ES2256858T3

ES2256858T3 - Lipasas preduodenales y polipeptidos derivados producidos por las plantas, sus procesos de obtencion y sus usos.

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Publication number: ES2256858T3
Application number: ES96915066T
Authority: ES
Inventors: Philippe Lenee; Veronique Residence Sainte-Madeleine Gruber; Sylvie Baudino; Bertrand Merot; Claude Benicourt; Claire Cudrey
Original assignee: Meristem Therapeutics SA
Current assignee: Meristem Therapeutics SA
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2006-07-16
Anticipated expiration: 2016-04-19
Also published as: WO1996033277A3; BR9608011A; WO1996033277A2; NZ307579A; CN1185178A; CZ330997A3; ZA963146B; BG101959A; TR199701207T1; KR19990007901A; US20040072317A1; US6573431B1; HUP9801438A2; AU718905B2; JPH11504207A; PL322874A1; AU5696796A; BG64320B1; PL186586B1; JP2007325590A

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LA UTILIZACION DE SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS RECOMBINANTES QUE CONTIENEN EL ADNC QUE CODIFICA UNA LIPASA PREDUODENAL, O CUALQUIER SECUENCIA DERIVADA DE ESTE ADNC, PARA LA TRANSFORMACION DE CELULAS VEGETALES CON OBJETO DE OBTENER LIPASA PREDUODENAL RECOMBINANTE, O POLIPEPTIDOS DERIVADOS. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A LA UTILIZACION DE LAS PLANTAS, O PARTES DE PLANTAS, GENETICAMENTE TRANSFORMADAS, O DE EXTRACTOS DE ESTOS VEGETALES, O DE LIPASA PREDUODENAL RECOMBINANTE O POLIPEPTIDOS DERIVADOS OBTENIDOS, EN EL CAMPO DE LA ALIMENTACION, O PARA OBTENER MEDICAMENTOS, O EN EL CAMPO INDUSTRIAL.

Description

Lipasas preduodenales y polipéptidos derivados producidos por las plantas, sus procesos de obtención y sus usos.

La presente invención tiene se refiere a la producción, por parte de plantas, de lipasas preduodenales recombinantes, en particular de lipasas gástricas recombinantes, y a otros derivados polipeptídicos de de estas últimas que poseen una actividad lipásica, y a sus usos, en particular como alimentos funcionales o en composiciones farmacéuticas o en formulaciones enzimáticas para aplicaciones agro-alimentarias o industriales.

La lipasa gástrica del perro (LGC) es una glicoproteína de 379 aminoácidos (AA) que tiene un peso molecular de aproximadamente 50 kilodalton (kDa), la cual se sintetiza en forma de un precursor que contiene un péptido señal en el extremo amino-terminal (NH_{2}-terminal), y que es secretada por células medianas de la mucosa del fundus del estómago del perro (Carriere F. et al., 1991).

La lipasa gástrica humana (LGH) se sintetiza naturalmente en forma de un precursor y se describe en la publicación por Bodmer et al., 1987. La proteína LGH madura está constituida por 379 aminoácidos. Su péptido señal (PSLGH) está compuesto por 19 aminoácidos.

Estos enzimas pertenecen a la familia de lipasas denominada "preduodenal", algunos miembros de la cual ya han sido purificado y, en algunos casos, incluso clonados (Docherty A.J.P. et al., 1985; Bodmer M. W. et al., 1987; Moreau H. et al., 1988; Patentes Europeas nº 0 191 061 y nº 0 261 016).

Durante mucho tiempo, se ha dado por cierto que la hidrólisis de los lípidos alimentarios se efectuaba en el intestino delgado gracias a la acción de enzimas producidos por el páncreas (Bernard C., 1849).

Sin embargo, ciertas observaciones permiten pensar ahora que la hidrólisis de los triglicéridos pudiera tener lugar en el estómago por la acción indirecta de los enzimas preduodenales (Volhard, F., 1901; Shonheyder, F., y Volquartz, K., 1945). Estos enzimas, y en particular la lipasa gástrica del perro, tienen propiedades enzimáticas y fisicoquímicas que los diferencia de las lipasas pancreáticas de mamíferos. Estas diferencias entre lipasas gástricas y pancreáticas concierne esencialmente a los puntos siguientes: peso molecular, composición en aminoácidos, resistencia a la pepsina, especificidad de sustrato, pH óptimo de acción, y estabilidad en medio ácido.

Además, in vitro, en ciertas condiciones, es posible demostrar una acción sinérgica entre las lipasas gástricas y pancreáticas sobre la hidrólisis de triglicéridos de cadena larga (Gargouri, Y. et al., 1989).

Se conocen varias situaciones patológicas (fibrosis cística, insuficiencia pancreática exocrina) en las que los pacientes total o parcialmente carecen de secreción pancreática exocrina y, por tanto, de los enzimas necesarios para la hidrólisis de los alimentos (amilasas, lipasas, proteasas) La no absorción de las grasas en el intestino, y en particular de los triglicéridos de cadena larga, se traduce en una aumento muy importante de la esteatorrea en estos pacientes, y en una retraso muy considerable en el incremento de peso en los pacientes jóvenes. Para corregir esto, se administran a estos sujetos extractos pancreáticos porcinos con las comidas. La eficacia terapéutica de estos extractos podría mejorarse claramente mediante la co-prescripción de LGC debido a la especificidad de su acción sobre los triglicéridos de cadena larga.

El artículo por Carriere et al., (1991) describe la purificación y determinación de la secuencia NH_{2}-terminal de la LGC. También se describe en esta publicación un proceso para la extracción de este enzima a partir de estómagos de perro. Este proceso consiste esencialmente en someter los estómagos de perros a una maceración en medio ácido (pH 2,5) en presencia de sales solubles en agua que favorecen la precipitación de la lipasa en dicho medio ácido. Unas etapas de filtraciones sobre tamices moleculares y de cromatografías de intercambio iónico permiten purificar la LGC hasta su homogeneidad. La LGC purificada obtenida mediante estos procedimientos es una glicoproteína que tiene un peso molecular de 49.000 dalton, 6.000 de los cuales corresponden a azúcares y 43.000 a la parte proteica.

Las razones evidentes de las dificultades de aprovisionamiento de estómagos de perros impiden todo desarrollo de este procedimiento, tanto a nivel de laboratorio como a nivel industrial. Esto resulta en la necesidad de descubrir un proceso que permita la producción de LGC en una gran cantidad, que haga innecesaria la utilización de estómagos de perros.

Las secuencias nucleotídica y peptídica de la LGC se han determinado con el objetivo de producir industrialmente la LGC mediante un proceso que use la ingeniería genética. Estos trabajos han sido el objeto de la solicitud de internacional con nº WO 94/13816, depositada el 16 de Diciembre de 1993.

El proceso para la producción de LGC recombinante descrito en esta solicitud internacional reivindica la Escherichia coli (E. coli) como la célula huésped transformada que puede producir la LGC.

Algunas dificultades halladas durante la producción de la LGC recombinante por parte de E. coli, notablemente la necesidad de cultivar grandes cantidades de E. coli en un fermentador, con costes elevados, han conducido los inventores a buscar otros procedimientos de producción de esta LGC.

Las células de mamíferos son, a priori, más apropiadas para la expresión de genes de mamíferos. Sin embargo, su utilización plantea problemas de maduración de las proteínas. El conjunto de enzimas que realiza la maduración post-traducción difiere de un tejido, un órgano, o una especie a otra. Por ejemplo, se ha descrito que la maduración post-traducción de un proteína del plasma podría ser diferente si se obtiene a partir de sangre humana o si se produce mediante una célula recombinante, tales como las células ováricas del hámster Chino, o en la leche de un animal transgénico. Además, los bajos niveles de expresión obtenidos con células de mamífero implican cultivos in vitro en volúmenes muy grandes con costes elevados. La producción de proteínas recombinantes en la leche de animales transgénicos (ratones, ovejas y vacas) permite reducir los costes de producción y que se superen los problemas del nivel de expresión. Sin embargo, permanecen los problemas éticos y los problemas de contaminación viral y subviral (priones).

Por estas razones, las transgénesis de genes de mamíferos en células vegetales podría proporcionar una ruta para la producción de nuevas proteínas recombinantes en grandes cantidades, con un coste de producción reducido, y sin el riesgo de contaminación viral o subviral.

En 1983, varios laboratorios descubrieron que era posible transferir un gen heterólogo al genoma de una célula vegetal (Bevan et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983a y b) y regenerar plantas transgénicas a partir de estas células modificadas genéticamente. Todas las células de la planta tienen por tanto las características modificadas genéticamente, las cuales se transmiten a los descendientes mediante fertilización sexuada.

Gracias a estos trabajos, varios equipos se interesaron en la producción de proteínas recombinantes de mamíferos en células vegetales o en plantas transgénicas (Barta et al., 1986; Marx, 1982). Uno de los primeros resultados verdaderamente significativo en este dominio ha sido la producción de anticuerpos en plantas de tabaco transgénicas (Hiatt et al., 1989).

Para expresar una proteína heteróloga en la semilla, el sitio de almacenamiento de proteínas en las plantas, el grupo de Vandekerckhove (1989) fusionó la secuencia con códigos para el gen de la leu-encefalina al gen que codifica la albúmina 2S de Arabidopsis thaliana. Con esta construcción, se han producido plantas de colza que expresan la leu-encefalina específicamente en las semillas con niveles de expresión del orden del 0,1% de las proteínas totales. En 1990, Sijmons y colaboradores transfirieron el gen de la albúmina de suero humana a células de tabaco y patata. No importa cual fuera el origen de los péptidos señal (humanos o de plantas), se obtuvieron niveles de albúmina de suero humana del orden del 0,02% de las proteínas totales en hojas, tallos y tubérculos de patata.

También se han producido otras proteínas recombinantes de mamífero en plantas: el antígeno de superficie de la hepatitis B (Mason et al., 1992), interferones (De Zoeten et al., 1989; Edelbaum et al., 1992; Truve et al., 1993); un anticuerpo de ratón anti-Streptococcus mutantes, el agente de la caries dental (Hiatt and Ma, 1992; Ma et al., 1994), fragmentos del anticuerpo scFv anti-cáncer (Russel D., 1994), un anticuerpo anti-herpes (Russel D., 1994), hirudina (Moloney et al., 1994), la toxina del cólera (Hein R., 1994) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Higo et al., 1993).

Todas estas investigaciones han demostrado que es posible la producción de proteínas recombinantes de mamíferos en células vegetales, y que los mecanismos de síntesis de proteínas a partir de secuencias del ADN son similares en células animales y en células vegetales. Sin embargo, existen ciertas diferencias entre las células vegetales y animales, principalmente a nivel de la maduración de los glicanos polimanosídicos en complejos de glicanos, a también a nivel de los sitios de corte de los péptidos señal, lo que no permite garantizar la obtención de proteínas de mamíferos activas o suficientemente activas mediante la transformación de células vegetales.

Los inventores han demostrado que el uso de células vegetales transformadas por una secuencia nucleotídica recombinante apropiada, permite obtener la LGC recombinante, o la LGH recombinante, o polipéptidos derivados de estas últimas, que presentan un actividad enzimática suficiente para ser susceptibles de ser desarrolladas en una aplicación industrial.

El objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo proceso de producción, mediante plantas, de lipasas preduodenales recombinantes, y más particularmente, de la LGC o LGH recombinantes, o polipéptidos derivadas de éstas, que presentan una actividad enzimática, más particularmente una actividad lipásica, de tal forma que dichas, lipasas recombinantes o sus polipéptidos derivados pueden usarse industrialmente.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar útiles para la realización de un proceso tal, principalmente nuevas secuencias nucleotídicas recombinantes, células de plantas transformadas genéticamente, plantas o partes de plantas (principalmente hojas, tallos, frutos, semillas o granos, raíces) transformadas genéticamente, y fragmentos de estas plantas o parte de plantas transformadas genéticamente.

La invención tiene también por objeto proporcionar nuevas lipasas preduodenales recombinantes de mamíferos, o cualquier polipéptido derivado, enzimáticamente activos y que se obtienen a partir de células vegetales, o de plantas, transformadas genéticamente.

La invención tiene también por objeto proporcionar nuevas composiciones enzimáticas susceptibles de ser usadas en el contexto de poner en práctica reacciones enzimáticas, principalmente a escala industrial.

La invención tiene también por objeto proporcionar composiciones farmacéuticas novedosas, principalmente en el contexto del tratamiento de patologías asociadas con un déficit de producción de lipasa en el organismo, tales como la fibrosis cística.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar nuevos combustibles, también denominados biocombustibles, los cuales tienen la ventaja de ser menos contaminantes que los combustibles derivados del petroleo, y de tener un coste de producción menor.

La invención se ilustra a continuación con la ayuda de las figuras siguientes:

Figura 1, muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc (SEC. Nº ID.: 7), en donde los nucleótidos situados en las posiciones 1 a 1137 codifican la LGC mostrada en la Figura 2 y correspondiente a la SEC. Nº ID.: 2.

Figura 2, muestra la secuencia de aminoácidos de la LGC y correspondiente a la SEC. Nº ID.: 2.

Figura 3, muestra una secuencia de nucleótidos derivada del ADNc mostrado en la Figura 1 y correspondiente a la SEC. Nº ID.: 1, los nucleótidos situados en las posiciones 1 a 1137 de dicha secuencia derivada codifican la LGC, tal como la mostrada en la Figura 2 y correspondiente a la SEC. Nº ID.: 2.

Figura 4, representa la secuencia de nucleótidos del ADNc, en donde los nucleótidos situados en las posiciones 47 a 1240 codifican el precursor de la LGH de 398 aminoácidos, y los nucleótidos situados en las posiciones 104 a 1240 codifican la LGH madura de 379 aminoácidos.

Figura 5, muestra la secuencia de aminoácidos de la LGH estando delimitado el precursor de la LGH por los aminoácidos situados en las posiciones 1 y 398, estando delimitada la LGH por los aminoácidos situados en las posiciones 20 y 398.

Figuras 6, 7 y 8, representan los resultados de experimentos de inmunodetección del tipo "Western" de polipéptidos recombinantes producidos por las hojas y granos de tabaco Xanthi, los granos de colza, y por las hojas y frutos del tomate, transformados con la ayuda de secuencias recombinantes según la invención.

Figuras 9 y 10, representan respectivamente el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y el resultado de la transferencia de este gel sobre membrana de nitrocelulosa, y el revelado, a partir de anticuerpos anti-lipasa gástrica de perro, de la LGC purificada a partir de hojas de tabaco.

Figura 11, representa un ejemplo de detección sobre membrana de los residuos glicánicos de la LGC recombinante.

Figura 12, representa el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de la LGC purificada a partir de granos de colza.

Figuras 13, 14 y 15, ilustran los diferentes ensayos efectuados en el contexto de la obtención de metiléster oléico a partir de granos transformados según la invención.

La presente invención tiene por objeto la utilización de una secuencia nucleotídica recombinante que contiene, por una parte, un ADNc que codifica cualquier lipasa preduodenal de mamífero, a saber, las lipasas en las que la secuencia nucleotídica que codifica éstas últimas presenta un porcentaje de homología de al menos aproximadamente el 75%, en particular al menos de aproximadamente el 77% a aproximadamente el 85%, y en donde las secuencias en aminoácidos presentan entre ellas un porcentaje de homología de al menos aproximadamente el 70%, y en particular al menos de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%, y que presentan la propiedad de ser ácidoresistentes y se ser activas a un pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, y más particularmente a un pH de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2, en particular un ADNc que codifique toda lipasa gástrica de mamífero, o un ADNc que codifique todo polipéptido derivado de las lipasas preduodenales mencionadas más arriba mediante la adición y/o supresión y/o sustitución de un (o varios) aminoácido, poseyendo este polipéptido derivado las propiedades de las lipasas preduodenales descritas más arriba y, por otra parte, los elementos que permiten a una célula vegetal producir la lipasa preduodenal codificada por dicho ADNc, o producir un polipéptido derivado tal como el definido en ésta más arriba, en particular un promotor y un terminador de la transcripción reconocidos por la maquinaria de transcripción de las células vegetales, para la transformación de células de plantas con vistas a la obtención, a partir de esas células, o de plantas obtenidas a partir de estas últimas, de una lipasa preduodenal recombinante de mamífero en forma de enzima activo, o de un (o varios) polipéptido derivado de esta última tal como el definido en ésta más arriba.

La presente invención tiene más particularmente por objeto la utilización de una secuencia nucleotídica recombinante que contiene, por una parte, el ADNc representado en la Figura 1, el cual codifica la lipasa gástrica del perro (LGC) mostrada en la Figura 2, o una secuencia nucleotídica derivada de este ADNc, en particular mediante la adición y/o supresión y/o sustitución de un (o más) nucleótido, siendo dicha secuencia derivada capaz de codificar un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la LGC mostrada en la Figura 2, o para un polipéptido derivado de la LGC por adición y/o supresión y/o sustitución de un (o varios) aminoácidos, presentando este polipéptido derivado una actividad lipásica, y, por otra parte, los elementos que permiten a una célula vegetal producir el polipéptido codificado por dicho ADNc o por una secuencia derivada mencionada más arriba, en particular un promotor y un terminador de la transcripción reconocidos por la maquinaria de transcripción de las células vegetales (y más particularmente por las polimerasas del ARN de éstas últimas), para la transformación de células de plantas con vistas a la obtención, a partir de esas células, o de plantas obtenidas a partir de estas últimas, de LGC recombinante en forma de enzima activo, o de un (o varios) polipéptido derivado de esta última tal como el definido en ésta más arriba.

La invención concierne igualmente a toda secuencia nucleotídica recombinante, tal como la descrita en ésta más arriba, que contenga, a título del ADNc, el representado en la Figura 1, o una secuencia nucleotídica derivada de éste último tal como se ha definido más arriba.

En relación a esto, la invención tiene más particularmente por objeto toda secuencia nucleotídica recombinante tal como se ha descrito más arriba, que contenga el ADNc representado en la Figura 1, y que codifique la lipasa gástrica del perro (LGC) representada en la Figura 2.

La invención tiene, aún más particularmente, por objeto toda secuencia nucleotídica recombinante tal como la descrita más arriba, que contenga una secuencia nucleotídica derivada del ADN representado en la Figura 1, siendo dicha secuencia nucleotídica derivada tal como se definió más arriba, y codificando la lipasa gástrica del perro (LGC) mostrada en la Figura 2. Una secuencia derivada tal, es ventajosamente la mostrada en la Figura 3 y correspondiente a la representada en la Figura 1, en la cual el nucleótido A en la posición 12 es remplazado por el nucleótido G, el nucleótido T en la posición 13 es remplazado por el nucleótido C, y el nucleótido A en la posición 15 es remplazado por el nucleótido T.

Ventajosamente, las secuencias nucleotídicas recombinantes según la invención contienen una (o varias) secuen-
cia(s) codificante para un péptido responsable de dirigir los polipéptidos recombinantes de la invención (a saber, de la LGC recombinante o de los polipéptidos derivados antes mencionados) en un compartimento determinado de la célula vegetal, particularmente en el retículo endoplásmico o en las vacuolas, o bien incluso en el exterior de la célula, en la pared pectocelulósica o en el espacio extracelular, también denominado apoplasma.

Entre los terminadores de la transcripción que pueden usarse para la transformación de células vegetales en el contexto de la presente invención, se pueden citar el terminador poliA 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) descrito en el artículo por Franck et al., 1980, o el terminador polyA NOS, el cual corresponde a la región 3' no codificante del gen de la sintasa de nopalina del plásmido Ti de la cepa de Agrobacterium tumefaciens con nopalina (Depicker et al., 1982).

En relación a esto, la invención tiene por objeto cualquier secuencia nucleotídica tal como la descrita en ésta más arriba, que contenga cadena abajo respecto dicho ADNc el terminador polyA 35S del CaMV o el terminador polyA NOS de Agrobacterium tumefaciens.

Entre los promotores de la transcripción que pueden usarse para la transformación de células vegetales en el contexto de la presente invención, podrían mencionarse:

: el promotor 35S, o ventajosamente el promotor constitutivo doble 35S (pd35S) del CaMV, permitiendo estos promotores la expresión de polipéptidos recombinantes de la invención en la planta entera obtenida a partir de células transformadas según la invención, y que son descritos en el artículo de Kay et al., 1987,

: el promotor pCRU del gen de la cruciferina de rábano, que permite la expresión el promotor 35S, que permite la expresión de polipéptidos recombinantes de la invención solamente en las semillas (o granos) de la planta obtenida a partir de células transformadas según la invención, y descritos en el artículo de Depigny-This et al., 1992.

: los promotores pGEA1 y pGEA6 correspondientes a la región 5' no codificante de los genes de la proteína de reserva de los granos, GEA1 y GEA6, respectivamente, de Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993), y que permiten una expresión específica en granos,

: el promotor quimérico super-promotor pSP (PCT/US94/12946), constituido por la fusión de tres activadores transcripcionales del promotor del gen de la sintasa de octopina de Agrobacterium tumefaciens, de un elemento activador transcripcional del gen de la sintasa de manopina, y del promotor de la sintasa de manopina de Agrobacterium tumefaciens,

: el promotor actina del arroz seguido por el intrón de actina del arroz (pAR-IAR) contenido en el plásmido pAct1-F4 descrito por McElroy et al., (1991),

: el promotor del gen de la \gammazeína de maíz (p\gammazeína) contenido en el plásmido p\gamma63 descrito en Reina et al., (1990), y que permite la expresión en el albumen de semillas de maíz.

En relación a esto, la invención tiene por objeto cualquier secuencia nucleotídica tal como la descrita en ésta más arriba, que contenga cadena arriba respecto dicho ADNc el promotor constitutivo doble 35S (pd35S) del CaMV, o el promotor pCRU del gen de la cruciferina de rábano, o los promotores pGEA1 o pGEA6 de Arabidopsis thaliana, o el súperpromotor pSP de Agrobacterium tumefaciens, o el promotor pAR-IAR del arroz, o el promotor p\gammazeína de maíz.

Las secuencias que codifican un péptido director utilizadas en el contexto de la presente invención, pueden ser de origen vegetal, humano o animal.

Entre las secuencias que codifican un péptido director de origen vegetal podrían mencionarse:

: la secuencia nucleotídica de 69 nucleótidos (indicada en los ejemplos que siguen) que codifica el prepéptido (péptido señal) de 23 aminoácidos de la esporamina A en la patata dulce, permitiendo este péptido señal la entrada de polipéptidos recombinantes de la invención dentro del sistema de secreción de células vegetales transformadas según la invención (es decir, principalmente el retículo endoplásmico),

: la secuencia nucleotídica de 42 nucleótidos (indicada en los ejemplos que siguen) que codifica los 14 aminoácidos N-terminales del propéptido director hacia vacuolas de la esporamina A en la patata dulce, permitiendo este péptido señal la acumulación de polipéptidos recombinantes de la invención en las vacuolas de células vegetales transformadas según la invención,

: la secuencia nucleotídica de 111 nucleótidos (indicada en los ejemplos que siguen) que codifica el prepropéptido de 37 aminoácidos de la esporamina A, formado por la parte N-terminal hacia la parte C-terminal de los 23 aminoácidos del péptido señal antes mencionado, seguidos por los 14 aminoácidos del propéptido antes mencionado, permitiendo este prepropéptido la entrada de polipéptidos recombinantes de la invención en el sistema secretor, y su acumulación en las vacuolas de de células vegetales transformadas según la invención,

: las tres secuencias antes mencionadas se describen en los artículos de Murakami et al., 1986, y Matsuoka y Nakamura, 1991,

: el propéptido carboxi-terminal de la lectina de cebada descrito, principalmente, en los artículos de Schroeder- et al., 1993, y Bednarek y Ralkhel, 1991.

