 단백질 추출물의 DGL: 탈글리코실화 실험.
탈글리코실화 실험을 위한 단백질의 추출을 위한 프로토콜은 아래와 같다. 0.5 g의 잎 (생 중량)을 액체 질소에서 분쇄한 다음 1 ml의 변성 완충액 (1% β-메르캅토에탄올, 25 mM EDTA 및 1% SDS를 첨가한 100 mM의 인산염 완충액, pH 7.5)에 4℃로 두었다. 분쇄한 물질은 4℃에서 15분간 10,000 g로 원심분리하였다. 단백질을 변성시키기 위해 100℃에서 5분간 상등액을 배양한 다음 2분간 10,000 g에서 원심분리하였다. 그 다음 상등액을 탈글리코실화 완충액 (1% β-메르캅토에탄올, 25 mM EDTA, 0.1% SDS 및 1% 옥틸 글루코시드를 첨가한 100 mM의 인산염 완충액, pH 7.5)에서 10배 희석하였다. 효소 (N-글리코시다제 F, PNGase Boehringer)를 상등액 100 ㎕ 당 1 U의 양으로 첨가하였다. 각 시료에 대해 효소가 없는 대조군을 사용하였다. 대조 단백질 (개 또는 쥐 위장 리파제)의 탈글리코실화는 동일한 조건하에서 발생하였다. 다양한 단백질 시료를 실온에서 8시간 동안 배양하였다. 그 다음 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기 영동으로 단백질을 분리하고 앞선 문단에서 설명된 것과 같은 니트로셀룰로스 멤브레인 상에서 전이하였다.
웨스턴 블롯 결과에 따라서, 대조군으로서 사용된 위장 리파제는 약 50 kDa의 외견 분자량을 가졌다. 탈글리코실화 후, 그의 외견 분자량은 약 43 kDa에 불과하였다.
상기 설명된 조건하에서 PNGase 없이 배양된 후, 담배 잎에서 생성된 리파제는 49 (폴리펩티드 (△4)), 37 (폴리펩티드 (△54))및 28 kDa의 외견 분자량의 3개 밴드를 형성하는 것으로 나타났다. 분자량 28 kDa의 밴드는 실온에서 8시간 배양하는 동안 발생하는 단백질 가수분해의 결과가 틀림없다. 탈글리코실화 후, 담배 잎에서 생성된 단백질이 글리코실화되었음을 나타내는 3개 밴드의 분자량은 약 1 내지 2 kDa로 감소하였다.
c) 트랜스제닉 토마토 잎 및 과실에서 발현된 DGL.
개의 위장 리파제 상에서 웨스턴 유형의 면역검출 실험을 완충액 B (상기 추출 프로토콜을 참고)로 추출된 토마토 잎 및 과실의 단백질 상에서 실시하였다. 이들 실험을 수행하기 위해, 추출된 단백질 (잎 및 과실에 대해 각각 총 가용성 단백질 15 ㎍ 및 6 ㎍))을 문단 X.a)에서 설명된 것과 같은 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였다.
약 50 kDa의 외견 분자량에서 단일 밴드의 형태로 이동하는, 대조 단백질은 천연 위장 리파제 (트랙 4, 도 8)이다.
비변성된 토마토 잎 및 과실의 단백질 추출물에서는 밴드가 검출되지 않았다.
사용된 구조체 (pBIOC25 또는 pBIOC26)에 상관없이, 토마토 잎 및 과실에서 생성된 리파제는 2개 밴드의 형태이었다. 양적으로 가장 큰 밴드는 약 37 kDa의 외견 분자량을 가졌고 이는 상기 언급된 폴리펩티드 (△54)에 대응하였다. 보다 작은 밴드는 약 49 kDa의 외견 분자량을 가졌고 이는 상기 언급된 폴리펩티드 (△4)에 대응하였다 (도 8).
XI. 식물로부터의 개 위장 리파제의 정제.
a) 담배 잎으로부터의 DGL의 정제.
담배 잎에서 생성된 개 위장 리파제의 활성도를 pH-스태트 (Mettler-Toledo-DL25)을 이용하여 5.5로 유지되도록 조절된 pH 및 37℃의 온도에서 기질로서 트리부티린 (1 ml의 트리부티린을 볼텍스에서 0.15 M의 NaCl 수용액 29 ml에 유화시켰다)을 사용하는 적정법으로 측정하였다. 에멀젼이 왕성한 기계적 교반에 의해 유지되는 한편, 분석은 0.02 N 탄산나트륨을 첨가함으로써 리파제의 작용하에서 유리된 부티르산을 중화하는 것을 포함하였다. 1 리파제 단위는 이들 pH 및 온도 조건하에서 분당 유리된 지방산 1 마이크로몰에 대응하였다.
첫 크로마토그래피 단계 후, 리파제 활성은 0.15 M NaCl, 타우로데옥시콜릭산나트륨 2 mM 및 소 혈청 알부민 1.5 μM로된 용액 29 ml에 1 ml의 트리부티린이 첨가된 에멀젼에 0.5 ml의 분석 시료로 가르고리 (Gargouri) 등에 의해 설명된 분석 (1986)에 따라 설명하였다.
