JP2001527406A

JP2001527406A - 組換えラクトフェリン、その植物による生成方法及び利用

Info

Publication number: JP2001527406A
Application number: JP54778398A
Authority: JP
Inventors: ドミニクルグラン; ヴァレリサルモン; ジェネビブスピック; ベロニクグルベ; フィリプボーナ; ベルトランメロ
Original assignee: メリステムセラピューティクスエスエー
Priority date: 1997-05-02
Filing date: 1998-05-04
Publication date: 2001-12-25
Also published as: US20030229925A1; FR2762850A1; US7354902B2; CA2288435A1; DE69839768D1; US6569831B1; US8334254B2; EP0981617B1; AU7659298A; US20110092411A1; WO1998050543A1; EP0981617A1; ATE402260T1; FR2762850B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン、又は由来タンパク質をコードするcDNA、及び当該cDNAによりコードされるラクトフェリン又は由来タンパク質を植物細胞に生成されることに必要な要素、特に植物細胞の転写機械が認識する転写プロモーター及びターミネーターを、細胞からもしくはこれから取得した植物から、ラクトフェリン又は由来タンパク質を得る目的として、植物細胞を形質転換する為の利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】組換えラクトフェリン、その植物による生成方法及び利用本発明は、植物による組換えラクトフェリン（rLf）の生成方法、ならびにその利用に関する。哺乳類のタンパク質の使用については、非通常性の感染媒介物、特にプリオン形のものによって汚染されるという危険性があるため、問題が残る。従って商業化及び規制法規への影響が大きい。動物性感染媒介物の完全にないタンパク質の生成は新たな課題となるか、選択したタンパク質及び植物素材による新たな問題がある。従来の技術では、Mitraら（1994）の文献に記述された、ヒトラクトフェリンをコードするDNA配列によって、タバコの細胞の形質転換が知られている。しかしながら、この文献は植物細胞に限り、その植物細胞から再生した植物を得られない。更に、発現したタンパク質は精製物ではなく、タンパク質全部ではない、一部の断片（48kDa）のみが検出された為、完全なものではない。従来の技術では、特許出願WO 9637094に記述した、ラクトフェリンをコードする遺伝子で形質転換をすることにより抗ウイルス性の植物を得られることも知られている。しかし、この文献においても、タンパク質は精製物ではなく、しかもその存在の唯一の指標はウエスタンブロットによるテストである。ラクトフェリンの複雑性及び使用する植物素材の特性により、抽出や精製の過程は、植物からラクトフェリンを得る際に大きな妨げとなる。この二つの過程においての問題、各タンパク質を植物から得る際に、新たな問題となる。ラクトフェリンはトランスフェリン類の糖タンパク質である。人乳での発見後、濃度は極めて異なるが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、モルモット等、他の動物類でも検出された。人乳ではラクトフェリンの濃度は1〜2g/lであり、初乳では特に高く、哺乳に従い減少する。乳でのラクトフェリンは主にアポ型、即ち鉄飽和していない形で存在する。一方、ラクトフェリンは唾液、胆汁、膵液、小腸分泌液等の他多数の分泌液でも発見さている。気管分泌液、膣分泌液、鼻汁、腸分泌液等ほとんどの粘液にも現れる。ラクトフェリンは、多形核好中球白血球のミエロペロキシダーゼを有しない細胞の第二級顆粒内にも存在する。白血球ラクトフェリンは、顆粒球生成の前骨髄球性段階から後骨髄球性段階の間に合成する。好中球の脱顆粒の際、ラクトフェリンは血内のトランスフェリン（2〜3g/l）に比べてやや低めの濃度（0.4〜 2g/l）で血漿内に遊離される。 Metz-Boutigueらは、1984年に既にヒトラクトフェリン（hLf）のペプチド配列を決定した。そのアミノ酸692個の配列はヒト乳腺ラクトフェリンcDNAのクローニ化によって確証した(Powell及びOgden、1990、Reyら、1990)。ラクトフェリンとセロトランスフェリンの一次構造及び立体配置は非常に近いものである。それらのポリペプチド鎖は、αヘリックス状の小ペプチドが連結する二個のローブ（N末ローブ及びC末ローブ）から為る。ヒトラクトフェリンのN半とC半の配列相同率は37％である。ヒトラクトフェリンをトリプシンにより加水分解することによって、Legrandら（1984）は30kDa（アミノ酸残基4〜283）のNトリプシン断片（N -t）及び50kDa（アミノ酸残基284〜692）のCトリプシン断片（C-t）を得た。これらの断片は等モル割合でN-t/C-t非共有複合体として再結合でき、ヒトラクトフェリンと分光学的及び電気泳動的に近い性質を有する(Legrandら、1986)。ラクトフェリンは、３価の鉄イオン２個を可逆的に結合し、中央が465nm の吸収極大であるサーモンピンク色に発色する。各３価の鉄イオンを結合するには炭酸塩の結合を必要とする。pH6.4においての[Fe3+]2-Lf結合体の会合定数は約10²⁴M^-1であるがpHに従い減少する。X線回折によるラクトフェリンの3.2Å、2 .8Å、2.2Åでの研究は、各３価の鉄イオンがチロシン残基２個、ヒスチジン１個、アスパラギン１酸個、炭酸塩１個に配位することを示す。これらのアミノ酸はそれぞれ２個のローブでは同じものである。これら２個の鉄結合部位はこの金属に対して親和性が強いが、異なるpH下で遊離する。即ち、N-tローブはその鉄をpH5.8にて遊離する（酸不安定性ローブ）が、C-tローブはその鉄をpH4にて放出する（酸安定性ローブ）。他のイオン、特にガリウムは、タンパク質に結合できる。何人かの研究者が⁶⁷Ga-Lfを対ガン診断でのトレーサーとしての使用に関心を示し、⁶⁷Gaの注入後、結合体が優先的に乳房組織、生理的、病態的分泌液、 BurkittとHodgkinのリンパ腫内に現れるのを示した。糖修飾化に関しては、母乳から分離したラクトフェリンは、Asn¹³⁸、Asn⁴⁷⁹、Asn⁶²⁴である糖修飾部位３個があり最初の一個はN-t、後の２個はC-tローブに位置する。糖修飾化は、分子の 85％は優先的に部位２個所（Asn¹³⁸及びAsn⁴⁷⁹）で行われ、部位１個（Asn⁴⁷⁹）又は３個同時の糖修飾化は、それぞれ5％と9％の場合起こる。ラクトフェリンのグリカンはモノ、或いはジシアル酸付加、及びフコシル化したN− アセチルラクトサミン型のものである(Spikら、1982)。フコース残基は結合部位のN−アセチルグルコサミンでα(1,6)に、又はアンテナの5'N−アセチルグルコサミンでα(1,3)に分枝している。白血球ラクトフェリンは前記のと異なりフコースを全く含まない。セロトランスフェリンが生体の細胞全体にとって主な鉄輸送体であることは確かだか、ラクトフェリンの機能は、基本的に生体の防御及び炎症系に関連し、直に病原微生物に対し、或いは間接的に免疫効果細胞を介して作用する。ラクトフェリンは多数のメカニズムから成る抗菌物抗菌物である。その第一の制菌効果はラクトフェリンによる鉄欠乏から為る。鉄はDNAの生合成に必要であるので、ラクトフェリンが周囲の環境から鉄を隔絶することにより、バクテリアの分裂を抑制する。、抗体を介するより複雑なメカニズムも実証された。即ち、病原菌特異的IgA及びIgGの存在下、ラクトフェリンの制菌活性は向上する。もう一方では、リゾジムはグラム陽生菌の細胞壁に対する溶解活性をラクトフェリンの活性と合わせられる。このように乳内では、ラクトフェリン、リゾジム及び抗体は、微生物による攻撃の際、相乗作用が可能である。ラクトフェリンによる第二の抗菌効果はその殺菌機能に関連する。ラクトフェリンはグラム陰生菌の細胞壁を結合することにより不安定化し、リポ多糖（ LPS）を放出する。これにより細胞壁は脆弱し、疎水的抗体の作用に敏感になる。これらの仮説は、E．coliを含むグラム陰生菌のラクトフェリンによる不安定化効果を電子顕微鏡により観察し、確認した。ラクトフェリンの結合はLPSのA脂質にて行われ、その後それらLPSが細菌の外膜から抽出され細菌に決定的なダメージを与える一つの仮説がある。近年、殺菌機能を含む、ヒトラクトフェリンの領域(ラクトフェリシンA ）及びウシラクトフェリンの領域(ラクトフェリシンB)が確認された：その両方はN-ローブのアミノ酸18個のループ内に位置し、これらのループはヒトラクトフェリンの場合システイン残基20と37、ウシラクトフェリンの場合システイン残基 19と36によるジスルフィド結合によって形成する。更に、LPSとの結合におけるヒトラクトフェリンの残基28〜34の重要性は証明された。このように、制菌及び殺菌活性により、母乳中にあるラクトフェリンは乳児を小児下痢から保護する。ヒトラクトフェリンの抗真菌効果が幾つかのカンジダにおいて証明された。又、このウシラクトフェリンの効果は、酵母及び糸状菌類において証明された。実際に、ウシラクトフェリシンの効果は、全アポウシラクトフェリンより高く、抗生物質型陽イオンペプチドである、細胞膜を不安定化する性質で知られるポリミクシンBと同様である。ラクトフェリシンBが、キノコの表面と直接に相互することにより、超微細構造の変化を誘導することも実証された。近年、幾つかの研究者がヒトラクトフェリンの抗ウイルス活用を証明した。即ち、幾つかのウイルスは、目的細胞の細胞膜上のプロテオグリカンに吸着した後、特異な受容体と結合し、ウイルス膜と宿主膜を融合するメカニズムによって細胞内に侵入する。ラクトフェリンは、その強度な塩基性に基づき、細胞のヘパラン硫酸と結合することにより、数種類のウイルスの吸着を抑制することが可能である。HIV(ヒト免疫不全症ウイルス)及びHCMV（ヒト巨細胞ウイルス）に関する最も決定的なインビトロ研究で、半抑制濃度は約40μg／mlだった。HSV−１(１型単純疱疹ウイルス)でも同様な結果が得られた。