Entre las secuencias que codifican un péptido director de origen humano o animal podrían mencionarse aquéllas que codifican el péptido señal de la lipasa gástrica humana (LGH) tal como se describe en la Patente Europea nº 0.191.061, o el de la lipasa gástrica de conejo (LGL) tal como se describe en la Solicitud de Patente Europea nº 0.542.629, la secuencia de la cual se indica en los ejemplos que siguen, o la de la lipasa pancreática humana (LPH), o también el de la lipasa gástrica del perro (LGC).

Pueden mencionarse igualmente, entre las secuencias que codifican un péptido director, aquéllas que codifican el tetrapéptido KDEL y que permiten el direccionamiento en el retículo endoplásmico.

En relación a esto, la invención tiene por objeto cualquier secuencia nucleotídica recombinante tal como la descrita en ésta más arriba, que contenga una secuencia codificante de la totalidad o parte de un péptido señal tal como el de la esporamina A de la patata dulce, o el de la LGH, o el de la LGL, o el de la LGC, estando situada esta secuencia que codifica un péptido señal en dicha secuencia nucleotídica recombinante, cadena arriba respecto dicho ADNc o de su secuencia derivada, y cadena abajo del promotor usado, de tal forma que el último aminoácido C-terminal del péptido señal está unido al primer aminoácido N-terminal del polipéptido codificado por dicho ADNc, o su secuencia derivada, en la proteína codificada por dicha secuencia nucleotídica recombinante.

La invención tiene también por objeto toda secuencia nucleotídica recombinante tal como la descrita en ésta más arriba, que contenga una secuencia codificante de la totalidad o parte de un péptido director hacia vacuolas, en particular el de la esporamina A de la patata dulce, estando situada esta secuencia, que codifica un péptido director hacia vacuolas, en dicha secuencia nucleotídica recombinante, entre la secuencia que codifica un péptido señal y la que codifica dicho ADNc o su secuencia derivada, de tal forma que el primer aminoácido N-terminal del péptido director hacia vacuolas esté unido al último aminoácido C-terminal del péptido señal, y que el último aminoácido C-terminal de dicho péptido director esté unido al primer aminoácido N-terminal del polipéptido codificado por dicho ADNc o su secuencia derivada, en la proteína codificada por dicha secuencia de nucleótidos recombinante.

La invención tiene también por objeto toda secuencia nucleotídica recombinante tal como la descrita en ésta más arriba, que contenga una secuencia codificante de la totalidad o parte de un péptido director hacia vacuolas, en particular el de la lectina de cebada, estando situada esta secuencia, que codifica un péptido director hacia vacuolas, en dicha secuencia nucleotídica recombinante, cadena abajo respecto la secuencia que codifica dicho ADNc o su secuencia derivada, de tal forma que el primer aminoácido N-terminal del péptido director hacia vacuolas esté unido al último aminoácido C-terminal del polipéptido codificado por dicho ADNc o su secuencia derivada, en la proteína codificada por dicha secuencia de nucleótidos recombinante.

La invención, más particularmente tiene por objeto las secuencias nucleotídicas recombinantes siguientes:

: aquélla (denominada pd35S-PS-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pd35S del CaMV, la secuencia que codifica el péptido señal de la esporamina A, estando seguida esta última por la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pd35S-PPS-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pd35S del CaMV, la secuencia que codifica el prepropéptido de la esporamina A, estando seguida esta última inmediatamente por la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pd35S-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pd35S del CaMV, la secuencia que codifica parte del péptido señal de la LGL (es decir, para una secuencia formada por los primeros 19 aminoácidos, indicada en los ejemplos siguientes, estando suprimidos los 19 nucleótidos que codifican los 3 últimos aminoácidos C-terminales), estando seguida esta última inmediatamente por el ADNc representado en la Figura 1, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pCRU-PS-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pCRU de la cruciferina, la secuencia que codifica el péptido señal de la esporamina A, estando esta última inmediatamente seguida por la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pCRU-PPS-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pCRU de la cruciferina, la secuencia que codifica el prepropéptido de la esporamina A, esta última estando seguida inmediatamente por la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV

: aquélla (denominada pCRU-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pCRU de la cruciferina, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como la descrita en ésta más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc mostrado en la Figura 1, o en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pGEA1-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pGEA1 de Arabidopsis thaliana, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como se describe más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc mostrado en la Figura 1, o en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pGEA6-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pGEA6 de Arabidopsis thaliana, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como se describe más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc mostrado en la Figura 1, o en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pAR-IAR-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pAR-IAR del arroz, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como se describe más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc mostrado en la Figura 1, o en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV, o el terminador poliA NOS de Agrobacterium tumefaciens,

: aquélla (denominada p\gammazeína-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor p\gammazeína del maíz, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como se describe más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc mostrado en la Figura 1, o en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada p\gammazeína-PSLGL-LGC-KDEL) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor p\gammazeína del maíz, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como se describe más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc mostrado en la Figura 1, o en la Figura 3, a continuación por el tetrapéptido KDEL, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV.

Ventajosamente, las secuencias nucleotídicas recombinantes de la invención contienen también una secuencia de nucleótidos que puede usarse como un marcador de dichas secuencias recombinantes, en particular para la diferenciación (y, por tanto, selección) de aquéllas de las células vegetales que son transformadas por dichas secuencias recombinantes, de aquéllas que no lo son.

Una secuencia nucleotídica tal, que puede usarse como marcador de dichas secuencias recombinantes, se escoge preferiblemente de entre los genes de resistencia a los antibióticos, en particular, el gen de la resistencia a la kanamicina.

La invención tiene igualmente por objeto todo vector, en particular plasmídico, que contenga una secuencia nucleotídica recombinante según la invención insertada en un sitio no esencial para su replicación.

La invención concierne también a toda célula huésped, en particular a toda bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens, transformada por un vector tal como se ha definido más arriba.

La presente invención tiene igualmente por objeto todo procedimiento de LGC recombinante bajo forma de enzima activo, y/o de uno (o varios) polipéptido(s) derivado(s) de éste último, en particular por la adición y/o supresión y/o sustitución de uno (o varios) aminoácido(s), presentando este (o estos) polipéptido(s) derivado(s) una actividad lipásica, caracterizado en que comprende:

: la transformación de células vegetales, de forma que se integre en el genoma de esas células, una (o varias) secuencia(s) nucleotídica(s) recombinante(s) según la invención,

: cuando sea apropiado, la obtención de plantas transformadas a partir de las células transformadas mencionadas más arriba,

: la recuperación de la LGC recombinante y/o del (o de los) polipéptido(s) derivado(s) mencionado(s) más arriba producido(s) en dichas células vegetales o en las plantas transformadas mencionadas más arriba, en particular por extracción, seguida, cuando convenga, por una purificación.

De acuerdo con un modo de realización del proceso antes mencionado de la invención, la transformación de células vegetales puede realizarse mediante la transferencia de la secuencia nucleotídica recombinante de la invención al interior de protoplastos, en particular después de la incubación de estos últimos en una solución de polietilenglicol (PEG) en presencia de cationes divalentes (Ca^{2+}) según el procedimiento descrito en el artículo de Krens et al., 1982.

La transformación de las células vegetales puede realizarse también por electroporación, en particular de acuerdo con el procedimiento descrito en el artículo de Fromm et al., 1986.

La transformación de las células vegetales puede realizarse igualmente mediante la utilización de un cañón de genes que permite la proyección, a velocidad muy elevada, de partículas metálicas recubiertas de secuencias nucleotídicas recombinantes según la invención, suministrándose de este modo los genes al interior del núcleo celular, en particular según la técnica descrita en el artículo de Sanford, 1988.

Otro procedimiento de transformación de células vegetales, es el de la microinyección citoplásmica o nuclear, tal como la descrita en el artículo de De La Penna et al., 1987.

Según un modo de realización particularmente preferido del proceso mencionado más arriba de la invención, las células vegetales se transforman poniéndolas junto con una célula huésped transformada por un vector acorde con la invención. tal como el descrito más arriba, siendo dicha célula huésped susceptible de infectar dichas células vegetales, y permitir la integración en el genoma de éstas últimas, de secuencias nucleotídicas recombinantes de la invención contenidas en el genoma del vector antes mencionado.

De forma ventajosa, la célula huésped usada mencionada más arriba es Agrobacterium tumefaciens, en particular, de acuerdo con los procedimientos descritos en los artículos de Bevan, 1984 y An et al., 1986, o también Agrobacterium rhizogenes, en particular de acuerdo con el procedimientos descrito en el artículo por Jouanin et al., 1987.

Entre las células vegetales que pueden transformarse en el contexto de la presente invención, se pueden citar las de colza, tabaco, maíz, guisante, tomate, zanahoria, trigo, cebada, patata, soja, girasol, lechuga, arroz y alfalfa.

Según un modo de realización del procedimiento antes mencionado de la invención, las células vegetales transformadas según la invención, se cultivan in vitro, en particular en fermentadores según el procedimiento descritos en el artículo de Brodelius, 1988, en medio líquido, o según el procedimiento descrito en el artículo de Deno et al., 1987, el cual se lleva a cabo mediante el cultivo de raíces transformadas in vitro.

Los medios de los cultivos in vitro mencionados más arriba se recuperan a continuación para extraer y, si procede, purificar, principalmente mediante cromatografía, la LGC recombinante y/o el(los) polipéptido(s) derivado(s) definidos más arriba, producidos por dichas células transformadas cultivadas in vitro.

Según un modo de realización preferido del procedimiento mencionado más arriba de obtención de la LGC recombinante y de (los) polipéptido(s) derivado(s) según la invención, la transformación de células vegetales está seguida por una etapa de obtención de plantas transformadas mediante la puesta en cultivo de dichas células transformadas en un medio apropiado. La LGC recombinante y/o el(los) polipéptido(s) derivado(s), producido(s) en las células de las plantas enteras obtenidas de este modo, se recuperan por extracción realizada a partir de plantas enteras, o de partes de estas plantas (en particular, a partir de las hojas o de los tallos o de los frutos), o aún a partir de semillas producidas por estas plantas, estando seguida esta extracción, según el caso, por una etapa de purificación de la LGC recombinante y/o de (o de los) polipéptido(s) derivado(s).

Las plantas transformadas usadas para la recuperación de la LGC recombinante y/o del (o de los) polipéptido(s) derivado(s) en el contexto del procedimiento antes mencionado, son aquéllas de la generación T0, a saber, aquéllas obtenidas a partir del cultivo de células transformadas de la invención en un medio apropiado, o ventajosamente de células de las generaciones siguientes (T1, T2, etc.) obtenidas por autofecundación de las plantas de la generación precedente, y en las cuales las secuencias nucleotídicas recombinantes se reproducen de acuerdo con las leyes de Mendel.

Entre los polipéptidos derivados de la LGC recombinante susceptibles de poder obtenerse en el contexto de la puesta en práctica de un procedimiento según la invención, se pueden citar:

: el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 55 y 379 de la Figura 2, también denominado polipéptido (\Delta54), y representado por la SEC. Nº ID.: 4, estando codificado dicho polipéptido por la secuencia de nucleótidos representada por SEC Nº ID.: 3,

: el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 5 y 379 de la Figura 2, también denominado polipéptido (\Delta4), y representado por la SEC. Nº ID.: 6, estando codificado dicho polipéptido por la secuencia de nucleótidos representada por SEC. Nº ID.: 5.

La invención tiene más particularmente por objeto todo procedimiento tal como el descrito más arriba, de obtención de la LGC recombinante representada en la Figura 2, y cuando sea apropiado, de la obtención de uno (o de varios) polipéptido(s) derivado(s), principalmente del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4) mencionados más arriba, estando caracterizado dicho proyecto por la integración, en el genoma de estos últimos, de una secuencia recombinante tal como la descrita más arriba, que contiene por una parte el ADNc representado en la Figura 1 y, por otra parte, la secuencia que codifica el péptido señal de 22 aminoácidos de la LGL, ventajosamente de la que codifica los 19 primeros aminoácidos del péptido señal de la LGL.

La invención se refiere más particularmente a un proceso para la preparación, tal como se describió más arriba, de la LGC recombinante mostrada en la Figura 2, cuando sea apropiado, en combinación con el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4), caracterizado en que comprende:

: la transformación de células de explantes de hojas de una planta, mediante la puesta contacto de éstas últimas con una cepa de Agrobacterium tumefaciens transformada, tal como se describió más arriba, mediante un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos recombinante pd35S-PSLGL-LGC mencionada más arriba, en un medio de cultivo apropiado,

: la selección de los explantes transformados en un medio que contiene kanamicina,

: la producción de plantas transformadas, a partir de los explantes transformados antes mencionados, mediante cultivo de estos últimos en un medio apropiado,

: la extracción de la LGC recombinante, y, cuando sea apropiado, del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4), en particular moliendo las hojas y/o semillas y/o frutos de las plantas transformadas antes mencionadas en un tampón apropiado, la centrifugación y recuperación del sobrenadante que constituye el extracto de plantas con actividad enzimática,

: cuando sea apropiado, la purificación de la LCG recombinante a partir del extracto obtenido en la etapa precedente, en particular mediante cromatografía realizada a partir del sobrenadante, lo que conduce a la obtención de la LGC recombinante bajo forma esencialmente pura.

La invención tiene igualmente por objeto la aplicación del procedimiento mencionado más arriba a la obtención del polipéptido (\Delta54) o del polipéptido (\Delta4) en una forma esencialmente pura, mediante la purificación de estos últimos a partir del extracto obtenido en el proceso mencionado más arriba, en particular, mediante cromatografía realizada a partir del sobrenadante de la extracción.

La invención tiene más particularmente por objeto un procedimiento de obtención del polipéptido (\Delta4) mencionado más arriba, cuando sea apropiado en una forma esencialmente pura, mediante la puesta en práctica del procedimiento descrito en ésta más arriba, en el cual las células transformadas con la secuencia pd35S-PSLGL-LGC, sin células de explantes de solanáceas, en particular, del tabaco o del tomate.

De acuerdo con un modo de realización del proceso antes mencionado, el polipéptido (\Delta4) puede obtenerse específicamente mediante extracción a partir de las hojas antes mencionadas de plantas de tabaco transformadas, en particular, moliendo estas hojas en un tampón apropiado, centrifugando y recuperando el sobrenadante. El polipéptido (\Delta4) puede purificarse a continuación a partir del extracto de hoja mencionado más arriba, que contiene dicho polipéptido (\Delta4), en particular, mediante cromatografía llevada a cabo con el sobrenadante antes mencionado.

La invención tiene más particularmente por objeto todo procedimiento, tal como el descrito más arriba, de obtención de LGC recombinante y/o de uno (o varios) polipéptido(s) derivado(s) de éste último, tales como los definidos más arriba, caracterizado en que la etapa de transformación de las células vegetales se realiza por integración, en el genoma de éstas últimas, de una secuencia que contiene, por una parte, la secuencia nucleotídica representada en la Figura 3, y por otra parte, la secuencia codificante del péptido señal de la esporamina A descrito más arriba.

Entre los polipéptidos derivados de la LGC recombinante, que pueden obtenerse en el contexto de la puesta en práctica del procedimiento descrito más arriba, se puede citar el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4).

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La invención más particularmente se refiere a un proceso para la preparación de la LGC recombinante antes mencionada y/o el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4), caracterizada en que comprende:

: la transformación de células de explantes de una planta (en particular, explantes de hojas) poniéndolas en contacto con una cepa de Agrobacterium tumefaciens transformada con un plásmido, tal como se describió más arriba, que contiene la secuencia de nucleótidos recombinante pd35S-PS-LGC y/o la secuencia pd35S-PPS-LGC,

: la extracción de la LGC recombinante y/o del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4), en particular moliendo, en un tampón apropiado, las hojas y/o semillas y/o frutos de las plantas transformadas antes mencionadas, la centrifugación y recuperación del sobrenadante que constituye el extracto de plantas con actividad enzimática,

: cuando sea apropiado, la purificación de la LGC recombinante y/o del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4), a partir del extracto obtenido durante el paso precedente, en particular mediante cromatografía realizada con el sobrenadante, la cual conduce a la preparación de LGC recombinante y/o del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4) en una forma esencialmente pura.

La invención trata más particularmente de un procedimiento para la obtención del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4) mencionados más arriba, mediante la puesta en práctica del procedimiento descrito más arriba, en el cual las células transformadas son células de explantes de hojas de solanáceas, en particular del tabaco o del tomate.

Según un modo particular de realización del procedimiento antes mencionado de la invención, el polipéptido (\Delta54) puede obtenerse específicamente por extracción a partir de las semillas de tabaco transformadas mencionadas más arriba, en particular, moliendo estas semillas en un tampón apropiado, centrifugando y recuperando el sobrenadante. El polipéptido (\Delta54) puede purificarse a continuación a partir del extracto de semilla, mencionado más arriba, que contiene dicho polipéptido (\Delta54), en particular, mediante cromatografía llevada a cabo con el sobrenadante antes mencionado.

La invención más particularmente se refiere a un proceso para la preparación de la LGC recombinante y/o del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4), caracterizada en que comprende:

: la transformación de células de explantes de una planta poniendo éstas últimas en contacto con una cepa de Agrobacterium tumefaciens transformada con un plásmido, tal como se describió más arriba, que contiene la secuencia de nucleótidos recombinante pCRU-PPS-LGC y/o la secuencia pCRU-PS-LGC y/o la secuencia pGEA1-PSLGL-LGC y/o la secuencia pGEA6-PSLGL-LGC y/o la secuencia pAR-IAR-PSLGL-LGC y/o la secuencia p\gammazeína-PSLGL-LGC y/o la secuencia p\gammazeína-PSLGL-LGC-KDEL,

: la extracción de la LGC recombinante y/o del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4), en particular moliendo, en un tampón apropiado, las semillas producidas por las plantas transformadas antes mencionadas, la centrifugación y recuperación del sobrenadante que constituye el extracto de plantas con actividad enzimática,

La invención tiene más particularmente por objeto un procedimiento de obtención del polipéptido (\Delta54) mencionado más arriba, mediante la puesta en práctica del procedimiento descrito más arriba, en el cual las células transformadas son células de explantes de colza, o de tabaco, y la extracción del polipéptido (\Delta54) se efectúa principalmente moliendo las semillas transformadas.

Las células vegetales transformadas en los procesos descritos más arriba se escogen ventajosamente de entre tabaco, colza, maíz, guisante, tomate, zanahoria, trigo, cebada, patata, soja, girasol, lechuga, arroz y alfalfa.

La invención más particularmente se refiere al proceso para la preparación de la LGC recombinante y/o del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4), caracterizado en que comprende:

: la transformación de células de callos del maíz, mediante el bombardeo de éstas últimas con la ayuda de un cañón de partículas, con los plásmidos que contienen la secuencia nucleotídica recombinante pAR-IAR-PSLGL-LGC y/o la secuencia p\gammazeína-PSLGL-LGC y/o la secuencia p\gammazeína-PSLGL-LGC-KDEL,

: la selección de los callos transformados en medio que contiene un agente selector tal como la kanamicina,

: la producción de plantas de maíz transformadas, a partir de los callos transformados antes mencionados, mediante cultivo de los últimos en un medio apropiado,

: cuando sea apropiado, la purificación de la LGC recombinante y/o del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4), a partir del extracto obtenido durante la etapa precedente, en particular mediante cromatografía realizada con el sobrenadante, la cual conduce a la obtención de la LGC recombinante y/o del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4) en una forma esencialmente pura.

La invención tiene igualmente por objeto cualquier célula vegetal transformada genéticamente que contiene una (o más) secuencia(s) de nucleótidos recombinante(s) tal como se ha descrito más arriba, según la invención, integradas en su genoma de una manera estable.

La invención concierne igualmente a toda célula vegetal transgénica tal como las descritas más arriba, que contenga uno (o varios) polipéptido(s) recombinante(s) según la invención, tales como la LGC recombinante y/o el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4), dicha célula vegetal llamándose también célula vegetal con actividad enzimática, y más particularmente con actividad lipasa, tal como se define más adelante.

La invención tiene igualmente por objeto semillas transformadas que contienen una (o más) secuencia(s) de nucleótidos recombinante(s) tal como se ha descrito más arriba, según la invención, integradas en sus genoma de una manera estable.

La invención concierne igualmente a las semillas transgénicas descritas más arriba, que contengan uno (o varios) polipéptido(s) recombinante(s) según la invención, tales como la LGC recombinante y/o el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4), dichas semillas llamándose también semillas con actividad enzimática, y más particularmente con actividad lipasa, tal como se define más adelante.

Las semillas transformadas según la invención son aquéllas recolectadas a partir de plantas genéticamente transformadas según la invención, siendo estas plantas transformadas, bien aquéllas de la generación T0 mencionadas más arriba y obtenidas poniendo en cultivo las células transformadas según la invención, bien aquéllas de las generaciones siguientes (T1, T2, etc.) obtenidas por autofecundación o por cruzamiento de las plantas de las generaciones precedentes (tal como se indicó más arriba).

La invención tiene igualmente por objeto plantas partes de plantas (en particular, explantes, tallos, hojas, raíces, polen, etc.) genéticamente transformadas, caracterizadas en que contienen una (o más) secuencia(s) de nucleótidos recombinante(s) tal como se ha descrito más arriba, según la invención, integradas en sus genoma de una manera estable.

La invención concierne igualmente a las plantas o partes de plantas transgénicas descritas más arriba, que contienen uno (o varios) polipéptido(s) recombinante(s) según la invención, tales como la LGC recombinante y/o el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4), dichas plantas o partes de plantas se denominan también plantas o fragmentos de plantas con actividad enzimática, y más particularmente con actividad lipasa, tal como se define más adelan-
te.

La invención tiene más particularmente por objeto las plantas transformadas antes mencionadas, obtenidas mediante el cultivo de células o semillas tal como se describió más arriba, de acuerdo con la invención.

Las plantas, o partes de plantas, según la invención se escogen ventajosamente de entre la colza, tabaco, maíz, guisante, tomate, zanahoria, trigo, cebada, patata, soja, girasol, lechuga, arroz y alfalfa.

La presente invención tiene por objeto todo extracto con actividad enzimática, y más particularmente una actividad lipásica definida más adelante, tal como el obtenido por la puesta en práctica de uno de los procedimientos de la invención descritos más arriba, que contiene, como enzimas activos, uno (o varios) polipéptido(s) recombinante(s) según la invención, tales como la LGC recombinante y/o el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4).

La actividad lipásica (o lipolítica) de las plantas o partes de plantas, y de los extractos vegetales con actividad enzimática de la invención, puede medirse en particular según el procedimiento de Gargouri (Gargouri et al., 1986) usando un triglicérido de cadena corta (tal como al tributirina) como sustrato. La actividad enzimática se da en unidades U, correspondiendo una unidad U a la cantidad de enzima necesaria para liberar un mmol de ácidos grasos libres por minuto a 37ºC en condiciones de pH óptimas.

Los extractos de plantas con actividad enzimática de la invención son ventajosamente tales que el porcentaje en peso de polipéptidos recombinantes enzimáticamente activos representa aproximadamente del 0,1% al 20%, en particular aproximadamente del 1% a aproximadamente el 15%, con relación al peso total de proteínas presente en estos extractos, lo que corresponde a medidas de actividad enzimática desde aproximadamente 0,5 U por g de peso fresco (PF) de hojas hasta aproximadamente 1000 U/g de PF de hojas, en particular, desde aproximadamente 10 U/g de PF hasta aproximadamente 300 U/g de PF de hojas, o aún desde aproximadamente 1 U/g de PF de semillas hasta aproximadamente 5000 U/g de PF, en particular desde aproximadamente 10 U/g de PF de semillas hasta aproximadamente 1000 U/g de PF de semillas.