동결건조한 잎 1 g을 pH 2.5, 4℃인 20 mM의 글리신 완충액 30 ml에서 분쇄하고, 혼합물을 15분 동안 완만하게 교반하였다. 완충액에 담궈두는 동안, 1 N의 HCl을 첨가하여 pH를 2.5로 유지시켰다. 완충액에 담궈둔 생성물을 5분간 15,000 g로 원심분리하였다. 1 N의 NaOH를 첨가하여 상등액의 pH를 4로 조정하였다. 미라클로스 (MIRACLOTH; Calbiochem)로 여과한 후, 모든 상등액을 분당 1 ml의 유속인 pH 4의 20 mM 아세트산나트륨 및 20 mM의 NaCl로된 완충액에서 평형된 10 ml (지름 1.6 cm)의 양이온 교환 수지 칼럼 (S-Sepharose Fast Flow resin-약전)에 사용하였다. 2 ml의 분획을 수집하였다. 상등액의 통과 후, 칼럼을 40 ml의 평형 완충액으로 세척하였다. 칼럼 상에서 보유된 단백질을 아래의 프로토콜에 따라 용출시켰다.
- 1 ml의 분석 시료로 실시한 시험에서, 리파제 활성을 함유하지 않는 단백질의 제1조의 피크를 용출시키기 위한, 30분에 걸쳐 20 mM 내지 210 mM NaCl의 pH 4.0인 20 mM 아세트산나트륨 완충액에서의 선형 구배,
- 210 mM NaCl에서 20분 동안 안정 상태에 도달하고,
- 제2조의 피크를 용출시키기 위한, 30분에 걸쳐 210 mM 내지 500 mM NaCl의 pH 4.0인 20 mM 아세트산나트륨 완충액에서의 선형 구배. 0.5 ml의 분석 시료에서 측정한 리파제 활성은 300 내지 400 mM의 이온 강도에서 이 제2 구배 동안에 용출되었다.
활성 분획을 수집하고 분자량 한계 30 kDa의 오메가셀(OMEGACELL) 농축 셀 (Filtron Technology Corporation)을 이용하여 농축시켰다.
눙축물을 pH 8인 10 mM 트리스-HCl 완충액에 대해 12시간 동안 투석한 다음, pH 8인 10 mM 트리스-HCl 완충액에서 평형된 음이온 교환 수지 (지름 0.5 cm 및 높이 5 cm의 모노Q HR 5/5-약전)에 적용시켰다. 리파제 활성을 0.5 ml의 분석 시료에서 측정하였다. 유속을 분당 1 ml로 유지시키고, 이는 다시 말해서 2.0 mPa의 압력이다. 보유되지 않은 분획의 용출 및 pH 8인 10 mM 트리스-HCl 완충액 10 ml로 칼럼을 세척한 후, 0 내지 400 mM NaCl의 이온 강도의 선형 구배를 60분에 걸쳐 적용하였다. 리파제 활성을 100 mM 및 200 mM 사이의 이온 강도에서 용출되었다.
활성 분획을 수집하고 분자량 한계 30 kDa인 오메가셀 농축 셀을 이용하여 농축시켰다. 농축물은 담배 잎을부터 추출된 개 위장 리파제의 정제된 형태로 구성되었다.
단백질의 농축은 농축 상등액에서는 엠. 브래드포드 (M. Bradford; 1976)의 방법에 따르고 첫 번째 이온 교환 크로마토그래피 후의 용액에 대해서는 오.에이치. 라우리 (O.H. Lowry; 1951)의 방법에 따라서 결정하였다.
정제의 다양한 단계는 유.케이. 라엠리 (1970)의 기술에 따른 변성 폴리아크릴아미드 겔 (SDS-PAGE 12.5%)상의 전기 영동으로 분석하였다. 한편, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 이 방법으로 분리된 단백질은 쿠마시 블루 (Coomassie blue)로 염색하여 검출하고, 다른 한편으로 20 mM의 트리스 염기, 150 mM의 글리신 및 20%의 에탄올로된 완충액에서 멤브레인 cm2당 2.3 mA인 반건조 전기전이 (Transblot SD, BIORAD)의 기술로 니트로셀룰로스 멤브레인 상에 전이하였다. 니트로셀룰로스 멤브레인 상에 전이된 재조합 개 위장 리파제를 아래 프로토콜에 따른 면역검출법으로 검출하였다.
- 탈지유 분말을 5% 및 트윈 20을 0.1%의 양으로 첨가한, PBS 완충액으로 1/5,000으로 희석한, 기니아 피그에서 생성된 개의 위장 항-리파제 폴리클로날 항체로 실온에서 1시간 동안 목적 단백질을 표지하고,
- 탈지유 분말을 1% 및 트윈 20을 0.1%의 양으로 첨가한, PBS 완충액의 연속적인 3개의 조에서 각 조마다 10분씩 멤브레인을 세척하고,
- 탈지유 분말을 1% 및 트윈 20을 0.1%의 양으로 첨가한, PBS 완충액 중에 1/2,000으로 희석된 페록시다제 (시그마)에 결합된 항-기니아 피그 항체로 실온에서 1시간 동안 표지하고,
- 탈지유 분말을 1% 및 트윈 20을 0.1%의 양으로 첨가한, PBS 완충액의 연속적인 3개의 조에서 각 조마다 10분씩 멤브레인을 세척하고,
- 시간 경과에 따라 안정한 청색 착색을 생성시키는 H2O2의 존재하에서 4-클로로-1-나프톨 (시그마)에 대한 페록시다제의 작용에 의한 검출.
잎에서 생성된 리파제는 약 49 (폴리펩티드 (Δ4)) kDa 및 37 (폴리펩티드 (Δ54)) kDa의 2개 밴드를 형성하였다.
b) 담배 잎으로부터 DGL의 정제를 위한 변이체.
담배 잎에서 생성된 개 위장 리파제에 대한 활성을 pH-스태트 (METTLER-TOLEDO-DL25)를 이용하는, 가고리 등 (1986)이 설명한 적정법으로써 측정하였다.