これらの研究はウイルス受容体（ヘパラン硫酸、プロテオグリカン、低密度リポタンパク質受容体）の遮断のみではなく、ラクトフェリンとウイルスの相互作用の可能性を示す。この近年に発見された機能は、特に免疫不全症や再発の病態に関しては、予防及び治療への新たな方向となる。組織が炎症すると、結果の一つとして遊離基が発生し、脂質が過酸化する。これらの遊離基は主に微生物の食作用メカニズムから生じている。Haber−Wei ss反応に従い、遊離基は、反応の触媒役を果たしている３価の鉄イオンによって発生する。好中球の脱顆粒から由来したラクトフェリンが、遊離基の発生を触媒する鉄を即時に隔絶し、細胞外での遊離基の発生を停止することがインビボで実証された。この活性によってラクトフェリンは組織のダメージを避ける。同様なメカニズムによりラクトフェリンは脂質の過酸化を抑制し、結合する細胞膜を保護する。このように、これらの研究は、ラクトフェリンが無鉄の状態であれば、抗酸化及び抗炎症化活性を有することを実証した。白血球の顆粒から放出したラクトフェリンは、GM−CSF（顆粒球・大食細胞コロニー刺激因子）の生成を減少し、顆粒球や大食細胞のコロニー形成の抑制物として認識された。ラクトフェリンの活性は、白血球、線維芽細胞及び内皮細胞によるGM−CSFの放出を制御するモノカインの放出を抑制することにあるため、関連するメカニズムは複雑なものと思われる。該モノカインはIL1であると確認された。抗体生成の抑止、補体の活性化の調整、又はNK細胞（Natural Killer）の活性の調整等幾多のラクトフェリンの機能は、サイトカインにより制御するメカニズムに関連する。ラクトフェリンがIL1、IL2及び TNFa等のサイトカインに対し負帰還を発揮し、炎症部位での動員及び活性化を防止することを証明した研究がある。 Zimeckiら（1991）は、CD4-CD8-未熟胸腺細胞がラクトフェリンの存在下でインキュベートすると、補助リンパ球の特徴であるマーカーCD4+を得ることを実証した。この研究者は更に、ラクトフェリンの存在下におけるB細胞の様々な表現形的及び機能的変化を示した。(Zimeckiら、1995)。活性化リンパ球にとって、ヒトラクトフェリンの特異的な受容体が特徴付けられた(Mazurierら、1989) 。もう一方では、ラクトフェリンとその受容体との相互部位が記述された：それはN末端に、更に正確にはラクトフェリンの最初の50残基に含まれていることをL egrandら（1992）は実証した。ラクトフェリンは低濃度(0.75μg/ml)でNK細胞(Natural Killer)及びLAK 細胞の細胞毒性を調整する。ラクトフェリンは腫瘍細胞、及びレトロウイルスによって感染された細胞に対するNK細胞の細胞毒活性を有意に高める。ラクトフェリンは単球の細胞毒性にも作用する。これらのラクトフェリンによるNK細胞、リンパ球及び接着細胞の刺激の原因は、ラクトフェリンの内部移行後、キラー細胞が活性化した、又は標的細胞が変化し、溶解に敏感になった結果である。更にラクトフェリンは、炎症反応における免疫調整を行っている(Elass-R ochardら、1995;Elass-Rochardら、1998によって確証した)；Salmonら（1998）による研究の課題として抗腫瘍性活性の実証がある。ラクトフェリンは、子ウシ血清を除いた培地上、多数の細胞に対して成長因子活性を発揮する。この活性は特にB及びT系ヒトリンパ球でマウスマクロファージ系（P388 DI）に対して証明した。更にラクトフェリンは、トリチウム化チミジンのラット腸細胞DNA内への挿入を刺激する。成長因子活性における鉄の役割はまだ論議であり：一方の研究者によると、ラクトフェリンの作用は細胞増加が必要とする鉄を提供することから為り；もう一方では鉄に役目は全くなく、分裂促進性活性はタンパク質そのものによる。ラクトフェリンが腸管での鉄吸収に関係があるとの仮説は、母乳を与えた乳児は鉄欠乏の割合が少ないとの観察によるものである。同じく、これらの乳児のみが、生後六ヶ月まで大量な鉄の貯蔵を保つことから、母乳中における鉄のバイオアベイラビリティが高いことを示す。即ち、吸収率は初期の三ヶ月間は81％に達し、その後早く減少する。母乳の幾多の成分中、ラクトフェリンは、母乳中における高度な鉄の生物利用可能度、及びその吸収の調整に関して、最も納得できる説明を提供する。1979年に、Coxらは既にヒト腸管の鉄の吸収に関するラクトフェリンの影響を研究した。腸細胞のラクトフェリン受容体は、最初はウサギ、次にマウスで発見された。更に、ヒト腸細胞の受容体が研究され、HT29ヒト腸細胞の培養で鉄キレーターの存在下、ラクトフェリン受容体の数が二倍になることが証明された(Mikogamiら、1994、1995)。この増加は受容体の新規合成によるものである。従って、ラクトフェリン受容体の発現は鉄不足により調整され、この欠乏は腸細胞によるラクトフェリン受容体の内部移行を増やす。このように、ラクトフェリン受容体は、特に鉄欠乏の場合、鉄分栄養に関する役目を果たしている。ヒトラクトフェリンcDNAの配列決定の他に、幾多の動物種属のラクトフェリンcDNAの核酸配列が決定された。特に： -ウシラクトフェリン（Pierceら、1991） -ブタラクトフェリン（Alexander B．F．ら、1991） -ヤギラクトフェリン（Le Provost F．ら、1994）の配列が上げられる。 cDNA配列に対応するペプチド配列の分析は最も高い相同性を示す。特に、ヒトラクトフェリンとウシラクトフェリンの間では69％の相同性がある。ヒトラクトフェリンと同様、ウシラクトフェリンのcDNA核酸配列は、アミノ酸16個から為るシグナルペプチドを含む。この構造的相同性は機能的相同性に関連する。特に、ヒトラクトフェリンと同様、ウシラクトフェリンのN末端は塩基性アミノ酸率が高いため、両ラクトフェリンは同様に酸性成分により認識される。例えば、グラム陰生菌のリポ多糖や、幾多の細胞の表面上にあるプロテオグリカンとの相互作用は、両方のタンパク質にて同様である(Elass-Rochard E．ら、1995)。これら同様の相互作用は、両ラクトフェリンがリポ多糖により活性化した大食細胞からのシトカインの放出を抑制し、即ち炎症反応のメカニズム上、同じ役目を果たしていることを示す。同じく、両ラクトフェリンは腸細胞に対して同じ結合性質を持ち、腸管での鉄吸収や、幾多の抗生菌及び抗ウイルス活性で同じ役目を果たしている。これにより幾多のラクトフェリンの役目、特に抗酸化、抗菌及び抗ウイルス活性は、治療法もだが、特に生菌、真菌及びウイルスによる感染に対する予防法、更に通常手術後の敗血性ショックの予防に関して、このタンパク質は大きな重要性がある。ラクトフェリンの免疫調整及び抗腫瘍性活性は、更に炎症やガン治療法でも使用可能である(Damiensら、Zimeckiら)。更に、ラクトフェリンは皮製薬や化粧品による処理法、例えば化粧による抗遊離基処理、又は髪のケラチンを空気による破損から保護に使用可能である。発明の詳細な説明本発明は下記 −一方では、ラクトフェリン、特に哺乳類のラクトフェリン、好ましくはウシ、ブタ、ヤギ、ヒトラクトフェリン、又は由来タンパク質（由来タンパク質とは、基準タンパク質と少なくとも70%の相同性、特に少なくとも80%、例えば85 から100%の相同性を有し、及び／又は、糖鎖形成プロフィール異なるが、基準ラクトフェリンの機能的性質を保存するものを意味する）をコードするcDNAを、また他方では、当該cDNAによりコードされるラクトフェリン又は由来タンパク質を植物細胞に生成されることに必要な要素、特に植物細胞の転写機械が認識する転写プロモーター及びターミネーターを含む組換え核酸配列を、細胞からもしくはこれから取得した植物から、ラクトフェリン又は由来タンパク質を得る目的として、植物細胞を形質転換する為に利用すること、 −一方では、ラクトフェリン、特に哺乳類のラクトフェリン、好ましくはウシ、ブタ、ヤギ、ヒトラクトフェリン、又は由来タンパク質をコードする配列を、また他方では、当該配列によりコードされるラクトフェリン又は由来タンパク質を植物細胞に生成されることに必要な要素を、特に植物細胞の転写機械が認識する転写プロモーター及びターミネーターを含むことを特徴とする組換え核酸配列。好ましくは、核酸配列はポリペプチドの分泌に必要なシグナルペプチドをコードする配列を含む。 −場合によっては、その複製に影響を与えない部位に挿入した、本発明による核酸配列を含むベクター、特にプラスミド、 −本発明によるベクターによって形質転換した宿主細胞、特にアグロバクテリウム・ツメファシェンス等のあらゆるバクテリア、 −ラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質を取得する手順で、下記を含むことを特徴とするもの、 −特にそれ自身は、本発明のベクターによって形質転換した、本発明による宿主細胞によって、本発明による組換え配列を細胞のゲノムに組込むように植物細胞を形質転換すること、 −場合によっては、上記の形質転換細胞からの形質転換植物を取得すること、 −特に抽出と、場合により、その後の精製によって、上記形質転換した植物又は細胞内のラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質を回収すること、 −本発明による一つ（又は複数）の組換え核酸配列を含み、ゲノム内に安定した形式で組込んだことを特徴とする、特にアブラナ、タバコ、トウモロコシ、エンドウマメ、トマト、ニンジン、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ヒマワリ、レタス、コメ、ウマゴヤシ及びテンサイの中から選択する遺伝形質転換の植物、植物抽出物又は植物の部分、特に葉、及び／又は果実及び／又は種子、及び/又は植物細胞、 −本発明による手順に従って取得されたことを特徴とするラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質、 −本発明によるラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質を含むことを特徴とする遺伝形質転換の植物、植物抽出物又は植物の部分、特に葉、及び／又は果実及び／又は種子、及び/又は植物細胞で、この植物は特にアブラナ、タバコ、トウモロコシ、エンドウマメ、トマト、ニンジン、コムギ、オオムキ、ジャガイモ、ダイズ、ヒマワリ、レタス、コメ、ウマゴヤシ及びテンサイの中から選択したもの、 −医薬、医用、歯科、化粧又はバイオテクノロジー組成物を得る為に、本発明による植物、植物抽出物又は植物部分、及び／又はタンパク質（ラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質）の利用、 −本発明による植物、植物抽出物、植物の部分及び／又はタンパク質（ラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質）を含むことを特徴とするバイオ物質又は医薬、医用、歯科、化粧又はバイオテクノロジー組成物、に関する。