La invención, más particularmente tiene por objeto los siguientes extractos de plantas con actividad enzimática nucleotídicas recombinantes siguientes:

* los extractos de hojas y/o frutos y/o semillas de plantas obtenidas mediante la transformación de células de explantes de estas plantas con la secuencia pd35S-PSLGL-LGC o la secuencia pd35S-PS-LGC o la secuencia pd35S-PPS-LGC, según uno de los procedimientos descritos más arriba, y que contiene la LGC recombinante y/o el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4), en particular:

: los extractos de hojas de tabaco obtenidas mediante la transformación de células de explantes de hojas de tabaco con la secuencia pd35S-PS-LGC o la secuencia pd35S-PPS-LGC según el proceso descrito más arriba, y que contiene el polipéptido (\Delta54) en combinación con el polipéptido (\Delta4), siendo el porcentaje en peso de la mezcla de estos dos polipéptidos con respecto al peso total de proteínas presentes en dicho extracto desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 20%, siendo la actividad enzimática de dicho extracto desde aproximadamente 100 U/g de PF hasta aproximadamente 300 U/g de PF,

: los extractos de hojas de tomate obtenidas mediante la transformación de células de explantes de hojas de tomate con la secuencia pd35S-PS-LGC o la secuencia pd35S-PPS-LGC según el proceso descrito más arriba, y que contiene el polipéptido (\Delta54) en combinación con el polipéptido (\Delta4), siendo el porcentaje en peso de la mezcla de estos dos polipéptidos con respecto al peso total de proteínas presentes en dicho extracto desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 20%, siendo la actividad enzimática de dicho extracto desde aproximadamente 100 U/g de PF hasta aproximadamente 300 U/g de PF,

: los extractos de hojas de tabaco obtenidas mediante la transformación de células de explantes de hojas de tabaco con la secuencia pd35S-PSLGL-LGC según el proceso descrito más arriba, y que contiene el polipéptido (\Delta4), siendo el porcentaje en peso de este polipéptido con respecto al peso total de proteínas presentes en dicho extracto desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 20%, siendo la actividad enzimática de dicho extracto desde aproximadamente 100 U/g de PF hasta aproximadamente 300 U/g de PF,

: los extractos de hojas de tabaco obtenidas mediante la transformación de células de explantes de hojas de tabaco con la secuencia pd35S-PPS-LGC según el proceso descrito más arriba, y que contiene el polipéptido (\Delta54), siendo el porcentaje en peso del polipéptido (\Delta54) con respecto al peso total de proteínas presentes en dicho extracto desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 1%, siendo la actividad enzimática de dicho extracto desde aproximadamente 10 U/g de PF hasta aproximadamente 300 U/g de PF,

* los extractos de semillas de plantas obtenidas mediante la transformación de células de explantes de estas plantas con la secuencia pCRU-PS-LGC, o la secuencia pCRU-PPS-LGC, o la secuencia pGEA1-PSLGL-LGC, o la secuencia pGEA6-PSLGL-LGC, según uno de los procesos descritos más arriba, y que contienen la LGC recombinante y/o el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4), en particular:

: el extracto de semillas de colza obtenidas mediante la transformación de células de explantes de hojas de colza con la secuencia pCRU-PS-LGC o la secuencia pCRU-PPS-LGC, o la secuencia pGEA1-PSLGL-LGC, o la secuencia pGEA6-PSLGL-LGC, según el proceso descrito más arriba, y que contiene el polipéptido (\Delta54), siendo el porcentaje en peso del polipéptido (\Delta54) con respecto al peso total de proteínas presentes en dicho extracto desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 1%, siendo la actividad enzimática de dicho extracto desde aproximadamente 10 U/g de PF hasta aproximadamente 1000 U/g de PF,

* los extractos de semillas de plantas obtenidas mediante la transformación de células de explantes de estas plantas con la secuencia pAR-IAR-PSLGL-LGC, o la secuencia p\gammazeína-PSLGL-LGC, y/o la secuencia p\gammazeína-PSLGL-LGC-KDEL, según uno de los procesos descritos más arriba, y que contienen la LGC recombinante y/o el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4), en particular:

: el extracto de semillas de maíz obtenidas mediante la transformación de células de maíz (en particular, de callos de maíz) con la secuencia pAR-IAR-PSLGL-LGC y/o la secuencia p\gammazeína-PSLGL-LGC y/o la secuencia p\gammazeína-PSLGL-LGC-KDEL, según el procedimiento descrito más arriba, y que contiene el polipéptido (\Delta54), siendo el porcentaje en peso del polipéptido (\Delta54) con respecto al peso total de proteínas presentes en dicho extracto desde aproximadamente el 0,1 hasta aproximadamente el 1%, siendo la actividad enzimática de dicho extracto desde aproximadamente 10 U/g de PF hasta aproximadamente 1000 U/g de PF.

La presente invención tiene igualmente por objeto toda LGC recombinante enzimáticamente activa, en donde la secuencia en aminoácidos es la representada en la Figura 2, o polipéptidos derivados de esta última, en particular por la adición y/o supresión y/o sustitución de uno (o varios) aminoácido(s), presentando estos polipéptidos derivados una actividad lipásica, tales como los obtenidos esencialmente por la puesta en práctica de uno de los procedimientos de la invención descritos más arriba, comprendiendo estos procedimientos una etapa de purificación de los polipéptidos recombinantes de la invención, en particular por cromatografía realizada a partir de los extractos enzimáticos descritos más arriba.

A título de polipéptidos derivados de la LGC recombinante mencionada más arriba, la invención tiene más particularmente por objeto los polipéptidos (\Delta54) y (\Delta4) mencionados más arriba, los pesos moleculares de los cuales son, respectivamente, de aproximadamente 37 kDa y aproximadamente 49 kDa.

Por LGC enzimáticamente activa, o polipéptidos derivados que presentan una actividad lipásica, tales como los mencionados más arriba, se entiende que significa cualquier polipéptido recombinante que es capaz de tener una actividad lipásica tal como la medida según el procedimiento de Gargouri mencionado más arriba.

A modo de ilustración, los polipéptidos recombinantes de acuerdo con la invención tienen una actividad lipasa de, desde aproximadamente 10 U/mg de polipéptidos recombinantes hasta aproximadamente 1000 U/mg, de forma ventajosa desde aproximadamente 100 U/mg hasta aproximadamente 600 U/mg.

La invención concierne más particularmente a la LGC recombinante, tal como la obtenida por la purificación de los extractos enzimáticos de hojas o de semillas de tabaco, proviniendo estas hojas o semillas de plantas de tabaco transformadas, obtenidas ellas mismas a partir de células de tabaco transformadas con la secuencia pd35S-PSLGL-LGC según el procedimiento descrito más arriba, presentando dicha LGC recombinante una actividad lipásica tal como la descrita más arriba.

La invención tiene igualmente por objeto el polipéptido (\Delta54) y el polipéptido (\Delta4) obtenido mediante la purificación del extracto enzimático de hojas y/o semillas y/o frutos de plantas, en particular solanáceas, tales como el tabaco y el tomate, obtenidas ellas mismas a partir de células de plantas transformadas con la secuencia pd35S-PS-LGC, o la secuencia pd35S-PPS-LGC, o la secuencia pd35S-PSLGL-LGC, de acuerdo con el procedimiento descrito más arriba, presentando los dichos polipéptidos (\Delta54) y (\Delta4) una actividad lipásica tal como la descrita más arriba.

La invención tiene igualmente por objeto el polipéptido (\Delta54) obtenido mediante la purificación del extracto enzimático de semillas de tabaco, o de semillas de colza, originando estas semillas respectivamente a partir de plantas de tabaco o de colza transformadas, obtenidas ellas mismas, respectivamente, a partir de células de tabaco o colza transformadas con la secuencia pCRU-PS-LGC o la secuencia pCRU-PPS-LGC, según los procesos descritos más arriba, teniendo el polipéptido recombinante (\Delta54) una actividad lipásica como la descrita más arriba.

La invención tiene igualmente por objeto el polipéptido (\Delta54) y el polipéptido (\Delta4) obtenido mediante la purificación del extracto enzimático de semillas de colza, originándose estas semillas de plantas de colza transformadas, obtenidas ellas mismas a partir de células de colza transformadas con la secuencia pGEA1-PSLGL-LGC y/o la secuencia pGEA1-PSLGL-LGC, de acuerdo con el proceso descrito más arriba, teniendo dichos polipéptidos recombinantes (\Delta54) y (\Delta4) una actividad lipásica tal se ha descrito más arriba.

La invención tiene igualmente por objeto el polipéptido (\Delta54) y el polipéptido (\Delta4) obtenido mediante la purificación del extracto enzimático de semillas de maíz, originándose estas semillas de plantas de maíz transformadas, obtenidas ellas mismas a partir de células de maíz transformadas con la secuencia pAR-IAR-PSLGL-LGC y/o la secuencia p\gammazeína-PSLGL-LGC, y/o la secuencia p\gammazeína-PSLGL-LGC-KDEL, de acuerdo con los procesos descritos más arriba, teniendo dichos polipéptidos recombinantes (\Delta54) y (\Delta4) una actividad lipásica tal se ha descrito más arriba.

Los pesos moleculares de los polipéptidos (\Delta54) y (\Delta4) según la invención son respectivamente de 37 kDa y 49 kDa, medidos mediante análisis en gel de poliacrilamida y mediante inmunodetección después de electrotransferencia sobre nitrocelulosa (estos procedimientos se detallan en los ejemplos de realización de la invención que siguen).

La invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos recombinantes de la invención, y más particularmente a los dirigidos contra la LGC recombinante según la invención, y/o contra el polipéptido (\Delta54) y/o contra el polipéptido (\Delta4) mencionados más arriba, y susceptibles de reconocer igualmente la LGH.

Tales anticuerpos pueden obtenerse mediante la inmunización de un animal con estos polipéptidos, seguida por la recuperación de los anticuerpos formados.

No hace falta decir que esta producción no está limitada a los anticuerpos policlonales.

Se aplica también a cualquier anticuerpo monoclonal producido por cualquier hibridoma, el cual puede formarse mediante procedimientos convencionales a partir de células del bazo del animal, en particular a partir de ratón o rata, inmunizados contra uno de los polipéptidos purificados de la invención por una parte, y células de un mieloma apropiado por otra parte, y que pueden seleccionarse de acuerdo con su capacidad para producir anticuerpos monoclonales que reconozcan el polipéptido mencionado más arriba usado inicialmente para la inmunización de los animales, al igual que la LGH.

La invención concierne igualmente a la utilización de plantas, partes de plantas, células de plantas, o semillas transformadas según la invención, para la obtención de uno (o varios) polipéptido(s) recombinante(s) según la invención, tales como la LGC recombinante, o sus polipéptidos derivados, tales como los definidos más arriba, en particular por la puesta en práctica de unos de los procedimientos de la invención mencionados más arriba, estando dichos polipéptidos recombinantes esencialmente bajo forma pura o contenidos en extractos vegetales con actividad enzimática, tales como los definidos más arriba.

La invención tiene igualmente por objeto la utilización, en el dominio de la alimentación humana o animal, de plantas, o partes de plantas, con actividad enzimática según la invención, o de extractos vegetales con actividad enzimática, tales como los definidos más arriba, o aún de polipéptidos recombinantes según la invención, tales como la LGC recombinante, o de sus polipéptidos derivados, tales como los definidos más arriba.

La invención concierne más particularmente a la utilización, como alimentos, de plantas, o partes de plantas, en particular, hojas, frutos, semillas, con actividad enzimática según la invención.

En relación a esto, la invención tiene más particularmente por objeto todo alimento constituido por una planta con activida enzimática, tal como se describe más arriba, o partes de esta planta, en particular hojas o frutos, o aún semillas procedentes de esta última, y susceptibles de presentar un carácter comestible para el hombre o los animales.

La invención se refiere igualmente a toda composición alimentaria que contenga una (o varias) planta(s) con actividad enzimática, tal(es) como la(s) descrita(s) más arriba, y/o partes de esta(s) planta(s), en particular las hojas y/o las semillas y/o los frutos de esta(s) planta(s), y/o uno (o varios) extracto(s) vegetal(es) con actividad enzimática, tal(es) como el(los) descrito(s) más arriba, y/o uno (o varios) polipéptido(s) recombinante(s) de la invención, cuando sea apropiado en asociación con uno (o varios) de otro(s) compuesto(s) comestible(s).

De forma ventajosa, las plantas o partes de las plantasa contenidas en la composición alimentaria antes mencionada, se presentan en forma de material molido.

Los alimentos según la invención, también denominados alimentos funcionales, o las composiciones alimentarias según la invención, se destinan más particularmente a facilitar la absorción de las grasas animales o vegetales ingeridas por un individuo sano o que padece una o varias patologías que podrían afectar o no el nivel de producción de lipasa gástrica y/o pancreática. En relación a esto, los alimentos o composiciones de la invención son ventajosamente útiles como suplementos nutricionales.

La invención tiene igualmente por objeto la utilización de plantas, o de partes de plantas, en particular de hojas y/o de frutos y/o de semillas, o de células vegetales con actividad enzimática según la invención, o de extractos vegetales con actividad enzimática, tales como los definidos más arriba, o aún de polipéptidos recombinantes según la invención, tales como la LGC recombinante, o sus polipéptidos derivados, tales como los definidos más arriba, para la obtención de medicamentos (o composiciones farmacéuticas) destinadas a facilitar la absorción de las grasas animales o vegetales ingeridas por un individuo sano o que padece una o varias patologías que podrían afectar o no el nivel de producción de lipasa gástrica y/o pancreática.

En particular, tales composiciones farmacéuticas son ventajosamente utilizadas en individuos que experimentan un tratamiento médico que altera el mecanismo de absorción de las grasas, o también en las personas ancianas.

Las composiciones farmacéuticas según la invención están también más particularmente destinadas al tratamiento de patologías ligadas a la insuficiencia de lipasas (en particular de la(s) lipasa(s) gástrica y/o pancreática) en el organismo, y más particularmente de patologías tales como la fibrosis cística y la insuficiencia pancreática exocrina.

La invención tiene por objeto más particularmente toda composición farmacéutica que comprenda uno (o varios) extracto(s) vegetal(es) con actividad(es) enzimática(s) descrito(s) más arriba, y/o uno (o varios) polipéptido(s) recombinante(s) según la invención, cuando sea apropiado, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La invención más particularmente tiene por objeto toda composición farmacéutica antes mencionada que contenga la LGC recombinante, y/o del polipéptido (\Delta54) y/o del polipéptido (\Delta4), en forma esencialmente pura o bajo la forma de extractos enzimáticos tales como los descritos más arriba.

Las composiciones farmacéuticas según la invención se administran preferiblemente por vía oral, y se presentan, en particular, bajo la forma de cápsulas, comprimidos o polvos a diluir.

La posología diaria en el hombre es ventajosamente desde aproximadamente 200 mg hasta aproximadamente 1000 mg, preferiblemente repartidos entre los momentos de las comidas principales, si dichas composiciones farmacéuticas contienen extractos enzimáticos tales como los descritos más arriba, y desde aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 500 mg, si dichas composiciones farmacéuticas contienen los polipéptidos recombinantes según la invención en una forma esencialmente pura.

La invención tiene igualmente por objeto la utilización de plantas, o de partes de plantas, en particular de hojas y/o de frutos y/o de semillas, o de células vegetales con actividad enzimática según la invención, o de extractos vegetales con actividad enzimática, tales como los definidos más arriba, o aún de polipéptidos recombinantes según la invención, tales como la LGC recombinante, o sus polipéptidos derivados, tales como los definidos más arriba, para llevar a cabo reacciones enzimáticas en el dominio industrial, en particular en la industria de las grasas, de la lipoquimia y en la industria lechera.

La invención concierne a todo proceso, en particular la bioconversión enzimática o de biocatálisis, mediante la puesta en práctica de una o varias reacciones enzimáticas en el dominio industrial, agroalimentario o agroindustrial, en particular en la industria de la grasa, de la lipoquímia, y en la industria lechera, efectuándose estas reacciones enzimática por medio de plantas, o partes de plantas, en particular hojas y/o frutos y/o semillas, o células vegetales con con actividad enzimática según la invención, o de extractos vegetales con actividad enzimática, tales como los definidos más arriba, o también de polipéptidos recombinantes según la invención, tales como la LGC recombinante, o de sus polipéptidos derivados, tales como los definidos más arriba.

La invención tiene más particularmente por objeto las preparaciones enzimáticas con destinación industrial, agroalimentario o agroindustrial, susceptibles de ser utilizadas en el contexto de poner en práctica un proceso tal como el descrito más arriba, y que comprenden uno (o varios) extracto(s) vegetal(es) con actividad enzimática tales como los definidos más arriba, y/o uno (o varios) polipéptidos recombinantes y/o el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4), cuando sea conveniente en asociación con uno (o varios) aditivo(s) u otro(s) enzima(s) susceptible(s) de ser utilizado(s)
en el contexto de la aplicación industrial mencionada más arriba.

La invención concierne más particularmente a la utilización de plantas, o partes de plantas, en particular, hojas, frutos, semillas, o de células vegetales con actividad enzimática según la invención, para la puesta en práctica, a escala industrial, de reacciones de bioconversión enzimáticas, o de biocatálisis, tales como las hidrólisis o las trans-esterificaciones enzimáticas.

De forma ventajosa, las plantas con actividad enzimática, o partes de estas plantas, en particular las hojas y/o frutos y/o semillas, o las células vegetales, según la invención, se utilizan a la vez en tanto que fuente enzimática y sustrato de la reacción.

La invención tiene igualmente por objeto todo proceso de biocatálisis que utiliza las plantas, o partes de plantas, en particular las hojas y/o frutos y/o semillas, o las células vegetales con actividad enzimática según la invención, y más particularmente las plantas que contienen la LGC recombinante y/o el polipéptido (\Delta54) y/o el polipéptido (\Delta4), utilizándose las dichas plantas, o partes de plantas, a la vez en tanto que fuente enzimática y sustrato de la reacción.

La invención concierne más particularmente a la utilización de plantas con actividad enzimática, o de partes de estas plantas, según la invención para la obtención de hidrocarburos.

En relación a esto, la presente invención tiene por objeto todo procedimiento de obtención de biocarburantes por adición de alcohol, en particular, de metanol o de etanol, a un material molido de la totalidad o parte de las plantas transformadas según la invención, en particular, un material molido de semillas de colza, de girasol o de soja, transformados según la invención, y la recuperación del biocarburante, en particular por filtración.

La invención concierne igualmente a los ésteres de ácidos grasos vegetales tales como los obtenidos por la puesta en práctica del procedimiento antes mencionado, en particular el metiléster del ácido oleico.

La invención también tiene por objeto todo biocarburante, tal como el obtenido por la puesta en práctica de un procedimiento tal como el descrito más arriba, y más particularmente todo biocarburante mencionado más arriba que comprenda ésteres de ácidos grasos vegetales.

La invención se refiere más particularmente a todo biocarburante tal como el obtenido por la puesta por la puesta en práctica del procedimiento antes mencionado a partir de semillas de colza, y que comprende un metiléster de ácido oleico.

La invención se refiere igualmente a la utilización de los anticuerpos antes mencionados, dirigidos contra los polipéptidos recombinantes de la invención, para la puesta en práctica de un procedimiento de detección o de dosificación de la LGC o de la LGH en una muestra biológica susceptible de contenerla.

La invención concierne más particularmente a la utilización de estos anticuerpos para la puesta en práctica de un procedimiento de diagnóstico in vitro de patologías asociadas a la sobreproducción o, a la inversa, a la insuficiencia, o incluso a la ausencia de producción de lipasa en el organismo.

Este procedimiento para el diagnóstico in vitro, realizado a partir de una muestra biológica obtenida de un paciente, comprende una etapa de exposición de esta muestra a uno o varios anticuerpos según la invención, seguida por una etapa de detección de los eventuales complejos anticuerpo-LGH formados durante la etapa precedente.

En relación a esto, la invención concierne igualmente a un equipo para la puesta en práctica de un procedimiento de detección o de diagnóstico in vitro antes mencionado, que comprende:

: anticuerpos tales como los descritos más arriba, ventajosamente marcados de forma radiactiva o enzimática, así como los reactivos para la constitución de un medio propicio para la realización de la reacción inmunológica entre estos anticuerpos y la LGH,

: reactivos que permiten la detección de los complejos inmunológicos formados entre estos anticuerpos y la LGH.

La presente invención tiene más particularmente por objeto la utilización de una secuencia nucleotídica recombinante que contiene por una parte el ADNc representado en la Figura 4 y que codifica la lipasa gástrica humana (LGH) mostrada en la Figura 5, o una secuencia nucleotídica derivada de este ADNc, en particular mediante la adición y/o supresión y/o sustitución de uno (o más) nucleótido(s), siendo dicha secuencia derivada capaz de codificar un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la LGH mostrada en la Figura 5, o un polipéptido derivado de la LGH por adición y/o supresión y/o sustitución de un (o varios) aminoácidos, presentando este polipéptido derivado una actividad lipásica, y, por otra parte, los elementos que permiten a una célula vegetal producir el polipéptido codificado por dicho ADNc o por una secuencia derivada mencionada más arriba, en particular un promotor y un terminador de la transcripción reconocidos por la maquinaria de transcripción de las células vegetales (y más particularmente por las polimerasas del ARN de éstas últimas), para la transformación de células de plantas con vistas a la obtención, a partir de esas células, o de plantas obtenidas a partir de estas últimas, de LGC recombinante en forma de enzima activo, o de uno (o varios) polipéptido(s) derivado(s) de esta última tal(es) como el(los) definido(s) en ésta más arriba.

En relación a esto, la invención concierne a toda secuencia nucleotídica recombinante, tal como se ha descrito más arriba en el contexto de la transformación de plantas con vistas a la preparación de LGC recombinante, en la cual la secuencia nucleotídica codificante de la LGC y representada en la Figura 1 o Figura 3, es remplazada por la secuencia nucleotídica que codifica la LGH y está representada en la Figura 4.

: aquélla (denominada pSP-PSLGH-LGH) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pSP de Agrobacterium tumefaciens, la secuencia que codifica el péptido señal de la LGH, estando seguida esta última por la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 4, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pSP-PSLPH-LGH) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pSP de Agrobacterium tumefaciens, la secuencia que codifica el péptido señal de la LPH, estando seguida esta última por la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 4, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pSP-PSLGL-LGH) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pSP de Agrobacterium tumefaciens, la secuencia que codifica el péptido señal de la LGL (tal como se ha descrito más arriba), estando seguida esta última por la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 4, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV.

La invención concierne igualmente a los vectores y huéspedes celulares transformados por estos vectores, tales como los descritos más arriba, y que contienen las secuencias nucleotídicas recombinantes mencionadas más arriba que codifican la LGH y/o sus polipéptidos derivados.

La presente invención tiene igualmente por objeto todo procedimiento de obtención de LGH recombinante bajo la forma de enzima activo, y/o de uno (o varios) polipéptido(s) derivado(s) de ésta última, en particular por la adición y/o supresión y/o sustitución de uno (o varios) aminoácido(s), presentando este (o estos) polipéptido(s) derivado(s) una actividad lipásica, caracterizado en que comprende:

: la recuperación de la LGH recombinante y/o del (o de los) polipéptido(s) derivado(s) mencionado(s) más arriba producido(s) en dichas células vegetales o en las plantas transformadas mencionadas más arriba, en particular por extracción, seguida, cuando convenga, por una purificación.

