UA73267C2

UA73267C2 - Recombinant gastric lipases of dog (lgc) and human (lgh), polypeptide derivatives thereof, method for producing by plants tranformation and use thereof

Info

Publication number: UA73267C2
Application number: UA97115538A
Authority: UA
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 2005-07-15
Also published as: WO1996033277A3; BR9608011A; WO1996033277A2; NZ307579A; CN1185178A; CZ330997A3; ZA963146B; BG101959A; TR199701207T1; KR19990007901A; US20040072317A1; ES2256858T3; US6573431B1; HUP9801438A2; AU718905B2; JPH11504207A; PL322874A1; AU5696796A; BG64320B1; PL186586B1

Description

Опис винаходу

Предметом даного винаходу є продукування рослинами рекомбінантних передуоденальних ліпаз, особливо, рекомбінантних шлункових ліпаз та інших поліпептидних похідних цих останніх, які мають ліпазну активність, а також їх застосування, особливо, як функціональних харчових продуктів або у фармацевтичних композиціях, або у ферментативних препаративних формах для використання в індустрії або продовольчій промисловості.

Шлункова ліпаза собаки (ІС) являє собою глікопротеїн з 379 амінокислот (АА) з молекулярною масою близько 50 кілодальтонів (кДа), що синтезується у вигляді попередника, який містить сигнальний пептид з 70 кінцевою аміногрупою та секретується серединними клітинами слизової оболонки дна шлунку собаки ІСагіеге ЕР та ін., 19911.

Людська шлункова ліпаза (І СН) легко синтезується у вигляді попередника і описана в публікації Водтег М.МУ. та ін., 1987р. Зрілий протеїн | СН складається з 379 амінокислот. Його сигнальний пептид (РЗІ ОН) містить 19 амінокислот.

Ці ферменти належать до сімейства так званих "передуоденальних" ліпаз, деякі члени якого вже одержані в очищеному вигляді, а в деяких випадках навіть клоновані |Ооспепу А.).Р. та ін., 1985р.; Водтег ММУ. та ін., 1987р.; Могеаи Н. та ін., 1988р.; європейські патенти МоМо 0191061 та 0261016).

Протягом тривалого часу вважалось, що гідроліз харчових ліпідів відбувається у тонкій кишці під дією ферментів, які продукуються підшлунковою залозою |Вегпапга С. 1849р.|.

Але, спостереження дозволяють припустити, що гідроліз тригліцеридів може протікати у шлунку під дією передуоденальних ферментів |Моїйага Р., 1901р.; Зпоппеудег Р., МоІдцагі2 К., 1945р.). Такі ферменти, і особливо, шлункова ліпаза собаки, характеризуються ферментативними та фізико-хімічними властивостями, які відрізняють їх від панкреатичних ліпаз ссавців. Ці різниці між шлунковими та панкреатичними ліпазами стосуються, головним чином, наступних моментів: молекулярна маса, склад амінокислот, стійкість до пепсину, с специфічність субстрату, оптимальне значення рН при впливі та стабільність у кислому середовищі. Ге)

Крім того, ін вітро, при певних умовах, можна спостерігати синергізм при впливі шлункових і панкреатичних ферментів на гідроліз тригліцеридів з довгими ланцюгами ІСагодоигі, У. та ін., 1989р.|.

Відомий ряд патологічних станів (муковісцидоз, екзокринна панкреатична недостатність), при яких у пацієнтів, повністю або частково, відсутня екзокринна панкреатична секреція та, отже, вони позбавлені - ферментів, необхідних для гідролізу їди (амілази, ліпази, протеази). Відсутність абсорбції жирів і, особливо, Ге) тригліцеридів з довгими ланцюгами, у кишечнику веде до дуже значного збільшення стеатореї у цих пацієнтів, а також до дуже суттєвого уповільнення збільшення ваги у молодих хворих. З метою коректування у цих випадках с цим суб'єктам вводять витяжки з підшлункової залози свині під час їжі. Терапевтичний ефект таких витяжок може се бути суттєво посилений за рахунок одночасного призначення С внаслідок специфічності її впливу на

Зо тригліцериди з довгими ланцюгами. -

У статті Сатівеге та ін. (1991р.) описані очищення та визначення МН о-кінцевої послідовності шлункової ліпази собаки. Спосіб, якій забезпечує екстрагування цього ферменту з шлунків собак, також описаний у згаданій публікації. Цей спосіб полягає, в основному, в тому, що собачі шлунки піддаються мацерації у кислому « середовищі (рН-2,5) у присутності водорозчинних солей, які сприяють висолюванню ліпази з вищевказаного З 50 середовища. Операції фільтрації через молекулярне сито та іонообмінної хроматографії дозволяють очистити с СС до однорідності. Очищена та одержана таким чином І С являє собою глікопротеїн з молекулярною масою

Із» 49000 дальтонів, з яких 6000 відповідають цукрам і 43000 - протеїновій частині.

Очевидні причини, пов'язані з труднощами забезпечення шлунками собак, перешкоджають усякому розвитку даного способу як на лабораторному, так і промисловому рівнях. Звідси витікає необхідність у розробці способу, який дозволяє одержувати І СС у великій кількості, не прибігаючи при цьому до використання собачих і шлунків. оз Нуклеотидна та пептидна послідовність ЇЗС були визначені з метою одержання С у промисловому масштабі за допомогою способу, при якому використовують методи генної інженерії. Такі роботи складають о предмет міжнародної заявки УМО 94/13816, поданої 16 грудня 1993 року. б 20 Спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки, описаний у цій міжнародній заявці, оснований на використанні ЕзспПегіспіа сої (Е.соїї) в якості трансформованої клітини-хазяїна, здатної продукувати І С. тм Певні труднощі, які зустрічаються під час продукування рекомбінантної |з за допомогою Е.соїї, особливо, необхідність у культивуванні значних кількостей Е.соїї у ферментері, що пов'язано з великими витратами, стали причиною пошуку винахідникам інших способів одержання цієї І с. 29 Клітини ссавців, апріорі, більш пристосовані до експресії генів ссавців. Однак, при їх застосуванні

ГФ) виникають проблеми, пов'язані з дозріванням протеїнів. Набір ферментів, за допомогою яких реалізується пост-трансляційне дозрівання, розрізняється залежно від тканини, органу і виду. Так, наприклад, о повідомлялось, що пост-трансляційне дозрівання плазматичного протеїну може бути різним коли його одержують з людської крові або коли він продукується рекомбінантною клітиною, як, наприклад, клітини яєчників 60 китайського хом'яка, або в молоці трансгенної тварини. Крім того, низькі рівні експресії, що досягаються при використанні клітин ссавців потребують культивований ін вітро в дуже великих об'ємах, що пов'язано з високими витратами. Продукування рекомбінантних протеїнів у молоці трансгенних тварин (миші, вівці та корови) дозволяє знизити виробничі витрати та подолати проблеми, пов'язані з рівнем експресії. Однак, залишаються етичні проблеми та проблеми вірусної та субвірусної (інфекційні частини протеїну) контамінації. бо За цими причинами, перенос генів ссавців у рослинну клітину може відкрити шлях продукування у великих кількостях нових рекомбінантних протеїнів при зниженні виробничих витрат та без небезпеки вірусної або субвірусної контамінації.

У 1983 році у декількох лабораторіях було зроблено відкриття, згідно з яким можна переносити гетерологічний ген у геном рослинної клітині (Вемап та ін.; Негїтега-Езігейа та ін., 1983Зр., а, Б) та регенерувати трансгенні рослини з цих генетично модифікованих клітин. Тоді усі клітини рослин мають генетично змінений характер, якій передається потомству шляхом статевого запліднення.

Завдяки цим роботам різні колективи зацікавились питанням продукування рекомбінантних протеїнів ссавців у рослинних клітинах або у трансгенних рослинах (Вага та ін., 1986р.; Магх, 1982р.). Одним з перших, дійсно /о значимих результатів у цій області було одержання антитіл у трансгенних тютюнових рослинах |Ніай та ін., 1989р.|.

Для експресування гетерологічного протеїну у зерні - місце зберігання протеїнів у рослинах - колектив

Вандекеркхова (Мапдекегокпоме) (1989р.) виконав злиття послідовності, кодуючої лей-енкефалін, з геном, кодуючим альбумін 25 Агарідорзівз (паійапа. За допомогою цієї конструкції були одержані види трансгенного /5 рапсу, які специфічно експресують лейенкефалін у зернах зі ступенями експресії порядку 0,195 від загальної кількості протеїну. У 1990 році бійтопе та співробітники здійснили перенесення гену альбумінної людської сироватки у клітини тютюну та картоплі. Яким би не було походження сигнальних пептидів (людське або рослинне), кількість вміщуючої альбумін людської сироватки у листях, стеблах та бульбах картоплі складало порядку 0,0290 від загальної кількості протеїнів.

Також були продуковані у рослинах і інші рекомбінантні протеїни ссавців: поверхневий антиген гепатиту В

Мазоп та ін., 1992р.Ї; інтерферони |Ое 2оеєеіїеп та ін., 1989р.; Едерацт та ін., 1992р.; Тгиме та ін., 1993р.|; антитіла миші проти Зігеріососсиз птиіапе; збудник карієсу зубів (Ніай і Ма, 1992р.; Ма та ін., 1994р.), фрагменти антитіл зсЕМ проти ракових клітин (Киззе! О., 1994р.), антитіло проти герпесу |Киззеї 0., 1994р.), гірудин |Моїопеу та ін., 1994р.і), токсин холери (|Неїп К., 1994р.) та фактор росту людського сч ов епідермісу (Е.О.Р.) |Нідо та ін., 1993р.).

Сукупність даних цих досліджень дозволяє показати, що продукування рекомбінантних протеїнів ссавців у і) рослинних клітинах можливо і що механізми синтезу протеїнів з послідовностей ДНК схожі між собою у тваринних і рослинних клітинах. Все ж існують деякі різниці між рослинними та тваринними клітинами, особливо, на рівні дозрівання поліманнозидних гліканів до складних гліканів, або ще на рівні місць розщеплення М зо сигнальних пептидів, що, отже, не дозволяє гарантувати одержання активних або досить активних протеїнів ссавців шляхом трансформації рослинних клітин. ісе)

Авторами винаходу було встановлено, що використання рослинних клітин, трансформованих за допомогою сі відповідної рекомбінантної нуклеотидної послідовності, дозволяє одержати рекомбінантну 1!05С або рекомбінантну ІОН або поліпептидні похідні цих останніх, що характеризуються ферментативною активністю, ме)

Зв яка достатня у відношенні придатності використання у промисловому масштабі. ї-

Метою даного винаходу є розробка нового способу одержання рекомбінантних передуоденальних ліпаз ссавців, та, особливо, рекомбінантної (з або ІОН, за допомогою рослин або поліпептидних похідних / ОС і

ІОН, що характеризуються ферментативною активністю, особливо, ліпазною активністю, яка дозволила б використовувати у промисловому масштабі зазначені рекомбінантні ліпази та їх поліпептидні похідні. «

Іншою метою даного винаходу є створення інструментів для здійснення такого способу, особливо, для з с одержання нових рекомбінантних нуклеотидних послідовностей, генетично трансформованих рослинних клітин, генетично трансформованих рослин або частин рослин (особливо, листя, стеблів, плодів, насіння або зерен, ;» коріння) та генетично трансформованих фрагментів цих рослин або частин рослин.

Метою винаходу також є одержання нових рекомбінантних передуоденальних ліпаз (ліпази) ссавців або любої поліпептидної похідної, які ферментативно активні, і таких, які одержують з генетично трансформованих -І рослинних клітин або рослин.

Винахід, крім того, стосується одержання нових ферментативних композицій, придатних для використання у о ферментативних реакціях, особливо у промисловому масштабі. ко Ще одною метою винаходу є одержання нових фармацевтичних композицій, призначених, головним чином, 5р для лікування патологій, пов'язаних з дефіцитом продукування ліпази в організмі, таких як, наприклад,

Ме, муковісцидоз.

І Ще одна мета даного винаходу полягає у створенні нових видів палива, що називаються ще біопаливом, які характеризуються тою перевагою, що вони менше забруднюють навколишнє середовище порівняно з паливом, яке одержується з нафти, та мають меншу собівартість.

Нижче винахід ілюструється наступними фігурами: на Фіг.1 представлена нуклеотидна послідовність КДНК, нуклеотиди якої розташовані у позиціях 1-1137,

Ф) кодують шлункову ліпазу собаки (І С), представлену на Фіг.2 та яка відповідає послідовності Мо2; ка на Фіг.2 представлена амінокислотна послідовність шлункової ліпази собаки, яка відповідає послідовності

Мо2; во на Фіг.3 представлена нуклеотидна послідовність, яка походить від кКДНК, що показана на Фіг.1 та відповідає послідовності Мої, причому нуклеотиди, розташовані у позиціях 1-1137 вищезазначеної похідної послідовності, кодують шлункову ліпазу собаки, яка представлена на Фіг.2 і відповідає послідовності Мо2; на Фіг.4 представлена нуклеотидна послідовність кКДНК, нуклеотиди якої, розташовані у позиціях 47-1240, кодують попередника шлункової ліпази людини (ОН), яка складається з 398 амінокислот, а нуклеотиди, 65 розташовані у позиціях 104-1240, кодують зрілу шлункову ліпазу людини з 379 амінокислот; на Фіг.5 представлена амінокислотна послідовність шлункової ліпази людини, причому попередник ОН обмежений амінокислотами, розташованими у позиціях 1 і 398, а зріла шлункова ліпаза людини обмежена амінокислотами, розташованими у позиціях 20 і 398; на Фігурах 6, 7 і 8 представлені результати імунологічного аналізу типу "вестерн-блокування" рекомбінантних поліпептидів, продукованих листям та насінням тютюну Хапіпйі, насінням рапсу, листям і плодами томату, трансформованими шляхом рекомбінантних послідовностей згідно винаходу; на Фігурах 9 і 10 представлені, відповідно, аналіз за допомогою електрофорезу на поліакриламідному гелі та результат переносу цього гелю на нітроцелюлозну мембрану, а також виявлення, виходячи з антитіла проти шлункової ліпази собаки, очищеної шлункової ліпази собаки з листя тютюну; 70 на Фіг.11 представлений приклад визначення на мембрані гліканових залишків рекомбінантної шлункової ліпази собаки; на Фіг.12 представлений аналіз за допомогою електрофорезу на поліакриламідному гелі шлункової очищеної ліпази собаки з насіння рапсу;

Фігури 13, 14 і 15 ілюструють різні досліди, які проводилися для одержання метилового ефіру олеїнової 7/5 Кислоти з трансформованого насіння згідно винаходу.

Предметом даного винаходу є застосування рекомбінантної нуклеотидної послідовності, яка містить, з одного боку, кКДНК, кодуючу любу передуоденальну ліпазу ссавців, а саме ліпази, нуклеотидні послідовності яких, що кодують ці останні, мають між собою гомологію приблизно, принаймні, на 7595, особливо, принаймні, приблизно на 77-8595 і амінокислотні послідовності яких мають між собою гомологію, принаймні, приблизно на 7095, особливо, принаймні, приблизно на 80-90965, і які є кислотостійкими та активними при значенні рН приблизно від 1 до приблизно 5, переважно при рН приблизно від 1,5 до 2, особливо, КДНК, кодуючу любу шлункову ліпазу ссавців або кКДНК, кодуючу любу поліпептидну похідну згаданих вище передуоденальних ліпаз, що одержується за допомогою додавання та/або супресії та/або заміни одної амінокислоти (або декількох амінокислот), причому ця вказана поліпептидна похідна має описані вище властивості передуоденальних ліпаз, та з іншого боку, с г елементи, які дозволяють рослинній клітині продукувати передуоденальну ліпазу, кодовану згаданою вище

КДНК, або продукувати поліпептидну похідну, як, наприклад, зазначені вище, особливо, промотор і термінатор і) транскрипції, які розпізнаються транскрипційним апаратом рослинних клітин, для трансформації рослинних клітин з метою одержання з цих клітин або рослин, що одержуються з цих клітин, рекомбінантної передуоденальної ліпази ссавців у вигляді активного ферменту або поліпептидної похідної (або декількох М зр поліпептидних похідних) цього ферменту, такого (таких), як зазначено (зазначені) вище.

Переважно, предметом даного винаходу є, особливо, застосування рекомбінантної нуклеотидної со послідовності, яка містить, з одного боку, КДНК, яка представлена на Фіг.1 і кодує шлункову ліпазу собаки с (ОС), показану на Фіг.2, або нуклеотидну послідовність, яка походить від цієї КДНК, особливо у результаті додавання та/або супресії та/або заміни одного нуклеотиду (або декількох нуклеотидів), причому вищевказана ме) похідна послідовність здатна кодувати поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична такій шлунковій ї- ліпази собаки, представленої на Фіг.2, або поліпептид, який походить від шлункової ліпази собаки у результаті додавання та/або супресії та/або заміни одної амінокислоти (або декількох амінокислот), причому ця поліпептидна похідна характеризується ліпазною активністю, та, з іншого боку, елементи, які дозволяють рослинній клітині продукувати поліпептид, кодований вищевказаною кДНК або вказаною вище похідною « послідовністю, особливо, як промотор та термінатор транскрипції, що розпізнаються транскрипційним апаратом з с рослинних клітин (а саме, РНК-полімеразами цих клітин), для трансформації рослинних клітин з метою . одержання з цих клітин або рослин, одержаних з цих клітин, рекомбінантної шлункової ліпази собак у вигляді и?» активного ферменту або поліпептидної похідної (або декількох поліпептидних похідних) цього ферменту, такого, як зазначено (зазначені) вище.

Винахід стосується також любої рекомбінантної нуклеотидної послідовності, такої, як описана вище, що -І містить, у якості КДНК, представлену на Фіг.1 кКДНК або нуклеотидну послідовність, що походить від цієї кКДНК, таку, як зазначена вище. і На цій підставі, предметом винаходу переважно є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як ко описана вище, що містить кКДНК, представлену на Фіг.1 і яка кодує шлункову ліпазу собаки, представлену на

Фіг.2.

Ме. Ще одним предметом винаходу, переважно, є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як "М описана вище, що містить нуклеотидну послідовність, яка походить від кДНК, представленої на Фіг.1, причому вищевказана нуклеотидна похідна послідовність є описаною вище послідовністю і кодує шлункову ліпазу собаки, представлену на Фіг.2. Така похідна послідовність, переважно, є послідовністю, представленою на Фіг.3З, і відповідає послідовності, представленій на Фіг.1, в якій нуклеотид А в позиції 12 замінений нуклеотидом о, нуклеотид Т у позиції 13 замінений нуклеотидом С, а нуклеотид А в позиції 15 замінений нуклеотидом Т. (Ф) Переважно, рекомбінантні нуклеотидні послідовності згідно винаходу містять одну (або декілька) ка послідовность (послідовностей), кодуючу пептид, відповідальний за адресацію рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу (а саме, рекомбінантної шлункової ліпази собаки або згаданих вище поліпептидних похідних) у бо певне місце рослинної клітини, особливо, в ендоплазматичну сітку або у вакуолі, або навіть на поверхню клітини, у пектоцелюлозну перегородку або у міжклітинний простір, що називається також апоплазмою.

З термінаторів транскрипції, які можуть бути використані для трансформації рослинних клітин у рамках даного винаходу, можна вказати на термінатор роїуА 335 вірусу мозаїки цвітної капусти (Саму), описаний у статті Егапск та ін. 1980Ор., або термінатор роуА МОБ, що відповідає некодуючій ділянці 3 гену 65 нопалінсинтази Ті-плазміди Адгорасіегіцт (шптегасіепз, штаму нопаліну (ОеріскКег та ін., 1982р.|.

На цій підставі предметом винаходу є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така як описана вище,

яка містить нижче вищевказаної кКДНК або її похідної послідовності термінатор роїхА 355 вірусу Самм або термінатор роїуа МОЗ Адгорасіегіт (Штетасіепв.

З промоторів транскрипції, які можна використовувати для трансформації рослинних клітин у рамках даного винаходу, можна назвати: - промотор 355 або, переважно, подвійний конститутивний промотор 355 (раз55) вірусу Саму, причому ці промотори забезпечують експресію рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу у всій рослині, одержаній з клітин, трансформованих згідно винаходу та описаних у статті Кау та ін., 1987р., - промотор РСКИ гену круциферину редьки, який дозволяє протікати експресії рекомбінантних поліпептидів 7/о Згідно винаходу тільки у насінні (або зернах) рослини, одержаної з трансформованих згідно винаходу клітин, який описаний у статті Оерідпу-Тпіз та ін., 1992р.; - промотори рОЕА!1 та роЕАб, які відповідають некодуючій ділянці 5' генів запасного протеїну насіння СЕА!1 і СЕАб, відповідно, Агарідорзіз (Найапа ІСацбріег та ін., 1993р.|, і які дозволяють протікати специфічній експресії у насінні; - химерний суперпромотор раР. (РСТ/О594/12946), утворений у результаті злиття, при потрійному повторі транскрипційного активуючого елементу промотору гену октопін-синтази Адгорасіегіцт (Шптегїасіепв, транскрипційного активуючого елементу промотору гену маннопінсинтази та промотору маннопінсинтази

Адгорасіегішт (Штегасіепв; - актиновий промотор рису та наступний за ним актиновий інтрон рису (рАК-ІАК), який міститься у плазміді

ВАсСИ-Р4 та описаний авторами МеЕіїгоу та ін. (1991р.); - промотор гену у-зеїну кукурудзи (ру-зеїн), який міститься у плазміді р уб3, описаної Кеїпа та ін., (1990Ор.), та який сприяє експресії у ендоспермі кукурудзяних зерен.

На цій підставі, предметом винаходу є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як описана вище, яка містить вищевказаний кДНК або такої, що походить від неї послідовності подвійний конститутивний с промотор 355 (раз55) вірусу СаМмМ, або промотор РОКИ гену круциферину редьки, або промотори роОЕА! і рОЕАбБ Агабідорзіз (Паїїапа, або суперпромотор роР бактерії Адгорасіегішт (Штегасіепз, або промотор рАК-ІАК о рису, або промотор ру-зеїну кукурудзи.

Послідовності, які кодують спрямовуючий пептид та застосовуються в рамках даного винаходу, можуть бути тваринного, людського або рослинного походження. рч-

З послідовностей, які кодують спрямовуючий пептид рослинного походження, можна вказати: - нуклеотидну послідовність з 69 нуклеотидів (надається у нижче приведених прикладах), кодуючу препептид іш (сигнальний пептид) з 23 амінокислот спораміну А батату, причому цей сигнальний пептид дозволяє вводити сі рекомбінантні поліпептиди, згідно винаходу, в секреторну систему рослинних клітин, трансформованих згідно винаходу (а саме, у ендоплазматичну сітку); о - нуклеотидну послідовність з 42 нуклеотидів (надається у нижче приведених прикладах), яка кодує ч-

М-кінцевий пропептид з вакуолярною адресацією з 14 амінокислот спораміну А батату та дозволяє акумулювати рекомбінантні поліпептиди згідно винаходу у вакуолях рослинних клітин, трансформованих згідно винаходу; - нуклеотидну послідовність зі 111 нуклеотидів (надається у нижче приведених прикладах), кодуючу « препропептид з 37 амінокислот спораміну А, утворений М-кінцевою частиною у напрямку до С-кінцевої частини з 40. 23 амінокислот згаданого вище сигнального пептиду, за яким йдуть 14 амінокислот вищезгаданого пропептиду, щей с причому цей препропептид дозволяє вводити рекомбінантні поліпептиди, згідно винаходу, у секреторну систему ц та накопичувати їх у вакуолях рослинних клітин, трансформованих згідно винаходу, причому три вищевказані "» послідовності описані у роботах Мигакаті та ін., 1986р., Маїзиока ТаМмакатига, 1991р.; - карбокси-кінцевий пропептид лектину ячменя описаний особливо у роботах Зспгоедег та ін., 1993р., та

Веапагек та КаїКкнеї, 1991р. -І З послідовностей, кодуючих спрямовуючий пептид людського або тваринного походження, можна назвати такі, кодуючі сигнальний пептид шлункової ліпази людини (ІОН), такий як описаний у європейському патенті о Ме0191061, або такої шлункової ліпази кролика (І СІ), як описаний у європейській заявці на патент Мо0542629, ко послідовність яких вказана у нижче приведених прикладах, або такої панкреатичної ліпази людини (І РН) або ще такої шлункової ліпази собаки (І СС).

Ф З кодуючих спрямовуючий пептид послідовностей також можна назвати послідовність, яка кодує тетрапептид "І КОЕГ. та забезпечує адресацію у плазматичну сітку.

На цій підставі, предметом винаходу є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як описана вище, яка містить послідовність, кодуючу весь або частину сигнального пептиду, такого, як сигнальний пептид спораміну А батату або сигнальний пептид шлункової ліпази людини або шлункової ліпази кролика або шлункової ліпази собаки, причому ця послідовність, кодуюча сигнальний пептид, знаходиться, у вищевказаній

Ф, рекомбінантній нуклеотидній послідовності, вище кДНК або послідовності, що походить від неї послідовності, та іме) нижче використовуваного промотору, таким чином, що остання С-кінцева амінокислота сигнального пептиду зв'язана з першою М-кінцевою амінокислотою поліпептиду, кодованого за допомогою вищевказаної кКДНК або бо послідовності, що походить від неї, у протеїні, кодованому вищезазначеною рекомбінантною нуклеотидною послідовністю.

Предметом винаходу також є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як описана вище, яка містить послідовність, кодуючу весь або частину вакуолярного спрямовуючого пептиду, особливо, як пептид спораміну А батату, причому ця послідовність, кодуюча вакуолярний спрямовуючий пептид, знаходиться у 65 вищезазначеній рекомбінантній нуклеотидній послідовності, між послідовністю, кодуючою сигнальний пептид, та послідовністю, кодуючою вищевказану кКДНК або послідовність, що походить від неї, таким чином, що перша

М-кінцева амінокислота вакуолярного спрямовуючого пептиду виявляється зв'язаною з останньою С-кінцевою амінокислотою сигнального пептиду та остання С-кінцева амінокислота згаданого спрямовуючого пептиду виявляється зв'язаною з першою М-кінцевою амінокислотою поліпептиду, кодованого кДНК або її похідною послідовністю, у протеїні, коюодованому зазначеною рекомбінантною нуклеотидною послідовністю.

Предметом винаходу також є люба рекомбінантна нуклеотидна послідовність, така, як описана вище, яка містить послідовність, кодуючу весь або частину вакуолярного спрямовуючого пептиду, зокрема, як пептид лектину ячменю, причому ця послідовність, кодуюча вакуолярний спрямовуючий пептид, розташовується у вищевказаній рекомбінантній нуклеотидній послідовності, нижче послідовності, кодуючої вищезазначену кДдНК 70 або її похідну послідовність таким чином, що перша М-кінцева амінокислота вакуолярного спрямовуючого пептиду виявляється зв'язаною з останньою С-кінцевою амінокислотою поліпептиду, кодованого вищезгаданою

КДНК або її похідною послідовністю, у протеїні, кодованому вищевказаною рекомбінантною нуклеотидною послідовністю.

Предметом винаходу є особливо наступні рекомбінантні нуклеотидні послідовності: - послідовність (що позначається як раз55-Р5-І С), яка містить у напрямку 5 -53 промотор раз55 Саму, послідовність, яка кодує сигнальний пептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, представлена на Фіг.3, потім - термінатор роїуА 355 вірусу Сами; - послідовність (що позначається як разо5-РРЗ-Ї С), яка містить у напрямку 5-53 промотор разоз Саму, послідовність, яка кодує препропептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, представлена на Фіг.3, потім - термінатор роїуА 355 вірусу Самум; - послідовність (що позначається як разо5-РЗІ СІ -І| С), яка містить у напрямку 5-53" промотор разь5 Саму, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (І СІ) (а саме, послідовність, Що складається з 19 перших амінокислот та зазначена у наведених нижче прикладах, при цьому 9 нуклеотидів, кодуючих З останні С-кінцеві амінокислоти, виключаються), за якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1, Ге потім - термінатор роїуА 355 вірусу Самм; о - послідовність (що позначається як рСКИО-РБ-Ї05С), яка містить у напрямку 5 -53 промотор ДСК круциферину, послідовність, яка кодує сигнальний пептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, представлена на Фіг.3, потім - термінатор роїуА 355 вірусу Самм; - послідовність (що позначається як рСКО-РРБЗ-Ї С), яка містить у напрямку 5 53 промотор рСКО її круциферину, послідовність яка кодує препропептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна «со послідовність, представлена на Фіг.3, потім - термінатор роїуА 355 вірусу Сами; - послідовність (що позначається як рСВО-РБІ І-І С), яка містить у напрямку 5 -53 промотор РСВО СМ круцефірину, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду ліпази (ІІ) (така, як описана вище), за со якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1 або 3, потім - термінатор роїуА 355 вірусу Самм;

Зо - послідовність (що позначається як рОЕА1-РБІ І-І 05), яка містить у напрямку 5 -»53 промотор рОЕАЇ в.

Агарідорзів (Ппаійапа, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду ліпази 01 (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1 або 3, потім - термінатор роїуУА 355 вірусу СаМммМ; - послідовність (що позначається як рОЕгАб-РБІ І-І С), яка містить у напрямку 5 -53 промотор рРОЕгАб «

Агарідорзів (Ппаійапа, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (ІІ) З (така, як описана вище), за якою відразу йде кКДНК, представлена на Фіг.1, або 3, потім - термінатор роїуА 355 с вірусу Сами;

Із» - послідовність (що позначається як рАК-ІАК-РБІ О1І-І С), яка містить у напрямку 5-53 промотор рАК-ІАК рису, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду ліпази І С) (така, як описана вище), за якою відразу йде КкДНК, представлена на Фіг.1 або 3, потім - термінатор роїуА 355 Самм або термінатор роїухА МО5 15 бактерії Адгорасіегіцт (штегасіепв; - - послідовність (що позначається як ру-зеїн-РЗІ СІ -І С), яка містить у напрямку 5-53" ру-зеїновий промотор (95) кукурудзи, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду ліпази І Сі (така, як описана вище), за якою відразу йде КкДНК, представлена на Фіг.1 або 3, потім - термінатор роїуА 355 вірусу Самм; - послідовність (що позначається як р у-зеїн-Р5І І -С-КОЕГ), яка містить у напрямку 5' -»3 ру-зеїновий (о) 50 промотор кукурудзи, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду ліпази І Сі (така, як описана вище), «м за якою відразу йде кДНК, представлена на Фіг.1 або 3, потім послідовність, яка кодує тетрапептид КОЕЇ, і потім - термінатор роїуА 355 вірусу Саму.

Рекомбінантні нуклеотидні послідовності згідно винаходу, переважно, містять також нуклеотидну послідовність, що використовується як маркер вищевказаних рекомбінантних послідовностей, особливо, для диференціації (і, отже, селекціонування) рослинних клітин, які трансформовані вищевказаними рекомбінантними

ГФ) послідовностями, від тих, які не містять цього маркера. г) Переважно, таку нуклеотидну послідовність, що використовується як маркер вищевказаних рекомбінантних послідовностей, вибирають зі стійких до антибіотиків генів, як особливо ген стійкості до канаміцину. во Предметом винаходу є також любий вектор, особливо, плазмідний, якій містить рекомбінантну нуклеотидну послідовність згідно винаходу, включену в сайт, що не є необхідним для її реплікації.

Винахід стосується також любої клітини-хазяїна, особливо, любої бактерії, такої як Адгорасіегійт

Іштегасіепз, трансформованої вектором, таким як описаний вище.

Предметом даного винаходу є також любий спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки (І с) в5 у вигляді активного ферменту та/або одного або декількох поліпептидних похідних цього ферменту, зокрема, у результаті додавання та/або супресії та/(або заміни одної амінокислоти (або декількох амінокислот), причому така поліпептидна похідна (поліпептидні похідні) має (мають) ліпазну активністю, який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію рослинних клітин для інтеграції у геном цих клітин одної або декількох рекомбінантних нуклеотидних послідовностей згідно винаходу; - при необхідності, одержання трансформованих рослин з вищевказаних трансформованих клітин; - виділення рекомбінантної шлункової ліпази собаки (І С) та/або згаданої вище поліпептидної похідної (або поліпептидних похідних), продукованої (продукованих) у вищевказаних трансформованих клітинах або вищевказаних трансформованих рослинах, особливо, шляхом екстракції з наступним, при необхідності, 7/0 очищенням.

Згідно з варіантом здійснення вказаного вище способу відповідно до винаходу, трансформація рослинних клітин може виконуватись шляхом переносу рекомбінантної нуклеотидної послідовності, згідно винаходу, У протопласти, зокрема, після інкубації цих останніх у розчині поліетиленглікюолю (ПЕГ) у присутності двовалентних катіонів (Сат)3 за методом, описаним у статті Кгепз та ін., 1982р.

Трансформацію рослинних клітин можна також здійснювати за допомогою електропорації, зокрема, методом, описаним у статті Еготт та ін., 1986р.

Трансформацію рослинних клітин можна також здійснювати за допомогою генної пушки, що забезпечує викид з дуже великою швидкістю металевих часток з опокриваючими їх рекомбінантними нуклеотидними послідовностями згідно винаходу, доставляючи таким чином гени всередину ядра клітини, зокрема, за допомогою методу, описаного у статті Запіога, 1988р.

Іншим методом трансформації рослинних клітин є метод нуклеарної або цитоплазматичної мікроін'єкції, як, наприклад, метод, описаний у статті Ое І а Реппа та ін., 1987р.

Відповідно до найбільш переважного варіанту здійснення вказаного вище способу, згідно винаходу, рослинні клітини трансформують шляхом сполучення їх з клітиною-хазяїном, трансформованою вектором, згідно Га винаходу, наприклад, описаним вище вектором, причому вищевказана клітина-хазяїн здатна інфікувати вищевказані рослинні клітини, забезпечуючи інтеграцію у геном цих останніх рекомбінантних нуклеотидних і9) послідовностей, згідно винаходу, які містяться попередньо у геномі вищевказаного вектору.

Переважно, вищевказаною використовуваною клітиною-хазяїном є Адгобасіегіт (штегасіепв, зокрема, згідно з методами, описаними у статтях Вемап, 1984р., і Ап та ін., 1986бр., або ж Адгорасіегішт гпігодепез, зокрема, рч-

Згідно методу, описаному у статті доцапіп та ін., 1987р.

З рослинних клітин, здатних до трансформації у рамках даного винаходу, можна вказати клітини рапсу, о тютюну, кукурудзи, гороху, томату, моркви, пшениці, ячменю, картоплі, сої, соняшника, салату-латуку, рису та с люцерни.

Відповідно до варіанту здійснення вказаного вище способу згідно винаходу, рослинні клітини, і. 3з5 трансформовані згідно винаходу, культивують ін вітро, особливо, у біореакторах, за методом, описаним у роботі р

Вгодеїйиз, 1988р., у рідкому середовищі або згідно методу, описаному у роботі Вгодеїйвз та ін., 1979р., в іммобілізованій формі або ще згідно методу, описаному у роботі Оепо та ін., 1987р., шляхом культивування трансформованих корнів ін вітро. «

Вищевказані культуральні середовища ін вітро потім витягають для екстрагування з них та, при 70 необхідності, очищення, особливо, за допомогою хроматографії, рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або 8 с поліпептидної похідної (поліпептидних похідних), описаної (описаних) вище, продукованих вищевказаними ц трансформованими клітинами, культивованими ін вітро. "» Відповідно до переважного варіанту здійснення вищевказаного способу одержання рекомбінантної ІС та/або поліпептидної похідної (поліпептидних похідних) згідно винаходу, трансформація рослинних клітин супроводжується стадією одержання трансформованих рослин шляхом культивування зазначених -І трансформованих клітин у відповідному середовищі. Рекомбінантна ІС та/або поліпептидна похідна (поліпептидні похідні), продуковані у клітинах рослин, що одержані таким чином, витягають шляхом екстракції з о цілих рослин або частин цих рослин (особливо з листя або стебла, або плодів) або ще з насіння цих рослин, ко причому за цією екстракцією, при необхідності, йде стадія очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки (ОС) та/або поліпептидної похідної (поліпептидних похідних). б Трансформованими рослинами, що використовуються для витягання рекомбінантної Ї05С та/або "І поліпептидної похідної (поліпептидних похідних) у рамках вищевказаного способу, є рослини генерації ТО, а саме, рослини, одержані шляхом культивування трансформованих клітин, згідно винаходу, на відповідному середовищі або, переважно, рослини наступних генерацій (Т1, 712 і т.д.), одержаних внаслідок самозапилення рослин попередньої генерації, в яких рекомбінантні нуклеотидні послідовності, згідно винаходу, розмножуються за законом Менделя.