本発明による医薬組成物とは、特に細菌性、真菌性又はウイルス性病状又は症状、炎症又は炎症性の病状、敗血性ショック、細胞増殖現象又は貧血等の鉄欠乏に関する病状を予防し、又は治療できるものを構成する、もしくはその製造工程に入る本発明によるあらゆる組成物を含む。本発明による化粧用組成物とは、特に地塗り用の添加剤（クリーム、ポマード、白粉、軟膏）等を構成する（又はその製造工程に入る）本発明によるあらゆる組成物を含む。好ましくは、本発明による組換え核酸配列は、植物細胞の特定された区域、特に小胞体又は液胞、もしくは細胞の外側、ペクチンセルロース壁内又はアポプラスムと呼ばれる細胞外空間に、組換えポリペプチドのアドレッシングに対応するペプチドをコードする一つ（又は複数）の配列を含む。本発明に関する植物細胞の形質転換の為に利用可能な転写ターミネーターの中では、カリフラワー・モザイク・ウィルス（CaMV）のポリA 35Sターミネーター、又はノパリン系のアグロバクテリウム・ツメファシェンスTiプラスミドのノパリン合成酵素遺伝子の非コード3'領域に相当するポリA NOSターミネーターが挙げられる。従って、本発明は上記cDNA、又はその由来配列の下流にCaMVのポリA 35S ターミネーター、もしくはアグロバクテリウム・ツメファシェンスのポリA NOS ターミネーターを含む、上記のあらゆる組換え核酸配列を対象とする。本発明に関する植物細胞の形質転換の為に利用可能な転換プロモーターの中では下記のものを挙げられ： −プロモーター35S(P35S)、又は好ましくはCaMVの二重構成プロモーター3 5S(Pd35S)、これらのプロモーターは本発明によって形質転換された細胞から取得した植物全体について、本発明による組換えポリペプチドの発現を可能し、Ka yら，1987の論文に記述されたものであり、 −本発明によって形質転換された細胞から取得した植物の種子（穀粒）のみにおいて本発明による組換えポリペプチドの発現を可能とするラディッシュのクルシフェリン遺伝子のPCRUプロモーター、Depigny-Thisら，1992の論文に記述されたものであり、 −種子内で特異的な発現をする、各々シロイヌナズナの種子貯蔵タンパク質遺伝子GEA1及びGEA6の非コード5'領域に相当するプロモーターPGEA1とPGEA6 (Gaubierら，1993)、 −アグロバクテリウム・ツメファシェンスのオクトピン合成酵素遺伝子プロモーターの転写活性化因子要素の三重反復、マノピン合成酵素遺伝子プロモーターの転写活性化因子要素とアグロバクテリウム・ツメファシェンスのマノピン合成酵素プロモーターの融合から成るスーパー・プロモーターPSPのキメラのプロモーター(Ni Mら，1995)、 −McElroyら(1991)が記述したプラスミドpAct1-F4に含まれるコメのアクチンプロモーター後、コメのアクチン・イントロン(PAR-IAR)、 −オオムギのHMGW（高分子重量グルテンイン）プロモーター(Anderson O.D．ら，1989)、 −トウモロコシ種子アルブミンでの発現可能のReinaら(1990)の記述したプラスミドpγ63に含まれるトウモロコシγゼイン（Pγzein）の遺伝子プロモーター。従って、本発明は上記cDNA、もしくはその由来物の上流にCaMVの二重構成プロモーター35S(Pd35S)、又はラディッシュのクルシフェリン遺伝子のPCRUプロモーター、又はシロイヌナズナのPGEA1かPGEA6プロモーター、又はアグロバクテリウム・ツメファシェンスのスーパー・プロモーターPSP、又はコメのPAR-IARプロモーター、オオムギのHMGWプロモーター又はトウモロコシのpγゼイン・プロモーターを含む、上記の如く記述されたあらゆる組換え核酸配列を対象とする。本発明に関するアドレッシングペプチドをコードする配列は、植物、ヒト又は動物から由来するものであっても良い。植物から由来するアドレッシングペプチドをコードする配列の中では、下記のものが挙げられ： −サツマイモのスポラミンAの23アミノ酸のプリペプチド（シグナルペプチド）をコードする69ヌクレオチドから成る核酸配列であり(下記の例で示す)、尚このシグナルペプチドは本発明により形質転換した植物細胞の分泌系において（即ち、主に小胞体における）本発明の組換えポリペプチドの導入を可能とするものであり、 −本発明による形質転換された植物細胞の液胞内で本発明の組換えポリペプチドを蓄積することを可能とするサツマイモのスポラミンAの液胞アドレッシングのアミノ酸の14個からなるN末端プロペプチドをコードする42核酸配列(下記の例で示す)、 −N末端部分からC末端部分の間における上記シグナルペプチドの23アミノ酸と、続いて上記プロペプチドの14アミノ酸から成る、スポラミンAの37アミノ酸のプリプロペプチドをコードする111核酸配列(これ以降の例で示す)、尚このプリプロペプチドは、本発明による形質転換植物細胞の液胞内の分泌系に、本発明の組換えポリペプチドを導入し蓄積することを可能とするものであり、上記の三配列は、Murakamiら，1986及びMatsuokaら，1991の論文に記述があり、 −特にSchroederら，1993、Bednarekら，1991の論文に記述された、オオムギレクチンのカルボキシ末端プロペプチド、 −及び分泌を可能とするPRS(病原関連タンパク、Cornelissenら，1986)。尚、アドレッシングペプチドをコードする配列の中では、KDEL、SKEDL及びHDELペプチドをコードし、小胞体内でのアドレッシングを可能とするものか挙げられる。尚、本発明は上記の如く、特にサツマイモのスポラミンAの、液胞アドレッシングペプチドの全体、又は一部をコードする配列を含む、あらゆる組換え核酸配列を対象とするが、この液胞アドレッシングペプチドをコードする配列は、当該組換え核酸配列内、当該組換え核酸配列のコードするタンパク質内、液胞アドレッシングペプチドの最初のN末端アミノ酸がシグナルペプチドの最終のC末端アミノ酸と結合し、また当該アドレッシングペプチドの最終のC末端アミノ酸当該cDNAもしくはその由来配列のコードするポリペプチドの最初のN末端アミノ酸と結合するように、シグナルペプチドをコードする配列と当該cDNAもしくはその由来配列をコードする配列の間に位置する。尚、本発明は上記の如く、特にオオムギレクチンの、液胞アドレッシングペプチドの全体又は一部をコードする配列を含む、あらゆる組換え核酸配列を対象とするが、この液胞アドレッシングペプチドをコードする配列は、当該組換え核酸配列内、当該組換え核酸配列のコードするタンパク質内、液胞アドレッシングペプチドの最初のN末端アミノ酸が当該cDNAもしくはその由来配列のコードするポリペプチドの最終のC末端アミノ酸と結合するように、当該cDNA、もしくはその由来配列をコードする配列下流に位置する。実地例１：ヒトラクトフェリンをコードする全cDNAを含むpBS-Lfプラスミドの形成ラクトフェリンは前タンパク質の形で合成され、その692アミノ酸から成る成熟タンパク質をコードする配列を19アミノ酸のMKLVFLVLLFLGALGLCLA配列から成るシグナルペプチド（PSLf）が先んじる。このシグナルペプチドの配列を含む全cDNAをここで使用した。λgt11ベクター内に形成したヒト乳腺cDNAバンク（Clonetech、品目番号HL1037b、CA、USA ）から単離した。バンクは、Lfシグナルペプチドのアミノ酸（即ち、ヒトプレラクトフェリンとも言う未熟性hLfのアミノ酸1〜19）に相当するオリゴヌクレオチドから成るプローブを使用し、ニトロセルロースレプリカ上のハイブリッド形成法によりスクリーニングした。手短に述べれば、クローンは水酸化ナトリウム0. 5M、塩化ナトリウム1.5Mの溶液で２分間固定させた後、塩化ナトリウム1.5M、トリス‐HCl 0.5M、pH7.4の溶液で５分間かけて中和した。その後フィルターを２倍SSC(塩化ナトリウム17.5g/l、ムクエン酸三ナトリウム8.8g/l、QSP 11)溶液ですすいだ。最後に、80℃で２時間温置することによって、 DNAを固着した。ハイブリド形成は、ハイブリダイゼーション溶液（６倍SSC、10 倍デンハート、ノニデットNP40(オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、S igma)0.1％(重量：体積)、サケ精子のDNA 100μ1/ml）1mlに対して10⁶cpmの割合で³²Pにより標識した上記オリゴヌクレオチドプローブを使用し65℃で一夜行った。その後レプリカは42℃の２倍SSC、ドデシル硫酸ナトリウム0.1％の溶液で４回洗浄し、照射した。 λgt11をEcoRI（DNA 1μgに対して3U、37℃で２分間）で限定加水分解し、Lfの全cDNAはpBluescript SK（Stratagene、la Jolla、USA）のEcoRI部位内にクローン化し、pBS-Lfプラスミドを得た。実地例2：3’末端を変更したヒトラクトフェリンをコードする全cDNAを含むpBS-12プラスミドの形成停止コドンの下流にある配列を、下記pBIOC21に含まれるターミネータと融合する為、ヒトラクトフェリンcDNAの3’末端の変更を行った。ポリメラーゼ連鎖反応法によるこの変更は、停止コドンの上流にある天然のEcoRI制限部位（G AATTC）を除き、９塩基対下流、XbaI部位（TCTAGA）前にEcoRI制限部位を形成した。このpBS-Lfを基質とするポリメラーゼ連鎖反応は、下記のオリゴデオキシリボヌクレオチドのセットを使用した： 5’オリゴ：5’ATGACAACACTGAGTGTCTGGCC 3’(核酸1991〜2011、即ち未熟性hLf のアミノ酸664〜671に相当する) は変異部位（未熟性hLfのアミノ酸711に相当する停止コドンを含むオリゴヌクレオチド）を含む。