CZ330997A3

CZ330997A3 - Rekombinantní preduodenální lipázy a polypeptidové deriváty produkované rostlinami, způsob jejich získávání a použití

Info

Publication number: CZ330997A3
Application number: CZ973309A
Authority: CZ
Inventors: Philippe Lenne; Véronique Gruber; Sylvie Baudino; Bertrand Merot; Claude Benicourt; Claire Cudrey
Original assignee: Parke-Davis
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-19
Publication date: 1998-03-18
Also published as: EP0822988A2; ZA963146B; AU718905B2; HUP9801438A2; UA73267C2; JP4077875B2; US20040072317A1; FR2733249A1; BG101959A; ATE313632T1; JP2007325590A; CA2218418A1; WO1996033277A3; CN1185178A; ES2256858T3; BG64320B1; FR2733249B1; MX9707973A; WO1996033277A2; AU5696796A

Description

* Vynález se týká rekombinantních preduodenálních lipáz, zejména rekombinantních gastrických lipáz a dále polypeptidových derivátů těchto sloučenin, vykazujících účinek lipázy, stejně jako jejich použití, zejména jako funkční potrava nebo ve farmaceutických kompozicích nebo v enzymatických formulacích s agro-alimentárními nebo průmyslovými aplikacemi.

Dosavadní stav techniky

Psí gastrická lipáza (LGC - lipase gastrique de chien) je glykoprotein 379 aminokyselin (AA) o molekulové hmotnosti zhruba 50 kilodaltonů (kDa), syntetizovaný ve formě prekurzoru, obsahujícího na aminoterminálním konci (NH2-terminál) signální peptid a vylučovaný medjánními buňkami sliznice psího žaludku (Carriěre F. a kol., 1991).

Lidská gastrická lipáza (LGH - lipase gastrique humaine) je přirozeně syntetizována ve formě prekurzoru a je popsána v publikaci Bodmer M.W. a kol., 1987. Maturovaný protein lidské gastrické lipázy je tvořen 379 aminokyselinami. Jeho signální peptid se skládá z 19 aminokyselin.

• * » · « <

• ·

Tyto proteiny náleží do skupiny lipáz, nazývaných „preduodenální“, jejíž některé členy již byly purifikovány a někdy dokonce klonovány (Docherty A.J.P. a kol., 1 985; Bodmer

M.W. a kol., 1987; Moreau H. a kol., 1988; Evropské patenty č.

191 061 a č. 0 261 016).

r

Po dlouhou dobu bylo pokládáno za dokázané, že hydrolýza alimentárních lipidů se odehrává na úrovni tenkého střeva díky “ působení enzymů, produkovaných slinivkou břišní (Bernard C.,

1849).

Pozorování však nicméně dovolují předpokládat, že hydrolýza triglyceridů může probíhat v žaludku působením preduodenálních enzymů (Volhard, F. 1901; Shonheyder, F. a Volquarts, K., 1945). Tyto enzymy, a obzvláště psí gastrická lipáza, mají enzymatické a fyzikálně-chemické vlastnosti, které je odlišují od savčích pankreatických lipáz. Tyto rozdíly mezi pankreatickými a gastrickými lipázami spočívají v zásadě v následujících bodech: molekulová hmotnost, složení z aminokyselin, odolnost proti pepsinu, specificita substrátu, optimální pH působení a stabilita v kyselém prostředí.

c?

/ ___ Navíc, in vitro a za jistých podmínek, je možno prokázat synergii i působení mezi účinky gastrických a pankreatických lipáz na hydrolýzu triglyceridů s dlouhými řetězci (Gargouri, Y. a kol., 1989).

Je známo více patologických situací (mucoviscidóza, exokrinní pankreatická nedostatečnost), kdy pacienti úplně nebo částečně postrádají exokrinní pankreatickou sekreci a tedy i enzymy, potřebné pro hydrolýzu potravy (amylázy, lipázy a proteázy).

Absence absorpce tuků na intestinální úrovni, zejména absorpce triglyceridů s dlouhými řetězci, se projevuje tím že se u pacientů velmi významně zvýšení steatorrhea a velmi citelně se zpomalí přibývání na váze u mladých pacientů. Pro korekci těchto poruch jsou pacientům podávány při jídle pankreatické extrakty vepře, Terapeutická účinnost těchto extraktů může být velmi zvýšena i současným podáváním psí gastrické lipázy díky jejímu specifickému účinku na triglyceridy s dlouhými řetězci. ►

I

V článku Carriěre a kol. (1991) je popsána purifikace a určení terminální sekvence psí gastrické lipázy. Způsob, dovolující extrakci tohoto enzymu z psího žaludku je v této publikaci popsán také. Tento způsob v zásadě spočívá v tom, že se psí žaludek podrobí maceraci v kyselém prostředí (pH 2,5) v přítomnosti ve vodě rozpustných solí, usnadňujících vylučování lipázy v tomto prostředí. Etapy filtrace na molekulárním sítu a chromatografie iontovou výměnou dovolují purifikovat homogenní psí gastrickou lipázu. Purifikovaná psí gastrická lipáza, získaná tímto procesem, je glykoprotein o molekulové hmotnosti 49000 daltonů, z nichž 6000 odpovídá cukrům a 43000 proteinové části.

p

Zřejmé obtíže při získávání psích žaludků zabraňují jakémukoli ' rozvoj i tohoto způsobu jak na úrovni laboratorní, tak na úrovni ( průmyslové. Odsud vyplývá nutnost nalézt způsob, který by dovoloval produkci psí gastrické lipázy ve velkých množstvích a to bez použití psích žaludků.

Nukleotidová a peptidová sekvence psí gastrické lipázy byla určena s cílem průmyslové produkce psí gastrické lipázy s použitím metod genového inženýrství. Tyto práce tvoří předmět • « mezinárodní přihlášky vynálezu č. WO 94/1 38 1 6, podané 16. prosince 1993.

Způsob produkce rekombinantní psí gastrické lipázy, popsaný v této mezinárodní přihlášce nárokuje využití Escherichia coli (E. coli) jako transformované hostitelské buňky, která může _¥ produkovat psí gastrickou lipázu.

Jisté obtíže, na které sé narazilo při výrobě rekombinantní psí gastrické lipázy pomocí E. coli, zejména nutnost kultivovat značná množství E. coli ve fermentátorech, která přináší zvýšené náklady, vedla vynálezce k hledání jiných způsobů produkce této psí gastrické lipázy.

Buňky savců jsou a priori lépe adaptovány na expresi savčích genů. Jejich použití nicméně přináší problémy při maturaci proteinů. Enzymatické soubory, které realizují post-translační maturaci, jsou různé a liší se v závislosti na tkáni, orgánu a druhu. Například bylo popsáno, že post-translační maturace plasmatického proteinu může být různá, jestliže je protein získán z lidské krve nebo jestliže je produkován rekombinantními buňkami, jako jsou například ovariální buňky čínského křečka _r . .. nebo v mléku transgenického zvířete. Kromě toho nízká úroveň , exprese, dosažená v případě použití savčích buněk, implikuje používání kultur in vitro o velmi velkých objemech a tedy s vysokými náklady. Výroba rekombinantních proteinů v mléku transgenických zvířat (myš, ovce a kráva) dovoluje snížit výrobní náklady a překonat problémy s úrovní exprese. Zůstávají nicméně etické problémy a problémy s virální a subvirální (priony) kontaminací.

» *

Z těchto důvodů genový přenos savčích genů do rostlinné buňky může přinést způsob výroby nových rekombinantních proteinů ve velkých objemech při snížených výrobních nákladech a bez rizika virální a subvirální kontaminace.

V roce 1983 řada laboratoří objevila, že je možno přenést heterologické geny do genomu rostlinné buňky (Bevan a kol., 1983; Herrera-Estrella a kol., 1983 a a 6) a regenerovat »transgenické rostliny z geneticky modifikovaných buněk. Všechny rostlinné buňky vykazovaly tudíž modifikovaný genetický charakter, který je přenášen na potomstvo při pohlavním oplodňování.

Díky těmto pracím se řada skupin začala zajímat o produkci rekombinantních savčích proteinů v rostlinných buňkách nebo v transgenických rostlinách (Barta a kol., 1986; Marx, 1982). Jeden z prvních skutečně významných výsledků v této oblasti byla výroba protilátek v transgenických rostlinách tabáku (Hiatt a kol., 1989).

Pro expresi heterologického proteinu v semenu, místu uchovávání pro t e inů u rostl i η, v 1 o ži 1 a _ s kup i n a_k t e r o uv e d_L Vand e k e r c kh o ve__________________^c ξ

(1989), sekvenci kódující leu-enkefalin do genu, kódujícího albumin 2S u Arabidopsis' thaliana. Pomocí této konstrukce byly ;

vytvořeny rostliny transgenické řepky, které exprimovaly leuenkefalin specificky v semenech při úrovni exprese řádově 0,1 % celkových proteinů. V roce 1990 Sijmons a spolupracovníci přenesli gen lidského sérového albuminu do buněk tabáku a brambor. Bez ohledu na původ signálních peptidu (lidské nebo rostlinné) bylo dosaženo poměru lidského sérového albuminu řádově 0,02 % celkových proteinů, získaných v listech, stoncích • * · · a hlízách brambor.

Pomocí rostlin byly produkovány i další rekombinantní savčí proteiny; například povrchový antigen hepatitidy B (Mason a kol., 1992); interferony (De Zoeten a kol., 1989; Edelbaum a kol., 1992; Truve a kol., 1993); myší protilátky antiStreptococcus mutans, agens zubního kazu (Hiatt a Ma, 1992; Ma * a kol., 1994), fragmenty protilátek scFV působících proti » rakovinovým buňkám (Russel D., 1994), protilátky anti-Herpes (Russel D., 1994), hirudin (Moloney a kol., 1994), cholerový toxin (Hein R., 1994) a růstový faktor lidského epidermu (E.G.F.) Higo a kol., 1 993).

Soubor těchto výzkumů dovolil dokázat, že je možná výroba rekombinantních savčích proteinů v rostlinných buňkách a že mechanismy této syntézy proteinů, vycházející ze sekvencí DNA, jsou podobné v buňkách živočišných a v buňkách rostlinných. Existují však nicméně některé rozdíly mezi rostlinnými a živočišnými buňkami, zejména na úrovni maturace polymannosidových glykanů na komplexní glykany nebo na úrovni míst štěpení signálních peptidů, což nedovoluje zaručit získání * aktivních nebo dostatečně aktivních savčích proteinů transformací rostlinných buněk.

—— ' ’ - ‘9

Podstata vynálezu

Vynález se týká rekombinantní preduodenální lipázy a polypeptidových derivátů produkovaných rostlinami, způsobu jejich získávání a použití.

Vynálezci prokázali, že použití rostlinných buněk,

transformovaných prostřednictvím vhodné rekombinantní nukleotidové sekvence dovoluje získat rekombinantní psí gastrickou lipázu nebo rekombinantní lidskou gastrickou lipázu nebo odvozené polypeptidy těchto dvou látek, vykazující dostatečný enzymatický účinek k tomu, aby byly vytvářeny průmyslovým způsobem.

Cílem předkládaného vynálezu je podat nový způsob výroby preduodenálních rekombinantních savčích lipáz, obzvláště rekombinantní psí gastrické lipázy a rekombinantní lidské gastrické lipázy, s využitím rostlin, popřípadě výroby polypeptidových derivátů uvedených lipáz, které vykazují enzymatický účinek, obzvláště účinek lipázy, takový, že uvedené rekombinantní lipázy nebo jejich polypeptidové deriváty mohu být využívány průmyslovým způsobem.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je podat nástroje k provádění uvedeného způsobu, zejména nové nukleotidové rekombinantní sekvence, geneticky transformované rostlinné buňky, geneticky transformované rostliny nebo části rostlin (zejména listy, stonky, plody, semena nebo zrna, kořeny) a ________geneticky transformované fragmenty uvedených rostlin a částí rostlin.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je podání nových preduodenálních rekombinantních savčích lipáz nebo jejich polypeptidových derivátů, které jsou enzymaticky aktivní a takové, že byly získány z geneticky transformovaných rostlinných buněk nebo rostlin.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout nové enzymatické kompozice, které mohou být používány při provádění enzymatických reakcí, zejména reakcí prováděných v průmyslovém měřítku.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout nové farmaceutické kompozice, zejména kompozice použitelné při léčení patologií, spojených s nedostatečnou produkcí lipáz organismem pacienta, jako je například mucoviscidóza.

f

Dalším cílem předkládaného vynálezu je podat nová paliva, označovaná také jako biopaliva, která jsou výhodná tím, že vytvářejí méně znečištění než paliva z ropy a mají nižší výrobní náklady.

Vynález je v dalším blíže vysvětlen prostřednictvím obrázků, na kterých obr. 1 představuje nukleotidovou sekvenci cDNA, jejíž nukleotidy, nacházející se v polohách 1 až 1137, kódují psí gastrickou lipázu, znázorněnou na obr. 2 a odpovídající sekvenci SEQ ID NO 2, obr. 2 představuje sekvenci aminokyselin psí gastrické lipázy a odpovídá sekvenci SEQ ID NO 2, obr. 3 představuje nukleotidovou sekvenci odvozenou od sekvence cDNA, znázorněné na obr. 1 a odpovídající sekvenci SEQ ID NO 1, přičemž nukleotidy, nacházející se v polohách 1 až 1137 uvedené odvozené sekvence kódují psí gastrickou lipázu, která je znázorněna na obr. 2 a odpovídá sekvenci

SEQ ID NO 2, obr. 4 představuje nukleotidovou sekvenci cDNA, jejíž nukleotidy, nacházející se v polohách 47 až 1240 kódují prekurzor lidské gastrické lipázy o 398 aminokyselinách a nukleotidy, nacházející se v polohách 104 až 1240, kódují maturovanou lidskou gastrickou lipázu o 379 aminokyselinách, obr. 5 představuje sekvenci aminokyselin lidské gastrické lipázy, přičemž prekurzor je ohraničen aminokyselinami, nacházejícími se v polohách 1 až 398 a maturovaná lidská gastrická lipáza je ohraničena aminokyselinami, nacházejícími se v polohách 20 až 398, obr. 6, 7 a 8 představují výsledky imunodetekčních pokusů typu „Western“ s rekombinantními polypeptidy produkovanými listy a semeny tabáku Xanthi, semeny řepky a listy a plody rajského jablka, _____________________ trans f o r m o v a n ý m i pomocí řeko mbinantní c h s e k v en c í podle vynálezu, obr. 9 a 10 představují jednotlivě výsledky analýzy pomocí elektroforézy na polyakryla-midovém gelu a dosažené přenosem tohoto gelu na nitrocelulózovou membránu a prokázání purifikované psí gastrické lipázy, získané z listů tabáku, pomocí protilátek proti psí gastrické lipáze, obr. 11 představuje příklad detekce glykanových reziduí rekombinantní psí gastrické lipázy na membráně, obr. 12 představuje’ analýzu purifikované psí gastrické lipázy, získané ze semen řepky, pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu, obr. 13, 14 a 15 znázorňují výsledky různých pokusů, prováděných v rámci získání methylesteru kyseliny olejové ze semen, transformovaných podle vynálezu.

Předmětem předkládaného vynálezu je použití nukleotidové rekombinantní sekvence obsahující na jedné straně cDNA, kódující všechny preduodenální savčí lipázy, to jest lipázy, jejichž nukleotidové sekvence kódující uvedené lipázy vykazují mezi sebou procento homologie alespoň okolo 75 %, zejména od asi 77 % až do asi 85 % homologie a jejichž sekvence aminokyselin vykazují mezi sebou procento homologie alespoň 70 %, zejména od nejméně asi 80 % do asi 90 % homologie, vykazují vlastnost acidoresistence a jsou aktivní při pH od okolo

1,5 do okolo 5, zejména při pH od asi 1,5 do asi 2, zejména cDNA kódující všechny gastrické savčí lipázy, nebo cDNA /kódující všechny polypeptidy odvozené od výše uvedených preduodenálních lipáz adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, přičemž tento odvozený polypeptid vykazuje výše uvedené vlastnosti preduodenálních lipáz a na druhé straně prvky, dovolující rostlinné buňce produkovat preduodenální lipázu, kódovanou uvedenou cDNA nebo produkovat odvozený polypeptid, takový jaký byl -popsán výše, zejména promotor a terminátor transkripce, rozpoznávaný transkripčním mechanismem rostlinných buněk, pro transformaci rostlinných buněk s cílem získat z uvedených rostlinných buněk nebo z rostlin, získaných s využitím těchto buněk, rekombinantní preduodenální savčí iipázu ve formě aktivního enzymu nebo jeden nebo více polypeptidů, odvozených od uvedené lipázy, takových, jaké byly definovány výše.

Předmětem předkládaného vynálezu je obzvláště použití rekombinantní nukleotidové sekvence obsahující na jedné straně cDNA, znázorněnou na obr. 1 a kódující psí gastrickou Iipázu (LGC), znázorněnou na obr. 2 nebo nukleotidovou sekvenci, odvozenou z této cDNA, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo a/nebo substitucí jednoho nebo více nukleotidů, přičemž tato sekvence může kódovat polypeptid, jehož sekvence aminokyselin je identická sekvenci aminokyselin psí gastrické lipázy, znázorněné na obr. 2 nebo polypeptid odvozený z psí gastrické lipázy adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, přičemž tento odvozený polypeptid vykazuje účinek lipázy a na druhé straně prvky, dovolující rostlinné buňce produkovat polypeptid, kódovaný uvedenou cDNA nebo výše uvedenou odvozenou sekvencí, zejména promotor a terminátor transkripce, rozpoznávaný transkripčním mechanismem rostli η n ý c h buně k (a obzvláště j e j i c h RNA póly m e r á z am i), pro transformaci rostlinných buněk s cílem získat z uvedených rostlinných buněk nebo z rostlin, získaných s využitím těchto buněk, rekombinantní psí gastrické lipázy ve formě aktivního enzymu nebo jeden nebo více polypeptidů, odvozených od uvedené lipázy, takových, jaké byly definovány výše.

Předkládaný vynález se také týká každé výše uvedené rekombinantní nukleotidové sekvence, obsahující jakožto cDNA tu kyselinu, která je znázorněna na obr. 1 nebo nukleotidovou sekvenci od ní odvozenou výše uvedeným způsobem.

Vzhledem k tomu je předmětem předkládaného vynálezu obzvláště každá rekombinantní nukleotidová sekvence popsaná výše, obsahující cDNA, znázorněnou na obr. 1 a kódující psí gastrickou lipázu (LGC), znázorněnou na obr. 2.

Předmětem předkládaného vynálezu je obzvláště ještě každá rekombinantní nukleotidová sekvence, popsaná výše, obsahující nukleotidovou sekvenci odvozenou od cDNA, znázorněné na obr. 1, přičemž uvedená odvozená cDNA je taková, jako bylo definováno výše a kódující psí gastrickou lipázu (LGC), znázorněnou na obr. 3. Jedna taková sekvence je výhodně znázorněna na obr. 3 a odpovídá sekvenci, znázorněné na obr. 1, ve které byl nukleotid A v poloze 12 nahrazen nukleotidem G, nukleotid T v poloze 13 byl nahrazen nukleotidem C a nukleotid A v poloze 15 byl nahrazen nukleotidem T.

Výhodně obsahují rekombinantní nukleotidové sekvence podle vynálezu jednu nebo více sekvencí, kódujících peptid, zodpovědný za směrování rekombinantních polypeptidů podle vynálezu (to jest rekombinantní psí gastrická lipáza nebo výše uvedené polypeptidy, z ní odvozené) v prostoru, vymezeném rostlinnou buňkou, zejména v endoplasmatickém retikulu nebo ve vakuolách, nebo dokonce vně buňky, v pektocelulární stěně nebo v extracelulárním prostoru, nazývaném také apoplasma.

Mezi terminátory transkripce, které mohou být používány pro transformaci rostlinných buněk podle předkládaného vynálezu, je možno uvést terminátor polyA 35S viru mozaiky květáku (CaMV), popsaný v článku Franck a kol., 1 980 nebo terminátor polyA ♦ ♦ ·

NOS, odpovídající nekódující oblasti v 3' genu nopalin syntházy plasmidu Ti kmenu Agrobacterium tumefaciens (Depicker a kol.,

1982).

Vzhledem k tomu je předmětem vynálezu také každá rekombinantní nukleotidová sekvence taková, jaká byla popsána výše, obsahující v přední části uvedené cDNA nebo její odvozené sekvence terminátor polyA 35S viru CaMV nebo terminátor polyA NOS Agrobacterium tumefaciens.

Mezi promotory transkripce, které je možno použít pro transformaci rostlinných buněk podle předkládaného vynálezu je možno uvést:

- promotor 35S nebo výhodně dvojitý konstitutivní promotor 35S (pd35S) viru CaMV, přičemž tyto promotory dovolují expresi rekombinantních polypeptidů podle vynálezu v rostlině, získané s využitím transformovaných buněk podle vynálezu a jsou popsány v článku Kay a kol., 1987,

- promotor pCRU genu kruciferinu ředkvičky, dovolující expresi rekombinantních polypeptidů podle vynálezu výhradně v ___semenech__(nebo___zrnech) rostliny, získané s využitím transformovaných buněk podle vynálezu a popsaný v článku Depigny-This a kol., 1992,

- promotory pGEAl a pGEA6, odpovídající nekódující oblasti 5' genů zásobních proteinů obilí, GEA1 a GEA6, Arabindopsis thaliana (Gaubier a kol., 1993) a dovolující specifickou expresi v zrnech,

- promotor chimérický superpromotor pSP (PCT/US94/12946), konstituovaný fůzí trojnásobného opakování transkripčního aktivačního prvku promotoru genu octopinsyntházy f- 9

Agrobacterium tumefaciens, transkripčního aktivačního prvku promotoru genu mannopinsyntházy a promotoru mannopinsyntházy Agrobacterium tumefaciens,

- promotor aktinu rýže, následovaný introném aktinu rýže (pARIAR), obsažený v plasmidu pActl-F4, který popsal McElroy a kol. (1991)

- promotor genu yzeinu kukuřice (pyzein), obsažený v plasmidu py63, který popsal Reina a kol. (1990), který dovoluje expresi albumenu v semenech kukuřice.

Vzhledem k tomu je předmětem vynálezu také každá rekombinantní nukleotidová sekvence, popsaná výše, obsahující v přední části uvedené cDNA nebo její odvozené sekvence dvojitý konstitutivní promotor 35S (pd35S) viru CaMV, nebo promotor pCRU genu kruciferinu ředkvičky nebo promotory pGEAl a pGEA6 Arabindopsis thaliana nebo superpromotor pSP Agrobacterium tumefaciens nebo pAR-IAR rýže nebo promotor pyzein kukuřice.

Sekvence kódující peptid směrování, - používaný podle předkládaného vynálezu, může být původu rostlinného, lidského nebo živočišného.

Jako sekvence kódující peptid směrování rostlinného původu je možno uvést:

- nukleotidovou sekvenci 69 nukleotidů (popsanou v příkladech, které následují), kódující prepeptid (peptidový signál) o 23 aminokyselinách sporaminu A u sladkého bramboru, přičemž tento peptidový signál dovoluje vstup rekombinantních polypeptidů podle vynálezu do systému sekrece rostlinných buněk transformovaných podle vynálezu (to jest hlavně do endoplasmatického retikula),

- nukleotidovou sekvenci 42 nukleotidů (popsanou v příkladech, které následují), kódující N-terminální propeptid vakuolárního směrování o 14 aminokyselinách sporaminu A u sladkého bramboru, dovolující shromažďování rekombinantních polypeptidů podle vynálezu ve vakuolách rostlinných buněk, transformovaných podle vynálezu,

- nukleotidovou sekvenci 111 nukleotidů (popsanou v příkladech, které následují), kódující prepropeptid o 37 aminokyselinách sporaminu A, tvořeného od N-terminální části k C-terminální části 23 aminokyselinami výše uvedeného signálního peptidu, následovanými 14 aminokyselinami výše uvedeného propeptidu, přičemž uvedený prepropeptid dovoluje vstup rekombinantních polypeptidů podle vynálezu do systému sekrece a jejich akumulace ve vakuolách rostlinných buněk, transformovaných podle vynálezu, přičemž výše uvedené tři sekvence jsou popsány v článcích Maurakami a kol., 1986 a Matsuoka a Nakamura, 1991,

- karboxyterminální propeptid lektinu ječmene, popsaný zejména v článcích Schroeder a kol., 1993 a Bednarek a Ralkhel, 1991.