Ф, З поліпептидних похідних шлункової ліпази собаки (ІС), які можуть бути одержані у рамках здійснення ко способу згідно винаходу, можна вказати: - поліпептид, обмежений амінокислотами, розташованими у позиціях 55 і 379 на Фіг.2, що називається ще бо поліпептидом (д54) та представлений послідовністю Мо4, причому вищевказаний поліпептид кодований нуклеотидною послідовністю, представленою послідовністю Мо3; - поліпептид, обмежений амінокислотами, розташованими у позиціях 5 і 379 на Фіг.2, що називається ще поліпептидом (44) та представлений послідовністю Моб, причому даний поліпептид кодований нуклеотидною послідовністю, представленою послідовністю Моб; 65 Особливо, предметом винаходу є будь-який спосіб, такий як вищеописаний, одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки (С), представленої на Фіг.2, і, при необхідності, одержання поліпептидного похідного (або декількох поліпептидних похідних), особливо згаданих вище поліпептиду (454) та/або поліпептиду (44), причому вищевказаний спосіб відрізняється тим, що стадію трансформації рослинних клітин реалізують за рахунок інтеграції у геном цих клітин рекомбінантної послідовності, такої, як описана вище, що

Містить з одного боку, КДНК, представлену на Фіг.1, та, з іншого боку, послідовність, що кодує сигнальний пептид з 22 амінокислот шлункової ліпази кроля (ІІ), переважно таку, яка кодує 19 перших амінокислот сигнального пептиду шлункової ліпази кроля.

Більш прийнятно, винахід стосується способу, такого, як описаний вище, одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки, представленої на Фіг.2, при необхідності, у сполученні з поліпептидом (д54) та/або 70 (А4), який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію клітин експлантатів листя рослини за рахунок сполучення цих останніх зі штамом

Адгорасіегішт (шптегасіепз, трансформованим за допомогою плазміди, наприклад, описаною вище плазмідою, що містить вказану вище рекомбінантну нуклеотидну послідовність раз55--5101--С, у відповідному культуральному середовищі; - селекцію трансформованих експлантатів при використанні середовища, що містить канаміцин, - одержання трансформованих рослин з вищевказаних трансформованих експлантатів шляхом їх культивування на відповідних середовищах; - екстрагування рекомбінантної шлункової ліпази собаки, та при необхідності, поліпептиду ( А5бБ4) та/або поліпептиду (44), за допомогою гомогенізації листя, та/або насіння, та/або плодів вищезгаданих трансформованих рослин у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини, що утворює рослинний екстракт, який має ферментативну активність; - при необхідності, очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки, виходячи з екстракту, одержаного під час попередньої стадії, особливо, шляхом хроматографії надосадовою рідиною, в результаті чого одержують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки, по суті, у чистому вигляді. с

Предметом винаходу також є застосування вказаного способу для одержання поліпептиду ( А5бБі) або (44), Ге) по суті, у чистому вигляді шляхом очищення цих останніх, виходячи з екстракту, одержаного вказаним вище способом, зокрема, шляхом хроматографії надосадової рідини після екстракції.

Предметом винаходу, більш переважно, є спосіб одержання вищезгаданого поліпептиду ( А4), при необхідності, по суті, у чистому вигляді, за допомогою здійснення описаного вище способу, при якому клітини, - трансформовані послідовністю разб55-РЗІ 1-0, являють собою клітини експлантатів листя пасльонових, Ге) зокрема, тютюну або томату.

Згідно варіанту здійснення згаданого способу, поліпептид (44), може бути специфічно одержаний шляхом сч екстракції з листя вищевказаних трансформованих тютюнових рослин, особливо, шляхом гомогенізації цього со листя у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини. Потім поліпептид ( 4) може бути очищений, виходячи з екстракту вказаного листя, що містить вказаний поліпептид ( л4), зокрема, за ге допомогою хроматографії вказаної надосадової рідини.

Предметом винаходу є, більш переважно, любий спосіб, як, наприклад, описаний вище спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептидного похідного (або декількох поліпептидних похідних) « 20 вказаної ліпази, таких як, описані вище, який відрізняється тим, що стадію трансформації рослинних клітин -в здійснюють шляхом інтеграції у геном цих останніх, послідовності, яка містить, з одного боку, нуклеотидну с послідовність, представлену на Фіг.3, і, з іншого боку, послідовність, що кодує описаний вище сигнальний :з» пептид спораміну А.

З поліпептидних похідних рекомбінантної шлункової ліпази собаки, які можуть бути одержані описаним вище 15 способом, можна вказати вищезгадані поліпептиди (454) та/або (д4). -І Винахід, особливо, стосується способу одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або згаданого вище поліпептиду (АБ) та/або (А4), який відрізняється тим, що він включає: і - трансформацію клітин експлантатів рослини (зокрема, експлантатів листя) шляхом сполучення вказаних

ГІ клітин зі штамом Адгорасіегішт (Шштегасіепх, трансформованим плазмідою, наприклад, описаною вище плазмідою, яка містить вказану вище рекомбінантну нуклеотидну послідовність разбо5-Р5-ЇсС та/або

Ме раз55-РРВ-І ОС;

І - селекцію трансформованих експлантатів при використанні середовища, що містить канаміцин; - одержання трансформованих рослин з вищевказаних трансформованих експлантатів шляхом культивування цих експлантатів на відповідних середовищах; 5Б - екстрагування рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду ( 454) та/або поліпептиду (А4), зокрема, за допомогою гомогенізації листя та/або насіння, та/"або плодів вищезазначених трансформованих

Ф) рослин у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини, що являє собою рослинний ко екстракт, який має ферментативну активність; - при необхідності, очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду ( 454) та/або бо поліпептиду (л4), виходячи з одержаного у попередній стадії екстракту, зокрема, шляхом хроматографії надосадової рідини, у результаті чого одержують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (А5Б4) та/або поліпептид (4), по суті, у чистому вигляді.

Винахід переважно стосується способу одержання вищезгаданих поліпептидів ( А5бБ4) та/або (/А4), при здійснені описаного вище способу, в якому трансформованими клітинами є клітини експлантатів листя бо пасльонових, зокрема, тютюну або томату.

Відповідно до особливого варіанту здійснення згаданого вище способу згідно винаходу, поліпептид ( ДАБ4)

може бути специфічно одержаний шляхом екстракції з насіння згаданих трансформованих тютюнових рослин, зокрема, шляхом гомогенізації цього насіння у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини. Потім поліпептид (д54) можна очищувати, виходячи з екстракту вказаного насіння, що

Містить зазначений поліпептид (А5б4), зокрема, за допомогою хроматографії вказаної надосадової рідини.

Винахід, особливо, стосується способу одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або згаданого вище поліпептиду (АБ) та/або (А4), який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію клітин експлантатів листя рослини в результаті сполучення цих останніх зі штамом

Адгорасіегішт (шптегасіепз, трансформованим за допомогою плазміди, наприклад, описаною вище плазмідою, що 70 містить вказану вище рекомбінантну нуклеотидну послідовність рокИО-РР5Б-Ї(С та/або послідовність рСКО-РБЗ-Ї ОС, та/або послідовність рОЕАЇІ-РБІ 1 -І05С, та/або послідовність рОЕАб-Р5ІОІ1-ІЇОС, та/або послідовність рАК-ІАК-РБЗІ СІ -105С, та/або послідовність ру-зен-РЗІ 1-0, та/або послідовність ру-зеїн-РЗІ СІ -І С-КОЕЇГ; - селекцію трансформованих експлантатів при використанні середовища, що містить канаміцин; - одержання трансформованих рослин з вищевказаних трансформованих експлантатів шляхом їх культивування на відповідних середовищах; - екстрагування рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду ( 454) та/або поліпептиду (44), особливо, за допомогою гомогенізації насіння згаданих вище трансформованих рослин у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини, що утворює рослинний екстракт, який має ферментативну активність; - при необхідності, очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду ( А5бБ4), та/або поліпептиду (44), виходячи з одержаного у попередній стадії екстракту, зокрема, шляхом хроматографії надосадової рідини, у результаті чого одержують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки, по суті, у чистому вигляді. с

Винахід, більш переважно, стосується способу одержання згаданого вище поліпептиду ( Аб4) шляхом Ге) здійснення описаного вище способу, при якому трансформованими клітинами є клітини експлантатів рапсу або тютюну, а екстрагування поліпептиду ( Алб4) здійснюють, зокрема, шляхом гомогенізації трансформованого насіння.

Рослинні клітини, трансформовані згідно описаним вище способам, переважно, вибирають з клітин тютюну, - рапсу, кукурудзи, гороху, томату, моркви, пшениці, ячменю, картоплі, сої, соняшника, салату-латуку, рису та (Се) люцерни.

Винахід, переважно, стосується способу одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або см поліпептиду (АБ), і/або поліпептиду (44), який відрізняється тим, що він включає: со з - трансформацію клітин калюсів кукурудзи шляхом бомбардування цих клітин з пушки плазмідами з М рекомбінантною нуклеотидною послідовністю рАК-ІАК-РЗІ 01 -І С і/або послідовністю ру-зеїн-Р5І І-І С, і/або послідовністю ру-зеїн-Р5І СІ -І (5С-КОБЕЇ; - селекцію трансформованих калюсів при використанні середовища, що містить селективний агент, наприклад, канаміцин; « 20 - одержання трансформованих рослин кукурудзи з вищевказаних трансформованих калюсів шляхом їх ш-в с культивування на відповідних середовищах; - екстрагування рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду ( 454), і/або поліпептиду (А4), :з» зокрема, за допомогою гомогенізації насіння згаданих трансформованих рослин у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини, що створює рослинний екстракт, який має ферментативну активність; -І - при необхідності, очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/або поліпептиду ( АБ4), і/або поліпептиду (44), виходячи з одержаного у попередній стадії екстракту, зокрема, шляхом хроматографії о надосадової рідини, у результаті чого одержують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид ко (АБ), і/або поліпептид (А4), по суті, у чистому вигляді.

Фу 50 Винахід стосується також любої трансгенної рослинної клітини, такої як описана вище, яка містить рекомбінантний поліпептид (або декілька рекомбінантних поліпептидів) згідно з винаходом, такі, як що рекомбінантна шлункова ліпаза собаки та/або поліпептид (А5бБ4), і/або поліпептид (А4), причому зазначена рослинна клітина називається ще рослинною клітиною з ферментативною активністю, переважно, з ліпазною активністю, такою як описується нижче.

Предметом винаходу також є генетично трансформоване насіння, що містить одну рекомбінантну о нуклеотидну послідовність (або декілька рекомбінантних нуклеотидних послідовностей), таку як описана (описані) вище послідовність (послідовності), згідно винаходу стабільно інтегровану у геном. де Винахід стосується також описаного вище трансгенного насіння, що містить один рекомбінантний поліпептид (або декілька рекомбінантних поліпептидів) згідно винаходу, наприклад, рекомбінантну шлункову ліпазу собаки 60 та/або поліпептид (А5Б4), і/або поліпептид (А4), причому вказане насіння називається ще насінням з ферментативною активністю, переважно, з ліпазною активністю, такою як описується нижче.

Трансформованим згідно винаходу насінням є насіння, одержане від генетично трансформованих, згідно винаходу, рослин, причому цими трансформованими рослинами є або рослини вищевказаної генерації ТО, одержані шляхом культивування трансформованих, згідно винаходу, клітин, або рослини наступних генерацій бо (11, Т2 і т.д.), одержані самозапиленням або схрещенням рослин попередніх генерацій (як було вказано вище).

Предметом винаходу також є генетично трансформовані рослини або частини рослин (особливо експлантати, стебла, листя, плоди, коріння, пилок тощо), які відрізняються тим, що вони містять одну або декілька рекомбінантних нуклеотидних послідовностей таких, як описані вище, стабільно інтегрованих, згідно винаходу, в їх геном.

Винахід стосується також описаних вище трансгенних рослин або їх частин, які містять один або декілька рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки та/або поліпептид (д54) і/або поліпептид (А4), причому названі рослини або їх частини ще називаються рослинами або частинами рослин з ферментативною активністю, переважно, з ліпазною активністю, такою, як описується нижче.

Предметом винаходу, переважно, є згадані вище трансформовані рослини, такі, які одержують шляхом 7/0 Культивування клітин або насіння, згідно винаходу, такі як описані вище.

Трансформовані згідно винаходу рослини або їх частини, переважно, вибирають з рапсу, тютюну, кукурудзи, гороху, томату, моркви, пшениці, ячменю, картоплі, сої, соняшника, рису, салату-латуку, люцерни та буряка, або з частин цих рослин.

Предметом даного винаходу є любий рослинний екстракт з ферментативною активністю, більш конкретно, з 7/5 ліпазною активністю, що описується нижче, наприклад, екстракт, який одержується за одним з описаних вище способів згідно винаходу та який містить як активні ферменти один рекомбінантний поліпептид (або декілька рекомбінантних поліпептидів) згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки та/або поліпептид (АБ) і/або поліпептиду (44).

Ліпазну (або ліполітичну) активність рослин або їх частин, а також рослинних екстрактів з ферментативною активністю згідно винаходу, можна, особливо, визначати методом Гаргурі |(Сагдоигі та ін., 1986р.), при якому використовують тригліцерид з коротким ланцюгом (наприклад, трибутирин) як субстрат. Ферментативна активність виражається в одиницях (од.), при цьому одна одиниця (од.) відповідає кількості ферменту, необхідної для виділення їмкмоль вільних жирних кислот на хвилину при температурі 372С при оптимальному значенні рН. Ге

Рослинними екстрактами з ферментативною активністю згідно винаходу, переважно, є такі, де масовий о відсоток ферментативно активних рекомбінантних поліпептидів складає приблизно від 0,1 до 2095мас, особливо, від близько 1 до близько 1590омас, від загальної маси присутніх у цих екстрактах протеїнів, що відповідає величині ферментативної активності близько 0,5-1000бод./г сирої маси листя, особливо, близько 10-З0бод./г сирої маси листя або ще близько 1-5000од./г сирої маси насіння, особливо, приблизно 10-1000од./г сирої маси ї- зо насіння.

Предметом винаходу, особливо, є наступні рослинні екстракти з ферментативною активністю: ї-о екстракти з листя і/або плодів, і/або насіння рослин, таких, як одержувані шляхом трансформації клітин Ге експлантатів цих рослин за допомогою послідовності раз55-РБЗІ І-І С або послідовності раз55-РЗ-І С, або послідовності раз55-РРЗ-Ї ОС, за одним з описаних вище способів і які містять рекомбінантну шлункову ліпазу о собаки та/або поліпептид (АБ), і/або поліпептид (А4), особливо: че - екстракт з листя тютюну, такого, як одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів листя тютюну, за допомогою послідовності раз55-Р5-І (С або послідовності раз55-РРБЗ-Ї ОС, по описаному вище способу і який містить поліпептид (54) у сполученні з поліпептидом (А4), причому масовий відсоток суміші цих обох « поліпептидів по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті протеїнів складає приблизно від 0,1 до 2090омас, ферментативна активність цього екстракту складає близько 100-300бод./г сирої ші с маси; ч» - екстракт з листя або плодів томатів, таких як одержувані шляхом трансформації клітин експлантатів з " листя томату, за допомогою послідовності раз55-Р5-Ї0С або послідовності раз55-РРБ-Ї С, по описаному вище способу і які містять поліпептид ( А54) у сполученні з поліпептидом (/4), причому масовий відсоток суміші цих обох поліпептидів по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті, складає - приблизно від 0,1 до 2095мас, ферментативна активність цього екстракту складає близько 100-300од./г сирої с маси; - екстракт з листя тютюну, такого, як одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів з листя де тютюну, за допомогою послідовності раз55-РЗІ І -|3С по описаному вище способу і який містить поліпептид

Ф 20 (да), причому масовий відсоток цього поліпептиду по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у -ч вказаному екстракті, складає приблизно від 0,1 до 2096мас, ферментативна активність цього екстракту складає близько 100-3О00од./г сирої маси; - екстракт з насіння тютюну, такого, як одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів з листя тютюну, за допомогою послідовності раз55-РБ-Ї(С або послідовності раз55-РРЗ-ЇОС, за описаним вище 29 способом і який містить поліпептид ( 54), причому масовий відсоток поліпептиду (454) по відношенню до

ГФ) загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті, складає приблизно від 0,1 до 19о5мас, т ферментативна активність цього екстракту складає близько 10-300од./г сирої маси, екстракти з насіння рослин, таких, як одержувані шляхом трансформації клітин експлантатів цих рослин за допомогою послідовності роКО-РБ-ІоС 0 або послідовності рСКО-РРЗ-Г ОС, або послідовності 60 рОЕАТ1-РБІ І-І ОС, або послідовності рОЕгАб-РБІ І-І (3С, за одним з описаних вище способів і які містять рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (А5а4), і/або поліпептид (А4), особливо: - екстракт з насіння рапсу, такого, як одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів листя рапсу, за допомогою послідовності рскИ-РБ-/ЇОС або послідовності росКкО-РРЗ-ЇОС, або послідовності рОЕА!-РБЗІ о -| С, або послідовності рОєгАб-РЗІ сі -І (С, описаним вище способом і який містить поліпептид б5 (д54), причому масовий відсоток поліпептиду (А5бі4) по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті протеїнів, складає приблизно від 0,1 до близько 19омас, ферментативна активність цього екстракту складає від приблизно 10 до приблизно 1000од./г сирої маси; екстракти з насіння рослин, таких, як одержувані шляхом трансформації клітин експлантатів цих рослин за

Допомогою послідовності рАК-ІАК-РЗІ 1-15 і/або послідовності ру-зеїн-РЗІ 1-0, і/або послідовності ру-зеїн-Р5І І-І ЗС-КОЕЇ, за одним з описаних вище способів і які містять рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (454), і/або поліпептид (44), особливо: - екстракт з зерен кукурудзи, такий, як одержуваний шляхом трансформації клітин кукурудзи (зокрема, калюсів кукурудзи) за допомогою послідовності рАК-ІАК-РЗІ І-І і/або послідовності ру-зеїн-РЗІ І-І с, 70 або послідовності ру-зеїн-Р5І І-І С-КОЕЇ, за описаним вище способом і яка містить поліпептид ( АБ), причому масовий відсоток поліпептиду (д54) по відношенню до загальної маси протеїнів, що містяться у вказаному екстракті, складає приблизно від 0,1 до приблизно 19омас, ферментативна активність цього екстракту складає від приблизно 10 до приблизно 1000од./г сирої маси.

Предметом даного винаходу також є будь-яка ферментативно активна рекомбінантна шлункова ліпаза 75 собаки, амінокислотною послідовністю якої є така, представлена на Фіг.2 або її поліпептидні похідні, що одержуються, особливо, за допомогою додавання та/або супресії, та/л"або заміни одної або декількох амінокислот, причому ці поліпептидні похідні мають ліпазну активність, такі, які одержують, по суті, у чистому вигляді одним з описаних вище способів згідно винаходу, причому ці способи включають стадію очищення рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, особливо, шляхом хроматографії описаних вище 20 ферментативних екстрактів.

Предметом винаходу, більш конкретно, є поліпептиди (454) і (дл4), зазначені вище як поліпептидні похідні вищевказаної рекомбінантної Ї03С, молекулярні маси яких складають відповідно близько 3З7кДа та близько 49кДа.

Під ферментативно активною рекомбінантною шлунковою ліпазою собаки або поліпептидними похідними з с 25 дліпазною активністю, такими, як вказані вище, розуміють любий рекомбінантний поліпептид, який Ге) характеризується ліпазною активністю, такою, яку визначають за вказаним вище методом Гаргурі.

У якості ілюстрації, рекомбінантні поліпептиди згідно винаходу характеризуються ліпазною активністю приблизно від 10 до приблизно 1000од/мг рекомбінантних поліпептидів, переважно, приблизно 100-600од./мг.

Винахід стосується, особливо, рекомбінантної шлункової ліпази собаки, такої, яку одержують шляхом ї- 30 очищення ферментативного екстракту з листя або насіння тютюну, причому зазначені листя або насіння Ге одержують від трансформованих тютюнових рослин, які в свою чергу, одержують з клітин тютюну, трансформованих за допомогою послідовності раз55-РБІ І-І С за описаним вище способом, причому вказана с рекомбінантна шлункова ліпаза собаки характеризується ліпазною активністю, такою, як описана вище. с

Предметом винаходу також є поліпептид (А5Б4) і поліпептид (4), які одержують очищенням ферментативного

Зо екстракту з листя та/або насіння, та/або плодів рослин, зокрема, пасльонових, таких як трансформовані тютюн - або томат, причому ці останні самі одержують з клітин рослин, трансформованих за допомогою послідовності раз5о5-РБ-Ї С або послідовності разб5-РР5-Ї ОС, або послідовності раз55-Р5Іс1-ІОС, за описаним вище способом, причому вищевказані рекомбінантні поліпептиди (АБ) і (л4) характеризуються ліпазною активністю, « наприклад, такою, як вказана вище. З

Винахід стосується також поліпептиду (А5б4), такого, який одержують очищенням ферментативного екстракту с з насіння тютюну або насіння рапсу, причому зазначене насіння одержують відповідно від трансформованих :з» рослин тютюну або рапсу, які, у свою чергу, одержують відповідно з клітин тютюну або рапсу, трансформованих за допомогою послідовності РСКО-Р5Б-Ї С та/або послідовності РОСКО-РРЗ-Ї СС, за описаними вище способами, причому рекомбінантний поліпептид (А5Б4) характеризується ліпазною активністю, такою, як описана вище. -1 що Предметом винаходу також є поліпептид (А5б4) і поліпептид (ЛЯ), що одержуються шляхом очищення ферментативного екстракту з насіння рапсу, причому це насіння походить від трансформованих рослин рапсу, о які, у свою чергу, одержують з клітин рапсу, трансформованих за допомогою послідовності РОЕА1-РБІ І-І С г) і/або послідовності РОЕАб-РБІ І -| С, за описаними вище способами, причому рекомбінантні поліпептиди (44) і (354) характеризуються ліпазною активністю, такою, як описана вище.

Ме Предметом винаходу також є поліпептид (А5б4) і поліпептид (ЛЯ), що одержуються шляхом очищення "І ферментативного екстракту з зерен кукурудзи, причому ці зерна походять від трансформованих кукурудзяних рослин, які, у свою Чергу, одержують з клітин кукурудзи, трансформованих за допомогою послідовності рАК-ІАК-РЗІ СІ -1 С і/або ру-зеїн-РЗІ І-І С, і/або ру-зеїн-РБІ СІ -І 5С-КОЕЇ, за описаними вище способами, причому рекомбінантні поліпептиди (А4) і (А54) характеризуються ліпазною активністю, такою, як описана вище. о Уявні молекулярні маси поліпептидів ( АБ) і (д4) згідно винаходу складають, відповідно, З/кДа і 49кДа, коли їх визначають шляхом аналізу при використанні поліакриламідного гелю та шляхом імунологічного аналізу де після електрофоретичного перенесення на нітроцелюлозу (ці методи детально розглянуті у прикладах здійснення винаходу, які наведеш нижче). 6о0 Винахід стосується антитіл, направлених проти рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, особливо, таких, направлених проти рекомбінантної шлункової ліпази собаки згідно винаходу та/або проти вищезазначених поліпептиду (АБ) і/або поліпептиду (44), і здатних розпізнавати шлункову ліпазу людини.

Такі антитіла можна одержувати у результаті імунізації тварини вказаними поліпептидами з наступним виділенням антитіл, що утворились. бо Зрозуміло, що це продукування не обмежується поліклональними антитілами.

Його можна застосовувати і для будь-якого моноклонального антитіла, що продукується любою гібридомою,

яка може бути одержана класичними методами з селезінкових клітин тварини, особливо миші або пацюка, імунізованих проти одного з очищених поліпептидів згідно винаходу, з одного боку, а також з клітин відповідної мієломи, з іншого боку, і може бути селекціонована завдяки своїй здатності до продукування / Моноклональних антитіл, що розпізнають зазначений вище поліпептид, який використовується початково для імунізації тварин, також, як шлункова ліпаза людини.

Винахід стосується також застосування рослин, їх частин, рослинних клітин або насіння, трансформованих згідно винаходу, для одержання рекомбінантного поліпептиду (або декількох рекомбінантних поліпептидів) згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки або її поліпептидні похідні, такі, як вказані вище, 7/0 особливо шляхом здійснення одного з приведених вище способів згідно винаходу, причому вищевказані рекомбінантні поліпептиди знаходяться, по суті, у чистому вигляді або містяться у рослинних екстрактах з ферментативною активністю, таких, як описані вище.

Предметом винаходу також є застосування, в області харчування людини або тварини, рослин або їх частин з ферментативною активністю згідно винаходу, або рослинних екстрактів з ферментативною активністю, таких, у75. ЯК описані вище, або ще рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки або її поліпептидні похідні, такі, як описані вище.

Винахід, переважно, стосується застосування як продуктів харчування рослин, їх частин, особливо, листя, плодів, насіння, з ферментативною активністю згідно винаходу.

На цій підставі предметом винаходу є, особливо, будь-який харчовий продукт, який одержується з рослини з ферментативною активністю, такої, як описана вище або з її частин, особливо з листя або плодів, або ще насіння цієї рослини, що є їстівним для людини або тварини.

Винахід також стосується любої харчової композиції, що містить рослину (або декілька рослин) з ферментативною активністю, таку (такі), як описана (описані) вище та/або частини такої рослини (таких рослин), особливо, листя та/або насіння, та/або плоди цієї рослини (цих рослин), та/або рослинний екстракт сч об (рослинні екстракти) з ферментативною активністю, як, наприклад, описаний (описані) вище, та/або рекомбінантний поліпептид (або рекомбінантні поліпептиди) згідно винаходу, у випадку необхідності, у (8) сполученні з іншою їстівною сполукою (або декількома іншими їстівними сполуками).

Переважно, рослини або їх частини, які містяться у вказаній харчовій композиції, знаходяться у вигляді гомогенату. ї- зо Харчові продукти згідно винаходу, що називаються також функціональними харчовими продуктами, або харчові композиції згідно винаходу, призначені, особливо, для полегшення абсорбції рослинних або тваринних ісе) жирів, які потрапляють у шлунок індивідууму, здорового або ураженого одною або декількома патологіями, що с впливають або не впливають на ступінь продукування шлункової та/або панкреатичної ліпази. На цій підставі продукти харчування або харчові композиції згідно винаходу, переважно, використовують як харчові добавки. о

Предметом винаходу також є застосування рослин або їх частин, особливо, листя та/або плодів, і/або ї- насіння, або рослинних клітин, з ферментативною активністю згідно винаходу, або рослинних екстрактів з ферментативною активністю, таких, як описані вище, або ще рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, або її поліпептидні похідні, такі, як описані вище, для одержання медикаментів (або фармацевтичних композицій), призначених для полегшення абсорбції рослинних або « тваринних жирів, які потрапляють у шлунок індивідууму, здорового або враженого одною або декількома в с патологіями, які впливають або не впливають на ступінь продукування шлункової та/або панкреатичної ліпази. . Зокрема, такі фармацевтичні композиції, переважно, використовують для індивідуумів, які піддаються и?» лікуванню, що приводить до погіршення механізму абсорбції жирів або ще для осіб похилого віку.

Фармацевтичні композиції згідно винаходу також, переважно, призначені для лікування патологій, пов'язаних

З недостатністю ліпаз (особливо шлункової та/або панкреатичної ліпаз) в організмі, та більш конкретно, -І патологій, таких, як муковісцидоз або екзокринна панкреатична недостатність.

Предметом винаходу, більш конкретно, є люба фармацевтична композиція, яка містить описаний вище о рослинний екстракт (рослині екстракти) з ферментативною активністю та/або рекомбінантний поліпептид (або ко декілька рекомбінантних поліпептидів) згідно винаходу, при необхідності, у сполученні з фармацевтично прийнятним ексципієнтом.

Ме. Предметом винаходу, особливо, є люба вказана вище фармацевтична композиція, що містить рекомбінантну "М шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид (д5б4) і/або поліпептид (ЛЯ), по суті, у чистому вигляді або у вигляді ферментативних екстрактів, таких, як описані вище.

Фармацевтичні композиції згідно винаходу, переважно, вводять перорально і, переважно, знаходяться у Вигляді желатинових капсул, таблеток або порошків, що розбавляються.

Добова доза для людини, переважно, складає приблизно 200-1000Омг, яку вводять частинами, переважно, у іФ) момент основних прийомів їжі, у тому випадку, коли вищевказані фармацевтичні композиції містять ко ферментативні екстракти, такі, як описані вище, і близько 100-500мг у тому випадку, коли вищевказані фармацевтичні композиції містять рекомбінантні поліпептиди згідно винаходу переважно у чистому вигляді. во Предметом винаходу також є застосування рослин або їх частин, особливо листя, та/або плодів, і/або насіння, або рослинних клітин, з ферментативною активністю згідно винаходу або рослинних екстрактів з ферментативною активністю, таких, як описані вище, або ще рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, такі як, рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, або її поліпептидних похідних, таких, як описані вище, для проведення ферментативних реакцій в області індустрії, продовольчої промисловості або агропромисловості, б5 особливо, у промисловості з виробництва жирів, ліпохіми та молочної промисловості.

На цій підставі винахід стосується любого способу, особливо ферментативної біоконверсії або біокаталізу,

шляхом здійснення одної або декількох ферментативних реакцій в області індустрії, продовольчої промисловості або у агропромисловості, особливо, у промисловості по виробництву жирів, ліпохімії та молочної промисловості, причому ці ферментативні реакції проводяться за допомогою рослин, або їх частин, зокрема, листя, і/або плодів, і/або насіння, і/або рослинних клітин, з ферментативною активністю згідно винаходу або рослинних екстрактів з ферментативною активністю, таких, як описані вище, або ще рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, як, наприклад, рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, або її поліпептидні похідні, такі, як описані вище.

Предметом винаходу, зокрема, є ферментативні препарати, призначені для використання в області індустрії, 7/0 продовольчої промисловості та у агропромисловості, які можна застосовувати у рамках здійснення способу, такого як описані вище та які містять рослинний екстракт (або декілька рослинних екстрактів) з ферментативною активністю, як, наприклад, описані вище, і/або один або декілька рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, зокрема, рекомбінантна шлункова ліпаза собаки та/або поліпептид (А5бБ4) та/або поліпептид (44), при необхідності, у сполученні з одною або декількома добавками або одним або декількома іншими ферментами, 7/5 придатними для застосування у промисловому масштабі.

Винахід стосується також застосування рослин або їх частин, зокрема, листя, та/або плодів, та/або насіння, або рослинних клітин, з ферментативною активністю згідно винаходу, для здійснення у промисловому масштабі реакцій ферментативних біоперетворень або біокаталізів, таких, як ферментативний гідроліз або ферментативна переетерифікація.

Рослини з ферментативною активністю або частини цих рослин, зокрема, листя, та/або плоди, та/або насіння, або рослинні клітини згідно винаходу, переважно, використовують одночасно як ферментативне джерело та реакційний субстрат.

Предметом винаходу також є любий спосіб біокаталізу, при якому використовують рослини або їх частини, зокрема, листя, та/або плоди, та/або насіння, або рослинні клітини, з ферментативною активністю згідно с винаходу, та, зокрема, рослини, які містять рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та/або поліпептид ( А54) та/або поліпептид (44), причому вищевказані рослини або їх частини застосовують одночасно як ферментативне і) джерело та реакційний субстрат.

Винахід стосується переважно застосування рослин з ферментативною активністю. Або частин цих рослин, згідно винаходу, з метою одержання біопалива. -

На цій підставі, предметом даного винаходу є любий спосіб одержання біопалива шляхом добавлення спирту, особливо метанолу або етанолу, до гомогенату з цілих або частин рослин, трансформованих згідно ї-о винаходу, переважно, до гомогенату з насіння рапсу, соняшника або сої, трансформованих відповідно до Ге! винаходу, та шляхом рекуперації біопалива, особливо, шляхом фільтрації.

Винахід стосується також ефірів рослинних жирних кислот, які одержують зазначеним вище способом, о особливо, як метиловий ефір олеїнової кислоти. ч-

Предметом винаходу також є любе біопаливо, наприклад, біопаливо, яке одержується способом, таким, як описаний вище, і, особливо, любе вищевказане біопаливо, яке містить ефіри рослинних жирних кислот.

Винахід, зокрема, стосується любого біопалива, такого, яке одержують шляхом здійснення вищевказаного « способу з насіння рапсу і яке містить метиловий ефір олеїнової кислоти.

Винахід також стосується застосування зазначених вище антитіл, спрямованих проти рекомбінантних - с поліпептидів згідно винаходу, для здійснення методу виявлення або кількісного аналізу шлункової ліпази собаки ц або людини у біологічній пробі, яка може містити таку ліпазу. "» Винахід стосується, особливо, застосування зазначених антитіл для здійснення методу діагностики ін вітро патологій, пов'язаних з надпродукуванням або навпаки з недостатністю, навіть з відсутністю продукування ліпази в організмі. -і Такий метод діагностики ін вітро, що реалізується на відібраній у пацієнта біологічній пробі, включає о стадію співставлення вказаної проби з одним або декількома антитілами згідно винаходу, за якою йде стадія виявлення можливих комплексів антитіло-І ЗН, що утворилися під час попередньої стадії. ко На цій підставі винахід стосується також набору для здійснення згаданого вище методу виявлення або б» 50 діагностики ін вітро, який включає: - антитіла, такі як описані вище, переважно, радіоактивно або ферментативно маркіровані, а також реактиви що для створення сприятливого середовища при проведенні імунологічної реакції між цими антитілами та шлунковою ліпазою людини; - реактиви для виявлення імунологічних комплексів, що утворюються між цими антитілами та шлунковою ліпазою людини.

Предметом даного винаходу, особливо, є застосування рекомбінантної нуклеотидної послідовності, яка о містить з одного боку, КДНК, представлену на Фіг.4 і кодуючу шлункову ліпазу людини, представлену на Фіг.5, ко або нуклеотидну послідовність, що походить від цієї КДНК, особливо, в результаті добавки та/або супресії та/"або заміни одного або декількох нуклеотидів, причому вищевказана похідна послідовність здатна кодувати 60 поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична такій шлункової ліпази людини, наведеної на Фіг.5, або поліпептидну похідну шлункової ліпази людини, що одержується шляхом добавки, та/або супресії, та/або заміни одної, або декількох амінокислот, причому ця поліпептидна похідна характеризується ліпазною активністю, та, з іншого боку, елементи, які сприяють рослинній клітині продукувати поліпептид, кодований за допомогою вищевказаної КДНК або вищевказаної похідної послідовності, особливо, промотор та термінатор 65 транскрипції, що розпізнаються транскрипційним апаратом рослинних клітин (особливо, за допомогою

РНК-полімераз цих клітин), з метою трансформації рослинних клітин для одержання з цих клітин або рослин,

одержаних з цих клітин, рекомбінантної шлункової ліпази у вигляді активного ферменту або одної, або декількох поліпептидних похідних цього ферменту, таких, як описані вище.

На цій підставі винахід стосується любої рекомбінантної нуклеотидної послідовності, такої як, описана вище, в рамках трансформації рослин з метою одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки, в якій нуклеотидна послідовність, кодуюча шлункову ліпазу собаки та наведена на Фіг.1 або 3, замінена нуклеотидною послідовністю, що кодує шлункову ліпазу людини та наведена на Фіг.4.

Предметом винаходу є, особливо, наступні рекомбінантні нуклеотидні послідовності: - послідовність (що позначається як роР-РБІ ОН-І| ОН), яка містить у напрямку 5-53 промотор роР бактерії 70 Адпірасіегішт (утегїасіепв, послідовність, яка кодує сигнальний пептид шлункової ліпази людини, за якою безпосередньо йде представлена на Фіг.4 нуклеотидна послідовність, потім термінатор роїуА 535 вірусу Самм; - послідовність (що позначається як роР-РБІ РН-І ОН), яка містить у напрямку 5-53" промотор роР, бактерії

Адгірасіегіцшт (Шптегїасіепз, послідовність, яка кодує сигнальний пептид шлункової ліпази людини, за якою безпосередньо йде представлена на Фіг.4 нуклеотидна послідовність, потім термінатор роїуА 535 вірусу Самм; - послідовність (що позначається як роР-РБІ СІ -І СН), яка містить у напрямку 5'-»53 промотор роР бактерії

Адгірасіегічт (Шштегасіепв, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду І СІ (такої, як описана вище), за якою безпосередньо йде представлена на Фіг.4 нуклеотидна послідовність, потім термінатор роїуА 53 5 вірусу

Сами.

Винахід стосується також векторів і клітин-хазяїв, трансформованих вказаними векторами, таким як описані вище, та які містять вищевказані рекомбінантні нуклеотидні послідовності, що кодують шлункову ліпазу людини та/або її поліпептидні похідні.