ポリメラーゼ連鎖反応の条件：幾多のポリメラーゼ連鎖反応に使用した試薬はPromega Eurogentech（Seraing、Belgium）が合成した。それぞれの場合、基質5ngを両方のオリゴデオキシヌクレオチド100pモル、10nMのdNTP 3μl、25mMのMgCl₂ 6μl 、Taq DNAポリメラーゼ（2.5ユニット）0.5μlの存在下、製造者の緩衝液を含む 100μlの最終体積でインキュベートした。ポリメラーゼ連鎖反応はbio-med THERMOCYCLER 60（B．Braun）で行った。第一変質は94℃で５分間行った。その後、94℃で１分間、融解温度-10℃(即ち 50℃)で１分間、72℃で１分間のサイクルを30サイクル行った。最後に72℃で５分間の伸長を行った。このポリメラーゼ連鎖反応から得た作成物は、ラクトフェリンcDNAの単一 NdeI部位（未成熟hLfのアミノ酸678）を含む。これによりこの断片はXbaI及びNd eIにより加水分解し、NdeI-XbaI断片を除いたpBS-Lf内にサブクローン化し、pBS -12プラスミドを得た。連結条件は下記の通り：プラスミド100ng及び挿入断片100ngをT4 DNAリガーゼ（Stratagene）４ユニットの存在下、製造者の緩衝液及び条件下、即ち、特には10mMのATPを1μl含む、最終的体積50μl内16℃で一夜インキュベートした。これらの条件は下記述すべての連結反応に使用した。連結反応から得た作成物は、下記ルビヂウム法により予め適格化されたDH5αバクテリアの形質転換に使用した。適格化バクテリアの調製法：一夜培養したDH5αを、塩化カリウム（250mM）及び硫酸マグネシウム(16m M)を含むLB倍養液（バクトトリプトン10g/l、酵母抽出物(g/l、塩化ナトリウム5 g/l)内で、650nmでの光学密度が0.3を得るまで再培養した。次に、バクテリアの懸濁液は５分間4℃で2500rpmで遠心分離し、ペレットはTfb1緩衝液（塩化ルビヂウム100mM、塩化マンガン10mM、塩化カルシウム10mM、酢酸カリ10mM、グリセロール15％、酢酸0.2MでpH5.8に調整した）で懸濁し、氷上で15分間インキュベートし、同じ条件下遠心分離した。次にペレットはTfb2緩衝液(MOPS 10mM、塩化ルビヂウム10mM、塩化カルシューム75mM、グリセロール15％、水酸化ナトリウム0. 5MでpH7に調整した)6.5mlで懸濁した。その後細胞は毎チューブに200μlで、次の段階である形質転換のために-80℃にて保存した。形質転換の段階では、細胞は氷上で解凍し、DNA溶液（連結反応液25μl、即ちDNA 50ng）を適格化DH5α 200μlに添加した。懸濁液は氷上20分間インキュベートし、42℃の温度調整装置に90秒間液浸し、再び氷上に５分間置いた。懸濁液は、LB倍養液で再に一時間液体培養し、選択標識剤を含むLB倍地上延展した。クローンは37℃で一夜倍養後分析した。この方法は下記全ての形質転換に使用した。 pBS12クローンの分析後、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した断片の配列は、このプラスミドの配列決定（Sangerら、1975）によって確認した（Sequenase DNA sequencing kit、United States Biochemical Corpor ation、Cleveland、USA）。実地例3:ヒトラクトフェリンのシグナルペプチド（PSLf）をサツマイモのスポラミンのシグナルペプチド（PSSp）により入れ換えた、ヒトラクトフェリンをコードするcDNAを含む、pBS-12から由来したpBS-14プラスミドの形成先ずは、ポリメラーゼ連鎖反応法によって、理論的には分泌を可能とするサツマイモのスポラミンのシグナルペプチド（PSSp；Murakamiら、1986；Matsuo kaら、1991）をコードする配列との融合を可能とする為、LfのcDNA内にてXhoI部位の下流に、成熟タンパク質の配列の第一コドンの位置にSalI部位を挿入した。サツマイモのスポラミンのシグナルペプチドは23アミノ酸：MKAFTLALFLAL SLYLLPNPAHSから成る。 SalI部位（GTCGAC）及びXhoI部位（CTCGAG）を含む未熟性hLfのアミノ酸1 6〜28である5’オリゴ：及び、XcmI（CCAATTCAAGAATGG、未熟性hLfのアミノ酸153）を含む3’オリゴ：であるデオキシリボヌクレオチドは、上記の条件下pBS-12を基質とするこのポリメラーゼ連鎖反応に使用した。ポリメラーゼ連鎖反応から得た断片はXhoI 及びXcmIにより加水分解し、上記連結反応の条件に準じて、pBS-12のXhoIとXcmI部位に挿入した。形質転換は上記と同様に行った。生じたプラスミドはpBS-13と名付けた。その配列は上記と同様、配列決定法によって確認した。次に、スポラミンのシグナルペプチドと成熟LfのcDNAを融合する為、ポリメラーゼ連鎖反応によりSalI部位（GTCGAC）をスポラミンのシグナルペプチドの最終コドンの位置に、更にXhoI部位（CTCGAG）と、それに続くEcoRI部位を、ATG 開始コドンの直上流に挿入した。これらの変更はpMAT103を基質とするポリメラーゼ連鎖反応により上記述した条件に準じて行った。選択したオリゴデオキシヌクレオチドはこれら制限部位の挿入を可能とした：及び、増幅した断片をXhoI及びSalIにより消化し、予めXhoI及びSalIにより加水分解したpBS-13内にサブクローン化した。生じたpBS-14プラスミドはキメラタンパク質の最初のヌクレオチド500個の配列決定によって確認した。実地例４：pBIOC21の形成タバコの葉及び種内でヒトラクトフェリンをコードするcDNAを発現する為に次の制御配列を必要とする：１．CaMV（カリフラワーモザイクウイルス）の35Sの二重構成プロモーター(Pd35S)。これは天然プロモーター35SのTATA因子上流に位置した転写を活性化する配列を重複したものである（Kayら、1987）。２．35Sの転写を得る、カリフラワーモザイクウイルスの二本鎖環状DNAの非コード3'領域の配列にある、転写終結配列のポリA 35Sターミネーター（Franc kら、1980）。組換えDNA法によって、それぞれのプラスミドの作成はpBIOC4から由来する。このバイナリープラスミドはpGA442（An、1986）から由来したものである。 pBIOC4から由来し、「PD35S-T35S」発現カセットを含むプラスミドはpBIOC21プラスミドである。これらの作成物を再製する為の要素は、例えばWO9633277特許出願の明細書に記載され、ここに参考として記述する。実地例５：pBIOC21-PSLf-Lfの形成 Holsters（1978）の調製法により、バイナリプラスミドであるpBIOC704、 pBIOC705、pBIOC706及びpBIOC707のプラスミドDNAは、直接形質転換によりLBA44 04系アグロバクテリウム・ツメファシェンスに導入した。得たクローンは、導入したプラスミドDNAの酵素消化によって確認した。実施例７：pACT-IA-PSLf-Lfの形成トウモロコシの種子での構成発現は次の制御配列を必要とした： −McElroyら(1991)が記述したプラスミドpAct1-F4に含まれるコメのアクチンプロモーター後、コメのアクチン・イントロン(PAR-IAR)、 −ノパリン系アグロバクテリウム・ツメファシェンスのTiプラスミドのノパリン合成酵素の遺伝子の非コード3'領域に相当する転写終結配列であるポリA NOSターミネーター（Depickerら、1982）。 PSLf−Lfをコードする配列を挿入したpBSII-pAR-IAR-tNOSプラスミドはは、例えばWO9633277特許出願の明細書に記載され、ここに参考として記述する。「PSLf-Lf」をコードする配列はEcoRIで酵素消化によりpBS-12から分離した。消化した断片は0.8％アガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出し、アルコールにより沈殿し、乾燥し、水で溶解し、製造者の使用方法に準じてクレノー酵素（New England Biolabs）で処理した。PSLf-Lfをコードする配列はSalI及びNcoIにより二重消化したpBSII-PAR-IAR-TNOS内に挿入し、精製し、製造者の使用方法に準じてリョクトウヌクレアーゼ酵素（New England Biolabs）で処理し、子ウシアルカリホスファターゼ酵素（Boehringer Mannheim）により脱リン化した。連結反応は、脱リン化ベクター20ng、及び上記の「PSLf-Lf」をコードする配列を含むDNA断片200ngを、20μl内で10倍T4 DNAリガーゼ緩衝液２μl(Amersha m)、50％ポリエチレングリコール80002μl及びT4 DNAリガーゼ酵素5U（Amersham ）の存在下、14℃で16時間行った。予め適格化された大腸菌DH5αバクテリアは形質転換した（Hanahan、1983）。得たクローンのプラスミドDNAはアンピシリン 50μg/ml上選択して、アルカリ法(Birnboim及びDoly、1979)によって抽出し、制限酵素での酵素消化によって分析した。生じたプラスミドをpACT-IA-PSLf-Lfと名付けた。実施例８：pACT-IA-PSSp-Lfの形成「PSLf-Lf」断片が、pBS-14から分離し、クレノー酵素(New England Biolab s)で処理したEcoRI断片に相当する「PSSp-Lf」をコードする断片により置換したことを除いては、ACT-IA-PSSp-Lfの形成はpACT-IA- PSLf-Lfの形成と同様である。生じたプラスミドをpACT-IA-PSSp-Lfと名付けた。実地例９：pγzein-PSLf-Lfの作成トウモロコシの種子卵白での発現は次の制御配列を必要とした： - Reinaら、1990に記述したプラスミドp63に含まれたトウモロコシのゼインのガンマ（γ）遺伝子のプロモーター（Pgzein）。プラスミドp63はＰγzei nを、Clontech発売のpBI121のHindIII及びEcoRI部位の間に「P35S-gus-TNOS」発現カセットを含む、プラスミドpUC18のHindIII及びXbaI部位に、プロモータ35S （P35S）の代りにクローン化して生じた。