단쇄 트리글리세라이드에 대한 분석은 기질로서 트리부티린을 사용하여 실시하였다. 1 ml의 트리부티린을 0.15 M NaCl, 0.5 μM의 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM의 타우로데옥시콜릭산나트륨 (NaTDC)으로된 수용액 29 ml에서 유화시켰다. 조절된 pH를 5.0 및 온도를 37℃로 유지하였다.
왕성한 기계적 교반으로 에멀젼을 유지하는 한편, 분석은 리파제의 작용하에서 0.02 N의 탄산나트륨을 첨가함으로써 유리된 부티르산을 중화시키는 것을 포함하였다.
장쇄 트리글리세라이드에 대한 분석은 기질로서 30% 정제된 대두유, 1.2%의 정제된 계란 인지질, 1.67%의 무수 글리세롤 (IntralipidTM30%-스웨덴 스톡홀름에 소재한 PHRMACIA AB사로부터 구입)을 사용한 수에멀젼을 사용하여 실시하였다. 이 현탁액 10 ml를 0.15 M NaCl, 30 μM BSA 및 3.5 mM CaCl2로된 수용액 20 ml에서 유화시켰다. 조절된 pH를 4.0 및 온도를 37℃로 유지하였다.
왕성한 기계적 교반으로 에멀젼을 유지하는 한편, pH를 4에서 9로 점프한 후, 분석은 리파제의 작용하에서 0.2 N의 탄산나트륨의 첨가에 의해 유리된 지방산을 중화시키는 것으로 구성되었다.
1 단위 리파제는 각각의 pH 및 온도에 대해 정의된 조건하에서 분당 유리된 1 마이크로몰의 지방산에 대응하였다.
2 g의 동결건조된 잎을 4℃에서 pH 3인 0.2 M NaCl 60 ml에서 분쇄하였고 혼합물을 4℃에서 15분 동안 완만하게 교반하였다. 완충액에 담궈두는 동안, 1 N의 HCl을 첨가하여 pH를 3으로 유지시켰다. 완충액에 담궈둔 생성물 (균질물)을 10분간 10,000 g로 원심분리하였다. 미라클로스(MIRACLOTH) 및 0.45 μ 밀리포어(MILLIPORE) 여과기로 여과한 후, 모든 상등액을 8 ml/분 (240 cm h-1)의 유속에서 20 mM 아세트산나트륨 및 0.2 M NaCl로된 pH 3인 완충액에서 평형된 양이온 교환 수지 칼럼 (RESOURCE S 6 ml-약전-16 mm i.d.×30 mm)에 주입하였다.
보유되지 않은 분획의 통과 후, 평형 완충액을 칼럼의 부피로 사용하여 칼럼을 30회 세척하였다. 칼럼 상에 보유된 단백질을 7개의 칼럼 부피로 0.2 내지 0.5 M의 NaCl의 pH 3인 20 mM 아세트산나트륨 완충액에서 선형 구배로 용출하였다. 4 ml의 분획을 수집하였다.
0.5 ml의 분석 시료 상에서 측정한 리파제 활성도는 0.35 M NaCl의 이온 강도에서 용출하였다.
활성 분획을 수집하고 30 kDa의 분자량 한계를 가지는 오메가셀 농축 셀(Filtron Technology Corporation)을 이용하여 농축하였다.
단백질 농축에 대한 측정은 오.에이치. 라우리법 (1951)에 따라서 실시하였다.
니트로셀룰로스 멤브레인 상으로 폴리아크릴아미드 겔의 실시예 및 이 겔의 전이 결과 및 개 위장 항-리파제 항체로부터의 검출을 나타내었고 (도 9 및 10), 활성화제 (ECL 웨스턴 블로팅-AMERSHAM LIFE SCIENCE)의 존재하에서 루미놀(Luminol) 상에서 페록시다제의 작용에 의해 검출을 실시하고 사진 필름에 기록하였다.
- 단백질의 글리칸 잔기의 존재를 아래의 프로토콜에 따라 측정하였다:
·마이크로셀룰로스 멤브레인 상에 단백질의 고정화
·페리오데이트로 처리
·알칼리 포스파타제와 결합된 스트렙타비딘과의 특정 반응
·알칼리 포스페이트 (GLYCOTRACK OXFORD GLYLOSYSTEM)와 착색 반응.
글리칸 잔기의 멤브레인 검출의 예를 나타내었다 (표 11).
고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 분획의 순도를 확실히 하였다.
크로마토그래프 워터스 625 엘씨 (WATERS 625 LC)
다이오드 정렬 검출기 워터스 991 (WATERS 991)
칼럼 비다크 씨4 (VYDAC C4)
용출 조건:
시간 (분) 유속 (ml/분) % A % B
0 1 100 0
35 1 40 60
40 1 40 60
45 1 20 80
50 1 100 0
버퍼 A: 89.9% H2O, 10% 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산버퍼 B: 100% 아세토니트릴
정제 표: 재조합 DGL
총단위* 단백질의 mg 비활성도 정제 인자 수율
균질액 3200 / / / /
상등액 2800 230 13 1 88%
배출물 S 1600 6 250 20 50%
* 트리부티린 단위
천연 개 위장 리파제 (n-DGL) 및 재조합 개 위장 리파제 (r-DGL)에 대한 비교 비활성도
n-DGL* 담배 잎으로부터의 r-DGL 추출물
트리부티린 570 U/mg 250 U/mg
인트라리피드 30% 1000 U/mg 950 U/mg
* 문헌 [Carriere et al (1991) Eur. J. Biochem,202, 75-83]을 참고
c) 평지씨로부터의 DGL에 대한 정제
평지씨에서 생성된 재조합 DGL에 대한 활성을 잎으로부터 추출한 경우와 동일한 방법으로 측정하였다.