La invención más particularmente tiene por objeto todo procedimiento de producción de LGH recombinante, mediante la puesta en práctica de un proceso tal como el descrito más arriba en el contexto de la producción de LGC recombinante y/o de sus polipéptidos derivados con la ayuda de una secuencia recombinante mencionada más arriba, que comprende la secuencia representada por la Figura 4.

Entre los polipéptidos derivados de la LGH recombinante susceptibles de poder obtenerse en el contexto de la puesta en práctica de un procedimiento según la invención, se pueden citar:

: el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 74 y 398 de la Figura 5, también denominado polipéptido (\Delta54LGH),

: el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 24 y 398 de la Figura 5, también denominado polipéptido (\Delta4LGH).

La invención más particularmente se refiere a un proceso para la obtención, tal como el descrito más arriba, de la LGH recombinante y/o del polipéptido (\Delta54LGH) y/o del polipéptido (\Delta4LGH), caracterizada en que comprende:

: la transformación de células de explantes de hojas de una planta, mediante la puesta contacto de éstas últimas con una cepa de Agrobacterium tumefaciens transformada, tal como se describió más arriba, mediante un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos recombinante pSP-PSLPH-LGH y/o pSP-PSLGL-LGH, en un medio de cultivo apropiado,

: la extracción de la LGH recombinante y/o del polipéptido (\Delta54LGH) y/o del polipéptido (\Delta4LGH), en particular moliendo, en un tampón apropiado, las hojas y/o semillas y/o frutos de las plantas transformadas antes mencionadas, centrifugando y recuperando el sobrenadante que constituye el extracto de plantas con actividad enzimática,

: cuando sea apropiado, la purificación de la LGH recombinante y/o del polipéptido (\Delta54LGH) y/o del polipéptido (\Delta4LGH), a partir del extracto obtenido durante el paso precedente, en particular mediante cromatografía realizada con el sobrenadante, la cual conduce a la preparación de LGC recombinante y/o del polipéptido (\Delta54LGH) y/o del polipéptido (\Delta4LGH) en una forma esencialmente pura.

La invención tiene igualmente por objeto todas planta, o parte de esta planta, en particular las hojas y/o los frutos y/o las semillas, que contiene una (o más) secuencia(s) de nucleótidos recombinante(s) tal(es) como la(s) descrita(s) más arriba, según la invención, integradas en su genoma de una manera estable.

La presente invención tiene por objeto todo extracto con actividad enzimática, y más particularmente una actividad lipásica definida más adelante, tal como el obtenido por la puesta en práctica de uno de los procedimientos de la invención descritos más arriba, que contiene, como enzimas activos, uno (o varios) polipéptido(s) recombinante(s) según la invención, tales como la LGH recombinante y/o el polipéptido (\Delta54LGH) y/o el polipéptido (\Delta4LGH).

La invención tiene más particularmente por objeto los extractos de hojas y/o de semillas de plantas, tales como las obtenidas mediante la transformación de células de explantes de estas plantas con la secuencia pSP-PSLGH-LGH, o la secuencia pSP-PSLPH-LGH, o la secuencia pSP-PSLGL-LGH, según uno de los procedimientos descritos más arriba, y que contiene la LGH recombinante y/o el polipéptido (\Delta54LGH) y/o el polipéptido (\Delta4LGH), en particular:

: los extractos de hojas de tabaco obtenidas mediante la transformación de células de explantes de hojas de tabaco con la secuencia pSP-PSLGH-LGH, o la secuencia pSP-PSLPH-LGH, o la secuencia pSP-PSLGL-LGH, según el procedimiento descrito más arriba, y que contiene el polipéptido (\Delta54LGH), en asociación con el polipéptido (\Delta4LGH), siendo el porcentaje en peso de la mezcla de estos dos polipéptidos con respecto al peso total de proteínas presentes en dicho extracto desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 20%, siendo la actividad enzimática de dicho extracto desde aproximadamente 100 U/g de PF hasta aproximadamente 300 U/g de PF,

: los extractos de hojas de tabaco obtenidas mediante la transformación de células de explantes de hojas de tabaco con la secuencia pSP-PSLGL-LGH, y que contienen el polipéptido (\Delta4LGH), siendo el porcentaje en peso de este polipéptido con respecto al peso total de proteínas presentes en dicho extracto desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 20%, siendo la actividad enzimática de dicho extracto desde aproximadamente 100 U/g de PF hasta aproximadamente 300 U/g de PF.

La presente invención tiene igualmente por objeto toda LGH recombinante enzimáticamente activa, en donde la secuencia en aminoácidos es la representada en la Figura 5, o polipéptidos derivados de esta última, en particular por la adición y/o supresión y/o sustitución de uno (o varios) aminoácido(s), y más particularmente los polipéptidos (\Delta54LGH) y (\Delta4LGH), presentando estos polipéptidos derivados una actividad lipásica, tal como se obtienen en una forma esencialmente pura mediante la puesta en práctica de uno de los procesos de la invención descritos más arriba, comprendiendo estos procesos una etapa de purificación de los polipéptidos recombinantes de la invención, en particular por cromatografía realizada a partir de los extractos enzimáticos descritos más arriba.

Tal como se ha descrito previamente en el contexto de la LGC recombinante, la invención tiene igualmente por objeto:

: los anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra la LGH recombinante, o sus polipéptidos derivados, según la invención, y sus aplicaciones tales como las descritas más arriba,

: los alimentos, o composiciones alimentarias, o composiciones farmacéuticas, o preparaciones enzimáticas, con destinación industrial, a base de plantas, o de partes de plantas, en particular de hojas y/o frutos y/o semillas, o de células vegetales, o de extractos vegetales con actividad enzimática, tales como los definidos más arriba, o también de la LGH recombinante o de sus polipéptidos derivados según la invención,

: todo procedimiento de bioconversión enzimática, o de biocatálisis, o de preparación de biocarburantes, tales como los descritos más arriba, efectuados a partir de LGH recombinante o de sus polipéptidos derivados según la invención, o de plantas, o de partes de plantas, en particular de hojas y/o frutos y/o semillas, o de células vegetales, o de extractos vegetales con actividad enzimática, tales como los definidos más arriba.

La invención se ilustrará adicionalmente en la descripción detallada que sigue para la preparación de secuencias nucleotídicas recombinantes, tal como se describieron más arriba, y plantas transformadas que producen los polipéptidos recombinantes según la invención, y para un procedimiento de obtención de biocarburante.

I. Construcción de genes quiméricos que codifican la proteína recombinante de la lipasa gástrica de perro, y que permiten una expresión en las hojas y semillas de solanáceas I-A) Construcción de genes quiméricos que codifican la LGC recombinante y permiten la expresión en el tabaco

La expresión en las hojas y las semillas de tabaco del gen que codifica la lipasa gástrica de perro (LGC) requiere las secuencias reguladoras siguientes:

1.: el promotor constitutivo doble 35S (pd35S) del CaMV (virus del mosaico de la coliflor). Corresponde a una duplicación de las secuencias que activan la transcripción situadas cadena arriba respecto el elemento TATA de un promotor 35S natural (Kay et al., 1987);

2.: la secuencia de transcripción terminal, el terminador del poliA 35S, que corresponde a la región 3' no codificante del virus del mosaico de la coliflor, de ADN circular de doble hebra, el cual produce el transcrito 35S (Franck et al., 1980).

Las construcciones de varios plásmidos a través del uso de técnicas de ADN recombinante (Sambrook et al., 1989) se derivan del pBIOC4. Este plásmido binario se deriva del pGA492 (An, 1986), el cual contiene, entre los bordes derecho e izquierdo, las siguientes secuencias originarias del pTiT37 de Agrobacterium tumefaciens, sobre su ADN de transferencia:

el promotor constitutivo del gen nos que codifica la sintasa de nopalina (Depicker et al., 1982), la secuencia que codifica el gen nptII que codifica la fosfotransferasa II de neomicina (Berg and Berg, 1983) suprimida de la región de los 8 primeros codones, en donde el codón de iniciación de metionina ATG está fusionado a la secuencia de los primeros 14 codones de la secuencia que codifica el gen nos (Depicker et al., 1982), la secuencia que codifica el gen nos desprovista de la región de los primeros 14 codones, el terminador de nos (Depicker et al., 1982), una región que contiene múltiples sitios de clonación (también denominada poliengarce) (HindIII-XbaI-SacI-HpaI-KpnI-ClaI-BglII) precediendo el gen cat que codifica la acetiltransferasa del cloramfenicol (Close y Rodriguez, 1982), y las secuencias terminadoras del gen 6 del plásmido pTiA6 de Agrobacterium tumefaciens (Liu et al., 1993). Para eliminar la casi totalidad de la secuencia codificante del gen cat, el plásmido pGA492 se digirió dos veces con SacI (sitio de restricción del poliengarce) y por ScaI (sitio de restricción presente en la secuencia del gen cat) y se sometió a continuación a la acción del enzima ADN polimerasa de T4 (New England Biolabs) según las recomendaciones del fabricante. La ligación del plásmido modificado (20 ng) se realizó en un medio de reacción de 10 \mul que comprendía 1 \mul del tampón de ligada de ADN de T4 \times10 (Amersham); 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El sitio de restricción HindIII del plásmido de ADN del clone retenido se modificó a continuación en un sitio de restricción EcoRI con la ayuda de un adaptador HindIII-EcoRI fosforilado (Stratagene Cloning Systems). Para realizar esta modificación, se digirieron 500 ng de ADN del plásmido del clon retenido mediante HindIII, se desfosforilaron con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante, y se coprecipitaron en presencia de 1500 ng del adaptador de ADN HindIII-EcoRI, 1/10 volúmenes de acetato sódico 3M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos. Después de su centrifugación a 12.000 g durante 30 minutos, el ADN precipitado se lavó con etanol al 70%, se secó, se retomó en 8 \mul de agua, se mantuvo a 65ºC durante 10 minutos, y a continuación se ligó en presencia de 1 \mul de tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Después de la inactivación de la ligasa de ADN de T4 a 65ºC durante 10 minutos, la mezcla de reacción se digirió con EcoRI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se precipitó en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugó a 12.000 g durante 30 minutos, se lavó con etanol al 70%, se secó, y a continuación se ligó como se ha descrito más arriba. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática, en particular con HindIII y EcoRI. El plásmido binario resultante, el cual sólo tiene los últimos 9 codones de la secuencia que codifica el gen cat, y en donde el sitio EcoRI es único, se denominó pBIOC4.

El casete de expresión formado por el promotor pd35S y del terminador polyA 35S se aisló usando el plásmido pJIT163\Delta. El plásmido pJIT163\Delta se derivó del plásmido pJIT163, el cual se deriva a su vez del plásmido pJIT60 (Guerineau y Mullineaux, 1993). El plásmido pJIT163 posee un codón ATG entre los sitios HindIII y SalI del poliengarce. Para suprimir este ATG y obtener el plásmido pJIT163\Delta, el ADN del plásmido pJIT163 se digirió dos veces con HindIII y SalI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se precipitó en presencia de 1/10 volúmenes de acetato sódico 3M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugó a 12.000 g durante 30 minutos, se lavó con etanol al 70%, se secó, se sometió a la acción del enzima Klenow (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante, se desproteinizó mediante extracción con 1 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y a continuación con 1 volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), se precipitó en presencia de 1/10 volúmenes de acetato sódico 3M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 min, se centrifugó a 12.000 g durante 30 min, se lavó con etanol al 70%, se secó, y finalmente se ligó en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. Para aislar el casete de expresión formado por el promotor pd35S y del terminador polyA 35S (fragmento SacI-XhoI), el ADN de plásmido del clon pJIT163\Delta retenido se digirió con SacI y XhoI. El fragmento SacI-XhoI, portador del casete de expresión, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se precipitó en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugó a 12.000 g durante 30 minutos, se lavó con etanol al 70%, se secó, y a continuación se sometió a la acción del enzima Mung Bean Nuclease (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante. Este inserto purificado (200 ng) se clonó en el DNA plasmídico del pBIOC4 (20 ng), digerido con EcoRI, tratado con el enzima Mung Bean Nuclease, y desfosforilado por el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La reacción de ligación se realizó en 20 \mul, en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham); 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 12 \mul/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC21.

La lipasa gástrica de perro (LGC) se sintetiza naturalmente bajo la forma de un precursor. La proteína LGH madura está constituida por 379 aminoácidos. El ADN complementario de la LGC se clonó en los sitios BglII y SalI del vector de expresión pRU303, conduciendo al vector pDGL5.303 descrito en la solicitud internacional nº WO 94/13816. Se usó para la construcción de los plásmidos binarios pBIOC25, que contiene PS-LGC, y pBIOC26, que contiene PPS-LGC, en donde la secuencia que codifica la LGC madura está precedida respectivamente por la que codifica un péptido señal (PS) o un prepropéptido (PPS, es decir, un péptido señal seguido por secuencias N-terminales directoras hacia vacuolas) de origen vegetal. Las secuencias PS y PPS, formadas respectivamente por 23 y 37 aminoácidos, son aquéllas de una proteína de reserva de las raíces tuberosas de la patata dulce: esporamina A (Murakami et al., 1986; Matsukoa y Nakamura, 1991).

Para simplificar las fusiones entre la secuencia madura de la LGC y las de las señales directoras, PS o PPS, se modificó el plásmido pDGL5.303 mediante la introducción de un sitio de restricción HindIII suplementario entre los codones cuarto y quinto de la secuencia de LGC madura mediante mutagénesis dirigida por PCR usando 2 oligodesoxinucleótidos, 5' caggagatc TTG TTT GGA AAG CTT CAT CCC 3' (que contiene el unico sitio BglII en el plásmido y proporciona el sitio HindIII suplementario) y 5' CAT ATT CCT *CAG CTG* GGT ATC 3' (que contiene el único sitio PvuII en el plásmido). La amplificación del fragmento BglII-PvuII mediante la PCR se realizó en 100 \mul de medio de reacción que comprendía 10 \mul del tampón de la polimerasa de ADN Taq \times10 (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 9,0, y 1% de Triton\times100), 6 \mul de MgCl_{2} 25 mM, 3 \mul de dNTP 10 mM (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 100 pM de cada uno de los 2 oligodesoxinucleótidos descritos más arriba, 5 ng de ADN matriz (vector de expresión pRU303, incluyendo el ADN complementario de la LGC), 2,5 U de polimerasa del ADN Taq (Promega) y 2 gotas de aceite de vaselina. El ADN se desnaturalizó a 94ºC durante 30 min, se sometió a 30 ciclos, cada uno de 1 minuto, de desnaturalización a 94ºC, 1 minuto de hibridación a 50ºC y 1 min de elongación a 72ºC, y a continuación se continuó la elongación a 72ºC durante 5 minutos. La reacción de la PCR se realizó en la máquina "DNA Thermal Cycler" de PERKIN ELMER CETUS. El aceite se retiró mediante extracción con cloroformo. Los fragmentos de ADN contenido en el medio de reacción se precipitaron en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugaron a 12.000 g durante 30 minutos, se lavaron con etanol al 70%, se secaron, y se digirieron con los 2 enzimas de restricción BglII y PvuII. Los fragmentos de ADN digeridos originados en la PCR se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se precipitaron en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugaron a 12.000 g durante 30 minutos, se lavaron con etanol al 70%, se secaron, y a continuación se ligaron al ADN plasmídico del vector pDGL5.303, el cual se había digerido dos veces con BglII y PvuII, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyeron, se sometieron a precipitación en alcohol, se secaron, y se desfosforilaron mediante el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 100 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 50 ng de los fragmentos de ADN digeridos, procedentes de la amplificación mediante la PCR, descritos más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El ADN plasmídico de algunos de los clones retenidos se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). La introducción de este sitio de restricción HindIII no modifica el código genético de la LGC. De hecho, la secuencia natural de la LGC, AAA TTA (Lys-Leu), pasa a ser AAG CTT (Lys-Leu). El plásmido resultante se denominó pBIOC22 e incluye la secuencia de la proteína LGC madura correspondiente a:

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a. Construcción del plásmido binario PBIOC25 que contiene la PS-LGC

El plásmido pBIOC22 se digirió totalmente con BglII y parcialmente con HindIII con objeto de suprimir la secuencia que codifica el polipéptido Leu-Phe-Gly-Lys (primeros 4 aminoácidos) de la proteína LGC madura. Esta secuencia se remplazó por la que codifica el péptido señal PS de 23 aminoácidos (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC) fusionada a la de los 4 primeros codones de la secuencia que codifica la proteína LGC madura ("PS-4 primeros codones de la LGC madura"). La secuencia "PS-4 primeros codones de la LGC madura" se amplificó mediante la PCR usando el plásmido pMAT103 (Matsuoka and Nakamura, 1991) con la ayuda de los 2 oligodesoxinucleótidos siguientes 5' caggagatctgATG AAA GCC TTC ACA CTC GC y 5' ATG AAG CTT TCC AAA CAA GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G 3', según el protocolo de amplificación con la PCR descrito en el parágrafo I. Después de la doble digestión enzimática con BGlII y HindIII, los fragmentos de ADN procedentes de la PCR se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se precipitaron en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugaron a 12.000 g durante 30 minutos, se lavaron con etanol al 70%, se secaron, y a continuación se ligaron al ADN plasmídico del vector pBIOC22, el cual se había doblemente digerido BglII y HindIII, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se sometieron a precipitación con alcohol, se secaron, y se desfosforilaron mediante el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 100 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 50 ng de los fragmentos de ADN digeridos, procedentes de la amplificación mediante la PCR, descritos más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El ADN plasmídico de algunos de los clones retenidos se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). Se clonaron las secuencias del PS y de la LGC madura manteniendo sus pautas de lectura abienta. La secuencia de corte entre las secuencias del PS y de la LGC madura es Ser-Leu. El plásmido resultante se denominó pBIOC23. A partir del pBIOC23, se aisló el fragmento BglII-XbaI portador de la secuencia PS-LGC mediante doble digestión enzimática con BglII y XbaI, purificación mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, electroelución (Sambrook et al., 1989), precipitación con alcohol y secado. Este fragmento de ADN se trató a continuación con el enzima Klenow según las instrucciones del fabricante, y se ligó al ADN plasmídico del pBIOC21, el cual se había digerido en el sitio HindIII, tratado con Klenow y desfosforilado con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN, que contenían la PS-LGC, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC25. La secuencia nucleotídica del fragmento que codifica la proteína recombinante PS-LGC se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). El ADN plasmídico del vector binario pBIOC25 se introdujo mediante transformación directa en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens según el procedimiento de Holsters et al., (1978). La validez del clon retenido se verificó mediante digestión enzimática del ADN plasmídico introducido.

b. Construcción del plásmido binario PBIOC26 que continente la PPS-LGC

El plásmido pBIOC22 se digirió totalmente con BglII y parcialmente con HindIII con objeto de suprimir la secuencia que codifica el polipéptido Leu-Phe-Gly-Lys (primeros 4 aminoácidos) de la proteína LGC madura. Esta secuencia se remplazó por la que codifica el péptido señal PPS de 23 aminoácidos (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC AGG TTC AAT CCC ATC CGC CTC CCC ACC ACA CAC GAA CCC GCC) fusionada a la de los 4 primeros codones de la secuencia que codifica la proteína LGC madura ("PPS-4 primeros codones de la LGC madura"). La secuencia "PPS-4 primeros codones de la LGC madura" se amplificó mediante la PCR usando el plásmido pMAT103 (Matsuoka and Nakamura, 1991) con la ayuda de los 2 oligodesoxinucleótidos siguientes 5' caggagatctgATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' y 5' ATG AAG CTT TCC AAA CAA GGA GGG TTC GTG TGT GGT TG 3', según el protocolo de amplificación con la PCR descrito en el parágrafo I. Después de la doble digestión enzimática con BGlII y HindIII, los fragmentos de ADN procedentes de la PCR se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se precipitaron en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugaron a 12.000 g durante 30 minutos, se lavaron con etanol al 70%, se secaron, y a continuación se ligaron al ADN plasmídico del vector pBIOC22, el cual se había doblemente digerido BglII y HindIII, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyeron, se sometieron a precipitación con alcohol, se secaron, y se desfosforilaron mediante el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 100 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 50 ng de los fragmentos de ADN digeridos, procedentes de la amplificación mediante la PCR, descritos más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción.

El ADN plasmídico de algunos de los clones retenidos se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). Se clonaron las secuencias del PPS y de la LGC madura manteniendo sus pautas de lectura abierta. La secuencia de corte entre las dos secuencias es Ala-Leu. El plásmido resultante se denominó pBIOC24 A partir del pBIOC24, se aisló el fragmento BglII-XbaI portador de la secuencia PPS-LGC mediante doble digestión enzimática con BglII y XbaI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), y se precipitó con alcohol y se secó. Este fragmento de ADN se trató a continuación con el enzima Klenow según las instrucciones del fabricante, y se ligó al ADN plasmídico del pBIOC21, el cual se había digerido en el sitio HindIII, tratado con Klenow y desfosforilado con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN, que contenían la PPS-LGC, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC26. La secuencia nucleotídica del fragmento que codifica la proteína recombinante PPS-LGC se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). El ADN plasmídico del vector binario pBIOC26 se introdujo mediante transformación directa en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens según el procedimiento de Holsters et al., (1978). La validez del clon obtenido se verificó mediante digestión enzimática del ADN plasmídico introducido.

c. Construcción del plásmido binario PBIOC41 que contiene la PSLGL-LGC

La lipasa gástrica del conejo se sintetiza en forma de un precursor compuesto por un péptido señal de 22 aminoácidos situado en el extremo NH_{2}-terminal y precediendo la secuencia polipeptídica de la lipasa madura. El clon pJO101 que contiene el ADNc completo que codifica la lipasa gástrica del conejo se describe en la solicitud de Patente Europea nº 92 403 055.4 depositada el 11 de Diciembre de 1992 por el "Institut de Recherche Jouveinal" y titulada "Nucleic acids which code for rabbit gastric lipase and polypeptide derivatives, their use for the production of these polypeptides, and pharmaceutical compositions based on the latter".