Предметом даного винаходу є також любий спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази людини у вигляді активного ферменту та/або одної або декількох її поліпептидних похідних, що одержуються, особливо, за допомогою додавання та/або супресії, та/(або заміни одної, або декількох амінокислот, причому ця або ці Ге поліпептидні похідні мають ліпазну активність, який відрізняється тим, що він включає: о - трансформацію рослинних клітин для інтеграції у геном цих клітин одної або декількох рекомбінантних нуклеотидних послідовностей згідно винаходу, - при необхідності, одержання трансформованих рослин з вказаних вище трансформованих клітин, - виділення рекомбінантної ліпази людини та/або одної, або декількох вищевказаних поліпептидних похідних, - продукованих у вказаних вище трансформованих клітинах або рослинах, особливо шляхом екстракції з наступним, при необхідності, очищенням. ї-о

Предметом винаходу є, особливо, любий спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази людини шляхом см здійснення способу, такого, як описаний вище, у рамках одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки та/"або її поліпептидних похідних за допомогою вищевказаної рекомбінантної послідовності, яка включає Шк представлену на Фіг.4 послідовність. ч-

З поліпептидів, що є похідними рекомбінантної шлункової ліпази людини, які можна одержувати в рамках здійснення способу згідно винаходу, можна вказати: - поліпептид, обмежений амінокислотами, розташованими у позиціях 74 і 398 Фіг.5, що називається також « поліпептидом (АБ ОН); - поліпептид, обмежений амінокислотами, розташованими в позиціях 24 і 398 Фіг.5, що називається також - с поліпептидом (А ОН). ч» Винахід стосується, особливо, способу одержання, такого, як описаний вище, рекомбінантної шлункової " ліпази людини та/або поліпептиду (541! СН), та/або поліпептиду (44 ОН), який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію клітин експлантатів з листя рослин за рахунок поєднання цих останніх зі штамом - Адгорасіегішт (шШтегасіепх, трансформованим за допомогою плазміди, такої як описана вище, яка містить со вказану вище рекомбінантну нуклеотидну послідовність роеР-РБІОН-Ї ОН і/або реР-РБІРН-І/ СОН, і/або рЗР-РБІ ОГ-І ОН, у відповідному культуральному середовищі; де - селекцію трансформованих експлантатів при використанні середовища, яке містить канаміцин,

Ф 20 - одержання трансформованих рослин з трансформованих експлантатів, вказаних вище, шляхом їх культивування у відповідних середовищах; "м - екстрагування рекомбінантної шлункової ліпази людини та/або поліпептиду ( А5б4Ї СН), і/або поліпептиду (л4І ОН), особливо, за допомогою гомогенізації листя та/або зерен, і/або плодів згаданих трансформованих рослин у відповідному буфері, центрифугування та рекуперації надосадової рідини, що являє собою рослинний 25 екстракт, який має ферментативну активність;

ГФ) - при необхідності, очищення рекомбінантної шлункової ліпази людини та/або поліпептиду (дб ОН), і/або т поліпептиду (д4ЇЗН), виходячи з одержаного під час попередньої стадії, екстракту, особливо, шляхом хроматографії надосадової рідини, в результаті чого одержують рекомбінантну шлункову ліпазу людини та/або поліпептид (АБ ОН), і/або поліпептид (ЛЯ СН), по суті, у чистому вигляді. бо Винахід стосується також всієї рослини або її частини, як листя та/або плодів, та/або насіння, що містять одну або декілька рекомбінантних нуклеотидних послідовностей, таких, як описані вище, згідно винаходу, стабільно інтегровані в їх геном.

Предметом даного винаходу є любий рослинний екстракт з ферментативною активністю, особливо, з ліпазною активністю, що описується нижче, який одержується шляхом здійснення одного з описаних вище 65 способів, згідно винаходу, якій місить у якості активних ферментів один або декілька рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, таких, як рекомбінантна шлункова ліпаза людини та/або поліпептид (дБ СН), і/або поліпептид (ДАІ СН).

Предметом винаходу є, особливо, екстракти з листя та/або насіння рослин, таких, як одержувані шляхом трансформації клітин експлантатів з цих рослин за допомогою послідовності реР-РБЗІ ОН-І| СН або послідовності рРЗР-РЗІ РН-! ОН, або послідовності реР-РБІОІ--4ОН одним з описаних вище способів, і які містять рекомбінантну шлункову ліпазу людини та/або поліпептид (АБ СН), і/або поліпептид (ДЯ! СН), зокрема: - екстракт з листя або насіння тютюну, такого як одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів з тютюнового листя, за допомогою послідовності реР-РБІ ОН-| ЗН, або послідовності реР-РБЗІ РН-І ОН, або 70 послідовності реР-РБІ І1-Ї03Н, згідно вищеописаному способу, та який містить поліпептид ( 454! СН) у сполученні з поліпептидом (ЛЯ СН), причому масовий відсоток суміші з цих двох поліпептидів по відношенню до загальної маси присутніх у даному екстракті протеїнів складає від близько 0,1 до близько 2095мас, а ферментативна активність вказаного екстракту досягає від близько 100 до близько Зббод./г сирої маси; - екстракт з листя тютюну, такого як, одержуваний шляхом трансформації клітин експлантатів з тютюнового листя, за допомогою послідовності реР-РБЗІ Б1-І| СН, та який містить поліпептид ( ЛЯ! ОН), причому масовий відсоток цього поліпептиду по відношенню до загальної маси присутніх у даному екстракті протеїнів складає від близько 0,1 до близько 2095мас, а ферментативна активність вказаного екстракту досягає від близько 100 до близько ЗОбод./г сирої маси.

Предметом даного винаходу є також люба ферментативно активна рекомбінантна шлункова ліпаза людини, амінокислотною послідовністю якої є така, представлена на Фіг.5 або її поліпептидні похідні. Одержувані, особливо, за допомогою додавання та/або супресії, та/або заміни одної, або декількох амінокислот, зокрема, поліпептиди (АБ СН) та (А4І СН), причому ці поліпептидні похідні характеризуються ліпазною активністю, такі, як одержувані, переважно, у чистому вигляді одним з описаних вище способів згідно винаходу, причому ці способи включають стадію очищення рекомбінантних поліпептидів згідно винаходу, зокрема, шляхом с хроматографії описаних вище ферментативних екстрактів. Ге)

Як вже зазначалось вище стосовно рекомбінантної шлункової ліпази собаки, предметом винаходу також є: - полі- або моноклональні антитіла, спрямовані проти рекомбінантної шлункової ліпази людини або її поліпептидних похідних згідно винаходу та їх застосування, як описано вище; - харчові продукти або харчові композиції, або фармацевтичні композиції, або ферментативні препарати, - призначені для промислового застосування, на основі рослин або їх частин, особливо листя, та/або плодів, Ге та/або насіння, та/або рослинних клітин, або рослинних екстрактів, з ферментативною активністю, таких, як описані вище, або ще рекомбінантної шлункової ліпази людини, або її поліпептидних похідних згідно винаходу; с - любий спосіб ферментативної біоконверсії або біокаталізу або одержання біопалива, як описані вище, що с здійснюються при використанні рекомбінантної шлункової ліпази людини або її поліпептидних похідних згідно

Зо винаходу або рослин, або частин рослин, зокрема, листя та/або плодів, і/або насіння, та/(або рослинних - екстрактів з ферментативною активністю, таких, як описані вище.

Далі винахід пояснюється шляхом наведеного нижче детального опису одержання рекомбінантних нуклеотидних послідовностей, таких, як описані вище, а також трансформованих рослин, які продукують « рекомбінантні поліпептиди згідно винаходу, та способу одержання біопалива.

І. Конструкція химерних генів, що кодують рекомбінантний протеїн шлункової ліпази собаки та забезпечують З с експресію у листі та насінні пасльонових з» (І-А) Конструкція химерних генів, які кодують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та забезпечують експресію у тютюні.

Для експресії у листі та насінні тютюну гену, що кодує шлункову ліпазу собаки потрібні наступні регулюючі послідовності: - 1. Подвійний конститутивний промотор 355 (раз55) вірусу мозаїки цвітної капусти СаммМ.

Га Він відповідає подвоєнню послідовностей, що активують транскрипцію та розташовані вище елементу ТАТА природного промотору 355 ІКау та ін., 1987р.. о 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор роїу 355, який відповідає некодуючій ділянці 3

Ф 20 послідовності вірусу з дволанцюговою кільцевою ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскрипт 535

І(Егапк та ін., 1980р.|. "м Конструкції різних плазмід при використанні прийомів, пов'язаних з рекомбінантною ДНК |Затьгоок та ін., 1989р.), утворюються з рВІОСА. Дана бінарна плазміда походить від роА492 (Ап, 1986р.), яка містить між лівим і правим краями, наступні послідовності, що походять від плазміди ртіТ37 Адгорасіегішт (Штегасіепз у її 255 переносимій ДНК:

ГФ) конститутивний промотор гену поз, кодуючого нопалінсинтазу (|Оеріскег та ін., 1982р.Ї; кодуюча послідовність гену прійї, кодуючого неоміцинфосфотрансферазу І! (Вего і Вего, 1983р.)Ї, одержана у результаті де делеції ділянки перших 8 кодонів, у числі яких ініціюючий кодон метіонін АТО, та злиття з послідовністю з 14 перших кодонів кодуючої послідовності гену поз |Оеріскег та ін., 1982р.Ї; кодуюча послідовність гену пов, 60 позбавлена ділянки з 14 перших кодонів; термінатор поз (Оеріскег та ін., 1982р.); ділянка з множинними сайтами клонування (що називається також "полілінкер") (Ніпапі-ХраІ-Засі-НраІ-Крпі!-СіІаІ-Вдіїг), попередній гену саї кодуючому хлорамфеніколацетилтрансферазу (|Сіозе та Коагідце7, 1982рі а також кінцеві послідовності гену б плазміди ртіАб Адгобрасіегішт (Штеїасіепе (іш та ін., 1993р.). Для майже повного видалення кодуючої послідовності гену саї, плазміду рОА492 подвійно перетравлюють за допомогою бай (сайт бо рестрикції полілінкеру) і за допомогою Зеаї (сайт рестрикції, присутній у послідовності гену саб, після чого піддають впливу ферменту Т4 ДНК полімерази (Мем Еподіапа Віоїарв) відповідно до рекомендацій виробника

Легування модифікованої плазміди (2Онг) проводять у 1Омкл реакційного середовища, що містить Тмкл буферного розчину Т4 ДНК лігази х 10 (Атегепат) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігази (Атегепат) при 149С протягом 16 годин. Бактерії Евспегіспіа сої ОНбо, які попередньо роблять компетентними, трансформують

ІНапанап, 1983р.|. Плазмідну ДНК одержаних клонів, селекціонованих при використанні середовища, що містить 12 мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису (Вігпроїт і Юоїу, 1979р.| і аналізують шляхом ферментативного перетравлення. Потім сайт рестрикції Ніпа!її плазмідної ДНК утриманого клону модифікують у сайті рестрикції ЕсокК! за допомогою фосфорильованого адаптеру НіпапПІ-ЕсокіІ (Зігаїадепе Сіопіпд Зузіетвв). 70 Для проведення такої модифікації, 50О0нг плазмідної ДНК утриманого клону переварюють за допомогою Ніпагїії дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфатази телячого кишечнику (Воепгіпдег МапппВеїт), відповідно до рекомендацій виробника, та співосаджують у присутності 150Онг ДНК адаптеру НіпаїП-Есокі, 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію, рН 4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом ЗОхв. Після центрифугування з прискоренням 12009 протягом ЗОхв. ДНК, що випала в осад, промивають 7095-им етанолом, 75 сушать. Обробляють за допомогою мкл води, витримують при 652С протягом 10 хвилин, потім легують у присутності ТІмкл буферу Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегзпат) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегзпат) при 1496 протягом 16 годин. Після інактивації Т4 ДНК лігази при 65 «С протягом 10 хвилин, реакційну суміш після легування переварюють за допомогою ЕсоКІ, очищують шляхом електрофорезу на 0,8У0-ому гелі агарози, електроелююють |Затргсоок та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рн-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -809С протягом ЗОхв., центрифугують при прискоренні 120009 протягом 30 хвилин, промивають 7090-им етанолом, сушать, потім легують, як описано вище. Бактерії ЕзсНегіспіа соїї ОН5о, які попередньо роблять компетентними, трансформують ІНапайап, 1983р.|. Плазмідну ДНК одержаних клонів, селекціонованих при використанні середовища, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису ІВігпроїт і Ооїу, 1979р.| та аналізують шляхом ферментативного перетравлення, особливо, за с допомогою Ніпай ї Есові. Результуючу бінарну плазміду, що містить не більше 9 останніх кодонів кодуючої (3 послідовності гену саї і сайт Есокі, який є єдиним, позначають як рВІОСА.

Касету експресії, утворену промотором разьо5 та термінатором роїуА 355, виділяють з плазміди рЛТ163 А.

Плазміда рЛТ163А4 походить від плазміди рЛТ163, яка, в свою чергу, сама утворюється з плазміди рЛТбо

ІСцегіпеаи і Мийпеаих, 1993р.). Плазміда рЛТ163 містить кодон АТО, розташований між сайтами Ніпай і заїЇ - полілінкера. Для видалення згаданого кодону АТО та одержання плазміди рЛТ163 л, плазмідну ДНК рЛТ163 «о подвійно переварюють за допомогою НіпайШ і ЗаїЇ, очищують за допомогою електрофорезу на 0,895-ому гелі сч агарози, електроелююють |Затрбгоок та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рН-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні (9 120009 протягом 30 хвилин, промивають 70956-им етанолом, сушать, піддають впливу ферменту Кленова (Мем їм

Епадіапа Віоіарв) відповідно до рекомендацій виробника, видаляють протеїн шляхом екстракції за допомогою 1 об'єму суміші фенол:хлороформ:ізоаміловий спирт у співвідношенні 25:24:11, потім одного об'єму суміші хлороформ':ізоаміловий спирт у співвідношенні 24:11, осаджують у присутності 110 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рН--4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні « 120009 протягом ЗО хвилин, промивають 70956-им етанолом, сушать, і, нарешті, легують у присутності мкл в с буферу Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат) та 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегзпат) при 1492С протягом 16 й годин. Бактерії Езспегіспіа соїї ОН5Бо, які попередньо роблять компетентними, трансформують (Напайап, 1983р.1. "» Плазмідну ДНК одержаних клонів, селекціонованих у середовищі, що містить 5О0мкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису |ІВігпроїт і Юоїу, 1979р.4 і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Для виділення касети експресії, утвореної промотором разоз і термінатором -І роїуА 355 (фрагмент Засі-Хпої), плазмідну ДНК утриманого клону рЛТ1634А перетравлюють за допомогою засі та

Хпої. Фрагмент Засі-Хпої, що міститься у касеті експресії, очищують за допомогою електрофорезу на 0,896-ому о гелі агарози, електроелююють |ЗатрбгоокК та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ко ацетату натрію з рН-4,8 та 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 120009 протягом 30 хвилин, промивають7090-им етанолом, сушать, потім піддають впливу (22) . й . не ферменту Мипуо Веап Мисієвазе (Мем/ Еподіапа Віоіїарв) відповідно до рекомендацій виробника. Цю очищену що вставку (200нг) клонують у плазмідній ДНК рвІОСА (20Онг), перетравлюють за допомогою ЕсокКіІ, обробляють ферментом Мипд Веап Мисівеєазе та дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Военгіпдег Маппіеїт) відповідно до рекомендацій виробника. Реакцію легування проводять у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігази х 10 (Атегепат), 2мкл 5095-го о поліетиленгліколю 8000 та бод. ферменту 714 ДНК лігаза (Атегепат) при 1492 протягом 16 годин. Бактерії

ЕзспНегіснпіа соїї ОН5Бо, які попередньо роблять компетентними, трансформують (Напайап, 1983р.). Плазмідну ДНК о одержаних клонів, селекціонованих при використанні середовища, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису |Вігпроїт і ЮОоіу, 1979р. та аналізують шляхом ферментативного 60 перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВІОС21.

Шлункову ліпазу собаки (ІС) легко синтезують у вигляді попередника. Зрілий протеїн шлункової ліпази собаки складається з 379 амінокислот. Комплементарну ДНК шлункової ліпази собаки клонують у сайтах ВО! ї

Заї! вектору експресії РЕВРОЗОЗ, одержуючи вектор роб 5.303, який описаний у міжнародній заявці 94/13816. Його використовують для конструкції бінарних плазмід рРВІОС25, що містить Р5Б-Ї С і рВІОС26, що містить РРЗ-І ОС, бо де послідовність, що кодує зрілу І С, передує такій, що кодує сигнальний пептид (Р5) або препропептид (РРБ, тобто сигнальний пептид, за яким йдуть М-кінцеві вакуолярні спрямовуючі послідовності відповідно рослинного походження. Послідовностями РБЗ і РР5, утвореними відповідно 23 і 37 амінокислотами, є такі запасного протеїну бульбоподібних коренів батату: спорамін А |МигаКкаті та ін., 1986р.; Маїзикоа і Макатига, 1991р.1.

Для спрощення злиття послідовності зрілої шлункової ліпази собаки з такою сигналів адресації, Р5 або РРБ, плазміду рОСІ 5.303 модифікують за допомогою введення додаткового сайту рестрикції Ніпай у четвертий і п'ятий кодони послідовності зрілої шлункової ліпази собаки шляхом мутагенезу, що спрямовується за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (ПЦР) з використанням двох олігодезоксинуклеотидів: 5 саддадаїс ТО ТТ

СОА ААС СТТ САТ ССС 3 (що містить єдиний сайт Ва у плазміді та дає додатковий сайт Ніпа) і 5 САТ АТТ

ССТ САС Сто ОСТ АТС 3 (що містить єдиний сайт Руці! у плазміді). Ампліфікацію шляхом ПЦР фрагменту 7/0. ВеПІ-РУМІіЇ здійснюють у 100мкл реакційного середовища, що містить їОмкл буферу Тад ДНК полімераза х 10 (500мММ КСІ, 100мММ Ттів-НСІ, рН-9,0 ї 195 Ттйоп х 100), бмкл 25мМ Масі», Змкл т10мм амте (аАдтеР, асте, астр, аТТР), 100пМ кожного з описаних вище двох олігодезоксинуклеотидів, нг матричної ДНК (вектор експресії рКи.303, що включає комплементарну ДНК шлункової ліпази собаки), 2,5од. Тад ДНК полімерази (Промега) та 2 краплі вазелінового масла. ДНК денатурують при 942 протягом 5 хвилин, піддають 30 циклам, кожний з яких /5 Включає: 1 хвилина денатурації при 942С; 1 хвилина гібридизації при 5023 та 1 хвилина елонгації при 729С, потім елонгацію при 7223 продовжують протягом 5 хвилин. Цю реакцію ПЦР проводять в апараті "ОМА ТнептаїЇ

Сусіег" фірми "РегКкіп ЕІтег Сейи8". Масло видаляють шляхом екстракції хлороформом. Потім фрагменти ДНК, що містяться у реакційному середовищі, осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рнН-4,8 та 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -809С протягом ЗО хвилин, центрифугують при прискоренні 120009 протягом ЗО хвилин, промивають 70906-им етанолом, сушать і перетравлюють за допомогою двох ферментів рестрикції Во ї Рмушії. Перетравлені фрагменти ДНК, що походять з ПЦР, очищують шляхом електрофорезу на 296-ому гелі агарози, електроелююють |Ззатьгоок та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рН-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 120009 протягом 30 хвилин, промивають7090-им етанолом, сушать, потім с легують з плазмідною ДНК вектору рОСіІ.303, подвійно перетравлюють за допомогою ВоаїЇ ії РуціІ, очищують о шляхом електрофорезу на 0,890о-ому гелі агарози, електроелююють, осаджують за допомогою спирту, сушать і дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепгіпдег Мапппеїт) відповідно до рекомендацій виробника. Легування здійснюють зі 10Онг описаного вище дефосфорильованого вектора та 5Онг перетравлених ферментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР і описаних вище у 1Омкл в. реакційного середовища у присутності тмкл буферного розчину ТА ДНК лігаза х 10 (Атегепаті) і 2,5од. ферменту «со тТ4-ДНК-лігаза (Атегепат) при 1492 протягом 16 годин. Бактерії ЕзсПегіспіа сої ОН5 о, попередньо зроблені компетентними, трансформують |Напапйап, 1983р.І. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у с середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують по методу лужного лізису |ВітБоїт і Юоїу, 1979р.| та со аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Плазмідну ДНК деяких утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7 лм, що ї- випускається у продаж фірмою РІагтасіа, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів ІЗаподег та ін., 1977р.Ї. При введенні цього сайту рестрикції Ніпай генетичний код шлункової ліпази собаки не змінюється.

Насправді, послідовність природної шлункової ліпази собаки ААА ТТА (Гуз-Іеий) перетворюється в ААО СТТ « (Гуг-Геш). Одержану в результаті плазміду позначають як рВІОС22, причому вона включає послідовність протеїну зрілої шлункової ліпази собаки, яка відповідає: З с 160 РНЕ СІМ СУБ ВО ----- ТНВ АБР АБМ 1/5 АМВ "з араіс ТТО ТТ ОСА ААС СІТ --- АСА САТ ААТ ААС ТАС

ТІСТАбвА ----- тя тя

Ш- Ве, Ніні ПІ Хваї (95) єдиний сайт рестрикції єдиний сайт рестрикції ко БЕ: перший кодон зрілої шлункової ліпази собаки; АМВ: стоп-кодон. (о) 20 а. Конструкція бінарної плазміди РВІОС25, що містить Р5-І ОС -ч Плазміду рРВІОС22 перетравлюють повністю за допомогою Ваїй і, частково, за допомогою НіпаїїЇ з метою видалення послідовності, що кодує поліпептид І ец-РПе-с1у-І уз (4 перші амінокислоти) протеїну зрілої шлункової ліпази собаки. Цю послідовність заміняють такою, що кодує сигнальний пептид РЗ з 23 амінокислот (АТО ААА

ССС ТС АСА СТС ОСТ СТО ТС ТА ОСТ СТ ТС СТО ТАТ СТО СТО ССС ААТ ССА ОСС САТ ТСС), здійснюють злиття з послідовністю з 4 перших кодонів послідовності, що кодує протеїн зрілої шлункової ліпази

ГФ) собаки ("Р5БЗ-4 перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки"). Послідовність ""5-4 перших кодонів зрілої

ГФ шлункової ліпази собаки" ампліфікують за допомогою ПЦР, виходячи з плазміди Рмат103 |МаївиокКа та

МаКатига, 1991р.| за допомогою наступних двох олігодезоксинуклеотидів: 5 саддада(сі(дАТО ААА ОСС ТТ АСА во СТО ОСУ 5 о АТО ДАС СТТ ТСС АДА САА БА АТО ОС То АТ обо САС о 3, слідуючи протоколу ампліфікації ПЦР, як описано вище, у розділі 1. Після подвійного ферментативного перетравлення за допомогою

Во ї Ніпаїйї, фрагменти ДНК, одержані після ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують шляхом електрофорезу на 2906-ому гелі агарози, електроелююють |ЗатьгоокК та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рН-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 120009 протягом 30 хвилин, промивають 7090-м етанолом, сушать, потім легують з плазмідною б5 Щй НЯ

ДНК рВІОС22, яку подвійно перетравлюють за допомогою Ваїїй ії Ніпа!й, очищують шляхом електрофорезу на

О,8У6-ому гелі агарози, електроелююють (|ЗатбгоокК та ін. 1989рі), осаджують спиртом, сушать та дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепгіпдег МаппНеїт) відповідно до рекомендацій виробника. Легують зі 10О0нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 5Онг перетравлених фрагментів ДНК, одержаних після ампліфікації за допомогою ПЦР та описаних вище, у 1Омкл реакційного середовища у присутності їмкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегзпйат) та 2,5од. ферменту Т4-ДНК-лігаза (Атегзпат) при 149С протягом 16 годин. Бактерії Езспегіспіа соїї ОН5 ду, яким попередньо надана компетентність, трансформують (|Напайап, 1983р.Ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 5О0мкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису |Вігпроїт і 70 Воїу, 1979р.| та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції.

Плазмідну ДНК деяких утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування 7 тм, що випускається у продаж фірмою РІагптасіа, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів (Запдег та ін., 1977р.Ї. Послідовності РЗ і зрілої шлункової ліпази собаки клонують, зберігаючи відкритими їх рамки зчитування. Розщеплюваною послідовністю, розташованою між послідовностями 75 РБЗ і зрілою шлунковою ліпазою собаки, є Зег-іеи. Одержану в результаті цього плазміду позначають як рРВІОС23. Фрагмент ВаППІ-Храї, що включає послідовність РЗ-Ї С, виділяють з рРВІОС23 шляхом подвійного ферментативного перетравлення за допомогою Ва! і Хваї, очищення шляхом електрофорезу на 0,890-ому гелі агарози, електроелюації (Затьгоок та ін., 1989р.), осадження спиртом, висушування Після цього цей фрагмент обробляють ферментом Кленова відповідно до рекомендацій виробника і легують з плазмідною ДНК рВІОС21, перетравлюють у сайті Ніпай!, обробляють ферментом Кленова та дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепгіпдег Маппеїт) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 2Онг описаного вище дефосфорильованого вектора та 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять

РБЗ-ГОС, у 20 мкл реакційного середовища у присутності 2 мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат), 2мкл 5090-го поліетиленгліколя 8000 та 5од. ферменту ТА ДНК лігаза (Атегепат) при 149С протягом су 16 годин. Бактерії ЕвсПпегіспіа сої ОНбо, яким надана компетентність, трансформують ІНапапап, 1983р.|). о

Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису |Вітроіїт і Ооіу, 1979рі і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВІОС25. Нуклеотидну послідовність фрагменту, що кодує рекомбінантний протеїн Р5-Ї С, аналізують шляхом секвенування за - допомогою набору для секвенування Т7 тм, що випускається у продаж фірмою РНаптасіа, по методу з со використанням дидезоксинуклеотидів (Западег та ін., 1977р.). Плазмідну ДНК бінарного вектору рРВІОС25 вводять шляхом прямої трансформації у штам І ВА4404 Адгобасіегішт (шптегасіепе за методом Ноівіегз та ін. (1978р.). с

Придатність утриманого клону контролюють ферментативним перетравленням плазмідної ДНК. со

Б. Конструкція бінарної плазміди рРВІОС26, що містить РРЗ- ОС

Плазміду рРВІОС22 перетравлюють повністю з допомогою Ва! та, частково, за допомогою НіпаїїЇ з метою - видалення послідовності, що кодує поліпептид І еш-РНе-с1у-І уз протеїну зрілої шлункової ліпази собаки. Цю послідовність замінюють такою, що кодує сигнальний пептид РРБ з 37 амінокислот (АТО ААА ОСС ТС АСА СТО

ССТ СТО ТС ТА ОСТ СТ ОС СТО ТАТ СТО СТО ССС ААТ ССА ОСС САТ ТОС АСО ТТ ААТ ССС АТС «

СОС сто ССС АС АСА САС БдАА ССС ОСС), піддають злиттю з послідовністю з 4 перших кодонів протеїну зрілої шлункової ліпази собаки ("РР5-4 перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки"). Послідовність "РРЗ-4 т с перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки" ампліфікують шляхом ПЦР, виходячи з плазміди РМАТ1ОЗ ч ІМаївиоКа та МаКкатига, 1991р.| за допомогою наступних двох олігодезоксинуклеотидів: 5 саддада(с(юдАТО ААА ни ССС ТТСАСА СТО ОС 3 та 5 о АТО ДАС СТІ ТСС ААА САА оС ооо То ото тот Ост То 3, слідуючи протоколу ампліфікації шляхом ПЦР, як описано вище, у розділі 1. Після подвійного ферментативного перетравлення за допомогою Ваїй! ї Ніпа!Ш, фрагменти ДНК, одержані після ампліфікації за допомогою ПЦР, - очищують шляхом електрофорезу на 2965-ому гелі агарози, електроелююють ІЗатьгоок та ін., 1989р.), осаджують о у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рН-4,8 та 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 120009 протягом 30 хвилин, промивають7095о-им етанолом, ко сушать, потім легують з плазмідною ДНК рВІОС22, подвійно перетравлюють за допомогою Ваї!! та НіпанІ, б 20 очищують шляхом електрофорезу на 0,895-ому гелі агарози, електроелююють |Затбьгоок та ін., 1989р.), осаджують спиртом, сушать та дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепгіпдег "м Мапппеїйт) відповідно до рекомендацій виробника. Легують зі 100нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 5Онг описаних вище перетравлених фрагментів ДНК, що походять від ампліфікації шляхом ПЦР, у 10мкл реакційного середовища у присутності їмкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат) та 2,5од. 22 ферменту Т4-ДНК-лігаза (Атегепат) при 142 протягом 16 годин. Бактерії Евспегіспіа сої ОНбо, яким надана

ГФ) компетентність, трансформують |Напапйап, 1983р.ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису |Вігпроїт і Ооїу, 1979Ор.| і ді аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції.

Плазмідну ДНК деяких утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для 60 секвенування Т7 тм, що випускається у продаж фірмою РІагтасії, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів ІЗаподег та ін., 1977р.). Послідовності РР і зрілої | зС клонують, зберігаючи відкритими їх рамки зчитування. Розщеплюваною послідовністю між двома послідовностями є Аїа-ї еи.

Одержану в результаті цього плазміду позначають як рВІОС24. Фрагмент ВоПІ-Храї, що включає послідовність РРБ-Ї С виділяють з рРВІОС24 подвійним ферментативним перетравленням за допомогою ВоаїЇ і бо Храї, очищують шляхом електрофорезу на 0,890о-ому гелі агарози, електгроелююють |Ззатргоок та ін., 1989р.),

осаджують етанолом і сушать. Потім цей фрагмент оброблюють ферментом Кленова відповідно до рекомендацій виробника і легують з плазмідною ДНК рВІОС21, перетравлюють у сайті Ніпа, оброблюють ферментом Кленова та дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепгіпдег Маппіпеійт) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 20Онг описаного вище дефосфорильованого вектора та 20О0нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять РРБ-- ОС, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат), 2мкл 50905-го розчину поліетиленгліколя 8000 та бод. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегепат) при 149 протягом 16 годин.

Бактерії ЕвсПпегіспіа сої ЮОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують (|Напанап, 1983р.. 70 Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису |Вігпроїт і Ооіу, 1979р.)| та аналізують ферментативним перетравленням за допомогою ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВІОС26б. Нуклеотидну послідовність фрагменту, що кодує рекомбінантний протеїн РРБ-І СС, аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7/ тм, що випускається у продаж фірмою РІагтасіа, по методу з використанням 75 дидезоксинуклеотидів (Запдег та ін., 1977р.і1. Плазмідну ДНК бінарного вектору рРВІОС26 вводять прямою трансформацією у штам І ВА4404 Адгорасіегішт (шптегїасіепе за методом Ноівіегв та ін. (1978р.). Придатність одержаного клону контролюють шляхом ферментативного перетравлення введеної плазмідної ДНК.

В. Конструкція бінарної плазміди рРВІОСА1, що містить РБІ І-І С

Шлункову ліпазу кроля синтезують у вигляді попередника, що включає сигнальний пептид з 22 амінокислот, який розташований на МН 2-кінці та передує поліпептидній послідовності зрілої ліпази; клон ру0О101, що містить повну КДНК, кодуючу шлункову ліпазу кроля, описаний у європейський заявці на патент Мо92403055.4, поданій 12.11.92 дослідницьким інститутом "Іпвійці де Кеспегспйе уоцмеїпа!" та яка називається "Нуклеїнові кислоти, що кодують шлункову ліпазу кроля та поліпептидні похідні, їх застосування для продукування цих поліпептидів та фармацевтичні композиції на їх основі". Ге

Вистроювання поліпептидних послідовностей шлункової ліпази собаки та попередника шлункової ліпази о кроля показує, що послідовність РОК присутня в обох протеїнах. У поліпептидній послідовності ліпази кроля, що винайдена у природному очищеному протеїні |Могеаи та ін., 1988р.), перші три залишки ГІ, Е, о відсутні та входять у склад сигнального пептиду з 22 амінокислотами шлункової ліпази кроля (101). Тому сигнальний пептид шлункової ліпази кроля, позбавлений вказаних трьох загальних амінокислот, злився зі зрілою - протеїновою послідовністю шлункової ліпази собаки. Її поліпептидна послідовність складається з 19 наступних амінокислот: МУУМІ ЕММААГІ ЗАГ ОТТНО. ї-о

Плазміду рВІОС22, отже, перетравлюють повністю за допомогою ВаїЇ! та, частково, за допомогою Ніпайш з сем метою видалення послідовності, що кодує поліпептид І еш-РПе-С1у-І уз (4 перші амінокислоти) протеїну зрілої шлункової ліпази собаки. Цю послідовність замінюють такою, що кодує сигнальний пептид РБЗІ С! шлункової о ліпази кроля з 19 амінокислот (АТО ТО СТО СТТ ТТ АТО СТО ОСА ОСТ ТО СТА СТ ОСАСТТ ОСА АСТ р

АСА САТ ОСТ), піддають злиттю з послідовністю з 4 перших кодонів протеїну зрілої шлункової ліпази собаки (РБЗІ ОЇ -4 перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки"). Послідовність "Р5І І -4 перших кодонів зрілої шлункової ліпази собаки" ампліфікують за допомогою ПЦР, виходячи з плазміди руУ0О101, за допомогою « наступних двох олігодезоксинуклеотидів: 5 аддада(сісаасадїс ТО СТО СТІ ТІТСАТО ОТО 315 о АТО АдО 70 СТТ ТСС АДА САД АСС АТО ТОТ АСТ ТОСС дААС ТО 3, слідуючи протоколу ампліфікації ПЦР, який описаний - с вище, у розділі 1. Після подвійного ферментативного перетравлення за допомогою ВоаїЇйІ І Ніпаїї, фрагменти а ДНК, одержані після ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують електрофорезом на 295-ому гелі агарози, "» електроелююють |Затргсоок та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рн-4,8 та 2,5об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 1200049 протягом ЗО хвилин, промивають 70906-им етанолом, сушать, потім легують з плазмідною ДНК, що входить до -і складу рРВІОС22, подвійно перетравлюють за допомогою ВОаїЇ! ї Ніпап, очищують електрофорезом на 0,895-ому сю гелі агарози, електроелююють |ЗатбргооК та ін., 1989р.), осаджують спиртом, сушать і дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Воейгіпдег Маппіеїт) відповідно до рекомендацій виробника. іме) Легують зі 1О0Онг описаного вище дефосфорильованого вектора та 5Онг описаних вище перетравлених

Фу 50 фрагментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР, у 7Омкл реакційного середовища у присутності їмкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегзпат) та 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза що (Атегепат) при 142С протягом 16 годин. Бактерії ЕзсПегіспіа соїї ОН5о, яким попередньо надана компетентність, трансформують ІНапапап, 1983р.Ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису ІВігпроіїт і Ооіу, 1979рі та аналізують 22 шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Плазмідну ДНК деяких утриманих о клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7 тм, що випускається у продаж фірмою РНаптасіа, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів |(Запдег та ін., 1977р.). о Послідовності РБІ СІ. та зрілої шлункової ліпази собаки клонують, зберігаючи відкритими їх рамки зчитування (тобто таким чином, що вони утворюють одну відкриту рамку зчитування). Розщеплюваною послідовністю, 60 розташованою між двома послідовностями РБІ СІ і зрілою С, є СІу-еи. Одержану в результаті плазміду позначають як рВІОС40. Фрагмент ВаПІ-Хваї, що несе послідовність РБІ СІ -І| С виділяють з рРВІОС40 подвійним ферментативним перетравленням за допомогою Ва та Хбаї, очищенням шляхом електрофорезу на 0,896-ому гелі агарози, електроелюацією |Затьгоок та ін., 1989р.), осадженням спиртом, висушуванням. Після цього цей фрагмент ДНК оброблюють ферментом Кленова відповідно до рекомендацій виробника і легують з плазмідною бо ДНК рВІОС21, перетравлюють у сайті Ніпаїїї, оброблюють ферментом Кленова та дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепгіпдег Маппеїт) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з

2Онг описаного вище дефосфорильованого вектора та 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять

РБЗІСІ-/ОС, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат), 2мкл 5095-го поліетиленгліколя 8000 та 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегтзпат) при 1422 протягом 16 годин. Бактерії ЕзсПегіспіа сої ОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують ІНапанап, 1983р.Ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису |Вігпроїт і ЮОоіу, 1979р. та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВІОС41. Нуклеотидну послідовність фрагментів, що кодує рекомбінантний протеїн РБІ СІ -|(зС, аналізують шляхом секвенування за 70 допомогою набору для секвенування Т7 тм, що випускається у продаж фірмою РІагтасіа, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів (Западег та ін., 1977р.). Плазмідну ДНК бінарного вектора рВІОСА1 вводять шляхом прямої трансформації у штам І ВА4404 Адгобасіегішт (шптегасіепе за методом Ноівіегз та ін. (1978р.).