평지씨 10 g을 액체 질소에서 분쇄하였다. 생성된 분말을 12시간 동안 완만히 교반하면서 4℃에서 첫 번째 담금으로써 헥산으로 탈지하였다. 전량을 따라내고, 헥산을 제거하였다. 분말을 각 헹굼마다 4℃에서 1/2시간 동안 완만히 교반하면서 100 ml의 헥산으로 두번 헹구었다. 헥산을 따라내어 제거하였다. 분말을 회전식 증발기 (HEIDOLPH 94200)에서 건조시켰다. 탈지된 분말을 -20℃에서 저장하였다.
DGL의 추출은 분말 0.1 g 당 수용액 2 ml의 속도로 30분간 pH 3 (1 N HCl)인 NaCl 0.2 M의 수용액에 4℃에서 침지시켜 탈지된 분말로부터 실시하였다. 침지에 의한 생성물을 4℃에서 10분간 10,000 g으로 원심분리하였다.
펠렛을 제거하였다. 상등액은 종자 추출물을 구성하였다.
종자 추출물을 10 mM의 아세트산나트륨, 140 mM의 NaCl, 3 mM의 KCl로된 pH 4의 완충액에 대해 투석한 다음 수지 (히드라지드 아비드겔-BIOPROBE INTERNATIONAL, Inc.)에 결합된 기니아 피그로부터 생성된 개의 위장 항-리파제 폴리클로날 항체로 구성된 면역친화성 칼럼에 적용하였다.
수지/종자 추출물 접촉을 4℃에서 완만히 교반하면서 30분 동안 실시하였다. 그 다음 수지를 10 mM의 아세트산나트륨, 150 mM의 NaCl, 3 mM의 KCl의 pH 4의 완충액 10 칼럼 부피로 헹구었다. 0.2 M의 글리신, 150 mM의 NaCl의 pH 2.8의 완충액 5 칼럼 부피로 DGL을 추출하였다. 수집된 분획은 1 칼럼 부피와 동등한 부피를 가지고 pH 9인 1 M 트리스 완충액의 1/20th V/V를 함유하였다. 변성 매체에서 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동에 의한 분석 (도 12 참고)은 단백질의 분자량이 약 37 kDa임을 보여준다.
XII. 지방산 에스테르의 합성.
- 고정되었거나 (리포자임 (NOVO)) 고정되지 않은 (쥐 위장 리파제 (JO 4002)) 효소 제제의 형태이거나,
- 개 위장 리파제 (담배 T14-44 0.85% 발현)의 유전자로 형질전환된 토마토 종자의 형태로 공급되는 리파제에 대한 시험을 비형질전환된 평지씨로 수행하였다.
교반 벤치 (250 rpm)에 위치한 밀봉 마개의 유리병에서 16시간 동안 37℃에서 에스테르화 반응을 수행하였다. 지방산을 용해하는 유기 용매로는 헥산을 사용하였다. 평지씨에 함유된 트리아실글리세롤의 이론량에 관한 화학양론적으로 메탄올을 첨가하였다.
평지의 지방산 중 주성분은 올레산이고, 또한 선택된 비교 대조군은 올레산의 메틸 에스테르이다. 박층 크로마토그래피 (TLC)로 합성을 관찰하였다. 이동 용매는 헥산, 디에틸에테르 및 물 (70:10:1)의 혼합물이었다. 황산 (5%)을 함유하는 에탄올을 분무 후 고온 조건하에서 플레이트 상의 검출을 실시하였다.
첫째 시험에서, 27 ㎕의 메탄올 (0.66 mmol) 및 0.02 g의 리포자임을 0.2 g (0.22 mmol)의 평지 오일에 첨가하였다. 참고 메틸 올레이트의 수준에서 점이 나타나지 않았다 (도 13, 칼럼 2).
둘째 시험에서, 평지 오일을 건조 상태에서 평지씨 분쇄물 0.5 g으로 대체하고, 1 ml의 헥산을 첨가하였다. 메틸 에스테르를 합성하였다 (도 13, 칼럼 5).
그 다음 시험에서, 아래의 변형으로 위의 조건을 반복하였다. 리포자임의 양을 0.006 g으로 감소시키고 리포자임을 토끼 위장 리파제 (JO 4002) 0.007 g으로 대체하였다. 메틸 올레이트를 JO 4002가 아닌 리포자임의 존재하에서 합성하였다 (도 14, 칼럼 2).
끝으로, 최종 시험에서는 형질전환된 담배 종자 (담배 종자 1 g)로 리파제를 공급하였다. 메틸 에스테르의 특성을 갖는 점이 나타났다 (도 15, 칼럼 3).
결론적으로, 상기 결과는 평지씨 추출물, 알콜 및 트랜스제닉 담배에 의해 생성된 재조합 개 위장 리파제가 함께 존재할 경우, 생체 연료로서 사용될 수 있는 메틸 에스테르의 합성을 야기하는 에스테르화 반응을 얻을 수 있다는 것을 설명하였다.