これはトウモロコシの種子卵白で発現可能なものである。 - ノパリン系アグロバクテリウム・ツメファシェンスのプラスミドTiのノパリン合成酵素の遺伝子の非コード3'領域に相当する転写終結配列であるポリ A NOSターミネーター（Depickerら、1982）。「PSLf-Lf」配列がPγzeinで制御させるpgzein-PSLf-Lfプラスミドは、プラスミドp63内の、T4 DNAポリメラーゼ酵素（New England Biolabs）で処理した後、子ウシアルカリホスファターゼ酵素（Boehringer Mannheim）により脱リン化したSacI及びBamHI部位に、pBS-12から分離し、クレノー（New England Biolabs ）で処理したEcoRI断片のクローン化により得られた。連結は実施例７と同様に行った。予め適格化された大腸菌DH5αバクテリアは形質転換した（Hanahan、19 83）。得たクローンのプラスミドDNAは、アンピシリン50μg/ml上選択して、アルカリ法によって抽出し、制限酵素での酵素消化によって分析した。生じたプラスミドをpgzein-PSLf-Lfと名付けた。実施例10：pgzein-IA-PSSp-Lfの形成「PSLf-Lf」断片が、pBS-14から分離し、クレノー酵素(New England Biolab s)で処理したEcoRI断片に相当する「PSSp-Lf」をコードする断片により置換したことを除いては、pgzein-PSSp-Lfの形成は、pgzein-PSLf-Lfの形成と同様である。生じたプラスミドをpgzein-PSSp-Lfと名付けた。実地例11：pHMWG-IA-PSLf-Lfの作成トウモロコシの卵白での発現は次の制御配列を必要とした： - オオムギのHMWG（高分子重量グルテンイン）プロモーター（Anderson ら，1989）後、コメのアクチン・イントロン、 - 35Sの転写を得る、カリフラワーモザイクウイルスの二本鎖環状DNAの非コード3'領域の配列にある、転写終結配列のポリA 35Sターミネーター（T35S ）（Franckら、1980）。 pHMWG-IAプラスミドは、PHMWG-IAをpJIT163プラスミドのプロモータPD35S （P35S）の代りにクローン化して生じた。この作成物を再製する為の要素は、特にWO96/33277特許出願の明細書に記載されている。「PSLf-Lf」配列がPHMWG-IAで制御させるpHMWG-IA-PSLf-Lfプラスミドは、プラスミドpHMWG-IA内の、子ウシアルカリホスファターゼ酵素（Boehringer Man nheim）により脱リン化したEcorI部位に、pBS-12から分離したEcorI断片のクローン化により得られた。連結は、脱リン化ベクター100ng及び上記の「PSLf-Lf」をコードする配列を含むDNA断片 50ngを、10μlの反応液でT4 DNAリガーゼ緩衝液1μl（Amersham）の存在下、14 ℃で16時間行った。予め適格化された大腸菌DH5αバクテリアは形質転換した(Ha nahan、1983)。得たクローンのプラスミドDNAは、アンピシリン50μg/ml上選択して、アルカリ法によって抽出し、制限酵素での酵素消化によって分析した。生じたプラスミドをpHMWG-IA-PSLf-Lfと名付けた。実施例12：pHMWG-IA-PSSp-Lfの形成「PSLf-Lf」断片が、pBS-14から分離し、クレノー酵素(New England Biolab s)で処理したEcoRI断片に相当する「PSSp-Lf」をコードする断片により置換したことを除いては、pHMWG-IA-PSSp-Lfの形成は、pHMWG-IA-PSLf-Lfの形成と同様である。生じたプラスミドをpHMWG-IA-PSSp-Lfと名付けた。実施例13：遺伝子導入のナス科苗の取得方法Ａ．タバコの植物の形質転換形質転換の実験に使用したタバコの苗（Nicotiana tabacum）Xanthi NC及びPBD6変類）は、インビトロで、Gamborgらのビタミン（1968、Sigma品目番号M0 404）、ショ糖20g/l及び寒天（Merck）8g/lを加えたMurashige及びSkoogの基本培地上（1962）培養した。20分間120℃でオートクレーブする前、培地のpHはカリ液により5.8に調整した。タバコの育苗は節内のさし木作用によって、30日置きにこのMS20増殖培地に移植した。全てのインビトロ培養は温度調整した室内で次の条件下で行われた： - 光強度30μＥｍ^-2ｓ^-1；16時間の光周期 - 昼間26℃、夜間24℃の温周期。利用した形質転換法はHorschらの方法（1985）に基づく。プラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシェンスのLBA4404系の準備培養を攪拌下48時間28℃で、適当な抗生剤を加えたLB培地で行った。次に準備培養は同じ培地内50分の１に希釈し、同じ条件下培養した。一夜後、培養は遠心分離し（10分間、3000g）、バクテリアは同じ体積量のM30（ショ糖30g/l）培液で再懸濁し、この懸濁液を10分の１に希釈した。約１平方センチの外植体を上記述の育苗の葉から切り出した。次にバクテリア懸濁液と１時間接触させ、次にろ紙上急乾燥し、共培養培地（固形MS30）上に置いた。２日後、外植体をペトリ皿に、選択剤であるカナマイシン（200mg/l）、抗生剤であるAugmentin（400mg/l）及び発芽の誘導に必要なホルモン(BAP1mg/l 及びANA0.1mg/l)を含む再製培地MS30上移した。２週間の培養後、同じ培地上外植体の移植を行った。さらに２週間後、発芽はペトリ皿に、カナマイシン及びAu gmentinを含む発育培地MS20上移植した。15日後、発芽は半分移植した。発根は約20日間かかり、その後育苗は節内のさし木作用によりクローン化する、或いは温室へ出すことが可能となる。Ｂ．遺伝子導入のトマト植物の取得方法 UC82B系のトマトの種子は、Domcstos10％により15分間滅菌し、滅菌水で３回濯いだ。最後の濯ぎは10分間攪拌下で行った。この様に滅菌した種子はMSSV/2の培地上Nitschのビタミン（Thomas及びPr att、1981）、ショ糖30g/l、寒天（Merck、8g/lを加えたMurashige及びSkoogの基本培地）pH5.9、7〜8日間温度調整した室内で（光強度30μＥｍ^-2ｓ^-1、光周期16時間／８時間、26℃）出芽開始した。利用された形質転換法はFillattiらの方法（1987）に基づいた。プラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシェンスのLBA4404系の準備培養を攪拌下24時間28℃で適当な抗生剤を加えたLB培地で行った。次に準備培養は同じ培地で50分の１に希釈し、同じ条件下一夜培養した。600nmにての光学濃度を測定し、アグロバクテリアを遠心分離し（10分間、3000g）、KCMS液(Fi llattiらの出版物に記述された)で600nmにての光学濃度0.8を得るように再懸濁した。 Fillattiらの手順（1987）のいくつかの段階にて、技術的改善を加えた。外植体の準備培養及び共培養は、アセトシリンゴン（200ｍＭ）をKCMSに加えたこと以外、Fillattiら（1987）と同様に行った。 2Zの洗浄液は、カルベニシリンの代りにセフォタキム500mg/lを加えたことで異なる。使用された発育培地はNitschのビタミン、ショ糖20g/l、カナマイシン50mg/l、Augmentin 200mg/l、ANA 1mg/l及びゼアチン0.5mg/lを加えたMuras hige及びSkoog（Sigma M 5519）の基本培地から成る。実施例14：遺伝子導入アブラナの苗の取得方法春アブラナ(Westar又はLimagrain系のBrassica napus)の種子は、40分間1 5％Domestos(登録商標)溶液で消毒した。４回滅菌水で洗浄後、種子は各直径７c m高さ10cmの鉢に、種子20個づつの割合でショ糖30g/lを含み、寒天ゲル5g/lにより固化したMurashige及びSkoog（Sigma M 5519）の鉱物培地上発芽させた。これらの鉢は26℃で光周期16時間/８時間、光強度80μＥｍ^-2ｓ^-1の栽培室内に置いた。５日間の発芽後、子葉は無菌的に各葉柄を子葉節の約1ｍｍ上で切断して取った。同時に、プラスミド、即ちプロモータPCRU（又はPd35S）の制御で、アドレッシングシグナル（PS、PPS、PSLGL、PSPHP）をコードする配列と融合したヒト膵リパーゼをコードする配列を挿入されたプラスミドpGAZEを含むアグロバクテリウム・ツメファシェンスのLBA4404系の準備培養を50mlの三角フラスコ内28 ℃で36時間、10mlの2YTバクテリア培地に、使用系種の選択に有用な抗生物質を加えて行った。この準備培養は同じ条件での新たなバクテリア培養を1％で接種する為に使用した。14時間後、培養を15分間3000gで遠心分離し、バクテリアは同じ体積の出芽培液で再懸濁した。この懸濁液は直径5cmのペトリ皿に5ml/皿の割合で注入した。葉柄の切れ端は前記の如く調製したアグロバテリウム液に数秒間浸し、続いて葉柄の数ミリは再製培地に差し入れた。この培地は出芽培地と同じ基本成分から成るが、発芽の新形成を増進する植物ホルモンであるベンジルアミノプリン（BAP）4mg/lを加えたものである。直径9cmのペトリ皿（Greiner、品目番号6641 02）毎に外植体10個（葉柄の付いた子葉）の割合で培養した。出芽と同じ環境条件で２日間の共培養後、外植体は選択剤である硫酸カナマイシン45mg/l（Sigma、品目番号K4000）及び静菌剤であるクラブラン酸カリウム1/6(重量)とアモキシシリン化ナトリウム(注射用Augmentin)5/6の混合を600ml の割合で加えた前記培地を含むファイタトレー皿（Sigma品目番号P1332）に移植した。その後２回、３週間置きに、外植体は無菌に同じ条件で新たな培地に移植した。 2〜3回目の移植後に発生した緑発芽は、外植体から分離し個々に、BAPを除いたこと以外、前記と同じ培地が入った直径５センチ及び高さ10センチの透明な鉢にて培養開始した。３週間の培養後、形質転換発芽の茎を切断し、発芽は新鮮な培地が入った鉢に移植した。3〜4週間後、根は、育苗を人工気象室で順化することが可能になる程、十分発達している。