El alineamiento de las secuencias polipeptídicas de la lipasa gástrica de perro y del precursor de la lipasa gástrica de conejo ha demostrado que la secuencia LFGK está presente en las dos proteínas. En la secuencia polipeptídica de la lipasa de conejo determinada a partir de la proteína natural purificada (Moreau et al., 1988), los tres primeros residuos L, F y G están ausentes y forman parte del péptido señal de 22 aminoácidos de la LGL. A consecuencia de este hecho, el péptido señal de la lipasa gástrica de conejo desprovisto de estos tres aminoácidos comunes se fusionó con la secuencia de la proteína madura de la lipasa gástrica de perro. Su secuencia polipeptídica está formada por los siguientes 19 aminoácidos: MWVLFMVAALLSALGTTHG. El plásmido pBIOC22 se digirió totalmente con BglII y parcialmente con HindIII con objeto de suprimir la secuencia que codifica el polipéptido Leu-Phe-Gly-Lys (primeros 4 aminoácidos) de la proteína LGC madura. Esta secuencia se remplazó por la que codifica el péptido señal PSLGL de la lipasa gástrica de conejo de 19 aminoácidos (ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACTACA CAT GGT) fusionada a la de los 4 primeros codones de la proteína LGC madura ("PSLGL-4 primeros codones de la LGC madura"). La secuencia "PSLGL-4 primeros codones de la LGC madura" se amplificó mediante la PCR usando el plásmido pJO101 con la ayuda de los 2 oligodesoxinucleótidos siguientes 5' aggagatctcaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG 3' y 5' G ATG AAG CTT TCC AAA CAA ACC ATG TGT AGT TCC AAG TG 3' (SEC., según el protocolo de amplificación con la PCR descrito más arriba en el parágrafo I. Después de la doble digestión enzimática con BGlII y HindIII, los fragmentos de ADN procedentes de la PCR se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se precipitaron en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugaron a 12.000 g durante 30 minutos, se lavaron con etanol al 70%, se secaron, y a continuación se ligaron al ADN plasmídico del vector pBIOC22, el cual se había doblemente digerido BglII y HindIII, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se sometieron a precipitación con alcohol, se secaron, y se desfosforilaron mediante el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 100 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 50 ng de los fragmentos de ADN digeridos, procedentes de la amplificación mediante la PCR, descritos más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El ADN plasmídico de algunos de los clones retenidos se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). Se clonaron las secuencias del PSLGL y de la LGC madura manteniendo sus pautas de lectura abierta (es decir, de tal forma que constituyen una única pauta de lectura abierta). La secuencia de corte entre las secuencias del PSLGL y de la LGC madura es Gly-Leu. El plásmido resultante se denominó pBIOC40. A partir del pBIOC40, se aisló el fragmento BglII-XbaI portador de la secuencia LSLGL-LGC mediante doble digestión enzimática con BglII y XbaI, purificación mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, electroelución (Sambrook et al., 1989), precipitación con alcohol y secado. Este fragmento de ADN se trató a continuación con el enzima Klenow según las instrucciones del fabricante, y se ligó al ADN plasmídico del pBIOC21, el cual se había digerido en el sitio HindIII, tratado con Klenow y desfosforilado con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN, que contenían la PSLGL-LCG, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC41. La secuencia nucleotídica del fragmento que codifica la proteína recombinante PSLGL-LGC se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). El ADN plasmídico del vector binario pBIOC41 se introdujo mediante transformación directa en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens según el procedimiento de Holsters et al., (1978). La validez del clon retenido se verificó mediante digestión enzimática del ADN plasmídico introducido.

I-B) Construcción de genes quiméricos que codifican la LGC recombinante y permiten la expresión en el tomate

Las construcciones son las mismas citadas para la transformación genética del tabaco, a saber, los plásmidos pBIOC25, pBIOC26 y pBIOC41.

II. Construcción de genes quiméricos que codifican la proteína recombinante de la lipasa gástrica de perro, y que permiten la expresión en semillas de colza a) Construcción del plásmido binario pBIOC28 que contiene el promotor pCRU

La expresión de la lipasa gástrica de perro (LGC) en semillas de colza requiere la inserción del cADN que codifica la LGC entre las siguientes secuencias reguladoras:

1.: el promotor pCRU, el cual corresponde a la región no codificante 5' del gen de la proteína de reserva de las semillas, CRUCIFERIN A de rábano (Depigny-This et al., 1992), y que permite la expresión específica en las semillas;

Para obtener un plásmido binario similar al pBIOC21, pero en el cual el promotor pd35S ha sido remplazado por el promotor pCRU, el fragmento "EcoRI tratado con Klenow-BamHI", que contiene el promotor pCRU, se aisló usando el plásmido pBI221-CRURSP derivado de pBI221 (comercializado por Clontech) mediante la sustitución del promotor 35S por el promotor pCRU.

El fragmento "EcoRI tratado con Klenow-BamHI" portador del promotor pCRU se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se sometió a precipitación con alcohol, se secó y se ligó al ADN plasmídico del pJIT163 (descrito en el parágrafo I.), digerido con KpnI, el cual se había tratado con la polimerasa de ADN de T4 (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante, digerido a continuación con BamHI, purificado a continuación mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, electroeluido (Sambrook et al., 1989), sometido a precipitación con alcohol, secado y desfosforilado mediante el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN, que contenían la "EcoRI tratada con Klenow-BamHI", descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC27.

El casete de expresión formado por el promotor pCRU y del terminador polyA 35S se aisló a partir del plásmido pBIOC27 mediante digestión total con XhoI seguida por una digestión parcial con EcoRI. Se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se sometió a precipitación con alcohol, se secó y se trató con Klenow (New England Biolabs) según las instrucciones del fabricante, y se ligó al ADN plasmídico del pBIOC24 en el sitio EcoRI tratado con Klenow y desfosforilado con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN XhoI-EcoRI, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC28.

b) Construcción del plásmido binario pBIOC29 que contiene la PPS-LGC

El aislamiento del fragmentos BglII-XbaI portador de la secuencia de PPS-LGC a partir de pBIOC24 ya se ha descrito en I-A-b. Este fragmento se ligó al ADN plasmídico del pBIOC28 en el sitio EcoRI tratado con Klenow y desfosforilado con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN BglII-XbaI que contenían la PPS-LGC, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC29. La secuencia nucleotídica de la proteína recombinante PPS-LGC se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). El ADN plasmídico del vector binario pBIOC29 se introdujo mediante transformación directa en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens según el procedimiento de Holsters et al., (1978). La validez del clon retenido se verificó mediante digestión enzimática del ADN plasmídico introducido.

c) Construcción de los plásmidos binarios pBIOC90 y pBIOC91 que contienen el promotor pGEA1D

La expresión en semillas de colza del gen que codifica la lipasa gástrica de perro (LGC) requiere las secuencias reguladoras siguientes:

1.: el promotor pGEA1, correspondiente a la región 5' no codificante del gen de la proteína de reserva de las semillas GEA1 de Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993), y que permite la expresión específica en las semillas;

Para obtener el plásmido binario pBIOC90, similar al pBIOC21 pero en el que el promotor pd35S se ha remplazado con el promotor pGEA1D, se aisló el fragmento HindIII-BamHI tratado con Klenow, que contenía el promotor pGEA1, usando el plásmido pGUS2-pGEA1. El clon pGUS-2-pGEA1, derivado del pBI221 mediante la sustitución del promotor p35S por el promotor pGEA1, contiene 2 ATG en pauta: el ATG del gen GEA1 (Em2) y el ATG del gen gus. Se destruyó el ATG del gen GEA1. El fragmento de ADN contenido entre el sitio SalI y las secuencias cadena arriba respecto el ATG del gen GEA1 del clon pGUS-2-pGEA1 se amplificaron a continuación mediante la PCR usando 2 oligonucleótidos: 5' CAAACGTGTACAATAGCCC 3' y 5' CCCGGGGATCCTTTTTTG 3' Se ajustó la temperatura de hibridación. El fragmento amplificado mediante la PCR se digirió con SalI y BamHI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se precipitó en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugó a 12.000 g durante 30 minutos, se lavó con etanol al 70%, se secó, y a continuación se ligó al ADN plasmídico del vector pGUS-2-GEA1, doblemente digerido SalI y BamHI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se sometió a precipitación con alcohol, y se secó La ligación se realizó con 100 ng de vector y 50 ng de los fragmentos de ADN digeridos, procedentes de la amplificación mediante la PCR descrita más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. Algunos de los clones retenidos se verificaron mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento
del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). El plásmido resultante se denominó *pGUS-2-pGEA1D*.

El fragmento HindIII-BamHI portador del promotor pGEA1D aislado a partir del pGUS-2-pGEA1D, se trató con Klenow según las instrucciones del fabricante (Biolabs), se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se sometió a precipitación con alcohol, se secó y se ligó al ADN plasmídico del pBIOC21 en los sitios KpnI y HINDIII tratados con el enzima polimerasa del ADN de T4 (Biolabs) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng de pBIOC21 desfosforilado y 200 ng de los fragmentos de ADN XhoI-EcoRI, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados sobre 12 mg/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC90.

Para obtener el plásmido binario pBIOC91, el casete de expresión "pGEA1D-tNOS", aislado a partir del pBSII-pGEA1D, se introdujo en el plásmido binario pSCV1,2, obtenido a su vez mediante la clonación del fragmento HindIII portador del casete de expresión "p35S-nptII-tNOS" descrito por Fromm et al., (1986) en el sitio HindIII del pSCV1 construido por Edwards G. A. en 1990 siguiendo los procedimientos de clonación usuales.

El plásmido pBSII-pGEA1D se obtuvo en dos etapas:

: por una parte, el fragmento SacI-EcoRI portador del tNOS (terminador del gen de la sintasa de nopalina) de Agrobacterium tumefaciens, tratado con la polimerasa de ADN de T4 (Biolabs) según las instrucciones del fabricante y purificado, se clonó en el sitio EcoRV del pBSIISK+ comercializado por Stratagene, desfosforilado con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado y 200 ng de los fragmentos de ADN que contenían el tNOS, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. Algunos de los clones retenidos se verificaron mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). El plásmido resultante se denominó pBSII-tNOS.

: por otra parte, el fragmento portador del pGEA1D doblemente digerido con HindIII y tratado con los enzimas Klenow y BamHI, purificado, se clonó en los sitios "XbaI tratado con Klenow y BamHI" del plásmido pBSII-tNOS. La ligación se realizó con 100 ng del vector descrito más arriba y 50 ng de los fragmentos de ADN descritos más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBSII-pGEA1D.

A continuación, el casete de expresión "pGEA1D-tNOS" portado por el fragmento Xbal-HindIII tratado con Klenow, se clonó en el sitio SmaI del pSCV1,2 desfosforilado con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng de pSCV1,2 desfosforilado y 200 ng de fragmentos portadores del casete de expresión "pGEA1D-tNOS", en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC91.

d) Construcción del plásmido binario pBIOC92 que contiene el promotor pGEA6D

1.: el promotor pGEA6, correspondiente a la región 5' no codificante del gen de la proteína de reserva de las semillas GEA6 de Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993), y que permite la expresión específica en las semillas;

Para obtener el plásmido binario pBIOC92, similar al pBIOC21 pero en el que el promotor pd35S se ha remplazado con el promotor pGEA6D, se aisló el fragmento EcoRI-BamHI tratado con Klenow, que contenía el promotor pGEA6, usando el plásmido pGUS2-pGEA6. El clon pGUS-2-pGEA6, derivado del pUC18, contiene 2 ATG en fase: el ATG del gen GEA6 (Em6) y el ATG del gen gus. Se destruyó el ATG del gen GEA6. El fragmento de ADN contenido entre el sitio AccI y las secuencias cadena arriba respecto el ATG del gen GEA6 del clon pGUS-2-pGEA6 se amplificaron a continuación mediante la PCR usando 2 oligonucleótidos: 5' AAGTACGGCCACTACCACG 3' y 5' CCCGGGGATCCTGGCTC 3' Se ajustó la temperatura de hibridación.

El fragmento amplificado mediante la PCR se digirió con AccI y BamHI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se precipitó en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugó a 12.000 g durante 30 minutos, se lavó con etanol al 70%, se secó, y a continuación se ligó al ADN plasmídico del vector pGUS-2-GEA6, doblemente digerido AccI y BamHI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se sometió a precipitación con alcohol, y se secó La ligación se realizó con 100 ng del vector descrito más arriba y 50 ng de los fragmentos de ADN digeridos, procedentes de la amplificación mediante la PCR, descritos más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times 10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. Algunos de los clones retenidos se verificaron mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). El plásmido resultante se denominó *pGUS-2-pGEA6D*.

El fragmento EcoRI-BamHI portador del promotor pGEA6D aislado a partir del pGUS-2-pGEA6D, se trató con Klenow según las instrucciones del fabricante (Biolabs), se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se sometió a precipitación con alcohol, se secó y se ligó al ADN plasmídico del pBIOC21 en el XhoI tratados Klenow. El plásmido modificado pBIOC21 se obtuvo mediante doble digestión del pBIOC21 con HindIII tratada con Klenow y KpnI para suprimir el fragmento portador del promotor pd35S y remplazarlo con el fragmento KpnI-EcoRV portador del poliengarce compuesto por los sitios KpnI-XhoI-SalI-ClaL-HindIII-BamHI-SmaI-EcoRI-EcoRV del pBSIISK+.

La ligación se realizó con 20 ng de pBIOC21 desfosforilado y 200 ng de los fragmentos de ADN EcoRI-BamHI descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados sobre 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC92.

e) Construcción de los plásmidos binarios pBIOC93, pBIOC94, pBIOC95, pBIOC96 y pBIOC97 que contienen la PSLGL-LGC

El plásmido pBIOC40 se ha descrito más arriba. Este plásmido contiene el fragmento BglII-XbaI portador de la secuencia PSLGL-LGC.

Este fragmento se aisló mediante digestión enzimática doble con BglII y XbaI, se purificó mediante electroforesis con gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó, se sometió a precipitación con alcohol, se secó, se trató con Klenow, y se ligó a pBIOC28 (descrito más arriba) digerido con EcoRI, tratado con Klenow y desfosforilado; a pBIOC90 digerido con EcoRI, tratado con Klenow y desfosforilado; a pBIOC91 digerido con SmaI y desfosforilado; a pBIOC92 digerido con HindIII tratado con Klenow y desfosforilado, para producir respectivamente pBIOC93, pBIOC94, pBIOC95 y pBIOC96.

El plásmido pBIOC97, resultante de la clonación del fragmento KpnI-EcoRV portador del casete de expresión "pGEA6D-PSLGL-LGC-t35S", se trató con el enzima polimerasa de ADN de T4, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se sometió a precipitación con alcohol, se secó y se ligó a pSCV1,2 digerido con SmaI y desfosforilado. El casete de expresión "pGEA6D-PSLGL-LGC-t35S" procede del pBIOC92.

III. Construcción de genes quiméricos que codifican la proteína recombinante de la lipasa gástrica humana, y que permiten la expresión constitutiva, por ejemplo, en las hojas y semillas de tabaco a) Construcción del plásmido binario pBIOC82 que contiene el promotor quimérico Super-Promoter pSP

La expresión del gen que codifica la lipasa gástrica humana (LGH) en hojas de tabaco requiere las siguientes secuencias reguladoras:

1.: el promotor quimérico super-promoter (pSP; PCT/US94/12946). está constituido por la fusión de tres activadores transcripcionales del promotor del gen de la sintasa de octopina de Agrobacterium tumefaciens, de un elemento activador transcripcional del gen de la sintasa de manopina, y del promotor de la sintasa de manopina de Agrobacterium tumefaciens,

Para obtener un plásmido binario similar al pBIOC21, pero en el cual el promotor pd35S estuviera remplazado por el promotor pSP, se aisló el fragmento pvuII-SalI, sometido a Klenow, que contenía el promotor pSP, usando el plásmido pBISNI (PCT/US94/12946), purificado mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, electroeluido (Sambrook et al., 1989), sometido a precipitación con alcohol, secado y ligado al ADN plasmídico del pBIOC81, doblemente digerido con KpnI y EcoRI, y sometido a la polimerasa de ADN de T4, y desfosforilado mediante el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. El plásmido pBIOC81 corresponde al pBIOC21 el sitio XbaI del cual ha sido suprimido. Con objeto de hacer esto, se digirió el plásmido pBIOC21 con XbaI, a continuación se sometió a la acción del enzima Klenow, y se ligó por la acción de la ligasa de ADN de T4.

La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN portadores de pSP descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC82.

La lipasa gástrica humana (LGH) se sintetiza naturalmente en forma de un precursor descrito en la publicación por Bodmer et al., 1987. La proteína LGH madura está constituida por 379 aminoácidos. Su péptido señal (PSLGH) está compuesto por 19 aminoácidos. El sitio de restricción entre PSLGH y LGH es Gly-Leu.

La secuencia que codifica el precursor de la LGH se usó para la construcción de los plásmidos binarios pBIOC85, que contenía el PSLGH-LGH, pBIOC87, que contenía el PSLPH-LGH, y pBIOC89 que contenía el PSLGL-LGH, en donde la secuencia que codifica la LGH está precedida respectivamente por aquéllas que codifican su péptido señal natural, el PSLGH, el péptido señal de la lipasa pancreática humana (PSLGL; Giller et al., 1992) y el péptido señal de la lipasa gástrica de conejo (PSLGL; ya descrita previamente; Patente Europea nº 92.403055.4).

La secuencia que codifica el precursor de la LGH e aisló mediante doble digestión con PstI y DraI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), se precipitó en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugó a 12.000 g durante 30 minutos, se lavó con etanol al 70%, se secó. A continuación se clonó en los sitios PstI y SpeI (sometidos a la acción del enzima polimerasa del ADN de T4 (Biolabs) según las instrucciones del fabricante) del plásmido pBSIISK+ comercializado por Stratagene. La ligación se realizó con 100 ng de vector y 50 ng de los fragmentos de ADN portadores de la secuencia que codifica el precursor de la LGH descrita más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC83.

La secuencia que codifica la LGH madura se modificó mediante la introducción de un sitio BamHI, el cual no existía previamente, en los codones noveno y décimo, mediante mutagénesis dirigida por la PCR usando 2 oligodesoxinucleótidos: 5' aaactgcaggctcgag TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT GAA GTG ACT ATG 3' (conteniendo los sitios únicos PstI, XhoI y BamHI) y 5' AAT GGT GGT GCC CTG GGA ATG GCC AAC ATA GTG TAG CTG C 3' (conteniendo el único sitio MscI en el plásmido pBIOC83).

La amplificación del fragmento PstI-MscI se realizó en 100 \mul de medio de reacción que comprendía 10 \mul del tampón de la polimerasa de ADN Taq \times10 (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 9,0, y 1% de Triton \times100), 6 \mul de MgCl_{2} 25 mM, 3 \mul de dNTP 10 mM (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 100 pM de cada uno de los 2 oligodesoxinucleótidos descritos más arriba, 5 ng de ADN matriz (vector pRU303), 2,5 U de polimerasa del ADN Taq (Promega) y 2 gotas de aceite de vaselina. El ADN se desnaturalizó a 94ºC durante 5 minutos, se sometió a 30 ciclos, compuesto cada uno por 1 minuto de desnaturalización a 94ºC, 1 minuto de hibridación a 65ºC y 1 min de elongación a 72ºC, y a continuación se continuó la elongación a 72ºC durante 5 minutos. La reacción de la PCR se realizó en la máquina "DNA Thermal Cycler" de PERKIN ELMER CETUS. PstIEl aceite se retiró mediante extracción con cloroformo. Los fragmentos de ADN contenido en el medio de reacción se precipitaron en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugaron a 12.000 g durante 30 minutos, se lavaron con etanol al 70%, se secaron, y se digirieron con los 2 enzimas de restricción PstI y MscI. Los fragmentos de ADN digeridos originados en la PCR se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se precipitaron en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugaron a 12.000 g durante 30 minutos, se lavaron con etanol al 70%, se secaron, y a continuación se ligaron al ADN plasmídico del vector pBIOC83, el cual se había digerido dos veces con PstI y MscI, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyeron, se sometieron a precipitación en alcohol, y se secaron. La ligación se realizó con 100 ng del vector y 50 ng de los fragmentos de ADN digeridos, procedentes de la amplificación mediante la PCR, descritos más arriba, en un medio de reacción de 10 \mu en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. Algunos de los clones retenidos se verificaron mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). La introducción de este sitio de restricción BamHI no modifica el código genético de la LGH. De hecho, la secuencia natural de la LGH, GGA AGC (Gly-Ser), pasa a ser GGA TCC (Gly-Ser). El plásmido resultante se denominó pBIOC84.

b) Construcción del plásmido binario pBIOC85 que contienen la PSLGH-LGH

El fragmento PstI-XbaI portador de la secuencia de PSLGH-LGH se aisló mediante doble digestión enzimática con PstI y XbaI a partir de pBIOC83, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), y se sometió a precipitación con alcohol, y se secó. A continuación, este fragmento de ADN se trató con el enzima polimerasa del ADN de T4 (Biolabs) según las instrucciones del fabricante, y se ligó al ADN plasmídico del pBIOC82 digerido en el sitio EcoRI, tratado con Klenow (Biolabs) y desfosforilado con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN, que contenían la PSLGH-LGH, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC85. La secuencia nucleotídica del fragmento que codifica la proteína recombinante PSLGH-LGH se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). La secuencia de restricción entre PSLGH y la LGH madura es Gly-Leu. El ADN plasmídico del vector binario pBIOC85 se introdujo mediante transformación directa en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens según el procedimiento de Holsters et al., (1978). La validez del clon retenido se verificó mediante digestión enzimática del ADN plasmídico introducido.

c) Construcción del plásmido binario pBIOC86 que contiene la PSL

El plásmido pBIOC84 se digirió dos veces con PstI BamHI con objeto de suprimir la secuencia que codifica péptido señal PSLGH y los primeros 8 aminoácidos de proteína LGH madura (Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly). Esta secuencia se remplazó por la que codifica el péptido señal PSLPH de 16 aminoácidos (ATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA) fusionada a la que codifica los 8 primeros codones de la proteína LGH madura ("PSLPH-8 primeros codones de la LGH madura"). La secuencia "PSLPH-8 primeros codones de la LGH madura" se amplificó mediante la PCR a partir de la matriz 5' aaactgcaggctcgagaacaATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' usando los 2 oligodesoxinucleótidos, 5' aaactgcaggctcgagaacaATG C 3' y 5' C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3', según el protocolo de amplificación con la PCR descrito previamente (ver el parágrafo I más arriba). Se ajustó la temperatura de hibridación. Después de doble digestión enzimática con PstI and BamHI, los fragmentos enzimáticos procedentes de la amplificación con la PCR, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se precipitaron en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugaron a 12.000 g durante 30 minutos, se lavaron con etanol al 70%, se secaron, y a continuación se ligaron al ADN plasmídico del vector pBIOC84, doblemente digerido PstI y BamHI, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se sometieron a precipitación con alcohol, y se secaron. La ligación se realizó con 100 ng de vector y 50 ng de los fragmentos de ADN digeridos, procedentes de la amplificación mediante la PCR descrita más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. Algunos de los clones retenidos se verificaron mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). Las secuencias de la PSLPH y de la LGH madura se clonaron mientras se mantenían sus pautas de lectura abierta (es decir, de tal forma que constituyen una única pauta de lectura abierta). La secuencia de restricción entre PSLPH y la LGH madura es Gly-Leu. El plásmido resultante se denominó
pBIOC86.

El fragmento PstI-XbaI portador de la secuencia PSLPH-LGH se aisló mediante doble digestión enzimática con PstI y XbaI a partir de pBIOC86, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), y se sometió a precipitación con alcohol, y se secó. A continuación, este fragmento de ADN se trató con el enzima polimerasa del ADN de T4 (Biolabs) según las instrucciones del fabricante, y se ligó al ADN plasmídico del pBIOC82 digerido en el sitio EcoRI, tratado con Klenow (Biolabs) y desfosforilado con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN que contenían la PSLPH-LGH, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC87. La secuencia nucleotídica del fragmento que codifica la proteína recombinante PSLPH-LGH se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). El ADN plasmídico del vector binario pBIOC87 se introdujo mediante transformación directa en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens según el procedimiento de Holsters et al., (1978). La validez del clon retenido se verificó mediante digestión enzimática del ADN plasmídico introducido.

d) Construcción del plásmido binario pBIOC89 que contiene la PSLGL-LGH

El plásmido pBIOC84 se digirió doblemente con PstIy BamHI con objeto de suprimir la secuencia que codifica el péptido señal PSLGH y los primeros 8 aminoácidos de la proteína LGH madura (Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly). Esta secuencia se remplazó por la que codifica el péptido señal PSLGL de 19 aminoácidos (ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT) fusionada a la que codifica los 8 primeros codones de la proteína LGH madura ("PSLGL-8 primeros codones de la LGH madura"). La secuencia "PSLGL-8 primeros codones de la LGH madura" se amplificó mediante la PCR a partir de la matriz 5' aaactgcaggctc
gagaacaATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' usando los 2 oligodesoxinucleótidos, 5' aaactgcaggctcgagaacaATG C 3' y 5' C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3', según el protocolo de amplificación con la PCR descrito previamente (ver el parágrafo I más arriba). Se ajustó la temperatura de hibridación. Después de doble digestión enzimática con PstI and BamHI, los fragmentos enzimáticos procedentes de la amplificación con la PCR, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se precipitaron en presencia de 1/10 volúmenes acetato sódico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol absoluto a -80ºC durante 30 minutos, se centrifugaron a 12.000 g durante 30 minutos, se lavaron con etanol al 70%, se secaron, y a continuación se ligaron al ADN plasmídico del vector pBIOC84, doblemente digerido PstI y BamHI, se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyeron (Sambrook et al., 1989), se sometieron a precipitación con alcohol, y se secaron. La ligación se realizó con 100 ng de vector y 50 ng de los fragmentos de ADN digeridos, procedentes de la amplificación mediante la PCR descrita más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados sobre 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. Algunos de los clones retenidos se verificaron mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). Las secuencias de la PSLGL y de la LGH madura se clonaron mientras se mantenían sus pautas de lectura abierta (es decir, de tal forma que constituyen una única pauta de lectura abierta). La secuencia de restricción entre PSLGL y la LGH madura es Gly-Leu. El plásmido resultante se denominó pBIOC88.