Придатність одержаного клону контролюють шляхом ферментативного перетравлення введеної плазмідної ДНК.

І-Б. Конструкція химерних генів, що кодують рекомбінантну шлункову ліпазу собаки та забезпечують 75 експресію у томаті.

Використані конструкції є такими ж, що і конструкції, вказані для генетичної трансформації тютюну, а саме плазміди рРВІОС25, рРВІОС26 та рВІОСА1.

І. Конструкція химерних генів, що кодують рекомбінантний протеїн шлункової ліпази собаки та забезпечують експресію у насінні рапсу а) Конструкція бінарної плазміди рРВІОС28, що містить промотор РСКИ.

Експресія шлункової ліпази собаки (І С) у насінні рапсу викликає необхідність вставки кКДНК, що кодує І ОС, між наступними регулюючими послідовностями: 1. промотор рРСКИ, що відповідає некодуючій ділянці 5 гену запасного протеїну насіння, круциферин А редьки ІОерідпу- Тіз та ін., 1992р.) та сприяє специфічній експресії у насінні; Ге 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор роїуА 355, що відповідає некодуючій ділянці 3 о послідовності вірусу з дволанцюговою циклічною ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскриптор 535

І(Егапск та ін., 1980р.|.

Для одержання подібної рВІОС21 бінарної плазміди, у якої, однак, промотор разо5 замінений на промотор рСКИ, фрагмент "ЕсокКІ, оброблений ферментом Кленова та ВатНі", що містить промотор РСКИ, виділяють з ї- плазміди рВІ221-СКОК5Р, що походить від рВІ221 (випускається у продаж фірмою "СіІопіесп") шляхом заміни промотору 535 промотором РСКИ. ї-о

Фрагмент "ЕсокКіІ, оброблений ферментом Кленова та ВатНі", що містить промотор РСКО, очищують шляхом.й «СМ електрофорезу на 0,895-ому гелі агарози, електроелююють ІЗатьгоок та ін., 1989р.), осаджують спиртом, сушать та легують з плазмідною ДНК рЛтТ163 (описано у розділі 1), перетравлюють за допомогою Крпі, оброблюють за о допомогою 14 ДНК полімерази (Мем Епдіапа Віоїар5) відповідно до рекомендацій виробника, потім ч- перетравлюють за допомогою Ватні, очищують шляхом електрофорезу на 0,895-ому гелі агарози, електроелююють ІЗатрбгооК та ін., 1989р.), осаджують спиртом, сушать та дефосфорилюють за допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Воейгіпдег Мапппеїт) відповідно до рекомендацій виробника. «

Легують з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 200нг описаних вище фрагментів ДНК "Есокі, 70 оброблений ферментом Кленова та Ватні" у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного - с розчина Т4 ДНК лігази х 10 (Атегенат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколю 8000 та Бод. ферменту Т4 ДНК а лігаза (Атегепат) при 1492 протягом 16 годин. Бактерії ЕвсПпегіспіа сої ОН5 о, яким попередньо надана є» компетентність, трансформують |Напапйап, 1983р.ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису ІВігпроіїт і Юоїу, 1979р.) та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду -і позначають як рВІОС27. сю Касету експресії, що складається з промотору рРСКО та термінатору роїуА 535, виділяють з плазміди рРВІОС27, шляхом перетравлення повністю за допомогою Хпої, з наступним частковим перетравленням Есокі. Її іме) очищують електрофорезом на 0,896-ому гелі агарози, електроелююють |ЗзатрбгоокК та ін., 1989р.), осаджують

Фу 50 спиртом, сушать, оброблюють ферментом Кленова (Мем Епдіапа Віоіарв) відповідно до рекомендацій виробника та легують з плазмідною ДНК рВІОС24 у сайті ЕсокіІ, обробленому ферментом Кленова, та дефосфорилюють за що допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепгіпдег МаппПеїт) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора та 200нг описаних вище фрагментів

ДНК ХпоІ-ЕсокІ! у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегзпат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколю 8000 та 5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (АтетгеНнат) при 1420

Ге! протягом 16 годин. Бактерії ЕвзсПпегіспіа сої ОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують

ІНагапап, 1983р.Ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл о тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису (|Віпбоіїт і Ооіу, 1979р.| та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції Одержану плазміду позначають як 60 рВІОС28. б) Конструкція бінарної плазміди рРВІОС29, що містить РРЗ- ОС Виділення фрагменту ВаїпІ-Хваї, що містить послідовність РРБ-І ОС, з рРВІОС24 було вже описано у розділі І-А-б6. Цей фрагмент легують з плазмідною ДНК рВІОС28 у сайті ЕсоКІ, обробленому ферментом Кленова, і дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Военгіпдег МаппПеїт) відповідно до рекомендацій виробника. Легують з 20нг описаного вище бо дефосфорильованого вектора та 2О0Онг описаних вище фрагментів ДНК ВоїШ-ХпоЇ, у 2Омкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігази х 10 (Атегепат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколю 8000 та бод. ферменту 714 ДНК лігаза (Атегепат) при 1492 протягом 16 годин. Бактерії

Езспегіспіа сої ОН5бо, яким попередньо надана компетентність, трансформують |Напапап, 1983р.|. Плазмідну

ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису ІВігпроїт і Ооїу, 1979р.| та аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВІОС29. Нуклеотидну послідовність рекомбінантного протеїну РРБ-Ї С, аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7 тпм, що випускається у продаж фірмою РІагтасіа, по методу з використанням дидезоксинуклеотидів ІЗаподег та ін., 1977р.1. Плазмідну ДНК бінарного вектора рВІОС29 вводять прямою трансформацією у штам ІВА4404 70 Адгорасіегіцшт ішптеїасіепе за методом Ноівіегз та ін. (1978р.). Придатність одержаного клону контролюють шляхом ферментативного перетравлення введеної плазмідної ДНК. в) Конструкція бінарних плазмід рРВІОСОО та рВІОСО1, що містить промотор рОЕАЇ!Ю.

Для експресії у насінні рапсу тваринного гену, що кодує шлункову ліпазу собаки, необхідні наступні регулюючі послідовності: 1. Промотор роЕАТ, що відповідає некодуючій ділянці 5' гену запасного протеїну насіння, ЗЕА1 Агабрідорзіз

Інаійапа (Сацбіег та ін., 1993р.| та забезпечує специфічну експресію у насінні; 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор роїуА 355, що відповідає некодуючій ділянці 3 послідовності вірусу з дволанцюговою циклічною ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскрипт 535

І(Егапск та ін., 1980р.|.

Для одержання подібної рРВІОС21 бінарної плазміди рВІОСОО, у якої, однак, промотор разоз5, замінений на промотор Рдеа10, фрагмент Ніпап-Ватні, що оброблений по Кленову і містить промотор рОЕАТ, виділяють з плазміди реИ52-рОЕАТ. Клон реИВ-2-рРСЕАТ, що походить від рВІ221 в результаті заміни промотору рз55 промотором роОБЕАТ, містить у рамці зчитування 2 АТО: АТО гену СЕА1 (Етг) і АТО гену див. АТО гену СЕА1 видаляють. Фрагмент ДНК, що знаходиться між сайтом ЗаїЇ та послідовностями вище АТО гену СЕАТ клону Ге роеИБЗ-2-рЕАтТ, ампфліфікують за способом ПЦР за о допомогою двох оолігонуклеотидів: 5 о

САААСОСТОТАСААТАСССС 3 і 5 СССОБООАТССТТТТТТО 3. Підбирають температуру гібридизації.

Ампліфікований шляхом ПЦР фрагмент перетравлюють за допомогою Ба! і ВатНі, очищують шляхом електрофорезу на 296-ому гелі агарози, електроелююють |Ззатьгоок та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з Рн-4,8 та 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -809С протягом 30 хвилин, ї- центрифугують при прискоренні 120009 протягом ЗО хвилин, промивають 70906-им етанолом, сушать, потім со легують з плазмідною ДНК, що входить до складу різу5-2-рОЕАТ, подвійно перетравлюють за допомогою заї! та

Ватні, очищують шляхом електрофорезу на 0,895-ому гелі агарози, електроелююють |Затьгоок та ін., 1989р.|, с осаджують спиртом і сушать. Легують зі 10Онг вектору та 5Онг описаних вище перетравлених фрагментів ДНК, с що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР, у 10мкл реакційного середовища у присутності тїмкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегзпат) та 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атетгепат) при 14922 протягом 16 - годин. Бактерії Евзспегіспіа сої ОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують (|ІНапанап, 1983р.Її. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують методом лужного лізису |Вігпроїт і ЮОоіу, 1979р. та аналізують шляхом ферментативного « перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування, що випускається у продаж фірмою РНагтасіа, по методу з в) с використанням дидезоксинуклеотидів |Запдег та ін., 1977р.). Одержаний клон позначають як раИв-2-Рдеа10. "» Фрагмент Ніпапй-ВатнНі, який містить промотор рОЕАТО, виділений з раИВ-2-рсЕАТО і оброблений " ферментом Кленова відповідно до рекомендацій виробника (Віоіїарв), очищують шляхом електрофорезу на

О,896-ому гелі агарози, електроелююють ІЗатьгоокК та ін., 1989р.), осаджують спиртом, сушать та легують з плазмідною ДНК рВІОС21 у сайтах Крпі і Ніпап, оброблених ферментом Т4 ДНК полімераза (Віоіарв) відповідно - до рекомендацій виробника. Легують з 20нг дефосфорильованого рВІОС21 та 200нг описаних вище фрагментів со ДНК Хпо!1!-ЕсокіІІ, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколю 8000 та бод. ферменту Т4 ДНК лігаза (АтегеНнат) при 1420 о протягом 16 годин. Бактерії ЕвзсПпегіспіа сої ОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують

Ге»! 20 ІНапапап, 1983р.|. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують методом лужного лізису (|Вігабоїт і ЮОоіу, 1979р.| та аналізують шляхом тм ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВІОСОО.

Для одержання бінарної плазміди рВІОСО91, касету експресії "исЕАІ0-МО5", виділену з рВ5І-Рдеа10, 22 вводять у бінарну плазміду реСМ1.2, яку, в свою чергу, одержують шляхом клонування фрагменту Ніпаїй, що

ГФ) містить касету експресії "р355-пріП-4МО 5", описану Бготт та ін. (1986бр.), у сайті Ніпа!й расСМ1, створеному

Едуагаз О.А. у 1990р., при використанні звичайних способів клонування. о Плазміду рВ51ІІ-рРсЕАТО одержують у два етапи: - по-перше, фрагмент Засі-ЕсоКІ, що несе ІМО5 (термінатор гену нопалінсинтази), бактерії Адгорасіегіт 60 Іштегасіепз, оброблений фрагментом Т4 ДНК полімераза (Віоіїарв) відповідно до рекомендацій виробника та очищений, клонують у сайті ЕсоМ рВ5їІзЗКа (випускається у продаж фірмою Зігаїадепе), дефосфорилюють ферментом лужна фосфатаза кишечнику теляти (Воепгіпдег Маппіеїт) відповідно до рекомендацій виробника

Легують з 20нг дефосфорильованого вектора і 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що містять (МО5, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат), 2мкл 50905-го бо розчину поліетиленгліколю 8000 і Бод. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегепат), при 1492С протягом 16 годин

Бактерії, Езспегіспіа сої ОНбо, яким попередньо надають компетентність, трансформують ІНапапап, 1983р.|.

Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5О0мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису ІВігпроїт і ЮОоіу, 1979р.| і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування, що випускається у продаж фірмою РІагтасіа, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів ІЗапдег та ін., 1977р.ІЇ. Одержану плазміду позначають як рВ5ПІ-4-МО5, - по-друге, фрагмент, що несе рОЕАТ0О, двічі перетравлений за допомогою Ніпаїїї, оброблений ферментом

Кленова і Ватні та очищений, клонують в сайтах "ХраЇ, оброблений ферментом Кленова і ВатНі" плазміди 70. РВЗЇЇ-Тпов. Легують зі 10Онг вектора і 5Онг описаних вище фрагментів ДНК у 1Омкл реакційного середовища у присутності тїмкл буферного розчину ТА ДНК лігаза х 10 (Атегепат) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегепат) при 1492С протягом 16 годин. Бактерії, ЕвсПпегіспіа сої ОН5 о, яким попередньо надана компетентність, трансформують |Напапап, 1983р.Ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису ІВігпроїт і Юоїу, 1979р.| і аналізують 75 шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції Одержану плазміду позначають як рРВОЗІІ-рОЕгАТО.

Потім, касету експресії "ярзЕА10-МО5", яка містить фрагмент Хбваї!-Ніпа!, оброблений ферментом Кленова, клонують в сайті Зта! раСМ1.2, дефосфорильованому ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Военгіпдег Мапппеїт) відповідно до рекомендацій виробника Легують з 20нг дефосфорильованого вектора рЗСМ1.2 і 200нг фрагментів, що несуть касету експресії "рРсЕА10-МЧО5", у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколя 8000 і Бод. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегепат) при 1423 протягом 16 годин. Бактерії ЕзспПегіспіа соїї ОН5о, яким попередньо надана компетентність, трансформують (|Напайап, 1983р.|. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису Ге |Вітроіїт і Ооїу, 1979р.4 і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів о рестрикції. Одержану плазміду позначають як рРВІОСО1. г) Конструкція бінарної плазміди рРВІОСО92, що містить промотор рРОЕАбО.

Для експресії у насінні рапсу тваринного гена, що кодує шлункову ліпазу собаки, необхідні наступні регулюючі послідовності: ї- 1. Промотор рОЕАб, що відповідає некодуючій ділянці 5' гену запасного протеїну насіння, ЗЕАб Агабрідорзіз

Інаійапа (Сацбіег та ін., 1993р.| і забезпечує специфічну експресію в насінні; ї-о 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор роїуА 355, що відповідає некодуючій ділянці 3 Ге послідовності вірусу з дволанцюговою циклічною ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскрипт 535

І(Егапск та ін., 1980р.|. о

Для одержання подібної рРВІОС21 бінарної плазміди рВІОС9О2, в якій, однак, промотор разбо5 замінений на ч- промотор рОЕАбО, фрагмент ЕсоКкІ-ВатнНі, оброблений ферментом Кленова, що містить промотор рОЕАб, виділяють з плазміди р 52-рОЕАб. Клон реОВ-2-рРОЕАб, що походить від рИОсСт8, містить у рамці зчитування 2

АТО: АТО гену СЕАб (Етб) і АТО гену диз. АТО гену СЕАбЄ руйнують. Фрагмент ДНК, що знаходиться між сайтом «

Ассі і послідовностями вище АТО гену СЕАб клону реИ5-2-рРОЕАб, ампліфікують за допомогою ПЦР за допомогою двох олігонуклеотидів: 5 ААСТАСООССАСТАССАСО 3 і 5 СССОООбАТССТООСТС 3. - с Температуру гібридизації підбирають. а Амплифікований за допомогою ПЦР фрагмент перетравлюють за допомогою Ассі і Ватні, очищують шляхом "» електрофорезу на 2-95 гелі агарози, електроелююють |ЗзатргоокК та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рН-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 120009 протягом ЗО хвилин, промивають 7095-м етанолом, висушують, потім - і легують з плазмідною ДНК, що входить до складу різИ5-2-СЕАб, подвійно перетравленої за допомогою Ассі і сю Ватні, очищують шляхом електрофорезу на 0,8-95 гелі агарози, електроелююють |ЗатбргооК та ін., 1989р.|, осаджують спиртом і висушують. Легують зі 1О0Онг описаного вище вектора і 5ХОнг описаних вище перетравлених іме) ферментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР, у 1Омкл реакційного середовища у присутності

Фу 50 мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегепат) при 142 протягом 16 годин. Бактерії, ЕвзсПпегіспіа сої ОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують "м ІНапапап, 1983р.Ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису |Вігппбоїт і Ооу, 1979рі і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують 22 шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування, що випускається у продаж фірмою РНагтасіа, за

ГФ! методом з використанням дидезоксинуклеотидів |Запдег та ін., 1977р.і. Одержаний клон позначають як роиБ-2-рОЕАВО. о Фрагмент ЕсокКіІ-Ватні, що містить промотор рРОЕАбОЮ, виділений з реИз-2-рОЕАбО і оброблений ферментом

Кленова відповідно до рекомендацій виробника (Віоїарв), очищують шляхом електрофорезу на 0,895-му гелі 60 агарози, електроелююють |Затьгоок та ін., 1989р.), осаджують спиртом, висушують і легують з сайтом ХнНоЇ, обробленим ферментом Кленова, плазмідною ДНК модифікованої рРВІОС21. Модифіковану плазміду рРВІОС21 одержують подвійним перетравленням за допомогою НіпаїІї, обробленого ферментом Кленова і Крп! рВІОС21 для видалення фрагмента, що несе промотор раз55, з заміною його фрагментом Крпі-ЕсокМУМ, що несе полілінкер, утворений сайтами Крпі-Хпо!І-За1ІІ-СІаІ-Ніпанп-ВатнНіІ-Зта!-ЕсоКІ-ЕсоКкУ, що відносяться до рвВаІзК ак. бо Легують з 2Онг модифікованої дефосфорильованої рВІОС21 і 20О0нг описаних вище фрагментів ДНК

ЕсокІ-ВатНі у 20мкл реакційного середовища в присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10

(Атегепат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколя 8000 і Бод. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегзпат), при 1420 протягом 16 годин. Попередньо підготовлені бактерії, Евспегіспіа сої ОН5 о, яким попередньо надають компетентність, трансформують |Напапйап, 1983р.ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують за методом лужного лізису ІВігпроїт і Ооїу, 1979р. і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рРВІОС92. д) Конструкція бінарних плазмід РВІОСОЗ, рРВІОСО4, рВІООБ, рВІОСОб і рВІОСО7, що містять РБЗІ І-І С.

Плазміда рВІОС40 описана вище. Ця плазміда містить фрагмент Вайї-ХраІ, що несе послідовність 70 РБІОІ-І б.

Цей фрагмент виділяють подвійним ферментативним перетравленням за допомогою ВаїЇ! та Хвраї, очищують шляхом електрофорезу на 0,895-му гелі агарози, електроелююють, осаджують спиртом, висушують, обробляють ферментом Кленова і легують з рВІОС28 (описана вище), перетравленою за допомогою ЕсокіІ, обробленою ферментом Кленова і дефосфорильованою; з рВІОСОО, перетравленою за допомогою ЕсокКіІ, обробленою 75 ферментом Кленова і дефосфорильованою; з рВвІОСО1Ї, оперетравленою за допомогою Зта!ї і дефосфорильованою; з рВІОСО2, перетравленою за допомогою Ніпаїїї, обробленою ферментом Кленова і дефосфорильованою, з метою одержання, відповідно рВІОСОЗ, рВІОС94, рВІОСО5 і рВІОСОб.

Плазміду рРВІОС97 одержують в результаті клонування фрагмента Крпі-ЕсокМ, що несе касету експресії "РОЕАбО-РБІ І -і 50-1555"7, обробляють ферментом Т4 ДНК полімераза, очищують шляхом електрофорезу на 0,890-му гелі агарози, електроелююють, осаджують спиртом, висушують і легують з р3СМ1.2, перетравленою за допомогою Зтаї і дефосфорильованою. Касету експресії "рсСЕАбО-РБІ І-І 50-ї3557 одержують з рВІОС92.

ІП. Конструкція химерних генів, що кодують рекомбшантний протеїн шлункової ліпази людини і забезпечують конститутивну експресію, наприклад, у листі та насінні тютюну а) Конструкція бінарної плазміди рРВІОС82, що містить химерний промотор СУПЕРПРОМОТОР рор. Га

Для експресії гену, що кодує шлункову ліпазу людини (ЗН), у тютюновому листі необхідні наступні регулюючі послідовності: і) 1. Химерний промотор (надпромотор; рОР; заявка РЗТ/О594/12946). Його утворює потрійний повтор транскрипційного активуючого елементу промотору гену октопінсинтази Адгорасіегішт (Шптегїасіепв, транскрипційного активуючого елементу промотору гену маннопінсинтази та промотору маннопінсинтази бактерії Адгобасіегішт (Шптегасіепв; 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор роїуА 355, що відповідає некодуючій ділянці 3 іш послідовності вірусу з дволанцюговою циклічною ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскрипт 535 ДЖ «СМ

І(Егапск та ін., 1980р.|.

Для одержання подібної рРВІОС21 бінарної плазміди рВІОС92, у випадку якої, однак, промотор разьз о замінений на промотор роР, фрагмент руші-заїІ! підданий впливу ферменту Кленова, що містить промотор рОР, виділяють з плазміди рВІЗМІ, (заявка РЗТ/ОБО4/12946), очищують шляхом електрофорезу на 1905-му гелі агарози, електроелююють |Затьгоок та ін., 1989р.), осаджують спиртом, висушують і легують з плазмідною ДНК рРВІОС81, підданою подвійному перетравленню за допомогою Крпі та ЕсоКІ, впливу Т4 ДНК полімерази і « дефосфорильованою ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Воейгіпдег Мапппеїт) відповідно до рекомендацій виробника. Плазміда рРВІОС81 відповідає рРВІОС21, сайт якої Хра! видалений. Для досягнення - с цього плазміду рРВІОС21 перетравлюють за допомогою Хваї, потім піддають впливу ферменту Кленова і легують ц з ТА ДНК лігазою. "» Легують з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора і 200нг описаних вище фрагментів ДНК, що несуть ро5Р, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат), 2мкл 5096-го розчину поліетиленгліколя 8000 і Бод. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегзпат), при 142С -і протягом 16 годин. Бактерії, ЕзсПегіспіа сої ОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують сю ІНапапап, 1983р.Ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують за методом лужного лізису (Вігпрбоїт і ЮОоіу, 197О9рі| і аналізують шляхом іме) ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержану плазміду позначають як рВІОС82.

Шлункову ліпазу людини (ІОН) легко синтезують у вигляді попередника, описаного в публікації Водтег та "і ін., 1987р. Зрілий протеїн шлункової ліпази людини складається з 379 амінокислот. Його сигнальний пептид (РБЗІ СН) містить 19 амінокислот Сайтом розщеплення між РЗІ СНІ ОН є С1Уу-І еи.

Послідовність, що кодує попередника шлункової ліпази людини, використовують для конструкції бінарних плазмід рРВІОС85, що містить РБІ ОН-І ОН, рВІОС87, що містить РБІ РН-І ОН і рВІОС89, що містить РБІ І-І ОН, о де послідовність, що кодує шлункову ліпазу людини, передує послідовностям, що кодують, відповідно, його природний сигнальний пептид РБІ ОН, сигнальний пептид панкреатичної ліпази людини ІРЗІ РН, СійШег та ін, їмо) 1992р.| і сигнальний пептид шлункової ліпази кроля ІРБІ СОЇ, вище вже описано, європейський патент

Мо92.403055.41). 6о0 Послідовність, що кодує попередника шлункової ліпази людини, виділяють подвійним перетравленням за допомогою Рзії і Огаі, осчищують шляхом електрофорезу на 0,890-му гелі агарози, електроелююють ІЗатрьгоокК та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рН-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 120009 протягом ЗО хвилин, промивають 7090-м етанолом і сушать. Потім її клонують у сайтах Рваї! і Зре! (піддають впливу ферменту Т4 ДНК полімераза 65 (Віоїарз) відповідно до рекомендацій виробника) плазміди рВ5ИЗКя., що випускається у продаж фірмою

Зігаїадепе. Легують зі 1ООнг вектора і 5бОнг описаних вище фрагментів ДНК, що несе послідовність, кодуючу попередника шлункової ліпази людини, в 1Омкл реакційного середовища у присутності їмкл буферного розчину

Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат) і 2,5од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегепат) при 149 протягом 16 годин

Бактерії, ЕвсПпегіспіа сої ОН5бо, яким попередньо надана компетентність, трансформують |Напапап, 1983р.. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису ІВігпроїт і ЮОоіу, 1979р.| і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції Одержану плазміду позначають як рВІОС83.

Послідовність, що кодує зрілу ліпазу людини, модифікують введенням сайту Ватні, до цього відсутнього, у дев'ятий і десятий кодони шляхом спрямованого за допомогою ПЦР мутагенезу, використовуючи 2 70 олігодезоксинуклеотиду: 5 ааасідсаддсісдад ТТО ТТТ ОА ААА ТТА САТ ССТ ОБА ТСС ССТ БАА СТО АСТ

АТО 3 (що містить єдині сайти Рв, Хпої! і ВатНі) і 5 ААТ ОСТ Ост ОСС СТО ОА АТО ОСС ААС АТА ОТО

ТАС Сто С 3 (що містить один сайт Мзвсї у плаз міді рРВІОС83).

ПЦР-ампліфікацію фрагменту Рзй-МесіІ здійснюють у 1О0Омкл реакційного середовища, що містить 1Омкл буферного розчину Тад ДНК полімерази х 10 (500мМ Трис-НСЇІ, рН-9,0, і 195 Тритона х 100), бмкл 25мМ Масі», 75 Змкл 10мм амтк (адтк, астрР, астр, аттР), 10Онм кожного з двох описаних вище олігодезоксинуклеотидів, онг матричної ДНК (вектор рВІОС83), 2,5од. Тад ДНК полімерази (Рготеда) і 2 краплі вазелінового масла. ДНК денатурують при 942С протягом 5хв., піддають ЗО циклам, кожний з яких містить: 1 хвилина денатурації при 942; 1 хвилина гібридизації при 659 і 1 хвилина елонгації при 722С, потім елонгацію при 7222 проводять протягом 5 хвилин. Цю полімеразно-ланцюгову реакцію здійснюють в апараті "ОМА ТНпегта! Сусіег" фірми

РЕККІМ ЕГМЕК СЕТО5. Масло видаляють екстракцією за допомогою хлороформу. Потім, фрагменти ДНК осаджують з реакційного середовища у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рН-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -809С протягом ЗО хвилин, центрифугують при прискоренні 120009 протягом 30 хвилин, промивають 7095-м етанолом, сушать і перетравлюють за допомогою двох фрагментів рестрикції Ра і

Мессі. Перетравлені фрагменти ДНК, одержані після ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують шляхом с електрофорезу на 290-му гелі агарози, електгроелююють ІЗатьгоок та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 о об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рН-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 120009 протягом ЗО хвилин, промивають 7090-м етанолом, сушать і легують з плазмідною ДНК плазміди рВІОС83, підданої подвійному перетравленню за допомогою РзіїЇ і МвсіІ, очищенню шляхом електрофорезу на 0,896-му гелі агарози, електроелюації, осадженню спиртом та висушуванню. Легують в. зі 10О0нг вектора і БОнг описаних вище перетравлених фрагментів ДНК, що походять від ампліфікації за со допомогою ПЦР, в 1Омкл реакційного середовища в присутності їмкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат) і 2,50од. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегепат) при 1492 протягом 16 годин. Бактерії, Евзспегіспіа с сої ОНбо, яким попередньо надають компетентність, трансформують |(Напапап, 1983р.)Ї. Плазмідну. ДНК с одержаних клонів, які селекціоновані у середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом 3о лужного лізису ІВігпроіїт і Юоїу, 1979р.| і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою в ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування, що випускається у продаж фірмою РНагтасіа, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів

ІЗаподег та ін., 1977р.). Введення сайту рестрикції Ватні не змінює зміни генетичного коду шлункової ліпази « людини. Насправді, природна послідовність шлункової ліпази людини СОСА АОС (Сіу-5ег) перетворюється на З ссдтсс (СІу-5ег). Одержану плазміду позначають як рРВІОС84. с б) Конструкція бінарної плазміди рРВІОС85, що містить РЗІ СН- ОН

Із» Фрагмент Рзаї-Храї, що несе послідовність РБІ ОН-ІЇ ЗН, виділяють шляхом подвійного ферментативного перетравлення за допомогою Рвзій-Хра! з рВІОС83, очищують електрофорезом на 0,890о-му гелі агарози, електроелююють |ЗатбргоокК та ін., 1989р.), осаджують спиртом і сушать. Потім зазначений фрагмент ДНК обробляють ферментом 74 ДНК полімераза (Віоїарз) відповідно до рекомендацій виробника і легують з і плазмідною ДНК плазміди рВІОС82, перетравленої у сайті Хбраї, обробленої ферментом Кленова (Віоїарв) і оз дефосфорильованої за допомогою ферменту лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепгіпдег Мапппеїт) відповідно до рекомендацій виробника. о Легування здійснюють з 2Онг описаного вище дефосфорильованого вектора і 20Онг описаних вище

Ге»! 20 фрагментів ДНК, що містять РБІСН-! ОН, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегзпат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколю 8000 і бод. ферменту ТА ДНК тм лігаза (Атегепат) при 1492 протягом 16 годин. Бактерії, Езспегіспіа сої ОН5 о, яким попередньо надають компетентність, трансформують ІНапапап, 1983р.). Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують за методом лужного лізису |Вігпроїт і Юоіу, 1979р. 59 | аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Одержаний клон

ГФ) позначають як рВІОС52. Нуклеотидну послідовність фрагменту, що кодує рекомбінантний протеїн РБОІ ОН-| СН, юю аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7 тм, що випускається у продаж фірмою РІагтасіа, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів ІЗапдег та ін., 1977р.)Ї. Послідовністю розщеплення між послідовностями РБІ ОН і зрілою І ОН є С1у-І ен. Плазмідну ДНК бінарного вектора рВІОС85 60 вводять прямою трансформацією в штам І ВА4404 бактерії Адгобасіегіцт (Штегасіепз за методом Ногівіегз та ін. (1978р.). Придатність утриманого клону контролюють ферментативним перетравленням введеної плазмідної

ДНК. в) Конструкція бінарної плазміди рВІОС86, що містить РБІ СН-І ОН.

Плазміду рВІОС84 піддають подвійному перетравленню за допомогою Рв і ВатНіІ з метою видалення бо послідовності, що кодує сигнальний пептид РБІСН і 8 перших амінокислот зрілого протеїну ОН

(Геш-РНе-СІу-І ув-І ен-Нів-Рго-СІу) Цю послідовність заміняють такою, що кодує сигнальний пептид РБІ ОН з 16 амінокислот (АТО СТО ССА СТТ ТО АСТ СТТ ТСА СТО СТО СТО БА ОСА СТА ОСА ОбА) і здійснюють злиття з послідовністю, що кодує 8 перших кодонів зрілого протеїну ОН ("РБІ РН-8 перших кодонів зрілої шлункової ліпази людини"). Послідовність "РБІРН-8 перших кодонів зрілої шлункової ліпази людини" ампліфікують за допомогою ПЦР, виходячи з матриці 5 ааасідсаддсісдадаасааТОо СТО ССА СТІ ТО АСТ СТТ

ТСА СТО СТО СТО БА ОСА СТА ОСА ОСОБА ТТО ТТ ОбБА ААА ТТА САТ ССТ ОБА сс ССТ о 3 за допомогою двох олігодезоксинуклеотидів: 5 авасідсаддсісдадаасайтої ССЗ 15 С АСо дда ТСС АОО АТО ТАА ТТ ТСС 3, слідуючи протоколу ампліфікації за допомогою ПЦР, як описано вище (див. вище розділ І). Температуру 7/0 Пібридизації підбирають.

Після подвійного ферментативного перетравлення за допомогою РзіїЇ і Ватні, фрагменти ДНК, одержані шляхом ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують шляхом електрофорезу на 290-ому гелі агарози, електроелююють |Затргсоок та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рн-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -802С протягом 30 хвилин, центрифугують при прискоренні 1200049 75 протягом ЗО хвилин, промивають 7095-м етанолом, сушать і легують з плазмідною ДНК плазміди рВІОС84, подвійно перетравленої за допомогою Рзії і Ватні, очищеної електрофорезом на 0,8905-му гелі агарози, підданої електроелюації І(ЗатьгоокК та ін., 1989р.), осадженої спиртом та висушеної. Легують зі 1ООнг вектора і 5Онг описаних вище, перетравлених фрагментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР, в 1ТОмкл реакційного середовища в присутності їмкл буферного розчину ТА ДНК лігаза х 10 (Атегзпат) і 2,5од. ферменту

Т4 ДНК лігаза (Атегепат) при 142С протягом 16 годин. Бактерії, ЕвсНегіспіа соїї ОН5бо, яких попередньо роблять компетентними, трансформують (|Напапйап, 1983р.. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису ІВігпроїт і Юоіу, 1979р.| і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7 тм, що випускається у Га продаж фірмою РНаптасіа за методом з використанням дидезоксинуклеотидів І(Запдег та ін., 1977р.. о

Послідовності РБІ СІ і зрілої шлункової ліпази людини клонують, зберігаючи відкритими їх рамки зчитування (тобто, таким чином, що вони утворюють одну відкриту рамку зчитування). Послідовністю розщеплення між послідовностями Р5І сі і зрілою І ОН є С1у-І ем Одержану в результаті плазміду позначають як рВвІОС86.

З плазміди рВІОС8б виділяють фрагмент Рвзїй-Храі, що несе послідовність РБЗІ РН-! СН, подвійним - ферментативним перетравленням за допомогою Рзі! і Хваї, очищують електрофорезом на 0,890-му гелі агарози, електроелююють |ЗатргооК та ін, 1989р.), осаджують спиртом і висушують. Потім цей фрагмент ДНК ї-о обробляють ферментом 74 ДНК полімераза (Віоїарз) відповідно до рекомендацій виробника і легують з Ге плазмідною ДНК плазміди рВІОС82, перетравленої у сайті Хбраї, обробленої ферментом Кленова (Віоїарв) і дефосфорильованої ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепгіпдег Мапппеїт) відповідно до о рекомендацій виробника. Легування здійснюють з 20нг описаного вище дефосфорильованого вектора і 20Онг ї- описаних вище фрагментів ДНК, що містять РБІ ЗН-ІЇ СН, у 20мкл реакційного середовища у присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколя 8000 і Бод. ферменту

ТА ДНК лігаза (Атегзпат) при 142С протягом 16 годин. Бактерії, ЕзсПегіспіа соїї ОН5о, яких попередньо роблять « компетентними, трансформують (|Напапйап, 1983р.. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують за методом лужного лізису |Вігпроїт і Ооіу, 1979р.| - с і аналізують ферментативним перетравленням під дією ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як и рВІОС87. Нуклеотидну послідовність фрагменту, що кодує рекомбінантний протеїн РБІ РН-І! ОН, аналізують ,» шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7 тм, що випускається у продаж фірмою

Ріпагтасіа, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів |Запдег та ін, 1977р.). Плазмідну ДНК бінарного вектора рРВІОС87 вводять прямою трансформацією в штам І ВА4404 бактерії Адгорасіегішт (Шптегїавіепз за - методом Ноівіегз та ін (1978р.). Придатність утриманого клону контролюють ферментативним перетравленням о введеної плазмідної ДНК. г) Конструкція бінарної плазміди рВІОС89, що містить РБЗІ І-І ЗН Плазміду рВІОС84 піддають подвійному ко перетравленню за допомогою Рзії і Ваті з метою видалення послідовності, що кодує сигнальний пептид РБЗІ ОН і б 20 8 перших амінокислот зрілого протеїну шлункової ліпази людини (І ецш-РПе-с1у-І ув-І ен-Нів-Рго-СІу). Цю послідовність заміняють послідовністю, що кодує сигнальний пептид РБІ ОЇ, що складається з 19 амінокислот "м (АТО То ОТО СТ ТТ АТО СТО ОСА ОСТ ТО СТА ТСТ ОСА СТТ ОбБА АСТ АСА САТ ОСТ), і піддають злиттю з послідовністю, що кодує 8 перших кодонів протеїну зрілої шлункової ліпази людини ("РБІ БІ -8 перших кодонів зрілої шлункової ліпази людини"). Послідовність "Р5І 1-8 перших кодонів зрілої шлункової ліпази 22 людини" ампліфікують шляхом ПЦР, виходячи з матриці 5' ааасідсаддсісдадаасадато То То СТ То АТО о СТО ОСА ОСТ ТО СТА ТСТ ОСА СТТ БА АСТ АСА САТ ОСТ ТО ТТ ОБА ААА ТТА САТ ССТ ОБбА сс ССТ о 3 за допомогою двох олігодезоксинуклеотидів: 5 ааасідсаддсісдадаасадато То Зі 5 С Ас дда ТСС АоО де АТО ТАА ТТ ТСС 3, слідуючи протоколу ампліфікації за допомогою ПЦР, як описано вище (див. вище, розділ І).