도면에 대한 설명:
- 도 1: DGL을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열,
- 도 2: DGL의 아미노산 서열,
- 도 3: 도 2에 나타낸 DGL을 코딩하는, DGL을 코딩하는 cDNA로부터 유도된 뉴클레오티드 서열,
- 도 4: HGL을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 HGL의 아미노산 서열,
- 도 5: HGL의 아미노산 서열,
- 도 6: 구조체 pBIOC26, pBIOC25 및 pBIOC29로 형질전환된 크산티 담배 잎 및 종자 및 평지씨에 의해 생성된 재조합 폴리펩티드의 면역검출; E, 분자량 범위; LC, 개 위장 리파제; F, 구조체 pBIOC25로 형질전환된 담배 잎 및 GT, 담배 종자; GC, 구조체 pBIOC29로 형질전환된 평지씨; T, 비형질전환된 담배 잎,
- 도 7: 구조체 pBIOC25 및 pBIOC41로 형질전환된 담배 잎에 의해 생성된 재조합 폴리펩티드의 면역 검출; E, 분자량 범위; LC, 개 위장 리파제; 1 및 3, 구조체 pBIOC41로 형질전환된 담배 잎; 2, 구조체 pBIOC25로 형질전환된 담배 잎; T, 비형질전환된 담배 잎,
- 도 8: 구조체 pBIOC25 및 pBIOC26으로 형질전환된 토마토 잎 및 과실에 의해 생성된 재조합 폴리펩티드의 면역검출:
T1: 비형질전환된 토마토 과실
1 및 3: 형질전환된 토마토 과실
2: 형질전환된 토마토 잎
R: 분자량 범위
LC: 개 위장 리파제
T2: 비형질전환된 토마토 잎.
- 도 9: 비변성 매체에서 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 전기 영동에 의한 분석 (SDS-PAGE).
1: 평지씨 추출물, 2: 담배 잎에서 생성된 재조합 개 위장 리파제
3: 천연 개 위장 리파제, 4: 분자량 범위.
- 도 10: 니트로셀룰로스 멤브레인 상에 전이한 후 전술한 분석의 면역학적 검출
1: 천연 개 위장 리파제, 2: 담배 잎에서 생성된 재조합 개 위장 리파제
3: 평지씨 추출물.
- 도 11: 니트로셀룰로스 멤브레인 상으로 전이한 후 폴리아크릴아미드 겔로부터 글리칸 잔기의 존재 검출
1: 평지씨 추출물, 2 : 담배 잎에서 생성된 재조합 개 위장 리파제
3: 천연 개 위장 리파제.
- 도 12: 평지씨에서 생성된 r-DGL의 면역정제의 SDS-PAGE 분석
1: 천연 개 위장 리파제, 2: 재조합 개 위장 리파제
3 내지 6: 면역정제 칼럼으로부터 용출된 보유되지 않은 분획.
- 도 13: TLC 플레이트 상에서 검출; 1: 평지 오일, 효소 무; 2: 평지 오일 + 리포자임; 3: 올레산의 메틸 에스테르; 4: 평지씨, 효소 무; 5: 평지씨 + 리포자임,
- 도 14: TLC 플레이트의 검출; 1 및 4: 효소가 없는 평지씨; 2: 평지씨 + JO4002; 3: 올레산의 메틸 에스테르; 5: 평지씨 + 리포자임,
- 도 15: TLC 플레이트 상에서 검출; 1: 모노올레인, 디올레인, 트리올레인; 2: 올레산의 메틸 에스테르; 3: 평지씨 + 형질전환된 담배 종자.
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Volhard F., Z. Klin. Med.,42,414-429 (1901).
〈서열표〉
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인:
(A) 이름: 바이오켐 에스.아.
(B) 거리: 애비뉴 데 랑데 24
(C) 도시: 오비에레
(E) 국가: 프랑스
(F) 우편번호: 63170
(A) 이름: 엥스티투 드 레세르세 쥬베이날
(B) 거리: 뤼 드 라 로그 3-9
(C) 도시: 프레스네 세덱스
(E) 국가: 프랑스
(F) 우편번호: 94265 세덱스
(ii) 발명의 명칭: 식물에 의해 생성된 재조합 전십이지장 리파제 및 폴리펩티드 유도체, 그의 제조 방법 및 그의 용도
(iii) 서열수: 6
(iv) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.25 (EPO)
(vi) 선행 출원 데이타:
(A) 출원 번호: FR 9504754
(B) 출원일: 1995년 4월 20일
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1528 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 1..1137
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 379 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1048 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 1..975
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 325 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1198 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: cDNA 내지 mRNA
(ix) 특징:
(A) 이름/키: CDS
(B) 위치: 1..1125
(xi) 서열 설명:
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 375 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 설명:

Claims (33)

  1. 한편으로는 임의의 포유동물 전십이지장(preduodenal) 리파제, 즉 뉴클레오티드 서열이 약 75% 이상, 특히 약 77% 내지 85%의 상동성을 갖고 아미노산 서열이 70% 이상, 특히 약 80% 내지 약 90%의 상동성을 가지며, 약 1 내지 약 5, 특히 약 1.5 내지 약 2의 pH에서 내산성 및 활성을 갖는 특성을 갖는 임의의 포유동물 전십이지장 리파제를 코딩하는 cDNA, 보다 구체적으로는 임의의 포유동물 위장 리파제를 코딩하는 cDNA, 또는 전십이지장 리파제의 상기 특성을 갖는 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 전십이지장 리파제로부터 유도된 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA, 다른 한편으로는 식물 세포가 상기 cDNA에 의해 코딩되는 전십이지장 리파제를 생성하도록 하거나 상기 정의된 유도된 폴리펩티드를 생성하도록 하는 성분, 특히 식물 세포의 전사 기구에 의해 인식되는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열의, 형질전환된 식물 세포 또는 이 세포로부터 수득된 식물로부터 활성 효소 형태의 포유동물 재조합 전십이지장 리파제 또는 상기 정의된 1종 (이상의) 폴리펩티드(들)을 수득하기 위해 식물 세포를 형질전환시키기 위한 용도.