El fragmento PstI-XbaI portador de la secuencia de PSLGL-LGH se aisló mediante doble digestión enzimática con PstI y XbaI a partir de pBIOC88, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó (Sambrook et al., 1989), y se sometió a precipitación con alcohol, y se secó. A continuación, este fragmento de ADN se trató con el enzima polimerasa del ADN de T4 (Biolabs) según las instrucciones del fabricante, y se ligó al ADN plasmídico del pBIOC82 digerido en el sitio XbaI, tratado con Klenow (Biolabs) y desfosforilado con el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN, que contenían la PSLGL-LGH, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionado sobre 12 \mug/ml de tetraciclina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC89. La secuencia nucleotídica del fragmento que codifica la proteína recombinante PSLGL-LGH se verificó mediante secuenciación con la ayuda del equipo de secuenciación T7^{TM}, comercializado por Pharmacia, según el procedimiento del didesoxinucleótido (Sanger et al., 1977). El ADN plasmídico del vector binario pBIOC89 se introdujo mediante transformación directa en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens según el procedimiento de Holsters et al., (1978). La validez del clon retenido se verificó mediante digestión enzimática del ADN plasmídico introducido.

IV. Construcción de genes quiméricos que codifican la proteína recombinante de la lipasa gástrica de perro, y que permiten la expresión en semillas de maíz a) Construcción de los plásmido pBIOC98 y pBIOC99 que contienen la PSLGL-LGC y permiten la expresión en semillas de maíz

La expresión constitutiva del gen que codifica la lipasa gástrica de perro (LGC) en semillas de maíz requiere las siguientes secuencias reguladoras:

1. uno de los dos promotores que permiten la expresión constitutiva:

: el promotor actina del arroz seguido por el intrón de actina del arroz (pAR-IAR) contenido en el plásmido pAct1-F4 descrito por McElroy et al., (1991);

: el promotor constitutivo doble 35S (pd35S) del CaMV (virus del mosaico de la coliflor). Corresponde a una duplicación de las secuencias que activan la transcripción, situadas cadena arriba respecto el elemento TATA de un promotor 35S natural (Kay et al., 1987);

2. uno de los dos terminadores:

: la secuencia de transcripción terminal, el terminador del poliA 35S, que corresponde a la región 3' no codificante del virus del mosaico de la coliflor, de ADN circular de doble hebra, el cual produce el transcrito 35S (Franck et al., 1980),

: la secuencia de transcripción terminal, terminador polyA NOS, que corresponde a la región 3' no codificante del gen de la sintasa de nopalina del plásmido Ti de la cepa nopalina de Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982).

El plásmido pBIOC98, en donde la secuencia que codifica la PSLGL-LGC se coloca bajo el control de pAR-IAR, se obtuvo clonando el fragmento BglII-XbaI portador de la secuencia que codifica la PSLGL-LGC en los sitios "NcoI y SalI" del pBSII-pAR-IAR-tNOS.

El fragmento BglII-XBaI portador de la secuencia PSLGL-LGC se aisló a partir de pBIOC40 (descrito más arriba) mediante doble digestión enzimática con BglII y XbaI, se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, se electroeluyó, se sometió a precipitación con alcohol, se secó, y a continuación se trató con el enzima Klenow. El plásmido pBSII-pAR-IAR-tNOS se digirió doblemente con SalI y NcoI, se purificó, se trató con el enzima Mung Bean Nuclease, y se desfosforiló mediante el enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternera (Boehringer Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado descrito más arriba y 200 ng de los fragmentos de ADN, que contenían la PSLGL-LGC, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC98.

El plásmido pBSII-pAR-IAR-tNOS resulta de la clonación en sitios "Eco01091 tratador con Klenow y KpnI" del pBSII-tNOS del fragmento SnaBI-KpnI portador de la secuencia correspondiente a "pAR-IAR-incio de la secuencia que codifica el gen gus" aislada del plásmido pAct1-F4. La ligación se realizó con 100 ng del vector y 50 ng de los fragmentos de ADN descritos más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción.

El plásmido pBSII-tNOS se obtuvo clonando en el sitio EciRV desfosforilado del pBSIISK+ comercializado por Stratagene, el fragmento SacI-EcoRI portador de la secuencia tNOS aislada del pBI121 comercializado por Clontech mediante digestión enzimática doble con SacI y EcoRV, sometido a purificación mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y tratado con el enzima polimerasa de ADN de T4. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado y 200 ng de los fragmentos de ADN que contenían la secuencia tNOS, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción.

El plásmido pBIOC99, en donde la secuencia que codifica la PSLGL-LGC se coloca bajo el control de pd35S, se obtuvo clonando, en los sitios "KpnI y BamHI" del pBSII-t35S, el fragmento KpnI-BamHI portador de la secuencia que codifica la "pd35S-PSLGL-LGC" aislada del pBIOC41 descrito más arriba. La ligación se realizó con 100 ng del vector y 50 ng de los fragmentos de ADN descritos más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul digeridos en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción.

El plásmido pBSII-t35S se obtuvo clonando, en el sitio SpeI desfosforilado tratado con Klenow del pBSIISK+ comercializado por Stratagene, el fragmento SmaI-EcoRV portador de la secuencia t35S aislada del pJIT163 (descrito más arriba) mediante digestión enzimática doble con SmaI y EcoRV, sometido a purificación mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%. La ligación se realizó con 20 ng del vector desfosforilado y 200 ng de los fragmentos de ADN que contenían la secuencia t35S, descritos más arriba, en un medio de reacción de 20 \mul en presencia de 2 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham), 2 \mul de polietilenglicol 8000 al 50%, y 5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción.

b) Construcción de los plásmido pBIOC100 y pBIOC101 que contienen respectivamente la PSLGL-LGC y la PSLGL-LGC-KDEL y permiten la expresión en el albumen de semillas de maíz

La expresión del gen animal que codifica la lipasa gástrica de perro (LGC) en semillas de maíz requiere las siguientes secuencias reguladoras:

1.: el promotor del gen de la \gammazeína de maíz (p\gammazeína) contenido en el plásmido p\gamma63 descrito en Reina et al., El plásmido p\gamma63 resulta de la clonación del p\gammazeína en los sitios HindIII y XbaI del plásmido pUC18 que contiene, entre sus sitios HindIII y EcoRI, el casete de expresión "p35S-gus-tNOS" del pBI221 comercializado por Clontech. Éste permite la expresión en el albumen de semillas de maíz.

2.: la secuencia de transcripción terminal, terminador polyA NOS, que corresponde a la región 3' no codificante del gen de la sintasa de nopalina del plásmido Ti de la cepa nopalina de Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al., 1982).

El plásmido pBIOC100, en donde la secuencia que codifica la PSLGL-LGC se coloca bajo el control de p\gammazeína, se obtuvo clonando, en los sitios "SacI tratados con el enzima polimerasa del ADN de T4 y BamHI" del plásmido p\gammazeína, el fragmento "XbaI tratado con Klenow-BglII" aislado de pBIOC40. La ligación se realizó con 100 ng del vector y 50 ng de los fragmentos de ADN descritos más arriba, en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul del tampón de ligasa de ADN de T4 \times10 (Amersham) y 2,5 U del enzima ligasa de ADN de T4 (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Se transformó la bacteria Escherichia coli DH5\alpha, previamente hecha competente (Hanahan, 1983). El plásmido de ADN de los clones obtenidos, seleccionados sobre un medio que contenía 50 \mug/ml de ampicilina, se extrajo mediante el procedimiento de la lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979) y se analizó mediante digestión enzimática con enzimas de restricción. El plásmido resultante se denominó pBIOC100.

El plásmido pBIOC101 resulta de la sustitución del fragmento NcoI-AflII de pBIOC100 por el fragmento NcoI-AflII portador de la secuencia que codifica el tetrapéptido KDEL (que permite el direccionamiento hacia el retículo endoplásmico), colocado antes del codón de detención, y obtenido mediante amplificación con la PCR de acuerdo con los procedimientos descritos más arriba. Los 2 oligodesoxinucleótidos usados durante esta reacción fueron: 5' AAT CAC TTG GAC TTT ATC TGG Gcc atg GAT GCC 3' (sitio NcoI único) y 5' ATT ctt aag AAA CTT TAT TGC CAA ATG TTT GAA CGA TCG GGG AAA TTC GAC GCG TCT AGA ACT ATA GCT CAT CCT TAT TAT CTG TTC CCA TCA TGG 3' (la secuencia que codifica el KDEL y un sitio AflII único). La temperatura de hibridación fue de 70ºC. La clonación se realizó como se ha descrito previamente.

V. Ejemplo de la producción de plantas de colza transgénicas

Las semillas de colza de primavera (Brassica napus cv WESTAR o líneas Limagrain) se desinfectaron durante 40 minutos en una solución al 15% de Domestos. Después de lavarlas 4 veces con agua estéril, las semillas se pusieron a germinar, a razón de 20 semillas por maceta de 7 cm de diámetro y 10 cm de alto, sobre medio mineral de Murashige y Skoog (Sigma M 5519) con 30 g/l de sacarosa y solidificado con agargel a 5 g/l. Estas macetas se colocaron en una cámara de cultivo a 26ºC con un fotoperíodo de 16 h/8 h bajo una intensidad luminosa del orden de 80 \muE m^{-2}s^{-1}.

Después de 5 días de germinación, se retiran los cotiledones en condiciones estériles cortando cada peciolo aproximadamente 1 mm por encima del nódulo cotiledóneo.

En paralelo, se ha preparado un precultivo de Agrobacterium tumefaciens, cepa LBA4404, que contenía el plásmido pBIOC29 (o pBIOC25), es decir, el plásmido pGAZE en el que se ha insertado la secuencia que codifica la lipasa gástrica de perro fusionada con la que codifica un PPS (o PS) señal director, bajo el control del promotor pCRU (o pd35S), en un erlenmeyer de 50 ml, durante 36 horas, a 28ºC, en 10 ml de medio bacteriano 2YT (Sambrook et al., 1989), suplementado con los antibióticos útiles para la selección de la cepa utilizada.

Este precultivo sirve para sembrar, en un 1%, un nuevo cultivo bacteriano efectuado en las mismas condiciones. Transcurridas 14 horas, el cultivo se centrifuga durante 15 minutos a 3.000 g, y las bacterias se retoman en un volumen equivalente de medio de germinación líquido. Esta suspensión se distribuye en placas de Petri de 5 cm de diámetro a razón de 5 m/placa.

La extremidad seccionada del peciolo se sumerge algunos segundos en la solución de agrobacterias preparada de este modo, después se entierra el peciolo algunos milímetros en el medio de regeneración. Este medio tiene la misma composición de base que el medio de germinación, con la adición de 4 mg/ml de bencil-amino-purina (BAP), una fitohormona que promueve la nueva formación de brotes. Se cultivan diez explantes (cotiledón con peciolo) por placa de Petri de 9 cm de diámetro (Greiner reference 664102).

Después de 2 días de co-cultivo en las mismas condiciones medioambientales que la germinación, los explantes se replantan en cajas Phytatray (Sigma, referencia P1552) que contienen el medio precedente suplementado con un agente selector: 45 mg/l de sulfato de kanamicina (Sigma, referencia K4000) y un bacteriostático: mezcla de 1/6 (en peso) de la sal potásica del ácido clavulánico y 5/6 de la sal sódica de la amoxicilina (Augmentin, inyectable) en una cantidad de 600 mg/l.

Dos veces seguidas, con un intervalo de 3 semanas, los explantes se replantan en condiciones estériles sobre medio nuevo bajo las mismas condiciones.

Los brotes verdes aparecidos al final del segundo o tercer replante se separan del explante y se ponen en cultivo individualmente en potes transparentes de 5 cm de diámetro y 10 cm de alto, que contienen un medio idéntico al precedente, pero desprovisto de BAP. Después de crecer durante 3 semanas, el tallo de los brotes transformados se secciona y el brote se replanta en una maceta con medio fresco. Al final de tres o cuatro semanas, las raíces están suficientemente desarrolladas como para permitir la aclimatación de la plántula en un fitotrón. Los brotes que no son verdes o que no han enraizado se eliminan. Estas plántula se trasplantan en potes con 7 cm de lado rellenos de tierra (norma NF U44551: 40% de turba marrón, 30% de tierra de brezo tamizada y 30% de arena) saturada con agua. Después de dos semanas de aclimatación en fitotrón (temperatura 21ºC, fotoperíodo de 16 h/8 h y 84% de humedad relativa), las plántulas se trasplantan en potes de 12 cm de diámetro rellenos con la misma tierra enriquecida con fertilizante retardado (Osmocote, en una cantidad de 4 g/l de tierra) y a continuación se transportan a un invernadero (clase S2) regulado a 18ºC con dos riegos diarios con agua durante 2 minutos.

A partir de la aparición de las flores, éstas se colocan en bolsas (Crispac, referencia SM 570y 300 mm*700 mm) de forma que se impide la fecundación cruzada.

Cuando las silicuas alcanzan la madurez, se recolectan, se secan y a continuación se trillan. Las semillas obtenidas se usan para el análisis de la actividad bioquímica. La selección de la descendencia transgénica se hace por germinación en un medio que contiene sulfato de kanamicina a razón de 100 a 150 mg/l (según los genotipos). Las condiciones de trabajo son idénticas a las descritas más arriba, excepto que las germinaciones se efectúan en tubos de vidrio con una única semilla por tubo. Sólo las plántulas que desarrollan raíces secundarias durante las tres primeras semanas son aclimatadas en fitotrón antes de pasarlas al invernadero.

VI. Ejemplo de la producción de plantas solanáceas transgénicas a) Producción de plantas de tabaco transgénicas

Las plantas de tabaco usadas para los experimentos de transformación (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC y PBD6) se cultivan in vitro sobre el medio de base de Murashige and Skoog (1962), adicionado con las vitaminas de Gamborg et al., (1968, Sigma referencia M0404), con sacarosa a 20 g/l, y agar (Merck) a 8 g/l. The pH del medio se ajusta a 5,8 con una solución de potasa antes de autoclavarlo a 120ºC durante 20 minutos. Las plántulas de tabaco se replantan mediante cortes entre los nudos cada 30 días sobre este medio de multiplicación MS20.

Todos los cultivos in vitro se realizaron en una cámara climáticamente controlada en las condiciones definidas más abajo:

: intensidad luminosa de 30 \muE.m^{-2}.s^{-1};

: fotoperíodo de 16 h;

: termoperíodo de 26ºC durante el día, 24ºC de noche.

La técnica de transformación se deriva de la de Horsch et al., (1985).

Se realizó un precultivo de Agrobacterium tumefaciens, cepa LBA4404, conteniendo los plásmidos pBIOC29 o pBIOC26 o pBIOC25, durante 48 h a 28ºC, bajo agitación, en medio LB (Sambrook et al., 1989), suplementado con los antibióticos adecuados (rifampicina y tetraciclina). El precultivo se diluyó a continuación 50 veces en el mismo medio y se cultivo en las mismas condiciones. Después de una noche, se centrifugó el cultivo (10 minutos, 3000 g), se recuperaron las bacterias en un volumen equivalente de medio líquido MS (30 g/l de sacarosa), y esta suspensión se diluyó 10 veces.

Se cortaron explantes de aproximadamente 1 cm^{2} a partir de hojas de las plántulas descritas más arriba. A continuación se pusieron en contacto con la suspensión bacteriana durante 1 hora, después se secaron rápidamente sobre papel de filtro, y se colocaron sobre un medio de co-cultivo (MS30 sólido).

Después de 2 días, los explantes se transfirieron a placas de Petri sobre medio de regeneración MS30 que contenía un agente selector, la kanamicina (200 mg/l), un bacteriostático, la Augmentina (400 mg/l), y las hormonas necesarias para la inducción de brotes (BAP, 1 mg/l, y ANA, 0,1 mg/l). Se efectuó un replante de los explantes sobre el mismo medio después de 2 semanas de cultivo. Después de 2 semanas suplementarias, los brotes se replantan en placas de Petri sobre el medio de desarrollo, compuesto por medio MS20 suplementado con kanamicina y Augmentina. Después de 15 días, los brotes se resembraron. El enraizamiento requiere aproximadamente 20 días, al final de los cuales, las plántulas pueden clonarse cortando entre los nudos o sacadas al invernadero.

b) Producción de plantas de tomate transgénicas

Las semillas de tomate cv. UC82B se esterilizan con 10% de Domestos durante 15 minutos y se lavan 3 veces con agua estéril. El último lavado se efectúa durante 10 minutos bajo agitación.

Las semillas así esterilizadas se ponen a germinar en medio MSSV/2 (medio base de Murashige y Skoog (1962, Sigma referencia M6899)/2 al que se le añaden las vitaminas de Nitsch (Thomas y Pratt, 1981), sacarosa a 30 g/l, agar (Merck) a 8 g/l, pH 5,9, durante 8 u 8 días, en cámara controlada climáticamente (intensidad luminosa de
30 \muE.m^{-2}, s^{-1}, fotoperíodo de 16 h/8 h, 26ºC).

La técnica de transformación se deriva de la de Fillatti et al., (1987).

Se realizó un precultivo de Agrobacterium tumefaciens, cepa LBA4404, conteniendo los plásmidos pBIOC25 o pBIOC26, durante 24 h a 28ºC, bajo agitación, en medio LB, suplementado con los antibióticos adecuados (rifampicina y tetraciclina). El precultivo se diluyó a continuación 50 veces en el mismo medio y se cultivo en las mismas condiciones durante una noche. La OD se mide a 600 nm, se centrifugan las agrobacterias (10 minutos, 3000 g) y se retoman en medio KCMS líquido (descrito en la publicación de Fillatti et al., 1987) con objeto de obtener una OD de 0,8 a 600 nm.

Se han aportado mejoras técnicas en ciertas etapas del protocolo de Fillatti et al., (1987).

El precultivo de los explantes y el co-cultivo se han realizado como describieron by Fillatti et al., (1987) excepto que el medio KCMS se suplementó con acetosiringona (200 mM).

El medio de lavado 2Z difiere por la adición de cefotaxima a 500 mg/l en vez de carbenicilina. El medio de desarrollo utilizado está compuesto por el medio base de Murashige y Skoog (Sigma MS6899), suplementado con las vitaminas de Nitsch, sacarosa a 20 g/l, kanamicina a 50 mg/l, Augmentina a 200 mg/l, ANA a 1 mg/l y zeatina a 0,5 mg/l.

VII. Producción de plantas de maíz transgénicas a) Producción y utilización de callos de maíz como una diana para la transformación genética

La transformación genética del maíz, cualquiera que sea el procedimiento empleado (electroporación; Agrobacterium; microfibras, cañón de partículas), requiere generalmente la utilización de células indiferenciadas en divisiones rápidas que hayan conservado una aptitud para la regeneración de plantas enteras. Este tipo de células incluye el callo friable embriogénico (denominado del tipo II) del maíz.

Estos callos se obtienen a partir de embriones inmaduros del genotipo Hl II o (A188\timesB73) según el procedimiento y sobre los medios descritos por Armstrong (Malze Handbook; (1994), Eds. M. Freeling, V. Walbot; pp. 665-671). Los callos obtenidos de esta forma se multiplican y mantienen mediante replantes sucesivos cada quince días sobre el medio de iniciación.

A continuación se regeneran plántulas a partir de estos callos modificando el equilibrio hormonal y osmótico de las células según el procedimiento descrito por Vain et al., (Plant Cell Tissue and Organ Culture, 18:143-151 (1989)). Estas plantas se aclimatan a continuación en invernadero, en donde pueden cruzarse o autofecundarse.

b) Utilización del cañón de partículas para la transformación genética del maíz

El parágrafo precedente describe la obtención y la regeneración de las líneas celulares necesarias para la transformación; se describe aquí un procedimiento de transformación genética que conduce a la integración estable de los genes modificados en el genoma de la planta. Este procedimiento se basa en la utilización de un cañón de partículas idéntico al descrito por J. Finer (Plant Cell Report, 11:323-328 (1992)); las células diana son los fragmentos de callos descritos en el parágrafo 1. Los fragmentos con una superficie de 10 a 20 mm^{2} se han dispuesto, 4 horas antes del bombardeo, a razón de 16 fragmentos por placa, en el centro de una placa de Petri que contiene un medio de cultivo idéntico al medio de iniciación, suplementado con 0,2 M de manitol + 0,2 M de sorbitol. Los plásmidos portadores de los genes a introducir se purifican en una columna Qiagen.RTM, según las instrucciones del fabricante. A continuación se precipitan sobre partículas de tungsteno (M10) siguiendo el protocolo descrito por Klein (Nature, 327:70-73 (1987)). Las partículas recubiertas de este modo se proyectan hacia las células diana con la ayuda de un cañón y según el protocolo descrito por J. Finer (Plant Cell Report, 11:323-328 (1992)).

Las placas de callos bombardeadas de este modo, se sellan a continuación con la ayuda de Scellofraisre, y después se cultivan a oscuras a 27ºC. El primer replante tiene lugar 24 horas después, y a continuación cada quince días durante 3 meses sobre medio idéntico al medio de iniciación, suplementado con un agente selector, el tipo y la concentración del cual puede variar según el gen utilizado (ver parágrafo 3). Los agentes de selección utilizables consisten generalmente en compuestos activos de ciertos herbicidas (Basta®, Round up®) o cierto antibióticos (Higromicina, Kanamicina).

Después de 3 meses, o a veces algo antes, callos en los que el crecimiento no está inhibido por el agente de selección, habitual y mayoritariamente compuestos por células resultantes de la división de una células que tiene integrado en su patrimonio genético una o más copias del gen de selección. La frecuencia de obtención de tales callos es aproximadamente de 0,8 callos por placa bombardeada.

Estos callos se identifican, individualizan, amplifican, y a continuación se cultivan con objeto de regenerar las plántulas (ver parágrafo a). Con objeto de evitar toda interferencia con las células no transformadas, todas estas operaciones se realizan en medios de cultivo que contienen el agente selector.

Las plantas así regeneradas se aclimatan, a continuación se cultivan en un invernadero, en donde pueden cruzarse o autofecundarse.