緑でない或いは根を張ってない発芽は取り去った。その後この育苗を水で飽和した腐植土（規格、NF U4551：褐泥炭 40％、ふるいに掛けたヒース30％及び砂30％）で満たした幅７センチの受け皿に移植した。２週間人工気象室（温度21℃、光周期16時間／８時間及び相対湿度84 ％）での順化後、Osmocote（登録商標）遅発性の肥料を同じ腐植土に1lに対して 4gの割合で肥やした腐植土で満たした直径12センチの鉢に再植えし、続いて18℃ に調整した毎日２分間水撒きの温室（S2級）に移した。花の出現直後、交差受粉を防ぐ為、袋(Crispac、品目番号SM 570y300ｍｍ^* 700ｍｍ）をかぶせた。さやの成熟後、収穫し、乾燥し、続いて脱穀した。得た種子は生化学的活性の検定の為に使用する。遺伝子導入子孫の選択は、硫酸カナマイシン100から1 50mlg/l（遺伝型による）含めた培地で出芽して行う。操作条件は、出芽をガラス管内で管一本に対して種子１個で行うこと以外、上記述と同様だった。最初の３週間以内に、二次根を発育する育苗のみ人工気象室で順化してから温室に移した。実施例15：遺伝子導入のトウモロコシ苗の取得Ａ遺伝形質転換の標的としてトウモロコシのカルスの取得及び使用トウモロコシ遺伝形質転換は、使用する方法（電気穿孔法、アグロバクテリウム、微小繊維、粒子銃）にも関わらず、一般的に迅速分裂中の全植物を再生する能力を保存した未分化型細胞の使用を必要とする。トウモロコシの胚形成もろいカルス（II型という）はこの型の細胞から成る。このカルスは遺伝型H1 II又は（A188 ｘ B73）の未成熟胚から、Armstron gが（1994）記述した方法及び培地で得た。このように得たカルスは15日毎に開始培地での順次移植により増殖して、維持した。次に、Vainら（1989）の記述した方法に従ってこのカルスを使用し、細胞のホルモン性及び浸透圧性平衡を変更して、育苗を再生した。続いてこの植物は温室で順化し、交配又は自己受精が可能となる。Ｂトウモロコシの遺伝転換における粒子銃の使用前項では遺伝子導入に必要な株細胞の取得と再生を記述した。ここでは転換された遺伝子を植物のゲノムに安定的に組込みのできる遺伝子導入の方法を記述する。この方法は、微粒子銃の使用に基づき、J.Finer(1993)の説明した方法と同様である.対象細胞は項１で記述したカルスの欠片である。面積10〜20平方ミリの欠片は照射４時間前に、一皿に欠片16個の割合でマンニトール0.2M＋ソルビトール0.2Mを加えた開始培地と同様の培地を含むペトリ皿の中心に置いた。導入するべき遺伝子を含むプラスミドは、製造者の使用方法に準じてQuiagenのカラムにて精製した。次にKleinの記述した手順に準じて、タングステン粒子(M10) に沈殿した。このように被覆した粒子はJ．Finer(1992)の方法を従って、銃により標的の細胞へ撃った。次に、このように照射したカルスの皿を封着し、続いて暗所に27℃で培養した。第一移植は24時間後、その後３ヵ月間に渡って15日毎に、使用された遺伝子により質及び濃度が変わる（項３参照）選択剤を加えた開始培地と同様の培地で行った。使用可能な選択剤は一般的に幾つかの除草剤（Basta （登録商標）、Round up（登録商標）の活性剤或いは幾つかの抗生剤（ハイグロマイシン、カナマイシン等）から成る。３ヵ月後或いはその前に成長が選択剤に抑制されない、通常、多くの場合、その遺伝子内に１個又は複数の選択遺伝子を組み込んだ、１個の細胞分裂から生じる細胞から成るカルスを得た。このようなカルスの取得頻度は、一照射された皿に対して約0.8カルスである。このカルスを育苗を再生するように識別し、個別化し、増幅し、続いて培養した（実施例15項Ａ参照）。非遺伝子導入の細胞との如何なる干渉を防ぐ為に、この操作は選択剤を含む培地で行った。この様に再生した植物は温室で順化し、続いて培養し、交配又は自己受精可能となる。この様に再生した植物は、WO9637094で再生した植物の表現形と距離がある。実施例16-a：植物の葉からの組換えヒトラクトフェリン（rhLf）の検出生産力が最も高い植物を検査する為、pBIOC21-PSLf-Lf及びpBIOC21-PSSp- Lf構成物毎、20個の形質転換の生成物において可溶性タンパク質の抽出を行った後、質的及び量的に組換えラクトフェリン（rhLf）を検出した。即ち、葉は微粉末を得る為、液体窒素で砕いた。可溶性タンパク質は植物物質から、抽出緩衝液（トリス-HCl 50mM、エチレンジアミン四酢酸1mM、塩化ナトリウム100mM、TRITO N X-100 0.1％、pH6.5）によって、葉１グラムにつき4mlの抽出緩衝液の割合で抽出した。 30分間13000gで抽出液を遠心分離した後、上清は回収し、ろ過し、後の段階での組換えラクトフェリンの検出に使用した。イライザ法によるラクトフェリンの検出（Micogamiら、1994）各型の分子構成物の形質変換体は、組換えLfの量と可溶性タンパク質の量を比較することにより選択した。可溶性タンパク質はマイク現率は下記イライザ法によって測定した。ウサギの多クローン抗ヒトラクトフェリン抗体を下記の手順で生成した：ウサギの免疫化はhLfを連続に３回筋肉内注射して行った。１度目の注射の場合、非発熱性生理血清0.25ml及びフロイントの不完全アジュバント（Difco）0.25m lで溶解したhLf 1mgを注射した。２週間後、２度目の注射を非発熱性血清0.25ml 及びフロイントの不完全アジュバント（Difco）0.25mlで溶解したhLf 1mgで行った。更に４週間後、３度目の注射を２度目の条件と同様に行った。１度目の採取は、３度目の注射後10〜15日目に行い、20mlの血液を得た。次に、追加免疫に相当する注射（２度目の注射と同様の条件）は10日置きの採取を可能とした。ウサギの抗血清の免疫グロブリンは、飽和度35％の硫安塩析により精製した。沈殿物はトリス-HCl 10mM、pH8の緩衝液で透析し、DEAE Trisacryl(IBP)上のクロマトグラフィーで精製した。多クローン抗体はマイクロ滴定用プレートの穴に100μl／穴の割合（即ち、35μg/ml）で炭酸水素ナトリウム（NaHCO₃）緩衝液内4℃で一夜、又は37℃で２時間インキュベートした。イライザ用プレート(Falcon)をリン酸緩衝食塩水（塩酸ナトリウム150mM、リン酸ナトリウム（Na₂HPO₄、NaH₂PO₄）50mM、pH7.5）-tween 2%150μ l内にて、室温で20分間インキュベートすることにより非特異的部位を阻止した。リン酸緩衝食塩水-tween 0.05%で三回洗浄した後、可溶性タンパク質の抽出液から得た各試料100μlを37℃で２時間インキュベートした後、抗-Lf単クローン抗体によってhLfを検出した。抗-Lf単クローン抗体はマウス脾細胞とSP₂O/Ag骨髄腫細胞を融合して生成した。これらハイブリドーマの培養液の上清は直接にイライザ検査に使用した。抗体-rhLf複合体は、リン酸緩衝食塩水で3000分の１に希釈した。ペルオキシダーゼで標識化したヤギの抗マウス抗体（Diagnostic Pas teur）により認識され、上記同様に、37℃で２時間接触した。撹拌下、基質液（ H₂O₂10μlの存在下、「クエン酸／クエン酸ナトリウム」0.2M pH5.5の緩衝液10 μl内の二塩化オルトフェニレンチアミン4mg）の添加により現像し、発色は数分で終了し、反応は20％の硫酸を50μl／穴の割合で添加することにより停止した。光学濃度は490mMで読み取った。各段階の間、穴はリン酸緩衝食塩水-tween 0.05%で洗浄した。 rhLf：可溶性タンパク質の率はダイアグラム図１にて表わした。これによってpBIOC21-PSLf-Lf構成物の場合はT19形質変換体を、pBIOC21-PSSp-Lf構成物の場合はT30形質変換体を選択した。更に、イライザ法による形質変換体の分析は、pBIOC21-PSSp-Lf構成物から得たT30形質変換体によるrhLfの発現率が、pBIOC21-PSLf-Lf構成物から得たT1 9形質変換体と比較して三倍以上であることを明らかにした。この結果は、タンパク質の天然シグナルペプチドをスポラミンのものと置換した方が、rhLfの発現率が高いことを示す。ウエスタンブロット法選択した形質変換体のrhLfの見かけ分子量を検証する為、ウエスタンブロット（図２及び3）及び免疫沈降（図4）による検査を可溶性タンパク質の抽出液で行った。ポリアクリルアミド7.5%のゲルでのSDS-PAGE電気泳動後(可溶性タンパク質20μg／穴)、タンパク質はニトロセルロースに移植した。次にこれを、^*リン酸緩衝食塩水-tween 2%でインキュベートし、リン酸緩衝食塩水-tween 0.05%で三回洗浄した。ウサギの抗血清をDEAE Trisacryl上のクロマトグラフィーで精製し、ウサギの多クローン抗体を生成した。これらは、リン酸緩衝食塩水で500分の１に希釈し(即ち7μg/ml)、20℃で３時間膜と接触した後、膜はリン酸緩衝食塩水-tween 0.05%で洗浄した。続きに、抱合体である、ペルオキシダーゼで標識化したヤギの抗ウサギIgG(Diagnostic Pasteur)をリン酸緩衝食塩水で2500分の１に希釈し、20℃で１時間インキュベートした。膜は更にリン酸緩衝食塩水-twe en 0.05%で三回洗浄した。膜は、最終的なインキュベーションとしてリン酸緩衝食塩水100mlでDAB(四塩化3-3'-ジアミノベンジジン)40mg及びH₂O₂ 200μlの存在下、最終的現像を行った。＊リン酸緩衝食塩水：塩酸ナトリウム150mM、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄ 50mM、 pH 7.5 図２に表示する様に、一回目の形質変換から得た植物の分析は、抗-Lf抗体により認識される、見かけ分子量が80kDaのバンドが存在する。非形質変換の標準、即ちNicotiana tabacum Xanthi変類では信号は全く検出されなかった。rh Lf1の存在はT19形質変換体から検出され、イライザ法による分析の結果を確証した。図３はT30形質変換体から得た可溶性タンパク質のウエスタンブロットを表す。これは、母乳から分離したLfと共遊走する、見かけ分子量が80kDaのrhLf の存在を確証する。rhLfが二重バンドとして現れる。この二重項はN末端での変更（実施例16参照）では説明できないものである。