•r * * » * ♦» ♦

Mezi sekvencemi, kódujícími peptid směrování původu lidského nebo živočišného je možno citovat sekvence, kódující signální peptid lidské gastrické lipázy (LGH) tak, jak je popsána v evropském patentu č. 0 191 061 nebo signální peptid králičí gastrické lipázy (LGL) tak, jak je popsána v evropském patentu č. 0 542 629, jejichž sekvence jsou uvedeny v příkladech, které následují nebo sekvence kódující signální peptid lidské pankreatické lipázy (LPH) nebo ještě signální peptid psí gastrické lipázy (LGC).

Jako sekvence, kódující peptid směrování, je také možno citovat sekvenci kódující tetrapeptid KDEL a dovolující směrování v endoplasmatickém retikulu.

Vzhledem k tomu je předmětem vynálezu také každá nukleotidová *» rekombinantní sekvence tak, jak byla popsána výše, obsahující sekvenci kódující celý peptid nebo část signálního peptidu _A takového, jako je signální peptid sporaminu A sladkého bramboru nebo signální peptid lidské gastrické lipázy nebo signální peptid králičí gastrické lipázy nebo signální peptid psí gastrické lipázy, přičemž tato sekvence kóduje peptidový signál situovaný v uvedené rekombinantní nukleotidové sekvenci a přední části uvedené cDNA nebo v sekvenci z ní odvozené a v zadní části použitého promotoru a to takovým způsobem, že poslední aminokyseliny C-konce signálního peptidu je vázány s první aminokyselinou N-konce polypeptidu, kódovaného uvedenou cDNA nebo sekvencí z ní odvozené, v proteinu, kódovaném uvedenou rekombinantní nukleotidovou sekvencí.

Předmětem vynálezu je také každá rekombinantní nukleotidová * sekvence taková, jaká byla popsána výše, obsahující sekvenci ? kódující celý peptid vakuolového směrování nebo jeho část, zejmena peptid sporaminu A sladkého bramboru, přičemž tato *

sekvence se v uvedené rekombinantní nukleotidové sekvenci nachází mezi sekvencí, kódující signální peptid a sekvencí kódující uvedenou cDNA nebo sekvencí z ní odvozenou a to takovým způsobem, že první aminokyselina N-konce peptidu vakuolárního směrování je vázaná na poslední aminokyselinu Ckonce signálního peptidu a poslední aminokyselina C-konce uvedeného peptidu směrování je vázaná na první aminokyselinu r r

- 17 9 » * *

N-konce uvedeného polypeptidu kódovaného uvedenou cDNA nebo sekvencí z ní odvozenou v proteinu, kódovaném uvedenou rekombinantní nukleotidovou sekvencí.

Předmětem předkládaného vynálezu je také každá rekombinantní nukleotidová sekvence taková, jaká byla popsána výše, obsahující sekvenci, kódující celý peptid vakuolového směrování nebo jeho část, zejména peptid lektinu ječmene, přičemž tato sekvence vakuolového směrování se v uvedené rekombinantní nukleotidové sekvenci nachází v zadní části sekvence, kódující uvedenou cDNA nebo sekvenci z ní odvozenou a to takovým způsobem, že první aminokyselina N-konce peptidu vakuolárního směrování je vázaná na poslední aminokyselinu C-konce polypeptidu kódovaného uvedenou cDNA nebo sekvencí z ní odvozenou v proteinu, kódovaném uvedenou rekombinantní nukleotidovou sekvencí.

Předmětem vynálezu jsou zejména následující rekombinantní nukleotidové sekvence:

- sekvence (označená pd35S-PS-LGC), obsahující ve směru 5'—>3' promotor pd35S viru CaMV, sekvenci kódující signální peptid sporaminu A, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvence (označená pd3 5S-PPS-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pd35S viru CaMV, sekvenci, kódující prepropeptid sporaminu A, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvence (označená pd35S-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pd35S viru CaMV, sekvenci, kódující část f ' ' * I «>1» · *»···»· ' r f ♦· ί··β I t * · signálního peptidu králičí gastrické lipázy (to jest sekvenci, tvořenou 19 prvními aminokyselinami, uvedenou v příkladech, které následují, ze které bylo odstraněno 9 nukleotidů, kódujících poslední 3 aminokyseliny C-konce), která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 a je nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvence (označená pCRU-PS-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pCRU kruciferinu, sekvenci, kódující signální peptid sporaminu A, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvence (označená pCRU-PPS-LGC), · obsahující ve směru

5'—>3' promotor pCRU kruciferinu, sekvenci, kódující prepropeptid sporaminu A, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvence (označená pCRU-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pCRU kruciferinu, sekvenci, kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou i- sekvencí znázorněnou na obr. 1 a nakonec ukončená

5. terminátorem polyA 35S.viru CaMV,

- sekvence (označená pGEA 1-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'-»3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekvenci, kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, · jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 nebo na obr. 3 a . nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvence (označená pGEA6-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'—>3' promotor pGEA6 Arabidopsis thaliana, sekvenci, ί» ♦ ♦

* kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 nebo na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvence (označená pAR-IAR-PSLGL-LGC), obsahující vé směru 5'->3' promotor pAR-IAR rýže, sekvenci, kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 nebo na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV nebo terminátorem polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekvence (označená pyzein-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pyzein kukuřice, sekvenci, kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 nebo na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvence (označená pyzein-PSLGL-LGC-KDEL), obsahující ve směru 5'->3' promotor pyzein kukuřice, sekvenci, kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 nebo na obr. 3, potom sekvenci kódující tetrapeptid KDEL a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV.

Výhodně rekombinantní nukleotidové sekvence podle vynálezu také obsahují nukleotidovou sekvenci, použitelnou jako markér uvedených rekombinantních sekvencí, zejména pro odlišení (a tím i selekci) těch rostlinných buněk, které jsou transformovány podle vynálezu uvedenými rekombinantními sekvencemi od rostlinných buněk, které nejsou transformovány.

♦ » * · • · «

- 20 • ·· • · · • · ♦ ·« • «· • · · ·

Výhodně jsou takové nukleotidové sekvence, použitelné jako markér uvedených rekombinantních sekvencí, voleny ze souboru, zahrnujícího geny odolnosti proti antibiotikům, zejména geny odolnosti proti kanamycinu.

Předmětem vynálezu je také každý vektor, zejména plasmidový vektor, obsahující rekombinantní nukleotidovou sekvenci podle vynálezu, která je vložena do místa, které není důležité pro jeho replikaci.

Vynález se také týká každé hostitelské buňky, zejména bakterie jako je Agrobacterium tumefaciens, transformované vektorem, jako je vektor, popsaný výše.

Předmětem předkládaného vynálezu je také jakýkoli způsob výroby psí gastrické lipázy ve formě aktivního enzymu a/nebo jeden nebo více polypeptidů, odvozených od tohoto enzymu, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, přičemž tento polypeptid vykazuje účinek lipázy a uvedený způsob zahrnuje:

- transformaci rostlinných buněk takovým způsobem, že do genomu buněk je vložena jedna nebo více rekombinantních nukleotidových sekvencí podle vynálezu,

- v případě potřeby je z rostlinných buněk, transformovaných výše uvedeným způsobem, získána transformovaná rostlina,

- rekombinantní psí gastrická lipáza a/nebo polypeptid nebo polypeptidy z ní odvozené, jak byla popsány výše, produkované uvedenými transformovanými rostlinnými buňkami nebo uvedenými transformovanými rostlinami, jsou shromážděny, f :- 21 zejména extrakcí, a v případě potřeby následuje etapa purifikace.

Podle jednoho provedení výše uvedeného způsobu podle vynálezu je transformace rostlinných buněk provedena transferem rekombinantní nukleotidové sekvence podle vynálezu do protoplastů, zejména po jejich inkubaci v roztoku polyethylenglykolu (PEG) v přítomnosti divalentních kationtů (Ca^{2 +} ) metodou, kterou popsal Krens a kol., 1982.

Transformace rostlinných buněk může také být realizována elektroporací, zejména podle metody, který je popsána v článku Fromm a kol., 1986.

Transformace rostlinných buněk může být také realizována pomocí použití genového děla, dovolujícího vystřelovat velmi velkou rychlostí kovové částice, pokryté rekombinantními nukleotidovými sekvencemi podle vynálezu a takto dodávat geny do vnitřku buněčného jádra, zejména způsobem, popsaným v článku Sanford, 1988.

Jiný způsob transformace rostlinných buněk je způsob cytoplasmatické nebo jaderné mikroinjekce, popsaný v článku De La Penna a kol., 1987.

Obzvláště výhodný způsob provedení výše uvedeného způsobu podle vynálezu spočívá v transformaci rostlinných buněk jejich umístěním do přítomnosti buněčného hostitele transformovaného vektorem podle vynálezu, jak byl popsán výše, přičemž uvedený buněčný hostitel je schopen infikovat uvedené rostlinné buňky tím, že dovoluje integraci rekombinantní ch nukleotido vých sekvencí, původně obsažených v genomu výše uvedeného vektoru, do genomu rostlinných buněk.

Výhodně je výše použitý uvedený buněčný hostitel Agrobacterium tumefaciens a způsob je prováděn zejména podle metody, popsané v článku Bevan, 1984 a An a kol., 1 986 nebo Agrobacterium rhizogenes a způsob je prováděn zejména podle článku Jouanin a kol., 1987.

Jako rostlinné buňky, schopné transformace způsobem podle předkládaného vynálezu je možno citovat buňky řepky, tabáku, kukuřice, hrachu, rajského jablka, mrkve, pšenice, ječmene, brambor, sóji, slunečnice, salátu, rýže a vojtěšky.

V jednom provedení výše uvedeného způsobu podle vynálezu jsou rostlinné buňky, transformované podle vynálezu, kultivovány in vitro, zejména v bioreaktorech způsobem, který byl popsán v článku Brodelius, 1988, v tekutém prostředí, nebo způsobem, který byl popsán v článku Brodelius a kol., 1979, v imobilizované formě nebo ještě způsobem podle článku Děno a kol., 1987, zpracovávající kulturu transformovaných kořenů in vitro.

Kultivační prostředí in vitro, uvedené výše, je nakonec odebráno a je z něho extrahována, a v případě potřeby i purifikována, zejména chromatografií, rekombinantní psí gastrická lipáza a/nebo z ní odvozený polypeptid nebo polypeptidy, popsané výše, produkované uvedenými transformovanými buňkami, kultivovanými in vitro.

Ve výhodném provedení výše uvedeného způsobu získání rekombinantní psí gastrické Iipázý a/nebo polypeptidu nebo polypeptidů z ní odvozených podle vynálezu je transformace rostlinných buněk následována etapou získání transformovaných rostlin umístěním uvedených transformovaných buněk do vhodného prostředí. Rekombinantní psí gastrická lipáza a/nebo polypeptid nebo polypeptidy z ní odvozené, produkované buňkami takto získaných celých rostlin jsou získány extrakcí, aplikovanou na celé rostliny nebo na části těchto rostlin (zejména na listy nebo na stonky nebo na plody) nebo také jsou získány ze semen těchto rostlin a po této extrakci v případě potřeby následuje etapa purifikace rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidu nebo polypeptidů z ní odvozených.

Transformované rostliny, použité pro získání rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidu nebo polypeptidů z ní odvozených v rámci výše uvedeného způsobu podle vynálezu jsou rostliny generace TO, to jest rostliny získané z kultury buněk transformovaných podle vynálezu ve vhodném prostředí nebo výhodně rostliny generací následujících (TI, T2 atd.), získaných samooplodněním rostlin předcházející generace, ve kterých se rekombinantní nukleotidové sekvence podle vynálezu reprodukují podle Mendelových zákonů.

Mezi polypeptidy, odvozenými od rekombinantní psí gastrické lipázy, které mohou být získány p r ov ád ě n í m způsobu podle vynálezu je možno uvést:

- polypeptid, omezený aminokyselinami, nacházejícími se v polohách 55 až 379 na obr. 2, označený jako polypeptid (Δ54) a představovaný sekvencí SEQ ID NO 4, přičemž uvedený polypeptid je kódován nukleotidovou sekvencí, označenou jako

SEQ ID NO 3,

- polypeptid, omezený aminokyselinami, nacházejícími se v polohách 5 až 379 na obr. 2, označený jako polypeptid (Δ4) a představovaný sekvencí SEQ ID NO 6, přičemž uvedený polypeptid je kódován nukleotidovou sekvencí, označenou jako SEQ ID NO 5.

Předmětem vynálezu je obzvláště každý způsob, tak, jak byl popsán výše, získání rekombinantní psí gastrické lipázy, znázorněné na obr. 2 a případě potřeby získání jednoho nebo více odvozených polypeptidů, zejména polypeptidů (Δ54) a/nebo polypeptidů (Δ4) uvedených výše, přičemž uvedený způsob se vyznačuje tím, že etapa transformace rostlinných buněk je realizována integrací do genomu těchto rostlinných buněk rekombinantní sekvence, jaká byla popsána výše, obsahující na jedné straně cDNA, znázorněnou na obr. 1 a na druhé straně sekvenci kódující signální peptid o 22 aminokyselinách králičí gastrické lipázy, zejména sekvenci kódující prvních 19 aminokyselin signálního peptidu králičí gastrické lipázy.

Vynález se obzvláště týká způsobu výroby rekombinantní psí gastrické lipázy znázorněné na obr. 2, popsaného výše, v případě potřeby spojeného s polypeptidem (Δ54) a/nebo polypeptidem (Δ4) vyznačujícího se tím, že zahrnuje:

- transformaci buněk explantů listu rostliny jejich umístěním do přítomnosti kmene Agrobacterium tumefaciens, transformovaného plasmidem, popsaným výše, obsahujícím rekombinantní nukleotidovou sekvenci pd35S-PSLGL-LGC uvedenou výše, v odpovídajícím kultivačním prostředí,

- selekce transformovaných explantů v prostředí obsahujícím kanamycin,

- získání transformovaných rostlin z transformovaných explantů, uvedených výše, jejich kultivací ve vhodném prostředí,

- extrakce rekombinantní psí gastrické lipázy a v případě potřeby polypeptidu (Δ54) a/nebo polypeptidu (Δ4), zejména rozdrcením listů a/nebo semen a/nebo plody výše uvedených transformovaných rostlin ve vhodném pufru, centrifugací a získáním supernatantu představujícího rostlinný extrakt s enzymatickým účinkem,

- v případě potřeby purifikace rekombinantní psí gastrické lipázy ze extraktu, získaného v předcházející etapě, zejména chromatografií supernatantu, což vede k získání rekombinantní psí gastrické lipázy ve formě v podstatě čisté.

Předmětem vynálezu je také aplikace výše uvedeného způsobu výroby polypeptidu (Δ54) nebo polypeptidu (Δ4) ve formě v podstatě čisté provedením výše popsaného způsobu výroby, ve kterém buňky transformované sekvencí pd3 5S-PSLGL-LGC jsou buňky explantů listů lilkovitých rostlin, zejména tabáku nebo rajského jablka.

V jednom provedení výše uvedeného způsobu podle vynálezu může být polypeptid specificky získán extrakcí z listů výše uvedeného transformovaného tabáku, zejména rozdrcením těchto listů ve vhodném pufru', centrifugací a získáním supernatantu. Polypeptid (Δ4) může být následně purifikován z extraktu výše uvedených listů, obsahujících uvedený polypeptid (Δ4), zejména chromatografií z uvedeného supernatantu.

Předmětem vynálezu je obzvláště každý způsob, jak byl popsán výše, získání rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo jednoho nebo více polypeptidů od této lipázy, tak, jak jsou popsány výše, vyznačující se tím, že etapa transformace rostlinných buněk je prováděna integrací do genomu uvedených rostlinných buněk sekvence, obsahující na jedné straně nukleotidovou sekvenci znázorněnou na obr. 3 a na druhé straně sekvenci kódující signální peptid sporaminu, popsaný výše.

Jako polypeptidy, odvozené od rekombinantní psí gastrické lipázy, které je možno získat prováděním způsobu podle vynálezu je možno uvést polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4), uvedené výše.

Vynález se obzvláště týká způsobu výroby rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Δ54) a/nebo polypeptidu (Δ4) vyznačujícího se tím, že zahrnuje:

- transformaci buněk explantů rostliny (zejména explantů listů) jejich umístěním do přítomnosti kmene Agrobacterium tumefaciens, transformovaného plasmidem, popsaným výše, o‘bsahuj“ící“m^—re“k“o“mb“in“aíTťní~“ntrkŤeot idovou~^sekvenci^-^)^3“5“SYP SLGC a/nebo pd35S-PPS-LGC,

-selekci transformovaných explantů v prostředí obsahujícím kanamycin,

- extrakce rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Δ54) a/nebo polypeptidu (Δ4), zejména rozdrcením listů a/nebo semen a/nebo plody výše uvedených transformovaných rostlin ve vhodném pufru, centrifugací a získáním supematantu představujícího rostlinný extrakt s enzymatickým účinkem,

- v případě potřeby purifikace rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Δ54) a/nebo polypeptidu (Δ4) z extraktu, získaného v předcházející etapě, zejména chromatografií supernatantu, což vede k získání rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Δ54) a/nebo polypeptidu (Δ4), ve formě v podstatě čisté.

Předmětem vynálezu je obzvláště způsob získání výše popsaného polypeptidu (Δ54) a/nebo polypeptidu (Δ4) provedením výše popsaného způsobu ve kterém transformované buňky jsou buňky explantů listů lilkovitých rostlin, zejména tabáku a rajského jablka.

Podle jednoho provedení výše uvedeného způsobu podle vynálezu polypeptid (Δ54) může být specificky získán extrakcí ze semen výše uvedeného transformovaného tabáku, zejména rozdrcením těchto semen ve vhodném pufru, centrifugací a získáním supernatantu. Polypeptid (Δ54) může být následně purifikován z uvedeného extraktu semen, obsahujícího uvedený polypeptid (Δ54), zejména chromatografií výše uvedeného supernatantu.

Vynález se obzvláště týká způsobu výroby rekombinantní psí •*í gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Δ54) a/nebo polypeptidu (Δ4) vyznačujícího se tím, že zahrnuje:

J

- transformaci buněk explantů rostliny (zejména explantů listů) jejich umístěním do přítomnosti kmene Agrobacterium tumefaciens, transformovaného plasmidem, popsaným výše, obsahujícím rekombinantní nukleotidovou sekvenci pCRU-PPSLGC a/nebo sekvenci pCRU-PPS-LGC a/nebo sekvenci pGEAl

PSLGL-LGC a/nebo sekvenci pGE A6-P SLGL-LGC a/nebo r r

- 28 r r - ' · » «· sekvenci pAR-IAR-PSLGL-LGC a/nebo sekvenci pyzein-PSLGLLGC a/nebo sekvenci pyzein-PSLGL-LGC-KDEL,

- selekci transformovaných explantů v prostředí obsahujícím kanamycin,

- extrakce rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidů (Δ54) a/nebo polypeptidů (Δ4), zejména rozdrcením semen výše uvedených transformovaných rostlin ve vhodném pufru,, centrifugací a získáním supernatantu představujícího rostlinný extrakt s enzymatickým účinkem,

- v případě potřeby purifikace rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidů (Δ54) a/nebo polypeptidů (Δ4) z extraktu, získaného v předcházející etapě, zejména chromatografii supernatantu, což vede k získání rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidů (Δ54) a/nebo polypeptidů (Δ4), ve formě v podstatě čisté.

Předmětem vynálezu je obzvláště způsob získání výše popsaného polypeptidů (Δ54) provedením výše popsaného způsobu ve kterém “transformované bunky^-jsou Kuňky řěpky“ “ně Ko^-fabakua extrakce“ polypeptidů (Δ54) je prováděna zejména rozdrcením transformovaných semen.

Transformované rostlinné buňky, použité ve způsobech popsaných výše jsou zejména zvoleny ze souboru, zahrnuj ícícho buňky tabáku, řepky, kukuřice, hrachu, rajského jablka, mrkve, pšenice, ječmene, brambor, sóji, slunečnice, salátu, rýže a vojtěšky.

Vynález se obzvláště týká způsobu výroby rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidů (Δ54) a/nebo polypeptidů *

(Δ4) vyznačujícího se tím, že zahrnuje:

- transformaci buněk kalu (kalus) kukuřice jejich bombardováním pomocí částicového děla plasmidy, obsahujícími rekombinantní nukleotidovou sekvenci pAR-IARPSLGL-LGC a/nebo sekvenci pyzein-PSLGL-LGC a/nebo sekvenci pyzein-PSLGL-LGC-KDEL,

- selekci transformovaného kalu v prostředí obsahujícím selekční činidlo, jako je kanamycin,

- získání transformovaných rostlin kukuřice z transformovaného kalu, uvedeného výše, jejich kultivací ve vhodném prostředí,

- extrakci rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Δ54) a/nebo polypeptidu (Δ4), zejména rozdrcením semen výše uvedených transformovaných rostlin ve vhodném pufru, centrifugací a získáním supernatantu představujícího rostlinný extrakt s enzymatickým účinkem,

- v případě potřeby purifikaci rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Δ54) a/nebo polypeptidu (Δ4) z extraktu, získaného v předcházející etapě, zejména chromatografií supernatantu, což vede k získání rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Δ54) a/nebo polypeptidu (Δ4), ve formě v podstatě čisté.

Předmětem vynálezu je také každá geneticky transformovaná rostlinná buňka, obsahující’ jednu nebo více rekombinantních’ nukleotidových sekvencí podle vynálezu popsaných výše, které jsou stálým způsobem integrovány do jejich genomu.

Předmětem vynálezu je také každá transgenická rostlinná buňka, popsaná výše, obsahující jeden nebo více rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, jako je rekombinantní psí gastrická lipáza a/nebo polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4), přičemž uvedená rostlinná buňka je navíc rostlinná buňka s enzymatickým účinkem, obzvláště s účinkem lipázy, definovaným dále.

Předmětem vynálezu jsou také geneticky transformovaná semena obsahující jednu nebo více rekombinantních nukleotidových sekvencí podle vynálezu popsaných výše, které jsou stálým způsobem integrovány do jejich genomu.

Vynález se také týká transgenických semen popsaných výše, obsahujících jeden nebo více rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, jako je rekombinantní psí gastrická lipáza a/nebo polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4), přičemž uvedená semena jsou navíc semena s enzymatickým účinkem, obzvláště s účinkem lipázy, definovaným dále.

Semena transformovaná podle vynálezu jsou semena sklizená z rostlin geneticky transformovaných podle vynálezu, přičemž uvedené rostliny jsou buď rostliny výše uvedené generace TO, získané kultivací buněk transformovaných podle vynálezu, nebo ~r os t li n —másle du jících------generací-—(ΨΤρ—T~2- — atd)/~zfs k ané samooplodněním nebo křížením rostlin předcházejících generací (jak bylo zmíněno výše).

Předmětem vynálezu jsou také geneticky transformované rostliny nebo části rostlin (zejména explanty, stonky, listy, plody, kořeny, pyl a podobně), vyznačující se tím, že obsahují jednu nebo více rekombinantních nukleotidových sekvencí podle vynálezu popsaných výše, které jsou stálým způsobem integrovány do jejich genomu.

Vynález se také týká transgenických rostlin nebo částí rostlin popsaných výše, obsahujících jeden nebo více rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, jako je rekombinantní psí gastrická lipáza a/nebo polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4), přičemž uvedené rostliny jsou navíc rostliny s enzymatickým účinkem, obzvláště s účinkem lipázy, definovaným dále.