Підбирають температуру гібридизації. 60 Після подвійного ферментативного перетравлення за допомогою Рзії І Ватні, фрагменти ДНК, одержані після ампліфікації за допомогою ПЦР, очищують електрофорезом на 295-ому гелі агарози, електроелююють І(Затьгоок та ін., 1989р.), осаджують у присутності 1/10 об'єму ЗМ розчину ацетату натрію з рН-4,8 і 2,5 об'єму абсолютного етанолу при -809С протягом ЗО хвилин, центрифугують при прискоренні 120009 протягом 30 хвилин, промивають 70950-м етанолом, сушать і легують з плазмідною ДНК плазміди рВІОС84, подвійно бо перетравленої за допомогою Рв і Ватні, очищеної електрофорезом на 0,890-му гелі агарози, підданої електроелюації (ЗатбргооК та ін., 1989р.), осадженої спиртом і висушеної. Легують зі 1ООнг вектора і 5Онг описаних вище, перетравлених фрагментів ДНК, що походять від ампліфікації за допомогою ПЦР, у 1Омкл реакційного середовища в присутності їмкл буферного розчину ТА ДНК лігаза х 10 (Атегзпат) і 2,5од. ферменту

Т4 ДНК лігаза (Атегепат), при 1492 протягом 16 годин. Бактерії, ЕвзсПпегіспіа сої ОН5 о, яких попередньо роблять компетентними, трансформують |Напанап, 1983р.| Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5О0мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису |Вігпроїт і Юоіу, 1979р.1 і аналізують шляхом ферментативного перетравлення за допомогою ферментів рестрикції. Деякі з утриманих клонів аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7 лпм, що випускається у продаж фірмою РНагтасіа, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів І|Запдег та ін., 1977р.|. 70 Послідовності РБІ СІ і зрілої шлункової ліпази людини клонують, зберігаючи відкритими їх рамки зчитування (тобто таким чином, що вони утворюють одну відкриту рамку зчитування). Послідовністю розщеплення між послідовностями РОЗІ сі і зрілою І СН є С1у-І еи. Одержану в результаті плазміду позначають як рРВІОС88.

З плазміди рВІОС88 виділяють фрагмент Рвзії-ХраІ,) що несе послідовність РБЗІ С1-ІЇ ОН, подвійним ферментативним перетравленням за допомогою Рзгі! і Хваї, очищують електрофорезом на 0,890-му гелі агарози, 75 електроелююють |ЗатргооК та ін., 1989р.), осаджують спиртом і висушують. Потім цей фрагмент ДНК обробляють ферментом 74 ДНК полімераза (Віоїарз) відповідно до рекомендацій виробника і легують з плазмідною ДНК плазміди рВІОС82, перетравленої у сайті Хбраї, обробленої ферментом Кленова (Віоїарв) і дефосфорильованої ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепгіпдег Мапппеїт) відповідно до рекомендацій виробника.

Легування здійснюють з 2Онг описаного вище дефосфорильованого вектора і 20Онг описаних вище фрагментів ДНК, що містять РБІ СІ-ЇОН, у 20мкл реакційного середовища в присутності 2мкл буферного розчину Т4 ДНК лігаза х 10 (Атегепат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколя 8000 і бод. ферменту Т4 ДНК лігаза (Атегзпат) при 1492 протягом 16 годин. Бактерії, ЕзсПегіспіа соїї ОН5 о, яких попередньо роблять компетентними, трансформують (|Напапйап, 1983р.. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в Ге середовищі, що містить 12мкг/мл тетрацикліну, екстрагують за методом лужного лізису |ІВігпроїт і Юоіу, 1979р.| о і аналізують ферментативним перетравленням за допомогою ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рРВІОС89. Нуклеотидну послідовність фрагменту, що кодує рекомбінантний протеїн РБІ СІ -| СН, аналізують шляхом секвенування за допомогою набору для секвенування Т7 тм, що випускається у продаж фірмою

РІагтасіа, за методом з використанням дидезоксинуклеотидів І|Заподег та ін., 1977р.). Плазмідну ДНК бінарного - вектора рРВІОС89 вводять прямою трансформацією в штам І ВА4404 бактерії Адгорасіегічт іШтегасіепе за со методом Ногівіегг та ін. (1978р.). Придатність утриманого клону контролюють ферментативним перетравленням введеної плазмідної ДНК. с

ІМ. Конструкція химерних генів, що кодують рекомбінантний протеїн шлункової ліпази собаки і забезпечують с експресію в насінні кукурудзи а) Конструкція плазмід рРВІОСОВ8 і рВІОС99, що містять РБІ І-І ОС і забезпечують структурну експресію в - насінні кукурудзи.

Для конститутивної експресії в насінні кукурудзи тваринного гена, що кодує шлункову ліпазу собаки (І С), потрібні наступні регулюючі послідовності: « 1. один з двох промоторів, що забезпечують конститутивну експресію: - актиновий промотор рису, наступний за актиновим інтроном (рАК-ІАК), що міститься в плазміді рАси1-ГЕ4, - с описаній МеЕїгоу та ін. (1991р.); и - подвійний конститутивний промотор 355 (разб55) вірусу СаммМ (вірус мозаїки цвітної капусти). Він є» відповідає подвоєнню послідовностей, активуючих транскрипцію і розташованих вище елементу ТАТА природного промотору 355 (Кау та ін., 1987р.. 2. один з двох термінаторів: -і - кінцева послідовність транскрипції, термінатор роїуА 355, що відповідає некодуючій ділянці з сю послідовності вірусу з дволанцюговою циклічною ДНК мозаїки цвітної капусти, що продукує транскриптор 355

І(Егапск та ін., 1980р.|; іме) - кінцева послідовність транскрипції, термінатор роїлхА МОЗ, що відповідає некодуючій ділянці 3 гену

Фу 50 нопалінсинтази плазміди Ті бактерії Адгобасіегічт (штегасіепе штаму з нопаліном ІОеріскег та ін., 1982р.|.

Плазміду рВІОСО8, в якій послідовність, що кодує РБІ СІ -І(3С, знаходиться під контролем рАК-ІАК, що одержують клонуванням фрагменту ВаП-Хваї, що несе послідовність, яка кодує РБЗІ (І-І С в сайтах "Мсо! і заї!" рВЗО-рАК-ІАКАМО5.

З плазміди рВІОС40 (описана вище) виділяють фрагмент Вай-Храі), що несе кодуючу РБІ 01-І5С послідовність, подвійним ферментативним перетравленням під дією Ваїї| ї Храї, очищують електрофорезом на о 0,895-му гелі агарози, електроелююють, осаджують спиртом, сушать і потім обробляють ферментом Кленова

Плазміду рВ5ІІ-рАК-ІАК-ЯМО5 піддають подвійному перетравленню під дією зай! і Мсої, очищують ферментом їмо) Мипод Веап Мисієазе (Віоіарв) і дефосфорилюють ферментом лужної фосфатази кишечнику теляти (Воепйгіпдег

Мапппеійт) відповідно до рекомендацій виробника. Легування здійснюють з 20Онг описаного вище 60 дефосфорильованого вектора і 200нг описаних вище, фрагментів ДНК, що містять кодуючу РБІ БІ-і05С послідовність, у 20мкл реакційного середовища в присутності 2мкл буферного розчину Т4-ДНК-лігаза х 10 (Атегепат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколя 8000 і Бод ферменту Т4-ДНК-лігаза (Атетзпат) при 1490 протягом 16 годин Бактерії, ЕвзсПпегіспіа сої ОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують

ІНапапап, 1983р.Ї. Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5Омкг/мл бо ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису ІВігпроїт і ЮОоїу, 1979р.| і аналізують ферментативним перетравленням під дією ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як рВІОСОВ8.

Плазміду рРВ5Н-рРАК-ІАК-МОЗ одержують клонуванням в сайтах "Есо01091, оброблений ферментом Кленова і Крпі", рВЗО-МО 5 фрагменту ЗпавВІ-Крпі, що несе послідовність, що відповідає "рАК-ІАК-початку послідовності, що кодує ген див", виділену з плазміди рАсіІ-г4. Легування здійснюють зі 1О0Онг вектора і 5Онг перетравлених фрагментів ДНК, описаних вище, в 1Омкл реакційного середовища в присутності їмкл буферного розчину

Т4-ДНК-лігаза х 10 (Атегепат), і 2,50од. ферменту Т4 ДНК-лігаза (Атегепат) при 149 протягом 16 годин.

Бактерії, ЕвсПпегіспіа сої ОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують |Напапап, 1983р..

Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5О0мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису |Вігпроїт і Юоіу, 1979р.| і аналізують шляхом ферментативного перетравлення під 70 дією ферментів рестрикції.

Плазміду рВ5бП--МО5 одержують клонуванням у дефосфорильованому сайті ЕсоїЖМ рВопоЗКь, що випускається у продаж фірмою Зігаїадепе, фрагменту б5асі-ЕсоКіІ, що несе послідовність ІМО5, виділеного з рВІ121, що випускається у продаж фірмою Сіопіесі, в результаті подвійного ферментативного перетравлення під дією Бай і ЕсокМ, очищують електрофорезом на 290-му гелі агарози і обробляють ферментом 75 Т4-ДНК-полімераза. Легування здійснюють з 2онг дефосфорильованого вектора і 200нг фрагментів ДНК, що містить послідовність ІМО5, описаних вище, у 20мкл реакційного середовища в присутності 2мкл буферного розчину Т4-ДНК-лігаза х 10 (Атегзпат), 2мкл 5095-го розчину поліетиленгліколя 8000 і Бод. ферменту тТ4-ДНК-лігаза (Атетгепат) при 142 протягом 16 годин Бактерії, ЕзспПегіспіа соїї ОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують ІНапапап, 1983р.). Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису |Вігпроїт і Юоіу, 1979р.| і аналізують ферментативним перетравленням під дією ферментів рестрикції.

Плазміду рВІОС9ОЗ9, в якій кодуюча РБЇ 01-05 послідовність знаходиться під контролем разб55, одержують шляхом клонування, в сайтах "Кпрі і Ватні" плазміди рВ5И-ї355, фрагмента Кпирі і ВатНі, що несе послідовність, яка відповідає "раз55-РБІ І-І ОС", виділеному з описаної вище плазміди рВІОСА1. Легування Ге

Здійснюють зі 10Онг вектора і 5Онг перетравлених фрагментів ДНК, описаних вище, в 1Омкл реакційного о середовища в присутності їмл буферного розчину Т4-ДНК-лігаза х 10 (Атегзпат), і 2,5од. ферменту Т4

ДНК-лігаза (Атегзпат) при 1493 протягом 16 годин Бактерії, ЕвзсПегіспіа сої ОНбо, яким попередньо надана компетентність, трансформують ІНапапап, 1983р.). Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису |Вітроїт і Ооу, 1979р1і її аналізують шляхом ферментативного перетравлення під дією ферментів рестрикції. со

Плазміду рВЗН-їЇЗ355 одержують клонуванням у дефосфорильованому обробленому ферментом Кленова сайті Зреі плазміди рВЗІЗК, що випускається у продаж фірмою Зігаїадепе, фрагменту ЗтаІ-ЕсоКМ, що несе СМ послідовність ЇЗ55, виділеного з рЛТ163 (описаний вище) в результаті подвійного ферментативного с перетравлення під дією Зтаї і ЕСсокМ, очищеного електрофорезом на 295-му гелі агарози. Легування здійснюють з 20нг дефосфорильованого вектора і 200нг фрагментів ДНК, що містить послідовність 355, описаних вище, у їх» 20мкл реакційного середовища в присутності 2мкл буферного розчину Т4-ДНК-лігаза х 10 (Атегзпат), 2мкл 5ОФо-го розчину поліетиленгліколя 8000 і Бод. ферменту Т4-ДНК-лігаза (Атетзпат) при 142С протягом 16 годин.

Бактерії, ЕвсПпегіспіа сої ОН5бо, яким попередньо надана компетентність, трансформують |Напапап, 1983р.. «

Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в середовищі, що містить 5О0мкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису (Вігпроїт і Ооіу, 1979р.| і аналізують ферментативним перетравленням під дією о) с ферментів рестрикції. "» б) Конструкція плазмід рРВІОС100 ії рВІОС101, що містять, відповідно, РЗІ 1-10 і РБІ І-І ЗС-КОБЕЇ і " забезпечують експресію в ендоспермі насіння кукурудзи.

Для експресії в ендоспермі зерен кукурудзи тваринного гена, що кодує шлункову ліпазу собаки (ІС), потрібні наступні регулюючі послідовності: - 1. Промотор гену у-зеїна кукурудзи (ру-зеїн), що міститься у плазміді руб3, описаній Кеїпа та ін., 199Ор.

Га Плазміду руб3 одержують клонуванням ру-зеїна в сайтах Ніпай та Хра! плазміди рОС18, що містить, між сайтами Ніпайїйй та Храї, касету експресії "ра55-ди8-МО5" рВІ221, що випускається у продаж фірмою Сіопіесп. о Він забезпечує експресію в ендоспермі кукурудзяних зерен.

Ге»! 20 2. Кінцева послідовність транскрипції, термінатор роїлхА МОБ, що відповідає некодуючій ділянці 3' гену нопалінсинтази плазміди Ті бактерії Адгорасіегіцт (шптегїасіепз штаму, що містить нопалін (ОеріскКег та ін., 1982р.|. "м Плазміду рВІОС10ОО, в якій кодуюча РБІ СІ -Ї0С послідовність знаходиться під контролем р у-зеїна, одержують шляхом клонування, в сайтах "Зай, оброблений ферментом Т4-ДНК-полімераза і Ватні" плазміди руб3, фрагмента "Хваї, оброблений ферментом Кленова і Ва", виділеного з рВІОС40 (описана вище).

Легування здійснюють зі 10Онг вектора і бОнг перетравлених фрагментів ДНК, описаних вище, в 1Омкл (Ф) реакційного середовища у присутності їмл буферного розчину Т4-ДНК-лігаза х 10 (Атегзпат) і 2,5од. ферменту

Ге т4 ДНК-лігаза (Атетепат) при 142С протягом 16 годин. Бактерії, Езспегіспіа соїї ОН5о, яким попередньо надана компетентність, трансформують ІНапапап, 1983р.). Плазмідну ДНК одержаних клонів, які селекціоновані в во середовищі, що містить 5Омкг/мл ампіциліну, екстрагують за методом лужного лізису ІВігпроїт і Юоіу, 1979р.| і аналізують шляхом ферментативного перетравлення під дією ферментів рестрикції. Одержаний клон позначають як РВІОС10О00.

Плазміду рВІОС101 одержують шляхом заміни фрагмента МсоІ-АНІ плазміди рВІОС100 фрагментом

МесоІ-АЙЙ, що несе послідовність, кодуючу тетрапептид КОЕЇ (що забезпечує адресацію в ендоплазматичну 65 сітку), що знаходиться перед стоп-кодоном, одержаним шляхом ПЦрР-ампліфікації згідно описаним вище способам. Двома олігодезоксинуклеотидами, що використовуються в цій реакції, є 5 ААТ САС ТТО САС ТТ

АТС ТО Осс ад баї дсс 3 (один сайт Месої) і 5 ААТ сі а2гу ААА СТТ ТАТ ТОС САА АТО ТТ ОАА СОА ТСО

ОО ААА ТТ БАС СО ТСТ АСА АСТ АТА ОСТ САТ ССТ ТАТ ТАТ СТО ТТО ССА ТСА ТО 3 (послідовність, що кодує КОЕЇ і один сайт АТ). Температура гібридизації складає 702С. Клонування проводиться як описано

Вище.

М. Приклад одержання трансгенних рапсових рослин

Насіння ярового рапсу (Вгаззіса париз см МЕЗТАК або ліній І ітадгаїп) дезінфікують протягом 10 хвилин в 1595-ому розчині Юотевіов. Після 4-ри кратного промивання стерильною водою, насіння пророщують, з розрахунку по 20 насінин на горщик діаметром 7см і висотою 1Осм, у мінеральному середовищі Мигавзпіде і 70 ЗКоод (Зідта М 5519) з вмістом ЗОг/л сахарози, затверділої гелем агара в кількості 5г/л. Ці горщики приміщують в камеру для культивування з температурою 262 і з чергуванням освітленості і темряви 16г/8г і при освітленості приблизно 8ОмкЕ.м'-с7.

По закінченні 5 діб проростання стерильно відбирають сім'ядолі, зрізуючи кожний черешок приблизно на їмм вище сім'ядольного вузла.

Паралельно, в колбі Ерленмейєра ємністю 5Омл протягом Збг при 282С в 1Омл бактеріального середовища 21 |Затьгоок та ін., 1989р.), що доповнена антибіотиками, придатними для селекції використовуваного штаму, одержують передкультуру бактерії Адгорасіегіит (шптегасіепз штаму І ВА4404, що містить плазміду РВІОС29 (або рРВІОС25), а саме плазміду рОА7Е, в яку вбудована послідовність, що кодує шлункову ліпазу собаки, злита з послідовністю, що кодує сигнал адресації РР (або РБ) під контролем промотору рСКи (або раз5ьз).

Таку передкультуру використовують для обсіменіння 195 нової бактеріальної культури, що одержується в аналогічних умовах. По закінченні 14 годин, культуру центрифугують протягом 15 хвилин при прискоренні 30009 і бактерії обробляють еквівалентним об'ємом рідкого середовища пророщування. Цю суспензію розподіляють по чашках Петрі діаметром 5см з розрахунку по 5мл на чашку.

Відрізаний кінець черешка занурюють на декілька секунд в розчин таким чином одержаних агробактерій, С потім черешок занурюють на глибину в декілька міліметрів в регенераційне середовище. Це середовище має о такий же основний склад, що й середовище пророщування, однак, додатково містить 4мг/л бензиламінопурина (ВАР), який є фітогормоном, що сприяє новоутворенню бруньок. Культивують по десять експлантатів (сім'ядоля з черешком) на чашку Петрі діаметром Осм (Грейнер, номер за каталогом 664 102).

Після сумісного культивування протягом двох днів в тих же умовах, що і умови для пророщування, і - експлантати пересаджують на фітопланшети (Сігма, номер за каталогом Р 1552), що містять таке ж, як і «со попереднє, середовище, доповнене селективним агентом: 45мг/л сульфату канаміцину (Сігма, номер за каталогом К 4000) і бактеріостатичним агентом: суміш з 1/6 (по масі) калієвої солі клавулінової кислоти і 5/6. натрієвої солі амоксициліну (аугментин для ін'єкцій), з розрахунку бООмг/л. с

Далі, два рази, з інтервалом в З тижні, проводять пікіровку експлантатів, стерильно, на нове середовище в тих же умовах. -

Зелені бруньки, що з'явилися в кінці другої і третьої пікіровки, відділяють від експлантата та індивідуально культивують в прозорих горщиках діаметром 5см і висотою 1Осм, що містять середовище, аналогічне попередньому, але не містить ВАР. По закінченні трьох тижнів культивування, стебло « трансформованої бруньки відрізають, а бруньку приміщують в горщик зі свіжим середовищем. Через три-чотири тижні коріння розвивається в достатній мірі, що дозволяє акліматизувати росток у фітотроні. Бруньки, які не ші с позеленіли або не вкоренились, видаляють. Ці ростки тоді пересаджують в чашки зі стороною розміром 7см, ч заповнені насиченим водою гумусом (норма МЕ 044551: 4095 коричневого торфу, 3095 просіяного верескового » перегною і 3095 піску). Після двох тижнів акліматизації у фітотроні (температура: 212С, чергування освітленості і темряви: 16г/8г, відносна вологість: 8495) ростки пересаджують в горщики діаметром 12см, наповнені тим же гумусом, збагаченим добривом уповільненої дії (Озтосоїе, з розрахунку 4г/л перегною), потім переносять в і оранжерею (класу 52) з температурою 182 і з двократним зрошуванням водою щоденно протягом 2 хвилин. 2) Після появлення квітів, їх забезпечують мішечками (Стгізрас, стандарт ЗМ 570у З0О0мм"70О0мм) з метою попередження перехресного запилення. ю Після дозрівання стручків, їх збирають, висушують і лущать. Одержане насіння використовують для

Ге» 20 кількісного визначення біохімічної активності. Селекцію трансгенного потомства проводять шляхом пророщування на середовищі, що містить сульфат канаміцину з розрахунку 100-15Омг/л (залежно від генотипів). "м Умови пророщування аналогічні вищеописаним умовам, за виключенням того, що пророщення відбувається у пробірках, в кожній з яких знаходиться тільки одна насінина. | тільки ростки, що розвили вторинне коріння, перші три тижні акліматизують у фітотроні перед переносом до оранжереї. 59 МІ. Приклад одержання трансгенних пасльонових

Ф! а) Одержання трансгенних рослин тютюну.

Тютюнові рослини, що використовуються у експериментах з трансформації (Місойапа (арасит маг. Хапійпі МС і де РВОб) культивують ін вітро в основному живильному середовищі (Мигазпіде і ЗКосд (1962р )| з добавками вітамінів (батрого та ін. (1968р.); Сігма, номер за каталогом МО404), сахарози у кількості 20г/л і агара 60 (Мерк) у кількості г/л. Значення рН середовища доводять до 5,8 за допомогою розчину гідроксиду калію перед автоклавуванням при температурі 1202С протягом 20 хвилин. Пікіровку тютюнових рослин здійснюють за рахунок черешку міжвузля кожні 30 діб на цьому середовищі для розмноження М520.

Всі культивування ін вітро здійснюють у кліматичній камері при наступному режимі: - освітленість: ЗОМКЕ.м'2.с7, тривалість освітлення: 16 годин; бо - температурний режим: 262С удень та 242С уночі.

Використовуваний спосіб трансформації оснований на способі Ногзсп та ін. (1985р.).

Передкультивування бактерії Адгорасіегішт (шптеїасіепз штаму І ВА4404, що містить плазміди рВІОС29 або рРВІОС26, або рВІОС25, здійснюють протягом 48 годин при 282С при перемішуванні у середовищі І В |Затргоок та ін., 1989р.| з добавками адекватних антибіотиків (рифампіцин і тетрациклін). Передкультуру потім розріджують у 50 разів у тому ж середовищі та культивують у тих же умовах. По закінченні ночі, культуру центрифугують (1Охв., 30009), бактерії оброблюють еквівалентним об'ємом рідкого середовища М530 (ЗО0г/л сахарози) і цю суспензію розріджують у 10 разів.

Експлантати розміром близько 1см? вирізають з листя описаних вище ростків. Потім їх вводять у контакт з 70 бактеріальною суспензією протягом 1 години, після цього швидко висушують на фільтрованому папері та приміщують на середовище для спільного культивування (М530, тверда).

Через два дні експлантати переносять у чашки Петрі на середовище для регенерації М5З30О, що містить селективний агент, канаміцин (20Омг/л), бактеріостатичний агент, аугментин (40Омг/л) та гормони, необхідні для індукції бруньок (ВАР, 1Тмг/л і АМА, 0,Тмг/л). Пересадку експлантатів проводять на теж середовище після 75 2-х тижнів культивування. Після 2-х додаткових тижнів бруньки пересаджують у чашки Петрі на середовище для розвитку, що складається з середовища М520 з додаванням у нього канаміцину і аугментину Через 15 днів пересаджують половину бруньок. Укорінення продовжується близько 20 днів, після чого ростки можна клонувати черешком міжвузля або висаджувати в оранжерею. б) Одержання трансгенних рослин томату.

Насіння томату см.0С82В стерилізують за допомогою 1095-го Юотевіоз протягом 15 хвилин та тричі промивають стерильною водою. Останню промивку проводять протягом 10 хвилин при струшуванні.

Стерилізоване таким чином насіння пророщують на середовищі М55М/2 (основне живильне середовище

Мигазпіде і 5Косд, 1962р., Сігма, номер за каталогом Мб6899)/2 з добавкою вітамінів Міїзспй! |Ппотаз і Ргай, 1981р.), сахарози у кількості ЗОг/л, агара (МегсК) у кількості 8г/л, рН-5,9, протягом 7 або 8 діб у Ге кліматичній камері (освітленість: ЗОмкЕ.м'2.с7, тривалість освітлення і темряви: 1бгод/8год, 262С). о

Використовуваний спосіб трансформації оснований на способі ЕПШаці та ін. (1987р.).

Передкультивування бактерії Адгорасіегішт (штегтасіепз, штам І ВА4404, що містить плазміди рРВІОС25 або рРВІОС26, здійснюють протягом 24 годин при 282С при струшуванні у середовищі І В, доповненому адекватними антибіотиками (рифампіцин і тетрациклін). Перед-культуру потім розріджують у 50 разів у тому ж середовищі та - культивують у тих же умовах протягом ночі. Вимірюють оптичну щільність при бООнм, центрифугують «о агробактерії (1Охв., 30009) і оброблюють їх у рідкому середовищі КОМ (описане в публікації РіШаці та ін., 1987р.), з таким розрахунком, щоб одержати оптичну щільність при бОбОнм-0О,8). с

У деякі стадії способу згідно протоколу РіІаці та ін. (1987р.) внесені технічні удосконалення. со

Передкультивування експлантатів та спільне культивування здійснюють способом, описаним РіМПакі та ін.

Зо (1987р.), за виключенням того, що середовище КСМ5 доповнюють ацетосирингоном (200мММ). -

Промивальне середовище 27 відрізняється добавкою у нього 50Омг/л цефотаксима замість карбеніциліна.

Застосовне середовище вирощування складається з основного живильного середовища Мигазпіде і 5Косд (Сігма, М56899) з добавкою вітамінів Міїзси, 20г/л сахарози, 5Омг/л канаміцину, 200мг/л аугментина, мг/л АМА « (антинуклеарне антитіло) та О,5мг/л зеатина.

МІІ. Одержання трансгенних рослин кукурудзи в) с а) Одержання та застосування калюсу кукурудзи як мішені для генетичної трансформації. "» Для генетичної трансформації кукурудзи, яким би не був при цьому застосовний метод (електропорація, " агробактерії мікроволокна, пушка для обстрілу частками), як правило, потрібно використання недиференційованих клітин зі швидким діленням, що зберігають здатність до регенерації цілих рослин. Такий тип клітин утворює ембріогенний калюс кукурудзи, що легко кришиться (так званий тип 1Ї). - Такі калюси одержують з незрілих зародків генотипу НІ ІЇ або (АІ88 х В7З3) методом та на середовищах, які оо описані Агтвігопуд довідник Маїге; (1994р.) вид. М.Егееїїпо, М.ММаІрої стор.665-671). Одержані таким чином калюси розмножують та зберігають шляхом послідовних пересадок через кожні 15 днів на початковому ко середовищі. б 20 Потім регенерують ростки з вказаних калюсів, змінюючи гормональну та осмотичну рівновагу клітин методом, описаним Маїп та ін. |Ріапі СеїЇ Тізвие апа Огдап Сийиге (1989, 18:143-151)). Ці рослини потім акліматизують "М у оранжереї, де вони можуть схрещуватися або самозапилюватися. б) Застосування пушки для бомбардування частками з метою генетичної трансформації кукурудзи

У попередньому розділі було описано одержання та регенерація ліній клітин, необхідних для трансформації; 25 тут описується метод генетичної трансформації, що забезпечує стійке вбудовування видозмінених генів у геном

ГФ! рослини. Даний метод базується на використанні пушки для бомбардування частками, ідентичної з пушкою, описаною .).Ріпег (Ріапі Сеї!Ї Керогі (1992) 11, 323-328); клітинами-мішенями виступають фрагменти калюсів, о описані у розділі 1. Ці фрагменти з площею поверхні від 10 до 20мм? за 4 години до їх бомбардування приміщують, у кількості 16 фрагментів на чашку, у центр чашки Петрі, в якій містилося культуральне бо середовище, ідентичне вихідному середовищу, з добавкою 0,2М маніту ї- 0,2М сорбіту. Плазміди, що несуть вводимі гени, очищують на колонні Оіадепе з додержанням вказівок виробника. Потім їх осаджують на вольфрамових частках (М10), слідуючи методиці, описаній Кієїп (Маїшиге, (1987) 327: 70-73). З таким покриттям частини за допомогою пушки та згідно методиці, описаній У.Ріпег (Ріапі СеїЇ Керог (1992) 11: 323-3281; вистрілюють у клітини-мішені. бо Піддані таким чином бомбардуванню чашки з калюсами потім запечатують за допомогою ЗсеПоїгаї8Ф), після чого культивують у темряві при 2723. Першу пересадку проводять через 24 години, потім через кожні два тижні протягом 3-х місяців на середовище, ідентичне вихідному, з додаванням селективного агенту, природа та концентрація якого можуть змінюватись залежно від використовуваного гену (див. розділ 3). Використовуваними Селективними агентами є, як правило, активні сполуки деяких гербіцидів (Вазіа Ф, Коцпа ире) або деякі антибіотики (гігроміцин, канаміцин...).

Через З місяці, а іноді і пізніше, одержують калюси, ріст яких не гальмується агентом селекції, звичайно і частіше за все утворені клітинами, що походять від ділення клітини, у генотип якої інтегровано одна або декілька копій гена селекції. Частота одержання таких калюсів складає приблизно 0,8 калюсу на піддану 7/0 бомбардуванню чашку.

Ці калюси ідентифікують, індивідуалізують, ампліфікують, потім культивують з таким розрахунком, щоб регенерувати ростки (див. розділ "а"). Для уникання любої інтерференції з нетрансформованими клітинами всі зазначені операції проводяться на культуральних середовищах, що містять селективний агент.

Регенеровані таким чином рослини акліматизують та культивують потім в оранжереї, де вони можуть 7/5 схрещуватися або самозапилюватися.

МІ. Аналіз експресії шлункової ліпази собаки у трансгенних тютюнових рослинах

А) Протокол.

Протоколом екстрагування ліпази з тютюнового листя, взятого від оранжерейних рослин, є наступний: 1г листя (сира маса) гомогенізують у рідкому азоті, потім при 49С у бБмл буфера Трис-НСІ, 25мММ, рн-7,5, з додаванням 1ММ ЕДТУ і 10мММ меркаптоетанолу (буфер А) або буфера гліцин-НСІ, 25мМ, рн-З, з додаванням 1Мм ЕДТУ, 10мМ р-меркаптоетанола, 0,295 Тритона Х-100 та 250мМ Мас! (буфер Б).

Всю кількість гомогенату піддають негайному центрифугуванню при 42С протягом 15 хвилин при прискоренні 100009.

Для насіння тютюну екстрагування проводять у буфері Б з розрахунку 0,1г насіння на 4мл буфера. Ге

Ліпазну активність визначають за допомогою рН-5ТАТ тітрометичним методом Сагодоигі та ін. (1986р.), при (5) якому використовуваним субстратом є трибутирин. Емульсію трибутирину (4мл на ЗОмл емульсії) одержують у приладі для струшування і перемішування у присутності жовчних солей (1,04г/л), бичачого альбуміну (0,1г/л) і масі (Уг/л). Аналіз полягає у нейтралізації бутанової кислоти, що виділяється під дією ліпази, розчином гідроксиду натрію з заданим значенням рН-5,5 при 3720. Одна ліпазна одиниця відповідає кількості ферменту, ї- яка провокує виділення одного мікромолю жирних кислот на хвилину при 372 і при оптимальних значеннях рн «со (5,5). Природна (очищена) шлункова ліпаза собаки характеризується питомою активністю, що становить 570 одиниць на мг протеїну. с

Ліпазну активність можна визначати при використанні всього гомогенату, осаду після центрифугування або со надосадової рідини після центрифугування.

Зо При використанні надосадової рідини після центрифугування (буфер А), кількісний аналіз всіх розчинних в. протеїнів виконують по методу Вгасдгога (1976р.).

Сендвіч-імуноферментний аналіз ІСаїгтіеге та ін., 1993р.) проводять також при використанні надосадової рідини після центрифугування та при застосуванні двох популяцій моноклональних антитіл проти природної « шлункової ліпази собаки. Перша популяція включає антитіла, що реагують з шлунковою ліпазою людини та піддані афінному очищенню, виходячи з повної антисироватки, на шлунковій ліпазі людини, прищепленій до о, с колонки АйПіде! 10 |Аошираїа та ін., 1993р.). Ці антитіла використовують для покриття ямок планшетів для "» імуноферментного аналізу (ЕГІЗА) при концентрації мкг/мл. Друга популяція включає антитіла, якими не " розпізнають шлункову ліпазу людини. Їх очищають потім на колонці з сефарозою, зв'язують з протеїном А, а потім з біотином. Фіксування антитіл визначають по зміщенню кон'югату стрептавідин/пероксидаза, ферментативну активність яких виявляють за допомогою субстрату на основі о-фенілендіаміну. Одержані - результати мають якісне значення та їх позначають символами " та -. со Ефективність екстракції може бути збільшена за рахунок додавання у буфер для екстракції детергенту типа

СНАРЗ (3-(3-холамідопрогал)диметиламоній-1-пропансульфонат) (СІГМА). У цьому випадку дійсно вихід де екстракції з надосадової рідини збільшується приблизно до 10095 (див. таблицю 1). б 50 й у присутності 195 детергенту СНАРЗ в о т во б) експресія за допомогою рослинних сигнальних пептидів; кількісні аналізи при використанні листя та насіння тютюну, трансформованих за допомогою рВІОС25 та рВІОС26; імуноферментний аналіз.

Результати, які одержані на 98 рослинах ТО генотипу Хапійі (стадія 15-20 листків) наведені у таблиці 2.

Кількісні аналізи проводять на гомогенатах листя або насіння перед центрифугуванням. Для кожної конструкції, виміряні активності значно змінюються залежно від трансформантів. Приблизно 2095 рослин не мають ніякої б5 активності або вони мають дуже слабку активність для того, щоб її можна було виявити. Середні та максимальні активності наведені у таблиці 2.

Загальні кількості протеїнів схожі для 3-х конструкцій з середніми значеннями 7 і мг/г сирої маси листя та 34, 31 і Звмг/г сирої маси у насінні.

Середня ліпазна активність у трансформованому за допомогою конструкцій рВІОС25 листі складає З4од./г сирої маси, тобто 0,895 експресії від загальної кількості протеїнів. У насінні середня активність складає

Збод./г сирої маси, тобто 0,295. Досягнута максимальна активність одного з трансформантів складає 14бод./г сирої маси (листя; 2,595 експресії) та 148од./г сирої маси (насіння; 0,795 експресії). Ферментативні активності, одержані на трансформованих за допомогою конструкції рРВІОС25 рослинах подібні. Середня активність у листі складає З4од./г сирої маси (0,895 експресії), а максимальна активність - 134од./г сирої /о маси (Зо від загальної кількості протеїнів). У насінні середня активність досягає 42од./г сирої маси (0,390), максимальна активність - 159од./г сирої маси (195).

Для трансформованих за допомогою конструкції РВІОС29 рослин, у листі (специфічний промотор насіння) не виявляє ніякої активності. У насінні середня активність складає 12од./г сирої маси (0,195 експресії), а максимальна активність - 137од./г сирої маси (0,790).

Експресія у листі та зернах одного і того ж випадку трансформації, як правило, добре корелює.

Результати імуноферментних аналізів також узгоджуються з результатами кількісних аналізів по визначенню ферментативної активності, тобто рослина з ліпазною активністю дає позитивний результат в імуноферментному аналізі.

Одержані потім результати у випадку тих же самих рослин показують, що ліпазна активність може 2о Змінюватись у процесі розвитку рослини. Насправді, рослина, експресія якої по відношенню до загальної кількості протеїнів складає Зо на стадії 12-15 листків, показує експресію бУо при наступному кількісному аналізі (більш доросла рослина, з квітами). сч зв 1 дЕшаМ 00000109 мг/г сирої маси (серед.) протеїнів )мін.-макс. (серед.)

Зо о см щі - «

Й - г» максимумом експресії; п - число проаналізованих випадків трансформації. - в) Експресія за допомогою сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (І СІ); кількісні аналізи ліпазної со активності у тютюновому листі.

Результатами, одержаними на 44 рослинах ТО генотипів Хапійпі та рВОб (стадія 15-20 листгів) є наступні: де Всі кількісні аналізи проводять на гомогенатах листя перед центрифугуванням. Проаналізовані активності б 20 характеризуються великим розкидом залежно від трансформантів. Близько 2095 рослин не мають ніякої активності або мають дуже незначну активність для того, щоб її можна було виявити. Середня ліпазна активність "м у трансформованих за допомогою конструкції РВІОС41 складає Звод./г сирої маси для генотипу Хапійі та 480од./г сирої маси для генотипу РВОб. Максимальні активності складають, відповідно, 152 та 22бод./г сирої маси.

ЇХ. Аналіз експресп шлункової ліпази собаки у трансгенних томатних рослинах оо а) Методика.

ГФ! Методика екстракції ліпази з листя та плодів томату подібна тій, що описана для тютюнового листя, за виключенням того, що 1г свіжого матеріалу оброблюють у 4мл буферу В. Ліпазну активність визначають подібно о тому, як описано для листя тютюну. б) Кількісний аналіз плодів томатів. бо Проаналізовані плоди перших тридцяти трансформантів.