免疫沈降法 Protein-A Sepharose(Pharmacia)6mgをウサギの多クローン抗ヒトラクトフェリン抗体5mgの存在下、室温で一時間インキュベートした。これらの抗体は実施例16同様に生成した。Protein-A Sepharoseのビーズは遠心分離により回収し、トリス緩衝食塩水（トリス-HCl 20mM、塩化ナトリウム150mM、pH8.2）で３回洗浄し、20mlの可溶性タンパク質の抽出液で室温で２時間撹拌した。トリス緩衝食塩水で３回洗浄した後、タンパク質結合体を添加液（トリス62.5mM、ドデシル硫酸ナトリウム2％、ショ糖10％、β-メルカプトエタノール5％、ブロモフェノールブルー5％）によって解離し、ポリアクリルアミド7.5%のゲルでのSDS-PAG Eによって分離し、最後にクーマシーブルーで染色した。図４は、T19形質変換体の可溶性タンパク質の抽出液を免疫沈降した後、r hLfの見かけ分子量が80kDaの二重項の形で表している。T30形質変換体に関して結果は同様である。実施例16-b：トウモロコシの種子内での組換えヒトラクトフェリン（rhLf ）の検出 A. トウモロコシの種子内からの抽出。種子は液体窒素内で砕いた。粉末500mgに緩衝液（トリス-HCl 100mM pH8 、エチレンジアミン四酢酸1mM、塩化ナトリウム250ｍＭ、TRITON X-100 0.2％） 5mlを添加し、4℃で一夜浸漬した。ホモジェネートは4℃で10分間10000gで遠心分離した。Bradford法に準じてタンパク質の定量を行った。 B. ラクトフェリンの免疫検出抽出したタンパク質はトリス50mM pH6.8、ドデシル硫酸ナトリウム4％、ショ糖2 0％、β-メルカプトエタノール1％、ブロモフェノールブルー0.01％の緩衝液の存在下、95℃で５分間の加温で変性した。次にタンパク質は、変性条件下ポリアクリルアミド10%のゲルでの電気泳動によって分離した。泳動後、タンパク質はニトロセルロースの膜に移植した。ラクトフェリンは、ウサギで生成した抗ヒトラクトフェリン抗体、続いてアルカリホスファターゼに結合した抗ウサギIgGによって検出した。 C. pHMWG-IA-PSSp-Lf構成物によって形質転換したトウモロコシの種子のスクリーニング検査した10個の形質転換体の内５個が免疫検出によってポジティブ信号がある。実施例17：組換えヒトラクトフェリン（rhLf）の精製の例臭化シアンによって活性化したSepharose 4B(Pharmacia Biotech)に、多クローン抗ヒトラクトフェリン抗体を連結したアフィニティークロマトグラフィーによってpBIOC21-PSLf-Lfから生じるrhLf1及びpBIOC21-PSSp-Lfから生じるrhL f2を精製した：約3mgの抗体を結合するゲル1mlを、そのpHをトリス1Mによって8.2に調整したタンパク質抽出液100mlで、バッチ式に4℃で一夜インキュベートした。その後、ゲルを大量なトリス緩衝食塩水pH8.2により洗浄した。溶出はグリシン-HCl 0.2M pH2.4緩衝液で、連続的３回で行い、ポリアクリルアミド7.5% のゲルで分析した。この方法は、N末端を分析する為に、rhLf1の調製に使用した。この方法によって精製したrhLf1及びrhLf2のポリアクリルアミド7.5%のSDS-PAGEゲルでの分析は、両方のrhLfの分子量が異ならないことを表した(図5)。 pBIOC21-PSSp-Lfから生じるrhLf2キメラタンパク質に関しては、このタンパク質の分析を深める為に大量の精製を行った。即ち、Biopilot型(Pharmacia B iotech)の装置上、酢酸ナトリウム0.2M pH7の緩衝液で平衡したSP Sepharose Fa st Flow(Pharmacia Biotech)カラムによるイオン交換クロマトグラフィーで、rh Lf2は塩化ナトリウム0〜1Mの勾配で溶出した。収集した画分全体のイライザ検査によって確証された様に、rhLf2はその大部分が塩化ナトリウム0.7Mで溶出した画分に含まれている。ポジティブな画分は、Centripep 30（Amicon、Beverly、USA）を使用する限外ろ過によって濃縮し、リン酸緩衝食塩水（塩酸ナトリウム50mM、Na₂HPO₄-Na H₂PO₄ 50mM、pH7.5）に対して透析し、-20℃で凍結した。rhLf2の純度は、ポリアクリルアミド7.5%のSDS-PAGEゲルでの分析により、検証した。実施例18：組換えヒトラクトフェリンの抽出と精製の別実施例新鮮な或いは凍結した葉は微粉末を得るまで液体窒素で砕いた。可溶性タンパク質は植物物質から、Sepabeads Diaion SP 825(Resindion)又はDiaipn HP 20(Supelco)を1mlにつき0.2グラムの割合で含む抽出緩衝液（トリス-HCl 50mM、エチレンジアミン四酢酸1mM、塩化ナトリウム100mM、ジチオトレイトール1mM、T RITON X-100.2％(重量：体積)、フェニルメチルスルフホニルフロリド1mM、pH7. 0）によって、植物物質１グラムにつき4mlの抽出緩衝液の割合で抽出した。粉砕物は撹伴下4℃で12時間温置した。この段階は、可溶性タンパク質を抽出し、植物色素の一部を疎水的レジンに吸着することを目的とする。45分間15000gで抽出液を遠心分離した後、上清は、0.45ミクロンのMillipore膜でろ過した。植物の抽出液Biopilot型の装置で、酢酸ナトリウム0.2M pH7.8の溶液で平衡したMono-SHR10／10（Pharmacia Biotech）カラムによるクロマトグラフィーで処理した。抽出液をカラムに通した後、酢酸ナトリウム0.2M内の塩化ナトリウム0〜1Mの勾配を60分間カラムに流れ、rhLfはその塩化ナトリウム0.8Mで溶出した画分に含まれていた。この画分は‐20℃で冷凍した。この方法は、N末端を分析する為に、rhLf1の調製に使用した。この方法によって精製したrhLf1及びrhLf2のポリアクリルアミド7.5%のSDS-PAGEゲルでの分析は、両方のrhLfの分子量が異ならないことを表した(図5)。 pBIOC21-PSSp-Lfから生じるrhLf2キメラタンパク質に関しては、このタンパク質の分析を深める為に、大量の精製を行った。即ち、Biopilot型（Pharmaci a Biotech）の装置上、酢酸ナトリウム0.2M pH7の緩衝液で平衡したSP Sepharos e Fast Flow（Pharmacia Biotech）カラムによるイオン交換クロマトグラフィーで、rhLf2は塩化ナトリウム0 〜1Mの勾配で溶出した。収集した画分全体のイライザ検査によって確証された様に、rhLf2はその大部分が塩化ナトリウム0.7Mで溶出した画分に含まれている。この画分は-20℃で凍結した。実施例18：N末端配列の分析エドマンの分解法によるN末端配列の分析は両構成物各個、即ち、rhLf1及びrhLf2タンパク質の最初の７アミノ酸の配列がGRRRRSVであることを示し、これは基準となる成熟ヒトラクトフェリンのN末端の正確な配列に相当する。これらの結果は、サツマイモのスポラミン又はヒトラクトフェリンの分泌用シグナルペプチドと成熟ヒトラクトフェリンをコードする配列の融合が正確な切断を可能とすることを示す。実施例20：MALDI/TOF質量分析法による分析分析はMALDI Vision 2000レーザー脱着質量分計（Finnigan MAT、Brennen 、ドイツ）で行った。ラクトフェリン100pモルを含む溶液3μlを、2,5-ジヒドロ安息好酸10mg/mlを水/アセトニトリル（30/70）の混合液に含む基質液17μlに添加した。この容液は質量基準（シナピン酸での分子質量79590Daである血清ヒトトランスフェリン、Sigma）と同時に標的に向けて発射した。ラクトフェリンの分子質量は81250Daで、これは計算上分子質量（76320Da）であるrhLfのポリペプチド鎖に全分子質量が5180Daのグリカン２個を連鎖したものに相当する。これらの値から、グリカンの割合は糖タンパク質の全質量の6.35％を表す。実施例21：rhLf2のグリカンの構成糖タンパク質の単糖類をOV 101キャピラリーカラム上の気相クロマトグラフィー及びGirdel 300上のクロマトグラフィーで分析した。ヘリウム気流は10ml/mnで、気圧は0.5バールであった。温度は2℃/mnで120℃から2 40℃にプログラムした。メタン溶解法（Zanettaら、1972）、再N-アセチル化、及びトリメチルシリル化（Kamerligら、1975）によってトリメチルシリル化した由来物を得た。分析は糖タンパク質内にての全糖分の割合が6.5％であることを表す。モル構成は下記に示した。結果はrhLf2のグリカンが、単糖類のモル構成が異質なN-アセチルラクトサミン型であることを示す。主に注目するべきはキシロースの存在、ガラクトースの少なさ、N-アセチルノイラミン酸の非存在である。実施例22：ジャーカット細胞との結合実験複数のリンパ球においての研究は、その表面にラクトフェリン特異的の受容体が存在することを確証した。リンパ球の表面での出現は、分裂促進剤である植物性凝集素（PHA、Mazurierら、1989）を使用して研究した。研究は、静止状態のリンパ球はラクトフェリンの受容体がなく、植物性凝集素が、循環しているリンパ球の表面においての高親和性受容体の出現を誘導することを表し、この受容体は活性化後最初の二日間合成される。PHAによる活性化の条件下、結合定数及び結合部位の数はそれぞれ80nMと200000nMである。近年、同じ受容体は、安定で再現可能な結果を得るジャーカットリンパ芽球系において研究された(Biら、1 994)。rhLf2の結合研究において、このジャーカット細胞系を組換えタンパク質の生物活性の実験に使用した。ジャーカット系のTリンパ芽球は、予め熱失活したウシ胎児血清10％の存在下、Hepes 25mM、L-グルタミン2mM、ゲンタマイシン（5mg/ml）を含むRPMI 16 40（GIBCO、Cergy-Pontoise、フランス）pH7.4培地で、二酸化炭素5％の保温器内37℃で培養した。結合実験のため、サブコンフルエント段階で細胞は濃度4.10⁵/ml に希釈した。製造者の使用方法に準じてIodobeads（Pierce、Rockford、USA）を使用し、¹²⁵I 0.2mCiでrhLf2 100μgの標識を行った。