Předmětem vynálezu jsou obzvláště výše uvedené transformované s rostliny, získané kultivací buněk nebo semen podle vynálezu, popsaných výše.

Rostliny nebo části rostlin, transformované podle vynálezu jsou zejména zvoleny ze souboru, zahrnujícího řepku, tabák, kukuřici, hrách, rajské jablko, mrkev, pšenici, ječmen, brambory, sóju, slunečnici, rýži, salát, vojtěšku a řepu nebo části těchto rostlin.

Předmětem vynálezu je každý rostlinný extrakt s enzymatickým účinkem a obzvláště s účinkem lipázy, definovaným dále, získaný jedním z výše uvedených způsobů podle vynálezu, obsahující jako účinný enzym jeden nebo více rekombinantních polypeptidů podle vynálezu,' jako je psí gastrická lipáza a/nebo polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4).

Účinek lipázy (nebo lipolytický účinek) rostlin nebo částí rostlin »>

a rostlinných extraktů podle vynálezu může být měřen zejména ?.

metodou podle Gargouriho (Gargouri a kol., 1 986), využívající jako substrát triglycerid s krátkým řetězcem (jako je tributyrid). Enzymatický účinek je popisován v jednotkách U, kde jednotka U představuje množství enzymu, nutného pro uvolnění jednoho pmolu volných mastných kyselin za minutu při 37 °C v podmínkách optimálního pH.

• ♦

Rostlinné extrakty s enzymatickým účinkem jsou zejména ty extrakty, ve kterých hmotnostní procento enzymaticky účinných rekombinantních polypeptidů představuje zhruba od 0,1 % do 20 % a zejména od okolo 1 % do okolo 15 %, měřeno vzhledem k celkové hmotnosti proteinů, přítomných v uvedeném extraktu, což odpovídá míře enzymatického účinku od okolo 0,5 U na jeden gram čerstvé hmotnosti (PF) listů do okolo 1000 U na gram čerstvé hmotnosti listů, zejména účinku od okolo 10 U na jeden gram čerstvé hmotnosti (PF) listů do okolo 300 U na gram čerstvé hmotnosti listů nebo od okolo 1 U na jeden gram čerstvé hmotnosti semen do okolo 5000 U na gram čerstvé hmotnosti semen, zejména účinku od okolo 10 U na jeden gram čerstvé hmotnosti (PF) semen do okolo 1000 U na gram čerstvé hmotnosti listů.

Předmětem vynálezu jsou obzvláště rostlinné extrakty s následujícím enzymatickým účinkem:

* extrakty listů a/nebo plodů a/nebo semen rostlin, získaných transformací buněk explantů těchto rostlin—sekvencí - pd35S----------- PSLGL-LGC nebo sekvencí pd35S-PS-LGC nebo sekvencí pd35S-PPS-LGC jedním ze způsobů popsaných výše a obsahujících rekombinantní psí gastrickou lipázu a/nebo polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4), zejména

- extrakt listů tabáku, získaný transformací buněk explantů listů tabáku sekvencí pd35S-PS-LGC nebo sekvencí pd35S-PPS-LGC jedním ze způsobů popsaných výše a obsahující polypeptid .

(Δ54) spolu s polypeptidem (Δ4), přičemž hmotnostní procento směsi těchto dvou polypeptidů vzhledem k celkové hmotnosti proteinů přítomných v uvedeném extraktu je od okolo 0,1 % do okolo 20 % a enzymatický účinek uvedeného extraktu je od okolo 100 U na gram čerstvé hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvé hmotnosti,

- extrakt listů nebo plodů rajského jablka, získaný transformací buněk explántů listů rajského jablka sekvencí pd35S-PS-LGC nebo sekvencí pd3 5 S-PPS-LGC jedním ze způsobů popsaných výše a obsahující polypeptid (Δ54) spolu s polypeptiaem (Δ4), přičemž hmotnostní procento směsi těchto dvou polypeptidů vzhledem k celkové hmotnosti proteinů přítomných v uvedeném extraktu je od okolo 0,1 % do okolo 20 % a enzymatický účinek uvedeného extraktu je od okolo 100 U na gram čerstvé hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvé hmotnosti,

- extrakt listů tabáku, získaný transformací buněk explántů listů tabáku sekvencí pd3 5 S-PSLGL-LGC jedním ze způsobů popsaných výše a obsahující polypeptid (Δ4), přičemž hmotnostní procento tohoto polypeptidu vzhledem k celkové hmotnosti proteinů přítomných v uvedeném extraktu je od okolo 0,1 % do okolo 20 % a enzymatický účinek uvedeného extraktu je od okolo 100 U na gram čerstvé hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvé hmotnosti,

- extrakt semen tabáku, získaný transformací buněk explántů listů tabáku sekvencí pd35S-PS-LGC nebo sekvencí pd35SPPS-LGC jedním ze způsobů popsaných výše a obsahující polypeptid (Δ54), přičemž hmotnostní procento tohoto polypeptidu vzhledem k celkové hmotnosti proteinů přítomných v uvedeném extraktu je od okolo 0,1 % do okolo 1 % a enzymatický účinek uvedeného extraktu je od okolo 10 U na gram čerstvé hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvé hmotnosti, ♦ extrakty semen rostlin, získaných transformací buněk explántů těchto rostlin sekvencí pCRU-PS-LGC nebo sekvencí pCRUr * • » · * r ,r ' t r » · e ·- r

PPS-LGC nebo sekvencí pGEAl-PSLGL-LGC nebo sekvencí pGEA6-PSLGL-LGC jedním ze způsobů popsaných výše a obsahujících rekombinantní psí gastrickou lipázu a/nebo polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4), zejména - extrakt semen řepky, získaný transformací buněk explantů listů řepky sekvencí pCRU-PS-LGC nebo sekvencí pCRU-PPS-LGC ’ nebo sekvencí pGE A1-P SLGL-LGC nebo sekvencí pGEAó PSLGL-LGC jedním ze způsobů popsaných výše a obsahující ípolypeptid (Δ54), přičemž hmotnostní procento tohoto polypeptidu vzhledem k celkové hmotnosti proteinů přítomných v uvedeném extraktu je od okolo 0,1 % do okolo 1 % a enzymatický účinek uvedeného extraktu je od okolo 10 U na gram čerstvé hmotnosti do okolo 1 000 U na gram čerstvé hmotnosti, * extrakty semen rostlin, získaných transformací buněk explantů těchto rostlin sekvencí pAR-IAR-P SLGL-LGC a/nebo sekvencí pyzein-PSLGL-LGC a/nebo pyzein-PSLGL-LGC-KDEL jedním ze způsobů popsaných výše a obsahujících rekombinantní psí gastrickou lipázu a/nebo polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4), zejména

-- -------------extrakt—semen kukuřice-,——získaný- transformací—kukuřice - — (zejména buněk kalu kukuřice) sekvencí pAR-IAR-PSLGL-LGC a/nebo sekvencí pyzein-PSLGL-LGC a/nebo pyzein-PSLGL LGC-KDEL jedním ze způsobů popsaných výše a obsahující ’ polypeptid (Δ54), přičemž hmotnostní procento tohoto polypeptidu vzhledem k celkové hmotnosti proteinů přítomných v uvedeném extraktu je od okolo 0,1 % do okolo 1 % a enzymatický účinek uvedeného extraktu je od okolo. 10 U na gram čerstvé hmotnosti do okolo 1000 U na gram čerstvé hmotnosti.

* φ

Předmětem vynálezu je také každá enzymaticky účinná rekombinantní psí gastrická lipáza, jejíž sekvence aminokyselin je sekvence, znázorněná na obr. 2 nebo polypeptid odvozený od této lipázy, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, přičemž tento polypeptid má účinek lipázy, takové, že jsou získány ve formě v podstatě čisté provedením jednoho z výše popsaných způsobů podle vynálezu, přičemž tento způsob zahrnuje etapu purifikace rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, zejména chromatografií, vycházející z enzymatických extraktů, popsaných výše.

Jako polypeptidy, odvozené od psí gastrické lipázy, má vynález jako předmět polypeptid (Δ54) a polypeptid (Δ4), popsané výše, jejichž odpovídající molekulové hmotnosti jsou po řadě zhruba 37 kDa a zhruba 49 kDa.

Pod rekombinantní enzymaticky účinnou psí gastrickou lipázou nebo odvozeným polypeptidem, vykazujícím účinek lipázy, jak byly zmíněny výše, se rozumí každý rekombinantní polypeptid, který vykazuje účinek lipázy, tak jak je měřen metodou podle Gargouriho, zmíněnou výše.

Pro ilustraci lze uvést, že rekombinantní polypeptidy podle vynálezu vykazují účinek lipázy od okolo 10 U/mg rekombinantního pólypéptidů’ do okolo 1000 U/mg; zejména ód okolo 100 U/mg do okolo 600 U/mg.

Vynález se týká obzvláště rekombinantní psí gastrické lipázy, získané purifikaci enzymatického extraktu listů nebo semen tabáku, přičemž tyto listy nebo semena pocházejí z transformovaných rostlin tabáku, které pocházejí z buněk tabáku, • · · « f 5> * ♦ * « transformovaných sekvencí pd3 5 S-PSLGL-LGC způsobem popsaným výše, přičemž uvedená rekombinantní psí gastrická lipáza vykazuje účinek lipázy, jak byl popsán výše.

Předmětem vynálezu jsou také polypeptid (Δ54) a polypeptid (Δ4), získané purifikací enzymatického extraktu listů a/nebo semen a/nebo plodů rostlin, zejména lilkovitých rostlin, jako jsou transformovaný tabák nebo rajské jablko, přičemž tyto jsou samy získány z rostlinných buněk transformovaných sekvencí pd35S-PS-LGC nebo sekvencí pd3 5 S-PPS-LGC nebo sekvencí pd35S-PSLGL-LGC způsobem popsaným výše, přičemž uvedený polypeptid (Δ54) a polypeptid (Δ4) vykazují účinek lipázy, jak byl popsán výše.

Předmětem vynálezu jsou také polypeptid (Δ54), získaný purifikací enzymatického extraktu semen tabáku nebo semen řepky, přičemž tato semena pocházejí z transformovaných rostlin tabáku respektive řepky, přičemž tyto jsou samy získány z rostlinných buněk tabáku respektive řepky, transformovaných sekvencí pCRU-PS-LGC nebo sekvencí pCRU-PPS-LGC způsobem -----popsaným vý š e, přičemž u ve d e n ý r e k o m b i n a n t ní p o 1 y p e p t i ď - (Δ5 4) vykazuje účinek lipázy, jak byl popsán výše.

Předmětem vynálezu jsou také polypeptid (Δ54) a polypeptid (Δ4), získané purifikací enzymatického extraktu semen řepky, přičemž tato semena pocházejí z transformovaných rostlin řepky, přičemž tyto jsou samy získány z rostlinných buněk řepky, transformovaných sekvencí pGEA1-PSLGL-LGC a/nebo sekvencí pGEA6-PSLGL-LGC způsobem popsaným výše, přičemž uvedené rekombinantní polypeptidy (Δ54) a (Δ4) vykazují účinek lipázy, jak byl popsán výše.

Předmětem vynálezu jsou také polypeptid (Δ54) a polypeptid (Δ4), získané purifikací enzymatického extraktu semen kukuřice, přičemž tato zrna pocházejí z transformovaných rostlin kukuřice, přičemž tyto jsou samy získány z rostlinných buněk kukuřice, transformovaných sekvencí pAR-IAR-PSLGL-LGC a/nebo sekvencí pyzein-PSLGL-LGC a/nebo sekvencí pyzein-PSLGLLGC-KDEL způsobem popsaným výše, přičemž uvedené rekombinantní polypeptidy (Δ54) a (Δ4) vykazují účinek lipázy, jak byl popsán výše.

Zdánlivé molekulové hmotnosti polypeptidů (Δ54) a (Δ4) podle vynálezu jsou 37 kDa, respektive 49 kDa, pokud jsou měřeny analýzou polyakrylovým gelem a imunodetekcí po elektropřenosu na nitrocelulóze (tato metoda je detailně popsána v příkladech, které následují).

Vynález se také týká protilátek proti rekombinantním polypeptidům podle vynálezu a obzvláště protilátek proti rekombinantní psí gastrické lipáze podle vynálezu a/nebo proti polypeptidu (Δ54) a/nebo proti polypeptid (Δ4), uvedeným výše a schopných také rozpoznat lidskou gastrickou lipázu.

Takovéto protilátky mohou být získány imunizací zvířete těmito polypeptidy, následovanou získáním vzniklých protilátek.

Rozumí se samo sebou, že tato produkce není omezena na polyklonální protilátky.

Vynález se také týká všech monoklonálních protilátek, získaných každým hybridomem, který je možno vytvořit klasickými • .· r ♦ · « ^ř ' ^r ' · * · · Φ metodami z splenických buněk zvířete, zejména myši nebo krysy, imunizované proti jednomu z purifikovaných polypeptidů podle vynálezu na jedné straně a z buněk vhodného myelomu na druhé straně a může být selektován díky své schopnosti produkovat monoklonální protilátky, rozpoznávající výše uvedené polypeptidy, na počátku použité pro imunizaci zvířete a lidskou gastrickou lipázu.

Vynález se také týká použití rostlin, částí rostlin, rostlinných buněk a semen, transformovaných způsobem podle vynálezu, pro získání jednoho nebo více rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, jako je rekombinantní psí gastrická lipáza nebo polypeptidy z ní odvozené, jak byly definovány výše, zejména pro provádění jednoho z výše uvedených způsobů podle vynálezu, přičemž uvedené rekombinantní polypeptidy jsou ve formě podstatně čisté nebo obsažené v rostlinných extraktech s enzymatickým účinkem, tak jak byly definovány výše.

Předmětem vynálezu je také použití rostlin nebo částí rostlin s enzymatickým účinkem podle vynálezu nebo rostlinných extraktů _s- -enzymatickým ' účinkem, definovaných výše, — nebo také rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, jako je rekombinantní psí gastrická lipáza nebo polypeptidy z ní odvozené, definované výše, pro výživu lidí nebo zvířat.

Vynález se obzvláště týká použití rostlin nebo částí rostlin, zejména listů, plodů a semen s enzymatickým účinkem podle vynálezu jako potravy.

Z tohoto důvodu je předmětem vynálezu obzvláště každá potrava, tvořená rostlinou s enzymatickým účinkem, jak byla popsána • ► » · **' r - « * « » « výše, nebo část takové rostliny, zejména listy nebo plody nebo semena takovéto rostliny a která může být požívána buď člověkem nebo zvířetem.

Vynález se také týká každé jedlé nebo krmné směsi, obsahující jednu nebo více rostlin s enzymatickým účinkem, tak, jak byly popsány výše a/nebo části této rostliny nebo těchto rostlin, zejména jejich listy a/nebo semena a/nebo plody a/nebo jeden nebo více rostlinných extraktů s enzymatickým účinkem, tak jak byl popsán výše a/nebo jeden nebo více rekombinantní ch polypeptidů podle vynálezu, v případě potřeby spolu s jednou nebo více jedlými nebo krmnými složkami.

Výhodně se rostliny nebo části rostlin, obsažené ve výše uvedené jedlé nebo krmné směsi, v uvedené směsi nacházejí v rozdrceném stavu.

Pokrmy nebo krmivá podle vynálezu, nazývané také funkční pokrmy nebo krmivá nebo jedlé nebo krmné kompozice podle vynálezu jsou obzvláště určeny k tomu, aby usnadňovaly absorpci tuků živočišného nebo rostlinného původu, které požilo individuum, které je buď zdravé nebo zasažené jednou nebo více patologiemi, které ovlivňují nebo neovlivňují úroveň produkce gastrických a/nebo pankreatických lipáz. Z tohoto důvodu jsou pokrmy a krmivá nebo jedlé či krmné směsi podle vynálezu zejména používány jako doplňky výživy.

Předmětem vynálezu je také použití rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen, nebo rostlinných buněk s enzymatickým účinkem podle vynálezu nebo rostlinných extraktů s enzymatickým účinkem, tak jak jsou definovány výše, ř · • · e nebo také rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, jako je psí gastrická lipáza nebo polypeptidy od ní odvozené způsobem popsaným výše, pro získání léčiv (nebo farmaceutických kompozic), určených k usnadnění absorpce tuků živočišného nebo rostlinného původu, které požilo individuum, které je buď zdravé nebo zasažené jednou nebo více patologiemi, které ovlivňují nebo neovlivňují úroveň produkce gastrických a/nebo pankreatických lipáz.

Takovéto farmaceutické kompozice jsou zejména používány u individuí, které se podrobují lékařskému působení, měnícímu mechanismus absorpce tuků nebo jsou také používány u starých osob.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou obzvláště používány a určeny pro léčení patologií, vázaných k nedostatečné úrovni lipáz (obzvláště gastrické lipázy nebo lipáz a/nebo pankreatické lipázy nebo lipáz) v organismu a obzvláště u patologií jako je mucoviscidóza a exokrinní pankreatická nedostatečnost.

Předmětem vynálezu je obzvláště každá farmaceutická kompozice, zahrnující jeden nebo více rostlinných extraktů s enzymatickým účinkem, jak bylo popsáno výše a/nebo jeden nebo více rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, v případě potřeby v asociaci s farmaceuticky přijatelným vehikulem.

Předmětem vynálezu je obzvláště každá výše uvedená farmaceutická kompozice, zahrnující rekombinantní psí gastrickou lipázu a/nebo polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid

Γ ' (Δ4), ve formě v podstatě čisté nebo ve formě rostlinných extraktů popsaných výše.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu jsou výhodně podávány cestou orální a jsou předkládány zejména ve formě kapslí, tablet nebo prášků, určených ke rozpuštění.

Denní dávkování u člověka je výhodně od zhruba 200 mg do zhruba 1000 mg, podávané výhodně v okamžiku hlavního jídla, pokud uvedené farmaceutické kompozice obsahují enzymatické extrakty, popsané výše a od zhruba 100 mg do zhruba 500 mg, pokud uvedené farmaceutické kompozice obsahují rekombinantní polypeptidy podle vynálezu ve formě v podstatě čisté.

Předmětem vynálezu je také použití rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen, nebo rostlinných buněk s enzymatickým účinkem podle vynálezu nebo rostlinných extraktů s enzymatickým účinkem, jak byly definovány výše, nebo rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, jako je rekombinantní psí gastrická lipáza nebo od ní odvozené polypeptidy takové, jaké byly definovány výše, pro provádění enzymatických reakcí v průmyslové agroalimentární nebo žéůnědělskb-pTumysTó-vé oblasti, zejména v průmyslu mastných látek, v lipochemii a mlékárenství.

Z tohoto důvodu se vynález týká každého způsobu, zejména enzymatické biokonverze nebo biokatalýzy, spočívajícího v provádění jedné nebo více enzymatických reakcí v průmyslové agroalimentární nebo zemědělsko-průmyslové oblasti, zejména v průmyslu mastných látek, v lipochemii a mlékárenství, přičemž uvedené enzymatické reakce jsou prováděny s využitím rostlin ·

r r nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen, nebo rostlinných buněk s enzymatickým účinkem podle vynálezu nebo rostlinných extraktů s enzymatickým účinkem, jak byly definovány 'výše nebo s využitím rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, jako je rekombinantní psí gastrická lipáza nebo od ní odvozené polypeptidy takové, jaké byly definovány výše.

Předmětem vynálezu jsou obzvláště enzymatické přípravky určené pro průmyslovou, agroalimentární nebo zemědělsko-průmyslovou oblast, které mohou být použity v rámci provádění některého ze způsobů popsaných výše a zahrnující jeden nebo více rostlinných extraktů s enzymatickým účinkem, tak jak byly popsány výše a/nebo jeden nebo více rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, zejména rekombinantní psí gastrickou lipázu a/nebo polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4), v případě potřeby spolu s jedním nebo více aditivy nebo dalším enzymem nebo dalšími enzymy, které mohou být používány v rámci výše uvedené průmyslové aplikace.

Vynález se obzvláště týká použití rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen, nebo rostlinných buněk s enzymatickým účinkem podle vynálezu průmyslovém měřítku reakcí enzymatické biokatalýzy, jako je například hydrolýza pro provádění v biokonverze nebo nebo enzymatická transesterifikace.

Výhodně jsou rostliny s enzymatickým účinkem nebo části těchto rostlin, zejména listy a/nebo plody a/nebo semena, nebo rostlinné buňky, získané způsobem podle vynálezu, používány současně jako enzymatický zdroj a jako reakční substrát.

• · ♦

Předmětem vynálezu je také každý způsob biokatalýzy, používající rostliny nebo části rostlin, zejména listy a/nebo plody a/nebo semena nebo rostlinné buňky s enzymatickým účinkem a zejména rostliny, obsahující rekombinantní psí gastrickou lipázu a/nebo polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4), ve kterém jsou uvedené rostliny nebo uvedené části rostlin používány současně jako enzymatický zdroj a jako reakční substrát.

Vynález se zejména týká použití rostlin s enzymatickým účinkem nebo částí těchto rostlin podle vynálezu pro získání biopaliv.

Z tohoto důvodu je předmětem předkládaného vynálezu získání biopaliv adicí alkoholu, zejména methanolu nebo ethanolu, k rozdrceným rostlinám nebo částem rostlin, transformovaných podle vynálezu, zejména k rozdrceným semenům řepky, slunečnice nebo sóji, transformovaným podle vynálezu, a získání biopaliva, zejména filtrací.

Vynález se také týká esterů mastných kyselin rostlinného původu, získaných prováděním výše popsaného , způsobu,.....zejména methylesterů kyseliny olejové.

Vynález se také týká všech biopaliv, získaných prováděním způsobu popsaného výše a zejména všech.biopaliv uvedených výše, obsahujících estery mastných kyselin rostlinného původu.

Vynález se obzvláště týká všech biopaliv získaných prováděním výše popsaného způsobu, vycházejíce ze semen řepky, a obsahujících methylester kyseliny olejové.

*

Vynález se také týká použití výše uvedených protilátek proti rekombinantním polypeptidům podle vynálezu pro provádění způsobu metody detekce nebo dávkování psí gastrické lipázy nebo lidské gastrické lipázy v biologickém vzorku, který je může obsahovat. ’ '

Vynález se obzvláště týká použití uvedených protilátek pro provádění způsobu diagnózy in vitro patologií, vázaných na

J:

nadprodukci nebo naopak na nedostatečnost nebo dokonce absenci produkce lipáz v organismu.

Tyto způsoby diagnózy in vitro, prováděné s využitím biologického vzorku, odebraného pacientovi, zahrnující etapu umístění uvedeného vzorku do přítomnosti jedné nebo více protilátek podle vynálezu, následovanou etapou detekce případných komplexů protilátka - lidská gastrická lipáza, vytvořených v průběhu předcházející etapy.

Z tohoto důvodu se vynález také týká soupravy pro provádění způsobu detekce nebo diagnózy in vitro, uvedené výše, zahrnující:

- protilátky takové, jaké byly popsány výše, výhodně značkované radioaktivním nebo enzymatickým způsobem, stejně tak jako * řeáktaritý pro vytvoření vhodného prostředí prď ' průběh *~ imunologické reakce mezi uvedenými protilátkami a lidskou gastrickou lipázou,

- reaktanty, dovolující detekci imunologických komplexů vytvořených mezi uvedenými protilátkami a lidskou gastrickou lipázou.

Předmětem vynálezu je obzvláště použití rekombinantní nukleotidové sekvence, obsahující na jedné straně cDNA, znázorněné na obr. 4 a kódující lidskou gastrickou lipázu (LGH), znázorněnou na obr. 5 nebo nukleotidovou sekvenci odvozenou od této cDNA, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jednoho nebo více nukleotidů, přičemž uvedená sekvence může *· kódovat polypeptid, jehož sekvence aminokyselin je identická se sekvencí aminokyselin lidské gastrické lipázy, znázorněné na obr. 5 nebo polypeptid, odvozený z lidské gastrické lipázy adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, přičemž tento polypeptid vykazuje účinek lipázy, a na druhé straně prvky, dovolující rostlinné buňce produkovat polypeptid, kódovaný uvedenou cDNA nebo výše uvedenou odvozenou sekvencí, zejména promotor a terminátor transkripce, rozpoznávané transkripčním mechanizmem rostlinných buněk (a zejména RNA polymerázami uvedených rostlinných buněk), pro transformaci rostlinných buněk za účelem získání s pomocí těchto buněk rekombinantní psí gastrické lipázy ve formě aktivního enzymu nebo jednoho nebo více polypeptidů, odvozených od této rekombinantní lipázy, takových, jaké byly definovány výše.