Ліпазна активність, визначена в плодах, різна залежно від плодів у випадку одного і того ж трансформанту.

Вона складає в середньому 5бод./г сирої маси для спілих плодів і З5од./г сирої маси для зелених плодів, при цьому незалежно від досліджуваного конструкта (РВІОС25 або рВІОС26).

Необхідно відзначити, що у процесі дозрівання плоду активність знижується. Так, наприклад, для даного бо першого трансформанту ліпазна активність складає 132од./г сирої маси для зеленого плоду діаметром 10 мм; 44од./г сирої маси для червоно-зеленого плоду діаметром 33 мм і Збод./г сирої маси для червоного плоду діаметром 45мм.

Х. Імунологічний аналіз типу "вестерн-блотування" | С а) Шлункова ліпаза собаки І С, що експресується у листі та насінні трансгенних тютюну та рапсу а.1) Експресія за допомогою рослинних сигнальних пептидів; імунологічний аналіз листя та насіння тютюну та рапсу, трансформованих за допомогою рВІОС25, рВІОС26 і рВІОС29.

Імунологічний аналіз типу "вестерн-блотування" |Кепай і Запдома!ї, 1984р.| шлункової ліпази собаки проводять на протеїнах листя та насіння тютюну і рапсу, екстрагованих за допомогою буферів А і В (див. вище протокол екстрагування). Для проведення цього аналізу перш за все екстраговані протеїни (ЗОмг всіх протеїнів у У пробі) розділяють на поліакриламідному гелі, що денатурує на 12,595, згідно способу І аеттії О.К. (197Ор.), потім переносять їх на нітроцелюлозну мембрану. Поліклональне антитіло проти ліпази собаки, одержане у випадку морської свинки, використовують як зонд, і виявлення здійснюють за допомогою антитіла проти ДО морської свинки, маркірованого лужною фосфатазою.

Контрольним протеїном є природна шлункова ліпаза собаки (ІС, Фіг.б), яка переміщується у формі одної 7/5 бмуги з уявною молекулярною масою близько 50кДа. Міграція шлункової ліпази собаки трохи затримується у присутності екстракту з нетрансформованого тютюнового листя (Фіг.б, | СТ).

У протеїнових екстрактах з нетрансформованого листя і насіння тютюну і рапсу ніякої смуги не виявляють.

Продукована у тютюновому листі ліпаза виявляється у вигляді двох смуг. Найбільш значна у кількісному відношенні смуга має уявну молекулярну масу близько З7кДа і відповідає згаданому вище поліпептиду ( А5бБ4).

Менша смуга має уявну молекулярну масу приблизно 49кДа і відповідає вказаному вище поліпептиду ( 4) (Фіг.б, Р). У протеїнових екстрактах з насіння простежується тільки одна смуга з меншою молекулярною масою (Фіг.6, СТ і С). а.2) Експресія за допомогою сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (І СІ); імунологічний аналіз у листі та насінні тютюну, трансформованих за допомогою рВІОСА1. Га

Вестерн-блотування |Кепай і Запдома!ї, 1984р.| здійснюють на протеїнах тютюнових листя і насіння, екстрагованих буфером В (див. вище протокол екстрагування). Екстраговані протеїни перш за все розділяють на і) денатуруючому поліакриламідному гелі, (5О5-РАСЕ) відповідно до методу І аеттії (197Ор.), потім переносять на нітроцелюлозну мембрану. Поліклональне антитіло проти ліпази собаки, одержане від морської свинки, використовують як зонд, і, виявлення здійснюють за допомогою антитіла проти дб морської свинки, ч- маркірованого лужною фосфатазою.

Вестерн-блотування тютюнового листя наведено на Фіг.7. Контрольним протеїном є шлункова ліпаза собаки, іш що мігрує у вигляді єдиної смуги з уявною молекулярною масою близько 5ОкДа. сі

У протеїнових екстрактах з нетрансформованого листя тютюну (Т) ніякої смуги не виявляють. Продукована у тютюновому листі ліпаза знаходиться у вигляді великої смуги з уявною молекулярною масою близько 49кдДа і о

Відповідає згаданому вище поліпептиду (А4). ч-

У трансформованому за допомогою конструкції РВІОСА1 насінні тютюну рекомбінантна ліпаза виявляється у тій же формі, що і в листі. б) Шлункова ліпаза собаки в екстракті протеїнів з трансформованого листя тютюну: деглікозилювання. «

Методика екстракції протеїнів для деглікозилювання наступна: О,5г листя (сира маса) гомогенізують у рідкому азоті, потім при 49С в 1їмл денатуруючого буферного розчину (100мММ фосфатний буфер, рн-7,5, з - с добавкою 195 р-меркаптоетанола, 25ММ ЕДТУ та 195 додецилсульфату натрію (505). ч» Гомогенат піддають центрифугуванню при 492С протягом 15 хвилин при прискоренні 100009. Надосадову " рідину інкубують протягом 5 хвилин при 1002 з метою денатурації протеїнів, потім центрифугують протягом 2 хвилин при 10009. Надосадову рідину потім розріджують в 10 разів буфером для деглікозилювання (100ММ фосфатний буфер, рН-7,5, з добавкою 196 Д-меркаптоетанола, 25ММ ЕДТУ та 195 5О5 і 190 октилглікозиду). це. Фермент (М-глікозидаза Е, РМСазвзе, Воепгіпдег) додають з розрахунку Тод. на 10О0мкл надосадової рідини. Для оз кожної проби здійснюють контроль без ферменту. Деглікозилювання контрольного протеїну (шлункова ліпаза собаки або кроля) здійснюють за тих же умов. Різні протеїнові проби інкубують при кімнатній температурі о протягом 8 годин. Після цього протеїни розділяють шляхом електрофорезу на поліакриламідному гелі та б 20 переносять на мікроцелюлозну мембрану, як описано у попередньому розділі.

Згідно результатам "вестерн-блотування" шлункова ліпаза, що використовується як контроль, має уявну тм молекулярну масу близько 50кДа. Після деглікозилювання її уявна молекулярна маса складає тільки близько 4зЗкДа.

Продукована у тютюновому листі ліпаза, після інкубації без РМОСазе при описаних вище умовах, 29 проявляється у формі трьох смуг з уявними молекулярними масами 49 (поліпептид А4), 37 (поліпептид дБ) і

ГФ) 28кДа Смуга з молекулярною масою 28кДа є, без сумніву, результатом протеолізу, що пройшов при інкубації т протягом 8 годин при кімнатній температурі. Після деглікозилювання молекулярні маси трьох смуг зменшуються приблизно на 1-2кДа, що свідчить про глікозилювання протеїнів, продукованих у тютюновому листі. в) Шлункова ліпаза собаки, експресована у трансгенних листях та плодах томату. 60 Імунологічний аналіз типу "вестерн-блотування" шлункової ліпази собаки проводять на протеїнах листя і плодів томату, екстрагованих за допомогою буферного розчину В (див вище протокол екстрагування). Для проведення експериментів екстраговані протеїни (15мкг і бмкг всіх розчинних протеїнів, відповідно, у випадку листя та плодів томату) розділяють на денатуруючому поліакриламідному гелі, як описано у розділі Х.а.

Контрольним протеїном є природна шлункова ліпаза (слід 4 на Фіг.8), що мігрує у вигляді єдиної смуги з бо уявною молекулярною масою близько 5ОкДа.

У протеїнових екстрактах з нетрансформованих листя та плодів томату ніякої смуги не виявляють.

Продукована у листі та плодах томату ліпаза проявляється у вигляді двох смуг, яку б конструкцію (РВІОС25 або рВІОС26) при цьому не застосовували. Найбільш значна у кількісному відношенні смуга має уявну

Молекулярну масу близько 37кДа та відповідає згаданому вище поліпептиду (Л5бБ4). Менша смуга має уявну молекулярну масу близько 49кДа та відповідає вказаному вище поліпептиду (44) (Фіг.8).

ХІ. Очищення шлункової ліпази собаки з рослин а) Очищення шлункової ліпази собаки з тютюнового листя.

Активність шлункової ліпази собаки, продукованої у тютюновому листі, визначають титриметричним 70 способом, при цьому за допомогою РН-стату (Мейег-ТоіІедо-ОІ 25) величину рН фіксують при 5,5, температуру при 372С, використовуючи трибутирин як субстрат: їмл трибутирину емульгують у 29мл водного 0,15М розчина

Масі в апараті для струшування і перемішування. Аналіз полягає у нейтралізації бутанової кислоти, що виділяється під дією ліпази, шляхом додавання 0,02н розчину гідроксиду натрію, при цьому підтримують інтенсивне механічне струшування емульсії. Одна ліпазна одиниця відповідає 1 мікромолю жирної кислоти, що 75 Виділяється при даних величинах рН і температури.

Після першої стадії хроматографування, при відборі проби у кількості О,5мл, визначають ліпазну активність в емульсії, що складається з їмл трибутирину в 29мл 0,15М розчину Масі, 2мМ тауродезоксихоляту натрію, та 1,5мМкМ бичачого альбуміну, згідно аналізу, описаному Сагодоигі та ін., (1986р.). 1г ліофілізованого листя гомогенізують при 42С у ЗОмл 20мМ гліцинового буферного розчину, рН-2,5 і слабо струшують протягом 15 хвилин. Під час мацерації значення рН підтримують рівним 2,5 добавкою Ін соляної кислоти. Продукт мацерації центрифугують при прискоренні 150009 протягом 5 хвилин. Значення рн надосадової рідини доводять до 4 добавкою 1н розчину Маон. Після фільтрації через МІКАСІ ОТН (Саїпріоспет) всю кількість надосадової рідини вносять у колонку з катионообмінною смолою (смола: 5-5 ерпагозе Раві

Ріомж-Ріагтасіа) об'ємом 1Омл (діаметр 1,бсм), урівноважену буферним розчином 20мММ ацетату натрію, рН-4,0, «М 20ММ Масі при витраті Тмл/хв. Збирають фракції по 2мл. Після проходження надосадової рідини, колонку (5) промивають 40мл врівноважуючого буферного розчину. Утримані в колонці протеїни елююють за наступною методикою: - лінійний градієнт буферного розчину 20мММ ацетату натрію, рН-4,0, з 20мММ-210мММ Масі за 30 хвилин для елюювання першої сукупності протеїнових піків, що не характеризуються ліпазною активністю; тестпроводять на її пробах по мл; с - плато при 210мМ Масі протягом 20 хвилин; - лінійний градієнт буферного розчину 20мММ ацетату натрію, рН-4,0, з 210мМ-500мММ Масі за 30 хвилин при СМ елююванні другої сукупності протеїнових піків. Ліпазну активність, виміряну на пробах по 0,5мл, елююють під со час другого градієнту при іонній силі 300-400ММ

Зо Активні фракції збирають і концентрують за допомогою концентратора ОМЕСАСЕЇЇ з обмеженням в. молекулярної маси ЗОкДа (Рійгоп Тесппоіоду Согрогайоп).

Проводять діаліз концентрату протягом 12 годин проти 10ММ буферного розчину Ттіз-НСІ, рН-8, потім вносять його в колонку з аніонообмінною смолою (Мопос) НК5Б/5 діаметром 0О,5см та висотою 5см; РНагтасіа), « врівноважений 10мММ буферним розчином Тгіз-НСІ, рнН-8. Ліпазну активність визначають на пробі О,5мл. Витрати підтримують рівними їмл на хвилину при тиску 2,0Мла. Після елюювання не утриманої фракції та промивки о) с колонки за допомогою 1О0мл 10мММ буферного розчину Ттіз-НСЇІ, рН-8, застосовують лінійний градієнт з іонною ч силою 0-400мММ Масі за 60 хвилин. Ліпазну активність елююють при іонній силі 100мМ-200мММ. "» ! 5 :

Активні фракції збирають та концентрують за допомогою концентратора ОМЕСАСЕЇЇ до границі молекулярної маси ЗОкДа. Концентрат утворює очищена шлункова ліпаза собаки, екстрагована з листя тютюну.

Концентрацію протеїнів визначають методом Вгадіога М. (1976бр.) у концентрованих надосадових рідинах і - методом І ом/гу О.Н. (1951р.) у розчинах після першої іонообмінної хроматографії. со На різних стадіях очищення проводять аналізи електрофорезом на денатуруючому поліакриламідному гелі (50О5-РАСЕ 12,596) методом І аеттії О.К. (197Ор.). Протеїни, таким чином розділені на поліакриламідному гелі, ко виявляють, по-перше, забарвлюванням за допомогою кумасі-синього та, по-друге, переносять на б 20 нітроцелюлозну мембрану методом трансфекції електрошоком у напівсухому стані (Тгапзріої 50, ВІОКАЮ) у буферному розчині 20мМ Ттгіз-основа, 150ММ гліцин і 2095 етанол, при 2,3мА/см? мембрани. Перенесену на тм нітроцелюлозну мембрану рекомбінантну шлункову ліпазу собаки виявляють шляхом імунологічного аналізу за наступною методикою: - маркування протеїна-мішені поліклональним антитілом проти шлункової ліпази собаки, одержаним від 29 морської свинки та розрідженим у 5000 разів у забуференому фосфатом фізіологічному розчині (ЗФР), що (ФІ містить добавку знежиреного порошкового молока у кількості 5905 і Твін 20 у кількості 0,195, протягом год. при кімнатній температурі, о - промивка мембрани послідовно у трьох послідовних ваннах з буфера ЗФР, що містить добавку 195 знежиреного порошкового молока та 0,195 Твіну 20, протягом 10 хвилин у кожній ванні, бо - маркування за допомогою антитіла пероксидази (Сігма) морської свинки, розрідженого у 2000 разів у ЗФР, що додатково містить 195 знежиреного порошкового молока та 0,195 Твіну, протягом 1 години при кімнатній температурі, - промивка мембрани послідовно у трьох послідовних ваннах з буфера ЗФР, що містить добавку 195 знежиреного порошкового молока та 0,195 Твіну 20, протягом 10 хвилин у кожній ванні, бо - проявлення шляхом впливу пероксидази на 4-хлоро-1-нафтол (Сігма) у присутності Н 2025 блакитного,

стійкого у часі фарбування.

Продукована у листі ліпаза, проявляється у вигляді двох смуг з молекулярною масою близько 49кДа (поліпептид А4) і З7кДа (поліпептид д5а4). б) Варіант очищення шлункової ліпази собаки з тютюнового листя.

Активність шлункової ліпази собаки, продукованої у тютюновому листі, визначають титриметричними способами, описаними сСагодоигі та ін. (1986бр.) за допомогою рН-стату (Мейшег- Гоіедо-ОІ 25).

Визначення тригліцеридів з короткими ланцюжками проводять при використанні трибутирину як субстрату: 1мл трибутирину емульгують у 29мл водного розчину 0,15М Масі, 15мкМ сироватки бичачого альбуміну (ВЗА), 70 та 2мМ тауродезоксихоляту натрію (Мматос).

Значення рН складає 5,0, температура становить 3726.

Аналіз полягає у нейтралізації бутанової кислоти, що виділяється під дією ліпази, шляхом додавання 0,02н розчину гідроксиду натрію, причому здійснюють інтенсивне механічне струшування для збереження емульсії.

Кількісний аналіз тригліцеридів з довгими ланцюжками проводять при використанні як субстрату водної 75 емульсії з 30956 очищеного соєвого масла, 1,295 очищених фосфоліпідів яйця, 1,6795 безводного гліцерину (3090

Іпігаірідтм--НАКМАСІА АВ, Стокгольм, Швеція). 1Омл вказаної суспензії емульгують у 20мл водного розчину, що містить 0,15М Масі, ЗОмкМ сироватки бичачого альбуміну (ВЗА) і З3,56мММ Сасі». Значення рН складає 4,0, температура становить 3720.

Аналіз полягає у нейтралізації жирних кислот, що виділяються під дією ліпази, шляхом додавання 0,02М розчину гідроксиду натрію по стрибку значення рН з 4 до 9, причому здійснюють інтенсивне механічне струшування для збереження емульсії.

Одна ліпазна одиниця відповідає 1 мікромолі жирної кислоти, що виділяється в 1 хвилину при вказаних значеннях рН і температури для кожного з субстратів.

Два грама ліофілізованого листя гомогенізують при 492 у бОмл 0,2М розчину Масі, рН-З і слабо струшують й С протягом 15 хвилин при 42С. Під час цієї мацерації, значення рН підтримують рівним З добавкою ін НС. о

Продукт мацерації (гомогенат) центрифугують при 100009 протягом 10 хвилин. Після фільтрації через

МІКАСІ ОТН (Саїріоспет) та фільтр МІС'ІРОКЕ (0,45мкм) всю кількість надосадової рідини інжектують у колонку з катіонообмінною смолою (КЕЗБОШКСЕ 5 бмл - РНАКМАСІА - 16бмл (внутрішній діаметр) х ЗОмм), врівноважену буферним розчином 20мМ ацетату натрію, 0,2М Масі, рН-3, з витратою Вмл/хв (240см.г 7). -

Після проходження неутримуваної фракції, колонку промивають урівноважуючим буферним розчином у Ге) кількості, що перевищує у ЗО разів її обєм. Утримані у колонці протеїни елююють при лінійному градієнті буферного розчину 20мММ ацетату натрію, рН-З, з 0,2М-0,5М Масі у 7-кратних кількостях щодо об'єму колонки. с

Збирають фракції по 4мл. со

Активна ліпаза, визначена у пробах по 0,5мл, елююється при іонній силі О0,35М Масі.

Активні фракції об'єднують і концентрують за рахунок концентратора ОМЕСАСЕЇІЇ (Рійгоп Тесппоіоду -

Согрогаййоп) з молекулярною масою ЗокдДа.

Концентрацію протеїнів визначають методом І ому ОН. (1951р.).

На Фігурах 9 і 10 наведений приклад поліакриламідного гелю і результат переносу цього гелю на « нітроцелюлозну мембрану, а також виявлення антитіла проти шлункової ліпази собаки. Виявлення проводять впливом пероксидази на Люмінол (І итіпої) у присутності активатора (ЕСІ уевіегп Віойіпд - АМЕКЗНАМ ГІРЕ не) с ЗСІЕМСЕ) та відбиття на фотоплівці. "» Присутність гліканових залишків у протеїні визначають по наступній методиці: " - іммобілізація протеїну на нітроцелюлозній мембрані, - обробка періодатом, - специфічна реакція зі стрептавідином, зв'язаним з лужною фосфатазою,

Ше - реакція забарвлення лужної фосфатази (СІ УСОТКАСК-ОХРОКО СІ МІ ОБУЗТЕМ).

Ге) Приклад мембрани для виявлення гліканових залишків наведений на Фіг.11.

Чистота фракцій досягається за рахунок високоефективної рідинної хроматографії, де хроматограф Спготайодгарпе УМАТЕКЗ 6251 С, б 50 детектор з діодами УУАТЕКЗ 991, колонка МУБАС СА, тм Умови елюювання: 011 о о в 11 во юр юю з я |1рго во в | 1 ооо) 60

Тр А: 89,995 Н2О, 1095 ацетонітрилу, 0,195 трифтороцтової кислоти

Тр В: 10095 ацетонітрилу де

Загальна кіл-ть одиниць" (Кіл-ть протеїнів в мг Питома активність Коефіцієнт очищення |Вихід

Ресурєв щовиттаєтся 00п6ю00010000500001002ю000100000950000 вою

Порівняння питомих активностей природної шлункової ліпази собаки (п-Ї С) та рекомбінантної шлункової ліпази собаки (І-І С)

С етвсу деовоу ектвагована з тютюнового листя! 7 в) Очищення шлункової ліпази собаки з насіння рапсу 15 Активність рекомбінантної шлункової ліпази собаки, продукованої у насінні рапсу, визначають таким же способом, що і у випадку екстракції з листя. грамів насіння рапсу здрібнюють у рідкому азоті. Одержану муку знежирюють гексаном у ході першої мацерації при 42С при слабкому струшуванні протягом 12 годин. Надосадову рідину декантують і видаляють гексан. Муку промивають за допомогою 100мл гексану при слабкому струшуванні протягом 1/2 години при 42 720 при кожній промивці. Гексан видаляють шляхом декантації. Муку сушать у ротаційному випарнику (НЕІСОЇ РН 94200). Знежирена мука зберігається при -2026.

Екстрагування шлункової ліпази собаки проводять зі знежиреної муки мацерацією при 42С у водному 0,2М розчині Масі, рНн-З (1Н НС) протягом 30 хвилин з розрахунку 2мл водного розчину на 0,1г муки. Продукт с мацерації центрифугують при 100009 протягом 10 хвилин при 420.

Осад видаляють, надосадова рідина являє собою екстракт з насіння. о

Екстракт з насіння піддають діалізу проти буферного розчину 10мММ ацетату натрію, рН-4, 140мМ масі, Змм

КС, після чого вводять у колонку для імуноафінної хроматографії, що містить поліклональні антитіла проти шлункової ліпази собаки, одержані від морської свинки, зв'язані зі смолою (гідразид Амідде-ВІОРКОКЕ ч- зо ІМТЕКМАТІОМАЇГ, Іпс.).

Контактування між смолою та екстрактом з насіння триває ЗО хвилин при 49С при слабкому струшуванні. ікс,

Потім смолу промивають буферним розчином 10мМ ацетату натрію, рН-4, 150мМ Масі, ЗмМ КСІ, у кількості що є становить 10 об'ємів колонки. Шлункову ліпазу собаки елююють буферним розчином 0,2М гліцину, рнН-2,8, 150мМ масі, у кількості, що становить 5 об'ємів колонки. Зібрані фракції утворюють об'єм, що становить 1 о 3З5 об'єм колонки, та містять 1/20 частину по об'єму буферного 1М розчину тів, рН-9. Аналіз електрофорезом на ча поліакриламідному гелі у денатуруючому середовищі (див. Фіг.12) показує на наявність протеїну з молекулярною масою близько З7кДа.

ХІІ. Синтез ефірів жирних кислот

Досліди здійснюють з використанням нетрансформованого насіння рапсу, причому ліпазу використовують: « - або у вигляді іммобілізованого (ліпозим (МОМО)) або вільного (шлункова ліпаза кроля (ЩО 4002)) 8 с ферментативного препарату, й - або у вигляді трансформованих за допомогою гену шлункової ліпази собаки (тютюн Т14-44, 0,8595 експресії) "» насіння тютюну.

Реакції з етерифікації проводять при 372С протягом 16 годин у герметично зачинених колбах, приміщених на стіл-планшет для струшування (250об/хв). Як органічний розчинник використовують гексан, у якому розчинні -І жирні кислоти. Метанол додають у стехіометричному співвідношенні до теоретично розрахованої кількості триацилгліцерину, що міститься у насінні рапсу. о Переважаючим компонентом жирних кислот рапсу є олеїнова кислота, тому в якості стандарту вибирають ко метиловий ефір олеїнової кислоти. Контроль за синтезом здійснюють за допомогою тонкошарової хроматографії («ТСХ). Розчинником для міграції служить суміш з гексану, діетгилового ефіру та води (70:10:11). Проявлення

Ф пластинок здійснюється при нагріванні після пульверизації (590-ої) сірчаної кислоти в етанолі. "І Під час першого досліду, до 0,2г рапсового масла (0,22мілімоль) додають 27мкл метанолу (0,6ббмілімоль) і

О,02г ліпозиму: на одному рівні зі стандартним метиловим ефіром олеїнової кислоти не з'являється ніякої плями (Фіг.13, колонка 2).

У другому досліді, рапсове масло замінюють 0,5г здрібненого сухого насіння рапсу та додають 1мл гексану: у цьому випадку відбувається синтез складного метилового ефіру (Фіг.13, колонка 5). і) При наступних дослідах, використовують ті ж умови, але з наступними змінами кількість ліпозиму знижують ко до 0,006бг і ліпозим замінюють шлунковою ліпазою кроля (0,007г 90 4002). У цьому випадку синтез метилового ефіру олеїнової кислоти протікає у присутності ліпозиму, але не у присутності У0 4002 (Фіг.14, колонка 2). 60 Нарешті, в останніх дослідах, ліпазу використовують у вигляді трансформованого насіння тютюну (1г насіння тютюну). З'являється характерна пляма складного метилового ефіру (Фіг.15, колонка 3).

На закінчення слід відзначити, що описані вище результати свідчать про те, що при поєднанні екстрактів з насіння рапсу, спирту та рекомбінантної шлункової ліпази собаки, продукованої трансгенними тютюновими рослинами досягають реакції етерифікації, що приводить до синтезу складного метилового ефіру, який можна 65 використовувати як біопаливо.

Підписи до фігур

Фіг.1: нуклеотидна послідовність КДНК, кодуюча шлункову ліпазу собаки;

Фіг.2: амінокислотна послідовність шлункової ліпази собаки;

Фіг.3: нуклеотидна послідовність, що походить від кКДНК, кодуючої шлункову ліпазу собаки, та кодує наведену на Фіг.2 шлункову ліпазу собаки;

Фіг.4: нуклеотидна послідовність КДНК, кодуючої шлункову ліпазу людини, і амінокислотна послідовність шлункової ліпази людини;

Фіг.5: амінокислотна послідовність шлункової ліпази людини;

Фіг.6: імунологічний аналіз рекомбінантних поліпептидів, продукованих листям і насінням тютюну Хапійі, та /о насіння рапсу, трансформованих за допомогою конструкції рВІОС26, рВІОС25 і рВІОС29; Е - величина молекулярної маси; І з - шлункова ліпаза собаки; Е - тютюнове листя та СТ - насіння тютюну, трансформовані за допомогою конструкції РВІОС25; ОС - насіння рапсу, трансформоване за допомогою конструкції рВІОС29; Т - нетрансформоване тютюнове листя;

Фіг.7: імунологічний аналіз рекомбінантних поліпептидів, продукованих листям тютюну, трансформованим за 7/5 Допомогою конструкцій РВІОС25 і рВІОСА1, Е - величина молекулярної маси; І С - шлункова ліпаза собаки; 1 і З - листя тютюну, трансформоване за допомогою конструкції рРВІОС41; 2 - листя тютюну, трансформоване за допомогою конструкції РВІОС25; Т - нетрансформоване тютюнове листя;

Фіг.8: Імунологічний аналіз рекомбінантних поліпептидів, що продуковані листям і плодами томату, трансформованими за допомогою конструкцій рРВІОС25 і рВвІОС26:

Т1 - нетрансформований плід томату; 1 ї З - трансформовані плоди томату; 2 - трансформований лист томату;

Е - величина молекулярної маси;

І С - шлункова ліпаза собаки; сч тТ2 - нетрансформований лист томату.

Фіг.9: Аналіз шляхом електрофорезу на поліакриламідному гелі у денатуруючому середовищі (505-РАСЕ): і) 1. екстракт з насіння рапсу, 2. рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, продукована тютюновим листям, 3. природна шлункова ліпаза собаки, М зо 4. величина молекулярної маси

Фіг.10: Імуноблокування попереднього аналізу після переносу на нітроцелюлозну мембрану: ісе) 1. природна шлункова ліпаза собаки, с 2. рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, продукована тютюновим листям,

З. екстракт з насіння рапсу ме)

Фіг.11: Виявлення присутності гліканових залишків з поліакриламідного гелю після переносу на ї- нітроцелюлозну мембрану 1. екстракт з насіння рапсу, 2. рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, продукована тютюновим листям, 3. природна шлункова ліпаза собаки. «

Фіг.12: електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію у відношенні імуноочищення з с и-ВОЇ, продукованої насінням рапсу . 1. природна шлункова ліпаза собаки, и?» 2. рекомбінантна шлункова ліпаза собаки 3-6. неутримані фракції, елюйовані з колонки імуноочищення

Фіг.13: Проявлення пластинки ТСХ, 1 - рапсове масло, без ферменту, 2 - рапсове масло «т ліпозим, З - -І метиловий ефір олеїнової кислоти, 4 - насіння рапсу, без ферменту, 5 -насіння рапсу кт ліпозим

Фіг.14: Проявлення пластинки ТСХ, 1 і 4 - насіння рапсу, без наявності ферменту, 2 - насіння рапсу к о 304002, З - метиловий ефір олеїнової кислоти, 5 - насіння рапсу кт ліпозим. ко Фіг.15: Проявлення пластини ТСХ, 1 - моноолеїн, діолеїн, триолеїн, 2 - метиловий ефір олеїнової кислоти, 5ор З - трансформоване насіння рапсу «т насіння тютюну.

Ме, Список літератури

І 1. Ап еї аї. Ріапі РНузіо!., 81, 301-305 (1986). 2. Ап 0., Ріапі Рпузіо!., 81, 86-91 (1986).

З. Аоцибраїа М., Оапієї С, Ое Саго А., їмапома М.О., Нігп М., Загда Ї. ес Мегдег К., Еиг. У. Віоспет. 211, в 939-104 (1993). 4. Вага еї аї., Ріапі Мої. Віо!., 6, 347-357 (1986). (Ф, 5. Ведпагек 5.У. еї КаїкНнеї! М.М., Тне Ріапі Сеї, 3, 1195-1206 (1991). ка 6. Вего О.Е., Вего С.М., Віогесппоіоду, 1, 417-435 (1983). 7. Вегпага С, С.М. Асад. зсі., 28, 249-253 (1849). во 8. Вемап ева!., Майте, 304, 184-187 (1983). 9. Вемап М., Мисіеїс Асіаз. Кез., 12, 8711-8721 (1984). 10. Вігароїт Н.С., Боїу 9., Мисі. Асідв. Кев., 7, 1513-1523 (1979). 11. Водтег М.МУ. е( а), Віоспет Віорпуз.Асіа, 909, 237-244 (1987). 12. Вгадога М., Апаї! Віоспет., 72, 248 (1976). 65 13. Вгодеїйиз еїг аІ., РЕВ5 І еЦегв, 103, 93-97 (1979). 14. Вгодеїйив5, п: Моо-МХоцпуд М. (Ед), Віогеасіог Іттобрійлей Еплутез апа СеїЇв: ЕРипадатепіаїв апа

Арріїсайопв, ЕІземіег, І опагез (1988). 15. Сатіеге еї аі., Еиг. 93. Віоспет., 202, 75-83 (1991). 16. Сатіеге Р. Іацдіег К., Ватомтап А. Юоиспе( |. РіутепКко М. еї Мегдег К., зЗсапа. ..

Савзігоепіегоіоду, 28, 443-454 (1993). 17. Сіовзе 9.9., Коагідцег К.Г/.., Сепе, 20, 305-316 (1982). Ое І а Реппа еї аї., Майге, 325, 274-276 (1987). 18. Оепо еї! а)/., 9. Ріапі. Рпузіо!., 131, 315-322 (1987). 19. ЮОерісКег егйа!., У. Мої. Аррі. Сепеї., 1, 561-573 (1982). 20. Оерідпу- Тіз еї а/!., Ріапі. Мої. Віо!., 20, 467-479 (1992). 70 21. Ое 7оейеп еї аї., Мігоіоду, 172, 213-222 (1989). 22. Воспепу А.).Р. еї аі., Мисі. Ас. Кез., 13, 1891-1903 (1985). 23. Едеірацт еї аї., у). ої ІпіЇептегоп Кезеагсі, 12, 449-453 (1992). 24. Егапск еї аї. СеїЇ, 21, 285-294 (1980). 25. ЕШаці 9.9., Ківег у)., Кове К. еї Соптаї Г.., Віоїесппоіодіє, 5, 726-730 (1987). 26. батрого О.І., МіПег К.А. ег Ота К., Ехр. СеїЇ. Кев., 50, 151-158 (1968). 27. Сагдошгі У., Ріегопі ., Кіміеге С, Зацйпіеге 9-Р., Її оме Р.А., Загада Ї. е( Мегдег К., Савігоепіегоіоду, 91, 919-925 (1986). 28. Сагдошгі У. еї аіІ., Віоспет. Віорпуз. Асі., 1006, 255-271 (1989). 29. Сацрбіег еї аі., Мої. Сеп. Сепеї., 238, 409-418 (1993). 30. сіМег еї аї., 9. Вісі. Спет., 267, 16509-16516 (1992). 31. Спцегіпеаш Р., Миїййпеаих Р., Ріапі Моїесцшаг Віооду ГАВЕАХ, Стгоу К.К.О. (Ед), Міов. Зсіепійіс

Рибіїзпегз, Віаскмеї! Зсіепійіс Рибіїсакнопв, 121-147 (1993). 32. Напапап О., 9. Мої. Віо!., 166, 557-580 (1983). 33. Неїп К., Іпіегпайопа! Мееїйіпд ої Ргодисіоп ої Кесотрбіпапі Ргоїеїпз іп Ріапів, І еісевіег, р.22 (1994). сч 34. Неїгтега-ЕзігеїІа еї аї., Майшге, 303, 209-213 (19834). 35. Неїтега-Езігеїйа еї аі., ЕМВО .)., 2, 987-995 (19836). (8) 36. Ніак ех Ма, РЕВ5, 307, 71-75 (1992). 37. Ніак ег а), Майшге, 342, 76-79 (1989). 38. Нідо еї а1!., Віовсі. Віоспет., 57, 1477-1481 (1993). ї- зо 39. Ноіївіегз еї а), Мої. Сеп. Сепеї., 163, 181-187 (1978). 40. Ноггсп К.В., Егу У.Е., Нобїтапп М./.., Еісппоїк ОЮ. е( Кодеге 5.0., Зсіепсе, 227, 1229-1231 (1985). со 41. доцапіп еї аї., Ріапі 5сі., 53, 53-63 (1987). с 42. Кау еї а), Зсіепсе, 236, 1299-1302 (1987). 43. | аеттії О.К., Майиге, 227, 680-685 (1970). о 44. ім еї а!., Мої. Ріапі Місгоб. Іпіегасііопв, 6, 144-156 (1993). ї- 45. І ому О.Н., у. Віої. Спет., 173, 265-275 (1951). 46. Ма еї а!., Іпіегпайопа! Мееїйіпо ої Ргодисіоп ої Кесотріпапі Ргоїеїпз іп Ріапів, І еісевієг, р.39-40 (1994). 47. МеЕїгоу еї аії., Мої. Сеп. Сепеї., 231, 150-160 (1991). 48. Магх, Зсіепсе, 216, 1305-1307 (1982). « 49. Мавзоп еї а!., Ргос. Май). Асад. Зеї. О5А, 89, 11745-11749 (1992). в с 50. МаївиоКа К., Макатига К., Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА, 88, 834-838 (1991). . 51. МоіІопеу еї а). Іпіегпайопа! Меейіпо ої Ргодисіоп ої Кесотрбіпапі Ргоїеїпз іп Ріапі, І еісевіег, р.36-38 (1994). и?» 52. Могеаи Н. еї а), Віоспет. Віорпуз. Асі., 960, 268-293 (1988). 53. Мигакаті еї а!. Ріапі Мої. Віо!., 7, 343-355 (1986). 54. Мигазпіде Т. е( ЗКосад Е., Рпузіо!. Ріапіагит, 15, 473-497 (1962). -І 55. Мі еї аї., Ріапі ., 7, 661-676 (1995). 56. Кеїпа еї а!., Мисівїс Асіа Кезеагсі, 18, 6426 (1990). і 57. Кепагі у. еї Западомаї ІМ., Мей. Епгутої., 104, 455-460 (1984). ко 58. Киззеї О0., Іпіегпайопа! Мееїйіпод ої Ргодисійоп ої Кесотрбіпапі Ргоїеїпз іп Ріапів, І еісевіег, р.43 (1994). 59, Затрьгоок еї а). Моіесціаг Сіопіпу І арогаогу Мапиаї, 279 Еайіоп, Соїд Зргіпуд Нагбог І арогаїюгу Ргевзв (1989). б 60. Запіога .С., Тгтепаз іп Віоїесппоіоду, 6, 299-302 (1988). "І 61. Запдег еї аі., Ргос. Маї!. Асад. Зсі., 74, 5463-5467 (1977). 62. Зспгоедег М.К., ВогКизепісиз О.М., МаївиоКа К., МаКатига К. еї Каїкпе! М.М., Ріапі Рпузіої., 101, 451-458 (1993). 63. Зпоппеуадег Р., еї МоІдчагіг К., Асіа Рпузіо!ї. Зсапа., 9, 57-67 (1945). 64. Зі)топз ейа!, Віоїесппоіоду, 8, 217-221 (1990).

Ф, 65. Тпотаз В.К. еї Ргакн О., ТНеог. Аррі. Сепеї., 59, 215-219 (1981). ко 66. Тгиме еї аї., Віоїесппоіоду, 11, 1048-1052 (1993). 67. МапаекегсКроме еї а/!., Віобгесппоіоду, 7, 929-932 (1989). во 68. Моїпага РБ., 2. Кіїп. Меа., 42, 414-429 (1901).