VIII. Análisis de la expresión de la lipasa gástrica de perro en plantas transgénicas de tabaco a) Protocolo

El protocolo para la extracción de la lipasa a partir de hojas de tabaco obtenidas de plantas en el invernadero es como sigue: 1 g de hojas (peso fresco) se muele en nitrógeno líquido y a continuación a 4ºC en 5 ml del tampón Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, al que se ha añadido EDTA 1 mM y mercaptoetanol 10 mM (tampón A), ó tampón glicina-HCl 25 mM, pH 3, al que se le ha añadido EDTA 1 mM, \beta-mercaptoetanol 10 mM, 0,2% de Triton X-100 y NaCl 250 mM (tampón B). El material molido total se centrifuga inmediatamente a 4ºC durante 15 minutos a 10.000 g.

Para las semillas de tabaco, la extracción se realiza en tampón B en una cantidad de 0,1 g de semillas por 4 ml de tampón.

La actividad lipásica se determina con la ayuda de un pH-STAT mediante el procedimiento titrimétrico de Gargouri et al., (1986), en el cual el sustrato utilizado es la tributirina. La emulsión de tributirina (4 ml por 30 ml de emulsión) se preparar en un agitador por vórtice en presencia de sales biliares (1,04 g/l), albúmina bovina (0,1 g/l) y NaCl (9 g/l). El análisis comprende la neutralización del ácido butírico liberado bajo la acción de la lipasa con una solución de carbonato sódico a un pH regulado a 5,5 y a 37ºC. Una unidad de lipasa corresponde a la cantidad de enzima que causa la liberación de un micromol de ácido graso en 1 minutos a 37ºC bajo condiciones de pH óptimo (5,5). La lipasa gástrica de perro natural (purificada) tiene una actividad específica de 570 units/mg de proteína. La actividad lipásica puede medirse en el material molido total, en el sedimento, o en el sobrenadante de la centrifugación.

En el sobrenadante de la centrifugación (tampón A), se realiza un análisis de las proteínas totales solubles mediante el procedimiento de Bradford (1976).

Igualmente, se realiza un ensayo de ELISA en sándwich (Carriere et al., 1993) con el sobrenadante de la centrifugación con 2 poblaciones de anticuerpos policlonales anti-LGC natural. La primera población incluye los anticuerpos que reaccionan con la lipasa gástrica humana y que se han purificado por afinidad, a partir de antisuero total, con lipasa gástrica humana unida sobre una columna de Affigel 10 (Aoubala et al., (1993). Estos anticuerpos se usan para recubrir los pocillos de las placas de ELISA en una concentración de 1 \mug/ml. La 2ª población comprende los anticuerpos que no reconocen la lipasa gástrica humana. Ulteriormente se purifican en una columna de Sepharose acoplada a la proteína A y a continuación unida a biotina. La fijación de los anticuerpos de pone en evidencia por medios indirectos con un conjugado estreptoavidina/peroxidasa, la actividad enzimática del cual se revela por medio del sustrato o-fenilendiamina. Los resultados obtenidos tiene un valor cualitativo y se registran con la ayuda de los símbolos + y -.

El rendimiento de la extracción puede mejorarse añadiendo al tampón de extracción un detergente del tipo CHAPS (3-(3-colamidopropil)dimetil-amonio-1-propano sulfonato) (SIGMA). De hecho, en este caso, los rendimientos de extracción en el sobrenadante incrementan en aproximadamente el 100% (ver la Tabla 1).

TABLA 1 Actividad lipasa (U/g PF) en los extractos obtenidos a partir de 4 plantas de tabaco procedentes de la transformación con pBIOC25, en presencia de CHAPS 1%

Plantas	NaCl 0,2 M EDTA	NaCl 0,2 M EDTA
	1 mM pH 3,0	1 mM pH 3,0
		+ CHAPS 1%
1	80	112
2	40	104
3	43	109
4	54	92

b) Expresión con los péptidos señal de plantas; análisis de las hojas y de las semillas de tabaco transformadas con pBIOC25 y pBIOC26; ensayo de ELISA

Los resultados obtenidos con 98 plantas T0 del genotipo Xanthi (estadio de 15 a 20 hojas) se muestran en la Tabla 2. Los análisis se han realizado todos sobre los materiales molidos de hojas o semillas antes de la centrifugación. Para cada construcción, las actividades medidas muestran una amplia variabilidad de acuerdo con los transformantes. Aproximadamente el 20% de las plantas no tienen actividad o una actividad demasiado débil para ser detectada. Las actividades promedio y las actividades máximas se proporcionan en la Tabla 2.

Las cantidades de proteínas totales son similares para las 3 construcciones, con medias de 7 y 8 mg/g de PF en las hojas, y 34, 31 y 38 mg/g de PF en las semillas.

La actividad lipásica media en las hojas transformadas con la construcción pBIOC26 es 34 U/g de PF, es decir, 0,8% de expresión con respecto a las proteínas totales. En las semillas, la actividad media es de 36 U/g de PF, es decir, 0,2%. La actividad máxima obtenida en uno de los transformantes es de 146 U/g de PF (hojas; 2,5% de expresión) y 148 U/g de PF (semillas; 0,7% de expresión).

Las actividades enzimáticas analizadas en las plantas transformadas con la construcción pBIOC25 son similares. La actividad media en las hojas es de 34 U/g de PF (0,8% de expresión) y la actividad máxima es de 134 U/g de PF (3% de las proteínas totales). En las semillas, la actividad media es de 42 U/g de PF (0,3%) y la actividad máxima es de 134 U/g de PF (1%).

Para plantas con la construcción pBIOC29, no se detectó actividad en las hojas (promotor específico de semillas). En las semillas, la actividad media es de 12 U/g de PF (0,7%) y la actividad máxima es de 137 U/g de PF (0,7%).

La expresión en las hojas y en las semillas del mismo suceso de transformación está generalmente bien correlacionada.

Los resultados de los ensayos de ELISA concuerdan igualmente con los análisis de actividad enzimática, es decir, que una planta que presente una actividad lipásica da un resultado positivo en el ensayo de ELISA.

Los resultados obtenidos ulteriormente en las mismas plantas muestran que la actividad lipásica es susceptible de cambiar durante el curso del desarrollo de la planta. En efecto, una planta en la que la expresión, en relación a las proteínas totales, era del 3% en el estadio de 12-15 hojas, ha dado una expresión del 6% en un análisis ulterior (planta más vieja que había florecido).

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TABLA 2 Expresión de la lipasa en las hojas y en las semillas de tabaco Xanthi

		Proteínas totales	Actividad lipasa
		mg/g PF
			U/g PF	Expresión (% de
				proteínas totales)
Construcción	Órgano	min-max	min-max	min-max
		(promedio)	(promedio)	(promedio)
pBIOC26	Hojas	3-15	0-145,6	0-2,5
	(n=34)	(7)	(34,4)	(0,8)
	Semillas	24-43	0-147,6	0-0,7
	(n=34)	(34)	(36,3)	(0,2)
pBIOC25	Hojas	3-18	0-133,5	0-3
	(n=35)	(8)	(34)	(0,8)
	Semillas	17-35	0-158,5	0-1
	(n=35)	(31)	(41,9)	(0,3)
pBIOC29	Semillas	29-55	0-137,4	0-0,7
	(n=29)	(38)	(11,8)	(0,1)
\begin{minipage}[t]{160mm} PF, peso fresco; min, valor obtenido para el suceso de transformación que se expresaba al mínimo; max, valor obtenido para el suceso de transformación que se expresaba al máximo; n, número de sucesos de transformación analizados.\end{minipage}

c) Expresión con el péptido señal de la LGL; análisis de la actividad lipasa en las hojas de tabaco

Los resultados obtenidos con 44 plantas T0 de los genotipos Xanthi y PBD6 (estadio de 15 a 20 hojas) son como sigue:

Los análisis se realizaron todos sobre los materiales molidos de hojas antes de la centrifugación. Las actividades analizadas muestran una amplia variabilidad de acuerdo con los transformantes. Aproximadamente el 20% de las plantas no tienen actividad o una actividad demasiado débil para ser detectada. Las actividades lipásicas medias en las hojas transformadas con la construcción pBIOC41 es de 34 U/g de PF para el genotipo Xanthi y de 48 U/g de PF para el genotipo PBD6. Las actividades máximas son respectivamente 152 y 226 U/g de PF.

IX. Análisis de la expresión de la lipasa gástrica de perro en plantas transgénicas de tomate a) Protocolo

El protocolo para la extracción de la lipasa a partir de hojas y frutos de tomate es similar al descrito en ésta para las hojas de tabaco, excepto que se retoma 1 g de material fresco en 4 ml de tampón B. La actividad lipásica se determina tal como se describió para las hojas de tabaco.

b) Análisis en los frutos del tomate

Se analizaron los frutos de una treintena de transformantes primarios.

La actividad lipasa analizada en los frutos es variable dependiendo de los frutos incluso para el mismo transformante. En promedio es de 5 U/g de PF para un fruto maduro y de 35 U/g de PF para un fruto inmaduro, independientemente de la construcción ensayada (pBIOC25 o pBIOC26).

Debería destacarse que durante la putrefacción del fruto la actividad se reduce. Por ejemplo, para un determinado transformante primario, la actividad lipasa es de 132 U/g de PF para un fruto verde con un diámetro de 10 mm, de 44 U/g de PF para un fruto verde-rojo con un diámetro de 33 mm y 36 U/g de PF para un fruto rojo con un diámetro de 45 mm.

X. Inmunodetección del tipo "western" de la lgc recombiante a) LGC expresada en las hojas y semillas de tabaco y de colza transgénicos a.1) Expresión con los péptidos señales vegetales; inmunodetección en las hojas y semillas de tabaco y de colza transformadas con pBIOC25, pBIOC26 y pBIOC29

Los experimentos de inmunodetección del tipo "western" ("transferencias western") (Renart and Sandoval, 1984) con la lipasa gástrica de perro se han realizado con las proteínas de hojas de tabaco y semillas de tabaco y colza extraídas con los tampones A y B (ver el protocolo de extracción más arriba). Para la realización de estos experimentos, las proteínas extraídas (30 \mug de proteínas totales por muestra) se separan primero en un gel de poliacrilamida al 12,5% desnaturalizante de acuerdo con la técnica de U.K. Laemmli (1970), y a continuación se transfieren sobre una membrana de nitrocelulosa. Un anticuerpo policlonal anti-lipasa de conejo, obtenido del cobaya, se usa como sonda y el revelado se efectúa por medio de un anticuerpo anti-IgG del cobaya marcado con fosfatasa alcalina.

La proteína de control es la lipasa gástrica de perro natural (LC, Figura 6), que migra en forma de una única banda con un peso molecular aparente de 50 kDa. La migración de la lipasa gástrica de perro está ligeramente retardada en presencia del extracto de hojas de tabaco no transformadas (Figura 6, LC + T).

No se detecta banda alguna en los extractos proteicos de hojas y de semillas de tabaco y de colza no transformados. La lipasa producida en las hojas de tabaco se presenta bajo la forma de 2 bandas. La banda más importante cuantitativamente tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 37 kDa y corresponde al polipéptido (\Delta54) antes mencionado. La banda menor tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 49 kDa y corresponde al polipéptido (\Delta4) antes mencionado (Figura 8). En los extractos protéicos de semillas, sólo la banda de peso molecular inferior es visible (Figura 6, GT y GC).

a.2.) Expresión con el péptido señal de la LGL; inmunodetección en las hojas y semillas de tabaco transformadas con pBIOC41

Se realizaron transferencias Western (Renart y Sandoval, 1984) con las proteínas de las hojas y semillas de tabaco extraídas con el tampón B (ver el protocolo de extracción más arriba). Las proteínas extraídas se separan primero en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE) de acuerdo con la técnica de Laemmli (1970), y a continuación se transfieren sobre una membrana de nitrocelulosa. Un anticuerpo policlonal anti-lipasa de conejo, obtenido del cobaya, se usa como sonda y el revelado se efectúa por medio de un anticuerpo del cobaya marcado con fosfatasa alcalina.

Un ejemplo de transferencia western de hojas de tabaco se muestra en la Figura 7. La proteína de control es la lipasa gástrica de perro que migra bajo la forma de una única banda con un peso molecular aparente de 50 kDa. No se detecta banda alguna en los extractos proteicos de hojas de tabaco no transformadas (T). La lipasa producida en los extractos de hojas se presenta en forma de una banda principal con un peso molecular aparente de aproximadamente 49 kDa, y corresponde al polipéptido (\Delta4) antes mencionado.

En las semillas de tabaco transformadas con la construcción pBIOC41, la lipasa recombinante se presenta bajo la misma forma que en las hojas.

b) LGC en un extracto de proteínas de hojas de tabaco transformadas: experimento de desglicosilación

El protocolo de extracción de las proteínas para los experimentos de desglicosilación es el siguiente: se muelen 0,5 g de hojas (peso fresco) en nitrógeno líquido, a continuación a 4ºC en 1 ml de tampón de desnaturalización (tampón fosfato 100 mM, pH 7,5, al cual se le ha añadido 1% de \beta-mercaptoetanol, EDTA 25 mM y SDS al 1%). El material molido se centrifuga a 4ºC durante 15 minutos a 10.000 g. El sobrenadante se incuba durante 5 minutos a 100ºC con objeto de desnaturalizar las proteínas y a continuación se centrifuga durante 2 minutos a 10.000 g. El sobrenadante se diluye a continuación 10 veces en tampón de desglicosilación (tampón fosfato 100 mM, pH 7,5, al cual se le ha añadido un 1% de \beta-mercaptoetanol, EDTA 25 mM, 0,1% de SDS y 1% de octil-glucósido). En enzima (N-glicosidasa F, PNGasa de Boehringer) se añade en una cantidad de 1 U por 100 \mul de sobrenadante. Se realiza un control sin enzima para cada muestra. La desglicosilación de la proteína control (lipasa gástrica de perro o de conejo) tiene lugar en las mismas condiciones. Las diversas muestras de proteína se incuban a temperatura ambiente durante 8 horas. Las proteínas se separan a continuación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, y se transfieren sobre membrana de nitrocelulosa tal como se ha descrito en el parágrafo precedente.

De acuerdo con los resultados de la "transferencia western", la lipasa gástrica usada como control tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 50 kDa. Después de su desglicosilación, su peso molecular aparente es sólo aproximadamente 43 kDa.

La lipasa producida en las hojas de tabaco, después de incubación con PNGasa bajo las condiciones descritas más arriba, se presenta bajo la forma de 3 bandas con pesos moleculares aparentes de 49 (polipéptido (\Delta4)), 37 (polipéptido (\Delta54)) y 28 kDa. La banda de peso molecular de 28 kDa es sin duda el resultado de la proteolisis que ha tenido lugar durante la incubación de 8 horas a temperatura ambiente. Después de la desglicosilación, los pesos moleculares de las 3 bandas han disminuido en aproximadamente de 1 a 2 kDa, lo que muestra que las proteínas producidas en las hojas de tabaco están glicosiladas.

c) LGC expresada en las hojas y los frutos de tomates transgénicos

Se realizaron experimentos de inmunodetección del tipo "western" de la lipasa gástrica de perro con las proteínas de hojas y frutos de tomate extraídas con el tampón B (ver el protocolo de extracción más arriba). Para la realización de los experimentos, las proteínas extraídas (15 \mug y 6 \mug de proteínas solubles totales respectivamente para las hojas y frutos) se separaron en gel de poliacrilamida desnaturalizante como se describe en el parágrafo X.a).

La proteína de control es la lipasa gástrica natural (pista 4, Figura 8) que migra bajo la forma de una única banda con un peso molecular aparente de 50 kDa.

No se detecta banda alguna en los extractos proteicos de hojas y frutos de tomate no transformadas (T).

La lipasa producida en las hojas y en los frutos del tomate se presenta bajo la forma de 2 bandas, cualquiera que sea la construcción utilizada (pBIOC25 ó pBIOC26). La banda más importante cuantitativamente tiene un peso aparente de aproximadamente 37 kDa y corresponde al polipéptido (\Delta54) antes mencionado. La banda menor tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 49 kDa y corresponde al polipéptido (\Delta4) antes mencionado (Figura 8).

XI. Purificación de la lipasa gástrica de perro a partir de plantas a) Purificación de la LGC a partir de hojas de tabaco

La actividad de la lipasa gástrica de perro producida en las hojas de tabaco se determinó según un procedimiento titrimétricoo, el pH regulado se mantuvo a 5,5 y la temperatura a 37ºC con la ayuda de un pH-stat (Mettler-Toledo-DL25), utilizando la tributirina como sustrato: se emulsiona 1 ml de tributirina en 29 ml de una solución acuosa de NaCl 0,15 M en un agitador por vórtice. El análisis consiste en neutralizar el ácido butírico liberado bajo la acción de la lipasa, mediante la adición de carbonato sódico 0,02 N, mientras la emulsión se mantiene mediante una agitación mecánica vigorosa. Una unidad de lipasa corresponde a 1 micromol de ácido graso liberado por minuto en estas condiciones de pH y temperatura.

Después de la primera etapa cromatográfica, la actividad lipasa se pone en evidencia con una muestra de ensayo de 0,5 ml de una emulsión de 1 ml de tributirina en 29 ml de una solución de NaCl 0,15 M, taurodesoxicolato sódico 2 mM y 1,5 mM en albúmina de suero bovino conforme al análisis descrito por Gargouri et al., (1986).

Se muele un gramo de hojas liofilizadas a 4ºC en 30 ml de tampón glicina 20 mM, pH 2,5, y la mezcla se agita suavemente durante 15 minutos. Durante la maceración, se mantiene el pH a 2,5 mediante la adición de HCl. El producto de la maceración se centrifuga a 15.000 g durante 5 minutos. El pH del sobrenadante se ajusta a 4 mediante la adición de NaOH 1 N. Después de la filtración en MIRACLOTH (Calbiochem), la totalidad del sobrenadante se aplica a una columna de resina de intercambio catiónico (resina S-Sepharose Fast Flow, Pharmacia) de 10 ml (diámetro 1,6 cm) equilibrada en un tampón de acetato sódico 20 mM, pH 4,0, y NaCl 20 mM a una velocidad de flujo de 1 ml por minuto. Se recogen fracciones de 2 ml. Después del paso del sobrenadante, la columna se lava con 40 ml del tampón de equilibrado. Las proteínas retenidas en la columna se eluyen de acuerdo con el protocolo
siguiente:

: gradiente lineal en tampón acetato sódico 20 mM, pH 4,0, desde 20 mM hasta 210 mM de NaCl en el curso de 30 minutos para la elución de un primer conjunto de picos de proteínas que no contienen actividad lipasa, el ensayo de efectúa en muestras analíticas de 1 ml,

: meseta a NaCl 210 mM durante 20 minutos,

: gradiente lineal en tampón acetato sódico 20 mM, pH 4,0, desde 210 mM hasta 500 mM de NaCl en el curso de 30 minutos para la elución de un segundo conjunto de picos. La actividad lipasa medida en muestras analíticas de 0,5 ml se eluye durante este segundo gradiente a una fuerza iónica de entre 300 y 400 mM.

Las fracciones activas se recogen y concentran con la ayuda de una celda de concentración OMEGACELL de peso molecular limite de 30 kDa (Filtron Technology Corporation).

El concentrado se dializa durante 12 horas contra un tampón de Tris-HCl 10 mM, pH 8, y a continuación se aplica a una columna de resina de intercambio aniónico (MonoQ HR 5/5 de diámetro 0,5 cm y altura 5 cm, Pharmacia) equilibrada en tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8. La actividad lipasa se mide en una muestra analítica de 0,5 ml. La velocidad de flujo se mantiene a 1 ml por minuto, es decir, una presión de 2,0 mPa. Después de la elución de la fracción no retenida y del lavado de la columna con 10 ml de tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8, se aplica un gradiente lineal desde 0 hasta 400 mM de NaCl en el curso de 60 minutos. La actividad lipasa se eluye a una fuerza iónica de entre 100 mM y 200 mM.

Las fracciones activas se recogen y concentran con la ayuda de una celda de concentración OMEGACELL de peso molecular limite de 30 kDa. El concentrado constituye la forma purificada de la lipasa gástrica de perro extraída de las hojas de tabaco.

La concentración de proteínas se efectúa según el procedimiento de M. Bradford (1976) en los sobrenadantes de concentración y según el procedimiento de O. H. Lowry (1951) para las soluciones posteriores a la primera cromatografía de intercambio iónico.

Las diferentes etapas de la purificación se analizaron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE 12,5%) según la técnica de U.K. Laemmli (1970). Las proteínas separadas de esta forma sobre el gel de poliacrilamida son, por una parte, reveladas mediante la tinción con azul de Coomassie y, por otra parte, transferidas sobre una membrana de nitrocelulosa mediante la técnica de electrotransferencia semiseca (Transblot SD, BIORAD) en un tampón Tris base 20 mM, glicina 150 mM y etanol al 20% a 2,3 mA por cm^{2} de membrana. La lipasa gástrica de perro recombinante transferida sobre la membrana de celulosa se detecta mediante inmunodetección de acuerdo con el protocolo siguiente:

marcado de la proteína diana mediante un anticuerpo policlonal anti-lipasa gástrica de perro obtenido en el cobaya y diluido a 1/5.000 en tampón PBS, suplementado con leche en polvo desnatada al 5% y Tween 20 en una cantidad del 0,1%, durante 1 hora a temperatura ambiente,

: lavado de la membrana en tres lotes sucesivos de tampón PBS, se le había añadido leche en polvo desnatada al 1% y Tween 20 en una cantidad del 0,1%, durante 10 minutos por cada lavado,

: marcado con un anticuerpo anti-cobaya unido a peroxidasa (Sigma) diluido a 1/2.000 en tampón PBS, suplementado con leche en polvo desnatada al 1% y Tween 20 en una cantidad del 0,1%, durante 1 hora a temperatura ambiente,

: detección de la acción de la peroxidasa sobre el 4-cloro-1-naftol (Sigma) en presencia de H_{2}O_{2} para producir una coloración azul que es estable con el tiempo.

La lipasa producida en las hojas se presenta bajo la forma de 2 bandas de aproximadamente 49 kDa (polipéptido (\Delta4)) y 37 kDa (polipéptido (\Delta54)).

b) Variante para la purificación de la LGC a partir de hojas de tabaco

La actividad de la lipasa gástrica de perro producida en las hojas de tabaco se determina mediante el procedimiento titrimétrico de Gargouri et al., (1986) con la ayuda de un pH-STAT (METTLER-TOLEDO-DL25).

El análisis sobre triglicéridos de cadena corta se efectúa usando tributirina como sustrato: se emulsiona 1 ml de tributirina en 29 ml de una solución acuosa de NaCl 0,15 M, 1,5 \muM de albúmina de suero bovina (BSA) y taurodesoxicolato sódico 2 mM (NaTDC). El pH regulado se mantiene a 5,0 y la temperatura a 37ºC.

El análisis consiste en neutralizar el ácido butírico liberado bajo la acción de la lipasa, mediante la adición de carbonato sódico 0,02 N, mientras la emulsión se mantiene mediante una agitación mecánica vigorosa.

El análisis sobre triglicéridos de cadena larga se efectúa usando como sustrato una emulsión acuosa al 30% de aceite de soja purificado, 1,2% de fosfolípidos de huevo purificados, y 1,67% de glicerol anhidro (Intralipid^{TM} 30%, PHARMACIA AB, Estocolmo, Suecia). Diez ml de esta suspensión se emulsionan en 20 ml de una solución acuosa de NaCl 0,15 M, 30 \muM de BSA, y CaCl_{2} 3,5 mM. El pH regulado se mantiene a 4,0 y la temperatura a 37ºC.

El análisis consiste en neutralizar los ácidos grasos, liberados bajo la acción de la lipasa, mediante la adición de carbonato sódico 0,2 N, después de un salto en el pH desde 4 hasta 9, mientras la emulsión se mantiene mediante agitación mecánica vigorosa.