Γ*

Z tohoto důvodu se vynález týká každé rekombinantní - nukleotidové sekvence, jak byla popsána výše v rámci λ transformace rostlin s cílem získání rekombinantní psí gastrické lipázy, ve které nukleotidová sekvence kódující psí gastrickou lipázu a znázorněná na obr. 1 nebo na obr. 3 je nahrazena nukleotidovou sekvencí kódující lidskou gastrickou lipázu a znázorněnou na obr. 4.

Předmětem vynálezu jsou obzvláště následující rekombinantní nukleotidové sekvence:

- sekvence (označená pSP-PSLGH-LGH), obsahující ve směru 5'->3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekvenci kódující signální peptid lidské gastrické' lipázy, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 4 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvence (označená pSP-PSLPH-LGH), obsahující ve směru 5'->3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekvenci kódující signální peptid lidské pankreatické lipázy, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 4 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvence (označená pSP-PSLGL-LGH), obsahující ve směru 5'->3' promotor pSP Agrobacterium tumefaciens, sekvenci kódující signální peptid králičí gastrické lipázy (tak jak je popsán výše), která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 4 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV.

Vynález se také týká vektorů a hostitelských buněk, transformovaných těmito vektory, tak jak je to popsáno výše, a obsahujících výše uvedené rekombinantní nukleotidové sekvence kódující lidskou gastrickou lipázu a/nebo polypeptidy z ní odvozené.

Předmětem předkládaného vynálezu je také každý způsob výroby rekombinantní lidské gastrické lipázy ve formě účinného enzymu a/nebo jednoho nebo více polypeptidů, odvozených od této lipázy, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, přičemž tento odvozený polypeptid nebo polypeptidy vykazují účinek lipázy, vyznačující se tím, že * ♦ sestává z:

- transformace rostlinných buněk tím, že do genomu těchto buněk se vloží jedna nebo více rekombinantních nukleotidových sekvencí podle vynálezu,

- v případě potřeby získání transformovaných rostlin z výše uvedených transformovaných buněk,

- získání rekombinantní lidské gastrické lipázy a/nebo výše uvedeného polypeptidů nebo polypeptidů, z ní odvozených, produkovaných ve výše uvedených transformovaných buňkách nebo rostlinách a to zejména extrakcí, která je v případě potřeby následována purifikací.

Předmětem vynálezu je obzvláště každý způsob výroby rekombinantní lidské gastrické lipázy prováděním způsobu, popsaného výše v souvislosti s výrobou rekombinantní psí gastrické lipázy nebo od ní odvozených polypeptidů, pomocí výše uvedené rekombinantní sekvence, zahrnující sekvenci, znázorněnou na obr. 4.

Mezi polypeptidy, odvozenými od rekombinantní lidské gastrické lipázy, které mohou být získány v rámci provádění způsobu podle vynálezu je možno uvést:

- polypeptid, omezený aminokyselinami, nacházejícími se v polohách 74 až 398 na obr. 5, který je označovaný jako polypeptid (Á54LGH),

- polypeptid, omezený aminokyselinami, nacházejícími se v polohách 24 až 398 na obr. 5, který je označovaný jako polypeptid (Á4LGH).

• · ·

Vynález se obzvláště týká způsobu takového, jak byl popsán výše, pro výrobu rekombinantní lidské gastrické lipázy a/neb.o polypeptidu (A54LGH) a/nebo polypeptidu (Á4LGH), vyznačující se tím, že zahrnuje:

- transformaci buněk explántů listů rostliny jejich umístěním do přítomnosti kmene Agrobacterium tumefaciens, transformovaného plasmidem, popsaným výše, obsahujícím rekombinantní nukleotidovou sekvenci pSP-PSLGH-LGH a/nebo sekvenci pSP-PSLPH-LGH a/nebo sekvenci pSP-PSLGL-LGH uvedenou výše, ve vhodném kultivačním prostředí,

- selekci transformovaných explántů v prostředí obsahujícím kanamycin,

- získání transformovaných rostlin z transformovaných explántů, uvedených výše, jejich kultivací ve vhodném prostředí,

- extrakce rekombinantní lidské gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Á54LGH) a/nebo polypeptidu (Á4LGH), zejména rozdrcením listů a/nebo semen a/nebo plodů výše uvedených transformovaných rostlin ve vhodném pufru, centrifugací a získáním supernatantu představujícího rostlinný extrakt s enzymatickým účinkem,

- v případě potřeby purifikace rekombinantní lidské gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Á54LGH) a/nebo polypeptidu (Á4LGH) z extraktu, získaného v předcházející etapě, zejména chromatografií supernatantu, cóž vede k získání rekombinantní lidské gastrické lipázy a/nebo polypeptidu (Á54LGH) a/nebo polypeptidu (Á4LGH), ve formě v podstatě čisté.

Vynález se také týká každé rostliny nebo části této rostliny, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen, obsahujících jednu nebo více rekombinantních nuklotidových sekvencí popsaných • * výše podle vynálezu, které jsou stálým způsobem integrovány do jejich genomu.

Předmětem vynálezu je také -každý rostlinný, extrakt s enzymatickým účinkem, obzvláště s účinkem lipázy, definovaným výše, získaný prováděním jednoho ze způsobů popsaných výše, obsahující jako účinný enzym jeden nebo více rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, jako je rekombinantní lidská gastrická lipáza a/nebo polypeptid (A54LGH) a/nebo polypeptid (Á4LGH).

Předmětem vynálezu jsou obzvláště extrakty z listů a/nebo semen rostlin, získané transformací buněk explantů těchto rostlin sekvencí pSP-PSLGH-LGH a/nebo sekvencí pSP-PSLPH-LGH a/nebo sekvencí pSP-PSLGL-LGH jedním z výše popsaných způsobů, a obsahující rekombinantní lidskou gastrickou lipázu a/nebo polypeptid (Á54LGH) a/nebo polypeptid (A4LGH), zejména:

- extrakt listů nebo semen tabáku, získaný transformací buněk explantů listů tabáku sekvencí pSP-PSLGH-LGH a/nebo sekvencí pSP-PSLPH-LGH a/nebo sekvencí pSP-PSLGL-LGH způsobem popsaným výše a obsahující polypeptid (Á54LGH) .spolu s polypeptidem (A4LGH), přičemž hmotnostní procento směsi těchto dvou polypeptidů vzhledem k celkové hmotnosti proteinů přítomných v uvedeném extraktu je od okolo 0,1 % do okolo 20 % a enzymatický účinek uvedeného extraktu je od okolo 100 U na gram čerstvé hmotnosti do okolo 300 U na gram čerstvé hmotnosti,

- extrakt listů tabáku, získaný transformací buněk explantů listů tabáku sekvencí' pSP-PSLGL-LGH způsobem popsaným výše a

S s obsahující polypeptid (A4LGH), přičemž hmotnostní procento tohoto polypeptidu vzhledem k celkové hmotnosti proteinů přítomných v uvedeném extraktu je od okolo 0,1 % do okolo 20 % a enzymatický účinek uvedeného extraktu je od okolo 100 U na gram čerstvé hmotnosti do okolo 300 U ná gram čerstvé hmotnosti.

Předmětem předkládaného vynálezu je také každá enzymaticky účinná rekombinantní lidská gastrická lipáza, jejíž sekvence aminokyselin je sekvence, znázorněná na obr. 5 nebo polypeptid, odvozený od této lipázy, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, a obzvláště polypeptid (A54LGH)a polypeptid (A4LGH), přičemž tyto odvozené polypeptidy vykazují účinek lipázy, které jsou získány ve formě v podstatě čisté prováděním jednoho ze způsobů podle vynálezu, popsaných výše, přičemž tyto způsoby zahrnují etapu purifikace rekombinantních polypeptidů podle vynálezu, zejména chromatografii výše popsaných enzymatických extraktů.

Jak bylo popsáno výše v rámci popisu rekombinantní psí gastrické lipázy, předmětem vynálezu jsou také:

- polyklonální a monoklonální protilátky proti rekombinantní lidské gastrické lipáze nebo polypeptidům od ní odvozeným podle vynálezu a jejich aplikace, jak bylý popsány výše,

- pokrmy a krmivá nebo jedlé a krmné směsi nebo farmaceutické kompozice nebo enzymatické přípravky s průmyslovým určením na bázi rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen nebo rostlinné buňky nebo rostlinné extrakty s enzymatickým účinkem takové, jaké byly popsány výše, nebo nakonec rekombinantní lidská gastrická lipáza nebo polypeptidy od ní odvozené podle vynálezu,

- každý způsob enzymatické biokonverze nebo biokatalýzy nebo výroby biopaliv, jak byly popsány výše, prováděný na základě rekombinantní lidské gastrické lipázy nebo polypeptidů od ní odvozených podle vynálezu nebo na základě rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen a/nebo na základě rostlinných extraktů s enzymatickým účinkem takových, jaké byly popsány výše.

Příklady provedení vynálezu

I. KONSTRUKCE CHIMÉRICKÝCH GENŮ KÓDUJÍCÍCH REKOMBINANTNÍ PROTEINY PSÍ GASTRICKÉ LIPÁZY A DOVOLUJÍCÍ EXPRESI V LISTECH A SEMENECH LILKOVITÝCH ROSTLIN

I-A) Konstrukce chimérických genů kódujících rekombinantní psí gastrickou lipázu a dovolující expresi v tabáku

Exprese genu kódujícího psí gastrickou lipázu (LGC) v listech a semenech tabáků vyžaduj e, následuj ící regulační sekvence:

1. dvojitý konstitutivní promotor 35S (pd35S) viru CaMV (virus mozaiky květáku).

Tento promotor odpovídá duplikaci aktivační sekvence, umístěné před prvkem TATA přírodního promotoru 35S (Kay a kol., 1987);

2. terminální sekvence transkripce, terminátor polyA 35S, který odpovídá nekódující oblasti 3' sekvence viru s dvouvláknovou kruhovou DNA mozaiky květáku, produkující transkript 35S

- 52 (Franck a kol., 1 980).

Konstrukce různých plasmidů použitím technik rekombinantní DNA (Sambrook a kol., 1989) vychází z pBIOC4. Tento binární plasmid je odvozený z pGA492 (An, 1986)’ který obsahuje mezi pravým a levým okrajem; vycházejíce z plasmidů pTiT37 Agrobacterium tumefaciens, na své DNA, následující sekvence:

konstitutivní promotor genu nos kódujícího nopalinsyntházu (Depicker a kol., 1982), kódující sekvence genu nptll kódující neomycin fosfotransferázu II (Berg a Berg, 1 983) vynechaná z oblasti prvních 8 kodonů, mezi nimiž je kodon iniciátor methionin ATG a připojená k sekvenci prvních 14 kodonů sekvence kódující gen nos (Depicker a kol., 1982), sekvence kódující gen nos zbavená oblasti prvních 14 kodonů, terminátor nos (Depicker a kol., 1982), oblast obsahující vícenásobná místa klonování (také nazývaná polylinker) (HindlII-Xbal-SacI-HpalKpnl-Clal-BglII) předcházející genu cat, kódujícímu chloramfenikol acetyltransferázu (Close a Rodriguez, 1982) a terminační sekvence genu 6 plasmidů pTiA6 Agrobacterium tumefaciens (Liu a kol., 1993). Pro eliminaci takřka celé kódující sekvence genu cat byl plasmid pGA492 dvojnásobně natráven pomocí Sací (res trik ční místo polylinkeru) a Scal (restrikční místo přítomné v sekvenci genu cat) a potom podroben působení enzymu T4 DNA polymerázy (New Énglanď Biolabs) podle doporučení výrobce. Ligace modifikovaného plasmidů (20 ng) byla provedena v reakčním prostředí o 10 μΐ, obsahujícím 1 μΐ pufru T4 DNA ligázy x 10 (Amersham); 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při 14 °C po 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan,

983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na r - r · f * ♦ » · r r r * ♦ ♦ ♦ » pg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Potom bylo restrikční místo HindlII plasmidové DNA získaného klonu modifikováno v restrikčním místě EcoRI pomocí fosfory lovaného adaptoru HindlII-EcoRI (Stratagene Cloning Systems). Pro realizaci této modifikace bylo 500 ng plasmidové DNA získaného klonu natráveno pomocí HindlII, defosforylováno enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce a koprecipitována v přítomnosti 1500 ng DNA adaptoru HindlIIEcoRI, 1/10 objemu octanu sodného 3M pH 4,8 v 2,5 objemech čistého ethanolu při -80°C po dobu 30 minut. Po centrifugaci při 12000 g po 30 min. byla precipitovaná DNA promývána v ethanolu 70 %, sušena, vyjmuta v 8 μΐ vody, přivedena na 65°C po dobu 10 minut, potom ligována v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při 14 °C po dobu 16 hodin. Po inaktivaci T4 DNA ligázy při 65°C po 10 minut byla ligační reakční směs natrávena pomocí EcoRI, purifikována elektroforézou na gelu agarózy 0,8 %, elektrovymývána (Sambrook a kol., 1989), precipitována v přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při -80°C po dobu 30 minut, centrifugována při 12000 g po dobu 30 minut, promývána v ethanolu 70 %, sušena, potom ligována jak je popsáno výše. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidové DNA získaných klonů, selektovaná na 12 pg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením zejména pomocí HindlII a EcoRI. Vzniklý binární plasmid, který již obsahuje pouze 9 posledních kodonů sekvence kódující gen cat a jehož místo EcoRI je jediné, byl nazván pBIOC4.

• ·

- 54 9

Kazeta exprese, konstituovaná promotorem pd35S a terminátorem polyA 35S, byla izolována z plasmidů pJIT163A, Plasmid pJIT163Á je odvozen z plasmidů pJIT163, který sám je odvozen z plasmidů pJIT60 (Guerineau a Mullineaux, 1993). Plasmid pJIT63 obsahuje kodon ATG mezi místy HindlII a Sáli polylinkeru. Pro odstranění tohoto plasmidů

Sáli,

0,8 získání plasmidů pJIT163A byla pJIT163 dvojnásobně natrávena purifikována %, elektrovymývána v přítomnosti 1/10 elektroforézou na (Sambroók a kol., objemu 3M octanu plasmidová DNA pomocí HindlII agarózovém gelu

1989), precipitována

4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při -80°C po dobu centrifugována při 12000 g po dobu 30 minut, v ethanolu 70 %, sušena, podrobena působení

England Biolabs) podle doporučení extrakcí 1 objemem směsi fenol: (25:24:1) a potom 1 objemem směsi (24:1), precipitována v přítomnosti čistého sodného pH minut, promývána

Klenowova enzymu (New výrobce, deproteinizována chloroform: isoamylalkohol chloroform:isoamylalkohol

1/10 objemu 3M octanu sodného pH ethanolu při -80 °C po dobu 30 minut, po dobu 30 minut, promývána v 70 %

4,8 a 2,5 objemu centrifugována při ethanolu, sušena a

12000 g nakonec ligována v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Ámersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie EsřHěw DH5a~bylý ~ třánšformo vány (Hanahan, 19 8 3).

Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Pro izolaci kazety exprese konstituované promotorem pd35S a terminátorem polyA 35S (fragment SaclXhol) byla plasmidová DNA získaného klonu pJIT163Á natrávena pomocí Sací a Xhol. Fragment Sacl-Xhol, nesoucí kazetu exprese byl purifikován elektroforézou na agarózovém gelu, elektro vymýván (Sambrook a kol., 1989), precipitován v přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného.pH 4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80°C po dobu 30 minut, centrifugován při 12000 g po dobu 30 minut, promýván v ethanolu 70 %, sušen, podrobena působení enzymu Mung Beán * Nuclease (New England Biolabs) podle doporučení výrobce.

Tento purifikovaný insert (200 ng) byl klonován do plasmidové DNA pBIOC4 (20 ng), natrávané EcoRI, ošetřen enzymem Mung Beán Nuclease a defosforylován enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Reakce ligace byla provedena v 20 μΐ v přítomnosti 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1 983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 12 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC21.

Psí gastrická lipáza (LGC) jě“přiróže~ně syntetizována ve formě prekurzoru. Maturovaný protein psí gastrické lipázy je tvořen 379 aminokyselinami. Komplementární DNA psí gastrické lipázy byly klonována do míst GblII a Sáli vektoru exprese pRU303, vedoucímu na vektor pDGL5.303, popsaný v mezinárodní patentové přihlášce č. WO 94/13816. Ten byl použit pro konstrukci binárních plasmidů pBIOC25, který obsahuje PS-LGC a pBIOC26, který obsahuje PPS-LGC, kde sekvence kódující maturovanou psí gastrickou lipázu je předcházena sekvence kódující signální peptid (PS) nebo prepropeptid (PPS, to jest signální peptid, následovaný N-terminálními sekvencemi vakuolárního směrování) rostlinného původu. Sekvence PS a PPS, tvořené 23 respektive -3 7 aminokyselinami, jsou sekvence zásobního proteinu zhlízo vatělých kořenů sladkého bramboru: sporaminu A (Murakami a kol., 1986; Matsukoa a Nakamura, 1991).

%

Pro zjednodušení fuze mezi sekvencí maturované psí gastrické lipázy a sekvencí signálů směrování, PS a PPS, byl plasmid pDGL5.303 modifikován vložením doplňkového restrikčního místa HindlII do čtvrtého a pátého kodonu sekvence maturované psí gastrické lipázy mutagenezí, řízenou PCR s použitím 2 oligodesoxynukleotidů,

5' caggagaatc TTG TTT GGA AAG CTT CAT CCC 3' (obsahující jediné místo BglII plasmidu a přinášející dodatkové místo HindlII) a

5' CAT ATT CCT CAG CTG GGT ATC 3' (obsahující jediné místo PvuII plasmidu).

Amplifikace fragmentu BglII-PvuII pomocí PCR byly provedena v 100 μΐ reakčního prostředí, obsahujícího 10 μΐ pufru Taq DNA polymeráza x 10 (5 00 mM KCÍ, 100 mM Tris-Hcl, pH 9,0 a 1 % Triton x 100), 6 μΐ 25 mM MgCl₂, 3 μΐ 10 mM dNTP (dATP, * dCTP, dGTP a dTTP), 100 pM každého z výše popsaných dvou ~ oligodesoxynukleotidů, 5 ng DMA matrice (vektor exprese pRU303, obsahující komplementární DNA psí gastrické lipázy)

2,5 U Taq DNA polymerázy (Promega) a 2 kapky vazelínového oleje. DNA byla denaturována při teplotě 94 °C po dobu 5 minut, podrobena 30 cyklům, přičemž každý sestával z 1 minuty denaturace při teplotě 94 °C, 1 minuty hybridizace při teplotě 50 # · °C a 1 minuty elongace při teplotě 72 °C a potom byla elongace při teplotě 72 °C pokračována po dobu 5 minut. Tato reakce PCR byla provedena v přístroji „DNA Thermal Cycler“ - společnosti PERKIN ELMER < CETUS. Olej byl eliminován extrakcí v chloroformu. Potom byly fragmenty DNA, obsažené v reakčním prostředí, precipitovány v přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80 °C po dobu 30 minut, centrifugovány při 12000 g po dobu 30 minut, promývány v 70 % ethanolu, sušeny a natráveny dvěma restikčními enzymy BglII a PvuII. Natrávené fragmenty DNA, vzniklé z PCR, byly purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 2 %, elektro vymývány (Sambrook a kol., 1989), precipitovány v přítomnosti 1/10 objemů 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80 °C po dobu 30 minut, centrifugovány při 12000 g po dobu 30 minut, promývány v 70 % ethanolu, sušeny a potom ligovány do plasmidové DNA vektoru pDGL5.303, dvojnásobně natráveného pomocí BglII a PvuII, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektro vymývány, podrobeny precipitaci v alkoholu, sušeny a defosforylovány enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 100 ng defosforylovaného vektoru, popsaného výše a ng fragmentů natrávené DNA, vzešlé z PCR amplifikace, popsané výše, v 10 μΐ reakčního prostředí v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1 983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Plasmidová DNA některých získaných klonů byla verifikována sekvenací s pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., \9ΊΊ). Vložení tohoto restrikčního místa HindlII nemodifikuje genetický kód psí gastričké lipázy. Přirozená sekvence psí * gastričké lipázy AAA TTA (Lys-Leu) se totiž stane (AAG CTT (Lys-Leu). Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC22 a obsahuje sekvenci maturovaného proteinu psí gastričké lipázy, odpovídající:

LEU PHE GLY LYS LEU---THR ASP ASN LYS AMB agatcTTG TTT GGA AAG CCT---ACA GAT AAT AAG TAG TTCTAGA

BglII HindlII Xbal jediná restrikční místa jediné restrikční místo

LEU: první kodon maturované psí gastričké lipázy,

AMB: stop-kodon.

a. KONSTRUKCE BINÁRNÍHO PLASMIDU pBIOC25, OBSAHUJÍCÍHO PS-LGC.

Plasmid pBIOC22 byl úplně natráven pomocí BglII a částečně pomocí HindlII, aby byla odstraněna sekvence kódující polypeptid Leu-Phe-Gly-Lys (4 první aminokyseliny) maturovaného proteinu psí gastričké lipázy. Tato sekvence byla nahrazena sekvencí, kódující signální peptid PS o 23 aminokyselinách (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC), připojených na aminokyseliny prvních čtyř kodonů v sekvenci, kódující maturovaný protein psí gastrické lipázy („PS4 první kodony maturované psí gastrické lipázy“). Sekvence „PS4 první kodony maturované psí gastrické lipázy“ byla amplifikována pomocí PCR, vycházejíce z plasmidů pMAT103 (Matsuoka a Nakamura, 1991) pomocí dvou následujících oligodesoxynukleotidů:

5' caggagggatctgXTC AAA GCC TTC ACA CTC GC 3' a

5' G ATG AAG CTT TCC AAA CAA GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G 3' postupujíce podle protokolu amplifikace PCR, který byl popsán výše v odstavci I. Po dvojnásobném enzymatickém natrávení pomocí. BglII a HindlII byly fragmenty DNA, vyšlé z amplifikace PCR, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 2 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), precipitovány v přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80°C po dobu 30 minut, centrifugovány při 12000 g po dobu 30 minut, promývány v ethanolu 70 %, sušeny, poté ligovány do plasmidové DNA plasmidů pBIOC22, dvojnásobně natrávené pomocí BglII a HindlII, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), podrobeny precipitaci v alkoholu, sušeny a defosforylovány enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 100 ng výše popsaného defosforylovaného vektoru a 50 ng natrávených fragmentntů DNA, vzešlých z amplifikace PCR, popsané výše, v reakčním prostředí 10 μΐ v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 5 0 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly,-1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Plasmidová DNA některých získaných klonů byla verifikována sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Sekvence PS a maturované psí gastrické lipázy byly klonovány, přičemž jejich čtecí rámce byly udržovány otevřené. Místo štěpení mezi sekvencemi PS a maturovanou psí gastrickou lipázou je Ser-Leu. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC23. Vycházejíce z pBIOC23 byl izolován fragment BglIIXbal, nesoucí sekvenci PS-LGC, dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocí BglII a Xbal, purifikcí elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýváním (Sambrook a kol.,

1989), alkoholickou precipitací a sušením. Poté byl tento DNA fragment ošetřen Klenowovým enzymem podle doporučení výrobce a ligován do plasmidové DNA plasmidu pBIOC21, natrávené v místě HindlII, ošetřené podle Klenowa a defosforylované enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce.