Інформація про послідовність Мо 1:

Характеристики послідовності:

Довжина: 1528 пар основ

Тип: нуклеїнова кислота 65 Число ниток: однониткова

Конфігурація: лінійна

Тип молекули к ДНК для МРНК

Додаткова характеристика:

Назва/код:

Положення: 1...1137

Опис послідовності Мо1:

ТІС ТТТ СсА ЛАб СТТ САТ ССС АСА АС ССТ САЛА СТО АСС АТО ААТ АТА 48 м/ 55 рем вве біу Цув їеш Нів Рко Трг Ап Рко бій Ма! Тпг Мес деп т18 1 5 10 Й 15 "

АСТОСАб АТО АТС АСС ТАС ТОб ОСА ТАС ССА ССТ САС СлАА ТАТ СА стт 96 70 бБет біп Меб І1е ТЬх Тух ТІр біу Туг Рко д)аз Сі бій Тук біц Уді Й зо

СТО АСС ОДА САС СбТ ТАТ АТС СТТІ боб АТС САС АСА АТТ ОЄСТ ТАТ 005 1144

Чаї Тих бійц Адвр біу Тук І1їе це с1у 116 А5р АхЯ І1еє Рго тук сіу 75 Вод АЛА ААТ ТСА САС ААТ АТА СОС СОС АбА ССТ СТТ ОСА ТТТ ОТТО САА 192

Ака Пув Ап бек ОЗ Азп о Т1е Сіу Ату Агу Рго Маі Аза ре Гей біп зо 55 во

САС осстТ ТтТо СТО СА ТСА ССС АСА ЛАС ОТОС АТС ТСС ААС СТО СОС АС 240

Нів біу Пей Гей Аїа бег Азїа Тптг Аб5п о Тер І11е Бех Авп Бей Рго Ап 20 65 70 75 во

АС ОдосС сто бос ТТ АТС СТО ОСС о бАС о оСС боб ТАС БАС сто тоб сте 288

Авп бек Гея Аза Ре І1е Пемш АТа Ар Аза бСіу Тут Аєр Ма1ї Тгр Гей т 85 30 95 й с 25 бОЗ ААС АОС доб СОС ААС АСС ТО ССС Або дО ААТ СТО ТАС ТАС ТоО з36 с1у Ап Зег Агу б1у Авп ТвгоТгр Аза Агу Агу Аза еп Тут Тук бег Ге) 100 105 110

ССС САС ТСС ОТ САА ТтТС Тбо ост ТТС АС ТТ САС САС АТО ОСТ ААДд зв4

Рго Ар бет Маї бім Рпбе Ттір Аза Рпе бек Рре Ар бім Меї А1а Бу М 115 120 125

Зо Те)

ТАТ САС СТТ ССС ОСС АСС АТТ САС ТТС АТС ТТ АлАО ААА АС ОБА САС 32

Туг Азр МПех Рго Аїа Тпг І1е6 Ар Рпе Іїє цец цЦуз цуз Тир біу біп а с 130 135 140 й

А (зе)

САС АД СТА САС ТАС СТТ СОС САТ ТСС САС бос ДСС АС АТ бот тт «80 3Зз5 Аар Був ес Нів Тук Маї С1у Ніз 5ег біп біу Тіт Тпх 11є біу Рве - 145 150 155 160

АТС ОСС ОТТтТ тес АСС ААТ ССС дАб СТО СО лААА Сб АТС ААА СС ТтТС 5з2В

І116 Аза Ріпе Бех Тпх Азп Рко Цу5 Пем Аза ЦуБ Ахя Ії Гув тТах Ріє « 155 170 ії1т15 40 ТАТ ОСА ТТА ОСТ ССС сТТ ССС СС СТО ААб ТАС АСС ОбАА СС Сто ТТА 576 З с Тут Аїа Пец діа Рго Уаї А1їа Тпг Узі Був Тут Тік бій Твгобеч їв ц 180 185 190

Із

ААС ОААА СТО АТО СТО СТО ССтТ о тТоо ТТС сто ТТ АЛ СТІ АТА ТТТ ОСА 624

Авп о цув ем Мес Пем Маї Рко бек Рпе ем РБе. бує цеч Іїе Рре біу 45 195 200 205 . -

АдАС ОААА АТА ТТС ТАС ССА САС САС о тТтТС тТТТ САТ САА ТтТтТ Сто ОСС СС 56172 о Абзпоцув ЇІ1ї6є Рре Тут Рго Ні Ні РБе Ре АБр біп РПе рей А1їа Тпг 210 215 220 іме)

САС СТА ТОоС ТСС СОС бАС АСО СТО САТ СТО СТО ТОС АБС о дАС ОСС сто 720

Ге) бО1а Маї Суб Бек АкаФ бій ТпгІ маї Азр Грем цей Сув Бек Азп А1а цей 225 230 235 240 т що іме) бо б5

ТТтТ АТС АТТ ТСТ ОСА ТТТ САС АСТ АТО ААС ОТТО ААСОдтТО доТ сос тт тва впе І1Те І1є Сув б1іу Ре А5р Тіт Мес Ап Ген Ап Мебс бек Ага4 Гец 245 250 255 бАТ СТО ТАТ СТО ТСА САТ ААТ ССА СА ССА АСА ТОб СТ САС ДАС сте 816

Авр УМаї Тут Гей бБет Нів Авзп Рго А1а біу Тк бек Ма1і біп А5зп Уаї 250 265 270

СТС САС ТОС ТоС САС ОСТ СТІ ААС ТСТ Сбб ААС ОТТС САЛА ССТ ТТТ САС вва теза Ні Тер бех сій Аза Маї цуз бек б1у цЦуз Ре біп Аза Ріе Авр 215 280 285 .

ТО ОбА АОС ССА СТТ ОСЛО ДАЄ АТО АТО САС ТАТ САТ САС АОС АТО ССТ 912

Ттір сіу бек Рго Уаії біп Азп Меб Меб Ні Тук Ніз біп Зек мес рРхто 290 285 390

ССС ТАС ТАС ААС СТО АСА САС АТО САТ СТО ССА дТС СА сто ТС ААС 960 75 Вро Тух Тут Азп Пей ТБІ Ар Меб Нів Ууа1ї Рго І16е А1із Уа1і Тгр АБп 305 310 315 320

СстТ СОС АДС САС ТТС СТО ССО САС ССТ САС САТ СТІ САС СТТ тТтТб СТ 1008 біу сіу Азп Ар Бей Бец А1їа Азр рРБо Ні Ар Маї А5р Беч Бей Пец 325 330 335

ТСС АВО СТО ССС ДАТ СТО АТТ ТАС САС АСО ДАО АТТ ССТ ССТ ТАС ЛАТ 1056

Бег Був Мем Рго Ажп оБец І1є Тут Нів Акч Дуз І16 Ркго Рго Туг А5п 340 345 з50

САС ОТТЄ САС ТТТ АТС ТО СОС АТО САТ ССС ОССТ САА ССС СТІ ТАС ААТ о. 1504 сч нів Пец Авр Рпе І12 Тігр Аїа Меб Авр Аїа Рхго біп А1а МУаї Тух Азп 355 зво . 365 о

САД ОАТТ ОСсТТ ТСС АТО АТО ССА АСА САТ ДАТ ААС ТАСТТСТАСА ТТТААССААТ 1157 бі Іїе Ма1ї бех Ме Меє б1у Таг дор Ап Був 370 375 че ТАТТСТТТТА ТІСТТОСААЛ АТАССТТСТТ СТСТСАСАСО ТОСТТТТСТА ТСАТОТТТСА 1217 со

САСАСОСТОСА ТІСТТСССАТ ОСТТТТОАТТ ТСАСЛААТСТ СТТАОСАТСА ДСААТСТТТС 1277 сч

САТТОСТААТ ТТТТОСААТТТ ААЛАТОАТТТ ТТАААТТТОс СбСАТСТосСо ТосстТеАсТТ 1337 со

СОСТААСТОС ТСТОССТТСС СТТААСТСАТ САТСТОСОСО ТОСТАОСАТО сАсссттТоТа 1397 М тстасостос тососссосс сосостотост тетостосто стостоссос стостостест 1457

СТОСАСАСАС ССТСТСТСТС ТСТСАААТАЛ АТАЛАТАЛАТ ВААТАСТТАА ТААААТАААА 1517 «

ААВААВАААА А т1езе | шо - с Інформація про послідовність Мо2:

Характеристики послідовності. ч . и овжина амінокислот т 379

Тип: нуклеїнова кислота

Конфігурація: лінійна -І Тип молекули: протеїн (95) іме) (22) що іме) 60 б5 -д41-

Те рРПе біу Був цей Ні Рго ТБ Абп Рхо біц Маї ТЬг Меї А5п І1е 1 5 10 15 бек біп Меє І1е Трху Тут Тгр біу Тут Рго Аїа бі сії Тух бі Уаї 20 25 зо 9 . маї тпт бій Аєр біу Тут ІЗ рез б1у І1їе Авр Ага І1е Рго Тук біу 35 ай 45

Ахта Гуз Азп Бех бій Авп о Ї11е біу Ат АхЯ Рго Уаї Аіїа Ре Пем б1п 50 55 бо нНівз біу Пец йеч Аїа бек А1їа Тік о Азп о ТтроІ1іе бБег Азп ем Рго АБп 65 70 75 во

Азп обБеш Пем Аіа РПе І1їе Бех А1їа А5р Аза сіу Тут А5р Маї Тур ех 85 зо 5 с1у Ап Бех ДтЯ біу Азп Тк Ттр Аза Ат Агу Аза обей Тут Тут Бек 100 105 110

Рго Авр бет Уаї бій Рре Тер А1їа Рюе Бех РПе Ар біц Меє Аіїа Був 115 120 125 тук Авр цем Рхо Аїя Трптх І16 Абр Ре Ії Пем цує Був Тік біу бій 130 135 . 140

Авр пуз Пеп Ні Тук Ма1 б1іу Нів бех б1п біу Тк ТНк І1їе сбіу Рве 145 150 155 160 с т1е Аїа Ріє бек ТП Азп Рго був Пцеч Аза Цуз Агд Ії муз Тк рРпЄ о 165 170 1715

Тук Аїа Пей діа РКО Уаї Аза Тіпг о Уаї Був Тут ТПг біб Тк Цей Бей 180 185 180 у зо Аза! оцув Ппей Мес Гей Маї Рхко бек РрБе Ццец Рпе Був цей І1е Рре сіу 195 209 205 (Те)

Авп Був ІзЗе ВРпе Тух Ртго Ніз Ніб Ріе ре Ар Сіп РБе Грей Аза Тк се 210 215 270 со бій Уаї Сув Бех Ака4 Сійш тру Маї Ар реч Без Су Бех А5п діа Бем 225 230 235 240 -

РНе ї1є 11є Сув с1у Рпе Азр Тіт Меб дзп Пец Асп Мес Бех Аг Тем . 245 250 255

Ар Маї Тук Пес бек Ні Авзп орто Аїа б1іу Тік бег Маї біп дсп Маїс: « 260 265 «270 - лем нів Тхр бБет біп А1та Маї1 цу бек б1у цує Рре С)іп Аза Ре Ар с 275 280 285 ;з» и Ттр сіу Бек Рго Ма1! б)п Авп Меє Меє Нів Тух Ніз біп бер Меб рРго 290 295 оо рхо Тут Тух Ап обез Тіт Авр Ме нів Маї рхо ї11е Аїа Узі Тгр Авп - 305 з10 315 320 о біу сп1у Авп о Авр Гей без Аа АврорРго Нів Авр Уаї Аєр Гей пем Пед 325 330 335 ко б 50 Бех Пу5 Печ Рко Азп о Гей Іїе Тут Нів АгчЧ Пух Іїе Рго рРхго Туг Авп 340 345 350 в нів цей Ар Ріє І1е Ткр А1їа Мес Азр Аза Рго біп Аїа Мма1ї Туг Ап 355 зво 365 вв бід т1е Маї Бек Мес Мек Сіу ТНг Авр Ап Був й 370 375

ГФ) Інформація про послідовність Мо З: 7 Характеристики послідовності:

Довжина: 1048 пар основ во Тип: нуклеїнова кислота

Число ниток: двониткова

Конфігурація: лінійна

Тип молекули: ДНК (геномна)

Додаткова характеристика: в Назва/код:

Положення: 1...975

Опис послідовності Мое3:

АТА СОС СОС АСА ОСТ СТТ бСА ТТ ТТО САЛА САС осот тТТо СТО ССА ТСА А8

І1е сіу Ак Аху Рко Уаї А1їа Ре Пец біп Нівз сбіу цец Пец Аїа бег 1 5 10 15 5 .

ССС АСА АЛАС ОТОС АТС ТСС АдС СТО ССС ААС ААС дос сто осс ТС АТС ЗЕ

Аза Тахо Аза ТтроЇ1іе бек Ап цей Рбго А5п о Асп бех Пец Аза рре Іїе 20 " 25 зо й сто ОСС САС ОСС боб ТАС САС сто тоб сто боб ААС АОС Або СОС АС 145 її Аіа Агро ліва сіу Тут Азр Маї Тер рем Сіу Азп бех Аху О1у Абп з5 40 45

АСС ТОП СОС АСС АС ААТ СТО ТАС ТАС ТСо ССС САС ОТОС сто сАА ТТ 192

ТВІ Тгр А1іа Аху Акд Азп о Бец Тут Тук бег Рко Д5р бек Маї Сіц Ре 50 55 60 . тоб ост тТТС АСС ТТ САС САС АТО бСТ АДА ТАТ САС о стт ссс обсс дес 240 75 Тур Аїа Ре Бег Рпе Азр бій Мек Аза Був Тут Аєр Пец Ркго Аїа Трг 65 . 70 75 во

АТТ САС ОТТО АТС ОТТО АлЛО ЛАлЛ ОАСО бСА САС САС АС СТА САС ТАС СІТ РІ

І1їе Азр Рре ї1є Пец Пуз Був Тит біу й1іп Азр Пуз Гез Нів Туг Маї 85 зо 35

СОС САТ ТОС САС СОС АСС АСС АТТ ССТ ТС АТС СОС ТТТ ТС АС ДАТ 3136

Сіу Нів Бех біп біу Тих Тпг 116 біу Рпе І1ї1е Азіа рРпе Зек ТПг оАбп - 100 105 110

ССС во сто СО ААА СОб АТС ААА ОАСС ОТТО ТАТ ОСА ТТА ост ССС оТТ 384 с

Рго цу МБеч А1Тїа Муз Аку ї11е Пує ТВг РБе Тух Аїа ей діа Рго Ммаї 115 120 125 о

ССС АСС СТО ААС ТАС ДСС САА АОС ОСТО ТТА ААСОдАА СТО Ат сто сте 432

Віа тп о Маї пув Тух Тпу Січ ТБт Без Тео Абп о пуб Гей Меб пецй Маї 130 135 140 й й ї- сет тоб то СТО ТТО АЛАсо СТІ АТА ТТІ ОА ААС ОААА АТА ТТ ТАС СсСА 480 «со

Рто бек Рпе Пец Рбе Пу5 Без І1їе.Рбе біу Авп Гуз 116 Рре Туг Рко 145 150 155 160 с

САС САС ОТТО ТТТ САТ САА ТІТ Сто ССС АСС о бдо СТА тосС тос сос одо 5І:В со

Нів Нів ре Рпе Авр Сіп Рпе пемш діа Тр бій Уаз3 Суз Бех АхЯ бій 165 170 175 ї-

Со ста ОдтТ СТО сто тТОосС АСс ААС ОСС СТО ТТ АТС АТТ о ТотТ ОСА ТІТ 576

Тік Маї Ар рем пеп Суб бек Авзп Аїа Пем Ре ї1е І1е Сув біу рРБе . 180 185 180 - «

САС АСТ АТО ААС ОТТО ААС АТО АСТ ССС ТТС САТ СТО ТАТ СТО ТСА САТ 624 з

Авр ТПх Мет АБпП о їех деп Мес бех Аг Гей дер Уаї Тук Геї бех Нів с 195 200 205 :з» ААТ ССА ССА ОА АСА ТСО СТЕ САБО ААС ста СТО САС тоб ТоСс сдо ост вт72

Азп о Рго Аза б1іу ТБпх бек Маї бів Азп Маї Цей Нів Тхір бек сіп Аїа 210 215 220 й -І СТІ ААС ТСт СбО ААб ТІС САА ОСТ ТТТ САС тоб ССА ДОС о сСсА стТтТ СА 720 чаї був Бек б1у Буз Рпе біп Аза Рпе Азр Ттр сіу бах Ркго Уаї сіп г) 225 230 235 240 ке ААС АТО АТО САС ТАТ САТ САС АС АТО ССТ ССС ТАС ТАС ААС СТО АСА 768

Азп оМес Меє Нів Туг Нів біп Бех Мес Рго Рго Тухк Тут Авп Мем ТО

Ге) 245 250 255 і САС АТО САТ СТО ССА АТС ОСА СТ ТО ААСс сСТ СОС АС БАС То сто 815

Азр Ме Ні Маї Рхо Т1іє Аза Маї Тер Азп обіу С01у Азп о АБропем Гед 2650 2655 270 29 ССС бАС ССТ САС САТ СТТ САС СТТОТТо СТТ ТОС ААО Сто ССС ААТ Сто вба

Аза Авр рго нів Азр Уаї Ар йеш Пеп Бец бег Був цем Рко Азп Тем

Ф) 275 Й 2ва 285 І ко 60 б5 -А3-

АТТ ТАС САС дСС АЛ АТТ ССТ ССТ ТАС ААТ САС ОТТО бАС тТТтТ АТО ТОб з12

І1е Тук Нів Акад Муз І16 Рго Рко Тух Авп нів Пей Ар рРБе І1е Тгр - 290 295 зоо .

ССС АТО САТ ССС ССТ СЛА ССС СТІ ТАС ААТ САА АТТ ОСТТ ТОС АТО АТО зво

А1а мМмеб Ар А1Та Рго сіп Атїа Уаї Тук Азп біз І16є Маї бек Мебї Меє 305 ; 310 315 320

ССА АСА САТ ААТ АВО ТАСТТІСХТАСА ТІТАДССААТ ТАТІСТТТТА ТІСТТССАДА 1015 біу Тк Авр Ап Був 325

І

АТАССТІСТТ СТСТСАСАСО ТОСТТТТСТА ТСА 1048

Інформація про послідовність Мо4:

Характеристики послідовності:

Довжина: 325 амінокислот

Тип: амінокислота

Конфігурація: лінійна

Тип молекули: протеїн

Опис послідовності Мо4:

І1їе сіу Ак Ахуд Рго Уаї Аіїа РБе Пем Сів Ніб сіу беш Геї Аза Бек 1 5 10 15

Аїа тк доп Тгтр ЇІЗ1е бБег о Азп о Бечш рго Абп Абзп Бег Бей Ала рпе І1е 20 25 зо їеч Аїа Ар Аза б1іу Тут Авр Уаї Тур рей біу Ап о бег Ах біу Ап се 40 . 45 (5)

Тпк Тер о А1а Ак Ага Ап оцей Тух Тук бек Рго Авр бег Уаї бій Ре во 55 бо І

Тір Аза Ре бет Ре Ар бій Месб Аза Бук Тут Азр о Гем Рго А1їа ТБ - зо 65 7о 75 во (Се)

Ії АБ5р Ре ї11е цем пу Пуз Тпт сСіу сбіп Ар ПЦув Пез Нів Тут Маї . 85 90 95 с с1іу Нів Бек сіп біу Тік Твх Ії1е біу Ре Ізе діа Ре бег тЬк А5п со 160 105 110 35 . І в.

Рго Був меч діа цуз Ату 116 Муз ТПх рРлпе Тук Аїа Бей ліз Рго Чаї 115 120 125

Аїа тіх уаї Був Тух Трх біз Тр Без ред деп Бубз рез Меб цеч МУаї « 130 135 149 : - с Ркго Бек Ре їеч Ре пуб Бей ІїІ1е РПе біу Асп Буз І11е Ре Тук Рхо 145 150 155 160 и о а -і (95) ко (о) що ко бо б5 -дА-

Ні Нів Ре Рре Ар сіп РБе Гей Аїа Тпг Січ Уаї Сує Бех Акд 3 165 170 175

Тік Уаї Авр реч Тем Су бек Аєп А1з1а Це РПпе І1є Іїе Суз біу рРпе 180 185 190 5 .

Азр отТБт Меб Азп Бей Ап Мес бех Дгч Бей Абр Узі Тут Гей бег Ні 195 200 205

Аєп Рго Аза С1у Ті Бек Уа1і! б1іп Ав Уа)! Ге) Ні Тгр бег біп діа 210 215 220 чаї мПуз бек с1у Гу5 РПпе біп Аза Ре Ар Ттр с1іу бек Рго Маї сїіп 225 230 235 249

Аєп Меє Мес Нів Тут Ні біп бек Мес рто рго Тух Тух Аяп Сем Тік 245 250 255 й

Авр Мес Ні Маї Ркго І1е Аїа уаї Тхр Азп біу п1іу А5п др бе цей 260 265 270

Аза Азр Рго Ніб Азр Ма1ї Ар Ген Пцеч Пецй Бех Пує Пец Рхто Авп Беч 275 280 зв. пе Тут Ніз Атд Буз ЇІ1е Рго Рго Тут Абзп Нів Геч Авр РНе Іїе Тгр 290 295 300

Аїа Меб Ар Аза Ркго біп А1їа Уаї Тук Азп б) І1е Уд1і Бех Мес Ммеє за5 3І0 315 320 с діу Тих Авр Азп цу о 325

Інформація про послідовність Моб;

Характеристики послідовності:

Довжина. 1198 пар основ М зо Тип: нуклеїнова кислота (Се)

Число ниток: двониткова

Конфігурація: лінійна с

Тип молекули: ДНК (геномна)

Додаткова характеристика: о

Назва/код: ї-

Положення: 1...1125

Опис послідовності Моб:

СТІ САТ ССС АСА ААСОССТ САЛА СТО АСС АТС ААТ АТА АСТ САЛО АТО АТе 4з

Без Нів Рго Тк Ап Рго бій Ууаї ТргоМеб Азп ї1іє бех біп Меб І1є « 1 5 10 15 - . и? - (95) іме) (22) що іме) 60 б5

АСС ОТАС ТОС ОбСА ТАС ССА ССТ САБО СДА ТАТ САД СТТ СТО АСС САД САС зе

ТІ Тух Тгроб1у Туг Рко Аза сіє біз Тук біб Маї Чаї тітг бій А5р 20 25 зо

СЗТ ТАТ АТС СТ СОб АТС САС ДСЬ АТТ ССТ ТАТ обо ло АЛА ДАТ ТСА 144 сіу Тут Іїе реп сіу 116 Ар Ату І1е Рко Тук С1у Аху Був Ап Бек 15 Ай 45

САС ААТ АТА СС СО АбА ССТ СТЕ ОСА ТТТ ТТІС САД САС бот тт сто 182

Мч Азпог1іе с1у АхЯ Ак Рго Маї Аіа Рпе Пцем б1іп Ні5 біу без Гей 50 55 бо бСА ТСА ССС АСА АС ОТОС АТС ТС ААС СТО ССС АС АС дос сто СС 740

А1їа бет А1їа ТіПх Азп оТгр о Т1е бег Азп о Без Ро Азп Абзп бБег Бе Ала 65 70 75 во

ТТС АТС СТО ССС САС о сосС СОС ТАС ОбАС Сто ТОо Сто бОЗ ддСе дос доб 288 75 Рнпе ї16 Пем Аза Азр Аза біу Тух Азр Уаі Тгр Сем с1іу Аєп бет Ага 85 во 95 бОС ААС Одес ото ОСС доб Або ААЖ СТО ТАС ТАС ТСО ССС бАС тТССс сто ЗБ

С1іу Азп оТпх Тгр о А1а Аху Агу Аа Гем Тут Тух бек Рко Азр бех Маї 100 105 110 й

САА ТтІС тососстТ тт АОС ТТТ САС САС АТО ОСТ ААА ТАТ о Ссдо стт СОС 384 січ впе Тер Аза Ріе Бех Рпе А5в бі: Меї Аїа Ппув Тух Азр рез рРго 115 128 125

ОСС АСС АТТ САС ТІС АТС ТО ААФ АЛЛА АСС ССА САб САС ДдДО СТА САС 432 с

Аза Тит І1е Абзр Рбе І12е Ге муз цуб5 Тіт біу біп Ар був Гец Ні й 29 130 135 3140 : о

ТАС СТІ СОС САТ ТСС САС СОС АСС АСС дтТтТ ост ТтТе Ат бос Тіт тОес 480

Тух Маї біу НіБ бБет Сіп біу ТпІ ТПг ї11е біу Ріе Ізе Аїа РіБе бек 145 150 155 160 їм

СС ААТ ССС о АдАС СТО ССС ААА СО АТС АЛЛА АСС ОТТІС ТАТ ОСА ТТА ост 528 со

ТВЕ Ап о Рго Був еп Аїа Гуз Ат 1 Ду ТЕ Рпе Тук Аїа Гей Азїа 165 170 175 с

СсеОсС о стт ОСС АСС СТО АЛ ТАС АССПАА ДОС СТО ТТА ДАСОдДАА Сто АТО 576 со

РгОо Уаї діа тт уаї Гуз Тут Тпх бій ТпгоГей Гео Абп о Бу Бїец Ме 180 185 190 ч- сте сто сстТ тТсо ТТ Сто ТТС АВ СТТ АТА ТТТ ОА ААС о ААА АТА ІТС 624 їецй Уа1 Рхо Бех Рре Мей Рпе цу цеп ї11е Ріре б1у Азп Буб Іїє Рне 195 209 205 «

ТАС ССА САС САС ТІС ТІТ САТ САА ТТТ Сто бос СС САС СТА тоС Тос 672 з

Тук Рго Ніз Нів Рпе Ріє Азр біп Рпє Гец Аїа Тк бій Маї Суб Зег с 210 215 220 з СОС САС АСО СТО САТ СТО СІС ТС АБС дАС ССО СТО ТТТ АТС АТІ ТСТ т72с

Атя січ ТБгоУаї Абр еч Пец Су Бех Авп Аза Бей РБе І1є Ії Сув 225 .- 230 235 749 - (95) іме) (22) що іме) 60 б5 -Дв-

ОСА ТТТ ОАС АСТ АТО ААС ТТ ААС АТС АСТ СОС ТТ САТ СТО ТАТ Сто тев сФіу Рпе Азр ТБ Мес Азп Без Авп Мебє бех Акд Гей Авр Маї Тут Бем й 245 250 255

ТСА САТ ААТ ССА ОСА ССА АСА ТСо СТТ САС ААС ОсСТо СТО САС тТос тес 816

Бек Нів АБп о Ркго Аїа с1іу ТБк бет Маї біб А5п о Маі рез НіБ Тгр бет 260 265: 270

САС ОСТ СтТТ ААС ТСТ соб ААС ТТ САД ОССТ ТТТ бАС ТО бСА АС ССА аб4 бів Аза Уа) Був Бех сіу Пув Рпе біп Аза Рре Авр Тгр біу бБех Ркго 215 280 285 Й -

СТІ САб дАС АТО АТО САС ТАТ САТ САС АОС о АТо ССТ ССС ТАС ТАС АС зі2

Уаї бій дсп Меє Мес Нів Тук Ні біп бет Мес Рго Ркго Тут Тук Азп 290 295 зо0

СТО АСА САС АТО САТ СТО ССА АТС ОСА СТО ТОС ААС бот бос ААС САС збо 19 тем тег Ар Мес Ні Уа1ї Рго І1е Аза Маї Тур Аб5п с1у біу А5пПп о Азр зо5 310 315 з20

ТТ сто ССС САС ССТ САС САТ СТТ САС СТТ ОТТО СТ ТОС Адо сте Ссес 1008 пем рей АТа Ар Рго Ні Авр Уаї Азр Меч Гем Тем бег Пув Бем Рхто 325 . ззо 335

ААТ СТО АТТ ТАС САС АОС ДА АТТ ССТ ССТ ТАС ААТ САС ОТТО САС ТТ 1055

Азп рез ІТє Тук Нів Акад цує Ії Рко Рго Туг Азп Ні Без Авр Рпе зай 345 350

АТС тоб ССС АТО САТ ССС ССТ САЛ ССС о стТтТ ТАС ААТ САА АТТостІ тес 1104 с

І1їе Тгр Аза Ме Ар Аза Рго біп Аїа Маї Тух Авп січ Ізїе Ма1ї Бек . 355 з6о 365 . Го)

АТО АТО ОСА АСА САТ ЛАТ ААб ТАСТТСТАСА ТТТААСОААТ ТАТТСТІТТА 1155

Ммеє Меє сСіу ТІ АвБр Адзп Гуз 370 315 . у ттоттТосСААА АТАССТТСТТ СТСТСАСАСО ТОСТТТІСТА ТСА 1158 со

Інформація про послідовність Моб: с

Характеристики послідовності:

Довжина: 375 амінокислот і

Тип: амінокислота М

Конфігурація: лінійна

Тип молекули: протеїн

Опис послідовності Моб: «

Тез Ні Рко Тс о Азп Рго біл Маї ТБг о Мес Азп 16 бек біп Меї ї1є - 1 5 10 15

ТЛрпг Тут Ткросіу Тух Рго Аза сів біш Туг бій Маї Уаї тах б1іш Ар " 20 25 зо "» - (95) іме) (22) що іме) 60 б5 -Д7-

біу тух ї1є цей біу І1їе Авр Аг І1є Рго Тух б1іу Акд Муз АБп Бех 35 40 45 5сів Ап ї1е сСіу Акудр Ах Рго Уа! Аїа Рне Песп Сбіп Нів сіу цем їеци 50 55 во

Аіа бек Аза ТПх Азп Тгр о ї16 бехг А5п Темп Ртго Абп Аз бек їв Аза 65 7о 75 во

Рпе ї1їе бе Аїа Абр Аза біу Тухк А5р Маї Тгр Івец б1у Ап Бек Ах4а 85 20 95 10 с1у Азп о Твг оТтір Аза Ах Акд Авп о без Тук Тук Бек Рхо Азр Бек Уаї 100 105 110 біч Ре ТІр А1їа Ре бег РБє Азр Січ Меї Аїа Був Тух Авр Без рко 115 120 1725 15 20діа тик І1е АБр Рпе І1е цеп Бу Гуз Ту біу піп А5р Пух Гем Нів 130 135 140

Тут Маї бсіу Нів бБет бі біу Тіт ТБІ І11е с1у РБе І1є Аїа Рпе 5ех 145 150 155 160

Тік оА5п о Рго ув Ге Аза ШЦув Аку 116 Муз ТІ Рпе Тут Аіїа Печ А1ів 165 170 175

Рко Маї1ї Аїа ТБх Маї Пцуз Тух ТІ бі ТБх рем пе Азп о Буз цем Меє 180 185 190 с щі | 6) теп Маї Рго бек Рбє Пец РБре Був Гечи Іїе Рре біу Абп Ілу5 ї1е Ре 195 290 . 205

Тут Рго Нівз Нів Ре РБе дер бір Ре це Аза Тіт біз Ма1ї Суз 5ек 219 215 220 М 30 Ага біц Тіт о Уаї А5р о ПЦелз Без Сув бек А5зп Аза Пес Рпе І16е 112 Сувз (Се) 225 230 235 250 с

Сіу Рре Авр Тк Меб Азп Гей Ап оМеє бет Аг Пес Авр Маї1 Тух їеч : 245 250 255 со

З5 Бек Нів Аєп Рко А1а Сіу ТБтг Бек Ма1 біп Авп Ма1ї Гей Ні Тур Бек - 260 265 270 бСіп Аза Уаї Шу Зег біу Був Рре піп Аза Ріре Ар Тер б1у бЗет рРго 275 280 285 « 40 50уаї бій деп Мес Меб Нів Тух Ніб біп бек Меб Рго Рго Туг Тук Азп шщ 290 295 зо с "» Тез ТБІ Акр Меє Нів Уаї Рго І1е Аза Ма1 Тер Ахп с1у сіу Азп Ар й 305 й 310 315 320 55 Е - .