  2. 제1항에 있어서, 한편으로는 도 2에 도시한 개 위장 리파제 (DGL)를 코딩하는 도 1에 도시한 cDNA, 또는 1종 (이상의) 뉴클레오티드(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 cDNA로부터 유도된, 도 2에 도시한 DGL의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 DGL로부터 유도된, 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드, 다른 한편으로는 식물 세포가 상기 cDNA 또는 상기 유도된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 생성하도록 하는 성분, 특히 식물 세포의 전사 기구에 의해 인식되는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열의, 형질전환된 식물 세포 또는 이 세포로부터 수득된 식물로부터 활성 효소 형태의 재조합 DGL 또는 상기 정의된 1종 (이상의) 유도된 폴리펩티드(들)을 수득하기 위해 식물 세포를 형질전환시키기 위한 용도.
  3. 제1항에 있어서, 한편으로는 도 5에 도시한 인간 위장 리파제 (HGL)를 코딩하는 도 2에 도시한 cDNA, 또는 1종 (이상의) 뉴클레오티드(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 cDNA로부터 유도된, 도 5에 도시한 HGL의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 HGL로부터 유도된, 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드, 다른 한편으로는 식물 세포가 상기 cDNA 또는 상기 유도된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 생성하도록 하는 성분, 특히 식물 세포의 전사 기구에 의해 인식되는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열의, 형질전환된 식물 세포 또는 이 세포로부터 수득된 식물로부터 활성 효소 형태의 재조합 HGL 또는 상기 정의된 1종 (이상의) 유도된 폴리펩티드(들)을 수득하기 위해 식물 세포를 형질전환시키기 위한 용도.
  4. 한편으로는 도 2에 도시한 개 위장 리파제 (DGL)를 코딩하는 도 1에 도시한 cDNA, 또는 1종 (이상의) 뉴클레오티드(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 cDNA로부터 유도된, 도 2에 도시한 DGL의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 DGL로부터 유도된, 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드, 다른 한편으로는 식물 세포가 상기 cDNA 또는 상기 유도된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 생성하도록 하는 성분, 특히 식물 세포의 전사 기구에 의해 인식되는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  5. 한편으로는 도 5에 도시한 인간 위장 리파제 (HGL)를 코딩하는 도 2에 도시한 cDNA, 또는 1종 (이상의) 뉴클레오티드(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 cDNA로부터 유도된, 도 5에 도시한 HGL의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 뉴클레오티드 서열, 또는 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 HGL로부터 유도된, 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드, 다른 한편으로는 식물 세포가 상기 cDNA 또는 상기 유도된 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 생성하도록 하는 성분, 특히 식물 세포의 전사 기구에 의해 인식되는 전사 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  6. 제4항 또는 5항에 있어서,
    - 상기 cDNA 또는 그의 유도된 서열의 하류에 꽃양배추 모자이크 바이러스 (CaMV)의 터미네이터 폴리A 35S 또는 아그로박테리움 투메파시엔스의 터미네이터 폴리A NOS를,
    - 상기 cDNA 또는 그의 유도된 서열의 상류에 CaMV의 프로모터 35S 또는 이중가닥 프로모터 35S (pd35S), 또는 무의 크루시페린 유전자의 프로모터 pCRU, 또는 아라비돕시스 탈리아나의 프로모터 pGEA1 또는 pGEA6, 또는 아그로박테리움 투메파시엔스의 키메라-프로모터 pSP, 또는 벼의 프로모터 pAR-IAR, 또는 옥수수의 프로모터 pγzeine를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  7. 제4항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 DGL 및(또는) 유도된 폴리펩티드(들)을 식물 세포의 특정 기관으로 향하게 하는 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  8. 제4항, 6항 및 7항 중의 어느 한 항에 있어서,
    - 5'→3' 방향으로 CaMV의 프로모터 pd35S, 스포라민 A의 신호 펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 3에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pd35S-PS-DGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 CaMV의 프로모터 pd35S, 스포라민 A의 프리프로펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 3에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pd35S-PPS-DGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 CaMV의 프로모터 pd35S, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (명세서의 실시예에 나타낸 마지막 3개의 C-말단 아미노산을 코딩하는 9개의 뉴클레오티드가 억압된 최초의 19개 아미노산으로 구성된 서열), 이 서열 직후의 도 1에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pd35S-RGLSP-DGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 크루시페린의 프로모터 pCRU, 스포라민 A의 신호 펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 3에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pCRU-PS-DGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 크루시페린의 프로모터 pCRU, 스포라민 A의 프리프로펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 3에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pCRU-PPS-DGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 크루시페린의 프로모터 pCRU, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pCRU-RGLSP-DGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 아라비돕시스 탈리아나의 프로모터 pGEA1, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pGEA1-RGLSP-DGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 아라비돕시스 탈리아나의 프로모터 pGEA6, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pGEA6-RGLSP-DGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 벼의 프로모터 pAR-IAR, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S 또는 아그로박테리움 투메파시엔스의 터미네이터 폴리A NOS를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pAR-IAR-RGLSP-DGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 옥수수의 프로모터 pγzeine, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pγzeine-RGLSP-DGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 옥수수의 프로모터 pγzeine, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 (상기와 동일), 이 서열 직후의 도 1 또는 도 3에 도시한 cDNA, 테트라펩티드 KDEL을 코딩하는 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL로 칭함)
    로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  9. 제5항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 5'→3' 방향으로 아그로박테리움 투메파시엔스의 프로모터 pSP, HGL의 신호 펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 4에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pSP-HGLSP-HGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 아그로박테리움 투메파시엔스의 프로모터 pSP, HPL의 신호 펩티드를 코딩하는 서열, 이 서열 직후의 도 4에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pSP-HPLSP-HGL로 칭함),
    - 5'→3' 방향으로 아그로박테리움 투메파시엔스의 프로모터 pSP, RGL의 신호 펩티드의 일부를 코딩하는 서열(제8항에서 설명됨), 이 서열 직후의 도 4에 도시한 뉴클레오티드 서열 및 CaMV의 터미네이터 폴리A 35S를 순서대로 포함하는 뉴클레오티드 서열 (pSP-RGLSP-HGL로 칭함)
    로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 뉴클레오티드 서열.