Ligace byla pro vedena s 20 ng defosforylo váného vektoru popsaného výše a

200 ng fragmentů DNA, obsahujících PS-LGC, popsaných výše, v

- . . 20 μΐ reakčního prostředí v přítomnosti-2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 12 pg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC25. Nukleotidová sekvence fragmentů, kódujících rekombinantní protein PS-LGC byla verifikována sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Plasmidová DNA binárního vektoru pBIOC2 5 byla vložena přímou transformací do kmene LBA4404 Agrobacterium tumefaciens způsobem podle Holsterse a kol., (1978). Platnost získaného klonu byla ověřena enzymatickým natrávením vložené plasmidové DNA.

b. KONSTRUKCE BINÁRNÍHO PLASMIDU pBIOC26, OBSAHUJÍCÍHO PPS-LGC.

Plasmid pBIOC22 byl úplně natráven pomocí BglII a částečně pomocí HindlII, aby byla odstraněna sekvence kódující polypeptid Leu-Phe-Gly-Lys maturovaného proteinu psí gastrické lipázy. Tato sekvence byla nahrazena sekvencí, kódující signální peptid PPS o 23 aminokyselinách (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC AGG.TTC AAT CCC ATC CGC CTC CCC ACC ACA CAC GAA CCC GCC), připojených na aminokyseliny prvních čtyř kodonů v sekvenci, kódující maturovaný protein psí gastrické lipázy („PPS-4 první kodony maturované psí gastrické lipázy“). Sekvence „PPS-4 první kodony maturované psí gastrické lipázy“ byla amplifikována pomocí PCR, vycházejíce z plasmidu pMAT103 (Matsuoka a Nakamura, 1991) pomocí dvou následujících oligodesoxynukleotidů:

5' caggagatctgATGAAA GCC TTC ACA CTC GC 3' a

5' G ATG AAG CTT TCC AAA CAA GGC GGG TCC GTGTGT

GGT TG 3' • · « postupujíce podle protokolu amplifikace PCR, který byl popsán výše v odstavci I. Po dvojnásobném enzymatickém natrávení pomocí BglII a HindlII byly fragmenty DNA, vyšlé z amplifikace PCR, purifi kovány elektroforézou na agarózovém gelu 2 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), přecipitovány v přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80°C po dobu 30 minut, * centrifugo vány při 12000 g po dobu 30 minut, promývány v ?

ethanolu 70 %, sušeny, poté ligovány do plasmidové DNA > plasmidů pBIOC22, dvojnásobně natrávené pomocí BglII a

HindlII, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), podrobeny precipitaci v alkoholu, sušeny a defosforylovány enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 100 ng výše popsaného defosforylovaného vektoru a 50 ng natrávených fragmentntů DNA, vzešlých z amplifikace PCR, popsané výše, v reakčním prostředí 10 μΐ v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restfikčními enzymy. ~ *.

Plasmidová DNA některých získaných klonů byla verifikována sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Sekvence PPS a maturované psí gastrické lipázy byly klonovány, přičemž jejich čtecí rámce byly udržovány otevřené.

r f

Místo štěpení mezi sekvencemi PPS a maturovanou psí gastrickou lipázou je Ala-Leu. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC24. Vycházejíce z pBIOC24 byl izolován fragment BglII-Xbal, nesoucí sekvenci PPS-LGC, dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocí BglII a Xbal, purifikcí elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýváním (Sambrook a kol.,

1989), alkoholickou precipitací a sušením. Poté byl tento DNA fragment ošetřen Klenowovým enzymem podle doporučení výrobce a ligován do plasmidové DNA plasmidu pBIOC21, natrávené v místě HindlII, ošetřené podle Klenowa a defosforylované enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 20 ng defosforylovaného vektoru popsaného výše a 200 ng fragmentů DNA, obsahujících PPS-LGC, popsaných výše, v 20 μΐ reakčniho prostředí v přítomnosti 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5cc byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 12 pg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC26. Nukleotidová sekvence fragmentů, kódujících rekombinantní protein PPS-LGC byla verifikována sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia, metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Plasmidová DNA binárního vektoru pBIOC26 byla vložena přímou transformací do kmene LBA4404 Agrobacterium tumefaciens způsobem podle Holsterse a kol., (1978). Platnost získaného klonu byla ověřena enzymatickým natrávením vložené plasmidové DNA.

c. KONSTRUKCE BINÁRNÍHO PLASMIDU pBIOC41, OBSAHUJÍCÍHO PSLGL-EGC.

Králičí gastrická lipáza byla syntetizována ve formě prekurzoru, skládajícího se ze signálního peptidu o 22 aminokyselinách, nacházejícího se na NH2-konci a předcházejícího polypeptidovou sekvenci maturované lipázy. Klon pJOlOl, obsahující kompletní cDNA kódující králičí gastrickou lipázu je popsán v přihlášce evropského patentu č. 92 403 055.4, kterou předložil 12.11.92 „Institut de Recherche Jouveinal“ a která se nazývá „Acides nukléiques codant pour la lipase gastrique de lapin et derivés polypeptidiques, leur utilisation pour la production de ces polypeptides, et compositions pharmaceutíques á base de ces derniers“ (Nukleové kyseliny, kódující králičí gastrickou lipázu a odvozené polypeptidy, jejich použití pro výrobu těchto polypeptidů a farmaceutické kompozice na základě těchto polypeptidů).

Porovnání polypeptido vé sekvence psí gastrické lipázy a prekurzoru králičí gastrické lipázy ukázalo, že sekvence LFGK se nachází v obou proteinech. V polypeptiaové sekvenci králičí lipázy, určené na základě přirozeného purifikováného proteinu (Moreau a kol., 1988), chybějí tři první residua L,F,a G a tvoří část signálního-peptidu o 22 aminokyselinách králičí gastrické lipázy. Na základě toho byl signální peptid králičí gastrické lipázy, zbavený těchto tří prvních společných aminokyselin, fúzován do maturované proteinové sekvence psí gastrické lipázy. Jeho polypeptidová sekvence je tvořena následujícími 19 aminokyselinami: M W VLFM V A ALLS ALGTTHG.

» r

Plasmid pBIOC22 byl tedy úplně natráven pomocí BglII a částečně pomocí HindlII, aby byla odstraněna sekvence kódující polypeptid Leu-Phe-Gly-Lys (4 první aminokyseliny) maturovaného proteinu psí gastrické lipázy. Tato sekvence byla nahrazena sekvencí, kódující signální peptid LSLGL králičí gastrické lipázy o 19 aminokyselinách (ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT), připojených na aminokyseliny prvních čtyř kodonů v sekvenci, kódující maturovaný protein psí gastrické lipázy („PSLGL-4 první kodony maturované psí gastrické lipázy“). Sekvence „PSLGL-4 první kodony maturované psí gastrické lipázy“ byla amplifikována pomocí PCR, vycházejíce z plasmidu pJOlOl pomocí dvou následujících oligodesoxynukleotidů: 5' aggagatctcaacaMTG TGG GTG CTT TTC ATG GTG 3' a

5' G ATG AAG CTT TCC AAA ACC ATG TGT AGT TCC AAG TG 3' postupujíce podle protokolu amplifikace PCR, který byl popsán výše v odstavci I. Po dvojnásobném enzymatickém natrávení pomocí BglII a HindlII byly fragmenty DNA, vyšlé z amplifikace PCR, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 2 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), precipito vány v přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80°C po dobu 30 minut, centrifugovány při 12000 g po dobu 30 minut, promývány v ethanolu 70 %, sušeny, poté ligovány do plasmidové DNA plasmidu pBIOC22, dvojnásobně natrávené pomocí BglII a HindlII, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), podrobeny precipitaci v alkoholu, sušeny a defosforylovány enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 100 ng výše * 9 r - · r Γ r - r s - r - · · · · ř r popsaného defosforylovaného vektoru a 50 ng natrávených fragmentntů DNA, vzešlých z amplifikace PCR, popsané výše, v reakčním prostředí 10 μΐ v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Plasmidová DNA některých získaných klonů byla verifikována sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Sekvence PSLGL a maturované psí gastrické lipázy byly klonovány, přičemž jejich čtecí rámce byly udržovány otevřené. Místo štěpení mezi sekvencemi PSLGL a maturovanou psí gastrickou lipázou je Gly-Leu. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC40. Vycházejíce z pBIOC40 byl izolován fragment BglII-Xbal, nesoucí sekvenci PSLGL-LGC, dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocí BglII a Xbal, purifikcí elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýváním (Sambrook a kol., 1989), precipitací v alkoholu a sušením. Poté byl tento DNA fragment ošetřen --------Kleno wovým—enzymem podle doporučení výrobce a ligován do plasmidové DNA plasmidu pBIOC21, natrávené v místě HindlII,

... ošetřené podle Klenowa - a - defosforylované enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 20 ng defosforylovaného vektoru popsaného výše a 200 ng fragmentů DNA, obsahujících PSLGL-LGC, popsaných výše, v 20 μΐ reakčního prostředí v přítomnosti 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 r r f r

DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5ct byly transformovány (Hanahan, 1 983). Plasmidová DNA získaných klonů, .podrobených selekci na 12 pg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC41. Nukleotidová sekvence fragmentů, kódujících rekombinantní protein PSLGL-LGC byla verifikována sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia, metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Plasmidová DNA binárního vektoru pBIOC41 byla vložena přímou transformací do kmene LBA4404 Agrobacterium tumefaciens způsobem podle Holsterse a kol., (1978). Platnost získaného klonu byla ověřena enzymatickým natrávením vložené plasmidové DNA.

II. KONSTRUKCE CHIMÉRICKÝCH GENU, KÓDUJÍCÍCH REKOMBINANTNÍ PROTEIN PSÍ GASTRICKÉ LIPÁZY A DOVOLUJÍCÍ EXPRESI V SEMENECH ŘEPKY

a) Konstrukce binárního plasmidu pBIOC28 obsahujícího promotor pCRU.

Exprese genu kódujícího psí gastrickou lipázu (LGC) v semenech řepky vyžaduje vložení cDNA, kódující psí gastrickou lipázu mezi následující regulační sekvence:·

1. promotor pCRU, odpovídající nekódující oblasti 5' genu zásobního proteinu semen, kruciferinu A ředkvičky (DepignyThis a kol., 1992) a dovolující specifickou expresi v semenech;

2. terminální sekvence transkripce, terminátor polyA 35S, který odpovídá nekódující oblasti 3' sekvence viru s dvouvláknovou kruhovou DNA mozaiky květáku, produkující transkript 35S (Franck a kol., 1980).

Pro získání binárního plasmidu podobného pBIOC21, ale takového, že jeho promotor pd35S byl na hrazen promotorem pCRU, byl izolován fragment „EcoRI, ošetřený podle KlenowaBamHI“, obsahující promotor pCRU, z plasmidu pBI221CRURSP, odvozeného z pBI221 (prodávaného společností Clontech) nahrazením promotoru 35S promotorem pCRU.

Fragment „EcoRI, ošetřený podle Klenowa-BamHI“, nesoucí promotor pCRU byl purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), podroben precipitaci v alkoholu, sušen a ligován do plasmidové DNA plasmidu pJIT163 (popsaného v paragrafu I.), natráven pomocí KpnI, ošetřen pomocí T4 DNA polymerázy (New England Biolabs) podle doporučení výrobce, potom natráven pomocí BamHI, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), podroben precipitaci v alkoholu, sušen a defosforylován enzymem alkalické fosfatázy té1 eč í ho střev á (Boehringer M a η n h eim) po dle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 20 ng výše popsaného defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentů „EcoRI, ošetřený podle Klenowa-BamHI“, popsaných výše, v reakčním prostředí o 20 μΐ, obsahujícím 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1 983). Plasmidová DNA získaných r t »9 9 r r F ♦ ♦ · ♦« r r F » ·· · * · ♦ 4 · · ·« » » ·9

Τ *«· ·««« klonů, podrobených selekci v prostředí, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC27.

Kazeta exprese, konstituovaná promotorem pCRU a terminátorem polyA 35S, byla izolována z plasmidu pBIOC27 úplným natrávením pomocí Xhol, následovaným částečným natrávením pomocí EcoRI. Byla purifikována elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymývána (Sambrook a kol., 1 989), podrobena precipitaci v alkoholu, sušena, podrobena působení Klenowova enzymu (New England Biolabs) podle doporučení výrobce a ligována do plasmidové DNA plasmidu pBIOC24 v místě EcoRI, ošetřeném podle Klenowa a defosforylovaném enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 20 ng výše popsaného defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentů Xhol-EcoRI, popsaných výše, v reakčním prostředí o 2 0 μΐ v přítomnosti 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 12 pg/ml téťracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC28.

b) Konstrukce binárního plasmidu pBIOC29, obsahujícího PPSLGC

- 70 ♦ » • 9

Izolace fragmentu BglIII-Xbal, nesoucího sekvenci PPS-LGC z plasmidu pBIOC24 byla již popsána v I-A-b. Tento fragment byl ligován do plasmidové DNA plasmidu pBIOC28 v místě EcoRI, ošetřeném podle Klenowa a defosforylovaném enzymem alkalické fosfatázy (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 20 ng výše popsaného defosforylováného vektoru a 200 ng DNA fragmentntů BglIII-Xbal, obsahujících PPS-LGC, v reakčním prostředí 20 μΐ v přítomnosti pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA

W;

získaných klonů, podrobených selekci na 12 pg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC29. Nukleotidová sekvence rekombinantního proteinu PPS-LGC byla verifikována sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977).

Plasmidová DNA binárního vektoru pBIOC29 byla vložena přímou transformací do kmene LBA4404 způsobem podle Holsterse a kol.,

Agrobacterium tumefaciens (1978). Platnost získaného klonu by 1 a o V ě ř e n a ěn z ý m a t i c ky m n a t r á v ením v lož e n é plas mi d o v é DNA.

I?*'

c) Konstrukce binárních plasmidů pBIOC90 a pBIOC91 obsahujících promotor pGEAlD.

Exprese živočišného genu kódujícího psí gastrickou lipázu (LGC) v semenech řepky vyžaduje následující regulační sekvence:

* ♦

1. promotor pGEAl, odpovídající nekódující oblasti 5' genu zásobního proteinu semen, GEA1 Arabidopsis thaliana (Gaubier a kol., 1993) a dovolující specifickou expresi v semenech;

Pro získání binárního plasmidu pBIOC90, podobného pBIOC21, ale takového, že jeho promotor pd35S byl nahrazen promotorem pGEAlD, byl izolován fragment „HindlII-BamHI, ošetřený podle Klenowa“, obsahující promotor pGEAl, z plasmidu pGUS2pGEAl. Klon pGUS-2-pGEAl, odvozený z pBI221 nahrazením promotoru p35S promotorem pGEAl, obsahuje 2 ATG ve fázi: ATG genu GEA1 (Em2) a ATG genu gus. ATG genu GEA1 byl destruován. Fragment DNA, nacházející se mezi místy Sáli a sekvencemi před ATG genu GEA1 klonu pGUS-2-pGEAl byl amplifikován pomocí PCR s pomocí následujících dvou nukleotidů:

5' CAAACGTGTACAATAGCCC 3' a

5' CCCGGGGATCCTTTTTTG 3'.

Hybridizačrií teplota bylá Upravena. Fragment, amplifikováný pomocí PCR byl natráven pomocí Sáli a BamHI, purifikovaný elektroforézou na agarózovém gelu 2 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), precipitován v přítomnosti 1/10 objemu

3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80 °C a po dobu 30 minut, centrifugo ván při 12000 g po dobu 30 minut, promýván ethanolem 70 %, sušen a ligován do plasmidové DNA plasmidu pGUS-2-GEAl, dvojnásobně

» · • * natráveného pomocí Sáli a BamHI, purifikován elektróforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), podroben precipitaci v alkoholu a sušen. Ligace byla provedená s 100 ng vektoru a 50 ng DNA fragmentů vyšlých z amplifikace PCR, popsaných výše, v reakčním prostředí o 10 μ1,'obsahujícím 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5ct byly transformovány (Hanahan, 1 983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Některé získané klony byly verifikovány sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Vzniklý klon byl nazván pGUS-2-pGEAlD.

Fragment HindlII-BamHi, nesoucí promotor pGEAlD, izolovaný z pGUS-2-pGEA 1D, ošetřený podle Klenowa podle doporučení výrobce (Biolabs), byl purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), podroben precipitaci v alkoholu, sušen a ligován do plasmidové DNA plas mi ďů p BIO C 21 v mís teč h Kp ni a Ή indií Γ, o še třených enzymem T4 DNA polymerace (Biolabs) podle doporučení výrobce. Ligace- byla provedena’ s ' 20 “ng ’ defoŠfóryIovaného“ pBIOC21 a 200 ng DNA fragmentů Xhol-EcoRI, popsaných výše, v reakčním prostředí o 20 μΐ, obsahujícím 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA • · r

r

9

9 9 • · · · • · · · • ♦ » · · • · · • · ♦ · získaných klonů, podrobených selekci na 12 pg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC90.

Plasmid pBSII-pGEAlD byl získán ve dvou etapách:

- nejprve byl fragment SacI-EcoRI, nesoucí tNOS (terminátor genu nopalinsyntházy) Agrobacterium tumefaciens, ošetřený enzymem T4 DNA polymeráza (Biolabs) podle doporučení výrobce a purifikovaný, klonován do místa EcoRV pBSIISK+, prodávaného společností Stratagene, defosforylovaného enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 20 ng defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentů, obsahujících tNOS, popsaných výše, v reakčním prostředí o 20 μΐ, obsahujícím 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50- pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy.’ Některé získané klony byly verifikovány sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7 , prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC90.

- kromě toho byl fragment nesoucí pGEAlD dvojnásobně natráven pomocí HindlII, ošetřeného Klenowovým enzymem a BamlI,

- ,- Λ Γ 9 9 9 * · · ♦

.. _r ř··· · 9 9 9

9 9 * 9 9 9

A — ₉ * 9 9 - 9 9 ~ / 4 * ♦ · f _r r- 9 9 9 99 ·· ·· purifikován a klonován do míst „Xbal, ošetřené podle Klenowa a BamHI“ plasmidu pBSII-tNOS. Ligace byla provedena s 100 ng výše popsaného vektoru a 50 ng výše popsaných DNA fragmentů, v reakčním prostředí o 10 μΐ, obsahujícím 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10- (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidové DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazvánpBSII-pGEAlD.

Potom byla kazeta exprese „pGEAl D-tNOS“, přenesená na fragment Xbal-HindlII, ošetřený podle Klenowa, klonována do místa Smál pSCV1.2, defosforylovaného enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 20 ng defosforylovaného pSCV1.2 a 200 ng DNA fragmentů, nesoucích kazetu exprese „pGEA 1 D-tNOS“, v reakčním prostředí o 20 μΐ, obsahujícím 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza

------(Ame r s ham) p ři t eplotě 14 °C po dobu 16 hodiη. P ř e dbě žně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány -- (Hanahan,- 1 983).-Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 μg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC91.

d) Konstrukce binárního plasmidu pBIOC92 obsahujícího • «

promotor pGEA6D.

Exprese živočišného genu kódujícího psí gastrickou lipázu (LGC) v semenech řepky následující/regulační sekvence:

1. promotor pGEAó, odpovídající nekódující oblasti 5' genu zásobního proteinu semen, GEA6 Arabidopsis thaliana (Gaubier a kol., 1993) a dovolující specifickou expresi v semenech;

Pro získání binárního plasmidu pBIOC92, podobného pBIOC21, ale takového, že jeho promotor pd35S byl nahrazen promotorem pGEAóD, byl izolován fragment EcoRI-BamHI, ošetřený podle Klenowa, obsahující promotor pGEAó, z plasmidu pGUS2pGEA6. Klon pGUS-2-pGEA6 odvozený z pUC18, obsahuje 2 ATG ve fázi: ATG genu GEA6 (Em6) a ATG genu gus. ATG genu GEA6 byl destruován. Fragment DNA, nacházející se mezi místem AccI a sekvencemi před ATG genu GEA6 klonu pGUS-2pGEA6 byl amplifikován pomocí PCR s pomocí následujících dvou nukleotidů:

5' AAGTACGGCCACTACCACG 3' a

5' CCCGGGGATCCTGGCTC 3'.

Hybridizační teplota byla upravena.

Fragment, amplifikovaný pomocí PCR byl natráven pomocí AccI a

BamHI, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 2 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), precipitován v « · přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80 °C a po dobu 30 minut, centrifugo ván při 12000 g po dobu 30 minut, promýván ethanolem 70 %, sušen a ligován do plasmidové DNA plasmidů pGUS-2GEA6, dvojnásobně natráveného pomocí AccI a BamHI, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), podroben precipitaci v alkoholu a sušen. Ligace byla provedena s 100 ng výše popsaného vektoru a 50 ng natrávených DNA fragmentů vyšlých z amplifikace PCR, popsaných výše, v reakčním prostředí o 10 μΐ, obsahujícím 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1 983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýžy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikční mi enzymy. Některé získané klony byly verifikovány sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Vzniklý klon byl nazván pGUS-2-pGEA6D.

Fragment HindlII-BamHI, nesoucí promotor pGEA6Ď, izolovaný z pGUS-2-pGEA6D, ošetřený podle Klenowa podle doporučení výrobce (Biolabs), byl purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), podroben precipitaci v alkoholu, sušen a ligován do plasmidové DNA modifikovaného plasmidů pBIOC21 v místě Xhol, ošetřeném Klenowovým enzymem. Modifikovaný plasmid pBIOC21 byl získán dvojnásobným natrávením pBIOC21 pomocí HindlII, ošetřeným podle Klenowa a KpnI pro vyloučení fragmentu, • · · · • · ♦ · • · · « ♦ « · · • · · · nesoucího promotor pd35S a jeho nahrazení fragmentem KpnlEcoRV, nesoucím polylinker, míst Kpnl-XhoI-XalI-Clal-HindlIIBamHI-Smal-EcoRI-EcoRV plasmidu pBSIISK + . Ligace byla provedena s 20 ngdefosforylovaného. modifikovaného pBIOC21 a 200 ng DNA fragmentů EcoRI-BamHI, popsaných výše, v reakčním prostředí o 20 μΐ, obsahujícím 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 12 μg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC92.

e) Konstrukce binárních plasmidů pBIOC93, pBIOC94, pBIOC95, pBIOC96 a pBIOC97, obsahujících PSLGL-LGC.

Plasmid pBIOC40 byl popsán výše. Tento plasmid obsahuje fragment BglII-Xbal, nesoucí sekvenci PSLGL-LGC.

Tento fragment byl izolován dvojnásobným natrávením pomocí BglII a Xbal, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektro vymýván (Sambrůok a kol., 1989), podroben prečipitaci v alkoholu, sušeny, ošetřen podle Klenowa a poté ligován do pBIOC28 (popsán výše), natráveného pomocí EcoRI, ošetřeného podle Klenowa a defosforylovaného; do pBIOC90, natráveného pomocí EcoRI, ošetřeného podle Klenowa a defosforylovaného; do pBIOC91, natráveného pomocí Smál, ošetřeného podle Klenowa a defosforylovaného; do pBIOC92, natráveného pomocí HindlII, ošetřeného podle Klenowa a defosforylovaného; čímž • » · byly získány pBIOC93, pBIOC93, pBIOC93, respektive pBIOC93.

Plasmid pBIOC97 vznikne klonováním fragmentu KpnI-EcoRV, nesoucího kazetu exprese „pGE A6D-PSLGL-LGC-t3 5S“, ošetřeného enzymem T4 DNA polymeráza, purifikovaného elektroforézou na agarozovém gelu 0,8 %, e lekt rovy mývané ho, podrobeného precipitaci v alkoholu, sušeného a ligovaného do pSCV1.2, natráveného pomocí Smál a defosforylovaného. Kazeta exprese „pGEA6D-PSLGL-LGC-t35S“ pochází z pBIOC92.