Una unidad de lipasa corresponde a 1 micromol de ácido graso liberado por minuto bajo las condiciones definidas de pH y temperatura, para cada uno de los sustratos.

Se muelen 2 gramos de hojas liofilizadas a 4ºC en 60 ml de NaCl 0,2 M, pH 3, y la mezcla se agita suavemente durante 15 minutos a 4ºC. Durante esta maceración, el pH se mantiene a 3 mediante la adición de HCl 1 N. El producto de la maceración (homogenado) se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos. Después de la filtración sobre MIRACLOTH (Calbiochem) y un filtro de 0,45 \mu de MILLIPORE, la totalidad del sobrenadante se inyecta en una columna de resina de intercambio catiónico (RESOURCE S 6 ml, Pharmacia, 16 mm ID \times 30 mm) equilibrada en una tampón de acetato sódico 20 mM, NaCl 0,2 M, pH 3 a una velocidad de flujo de 8 ml/minutos (240 cm h^{-1}).

Después del paso de la fracción no retenida, la columna se lavó con 30 veces su volumen de tampón de equilibrado. Las proteínas retenidas en la columna se eluyen con un gradiente lineal de tampón acetato sódico 20 mM, pH 3, desde NaCl 0,2 M hasta 0,5 M NaCl en 7 volúmenes de columna. Se recogen fracciones de 4 ml.

La actividad lipasa medida en muestras analíticas de 0,5 ml se eluye a una fuerza iónica de 0,35 M NaCl.

Las fracciones activas se recogen y concentran con la ayuda de una celda de concentración OMEGACELL (Filtron Technology Corporation) con un peso molecular limite de 30 kDa.

La determinación de la concentración de protéina se efectúa según el procedimiento de O. H. Lowry (1951).

Se muestra (Figura 9 y 10) un ejemplo de gel de poliacrilamida y el resultado de la transferencia de este gel sobre una membrana de nitrocelulosa y la detección a partir de de anticuerpo anti-lipasa gástrica de perro, la detección se realizó mediante la acción de la peroxidasa sobre el Luminol en presencia de activador (ECL transferencia western, AMERSHAM LIFE SCIENCE) y registro sobre una película fotográfica.

La presencia de residuos glicánicos sobre la proteína se determinó según el protocolo siguiente:

: inmovilización de la proteína sobre una membrana de microcelulosa

: tratamiento con peryodato

: reacción específica con estreptoavidina acoplada con fosfatasa alcalina

: reacción coloreada de la fosfatasa alcalina (GLYCOTRACK OXFORD GYLOSYSTEM).

Se muestra un ejemplo de membrana de detección de residuos glicánicos (Figura 11).

La pureza de las fracciones se aseguró mediante cromatografía líquida de altas prestaciones,

Cromatógrafo WATERS 625 LC

Detector por matriz de diodos WATERS 991

Columna VYDAC C4

Condiciones de elución:

Tiempo (min)	Flujo (ml/min)	%A	%B
0	1	100	0
35	1	40	60
40	1	40	60
45	1	20	80
50	1	100	0
Tampón A: 89,9% de H_{2}O, 10% de acetonitrilo, 0,1% de ácido trifluoroacético
Tampón B: 100% de acetonitrilo.

TABLA DE PURIFICACIÓN LGC recombinante

	Unidades	mg de	actividad	factor de	rendimiento
	totales *	proteínas	específica	purificación
Homogenado	3200	/	/	/	/
Sobrenadante	2800	230	13	1	88%
Salida	1600	6	250	20	50%
* Unidades de tributirina

Actividades específicas comparadas de la lipasa gástrica de perro natural (n-LGC) y lipasa gastrica de perro recombinante (r-LGC)

	n-LGC*	r-LGC extraída de las
		hojas de tabaco
Tributirina	570 U/mg	250 U/mg
Intralipide al 30%	1000 U/mg	950 U/mg
ref.: Carrière et al., Eur. J. Biochem.*, 202:75-83 (1991)

c) Purificación de la LGC a partir de semillas de colza

La actividad de la LGC recombinante producida en las semillas de colza se determinó de la misma forma que en el caso de una extracción a partir de hojas.

Se molieron diez gramos de semillas de colza en nitrógeno líquido. La harina obtenida se desgrasó con hexano mediante una primera maceración a 4ºC con agitación suave durante 12 horas. Se decanta la totalidad, y el hexano se elimina. La harina se lava dos veces con 100 ml de hexano con agitación suave durante 1/2 hora a 4ºC para cara lavado. El hexano se elimina mediante decantación. La harina se seca en un rotavapor (HEIDOLPH 94200). La harina desgrasada se almacena a -20ºC.

La extracción de la LGC se efectúa a partir de la harina desgrasada por maceración a 4ºC en una solución acuosa de NaCl 0,2 M, pH 3 (HCl 1N) durante 30 minutos a razón de 2 ml de solución acuosa para 0,1 g de harina. El material resultante de la maceración se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos.

El precipitado se elimina. El sobrenadante constituye el extracto de las semillas.

El extracto de semillas se dializa frente un tampón de acetato sódico 10 mM, pH 4, NaCl 140 mM, KCl 3 mM, a continuación se aplica a una columna de inmunoafinidad formada por anticuerpos policlonales anti-lipasa gástrica de perro, obtenidos de cobayas, acoplados a una resina (hidrazida Avidgel, BIOPROBE INTERNATIONAL, Inc.).

El contacto resina/extracto de semilla es de 30 minutos a 4ºC bajo agitación suave. A continuación se lava la resina con 10 volúmenes de columna de tampón, acetato sódico 10 mM, pH 4, NaCl 150 mM, KCl 3 mM. La LGC se eluye con 5 volúmenes de columna de tampón, glicina 0,2 M, pH 2,8 NaCl 150 mM. Las fracciones recogidas tienen un volumen igual a 1 volumen de columna y contienen 1/20 V/V de tampón Tris 1 M, pH 9. El análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida en medio desnaturalizante muestra una proteína con peso molecular de aproximadamente 37 kDa.

XII. Síntesis de ésteres de ácidos grasos

Los ensayos se han realizado con semillas de colza no transformadas, aportándose la lipasa:

: bien en forma de preparación enzimática inmovilizada (lipozima (NOVO)) o libre (lipasa gástrica de conejo (JO 4002)),

: o bien en forma de semillas de tabaco transformadas con el gen de la lipasa gástrica de perro (tabaco T14-44, 0,85% de expresión).

Las reacciones de esterificación se realizan a 37ºC durante 16 horas en botellas de vidrio herméticamente tapadas colocadas en una mesa de agitación (250 rpm). El solvente orgánico usado es el hexano, en el cual son solubles los ácidos grasos. El metanol se añade en una proporción estequiométrica respecto la cantidad teórica de triglicerol contenido en las semillas de colza.

El mayor componente de los ácidos grasos de colza es el ácido oleico, y el control de referencia es también un metiléster de ácido oleico. La síntesis se monitorizó mediante cromatografía en capa fina (TLC). El solvente de migración es una mezcla de hexano, dietiléter y agua (70:10:1). El revelado de las placas se hace con calor después de pulverizar ácido sulfúrico (5%) en etanol.

En un primer ensayo, a 0,2 g de aceite de colza (0,22 mmoles) se les añaden 27 \mul de metanol (0,66 mmoles) y 0,02 g de lipozima: no aparece mancha alguna a nivel del metiléster oleico de referencia (Figura 13, columna 2).

En un segundo ensayo, el aceite de colza se remplaza con 0,5 g de semillas de colza molidas en seco y se añade 1 ml de hexano: hay síntesis de un éster metílico (Figura 13, columna 5).

En los ensayos siguientes, la condiciones anteriores se repiten con las siguientes modificaciones: la cantidad de lipozima se reduce a 0,006 g y el lipozima es sustituido por la lipasa gástrica de conejo (0,007 g of JO 4002). Hay síntesis de metiloleato en presencia de lipozima pero no en presencia de JO 4002 (Figura 14, columna 2).

Finalmente, en los últimos ensayos, la lipasa es proporcionada por las semillas de tabaco transformadas (1 g de semillas de tabaco). Aparece una mancha característica de un metiléster (Figura 8, columna 3).

En conclusión, los resultados descritos más arriba muestran que, a partir del momento en que se ponen en presencia de los extractos de semillas de colza, el alcohol y la lipasa gástrica de perro recombinante producida por los tabacos transgénicos, se obtiene una reacción de esterificación que conduce a la síntesis de un éster metílico que puede utilizarse como hidrocarburo.

Pies de figuras

Figura 1: secuencia nucleotídica del ADNc que codifica la LGC.

Figura 2: secuencia de aminoácidos de la LGC.

Figura 3: secuencia nucleotídica derivada del ADNc que codifica la LGC, y que codifica la LGC representada en la Figura 2.

Figura 4: secuencia nucleotídica del ADNc que codifica la LGH, y secuencia de aminoácidos de la LGH.

Figura 5: secuencia de aminoácidos de la LGH.

Figura 6: inmunodetección de los polipéptidos recombinantes producidos por las hojas y semillas de tabaco Xanthi, y por las semillas de colza transformadas con las construcciones pBIOC26, pBIOC25 y pBIOC29; E, escala de pesos moleculares; LG, lipasa gástrica de perro; F, hojas de tabaco, y GT, semillas de tabaco transformadas con la construcción pBIOC25; GC, semillas de colza transformadas con la construcción pBIOC29; T, hojas de tabaco no transformadas.

Figura 7: inmunodetección de los polipéptidos recombinantes producidos por las hojas de tabaco transformadas con las construcciones pBIOC25 y pBIOC41; E, escala de pesos moleculares; LC, lipasa gástrica de perro; 1 y 3, hojas de tabaco transformadas con la construcción pBIOC41; 2, hojas de tabaco transformadas con la construcción pBIOC25; T, hojas de tabaco no transformadas,

Figura 8: inmunodetección de los polipéptidos recombinantes producidos por las hojas y los frutos de tomates transformados con las construcciones pBIOC25 y pBIOC26; T1, fruto de tomate no transformado; 1 y 3, frutos de tomate transformados; 2: hojas de tomate transformadas; E: escala de pesos moleculares; LC: lipasa gástrica de perro; T2: hoja de tomate no transformado.

Figura 9: análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida en medio desnaturalizante (SDS-PAGE). 1, extracto de semillas de colza; 2, lipasa gástrica de perro recombinante producida a partir de hojas de tabaco; 3, lipasa gástrica de perro natural; 4, escala de pesos moleculares.

Figura 10: revelado inmunológico del análisis precedente después de transferirlo sobre membrana de nitrocelulosa. 1, lipasa gástrica de perro natural; 2, lipasa gástrica de perro recombinante producida a partir de hojas de tabaco; 3, extracto de semillas de colza.

Figura 11: revelado inmunológico de la presencia de residuos glicánicos a partir de un gel de poliacrilamida después de transferirlo sobre membrana de nitrocelulosa. 1, extracto de semillas de colza; 2, lipasa gástrica de perro recombinante producida a partir de hojas de tabaco; 3, lipasa gástrica de perro natural.

Figura 12: análisis mediante SDS-PAGE de la inmunopurificación de la r-LGC producida en semillas de colza. 1, lipasa gástrica de perro natural; 2, lipasa gástrica de perro recombinante; 3 a 6, fracciones no retenidas eluidas de la columna de inmunopurificación.

Figura 13: revelado de una placa de TLC; 1: aceite de colza, sin enzima; 2: aceite de colza+lipozima; 3: metiléster del ácido oleico; 4: semilla de colza, sin enzima; 5: semillas de colza + lipozima.

Figura 14: revelado de una placa de TLC; 1 y 4: semillas de colza sin enzima; 2: semillas de colza + JO4002; 3: metiléster del ácido oleico; 5: semillas de colza + lipozima.

Figura 15: revelado de una placa de TLC; 1: monoleína, dioleína, trioleína; 2: metiléster del ácido oleico; 3: semillas de colza + semillas de tabaco transformado.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: BIOCEM S.A.

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(B): CALLE: 24, Avenue des Landais

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(C): CIUDAD: AUBIERE

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(E): PAIS: FRANCIA

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(F): (ZIP): 63170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: INSTITUT DE RECHERCHE JOUVEINAL

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(B): CALLE: 3-9, rue de la Loge

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(C): CIUDAD: FRESNES

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(E): PAIS: FRANCIA

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(F): (ZIP): 94265 CEDEX

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: LIPASAS PREDUODENALES RECOMBINANTES Y POLIPÉPTIDOS DERIVADOS PRODUCIDAS POR LAS PLANTAS, SUS PROCEDIMIENTOS DE OBTENCIÓN Y SUS UTILIZACIONES

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

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(iv): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: Patent In Release #1.0,

\hskip5cm

Versión #1.25 (OEB)

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: FR 9504754

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(B): FECHA DE REGISTRO: 20-Abril-1995

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1528 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..1137

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

100

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 379 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 2:

103

104

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1048 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): UBICACIÓN: 1..975

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 3:

105

106

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 325 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 4:

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107

108

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1198 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): UBICACIÓN: 1..1125

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 5:

109

110

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. Nº ID: 6:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 375 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. Nº ID: 6:

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111

112

Claims

1. Utilización de una secuencia nucleotídica recombinante representada en la Figura 3 y que codifica la lipasa gástrica del perro (LGC) representada en la Figura 2 por una parte, y por otra parte, los elementos que permiten a una célula vegetal producir la lipasa gástrica de perro codificada por dicho ADNc, en particular un promotor y un terminador de la transcripción reconocidos por la maquinaria de transcripción de las células vegetales, para la transformación de células de plantas con vistas a la obtención, a partir de esas células, o de plantas obtenidas a partir de estas últimas, de LGC recombinante bajo la forma de enzima activo.

2. Secuencia nucleotídica recombinante, caracterizada en que contiene, por una parte, el ADNc representado en la Figura 3 y que codifica la lipasa gástrica del perro (LGC) representada en la Figura 2, y por otra parte, los elementos que permiten a una célula vegetal producir la lipasa gástrica de perro codificada por dicho ADNc, en particular un promotor y un terminador de la transcripción reconocidos por la maquinaria de transcripción de las células vegetales.

3. Secuencia nucleotídica recombinante según la reivindicación 2, caracterizada en que contiene:

: además de dicho ADNc, el terminador poliA S35 del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), o el terminador poliA NOS de Agrobacterium tumefaciens,

: además de dicho ADNc, el promotor 35S, o el promotor constitutivo doble 35S (pd35S) del CaMV, o el promotor pCRU del gen de la cruciferina de rabano, o el promotor pGEA1 ó pGEA6 de Arabidopsis thaliana, o el promotor quimérico pSP de Agrobacterium tumefaciens, o el promotor pAR-IAR del arroz, o el p\gammazeína del maíz.

4. Secuencia nucleotídica recombinante según una de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizada en que contiene una secuencia que codifica un péptido responsable de dirigir la LGC recombinante hacia un compartimento determinado de la célula vegetal.

5. Secuencias nucleotídicas recombinantes según una de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizadas en que se escogen de entre las siguientes:

: aquélla (denominada pd35S-PS-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pd35S del CaMV, la secuencia que codifica el péptido señal de la esporamina A, estando seguida esta última por la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pd35S-PPS-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pd35S del CaMV, la secuencia que codifica el prepropéptido de la esporamina A, estando seguida esta última inmediatamente por la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pd35S-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pd35S del CaMV, la secuencia que codifica parte del péptido señal de la LGL (es decir, para una secuencia formada por los primeros 19 aminoácidos, indicada en los ejemplos siguientes, estando suprimidos los 19 nucleótidos que codifican los 3 últimos aminoácidos C-terminales), estando seguida esta última inmediatamente por el ADNc representado en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pCRU-PS-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pCRU de la cruciferina, la secuencia que codifica el péptido señal de la esporamina A, estando esta última inmediatamente seguida por la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pCRU-PPS-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pCRU de la cruciferina, la secuencia que codifica el prepropéptido de la esporamina A, esta última estando seguida inmediatamente por la secuencia de nucleótidos representada en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV

: aquélla (denominada pGEA1-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pGEA1 de Arabidopsis thaliana, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como se describe más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc representado en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

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: aquélla (denominada pGEA6-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pGEA6 de Arabidopsis thaliana, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como se describe más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc representado en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada pAR-IAR-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor pAR-IAR del arroz, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como se describe más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc representado en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV, o el terminador poliA NOS de Agrobacterium tumefaciens,

: aquélla (denominada p\gammazeína-PSLGL-LGC) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor p\gammazeína del maíz, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como se describe más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc representado en la Figura 3, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV,

: aquélla (denominada p\gammazeína-PSLGL-LGC-KDEL) que contiene, en la dirección 5'->3', el promotor p\gammazeína del maíz, la secuencia que codifica una parte del péptido señal de la LGL (tal como se describe más arriba), estando esta última inmediatamente seguida por el ADNc representado en la Figura 3, a continuación por el tetrapéptido KDEL, y a continuación el terminador poliA 35S del CaMV.

6. Vector, en particular plásmido, que contiene una secuencia nucleotídica según una de las reivindicaciones 2 a 5, en un sitio no esencial para su replicación.

7. Huésped celular, en particular una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens, transformada por un vector según la reivindicación 6.

8. Procedimiento de obtención de LGC recombinante bajo forma de enzima activo, caracterizado en que comprende:

: la transformación de células vegetales, en particular con la ayuda de un huésped celular según la reivindicación 6, de forma que se integre en el genoma de esas células, una secuencia nucleotídica recombinante según una de las reivindicaciones 2 a 5,

: la recuperación de la LGC recombinante producida en dichas células vegetales o plantas transformadas mencionadas más arriba, en particular por extracción, seguida, cuando convenga, por una purificación.

9. Plantas, o partes de plantas, en particular hojas y/o frutos y/o semillas y/o células vegetales, transformadas genéticamente, caracterizadas en que contienen una (o varias) secuencia(s) nucleotídica(s) recombinante(s) según una de las reivindicaciones 2 a 5, integrada(s) de forma estable en su genoma, y, cuando sea apropiado, de la LGC recombinante con actividad enzimática, y más particularmente con actividad lipásica, escogidas en particular entre la colza, el tabaco, el maíz, el guisante, el tomate, la zanahoria, el trigo, la cebada, la patata, la soja, el girasol, la lechuga, el arroz y la alfalfa.

10. LGC recombinante enzimáticamente activa, en donde la secuencia en aminoácidos es la representada en la Figura 2, o polipéptido escogido entre el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 35 y 379 de la Figura 2, presentando estos polipéptidos una actividad lipásica, obtenidos bajo forma esencialmente pura por la puesta en práctica de un procedimiento según la reivindicación 8, comprendiendo este procedimiento una etapa de purificación de la LGC recombinante y/o del (o de los) polipéptido(s) mencionado(s) más arriba, en particular mediante cromatografía realizada a partir de los extractos enzimáticos obtenidos.

11. Extracto vegetal con actividad enzimática susceptible de obtenerse por la puesta en práctica de un procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado en que contiene la LGC recombinante enzimáticamente activa, en donde la secuencia de aminoácidos es la representada en la Figura 2, y/o de los polipéptidos escogidos entre el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 55 y 370, de la Figura 2, o el polipéptido delimitado por los aminoácidos situados en las posiciones 35 y 370, de la Figura 2, presentando estos polipéptidos una actividad lipásica.

12. Extracto vegetal con actividad enzimática según la reivindicación 11, caracterizado en que el porcentaje en peso de polipéptidos recombinantes enzimáticamente activos representa aproximadamente del 0,1% al 20%, en particular aproximadamente del 1% a aproximadamente el 15%, con relación al peso total de proteínas presente en estos extractos, lo que corresponde a medidas de actividad enzimática desde aproximadamente 0,5 U por g de peso fresco (PF) de hojas hasta aproximadamente 1000 U/g de PF de hojas, in particular, desde aproximadamente 10 U/g de PF hasta aproximadamente 300 U/g de PF de hojas, o aún desde aproximadamente 1 U/g de PF de semillas hasta aproximadamente 5000 U/g de PF, en particular desde aproximadamente 10 U/g de PF de semillas hasta aproximadamente 1000 U/g de PF de semillas.

13. Utilización de plantas, o de partes de plantas, en particular de hojas y/o de frutos y/o de semillas, transformadas genéticamente, según la reivindicación 9, para la preparación de un medicamento destinado a facilitar la absorción de las grasas animales o vegetales ingeridas por un individuo sano o que padece una o varias patologías que afectan o no la tasa de producción de lipasa gástrica y/o pancreática, preferentemente en individuos que experimentan un tratamiento médico que altera el mecanismo de absorción de las grasas, o aún en las personas ancianas, y preferentemente para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las patologías asociadas a la insuficiencia de lipasas (en particular de lipasa(s) gástrica y/o pancreática) en el organismo, y más preferentemente en patologías tales como la fibrosis cística y la insuficiencia pancreática exocrina.

14. Utilización de la LGC recombinante según la reivindicación 10 para la preparación de un medicamento destinado a facilitar la absorción de las grasas animales o vegetales ingeridas por un individuo sano o que padece una o varias patologías que afectan o no la tasa de producción de lipasa gástrica y/o pancreática, preferentemente en individuos que experimentan un tratamiento médico que altera el mecanismo de absorción de las grasas, o aún en las personas ancianas, y preferentemente para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las patologías asociadas a la insuficiencia de lipasas (preferentemente de lipasa(s) gástrica y/o pancreática) en el organismo, y más preferentemente en patologías tales como la fibrosis cística y la insuficiencia pancreática exocrina.

15. Utilización de extractos enzimáticos según una de las reivindicaciones 11 y 12 para la preparación de un medicamento destinado a facilitar la absorción de las grasas animales o vegetales ingeridas por un individuo sano o que padece una o varias patologías que afectan o no la tasa de producción de lipasa gástrica y/o pancreática, preferentemente en individuos que experimentan un tratamiento médico que altera el mecanismo de absorción de las grasas, o aún en las personas ancianas, y preferentemente para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de las patologías asociadas a la insuficiencia de lipasas (preferentemente de lipasa(s) gástrica y/o pancreática) en el organismo, y más preferentemente en patologías tales como la fibrosis cística y la insuficiencia pancreática exocrina.

16. Composición farmacéutica, caracterizada en que comprende la LGC recombinante y/o varios polipéptidos según la reivindicación 10, y/o uno o varios extractos enzimáticos según una de las reivindicaciones 11 y 12, cuando sea apropiado, en asociación con un vehículo farmacéutico aceptable.

17. Utilización de plantas, o de partes de plantas, en particular de hojas y/o de frutos y/o de semillas, transformadas genéticamente, según la reivindicación 9, para la preparación de alimentos destinados a la alimentación humana o animal, preferentemente alimentos funcionales, más particularmente destinados a facilitar la absorción de las grasas animales o vegetales ingeridas por un individuo sano o que padece una o varias patologías que afectan o no la tasa de producción de lipasa gástrica y/o pancreática.

18. Utilización de LGC recombinante según la reivindicación 10, para la preparación de alimentos destinados a la alimentación humana o animal, preferentemente alimentos funcionales, más particularmente destinados a facilitar la absorción de las grasas animales o vegetales ingeridas por un individuo sano o que padece una o varias patologías que afectan o no la tasa de producción de lipasa gástrica y/o pancreática.

19. Alimentos funcionales caracterizados en que comprenden una o varias plantas y/o partes de plantas, según la reivindicación 9, y/o la LGC recombinante y/o uno o varios polipéptidos según la reivindicación 10, y/o uno o varios extractos enzimáticos según una de las reivindicaciones 11 y 12.