  10. 그의 복제에 필수적이지 않은 부위에 제4항, 6항, 7항 또는 8항 중의 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 특히 플라스미드.
  11. 그의 복제에 필수적이지 않은 부위에 제5항, 6항, 7항 또는 9항 중의 어느 한 항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 특히 플라스미드.
  12. 제10항 또는 11항에 따른 벡터에 의해 형질전환된 세포 숙주, 특히 아그로박테리움 투메파시엔스와 같은 세균.
  13. - 그 자체가 제10항에 따른 벡터에 의해 형질전환된 제12항에 따른 세포 숙주의 도움으로 제4항, 6항, 7항 및 8항 중의 어느 한 항에 따른 재조합 서열이 식물 세포의 게놈 내에 통합되는 방식으로 식물 세포를 형질전환시키는 단계,
    - 적합한 경우, 상기 형질전환된 세포로부터 형질전환된 식물을 생성시키는 단계,
    - 상기 세포 또는 상기 형질전환된 식물에서 생성된 재조합 DGL 및(또는) 특히 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 재조합 DGL로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드(들)을 특히 추출에 의해, 적합한 경우 추출 후 정제에 의해 회수하는 단계
    로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 활성 효소 형태의 재조합 DGL 또는 상기 방법에 의해 재조합 DGL로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드(들)의 제조 방법.
  14. - 그 자체가 제11항에 따른 벡터에 의해 형질전환된 제12항에 따른 세포 숙주의 도움으로 제5항, 6항, 7항 및 9항 중의 어느 한 항에 따른 재조합 서열이 식물 세포의 게놈 내에 통합되는 방식으로 식물 세포를 형질전환시키는 단계,
    - 적합한 경우, 상기 형질전환된 세포로부터 형질전환된 식물을 생성시키는 단계,
    - 상기 세포 또는 상기 형질전환된 식물에서 생성된 재조합 HGL 및(또는) 특히 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 재조합 HGL로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드(들)을 특히 추출에 의해, 적합한 경우 추출 후 정제에 의해 회수하는 단계
    로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 활성 효소 형태의 재조합 HGL 또는 상기 방법에 의해 재조합 HGL로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드(들)의 제조 방법.
  15. 안정한 방식으로 그의 게놈 내에 통합된 제4항 내지 9항 중의 어느 한 항에 따른 1종 (이상의) 재조합 뉴클레오티드(들), 및 적합하게는 재조합 DGL 및(또는) 재조합 HGL 및(또는) 1종 (이상의) 유도된 폴리펩티드(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 효소 활성, 특히 리파제 활성을 갖는 유전적으로 형질전환된 평지, 담배, 옥수수, 완두콩, 토마토, 당근, 밀, 보리, 감자, 대두, 해바라기, 상추, 벼, 자주개자리 및 사탕무우로부터 선택되는 식물, 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자 및(또는) 식물 세포.
  16. 수득된 효소 추출물에 대하여 실시하는 크로마토그래피에 의한 재조합 DGL 및(또는) 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 재조합 DGL로부터 유도된 폴리펩티드(들)의 정제 단계를 포함하는 제13항의 방법의 실시에 의해 필수적으로 순수한 형태로 수득되는, 도 2에 도시한 아미노산 서열의 효소 활성을 갖는 재조합 DGL, 또는 도 2의 위치 55 내지 379의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 (Δ54), 도 2의 위치 5 내지 379의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 (Δ4)와 같은, 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 재조합 DGL로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드.
  17. 수득된 효소 추출물에 대하여 실시하는 크로마토그래피에 의한 재조합 HGL 및(또는) 도 5의 위치 74 내지 398의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 (Δ54HGL), 도 5의 위치 24 내지 398의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 (Δ4HGL)와 같은, 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 재조합 HGL로부터 유도된 폴리펩티드(들)의 정제 단계를 포함하는 제14항의 방법의 실시에 의해 필수적으로 순수한 형태로 수득되는, 도 5에 도시한 아미노산 서열의 효소 활성을 갖는 재조합 HGL, 또는 1종 (이상의) 아미노산(들)의 첨가 및(또는) 억제 및(또는) 치환에 의해 상기 재조합 HGL로부터 유도된 리파제 활성을 갖는 폴리펩티드.
  18. 재조합 DGL 및(또는) 제16항에 정의된 폴리펩티드 (Δ54) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4)와 같은 1종 (이상의) 유도된 폴리펩티드(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제13항에 따른 방법의 실시에 의해 수득되는 효소 활성을 갖는 식물 추출물.
  19. 재조합 HGL 및(또는) 제17항에 정의된 폴리펩티드 (Δ54HGL) 및(또는) 폴리펩티드 (Δ4HGL)와 같은 1종 (이상의) 유도된 폴리펩티드(들)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제14항에 따른 방법의 실시에 의해 수득되는 효소 활성을 갖는 식물 추출물.
  20. 제18항 또는 19항에 있어서, 효소 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드의 중량%가 상기 추출물에 존재하는 단백질의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.1% 내지 20%, 특히 약 1% 내지 15%로서, 약 0.5 U 내지 약 1,000 U/g (잎의 생 중량 (FM)), 특히 약 10 U/g (FW) 내지 약 300 U/g (FW), 또는 약 1 U 내지 약 5,000 U/g (종자의 FM), 특히 약 10 U/g (FW) 내지 약 1,000 U/g (FW)의 측정치에 대응하는 것을 특징으로 하는 효소 활성을 갖는 식물 추출물.