III. KONSTRUKCE CHIMÉRICKÝCH GENU, KÓDUJÍCÍCH REKOMBINANTNÍ PROTEIN LIDSKÉ GASTRICKÉ LIPÁZY A DOVOLUJÍCÍ KONSTITUTIVNÍ EXPRESI NAPŘÍKLAD V LISTECH A SEMENECH TABÁKU

a) Konstrukce binárního plasmidu pBIOC82 obsahujícího chimérický promotor SUPER-PROMOTOR pSP.

Exprese genu kódujícího lidskou gastrickou lipázu (LGH) v listech tabáku následující regulační sekvence:

1. chimérický promotor superpro m o tór (pS P; P C T / US 9 4 /12946). Tento je tvořen trojnásobným opakováním aktivačního transkripčního prvku promotoru genu ’ octopinsynthazy Agrobacterium tumefaciens, aktivačního transkripčního prvku promotoru genu mannopinsyntházy a promotoru mannopinsyntházy Agrobacterium tumefaciens·,

Pro .získání .binárního plasmidu. podobného pBIOC21, ale takového, že jeho promotor pd35S byl nahrazen promotorem pSP, byl izolován fragment pvull-SalI, ošetřený podle Klenowa, obsahující promotor pSP, z plasmidu pBISNl (PCT/US94/12946), purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 1 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), podroben precipitaci v alkoholu, sušen a ligován do plasmidové DNA plasmidu pBIOC81, dvojnásobně natrávené pomocí KpnI a EcoRI, ošetřen pomocí T4 DNA polymerázy a defosforylován enzymem alkalické fosfatázy telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Plasmid pBIOC81 odpovídá plasmidu pBIOC21, jehož místo Xbal bylo vynecháno. Aby toho bylo dosaženo, je plasmid pBIOC21 natráven pomocí Xbal, poté podroben působení Klenowova enzymu a ligován působením T4 DNA ligázy.

Ligace byla provedena s 20 ng výše popsaného defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentů, nesoucích pSP, popsaných výše, v reakčnim prostředí o 20 μΐ, obsahujícím 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza’ (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci v prostředí, obsahujícím na 12 pg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC82.

Lidská gastrická lipáza (LGH) byla přirozeně syntetizována ve formě prekurzoru, popsaného v publikaci Bodmer a kol., 1987. Maturovaný protein lidské gastrické lipázy je tvořen 379 aminokyselinami. Jeho signální protein (PSLGH) se skládá z 19 aminokyselin. Místo štěpení mezi PSLGH a lidskou gastrickou lipázu je Gly-Leu.

Sekvence kódující prekurzor lidské gastrické lipázy byla použita pro konstrukci binárních plasmidů pBIOC85, který obsahuje PSLGH-LGH, pBIOC87, který obsahuje PSLPH-LGH a pBIOC89, který obsahuje PSLGL-LGH, ve kterých je sekvence kódující lidskou gastrickou lipázu předcházena sekvencí, kódující její přirozený signální peptid PSLGH, signální peptid lidské pankreatické lipázy (PSLPH; Giller a kol., 1992), respektive signální peptid králičí gastrické lipázy (PSLGL; popsaná výše; evropský patent č. 92.403055.4).

kódující prekurzor lidské dvojnásobným natrávením elektroforézou na agarózovém kol., 1989), přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,δ

Sekvence, izolována gastrické lipázy pomocí

Pstl a byla

Dral, purifikací elektrovymýváním (Sambrook a gelu 0,8 %, precipitací v o ~ o c ~ u: -_~

- a ₉ j u u j c in u čistého ethanolu při teplotě - 8 0 ° C a po dobu 3 0 minut, ~ centrifugací při 12000 g po dobu 30 minut, promýváním ethanolem 70 % a sušení m. Po tom - byla klonována v mí stech- Pstl a Spěl (podrobených působení enzymu T4 DNA polymeráza (Biolabs) podle doporučení výrobce) plasmidů pBSIISK+, prodávaného společností Stratagene. Ligace byla provedena s 100 ng vektoru a 50 ng DNA fragmentů, nesoucích sekvenci, kódující prekurzor lidské gastrické ligázy, popsaných výše, v reakčním prostředí o 10 μΐ v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 r r • · (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie

Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1 983). Plasmido.vá DNA. získaných klonů, podrobených . selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením <· restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC83.

>

l*

Sekvence kódující maturovanou lidskou gastrickou lipázu byla modifikována vložením místa BamHI, které předtím neexistovalo, do devátého a desátého kodonu řízenou mutagenezí pomocí PCR s využitím dvou oligonukleotidů:

5' aaactgcaggctcgag TTG TTTGGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc

CCT GAA GTG ACT ATG 3' (obsahující místa Pstl, Xhol a BamHI)

5' AAT GGT GGT GCC CTG GGA ATG GCC AAC ATA GTG TAG

CTG C 3' (obsahující místo MscI, které jediné v plasmidu pBIOC83).

Amplifikace PCR fragmentu Pstl-MscI byla provedena v 100 μΐ reakčního prostředí, obsahujícího 10 μΐ pufru Taq DNA polymeráza x 10 (500 mM KC1, 100 mM Tris-Hcl, pH 9,0 a 1 %

Triton x 100), 6 μΐ 25 mM MgCh, 3 μΐ 10 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP a dTTP), 100 pM každého z výše popsaných dvou » oligodesoxynukleotidů, 5 ng DMA matrice (vektor pBIOC83) 2,5

U Taq DNA polymerázy (Promega) a 2 kapky vazelínového oleje.

DNA byla denaturována při teplotě 94 °C po dobu 5 minut, podrobena 30 cyklům, přičemž každý sestával z 1 minuty denaturace při teplotě 94 °C, 1 minuty hybridizace při teplotě 65 °C a 1 minuty elongace při teplotě 72 °C a potom byla elongace při teplotě 72 °C pokračována po dobu 5 minut. Tato reakce

PCR byla provedena v přístroji „DNA Thermal Cycler“ společnosti PERKIN ELMER CETUS. Olej byl eliminován extrakcí v chloroformu. Potom byly fragmenty DNA, obsažené v reakčním prostředí, precipitovány v přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH 4,8 a 2,5-objemu čistého ethanolu při teplotě -80 °C po dobu 30 minut, centrifugovány při 12000 g po dobu 30 minut, promývány v 70 % ethanolu, sušeny a natráveny dvěma restikčními enzymy Pstl a MscI. Natrávené fragmenty DNA, vzniklé z PCR, byly purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 2 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), precipitovány v přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH

4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80 °C po dobu 30 minut, centrifugovány při 12000 g po dobu 30 minut, promývány v 70 % ethanolu, sušeny a potom ligovány do plasmidové DNA vektoru pBIOC83, dvojnásobně natráveného pomocí pstl a MscI, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymývány, podrobeny precipitaci v alkoholu a sušeny. Ligace byla provedena s 100 ng vektoru a 50 ng fragmentů natrávené DNA, vzešlé z PCR amplifikace, popsané výše, v 10 μΐ reakčního prostředí v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie ETčhěracKia doli DH5a byTy transformovány (Hanahan,1983). ~

Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ·· ampicilinu, byla’ extrahována’ metodou alkalické lýzy “ ' (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Plasmidová DNA některých získaných klonů byla verifikována sekvenací s pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Vložení restrikčního místa BamHI nemodifikuje genetický kód lidské gastrické lipázy. Přirozená » ·

83- sekvence lidské gastrické lipázy GGA AGC (Gly-Ser) se totiž stane GGA TCC (Gly-Ser). Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC84.

b) Konstrukce binárního plasmidů pBIOC85, obsahujícího PSLGH-LGH.

Fragment Pstl-Xbal, nesoucí sekvenci PSLGH-LGH byl izolován dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocí Pstl a Xbal z pBIOC83, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1 989), podroben precipitaci v alkoholu a sušen. Poté byl tento fragment DNA ošetřen působením enzymu T4 DNA polymeráza (Biolabs) podle doporučení výrobce a ligován do plasmatické DNA plasmidů pBIOC82 natráveného v místě Xbal, ošetřeném podle Klenowa (Biolabs) a defosforylovaného enzymem alkalické fosfatázy (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 20 ng defosforylovaného vektoru a 200 ng DNA fragmentů BglIII-Xbal, obsahujících PSLGH-LGH, popsaných výše, v reakčním prostředí 20 μΐ v přítomnosti 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14°C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány⁵ (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 12 pg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý klon byl nazván pBIOC85. Nukleotidová sekvence rekombinantního proteinu PPS-LGC byla verifikována sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977), • ♦ * * • * • · · f ♦

- 84 • · ·

Sekvence štěpení mezi sekvencemi PSLGH a maturované lidské gastrické lipázy je Gly-Leu. Plasmidová DNA binárního vektoru pBIOC85 byla vložena přímou transformací do kmene LBA4404 Agrobacterium tumefaciens způsobem podle Holsterse a kol., (197.8). Platnost získaného klonu byla ověřena enzymatickým natrávením vložené plasmidové DNA.

c) Konstrukce binárního plasmidů pBIOC86, obsahujícího PSLPH-LGH.

Plasmid pBIOC84 byl dvojnásobně natráven pomocí Pstl a BamHI, aby byla suprimována sekvence, kódující signální peptid PSLGH a 8 prvních aminokyselin maturovaného proteinu lidské gastrické lipázy (Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly). Tato sekvence byla nahrazena sekvencí, kódující signální peptid PSLPH o 16 aminokyselinách (ATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGA), připojenou k sekvenci, kódující 8 prvních kodonů maturovaného proteinu lidské gastrické ligázy („PSLPH - 8 prvních kodonů maturované lidské gastrické lipázy“). Sekvence „PSLPH - 8 prvních kodonů maturované amplifikován pomocí

-----------PCR z matrice---------~

5' aaactgcaggctcgagaacaATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG- CTG CTG GGA GCA-GTA GCA GGA TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA tcc CCT G 3' s pomocí dvou oligodesoxynukleotidů,

5' aaactgcaggctcgagaacaATG C 3' a

5' C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3', podle protokolu PCR amplifikace, popsaného výše (viz paragraf I nahoře). Hybridizační teplota byla upravena. Po dvojnásobném ♦ · > » enzymatickém natrávení pomocí Pstl a BamHI byly fragmenty, amplifikované pomocí PCR, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 2 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), precipitovány v přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu, sodného pH

4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80 °C a po dobu 30 minut, centrifugovány při 12000 g po dobu 30 minut, promývány ethanolem 70 %, sušeny a ligovány do plasmidové DNA plasmidu pBIOC84, dvojnásobně natráveného pomocí Pstl a BamHI, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), podrobeny precipitaci v alkoholu a sušeny. Ligace byla provedena s 100 ng vektoru a 50 ng natrávených DNA fragmentů vyšlých z amplifikace PCR, popsaných výše, v reakčním prostředí o 10 μΐ, obsahujícím 1 μΐ pufru T4 DNA ligázy x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligázy (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Některé získané klony byly verifikovány sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Sekvence PSLPH a maturované lidské gastťické lipázy byly klonovány, přičemž jejich čtecí rámce byly udržovány otevřené. Místo štěpení mezi sekvencemi PSLPH a maturovanou lidskou gastrickou lipázou je Gly-Leu. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC86.

Fragment Pstl-Xbal, nesoucí sekvenci PSLPH-LGH, byl izolován z pBIOC86 dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocí Pstl a Xbal, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, • · ♦ elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), podroben precipitaci v alkoholu a sušen. Potom byl tento fragment DNA ošetřen enzymem T4 DNA polymeráza (Biolabs) podle doporučení výrobce a ligován do plasmidové DNA plasmidu pBIOC82, natráveného v místě Xbal, ošetřeném podle Klenowa a defosforylovaném enzymem alkalické fosfatázy z telecího střeva (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 20 ng defosforylovaného vektoru, popsaného výše, a 200 ng DNA fragmentů obsahujícím PSLPH-LGH, popsaných výše, v reakčním prostředí o 20 μΐ, obsahujícím 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 12 pg/ml tetracyklinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy.

Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC87. Nukleotidová sekvence fragmentu, kódujícího PSLPH-LGH byla verifikována sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977).

Plasmidová DNA binárního vektoru ρ BIO C 8 7 byla vložena přímou transformací do kmene LBA4404 Agrobacterium tumefaciens způsobem podle Holsterse a kol., (1978). Platnost získaného klonu byla- ověřena enzymatickým natrávením vložené plasmidové DNA.

d) Konstrukce binárního plasmidu pBIOC89, obsahujícího

PSLGL-LGH.

Plasmid pBIOC84 byl dvojnásobně natráven pomocí Pstl a

BamHI, aby byla suprimována sekvence, kódující signální peptid PSLGH a 8 prvních aminokyselin maturovaného proteinu lidské gastrické lipázy (Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly). Tato sekvence byla nahrazena sekvencí, kódující signální peptid PSLGL o 19 aminokyselinách (ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT), připojenou k sekvenci, kódující 8 prvních kodonů maturovaného proteinu lidské gastrické ligázy („PSLGL - 8 prvních kodonů maturované lidské gastrické lipázy“). Sekvence „PSLGL - 8 prvních kodonů maturované lidské gastrické lipázy“ byl amplifikován pomocí PCR z matrice

5' aaactgcaggctcgagaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT TTG TTT GGA AAA TTA CAT CCT GGA ttc CCT G 3' s pomocí dvou oligodesoxynukleotidů, 5' aaactgcaggctcgagaacaATG TGG 3' a

5' C AGG gga TCC AGG ATG TAA TTT TCC 3', podle protokolu PCR amplifikace, popsaného výše (viz paragraf I nahoře). Hybridizační teplota byla upravena. Po dvojnásobném enzymatickém natrávení pomocí Pstl a BamHI byly fragmenty, amplifikované pomocí -PCR, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 2 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), precipitovány v přítomnosti 1/10 objemu 3M octanu sodného pH

4,8 a 2,5 objemu čistého ethanolu při teplotě -80 °C a po dobu 30 minut, centrifugo vány při 12000 g po dobu 30 minut, promývány ethanolem 70 %, sušeny a ligovány do plasmidová DNA plasmidu pBIOC84, dvojnásobně natráveného pomocí Pstl a BamHI, purifikovány elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymývány (Sambrook a kol., 1989), podrobeny precipitaci v alkoholu a sušeny. Ligace byla provedena s 100 ng vektoru a 50 ng natrávených DNA fragmentů vyšlých z amplifikace PCR, r .·

0 0 0 0 9 0 « · » 0 · V · * · · popsaných výše, v reakčním prostředí o 10 μΐ, obsahujícím 1 μΐ pufru T4 DNA ligázy x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligázy (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1 979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Některé získané klony byly verifikovány sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Sekvence PSLGL a maturované lidské gastrické lipázy byly klonovány, přičemž jejich čtecí rámce byly udržovány otevřené. Místo štěpení mezi sekvencemi PSLGL a maturovanou lidskou gastrickou lipázou je Gly-Leu. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC88,

Fragment Pstl-Xbal, nesoucí sekvenci PSLGL-LGH, byl izolován z pBIOC88 dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocí Pstl a Xbal, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýván (Sambrook a kol., 1989), podroben precipitaci v alkoholu a sušen, enzymem T4 DNA výr o b c e a l i g o ván natráveného v místě Xbal, ošetřeném podle Klenowa a d e fo s f o ryl o v a n é m - e n z y me m a 1 k a 1 i c k é - f o s f a t á z y z t e 1 e c í h o s t ř e v a (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla provedena s 20 ng defosforylováného vektoru a 200 ng DNA fragmentů obsahujícím PSLGL-LGH, popsaných výše, v reakčním prostředí o 20 μΐ, obsahujícím 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při teplotě 14 °C po dobu 16 hodin.

Potom byl tento fragment DNA ošetřen polymeráza (Biolabs) podle doporučení dop 1 a s m i dové D N A p 1 a s m i d u p BIO C 8 2 ~ ♦ *

- 89 « 6 • · ·

Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidová DNA získaných klonů, podrobených selekci na 12 pg/ml tetracykl inu, byla extrahována metodou alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC89. Nukleotidová sekvence fragmentu, kódujícího rekombinantní protein PSLGL-LGH byla verifikována sekvenací pomocí sekvenační soupravy T7™, l

prodávané společností Pharmacia metodou didesoxynukleotidů (Sanger a kol., 1977). Plasmidová DNA binárního vektoru pBIOC89 byla vložena přímou transformací do kmene LBA4404 Agrobacterium tumefaciens způsobem podle Holsterse a kol., (1978). Platnost získaného klonu byla ověřena enzymatickým natrávením vložené plasmidové DNA.

IV. KONSTRUKCE CHIMÉRICKÝCH GENU KÓDUJÍCÍCH REKOMBINANTNÍ PROTEINY PSÍ GASTRICKÉ LIPÁZY A DOVOLUJÍCÍ EXPRESI V SEMENECH KUKUŘICE

a) konstrukce plasmidů pBIOC98 a pBIOC99, obsahujících PSLGL-LGC a dovolujících konstitutivní expresi v semenech kukuřice.

Konstitutivní exprese živočišného genu, kódujícího psí gastrickou lipázu (LGC) v semenech kukuřice, vyžaduje následující regulační sekvence:

1. jeden ze dvou promotorů, dovolujících konstitutivní expresi:

- promotor aktinu rýže, následovaný intronem aktinu rýže (pARIAR), obsažený v plasmidu pActl-F4, který popsal McElroy a

• « kol. (1991);

-konstitutivní dvojitý promotor 35S (pd35S) viru CaMV (virus mozaiky květáku). Tento promotor odpovídá duplikaci aktivační sekvence transkripce, nacházející se před prvkem TATA přirozeného promotoru 35S (Kay a kol., 1987);

2. jeden ze dvou terminátorů:

- terminační sekvence transkripce, terminátor polyA 35S, který odpovídá nekódující oblasti v 3' sekvence viru s dvouvláknovou kruhovou DNA mozaiky květáku, produkující transkript 35S (Franck a kol, 1980);

- terminační sekvence transkripce, terminátor polyA NOS, který odpovídá nekódující oblasti v 3' genu nopalin syntházy plasmidu TI Agrobacterium tumefaciens kmenu (Depicker Qa kol., 1982).

Plasmid pBIOC98, ve kterém byla sekvence, kódující PSLGLLGC umístěna pod kontrolu pAR-IAR, byla získána klonováním fragmentu BglII-Xbal, nesoucího sekvenci, kódující PSLGL-LGC v místech „Ncol a Sáli“ v pBSII-pAR-IAR-tNOS.

Fragment BglII-Xbal, nesoucí sekvenci kódující PSLGL-LGC, byl izolován z pBIOC40 (popsaného výše) dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocí BglII a Xbal, purifikován elektroforézou na agarózovém gelu 0,8 %, elektrovymýván, podroben precipitaci v alkoholu, sušen, potom ošetřen Klenowovým enzymem. Plasmid pBSII-pAR-IAR-tNOS byl dvojnásobně natráven pomocí Sáli a Ncol, purifikován, ošetřen enzymem Mung Beán Nuclease (Biolabs) a defosforylo ván enzymem telecí alkalické fosfatázy (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Ligace byla realizována s 20 ng

J* * defosforylovaného vektoru a 200 ng fragmentů DNA, obsahujících sekvenci, kódující PSLGL-LGC, popsanou výše, v reakčním prostředí o 20 μΐ v přítomnosti 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1 983). Plasmidická DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována pomocí metody alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý plasmid byl nazván pBIOC98.

Plasmid pBSII-pAR-IAR-tNOS vznikl klonováním pBSII-tNOS do míst „Eco01091, ošetřené podle Klenowa a KpnI“ fragmentu SnaBI-KpnI, nesoucího sekvence odpovídající „pAR-IAR-počítek sekvence kódující gen gus“, izolovaného z plasmidu pActl-F4. Ligace byla realizována s 100 ng vektoru a 50 ng fragmentů DNA, popsaných výše, v reakčním prostředí o 10 μΐ v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1 983). Plasmidická DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována pomocí metody alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy.

Plasmid pBSII-tNOS byl získán klonováním fragmentu SaclEcoRI, nesoucího sekvenci tNOS, izolovanou z pBI121, prodávaného společností Clontech, do defosforylovaného místa EcoRV pBSIISK+, který je prodáván společností Stratagene, dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocí Sací a EcoRV, » · 9 O » » « » • · · · · · • · · • · · · ·

• «

vystaven purifikaci elektroforézou na agarózovém gelu 2 % a ošetřen enzymem T4 DNA polymeráza. Ligace byla realizována s 20 ng defosforylovaného vektoru a 200 ng fragmentů DNA, obsahujících sekvenci tNOS, popsaných výše, v reakčním prostředí o 20 μΐ v přítomnosti 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ 50 % polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5 a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidická DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována pomocí metody alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy.

Plasmid pBIOC99, ve kterém je sekvence, kódující PSLGL-LGC pod kontrolou pd35S, byl získán klonováním fragmentu KpnlBamHI, nesoucího sekvenci, odpovídající „pd35S-PSLGL-LGC“, izolovanou z pBIOC41, popsaného výše, do míst „KpnI a BamHI“ plasmidů pBSII-t35S. Ligace byla realizována s 100 ng vektoru a 50 ng fragmentů DNA, popsaných výše, v reakčním prostředí o 10 μΐ v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při 14 °C po dobu 16 hodin. . Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1 983). Plasmidická DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována pomocí metody alkalické íýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy.

Plasmid pBSII-t35S byl získán klonováním fragmentu SmalEcoRV, nesoucího sekvenci t35S, izolovanou z pJIT163 (popsaného výše), do defosforylovaného místa Spěl, ošetřeného ♦ r

- 93 - ; ;

r - - · - « 99» · podle Klenowa, plasmidu pBSIISK, prodávaného společností Stratagene, dvojnásobným enzymatickým natrávením pomocí Smál a EcoRV a podroben purifikaci elektroforézou na gelu agarózy 2 %.. Ligace byla realizována s 20 ng vektoru a 200 ng fragmentů DNA, obsahujících sekvenci t35S, popsaných výše, v reakčním prostředí o 20 μΐ v přítomnosti 2 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham), 2 μΐ polyethylenglykolu 8000 a 5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham) při 14 °C po dobu 16 hodin. Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5a byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidická DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována pomocí metody alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy.

b) Konstrukce plasmidů pBIOClOO a pBIOClOl, obsahujících PSLGL-LGC, respektive PSLGL-LGC-KDEL a dovolujících expresi v albumenu semen kukuřice.

Exprese živočišného genu, kódujícího psí gastrickou lipázu (LGC), v albumenu semen kukuřice vyžaduje následující regulační sekvence:

1. promotor genu yzein kukuřice (pyzein), obsaženého v plasmidu py63, který popsal Reina a kol., 1990. Plasmid py63 pochází z klonování pyzeinu do míst HindlII a Xbal plasmidu pUC18, který obsahuje mezi místy HindlII a EcoRI kazetu exprese „p35S-gustNOS“ pBI221, prodávaného společností Clontech. Dovoluje expresi v albumenu semen kukuřice.

2. terminální sekvence transkripce, terminátor polyA NOS, který odpovídá nekódující oblasti v 3’ genu nopalin syntháza plasmidu • · • ♦ ♦

Ti Agrobacterium tumefaciens kmen (Depicker a kol, 1982).

Plasmid pBIOClOO, ve kterém je sekvence kódující PSLGL-LGC umístěna pod kontrolu pyzeinu, byl získán klonováním fragmentu „Xbal, ošetřený podle Klenowa - BglII“, izolovaného z pBIOC40 (popsaného výše), do míst „Sací, ošetřené enzymem T4DNA polymeráza a BamHI“, plasmidu ργ63. Ligace byla realizována s 100 ng vektoru a 50 ng fragmentů DNA, popsaných výše, v reakčním prostředí o 10 μΐ v přítomnosti 1 μΐ pufru T4 DNA ligáza x 10 (Amersham) a 2,5 U enzymu T4 DNA ligáza (Amersham.) při 14 °C po dobu 16 hodin. . Předběžně připravené bakterie Escherichia coli DH5cc byly transformovány (Hanahan, 1983). Plasmidická DNA získaných klonů, podrobených selekci na 50 pg/ml ampicilinu, byla extrahována pomocí metody alkalické lýzy (Birnboim a Doly, 1979) a analyzována enzymatickým natrávením restrikčními enzymy. Vzniklý klon byl nazván pBIOClOO.