遊離ヨウ素は、リン酸緩衝食塩水（塩酸ナトリウム50mM、Na₂HPO₄-NaH₂PO₄50mM、pH7.5）で平衡したSephadex G -25カラムによって排除した。細胞又はプラスチックにrhLf2が非特異的に結合するのを防ぐ為、結合実験は、ヒトトランスフェリン0.4％（重量：体積）を含むR PMIで行った。細胞5.10⁵を含む100mlのアリコットを0〜100mMまで上昇する濃度の標識rhLf2の存在下、1.5mlのプロピレンチューブに分けた。非特異的結合の測定は、100倍モル過剰の非標識Lfの存在下行った。細胞はタンパク質と4℃で一時間アジ化ナトリウム0.01％(重量：体積)の存在下インキュベートした。最後に、細胞はRPMI１mlで３回洗浄し、ペレットは最終的に、リン酸緩衝食塩水0.5mlで可溶した。次に放射能は、Compugammaガンマ線計数管L KB-Wallac（Turku、Finland）で測定した。ジャーカットTリンパ芽球細胞において、¹²⁵Iで標識したrhLf2の結合は、スキャッチャード法（1949）によって分析した。図６に表わすように、rhLf2と乳から分離したLfhの結合曲線は同様である。使用したLfの範囲では、80.27±33 nMの解離定数で、各細胞上の部位数が124400±36000である単一種類の受容体が細胞の表面で検出された。同じ細胞上、hLfは89.7±22nMの解離定数で103300±1 4000の各細胞上部位数で結合する。以上、結合実験は、同じパラメーターでリンパ球の受容体に認識されることからrhLf2が母乳Lfと近い立体配座であることを表わす。実施例23：rhLf2のHT29細胞の表面での結合母乳ラクトフェリンの結合は、腸細胞へ分化可能なヒト結腸の腺ガンから由来した腸細胞系（HT-29）において実証した(Mikogamiら、1994、1995)。この研究者は、ラクトフェリンの腸細胞の受容体との結合は鉄による飽和には無関係で、特異的であり、つまり静電的又はレクチン的な相互作用から生じるものではないことを証明した。 HT29系の細胞では、各細胞上の部異数は約3.10⁶で、Kdは約10^-6Mである。 HT-29-18C1クローンはこれらの特徴に適し、その生物活性を確認する為、rhLf2 の結合実験に使用した。クローン18C1のHT29細胞を、予め熱失活したウシ胎児血清10％の存在下、 L-グルタミン2mM、ゲンタマイシン（5mg/l）を含むDMEM（Eurobio、Les Ulis、フランス）で、二酸化炭素5％の保温器内37℃で培養した。この段階での集密直前で細胞は分離し、2cm²の穴にて、2.10⁴細胞/cm²の割合で再培養した。腸細胞への分化を可能とする21日間培養後、これらの細胞は結合研究に使用した。 rhLf2は実施例19に記述したのと同様に¹²⁵Iで標識した。各穴の細胞はアジ化ナトリウム0.01％(重量：体積)及びラクトフェリンの非特異結合を防ぐヒトトランスフェリンの存在下、氷上一時間インキュベートした。細胞に提示した遊離リガンドの濃度を計算する為、50μlの試料の放射能を測定した。DPBS+（Sigm a、品目番号D1283）500μlで５回濯いだ後、細胞はDPBS+/EDTA(5g/l)200μlによって脱着し、結合したrhLf2の放射能は、Compugamma λ線計数管LKB-Wallacで測定した。 HT-29-18C1腸細胞において、¹²⁵Iで標識したrhLf2の結合は、スキャッチャード法によって分析した。図７に表わすように、rhLf2と乳から分離したLfの結合曲線は同様である。使用したLfの範囲では、0.8±0.19μMの解離定数で各細胞上の部位数が1.8ｘ10⁶±0.28x10⁶である単一種類の受容体が細胞の表面で検出された。同じ細胞上、ヒトラクトフェリンは1±0.2μMの解離定数で、4ｘ10⁶±0.5x10⁶の各細胞上部位数で結合する。この腸細胞上の結合は、実施例19と同様に、rhLf2がラクトフェリン特異的受容体に未変性タンパク質と同様に認識されることから立体配座良く、生物活性が母乳から分離したラクトフェリンと一致することを表わす。実施例24：ウシラクトフェリンの植物内での生成及び精製今発明の記述した方法の使用によりウシラクトフェリンの植物内での生成が可能となる。図面の説明図１：全可溶性のタンパク質に対してrhLf1の発現率(％で示す)。欄１から１９：初生の形質転換体。欄NT：非形質転換タバコ。図２：ウエスタンブロット法によって、初生の形質転換体からの可溶性のタンパク質の抽出物でのrhLf1検出。レーン１，２，１８，１９，２０：初生の形質転換体。レーンNT：非形質転換タバコ。分子量対照の位置は左側に示している。図３：ウエスタンブロット法によって、初生の形質転換体T30からの可溶性のタンパク質の抽出物でのrhLf2検出。（２）形質転換体T30。（２）乳から単利したヒトLf。分子量対照の位置は左側に示している。図４：免疫沈降法によって、初生の形質転換体T19からの可溶性のタンパク質の抽出物でのrhLf1検出。SDS-PAGE分析はrhLf1と抗Lf抗体を示す。分子量対照の位置は左側に示している。図５：アフィニティークロマトグラフィーによる精製後のrhLf1とrhLf2の分析。レーン(１)：rhLf1、レーン(２)：rhLf2。分子量対照の位置は左側に示している。定的な結合。Lfが¹²⁵Iで，標識された。非特定的な結合は１００モル過剰で測定した、全結合の約２５％である。全結合から系統的に除く。この値は、二つの別の実験で決定したもので、各実験は２回繰り返す。 Lfが¹²⁵Iで，標識された。非特定的な結合は１００モル過剰で測定した、全結合の約２５％である。全結合から系統的に除く。この値は、二つの別の実験で決定したもので、各実験は２回繰り返す。

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Claims

【特許請求の範囲】１．一方では、ラクトフェリン、特に哺乳類のラクトフェリン、好ましくはウシ、ブタ、ヤギ、ヒトラクトフェリン、又は由来タンパク質をコードする cDNAを、また他方では、当該cDNAによりコードされるラクトフェリン又は由来タンパク質を植物細胞に生成されることに必要な要素、特に植物細胞の転写機械が認識する転写プロモーター及びターミネーターを含む組換え核酸配列を、細胞からもしくはこれから取得した植物から、ラクトフェリン又は由来タンパク質を得る目的として、植物細胞を形質転換する為の利用。２．請求項１記載の組換え核酸配列の利用において、利用された核酸配列は組換えポリペプチドの分泌に必要なシグナルペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする利用。３．請求項２記載の組換え核酸配列の利用において、利用されたシグナルペプチドはサツマイモのスポラミンAのシグナルペプチドであることを特徴とする利用。４．一方では、ラクトフェリン、特に哺乳類のラクトフェリン、好ましくはウシ、ブタ、ヤギ、ヒトラクトフェリン、又は由来タンパク質をコードする配列を、また他方では、当該配列によりコードされるラクトフェリン又は由来タンパク質を植物細胞に生成されることに必要な要素を、特に植物細胞の転写機械が認識する転写プロモーター及びターミネーターを含むことを特徴とする組換え核酸配列。５．請求項４記載の組換え核酸配列において、組換えポリペプチドの分泌に必要なシグナルペプチドをコードする配列を含むことを特徴とする核酸配列。６．請求項５記載の組換え核酸配列において、利用されたシグナルペプチドはサツマイモのスポラミンAのシグナルペプチドであることを特徴とする核酸配列。７．場合によっては、その複製に影響を与えない部位に挿入した、請求項４から６記載の核酸配列を含むベクター、特にプラスミド。８．請求項７記載のベクターによって形質転換した宿主細胞、特にアグロバクテリウム・ツメファシェンス等のあらゆるバクテリア。９．ラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質の取得方法において、 − 特にそれ自身は、請求項７記載のベクターによって形質転換された、請求項８記載の宿主細胞によって、請求項４から６記載の組換え配列を細胞のゲノムに組込むように植物細胞を形質転換すること、 − 場合によっては、上記の形質転換細胞からの形質転換植物を取得すること、 − 特に抽出と、場合により、その後の精製によって、当該上記形質転換した植物又は細胞内のラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質を回収すること、から成ることを特徴とする取得方法。１０．請求項４から６記載の一つ（又は複数）の組換え核酸配列を含み、ゲノム内に安定した形式で組込んだことを特徴とする、特にアブラナ、タバコ、トウモロコシ、エンドウマメ、トマト、ニンジン、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ヒマワリ、レタス、コメ、ウマゴヤシ及びテンサイの中から選択する遺伝形質転換の植物、植物抽出物又は植物の部分、特に葉、及び／又は果実及び／又は種子、及び/又は植物細胞。１１．請求項９記載の方法によって取得されたことを特徴とするラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質。１２．本発明によるラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質を含むことを特徴とする特にアブラナ、タバコ、トウモロコシ、エンドウマメ、トマト、ニンジン、コムギ、オオムキ、ジャガイモ、ダイズ、ヒマワリ、レタス、コメ、ウマゴヤシ及びテンサイの中から選択した遺伝形質転換の植物、植物抽出物又は植物の部分、特に葉、及び／又は果実及び／又は種子、及び /又は植物細胞。１３．医薬、医用、歯科、化粧又はバイオテクノロジー組成物を得る為に、請求項１０又は１２記載の植物、植物抽出物又は植物部分、及び／又はタンパク質（ラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質）の利用。１４．請求項１０又は１２記載の植物、植物抽出物、植物の部分及び／又は請求項１１記載のタンパク質（ラクトフェリン、特にヒトラクトフェリン又は由来タンパク質）から成ることを特徴とするバイオ物質又は医薬、医用、歯科、化粧又はバイオテクノロジー組成物。