Тем рец дДіа Авр о Рго Нів Ар Уаї Абр без ГПем цей бек Цує Пец Рго 35 325 ззо й 335 - і Авпобей І1є Тут Нів Ага уз І11є р Щ з40 то Рко Тут АБп Ні Цей Авзр Рне го 345 350 5І1їє тТтІр Аза Ме де

Ге) 355 й в оА1а Рго біп Аза уаї тук Ап біч Х1е уаї бек зво 3655 во меє Меє сбіу Тнг Ар Ап пух 2: 370 375 ла ко 60 б5

ТТОТТТЗСАА ААТТАСАТСС САСАНАСОСТ СЛВСТОАССА ТСЛАТАТААО ТСВбАТСАТС во

АССТАСТООО САТАСССАОС ТОАООАКТАТ САВОТТОТСА СССЛАСАСОс ТТАТАТОСТТ 120

СССАТОССАСЬ СААТТОСТТА ТОССВОСМАА ААТІСАСАСА ВТАТАССССС СВСАССТОТТ і1ва

СТАТІТТТОС ААСЬСОСТТТ БСТСССАТСЬ ОССАСАВАСТ бсАТСТсовА СеТесеСАне 240

ААСАСсСтТоб ССТтІСАТеСТ боосоАсосс бостАсСолЛосс тотоастосСо СААСвОСсВоє зо

СОсСьАСАССТ сесссьссАС СААТСТОТАС ТАСТСССсСо АСТССоТеоА АтТтсТоСоСстТ 160

ТТСсАССтТТтТо АССАСЬТООС ТАААТАТОВС сттесеосоь ССАТТОАСТТ САТеТТОвАЄ аго 710 ВААВСССОАС АССАСАЛОСТ АСАСТАССТТ пСССАТТоос АосбсСАССВО САТІСОТТЕС чо

АТСОССТТТТ ССАССЛАТСС СААССТОССо АААСОСАТСА ВААССТТСТА ТеСАТТВОСТ 540

ССССОТТССсСА СССТОЛАСТА СсАСССВААСо СТОТТАВЬСА вАСТСАТеСТ сСсТооСсТТоо воа

ТТССТСТТСА ВОСТТАТАТТ ТОСАВАСААЛ АТАТТСТАСС САСАССАСТІ СТІТОКТСАА ебо

ТТТсСТобоСА сесаостаАтТо Сстсссбосно АСсстобатТо ТостетосАС СВАеооССсТо т2о

ТТТАТСАТТТ СТОСАТТТСА САСТАТОААС ЇТОВАСАТСА стесстТтТосА ТОТОТАТСТео 780

ТСАСАТАВТС САССАСОЛАС вТСССТТСАС АВсстОсСстТоо АСТОСТОССА обстТоТТвве вго тстосовьотТ ТоСАЛОСТТТ ТСАСТасосА вСОССЬсСТТсС вОВАСАТСАТ ОСАСТАТСАТ Зоо сьслосСьтет СТССсСТАСТА САВСсСТОВСЬ СВСАТОСАТО ТОССААТОбО АСтТОотесАНе ьо соТоссАвАСС востТтЄстТасс СОАСССТСвАС САтТсТтТеовСс ТтІтТтостттТс савеотосоС 1020

ААТСТСАТТТ АССАСАССАА САТТОСТОСТ ТАСААТСАСТ ТОСАСТТТАТ СтТОаСосеАТо 1ов2 сАТеССССТо АвОСОСТІТА СААТОЛААТТ СТТІССАТОВ ТОССВАСАСВ ТААТАВСТАЄ 1150

ЖТСТАСАТТТ ААОСААТТАТ ТСХТТІТАТТО ТТССАЛААТА ССОТТСТТсСТС ТОоВсАССсТо 1200

ТІТТІСТАТСА ТСТІТСАСВО АСОСТОАТТС ТРСССАТОСТ ТІТСАТТТСА СААТСТСТІ 1250

АССКТСААСА АТСТІТССАТ ТОСТААТТТТ ТОЛАТТТААЛ АТСАТТІТІТА ААТТТОСсОСС 1320 вустесстос СТСАСТТОше ТААСТОСТОТ СОСТТсСосСтТтТ вАСТСАТОАтТ СТобосеТтОС 1389 зо ТАОСАтТосАс сСІТотТотТстТ ббостостас Сообосесос стсТесттст сстостосто 1450 стТСссссстТс СтТосСтСТОто САСАСАСССТ СТСТСТСТСТ СЛАЛАТАААТА ААТЬАВТЬАА 1500 іс),

ТАСТТААТАА ВАТАААЛАЛА вАВААААВ -1щмЕ с

Фіг - рем бів осіу пуз Тез Ніз Рга Тег одяп о Рго бі УМаї тв Меє деп тї1е со 1 2 10 15

Бек біп Мес ї11е ТБ Тут Тер б1у тух Рсо діа січ біч Туд бі чаї - 2о 28 КІ чаї Тнг обі лер біу Тут 112 Гес біу т1є Азр дкчЯ Ї1е Ро Тут сіу 35 12 45

Ага Буз Авп Бех біс Аза Г1є сСіу вто дга Рго мМаї діа Рпе Пец сп

ЗО 55 во

Мі з1у Пец Пец ліа Бек ліз Тпг Ап ТЕр 116 Зег Ап Ме Рго доп « ез то 73 Но

АвпоШеї пс Аза бе 1126 реп А1Та Ар дія біу Туг Азр чаї Тгр Пе -о 85 99 95 с с1і1у АБп о бегт Асо б1у Ап Твг о Тгр діа Адгд Вк Азп о беш Туї Жук Зек 100 105 110 щ Гго АБр бет УМа1ї бзій вне Тгр А1та Ре 5о- Ре АБр о бій Неї Аїа Дух а 115 129 125

Тук АБроБез Рго А1та ТНг І18 Ар Ре Ії1е Пес Пув пуз Тс Сіу бід 130 135 1410

Авр оСув зви Нів Тук Маї біу Ніз Бек біл біу ТІ ТІ 112 біу пе 145 130. 1595 160 -І Ії А1їа Рпе 5Зег ТапгЕ Авп о Рко Пух цей діа рух Бка Т11е Гу ТБг Ре 1е3 170 175

Тут Віа Твуи Віа Ркео Ма! Ліза Тк Уа) уз Тур ТК бі ТлгоБез Гео (95) 180 185 190

Ав опув Пец Меє Пес Уаї Рко Беї вйв во Рме Пух Гец Тів Рбе с1у ке 195 290 205

АБп Був 11е Рібе Тук Рко Ніз Ну Рпе Рне Азр бів Рпе їец Аза ТНг 210 215 220 (о) січ уві Сув бЗеї Ага біс ТвгоМа! дар без обоз Суб баг о Авп Аіїа Тез 229 230 235 250 "І Рпе І1е ї1іеє Суз 01у Рпе Азр Тіг Мет д5побен Аза Мес зе Ася Сей 245 250 253

Авр Чаї Ту Пеп бЗеїг Ні Авп о Рго Аза Сбіу Так Зег Маї біп Веп чаї 260 255 270

Без Нівї ТкЕр Ззек біп діа Чаї Пув бЗек о біу Пух Рне біп діа вле дер 215 280 285

ТІр білу Бег Рго Ма1 біп АБп Меїє Меї ніз тут Нів біп зег Меб Рго

ГФ) 23а 235 300 -

Рго Тут Тук Азп о Гец Тк Ар о Меє Ніз Маї Рго І12 А1іа Уаї Тгр Бал зо5 310 315 зго ке с-іу сіу Авп АБр їв Гей А1а Азр Ркго ні Азр Маі1ї Аве Пец о рец пе з2з 13а 335

Зег о цуз Гео Рго Ап Гей 1)є Тут Ні дДго ГБує 110 вхо вго Тут Ап во зчо 345 130

Ні Пец Ар о впе ІТе Тгр діа Мес лор діа Рго бів діа Маї Туг Азп 355 360 365 е1із Ї1е2 Маї Бек мес Мес с1іу ТнІ АБ» дяп уз 170 375

Фіг? бо тТТОстТТТОблЛА ДОСТТСАТСС САСАААСССТ СлЛАСТОАССА ТОАДАТАТААО ТСАСАТСАТе ва

Асотьстосе САТАСССАоС ТОАбСАДТАТ СААСТТСТСА СССААСАСОС ТТАТАТССТТ 120

ОССАТССЬСА СААТТОСТТА ТОСОВОСАЛА ААТТСВОАОВ АТАТАСОССС САСАССТОТТ 180 сСАТТТТЕсС ААСАСОСТТТ ОСТООСАТСА СССАСАААСТ ООАТСТІСАВ ССТОСССААС зав

ААСАССсСсТоВ ССТТСАТеСТ осссслессс бостАСоАСОо ТОТоОоСТобо СААСлЛлОСАбо 200

СССААСАССТ СОбССАССАС СААТСТСТАС ТАСТОбСССС АСТосотТосА АТТСТебоСТ 380 тТТСАшсСТТТо АСсСАСАТоСС ТАААТАТОАС СТТССССССА ССАТТСАСТТ САТСТТОААО 420

КАВАСОСОСАС АССАСААССТ АСАСТАСОТТ обССАТТССС дооосАССАЄС САТТоОТТТС «ча

АТСОССТІТТ ССВССААТСС СААССТОСОО ЛААСОСАТСА ААЛОСТТСТА ТОСАТТАОСТ 40

ССССТТОССА СССТОААСТА САСССАААСС СТУГТААЛСА ААСТСАТОСТ СсстТоСетТтеб хо

ЕТССТотТІСА АССІТАТАТТ ТООАААСААлЛ АТАЖТТСТАСС САСАССАСТТ СТТТСАТсАА тай

ТТТСТСВССА СССАСОТАТО СТССССССАЄ АСбОТОСАТС ТОСТСТОСАЄ СААСОСоСТо -20

ТТТАТСАТТТ СТОСАТТТСА САСТАТОВАС ТТОААСАТОдД ОТСОСТТОСА ЖТОТСТАТСТо 780

ТСАСВТВАТС САБСАССААС АТСССТІСКО ААСОТОСТОС АСТОСТОССА босСТОТТАА «о тТСТСССААСТ ТССААОСТТТ ТОАСТООСОА АССССАСТТС МОААСАТСАТ ОСАСТАТСАТ еІчІМ

САСАССАТОС СТСССТАСТА СААССТОАТА САСАТОСАТо ТОСЕААТСОС АстТоТОВААЄ таб сстсосьвсо ВСТТОСТоб СБАСССТСАС сАТОТТСАСС ТтТтТосттто свдестосос 1726

ВАТСТСАТТТ АССАСАСОДА ОАТТОСТОСТ ТАСААТЕАСТ ТОСАСТТТАТ стобОссАТО :18о оАТОССССТЕ ААСССЯКТТА СААТОАВАТТ СТТТССЬТОА ТОБСАВСАСА ТАТАДОоТАЄ 145

ТІСТАБАТТТ ДАСОСААТТАТ ТСТТТТАТТО ЖЕТСАДААТА СеоТТСТТсВС ТтереАсотоо -206

ТТТТСТАТСА ТОТТТОАбАС АСБСТСАТТО ТТСССАТОСТ ТТТОАТТТСА САДАТоТОТ -156 с

АСБСАТСАВСА АТОТТТССАТ ТООТААТТТТ ТОААТТТАВА АТОАТТТТТА дАтТтТтТОобосс 13720 о

ВТСТоСсТбо СТОАСТТОСС ТААСТОСТСТ ООСТТООСТТ ААОТСАТСАТ сТообОВТеЄ -186

ТАССАТСсСАС ссттотТСтТстТ сосстестоє собоосособ зтсотосттст сстостесто --14е стоссосссто СТОСТоТОТо САСАСАССІТ СТІТСТСТСТ САААТАДАТА ААТАЛАТАлЛА "вас

ТАФТТААТАА ААТАААААЛА АЛАААЛАХ :32Е - «ріг.3

АСАСАЛАСАС ВАТСОСТААСТ АТТІСТОАСО ВААСТОСАОВ ТССААА дл тоб сте 5 ке,

СТТ ТТА АСА АТО ОСА дДОТ ТТ АТА ТТ СТА СТО Об дСТОАСА САТ ООССТ 103 с

ТТО ТТ ОССА ААв ОТТА САТ СОТ ОБОХ ВС ОССТ ОАА ОТО дСТ АТО ААСОАТТ 151 со

АСТ САД ОАТО АТТОАСТ ТАТ ТОС ССА ТАС ОСА ДАТ СЛА САА ТАТ СВА СТЕ 199 і -

ОТО АСТ ОДА АТ СОТ ТАТ АТТ ОСТТ ОАА Сто ААТ дСлОАТТ сот ТАТ СОС 2а7

ВАС ОААА ААТ ТСА СОб ЛАТ дСА СОС САС АСА СсТ остт стб тттТ ТТо САС 295

САТ бот тус СТТ ССА ТСА ЗСС АСА ААС тоб дТТ о Тсс вдо сто сССо АС заз «

АвСОВОСсОСТТ бос тт о дТТ Ста ССА бАТ ст сот ТАТ пАТ сто тоб Сто зві шщ с ССС о ААСОВОС АСА СОА ААС дос той Бо АБА СА ААС ОТТО ТАС ТАТ ТСА 433 п » ССА САТ ТСА тт САА ТТС тоб ОСТ ТІС дос ТІТ САТ ОЛА АТО ОСТ АВА 487 " ТАТ САС СТТ ССА ПСО АСА АТС САС ТТС АТТ ОТА ААС АЛА АСТ ССА САб 535 пда сво СТА САС ТАТ сТТ бос САТ тес СА шОС АСС ДСС АТтТ бот о ТІТ ваз -І ВуУТ бос отТТтТ о тТСс АСС ОААТ СОС ДОС СТО ССТ ААА АСА АТС АЛА ЛОС ТТо єз1 2) ТАЖ ост ств ост о ссСтТ о стт осо АСТ сто АВО ТАТ АСА ВАА ВОС о сТт АТА 679 г) ВАС ВАВ ОСТІ АСА ТТТООТТ ССТ САА ТОС Сто ОТТО ААС оТТТ о АтТА ТТ СОТ 727

САС АЛА АТА ТТС ТАС ССА ОСС АВС ТТ ТТТ ОбАТ Сад ТТтТ о СстТтТ ост СТ тт5 б ЯдА СТО ТОС тес СОТ САС АТО СТб о ААТ СТ СТТ ТОС АОС АДТ СОС ТТА 823 "м ТТТ АТА АТТ ТСТ бсА ТІТ ОА ОАСТ ААБ ААЄ ТТТ ААС о всс о АСтТ сос То ті

САТ сто ТАТ СТА ТСА САТ ОААТ ССА ПСА БА вАСТОТСТ СТТ САД ААС АТО 919

ТТС САТ тоб СС Сай сССТ о стТТ ААС ТСТ СОС ААА ОТТО САА сСТ ТАТ бАС 257 о то всв вдс СсА ат САП АКТОАбО АТЄ САС ТАТ САТ САС ТОСОСАА ССТ 1015

ССС ТАС ТАС ВАТ ФТО лАСА ОСС дТО ЛАТ СТА ССА АТТ ССА ста Тбб АФ 1063 о сот бос ААб ОдС сто ТТ ОСТ САС ССС САА САТ стт бос стт о тто Ст 1111 во ЄСЬ АВА СТО ССС дАТ Стт АТТ ТАС САС ААбосАС АТТ о ССТ ТТТ ТАС ват 1152

САС ТТ САС ТГТ АІС ТОС ОСА АТ САТ ОСС ССТ САА САА СТІ ТАС ААТ 1207

САС АТТ СТЕ ТСТ АТО АТА ТСА пал сдтТ АВА ОВАй ТАСТТСТОСА ТІТАААСААТ 1760

ТАТОСОТТТС ТТТТТССААА АТАСТТІТАТТ СтСТСАТАТА ТАСТАТТТТС АТААтТОТТТа 1120

АСвТОСАСТВ СТІСТІТСТО ТАВТТТТОдДС ТТТАСАААТВ ТАТТОоОС 1357 бо . Фіг І

Мес Ттір рем Пец о цев ТВі ме А1ї3 бет еп І1е ет Маї цей б1іу ТБг 1 5 10 15

ТІ нів с1у Печ Ре б1іу Був Ппеш Ніз вБго б1у Бет гРго біз Уаї ТЕ 22 25 за меж Азп Іі бек біл Меб 116 Тнг Тук Ткр біу Туг Рго Азп о Сіц с1ш 35 4й 45 тук біш чаї Уаї ТвгІ б10 Ар біу Туг І16 Пец обі маї Ап дка 116 що 5 БО

Бта Тук піу Пух мук доп Бек біу йзп Тато бпіу бій Аго рго уаї Чаї 5 7 75 Во

Ттпе дез біп нії сіу ем цем дія бЗеїт А1а Тобто длл Тер І1Є6 Беїх Аоп 285 за 35 їач о РБго Абп о лЛяп бек обех А1Та Ре Х1ї6є реч лід Авроліа Ру Тук Авр 108 105 110

Ма1ї тТЕр Іеч біу Ап о Зег Ага біу д5п Тпх тТкроАїа дхо Ат Ап Гви 115 120 125

Тут Тухт Бетї рко Азр Бог о Ма1 бі Ре Тгр о діа РБе баг Рре Ар п1ч 130 135 їла

Ме Аїа цус Ту Азробеи Рго діа ТпЕ 116 Азр о Ре ті Маї ПЦуз Був 1415 130 155 160

Твтг біу бід цуз біп о пеш нів Тух уаї с1у Нів Бех біп біу ТБготву 165 170 175

Т1с сФіу вне І12 дія вне беї ТБІ Ап РгОо 5еї їеу дія уз Аг ї12 180 185 190

Туз Таро Рпе Тут лід Пец дія Бго Ма1 діа Так оМа1! цЦує Тук Тр губ 195 200 205

Бег Пеш тТ1те Аяєп ув Гем дк Впе У31 Рто зіп Бек цем пе Бук Ре 210 215 220

І16 ге сіу Азр Цуз 118 Блпе Тут Бто Нів Азп о ВБе Рбе Авр бій Ре 225 230 215 240

Пец від тТпІ Січ Ма1ї Суя бєг Ак бід Ме Іли Ап Іли Ту Суз Вег 245 ав5а 255

АвпоАіа Тез Ре І1е 118 Суз біу пе дер Бек цу ДЛюп Бре дяп Тк 260 265 27

Бег Ат цем дор Уа! Туг о йем Зег Ні зп Рго Азїа біу ТБ Бек чаї 275 280 285 стіп о Асп Мет Ре Ні Тгр ТнтІ біп дія Ма1 пуд бет с1у цув Бре 01п се 259 235 зоб віа Тут АБВ Тгр біу Бег во Уаї бід Авд Ат Мес Ні Туг Авр бід Ге) зо5 зо 315 329

Бек піп Бко Бк Туг Тук деп уа1 ТБголіа Ме Азоп Ууаї Рго іє Дів 385 330 115 чаї ТЕр Анп о сіу 51у цу Ар ем Пец Аїа АБрорго б1п АБр уаї Зіу. 340 345 за50 пем Шез БПечм о Бка Цулоцец рко Ап оцеч Т1е Тук Ніб Му З1іМ Ізв рго - 355 250 155

Ре Тук дп Нів Пцеч Азр Рре І1їє Тгр лЛіа Мес Авр Азта бга бій ої Ге) 3та 375 зво чаї Тук Ап АвроТів чаї бЗет Меє 16 бЗек бла аеро був Був зв5 зво 395 . се

Фіг с вет во псом пе т тора ето ес тт ар кА у а вн ке о ран пила и ЕНН в.

Кн ден ИН О ДИНТКИЮ б пере ует г ІН 424 Вовна я «

ЕЕ в пан и ви ло 31 ЕК я вв Ин о)

ЕПаган кер потен сх Тон ут и

КИ в и и с пах с дане ОН и и й й дожн. шкн в з» кн орні он ОНА " їа | ВИ у кн ово р 7 Тон В а: пен ке р а АННИ В В В - - Мн вв не ово мн сс ст1іСс Іс Е Е Е КС ІСТ (95) - - ни т

Ге» 20 Фіг.б " Кок ват сн ключ 140 " поле В а

На топ п В а ОН ; ен нн НН ВЗ

ЛЮДИНІ. лю

КС да ит 59 втекти п НИ 43 ах ПН ве ДН НД (Ф, Коен нак ев йо зе нн ЗО 60 ПО а ев, и ню 1. 2 3З31СЕТ

Ффіг.7 б5 що й - ння о,

Мах Пи в) перли с но

Що. Де не авЕ ув» ках е не ск

В ДАНЕ о: ля ване

Етно Ірен гак тв; неон ля НИ я

Я п ї ет шо дл с | 83 я зрве дк де, станах сни, сі сла хх 7 о

ЕН Есе нан у ікс зі пох с сія сен ан (нн ная ни чаш В У лю 43 пі Бена сте ин ; п пох пеки пе тка ТЕО Енн ше 19) п х о - партія ІДУ лк Кл пів

Й ПЕТАКНКл она яка ле

СОТ? З КН 2 ка

Ї тій р

НЯ Зк с зх КК ря ТА ера че лю Ей Бе 9.-

Тк ше 4... 4

С нин Мснтк Его Ну 67 ке й й ОВНА шо с Ед Еснях ла... Щи ле т ус ЕЕ онко: 2 кит; оч еле зона З й ян ЕХ

Те. Ера М уся тя ск яв Пе етья 0 З у п й сук Я щі вену снах мак зи: ет вк дн що

ПЕК ДАК рр вики в «вия и Ко нові, В а кН соя ее м Гу ні зо Е ет вина ния ЕКО я -20 ста п свееМ ки ше пає зе ТА ТеВ ення і лік со пу с ! ян ПЕН ЗА; х Я в ПВ, шани т -14 щі тари спе Кр ре ЕРИ - ча пекан ж с дев

Ве АУНУ ре и». така ла, ПД се ге т туге щш ;

КК Ен й У

ТА Сеня я 1 з Фіг.о "

З

Ї ие свя

Дкачеея ден й ее поса жил с и ю с у БО и св

Ц векжя -чіве Петрос ще Гео)

Й в шу ни, Куя а 5 ЗАКЛИКИ й Кен

Клін КН АИННЕ ій МИ а жо че АВ дея ч- дк ПЕІАЕТКНІ я:

БОЖЕ ре я. у ек ОК ер їй Ір іти ся Гея -яійння ДУ и й мав ан ПОН с

Іде Кавун я ие ве сю ! о не Ееж ен ук Я те снення ти акне -

Кене ь Коди Те: «шт а ко Я заденьЯк Баки

Пе ли МАН теж З

Ех ТЕХ кер

Ка Сини ен

Ге») 50 гоп ува їх і «СИ тк зе : ПНЯ дл "м Я

Фіг.10 60 б5 й ; . . : Й з т й й Н зв А У й ооо як 70 божа СТИ «Еш пря й ударних ПЕТ п Вели рекет не Іо веи «Ірен вв

Евро

Веди АП Удн

Ки 75 | ШЕекляв в о енд есте тин «винен Кей

Еге МНК певен: га со ув пен еату НИ ен пасм ок у ви КВ ву ре я

Фіг.11 49--як- | ДИВНЕ но нн

У Ди. п жна | ЕК ВЕНИ ше 37 ЗооеЕуАт Є ун в КН М

Аж ке ДИ і !

Кк и ВИ Н

Тилаздіваа 2 н

Фа ї-о ше ди а Й с ва НН.

Ярі тя вв та і ДНИНИ со

ТОЖ ЕЕ Нед - орви оо и і ви ВИЙ

Зо ЕЕ ЕЕ их ЕВ

Фіг.12 з» с с ( ) о )

Фо "і бо .

Фіг.13 б5

НИ

0 о а -е що 2 3 4 5 о Фіг.14 Ге (8) (в) о в) д їм (Се) с со і - о л « о а с - с . и? в і 23 -І

Фіг.15 (95) іме)

Claims

Формула винаходу

"А 1. Рекомбінантна нуклеотидна послідовність, що містить, з одного боку, кКДНК, наведену на фіг. 1, і яка кодує шлункову ліпазу собаки (ІС), наведену на фіг. 2, або нуклеотидну послідовність, що походить від цієї КДНК, зокрема, шляхом додавання і/або супресії, і/або заміни одного або декількох нуклеотидів, таку як Ннуклеотидна послідовність, наведена на фіг.

З, причому вищевказана похідна послідовність здатна кодувати поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична послідовності СС, наведеній на фіг. 2, або Ф, поліпептид, що походить від Ї5С за рахунок додавання і/або супресії, і/або заміни одної або декількох ко амінокислот, причому ця поліпептидна похідна має ліпазну активність, і, з іншого боку, елементи, що дозволяють рослинній клітині продукувати поліпептид, кодований вищезазначеною кДНК або вищезазначеною бо похідною послідовністю, зокрема промотор і термінатор транскрипції, що розпізнаються транскрипційним апаратом рослинних клітин, яка відрізняється тим, що вона містить: - нижче вищевказаної кКДНК або її похідної послідовності термінатор роїуА 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (Саму) або термінатор роїуА МОЗ Адгобвасіегіт (тегасіепв; - вище вищевказаної КДНК або її похідної послідовності, промотор 355 або подвійний конститутивний 65 промотор 355 (раз55) Саму, або промотор рСКИ гена круциферину редьки, або промотори рОЕАЇ і рОЕгЕАб Агарідорзіз (паійапа, або химерний промотор раР.

Адгорасіегіцт (Штегїасіепз, або промотор рАК-ІАК рису, або -Б4-

ру-зеїновий промотор кукурудзи.
2. Рекомбінантна нуклеотидна послідовність за п. 1, яка відрізняється тим, що вона містить послідовність, яка кодує пептид, відповідальний за адресацію рекомбінантної (з і/або пептидної похідної, або пептидних похідних у певну ділянку рослинної клітини.
3. Рекомбінантна нуклеотидна послідовність за будь-яким з пп. 1 і 2, яка відрізняється тим, що її вибирають з наступних послідовностей: - послідовність (що позначається як разбо5-РЗ-І С), яка містить у напрямку 5'-з 3 промотор разб55 вірусу Саму, послідовність, яка кодує сигнальний пептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, 70 наведена на фіг. З, потім - термінатор роїуА 355 вірусу СаМУ, - послідовність (що позначається як разо55-РРБ-ІЇ С), яка містить у напрямку 5"-з 3 промотор разь55 вірусу Саму, послідовність, яка кодує препропептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, наведена на фіг. 3, потім термінатор роїуА 355 вірусу Саму, - послідовність (що позначається як разо5-Р5І 1-0), яка містить у напрямку 5-33 промотор разз55 72 вірусу Саму, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (ІСІ) (а саме, послідовність, що складається з 19 перших амінокислот, при цьому 9 нуклеотидів, що кодують З останні С-термінальні амінокислоти, виключаються), за якою відразу йде кКДНК, наведена на фіг. 1, потім термінатор роїуА 355 вірусу Саму, - послідовність (що позначається як рСКО-РБ-Ї ОС), яка містить у напрямку 5-53 промотор РСКИ круциферину, послідовність, яка кодує сигнальний пептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, наведена на фіг. З, потім термінатор роїуА 355 вірусу Саму, - послідовність (що позначається як рСКИО-РРБ-Ї С), яка містить у напрямку 5-33 промотор РСКУ круциферину, послідовність, яка кодує препропептид спораміну А, за якою відразу йде нуклеотидна послідовність, наведена на фіг. З, потім термінатор роїуА 355 вірусу Саму, с - послідовність (що позначається як РСКО-РБІ СІ-І С), яка містить у напрямку 5-33 промотор рРСБО (У круциферину, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, наведена на фіг. 1, потім термінатор роїуА 355 Саму, - послідовність (що позначається як рОЕА!І-РБЗІ сі -І (3), яка містить у напрямку 5-33 промотор рОЕАЇ М зо Агарідорзіз (Наійапа, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, наведена на фіг. 1 або 3, потім - термінатор роїуА 355 вірусу Саму, ре) - послідовність (що позначається як РОЕАб-РБІ І-І С), яка містить у напрямку 5-33 промотор рОЕгАб сч Агарідорзіз (Наійапа, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, наведена на фіг. 1 або 3, потім - термінатор роїуА 355 вірусу Саму, і. - послідовність (що позначається як рАК-ІАК-РБІ І-І С), яка містить у напрямку 5-33 промотор рАК-ІАК ї- рису, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, наведена на фіг. 1 або 3, потім - термінатор роїуА 355 Самм або термінатор роїуА МОБ бактерії Адгорасіегіїйт Кштегасіепв, « - послідовність (що позначається як ру-зеїн-Р5І СІ -| С), яка містить у напрямку 5'-з 3 ру-зеїновий промотор кукурудзи, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (така, як описана - с вище), за якою відразу йде кДНК, наведена на фіг. 1 або 3, потім - термінатор роїуА 355 вірусу СаМУМ, "з - послідовність (що позначається як р у-зеїн-РЗІ І-І ЗС-КОЕЇ), що містить у напрямку 5-33 ру-зеїновий " промотор кукурудзи, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (така, як описана вище), за якою відразу йде кДНК, наведена на фіг. 1 або 3, потім послідовність, що кодує тетрапептид КОБЕЇ, і далі - термінатор роїуА 355 вірусу Саму.
- 4. Рекомбінантна нуклеотидна послідовність, яка містить, з одного боку, КДНК, наведену на фіг. 4, і яка со кодує шлункову ліпазу людини (І СН), наведену на фіг. 5, або нуклеотидну послідовність, що походить від цієї КДНК, зокрема, шляхом додавання і/або супресії, і/або заміни одного або декількох нуклеотидів, причому ко вищевказана похідна послідовність здатна кодувати поліпептид, амінокислотна послідовність якого ідентична б 20 послідовності /ЗН, наведеній на фіг. 5, або поліпептид, що походить від ЇЗН за рахунок додавання і/або супресії, і/або заміни одної або декількох амінокислот, причому ця поліпептидна похідна має ліпазну "м активність, і, з іншого боку, елементи, що дозволяють рослинній клітині продукувати поліпептид, кодований вищевказаною кДНК або вищевказаною похідною послідовністю, зокрема промотор і термінатор транскрипції, що розпізнаються транскрипційним апаратом рослинних клітин, яка відрізняється тим, що вона містить: 29 - нижче вищевказаної кКДНК або її похідної послідовності термінатор роїуА 355 вірусу мозаїки цвітної ГФ! капусти (Саму) або термінатор роїуА МОЗ Адгобвасіегіт (тегасіепв; - вище вищевказаної кКДНК або її похідної послідовності промотор 355 або подвійний конститутивний о промотор 355 (раз55) Саму, або промотор рСКИ гена круциферину редьки, або промотори рОЕАЇ і рОЕгАб Агарідорзіз (паійапа, або химерний промотор раР. Адгорасіегіцт (Штегїасіепз, або промотор рАК-ІАК рису, або 60 ру-зеїновий промотор кукурудзи.
5. Рекомбінантна нуклеотидна послідовність за п. 4, яка відрізняється тим, що вона містить послідовність, кодуючу пептид, відповідальний за адресацію рекомбінантної Ї03С і/або пептидної похідної, або пептидних похідних у певну ділянку рослинної клітини.
6. Рекомбінантна нуклеотидна послідовність за будь-яким з пп. 4 і 5, яка відрізняється тим, що її вибирають 62 з наступних послідовностей:

- послідовність (що позначається як реРр-РБІ ОН-І ОН), яка містить у напрямку 5'-з 3 промотор роР бактерії Адгорасіегішт (Штегасіепе, послідовність, яка кодує сигнальний пептид шлункової ліпази людини, за якою відразу йде наведена на фіг. 4 нуклеотидна послідовність, потім термінатор роїуА 355 вірусу Саму, - послідовність (що позначається як реР-РЗІ РН-Ї СН), яка містить у напрямку 5'-з 3 промотор роР бактерії Адгорасіегішт (Штегасіепе, послідовність, яка кодує сигнальний пептид шлункової ліпази людини, за якою відразу йде наведена на фіг. 4 нуклеотидна послідовність, потім термінатор роїуА 355 вірусу Саму, - послідовність (що позначається як реР-РБІ І-І СН), яка містить у напрямку 5-33 промотор роР бактерії Адгорасіегішт (штетасіепв, послідовність, яка кодує частину сигнального пептиду шлункової ліпази кроля (така, 70 як описана в п. З формули винаходу), за якою відразу йде наведена на фіг. 4 нуклеотидна послідовність, потім термінатор роїуУА 355 вірусу Саму.
7. Вектор, зокрема плазміда, для трансформації клітин, що містить нуклеотидну послідовність за будь-яким з пп. 1-3 у сайті, що не є необхідним для Її реплікації.
8. Вектор за п. 7, який відрізняється тим, що його вбудовують у клітину-хазяїна, зокрема в бактерію, таку як Адгорасіегічт Кшптегасіепв.
9. Вектор, зокрема плазміда, для трансформації клітин, що містить нуклеотидну послідовність за будь-яким з пп. 4-6 у сайті, що не є необхідним для Її реплікації.
10. Вектор за п. 9, який відрізняється тим, що його вбудовують у клітину-хазяїна, зокрема в бактерію, таку як Адгорасіегіцт (Штетасіепв.
11. Спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази собаки (ІС) у вигляді активного ферменту або одного або декількох поліпептидів, що походять від цієї останньої, зокрема, шляхом додавання і/або супресії, мМабо заміни однієї або декількох амінокислот, причому ця або ці поліпептидні похідні мають ліпазну активність, який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію рослинних клітин, зокрема, за допомогою клітини, яка, у свою чергу, трансформована с вектором за п.7 з метою інтеграції у геном цих клітин рекомбінантної нуклеотидної послідовності за будь-яким о з пп. 1-3; - за необхідності, одержання трансформованих рослин з вищевказаних трансформованих клітин; - рекуперацію рекомбінантної шлункової ліпази собаки (105) і/або згаданої вище, або згаданих вище поліпептидних похідних, продукованих у вищевказаних трансформованих клітинах або рослинах, зокрема, ї- шляхом екстракції, за необхідності, з наступним очищенням. «со
12. Спосіб одержання рекомбінантної шлункової ліпази людини у вигляді активного ферменту або одного або декількох поліпептидів, що походять від цієї останньої, зокрема, шляхом додавання і/або супресії, і/або с заміни одної або декількох амінокислот, причому ця чи ці поліпептидні похідні мають ліпазну активність, со який відрізняється тим, що він включає: - трансформацію рослинних клітин, зокрема, за допомогою клітини, яка, в свою чергу, трансформована і - вектором за п.9 з метою інтеграції в геном цих клітин рекомбінантної нуклеотидної послідовності за будь-яким з пп. 4-6; - за необхідності, одержання трансформованих рослин з вказаних вище трансформованих клітин; « - рекуперацію рекомбінантної ліпази людини та/або вказаного або вказаних вище поліпептидних похідних, продукованих у вказаних вище трансформованих клітинах або рослинах, зокрема, шляхом екстракції, за т с необхідності, з наступним очищенням. ч
13. Спосіб трансформації рослин або частин рослин, зокрема листя і/або плодів, і/або насіння, і/або » клітин рослин, який включає трансформацію зазначеної рослини однією або декількома рекомбінантними нуклеотидними послідовностями за будь-яким з пп. 1-6, шляхом стабільної інтеграції в їх геном, причому зазначені рослини або частини рослин за необхідності містять також рекомбінантну шлункову ліпазу собаки і/або - людини, і/або одну або декілька поліпептидних похідних, для одержання рослин або частин рослин, що о називаються також рослинами або їх частинами, зокрема, листям і/або плодами, і/або насінням, і/або клітинами рослин з ферментативною активністю, зокрема з ліпазною активністю, що вибирають з рапсу, тютюну, кукурудзи, їмо) гороху, томату, моркви, пшениці, ячменю, картоплі, сої, соняшника, салату-латуку, рису, люцерни та буряка або б 20 частин цих рослин.
14. Ферментативно активна рекомбінантна шлункова ліпаза собаки, амінокислотна послідовність якої "м наведена на фіг. 2, або поліпептиди, що походять від цієї останньої, зокрема, шляхом додавання і/або супресії, і/або заміни одної або декількох амінокислот, такі, як поліпептид, обмежений амінокислотами, розташованими у позиціях 55 і 379, що називається також поліпептидом ( А 54), і/або поліпептид, обмежений 22 амінокислотами, розташованими в позиціях 5 і 379 на фіг.2, що називається також поліпептидом ( А 4), причому Ге! ці поліпептидні похідні мають ліпазну активність, такі, які одержують, по суті, у чистому вигляді згідно зі способом за п.11, причому цей спосіб включає стадію очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки і/або де вказаної вище або вказаних вище поліпептидних похідних, зокрема, шляхом хроматографії одержаних ферментативних екстрактів. 60
15. Рекомбінантна шлункова ліпаза собаки за п. 14, яка використовується для одержання харчових продуктів, зокрема функціональних харчових продуктів, призначених, зокрема, для полегшення абсорбції рослинних або тваринних жирів, що поглинаються здоровим індивідуумом або індивідуумом, ураженим однією або декількома патологіями, що впливають або не впливають на ступінь продукування шлункової та/або панкреатичної ліпази.
16. Ферментативно активна рекомбінантна шлункова ліпаза людини, амінокислотна послідовність якої 65 наведена на фіг. 5, або поліпептиди, що походять від цієї останньої, зокрема, шляхом додавання і/або супресії, і/або заміни одної або декількох амінокислот, такі, як поліпептид, обмежений амінокислотами, -58в-

розташованими у позиціях 74 і 398 на фіг. 5, що називається також поліпептидом ( А 541! ЗН), і/або поліпептид, обмежений амінокислотами, розташованими в позиціях 24 і 398 на фіг. 5, що називається також поліпептидом (2 4! СН), причому ці поліпептидні похідні мають ліпазну активність, такі, які одержують, по суті, у чистому вигляді згідно зі способом за п.12, причому цей спосіб включає стадію очищення рекомбінантної шлункової ліпази собаки і/або вказаної вище або вказаних вище поліпептидних похідних, зокрема, шляхом хроматографії одержаних ферментативних екстрактів.
17. Рекомбінантна шлункова ліпаза людини за п. 16, яка використовується для одержання харчових продуктів, зокрема функціональних харчових продуктів, призначених, зокрема, для полегшення абсорбції 7/0 рослинних або тваринних жирів, що поглинаються здоровим індивідуумом або індивідуумом, ураженим однією або декількома патологіями, що впливають або не впливають на ступінь продукування шлункової та/або панкреатичної ліпази.
18. Ферментативно активний рослинний екстракт, такий, який одержують згідно зі способом за п. 11, який відрізняється тим, що він містить рекомбінантну ліпазу собаки і/або одну або декілька поліпептидних похідних, таких як поліпептид ( А 54) і/або поліпептид ( 5 4) за п. 14.
19. Ферментативно активний рослинний екстракт за п. 18, який відрізняється тим, що вміст ферментативно активних рекомбінантних поліпептидів складає приблизно від 0,1 до 20 95 мас., зокрема від близько 1 до близько 15 95 мас., по відношенню до загальної маси протеїнів у вказаних екстрактах, що відповідає ферментативній активності приблизно від 0,5 до приблизно 1000 од/г сирої маси листя, зокрема приблизно 10-300 од/г сирої го маси листя, або приблизно 1-5000 од/г сирої маси насіння, зокрема приблизно 10-1000 од/г сирої маси насіння.
20. Рослинний екстракт за будь-яким з пп. 18 або 19, який використовується для одержання харчових продуктів, зокрема функціональних харчових продуктів, призначених, зокрема, для полегшення абсорбції рослинних або тваринних жирів, що поглинаються здоровим індивідуумом або індивідуумом, ураженим однією або декількома патологіями, що впливають або не впливають на ступінь продукування шлункової та/або с г панкреатичної ліпази.
21. Ферментативно активний рослинний екстракт, такий, який одержують згідно зі способом за п. 12, (8) який відрізняється тим, що він містить рекомбінантну ліпазу людини і/або одну або декілька поліпептидних похідних, таких як поліпептид ( 2 54Ї (ЗН) і/або поліпептид ( А 4Ї СН) за п. 16.
22. Ферментативно активний рослинний екстракт за п. 21, який відрізняється тим, що вміст ферментативно М зо активних рекомбінантних поліпептидів складає приблизно від 0,1 до 95 мас., зокрема від близько 1 до близько 15 95 мас., по відношенню до загальної маси протеїнів у со вказаних екстрактах, що відповідає ферментативній активності приблизно від 0,5 до приблизно 1000 од/г сирої с маси листя, зокрема приблизно 10-300 од/г сирої маси листя, або приблизно 1-5000 од/г сирої маси насіння, зокрема приблизно 10-1000 од/г сирої маси насіння. ме)
23. Рослинний екстракт за будь-яким з пп. 21 або 22, який використовується для одержання харчових ї- продуктів, зокрема функціональних харчових продуктів, призначених, зокрема, для полегшення абсорбції рослинних або тваринних жирів, що поглинаються здоровим індивідуумом або індивідуумом, ураженим однією або декількома патологіями, що впливають або не впливають на ступінь продукування шлункової та/або панкреатичної ліпази. «
24. Фармацевтична композиція для лікування патологій, пов'язаних з порушенням механізму абсорбції жирів, з с яка відрізняється тим, що вона містить рекомбінантну шлункову ліпазу собаки і/або людини і/або одну або декілька поліпептидних похідних цих останніх за п.14 або п. 16 і/або один або декілька ферментативних ;» екстрактів за будь-яким з пп. 18-20, за необхідності, у сполученні з фармацевтично прийнятним ексципієнтом. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних -І мікросхем", 2005, М 7, 15.07.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. (95) іме) б 50 що Ф) іме) 60 б5