Plasmid pBIOClOl vznikl substitucí fragmentu NcolI-AflII v pBIOClOO fragmentem Ncol-AflII, nesoucím sekvenci, kódující tetrapeptid KDEL (dovolující směrování v endoplasmatickém retikulu), umístěný před stop-kodon, získaný PCR amplifikací způsobem, popsaným výše. Dva oligonukleotidy, použité v této reakci byly:

5' AAT CAC TTG GAC TTT ATC TGG Gcc atg gAT GCC 3' (jediné místo Ncol) a

5' AAT ctt aag AAA CTT TAT TGC CAA ATG TTT GAA CGA TCG GGG AAA TTC GAC GCG TCT AGA ACT ATA GCT CAT CCT TAT TAT CTG TTC CCA TCA TGG 3' (sekvence, kódující KDEL a jediné místo AfIII). Teplota hybridizace byla 70 °C. Klonování bylo prováděno výše popsaným způsobem.

V. PŘÍKLAD ZÍSKÁNÍ TRANSGENICKÝCH ROSTLIN ŘEPKY

Semena jarní řepky \Brassica napus, kultivar WESTAR nebo odrůda Limagrain) jsou dezinfikována po dobu 40 minut v roztoku Domestos 15 %. Po 4 promývání ve sterilní vodě jsou semena ponechána klíčit v množství 20 semen v nádobce o průměru 7 cm a výšce 10 cm v minerálním prostředí Murashige a Skoog (Sigma M 5519) s 30 g/1 sacharózy a solidifikované agarovým gelem 6 g/1. Tyto nádobky jsou umístěny do kultivační komory při teplotě 26 °C s fotoperiodou 16h/8h a s intenzitou

1 osvětlení řádu 80 mE m' S’ .

Po 5 dnech klíčení jsou dělohy sterilně odebrány odlomením každého řapíku zhruba 1 mm pod dělohou.

Paralelně byla realizována prekultura Agrobacterium tumefaciens, kmen LBA4404, obsahující plasmid pBIOC29 (nebo pBIOC25), to jest plasmid pGAZE, do kterého byla vložena sekvence, kódující směrovací signál PPS (nebo PS) pod kontrolou promotoru pCRU (nebo pd35S), v erlenmeyerove baňce 50 ml po dobu 36 hodin při 28°C v 10 ml bakteriálního prostředí 2YT (Sambrook a kol., 1989), doplněném antibiotiky, užitečnými pro selekci použitého kmene.

Tato prekultura sloužila na naočkování na 1 % nové bakteriální kultury, připravené za stejných podmínek. Po 14 hodinách kultivace byla centrifugována po dobu 15 minut při 3000 g a bakterie byly vyjmuty v ekvivalentním objemu tekutého prostředí pro tvorbu zárodků. Tato suspenze byla distribuována do petriho misek o průměru 5 cm po 5 ml na jednu misku.

9

Zvolený konec řapíku byl ponořen na několik sekund do takto připraveného roztoku agrobakterií a potom byl řapík ponořen několik milimetrů do regeneračního prostředí. Toto prostředí o stejném základním složení jako prostředí pro tvorbu zárodků a obsahující navíc 4 mg/1 benzyl-amino-purinu (BAP), fytohormonu, který podporuje neoformaci výhonků. Deset explantů (děloha s řapíkem) bylo umístěno na kultivaci do petriho misky o průměru 9 cm (Greiner, reference 664102).

Po dvou dnech kultivace ve stejných podmínkách jako při klíčení, jsou explanty přepíchány do misek phytatray (Sigma, reference P1 552), obsahujících předcházející prostředí, doplněné selektivním činidlem: 45 mg/1 siřičitanu kanamycinu (Sigma, reference K4000) a bakteriostatikem: směsí 1/6 (hmotnostně) draselné soli kyseliny klavulanové a 5/6 sodné soli amoxicilinu (injektovatelný Augmentin) v množství 600 mg/1.

Ještě dvakrát jsou explanty v intervalech 3 týdny sterilně přepíchány do nového prostředí a za stejných podmínek.

Zelené výhonky, které se objevily ke konci druhého nebo třetího období, byly odděleny od explantů a kultivovány odděleně v průhledných nádobách o průměru 5 cm a výšce 10 cm, které obsahovaly stejné prostředí jako předtím, ale zbavené BÁP. Po 3 týdnech kultivace byl stonek transformovaného výhonku oddělen a výhonek byl přepíchán do nádoby s čerstvým prostředím. Po třech nebo čtyřech týdnech byly kořínky dostatečně vyvinuty k tomu, aby rostlina mohla být umístěna do fytotronu. Výhonky, které nebyly zelené nebo zakořeněné byly odstraněny. Tyto rostliny byly potom přeneseny do květináčů o straně 7 cm,

* « » naplněných zemí (norma NF U44551: 40 % hnědá rašelina, 30 % prosátý humus a 30 % písek), nasycené vodou. Po dvou týdnech aklimatizace ve fytotronu (teplota 21 °C, fotoperioda 16h/8H a 84 % relativní vlhkost) byly rostlinky přesazeny do nádob o průměru 12 cm, naplněných stejnou zemí, obohacenou o hnojivo (Osmocote, v množství 4 g/1 země) a potom přeneseny do skleníku (třída S2), regulovaného na 18 °C s denním ·. zavlažováním vodou po 2 minuty.

Když se objevily květy, byly umístěny do sáčků (Crispac, reference SM 570y 300mm x 700 mm), aby se zabránilo kříženému oplodnění.

Když šešule dozrály, byly sklizeny, usušeny a vymláceny. Získaná semena sloužila k určení biochemického účinku. Selekce transgenického potomstva se prováděla klíčením v prostředí, obsahujícím síran kanamycinu v množství 100 až 150 mg/1 (podle genotypu). Operační podmínky byly stejné jako podmínky popsané výše s tím, že klíčení probíhalo v skleněné trubici s jediným semenem v trubici. Pouze rostlinky, které vyvinuly sekundární kořeny v průběhu prvních třech týdnů byly aklimatizovány ve fytotronu před jejich umístěním do skleníku.

«>

Vir^PŘÍKLÁD ZÍSKÁNÍ TRANSGENICKÝCH LILKOVITÝČH

ROSTLIN

a) Získání transgenických rostlin tabáku

Rostliny tabáku, použité pro pokus s transformací (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC a PBD6) byly kultivovány in vitro v základním prostředí Murashige a Skoog (1962), ke kterému byly přidány vitaminy Gamborg a kol., (1968, Sigma, reference M0404), sacharóza 20 g/1 a agar (Měrek) 8 g/1. pH prostředí bylo upraveno na 5,8 roztokem uhličitanu draselného před autoklávováním při 120 °C po dobu 20 minut. Rostlinky tabáku byly přepíchány každých 30 dní na tomto množivém prostředí MS20.

Všechny kultury in vitro byly realizovány v klimatizovaném prostředí za následujících podmínek:

- intenzita osvětlení 30 mE.m’².S‘^l, fotoperioda 16 hodin;

- termoperioda 26°C ve dne, 24 °C v noci.

Použitá transformační technika byla odvozena od techniky, kterou popsal Horsch a kol. (1985).

Prekultura Agrobacterium tumefaciens, kmen LBA4404, obsahující plasmidy pBIOC29 nebo pBIOC26 nebo pBIOC25 byla realizována po 48 hodin při teplotě 28 °C za míchání v prostředí LB (Sambrook a kol., 1989), do kterého byla přidána odpovídající antibiotika (rifampicin a tetracyklin). Prekultura byla potom zředěna na padesátinu ve stejném prostředí a kultivována ve stejných podmínkách. Po jedné noci byla kultura centrifugována (10 minut, 3000 g), bakterie byly vyjmuty v ekvivalentním objemu tekutého prostředí MS30 (30 g/1 sacharózy) a tato suspenze byla zředěna na jednu desetinu.

:Explanty zhruba 1 sm² byly odříznuty z listů rostlinek popsaných výše. Potom byly umístěny do kontaktu s bakteriální suspensí po dobu 1 hodiny a potom rychle sušeny na filtračním papíru a umístěny do prostředí kokultury (MS30, pevné).

• ♦

- 99 • ♦ * e · e · • ♦ • · · e

Po dvou dnech byly explanty přeneseny do Petriho misek v regeneračním prostředí MS30, obsahujícím selekční činidlo, kanamycin (200 mg/L), bakteriostatikum, augmentin (400 mg/1) a hormony, potřebné pro indukci výhonků (BAP, 1 mg/1 a ANA, 0,1 mg/L). Přepíchání explantů bylo provedeno do stejného prostředí po 2 týdnech kultivace. Po dalších 2 týdnech byly výhonky přepíchány do Petriho misek na prostředí složené z prostředí MS20, ke kterému byl přidán kanamycin a augmentin. Po 15 dnech byly výhonky přepíchány na polovinu. Zakořenění trvá zhruba 20 dní, po něž mohou být rostliny klonovány nebo přeneseny do skleníku.

b) Získání transgenických rostlin rajského jablka.

Semena rajského jablka kultivar UC82B byly sterilizovány v Domestos 10 % po 15 minut a promývány třikrát ve sterilní vodě. Poslední promývání bylo prováděno po 10 minut za míchání.

Takto sterilizovaná semena byla umístěna ke klíčení do prostředí MSSV/2 (základní prostředí Murashige a Skoog (1962, Sigma, reference M6899)/2, ke kterému byly přidány vitaminy, Nitsch (Tomas a Pratt, 1981), sacharóza 30 g/1, agar (Měrek) 8 g/1, pH 5,9, po 7 nebo 8 dní v klimatizované komoře (světelná intenzita 30 mE.m^.s'¹, fotoperioda 16h/8h, 26 °C).

Použitá technika transformace byla odvozeny od techniky Fillatti a kol., (1987).

Prekultura Agrobacterium tumefaciens, kmen LBA4404, obsahující plasmidy pBIOC25 nebo pBIOC26 byla realizována po » · hodin při teplotě 28 °C za míchání v prostředí LB, do kterého byla přidána odpovídající antibiotika (rifampicin a tetracyklin). Prekultura byla potom zředěna na padesátinu ve stejném prostředí a kultivována ve stejných podmínkách po jednu noc. Bylo měřeno DO při 600nm a kultura byla centrifugo vána (10 minut, 3000 g) a vyjmuta v tekutém prostředí KCMS (popsaném v publikaci Fillatti a kol., 1 987), aby se dosáhlo DO při 600 nm rovné 0,8.

Zlepšení této techniky bylo provedeno v některých etapách protokolu Fillati a kol., (1987).

Prekultura explantů a kokultura byly realizovány stejně, jako je to popsánu v Fillati a kol., (1987) s výjimkou, že do prostředí KCMS bylo doplněno acetosyringonem (200 mM).

Promývací prostředí 2Z bylo změněno přidáním cefotaximu 500 mg/1 namísto karbenicilinu. Prostředí pro vývin, které bylo použito, se skládalo ze základního prostředí Murashige a Skoog (Sigma MS6899), ke kterému byly přidány vitaminy Nitsch, sacharóza 20 g/1, kanamycin 50 mg/1, augmentin 200 mg/1, ANA 1 mg/1 a zeatin 0,5 mg/1.

VII. ZÍSKÁNÍ TRANSGENICKÝCH ROSTLIN KUKUŘICE

a) Kalus kukuřice, jeho získání a použití jako cíle genetické transformace.

Genetická transformace kukuřice, bez ohledu na to, která metoda je použita (elektroporace, Agr ob acterium, mikrovlákna, částicové dělo), vyžaduje obecně použití buněk, nerozdělených v rychlých děleních, které si ponechávají schopnost regenerace celých

101 r

rostlin. Tento typ buněk vytváří dělivý embryogenní kalus (řečený typu II) kukuřice.

Tento kalus, získaný z nezralých zárodků genotypu Hl II nebo (A188 x B73) podle způsobu a v prostředích, popsaných Armstrongem (Malze Handbook; (1984) M. Freeling, V. Walbot Eds.; str. 665-671). Takto získaný kalus byl pomnožen a uchováván postupnými přepí cháváními každých patnáct dní v inciačním prostředí.

Rostlinky byly potom regenerovány z kalu kukuřice, modifikujíce hormonální a osmotickou rovnováhu buněk metodou, kterou popsal Vain a kol. (Planí Cell Tissue and Organ Culture (1989, 18:143-151). Tyto rostliny byly potom aklimatizovány ve skleníku, kde mohly být kříženy nebo samooplodněny.

b) Použití částicového děla pro genetickou transformaci kukuřice.

Předešlý paragraf popsal způsob získání a regenerace buněčných linií, nutných k transformaci. Nyní zde bude popsána metoda, vedoucí ke stabilní integraci modifikovaných genů do genomu rostliny. Tato metoda spočívá v použití částicového děla, identického tomu, které popsal J. Finer (Plant Cell Report (1992) 1 1: 323-328). Buněčné cíle jsou fragmenty, které obsahuje kalus, popsané v paragrafu 1. Tyto fragmenty o povrchu od 10 do 20 mm² byly 4 hodiny před bombardováním uloženy, v počtu 16 fragmentů na misku, do středu petriho misky, obsahující kultivační prostředí, identické iniciačnímu prostředí, do kterého bylo přidáno 0,2 M mannitolu a 0,2 M sorbitolu. Plasmidy, nesoucí geny, které mají být vloženy, byly purifikovány na « · koloně Qiagen ®, postupujíce podle instrukcí výrobce. Potom byly precipitovány na částice wolframu (M10), postupujíce při tom podle protokolu, který popsal Klein (Nátuře (1987) 327:7073). Takto pokryté částice byly vystřelovány na buněčné cíle pomocí částicového děla a podle protokolu, který popsal J. Finer (Plant Cell Report (1992) 1 1:323-328).

Misky, obsahující kalus, bombardované tímto způsobem, byly potom utěsněny pomocí Scellofrais ® a pak kultivovány ve tmě při 2 7 °C. První přepíchání bylo provedeno po 24 hodinách, potom každých patnáct dní po 3 měsíce na identické prostředí, ke kterému bylo přidáno selekční činidlo, jehož povaha a koncentrace může záviset na použitém genu (viz paragraf 3). Použitelná selekční činidla jsou obecně složena z některých herbicidů (Basta ®, Round up ®) nebo některých antibiotik (Hygromycin, Kanamycin a podobně).

Po 3 měsících a někdy i dříve se získá kalus, jehož růst není inhibován selekčním činidlem, obvykle a majoritně složený z buněk, které vznikly z dělení buňky, která do své genové výbavy integrovala jednu nebo více kopií selektovaného genu. Frekvence —získání takového kalu—je zhruba 0,8____kalus____na jednu^ bombardovanou misku.

Tento kalus byl identifikován, oddělen, amplifikován a potom kultivován tak, aby vznikly rostlinky (viz paragraf a). Aby se vyloučila veškerá interference s netransformovanými buňkami, byly všechny operace prováděny v kultivačním prostředí, obsahujícím selekční činidlo.

Takto regenerované rostlinky byly aklimatizovány a potom

103 kultivovány ve skleníku nebo , mohly být kříženy nebo samooplodněny.

VIII. ANALÝZA EXPRESE PSÍ GASTRICKÉ LIPÁZY V TRANSGENOVÝCH ROSTLINÁCH TABÁKU

a) Protokol

Protokol extrakce lipázy z listů tabáku, odebraných z rostlin ve skleníku je následující: 1 g listů (čerstvá hmotnost) byl rozdrcen v tekutém dusíku a potom při 4 °C v 5 ml pufru Tris-Hcl 25 mM pH 7,5, doplněném EDTA lmM a merkaptoethanolem 10 mM (pufr A) nebo v pufru glycin-HCl 25 mM pH 3, doplněném EDTA lmM, β-merkaptoethanolu 10 mM, Tritonem X-100 0,2 % a NaCl 250 mM (pufr B). Celková drť byla okamžitě centrifugována při 4 °C po dobu 15 minut při 10000 g.

V případě semen tabáku byla extrakce prováděna v pufru B v množství 0,1 g semen na 4 ml pufru.

cÚčinek lipázy byl určen pomocí pH-STATu titrimetrickou metodou Gargouriho a kol., (1986), ve které použitý substrát byl tributyrid. Emulze tributyridu (4 ml na 30 ml emulze) byla realizována vířením v přítomnosti solí (1,04 g/1) hovězího albuminu (0,1 g/1) a NaCl (9 g/1). Určování spočívalo v neutralizaci uvolňované kyseliny máselné, uvolňované pod působením lipázy roztokem hydroxidu sodného při pH o hodnotě

5,5 a při teplotě 37 °C. Jednotka lipázy odpovídá množství r · • ·

- 104 enzymu, který vyvolá uvolnění jednoho mikromolu mastných kyselin za 1 minutu při 37 °C za podmínek optimálního pH (5,5). Přirozená (purifiko váná) psí gastrická lipáza má specifickou aktivitu 570 jednotek/mg proteinu.

Účinek lipázy může být měřen pro celkovou drť, sedlinu nebo supernatant centrifugace.

Pro supernatant centrifugace (pufr A) je dávkování celkových rozpustných proteinů realizováno metodou podle Bradforda (1976).

Sendvičový test ELISA (Carriěre a kol., 1993) byl také proveden na supernatant centrifugace s dvěma populacemi polyklonálních protilátek proti přirozené psí gastrické lipáze. První populace zahrnovala protilátky, reagující s lidskou gastrickou lipázou a byla purifikována afinitou z úplného antiséra na lidskou gastrickou lipázu, naočkovaného na koloně Affigel 10 (Aoubala a kol., 1993). Tyto protilátky jsou používány pro pokrytí destiček ELISA při koncentraci 1 pg/ml. Druhá populace zahrnuje protilátky, které neznají lidskou lipázu. Jsou později ------------purifikovány-na koloně Sépharose, - vázané na protein - A a potom______________ vázané na biotin. Fixace protilátek je dvojice streptavidin/peroxidáza, _jehož enzymatický účinek je prokázán prostřednictvím substrátu o-fenylendiaminu. Získané výsledky mají kvalitativní hodnotu a jsou zaznamenány pomocí symbolů + a - .

Výtěžek extrakce může být zlepšen přidáním detergentu typu

CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio-l-propan sulfonan) (SIGMA) do extrakčního pufru. V tomto případě se r 9 r r ·

• » «

- 105 totiž výtěžky extrakce v supernatantu zvýší zhruba o 100 % (viz tabulka 1).

Tabulka 1

Účinek lipázy (U/gPF) v extraktu, získaném ze 4 rostlin tabáku, vzniklého genetickou transformací s pBIOC25, v přítomnosti CHAPS 1 %.

Rostlin	NaCl 0,2 M/ EDTA 1 mM pH 3,0	NaCl 0,2 M/ EDTA 1 mM pH 3,0 + CHAPS 1%
1	80	112
2	40	104
3	43	109
4	54	92

b) Exprese rostlinných signálních peptidů; dávky v listech a semenech transformovaného tabáku s pBIOC25 a pBIOC26; test ELISA.

Získané výsledky pro 98 rostlin TO genotypu Xanthi’(stádium 15 až 20 listů) jsou podány v tabulce 2. Všechny dávky byly realizovány v drti listů a semen před centrifugací. Pro každý konstrukt vykazoval měřený účinek velkou variabilitu v závislosti na transformantu. Zhruba 20 % rostlin nemělo žádný účinek nebo účinek, který byl příliš slabý, aby mohl být odhalen. Střední účinky a maximální účinky jsou podány v tabulce 2.

* · · » ·

106

Množství úplných proteinů jsou podobná pro 3 konstrukty se střední hodnotou 7 až 8 mg/g čerstvé hmotnosti v listech a 34, 3 1 a 38 mg/g čerstvé hmotnosti v semenech.

Střední účinek lipázy v listech transformovaných konstruktem pBIOC26 byl 34 U na gram čerstvé hmotnosti, to jest 0,8 % exprese vzhledem k úplným proteinům. V semenech byl střední účinek 36 U na gram čerstvé hmotnosti, to jest 0,2 %. Maximální * účinek, dosažený u jednoho z transfórmantů byl 146 U na gram * čerstvé hmotnosti (listy, 2,5 % exprese) a 148 U na gram čerstvé hmotnosti (semena, 0,7 % exprese).

Enzymatické účinky, analyzované u rostlin, transformovaných pomocí konstruktu pBIOC25 jsou podobné. Střední účinek lipázy byl 34 U na gram čerstvé hmotnosti (0,8 % exprese) a maximální účinek 134 U na gram čerstvé hmotnosti (3 % úplných proteinů).

V semenech byl střední účinek 42 U na gram čerstvé hmotnosti (0,3%) a maximální účinek 159 U na gram čerstvé (1 %).

Pro rostliny transformované konstruktem pBIOC29 nebylá pozorována žádná aktivita v listech (promotor specifický na

---------semena)— V semenech—byl střední účinek 12—U— na—gram čerstvé -----------------------hmotnosti (0,1 % exprese) a maximální účinek 137 U na gram čerstvé hmotnosti (0,7..%). ..... ....... ......... .. . _ ... ....... ....

Exprese v listech a semenech pro jednu transformační událost jsou obecně dobře korelovány.

Výsledky testů ELISA souhlasí obecně také s výsledky určování enzymatického účinku, to jest rostlina vykazující účinek lipázy dává pozitivní výsledek v testu ELISA.

• ·

Ρ ♦ *

- 107

Výsledky získané později se stejnými rostlinami ukazují, že účinek lipázy je náchylný ke změnám v průběhu vývinu rostliny. Tak rostlina, jejíž exprese vzhledem k úplným proteinům byla 3 % ve stadiu 12 až 15 listů dávala expresi 6 % při pozdějším měření (starší rostlina po květu).

TABULKA 2: EXPRESE LIPÁZY V LISTECH A SEMENECH TABÁKU XANTHI.

	KONSTRUKT	ORGÁN	ÚPLNÝCH PROTEINU mg/g PF min-max (střed)	ÚČINEK LIPÁZY
U/g PF min-max (střed)	Exprese (% úplných proteinů) min-max (střed)
		Listy	3-15	0-145.6	0-2,5
		(n=34)	(7)	(34,4)	(0,8)
	pBIOC26
		Semena	24-43	0-147,6	0-0,7
		(n=34)	(34)	(36,3)	(0,2)
r		Listy -	3-18 +	- 0-133,5	0-3 -
ě*		(n=35)	(8)	(34)	(0-8)
	pBIOC25
		Semena	17-35	0-158,5	0-1
		(n=35)	(31)	(41,9)	(0,3)
	pBIOC29	Semena	29-55	0-137,4	0-0,7
		(n=34)	(38)	(11,8)	(OJ)

- 108 PF - čerstvá hmotnost (poids frais);

min - hodnota, získaná pro nejméně exprimující transformační událost;

max - hodnota, získaná pro nejvíce exprimující transformační událost;

n - počet analyzovaných transformačních událostí.

c) Exprese se signálním peptidem králičí gastrické lipázy; zkoumání účinku lipázy v listech tabáku.

Výsledky získané s 44 rostlinami TO genotypů Xanthi a pBD6 (stádium 15 až 20 listů) jsou následující:

Měření byly všechna prováděna v drti z listů před centrifugací. Analyzované účinky vykazovaly velkou variabilitu v závislosti na transformantu. Zhruba 20 % rostlin nemělo žádný účinek nebo účinek příliš slabý k tomu, aby byl zjištěn. Střední účinek lipá.zy v transformovaných listech s konstruktem pBIOC41 byl 38 U na gram čerstvé hmotnosti pro genotyp Xanthi a 48 U na gram —čerstvé hmotno s t i—pro genotyp P B D 6. Maxi m á 1 n í účinky byly 152,----------------------respektive 226 U na gram čerstvé hmotnosti.