  21. 건강한 개체 또는 위장 및(또는) 췌장 리파제의 생성 수준에 영향을 주거나 영향을 주지 않을 수 있는 1종 이상의 병변으로 고통받는 개체, 특히 지방 흡수의 기작을 변경시키는 의료 처치를 받고 있는 개체 또는 연로자에 의해 소화되는 동물성 또는 식물성 지방의 흡수를 촉진하기 위한 의약, 특히 개체에서의 리파제(특히 위장 및(또는) 췌장 리파제) 부족에 관련된 병변, 특히 낭포성 섬유증 및 췌장 외분비 부족과 같은 병변의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 제15항에 따른 유전적으로 형질전환된 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자, 또는 식물 세포, 또는 제16항에 따른 재조합 DGL 또는 이로부터 유도된 폴리펩티드, 또는 제17항에 따른 재조합 HGL 또는 이로부터 유도된 폴리펩티드, 또는 제18항 내지 20항 중 어느 한 항에 따른 효소 추출물의 용도.
  22. 제16항 또는 17항에 따른 재조합 DGL 및(또는) HGL 및(또는) 1종 (이상의) 유도된 폴리펩티드(들), 및(또는) 제18항 내지 20항 중 어느 한 항에 따른 1종 (이상의) 효소 추출물을, 적합한 경우 제약상 허용되는 부형제와 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
  23. 식품, 특히 건강한 개체 또는 위장 및(또는) 췌장 리파제의 생성 수준에 영향을 주거나 영향을 주지 않을 수 있는 1종 이상의 병변으로 고통받는 개체에 의해 소화되는 동물성 또는 식물성 지방의 흡수를 촉진하기 위한 기능성 식품의 제조를 위한, 제15항에 따른 유전적으로 형질전환된 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자, 또는 식물 세포, 또는 제16항에 따른 재조합 DGL 또는 이로부터 유도된 폴리펩티드, 또는 제17항에 따른 재조합 HGL 또는 이로부터 유도된 폴리펩티드, 또는 제18항 내지 20항 중의 어느 한 항에 따른 효소 추출물의 용도.
  24. 제15항에 따른 1종 (이상의) 식물(들) 또는 이 식물의 일부, 및(또는) 제16항 또는 제17항에 따른 재조합 DGL 및(또는) 재조합 HGL 및(또는) 이로부터 유도된 1종 (이상의) 폴리펩티드(들) 및(또는) 제18항 내지 20항 중의 어느 한 항에 따른 1종 (이상의) 효소 추출물(들)을 포함하는 기능성 식품.
  25. 산업적, 비료 또는 농업 관련 산업 분야, 특히 지방 산업, 지방화학 및 유산업에서의 효소 반응을 수행하기 위한, 제15항에 따른 유전적으로 형질전환된 식물, 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자 또는 식물 세포 또는 제16항에 따른 재조합 DGL 또는 이로부터 유도된 폴리펩티드, 또는 제17항에 따른 재조합 HGL 또는 이로부터 유도된 폴리펩티드, 또는 제18항 내지 20항 중의 어느 한 항에 따른 효소 추출물의 용도.
  26. 산업적, 비료 또는 농업 관련 산업 분야, 특히 지방 산업, 지방화학 및 유산업에서의 제15항에 따른 유전적으로 형질전환된 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자, 또는 식물 세포, 또는 제16항에 따른 재조합 DGL 또는 이로부터 유도된 폴리펩티드, 또는 제17항에 따른 재조합 HGL 또는 이로부터 유도된 폴리펩티드, 또는 제18항 내지 20항 중의 어느 한 항에 따른 효소 추출물에 의해 수행되는 1종 이상의 효소 반응의 수행에 의한, 효소에 의한 생체 물질 전환 또는 생체 촉매 작용 방법.
  27. 제18항 내지 20항 중의 어느 한 항에 따른 효소 활성을 갖는 1종 (이상의) 효소 추출물(들) 및(또는) 제16항 또는 제17항에 따른 재조합 DGL 및(또는) 재조합 HGL 및(또는) 이로부터 유도된 1종 (이상의) 폴리펩티드(들)을 포함하고 제26항에 따른 방법에 사용될 수 있는 산업적, 비료 또는 농업 관련 산업적 용도를 위한 효소 제제.
  28. 산업적 규모로 효소에 의한 가수분해 또는 에스테르 이전 반응과 같은 효소에 의한 생체 물질 전환 반응 또는 생체 촉매 작용을 실시하기 위한, 제15항에 따른 유전적으로 형질전환된 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자 또는 식물 세포의 용도.
  29. 효소 공급원과 반응 기질 모두로서 사용되는 제15항에 따른 유전적으로 형질전환된 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자 또는 식물 세포를 사용하는 생체 촉매 작용 방법.
  30. 제15항에 따른 유전적으로 형질전환된 식물 또는 식물의 일부, 특히 잎 및(또는) 과실 및(또는) 종자 또는 식물 세포의 생체 연료 제조를 위한 용도.
  31. 알콜, 특히 메탄올 또는 에탄올을 제15항에 따른 유전적으로 형질전환된 식물의 전부 또는 일부의 분말재에 첨가하고 생체 연료를 특히 여과에 의해 회수하는 단계에 의한 생체 연료의 생산 방법.
  32. 제31항에 따른 방법의 실시에 의해 수득되는, 식물 지방산의 에스테르, 특히 올레산의 메틸 에스테르.
  33. 식물 지방산의 에스테르, 특히 올레산의 메틸 에스테르를 포함하는, 제31항에 따른 방법의 실시에 의해 수득되는 생체 연료.
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