IX. ANALÝZA EXPRESE PSÍ GASTRICKÉ LIPÁZY V TRANSGENOVÝCH ROSTLINÁCH RAJSKÉHO JABLKA.

a) Protokol

Protokol extrakce lipázy z listů a plodů rajského jablka je

109 podobný protokolu, který byl uveden u listů tabáku, s výjimkou, že lg čerstvého materiálu je vyjmut v 4 ml pufru B. Účinek lipázy je určen způsobem, popsaným u listů tabáku.

b) Měření dávky u plodů rajského jablka.

<!»

Byly analyzovány plody třiceti primárních transformantů.

I>

*»

Účinek lipázy, měřený u rajských jablek se měnil v závislosti na plodu u téhož transformantů. Byl v průměru 5 U na gram čerstvé hmotnosti pro zralé plody a 35 5 U na gram čerstvé hmotnosti pro zelené plody, nezávisle na testovaném konstruktu (pBIOC25 nebo pBIOC26).

Stojí za povšimnutí, že v průběhu zrání plodu účinek klesá. Například pro daný primární transformant byl účinek lipázy 132 5 U na gram čerstvé hmotnosti pro zelený plod o průměru 10 mm, 44 5 U na gram čerstvé hmotnosti pro červeno-zelený plod o průměru 33 mm a 36 5 U na gram čerstvé hmotnosti pro červený plod o průměru 45 mm.

X. IMUNODETEKCE TYPU „WESTERN“ REKOMBINANTNÍ PSÍ GASTRICKÉ LIPÁZY

a) Psí gastrická lipáza, exprimované v listech a semenech transgenického tabáku a řepky.

a.l) Exprese s rostlinnými signálními peptidy; imunodetekce v listech a semenech tabáku a řepky transformovaných pomocí pBIOC25, pBIOC26 a pBIOC29.

• · • 9

9 · ♦ •

· ,» 9

9 9

- 110 » • 99

Pokusy s imunodetekcí typu „western“ (přenosy „western“ „western-blots“) (Renart a Sandovbal, 1 984) s psí gastrickou lipázou byly prováděny na proteinech, listů tabáku a semen tabáku a řepky, extrahovaných pufry A a B (viz extrakění protokol popsaný výše). Pro provedení těchto pokusů byly extrahované ₄ proteiny (30 pg úplných proteinů na vzorek) nejprve separovány na polyakrylamidovém gelu, denaturujícím na 12,5 % technikou, * kterou popsal Laemmli U.K. (1970) a potom přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Polyklonální protilátky proti psí lipáze, získané u morčete, byly používány jako sonda a prokazování bylo prováděno prostřednictvím protilátky anti-IgG morčete, značkované alkalickou fosfatázou.

Srovnávací protein byla přírodní psí gastrická lipáza (L.C. obr.6), která migruje ve formě jediného pásu o zdánlivé molekulové hmotnosti zhruba 50 kDa. Migrace psí gastrické lipázy je mírně zpožděna v přítomnosti extraktu z listů netransformovaného tabáku (obr. 6, LC + T).

Žádný pás nebyl detekován v proteinových extraktech listů a

---s e m e η n e t r a n s f o r m o v a n é h o -t a b á k u a ř e-p k yL i p á z a p r o d ukovaná _v------------------listech tabáku se objevuje ve formě 2 pásů. Kvantitativně

.. významnější pás má zdánlivou molekulovou hmotnost zhruba .37. . .

kDa a odpovídá výše uvedenému polypeptidu (Δ54). Minoritní pás má zdánlivou molekulovou hmotnost zhruba 49 kDa a odpovídá polypeptidu (Δ4) uvedenému výše (obr. 6, F). V proteinových extraktech semen je viditelný pouze pás o nižší molekulové hmotnosti (obr. 6, GT a GC).

a.2) Exprese se signálními peptidy králičí gastrické lipázy;

* · e ♦ 9 *

- 111 -

imunodetekce v listech a semenech tabáku, transformovaného pomocí pBIOC41

Přenosy western (Renart a Sandoval, 1984) byly provedeny s proteiny listů a semen transformovaného tabáku, extrahovanými v pufru B (viz extrakční protokol, uvedený výše). Extrahované proteiny byly nejprve separovány na denaturuj ícím polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) technikou, kterou popsal Laemmli (1970) a potom přeneseny na nitrocelulózo vou membránu. Polyklonální protilátka proti psí lipáze, získaná u morčete, byla používána jako sonda a prokazování bylo prováděno pomocí protilátky proti morčeti, označené alkalickou fosfatázou.

Příklady přenosů western u listů tabáku jsou znázorněny na obr. 7. Srovnávací protein je psí gastrická lipáza, která migruje ve formě jediného pásu o zdánlivé molekulové hmotnosti zhruba 50 kDa. Žádný pás nebyl detekován u proteinových extraktů z listů netransformovaného tabáku (T), Lipáza, produkovaná v extraktu listů, se presentuje ve formě jednoho majoritního pásu o zdánlivé molekulové hmotnosti zhruba 49 kDa a odpovídá výše uvedenému polypeptidu (Δ4).

V semenech tabáku, transformovaného konstruktem pBIOC41, se rekombinantní lipáza presentuje ve stejné formě v listech.

b) Psí gastrická lipáza v proteinovém extraktu listů transformovaného tabáku: pokus s deglykosylací.

Protokol extrakce proteinů pro pokus s deglykosylací je následující: 0,5 g listů (čerstvá hmotnost) bylo rozdrceno v

- 112 * Λ 0

tekutém dusíku a potom při teplotě 4 °C v 1 ml denaturačního pufru (fosforečnanový pufr 100 mM pH 7,5, doplněný 1 % βmerkaptoethanolem, 25 mM EDTA a 1 % SDS). Drť byla centrifugována při teplotě _4 °C po dobu.15 minut při 10000 g. Supernatant byl inkubován po dobu 5 minut při teplotě 100 °C, aby došlo k denaturaci proteinů, potom centrifugo ván po dobu 2 minut při 10000 g. Supernatant byl potom zředěn na jednu desetinu v deglykosylačním pufru (fosforečnanový pufr 100 mM pH 7,5, doplněný 1 % β-merkaptoethanolem, 25 mM EDTA, 1 % SDS a 1 % oktylglukosidem). Do supernatantu je přidán enzym (N-glykosidáza F, PNGáza Boehringer) v množství 1 U na 100 μΐ supernatantu. Pro každý vzorek je vytvořen srovnávací vzorek bez enzymu. Deglykosylace srovnávacího proteinu (psí nebo králičí gastrická lipáza) se provádí za stejných podmínek. Různé proteinové vzorky jsou inkubovány při teplotě okolí po dobu 8 hodin. Proteiny jsou potom separovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a přeneseny na nitrocelulózo vou membránu způsobem, popsaným v předcházejícím paragrafu.

Z výsledků „ western-blots“ vyplývá, že gastrická lipáza, používaná jako srovnávací vzorek, má zdánlivou molekulovou hmotnost—zhruba 50—kDa.~ Po—de gly kosy láci—jej í—zdánlivá - -------------molekulová hmotnost není větší než zhruba 43 kDa.

Lipáza produkovaná v listech tabáku se po inkubaci bez PNGázy za podmínek popsaných výše presentuje ve formě 3 pásů o zdánlivých molekulových hmotnostech 49 kDa (polypeptid (Δ4)), 37 kDa (polypeptid (Δ54)) a 28 kDa. Pás o molekulové hmotnosti 28 kDa je bezpochyby výsledkem proteolýzy, která probíhá během inkubace po dobu 8 hodin při teplotě okolí. Po deglykosylaci se molekulové hmotnosti 3 pásů sníží o zhruba 1 až 2 kDa, což

I « 4 · » · ř *

113 dokazuje, že proteiny, produkované v listech tabáku jsou glykosylované.

c) Psí gastrická lipáza exprimovaná v listech a plodech transgenického rajského jablka.

Imunodetekční pokusy typu „western“ s psí gastrickou lipázou byly provedeny pro proteiny z listů a plodů rajského jablka, extrahované pufrem B (viz extrakční protokol, popsaný výše). Pro provedení těchto pokusů byly extrahované proteiny (15 pg a 6 pg úplných rozpustných proteinů pro listy, respektive plody) separovány na denaturujícím polyakrylamidovém gelu, jak bylo popsáno v paragrafu X.a.

Srovnávací protein byla přírodní gastrická lipáza (stopa 4, obr. 8), která migruje ve formě jediného pásu o zdánlivé molekulové hmotnosti zhruba 50 kDa.

Žádný pás nebyl detekován u proteinových extraktů listů a plodů netransformovaných rajských jablek.

Lipáza produkovaná v listech a plodech rajského jablka se presentuje -ve formě 2 pásů,-bez= ohledu na použitý konstrukt (pBIOC25 nebo pBIOC26). Kvantitativně významnější pás má zdánlivou molekulovou hmotnost zhruba 37 kDa a odpovídá výše f uvedenému polypeptidu (Δ54). Minoritní pás má zdánlivou molekulovou hmotnost zhruba 49 kDa a odpovídá výše uvedenému polypeptidu (Δ4) (obr. 8).

XI. PURIFIKACE PSÍ GASTRICKÉ LIPÁZY Z ROSTLIN.

»999

a) Purifikace psí gastrické lipázy z listů tabáku.

Účinek psí gastrické lipázy, produkované v listech tabáku byl určen titrometrickou metodou, nastavené pH bylo rovno 5,5 a teplota 37 °C, používal se přístroj pH-stat (Mettler-ToledoDL25) a tributyrid jako substrát: 1 ml tributyridu bylo _g emulzifikováno v 29 ml vodného roztoku NaCl 0,15 M za víření.

Určování bylo prováděno neutralizací kyseliny máselné, * uvolňované působením lipázy, přidáním hydroxidu sodného 0,02

N, zatímco emulze byla udržována pod intenzívním mechanickým mícháním. Jedna jednotka lipázy odpovídá 1 mikromolu mastné kyseliny, uvolněné za minutu za uvedených podmínek pH a teploty.

Po první etapě chromatografie byl pokusným vzorkem 0,5 ml prokázán účinek lipázy na emulzi tributyridu v 29 ml roztoku

O, 15 M NaCl, 2 mM Taurodeoxycholátu sodného a 1,5 μΜ hovězího albuminového séra, postupujíce podle metody, kterou popsal Gargouri a kol., (1986).

Jeden gram lyofilisovaných listů byl drcen při teplotě 4 °C v 30

------ml —glyc ino vého pufru— 20- mM—pH—2γ5—a ponechán za mírného---------------------£ míchání po 15 minut. Po dobu macerace bylo pH udržováno na

2.5 adicí HC1 IN. Macerační .produkt byl centrifugován, při 15000 ......... _v g po dobu 5 minut. pH supernatantu bylo upraveno na 4 adicí

NaOH IN. Po filtraci na MIRACLOTH (Calbiochem) byl celý supernatant přenesen na kolonu pryskyřice vyměňující kationty (pryskyřice S-Sépharose Fast Flow - Pharmacia) o 10 ml (průměr

1.6 cm), vyvážené v pufru octanu sodném 20 mM pH 4,0, NaCl 20 mM s průtokem 1 ml za minutu. Byly shromážděny frakce 2 ml.

Po průchodu supernatantu byla kolona promývána 40 ml «

ekvilibračního pufru. Proteiny, zadržené kolonou byly vymývány podle následujícího protokolu:

- lineární gradient pufru octanu sodného 20 mM pH 4,0 od 20 mM do 210 mM NaCl po dobu 30 minut pro vymytí prvního souboru píků proteinů, které nevykazují účinek lipázy, test je prováděn na vzorcích 1 ml,

- plato při 210 mM NaCl po dobu 20 minut,

- lineární gradient pufru octanu sodného 20 mM pH 4,0 od 210 mM do 500 mM NaCl po dobu 30 minut pro vymytí druhého souborů píků. V průběhu tohoto druhého gradientu byly vymyty proteiny s účinkem lipázy, měřené ve vzorcích 0,5 ml, při iontové síle mezi 300 a 400 mM.

Aktivní frakce byly sloučeny, koncentrovány pomocí koncentrační buňky OMEGACELL s limitem molekulové hmotnosti 30 kDa (Filtron Technology Corporation).

Koncentrát byl dialyzován 12 hodin proti pufru Tris-HCl 10 mM pH 8 a potom aplikován na kolonu pryskyřice vyměňující anionty (MonoQ HR 5/5 o průměru 0,5 cm a výšce 5 cm - Pharmacia), vyvážené pufrem Tris-HCl 10 mM pH 8. Účinek lipázy byl měřen na vzorcích 0,’5^s ml. Průtok byl udržován na hodnotě 1 ml za minutu, což odpovídalo tlaku 2,0 MPa. Po vymytí nezadržené frakce a promývání kolony 10 ml pufru Tris-jHCl 10 mM pH 8 byl aplikován lineární gradient s iontovou silou od 0 do 400 mM NaCl za 60 minut. Proteiny s účinkem lipázy byly vymývány při iontové síle situované okolo 100 mM a 200 mM.

Aktivní frakce byly sloučeny, koncentrovány pomocí koncentrační buňky OMEGACELL s limitem molekulové • ·

- 116 hmotnosti 30 kDa (Filtron Technology Corporation). Koncentrát představoval purifikovanou formu psí gastrické lipázy, extrahované z listů tabáku.

Určení koncentrace proteinů bylo prováděno metodou, kterou popsal Bradford M. (1976), ze supernatantu koncentrátu a metodou podle Lowry O.H. (1951) pro roztoky po první chromatografii iontové výměny.

Různé etapy purifikace byly analyzovány elektroforézou na denaturuj ícím polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE 12,5 %) technikou, kterou popsal Laemmli U.K. (1970). Proteiny, které byly tímto způsobem separovány na polyakrylamidovém gelu byly na jedné straně prokázány barvením modří a na druhé straně přeneseny na nitrocelulózovou membránu technikou polosuchého elektropřenosu (Transblot SD, BIORAD) v pufru Tris Base 20 mM, glycin 150 mM a ethanol 20 % při 2,3 mA na cm² membrány. Rekombinantní psí gastrická lipáza přenesená na nitrocelulózovou membránu byla prokázána imunodetekcí podle následujícího protokolu:

-označení cílového proteinupolyklonálnr protilátkOU- pro ti—psí----------gastrické lipáze, získané u morčete a zředěné na 1/5000 v pufru

PBS s přidáním práškového-mléka, delipidovaného na 5 %, -a - - 0,1 % Tween 20 po dobu 1 hodiny při teplotě okolí,

- promývání membrány ve třech po sobě následujících lázních pufru PBS s přidáním práškového mléka, delipidovaného na 1 %, a 0,1 % Tween 20 po dobu 10 minut pro každou lázeň,

- označení protilátkami proti morčeti spojenými s peroxidázou (Sigma) ve zředění 1/2000 v pufru PBS s přidáním práškového mléka, delipidovaného na 1 %, a .0,1 % Tween 20 po dobu 1 ........

e r

117 hodiny při teplotě okolí,

- promývání membrány ve třech po sobě následujících lázních pufru PBS s přidáním práškového mléka, delipidováného na 1 %, a 0,1 % Tween 20 po dobu 10 minut pro každou lázeň,

- prokázání působením peroxidázy na 4-chloro-1-naftolu (Sigma) v přítomnosti H2O2, která vytvoří modré zabarvení, stálé v čase.

Lipáza, produkovaná v listech, se presentuje ve dvou pásech o zhruba 49 kDa (polypeptid (Δ4)) a 37 kDa (polypeptid (Δ54)).

b) Varianta purifikace psí gastrické lipázy z listů tabáku

Účinek psí gastrické lipázy, produkované v listech tabáku byl určen titrimetrickou metodou, kterou popsal Gargouri a kol., (1986) s pomocí pH-statu (METTLER-TOLEDO DL25).

Určování triglyceridů s krátkým řetězcem bylo provedeno s využitím tributyridu jako substrátu: 1 ml tributyridu bylo emulsifikováno v 29 ml vodného roztoku NaCl 0,15 M, Hovězího Albuminového Séra (BSA) 1,5 μΜ a taurodeoxycholátu sodného (NaTDC) 2 mM. Nastavené pH bylo 5,0 a teplota 37 °C.

Určování spočívalo v neutralizaci kyseliny máselné, uvolňované působením lipázy přidáním hydroxidu sodného 0,02 N, zatímco emulze byla intenzívně mechanicky míchána.

Určování triglyceridů s dlouhým řetězcem bylo provedeno tak, že jako substrát byla použita vodná emulze 30 % purifikovaného sójového oleje, 1,2 % purifikovaných fosfolipidů z vajec, 1,67 % bezvodého glycerolu (Intralipid™ 30 % - Pharmacia AB

- 118 Stockholm, Švédsko). Deset ml této suspenze bylo emulzifikováno v 20 ml vodného roztoku NaCl 0,15 M, BSA 30 μΜ a CaC12 3,5 mM. Nastavené pH mělo hodnotu 4,0 a teplota byla rovna 37 °C. . .

Určování spočívalo v neutralizaci mastných kyselin, uvolňovaných působením lipázy přidáním hydroxidu sodného 0,2 N po skoku pH ze 4 na 9, zatímco emulze byla intenzívně mechanicky míchána.

Jednotka lipázy odpovídá jednomu mikromolu mastné kyseliny, uvolněné za minutu v definovaných podmínkách pH a teploty pro každý substrát.

Dva gramy lyofilizovaných listů byly drceny při 4 °C v 60 ml

NaCl

0,2 M, pH 3 a ponechány za mírného míchání po dobu 15 minut při teplotě 4 °C. Po dobu této macerace bylo pH udržováno na 3 adicí HC1

IN.

Produkt macerace (homogenát) byl centrifugo ván při

10000 g po dobu 10 minut. Po filtraci na

MIRACLOTH (Calbiochem) a filtru MILLIPORE 0,45 μ, bylo celé vyměňující kationty (RESOURCE S^Ó ml ^Pharmacia“^ 16 mm“x mm), vyváženou pufrem octan sodný 20 mM, NaCl 0,2 M pH 3 p ř i p r ů t o k u 8 - m1Z mi n (2 4 0- c m h'¹). Po průchodu nezadržené frakce byla kolona promývána třicetinásobkem svého objemu ekvilibračního pufru. Proteiny, zadržené na koloně byly vymývány lineárním gradientem pufru octan sodný 20 mM pH 3 a od 0,2 M NaCl do 0,5 M NaCl v sedmi objemech kolony. Byly odebírány frakce 4 ml.

* ·

Proteiny s účinkem lipázy, měřeným ze vzorků 0,5 ml, byly vymývány při iontové síle 0,35 M NaCl.

Aktivní frakce byly sloučeny a koncentrovány koncentrační buňkou OMEGACELL (Filtron Technology Corporation) s limitní 4 molekulovou hmotností 30 kDa.

Určení koncentrace proteinů bylo provedeno metodou, kterou popsal Lowry O.H. (1951).

Příklad polyakrylamidového gelu a výsledku přenosu tohoto gelu na nitrocelulózovou membránu a prokázání pomocí protilátek proti psí gastrické lipáze jsou ukázány na obr. 9 a 10. Prokázání bylo provedeno působením peroxidázy na Luminol v přítomnosti aktivátoru (ECL western blotting - AMERSHAM LIFE SCIENCE) a impresí fotografického filmu.

Přítomnost glykanových reziduí na proteinu byla určena následujícím protokolem:

- imobilizace proteinu na nitrocelulózové membráně,

- působení jodistanem

- specifická reakce ’ s stréptavidinem, vázaným na alkalickou

- fosfatázu

- barevná reakce alkalické fosfastázy (GLYCOTRACK - OXFORD GLYLOSYSTEM)

Příklad membrány detekce glykanových reziduí je ukázán na obr. 11.

Čistota frakcí je zajištěna vysokovýkonnou kapalinovou

120 chromatografií.

Chromatograf WATERS 625 LC

Detektor s diodovou lištou WATERS 991

Kolona VYDAC C4

Podmínky vymývání

Cpe (min)	Průtok (ml/min)	% A	% B
0	1	100	0
35	1	40	60
40	1	40	60
45	1	20	80
50	1	100	0

Pufr A: 89,9 % H20 10 acetonitrilu, 0,1 % kyseliny trifluoroctové

Pufr B: 100 % acetonitrilu

Tabulka purifikace: rekombinantní psí gastrická lipáza

	Celkových jednotek*	mg proteinů	Specifický účinek	F aktor purifikace	V ýtěžek
Homogenát	3200	/	/	/	/
Supernatant	2800	230	13	1	88 %
Výstup S	1600	6	250	20	5 0 %

* Jednotek tributyridu

Porovnání specifických účinků přírodní psí gastrické lipázy (n-LGC) a rekombinantní psí gastrické lipázy (r-LGC) r121

	n-LGC *	r-LGC extrahovaná z listů tabáku
Tributyrid	570 U/mg	250 U/mg
Intralipid 30 %	1000 U/mg	950 U/mg

* reference: Carriěre a kol.(1991) Eur. J. Biochem. 202, 75-83.

’ c) Purifikace psí gastričké lipázy ze semen řepky

Účinek rekombinantní psí gastričké lipázy produkované v semenech řepky byl určen stejným způsobem, jako v případě extrakce z listů.

Deset gramů semen řepky bylo rozdrceno v tekutém dusíku. Získaná mouka byla delipidována v hexanu první macerací při teplotě 4 °C za míchání po dobu 12 hodin. Vše bylo dekantováno a hexan byl eliminován. Mouka byla promývána dvakrát 100 ml hexanu za mírného míchání po dobu 1/2 hodiny při teplotě 4 °C pro každé promývání. Hexan byl eliminován děkan tací. Mouka byla sušena v rotačním odpařovači (HEIDOLPH 94200). Delipidovaná mouka byla uchovávána při teplotě -20 °C.

v

Extrakce psí gastričké lipázy byla provedena z délipidované mouky macerací při teplotě 4 °C ve vodném roztoku 0,2 M NaCl pH 3 (HCI IN) po dobu 30 minut v objemu 2 ml vodného roztoku na 0,1 g mouky. Výsledek macerace byl centrifugován při 10000 g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C.

Sedlina byla eliminována. Supernatant je tvořen extraktem ze

122 semen řepky.

Extrakt ze semen byl dialyzován proti pufru octanu sodného 10 mM pH 4, NaCl 140 mM, KC1 3 mM, a potom byl aplikován na imunoafinitní kolonu, tvořenou polyklonálními protilátkami proti psí gastrické lipáze, získanými u morčete a vázanými na pryskyřici (hydrazid Avidgel - BIOPROBE INTERN ATION AL, lne.)

Kontakt pryskyřice-extrakt semen trval 30 minut při teplotě 4 °C za mírného míchání. Pryskyřice potom byla promývána 10 objemy kolony pufru octanu sodného 10 mM, pH 4, NaCl 150 mM, KC1 3 mM. Psí gastrická lipáza byla vymývána 5 objemy kolony pufru glycin 0,2 M, pH 2,8, NaCl 150 mM. Odebírané frakce měly stejný objem, rovný jednomu objemu kolony a obsahovaly jednu dvacetinu objemově pufru Tris 1M pH 9. Analýza elektroforézou na polyakrylamidovém gelu v denaturujícím prostředí (viz obr. 12) ukazují protein o molekulové hmotnosti zhruba 37 kDa.

XII. SYNTÉZA ESTERU MASTNÝCH KYSELIN

Pokusy. b y 1 y _ _ reál i z o v á n y s .netra nsfo rmovanými s em eny ř e p k y, přičemž lipáza byla dodána:

- buď ve formě imobilizováného enzymatického přípravku (lipozym (NOVO)) nebo volného enzymatického přípravku (králičí gastrická lipáza (JO 4002)),

- nebo ve formě transformovaných semen tabáku s genem psí gastrické lipázy (tabák T14-44 0,85 % exprese).

Reakce esterifikace byla prováděna při teplotě 37 °C po dobu 16

Γ r

hodin ve skleněných láhvích, hermeticky uzavřených a umístěných na třepacím stole (2 5 0 otáček/min). Použité organické rozpouštědlo je hexan, ve kterém jsou mastné kyseliny rozpustné. Je přidán methanol ve stechiomerickém poměru vzhledem k teoretickému množství triacylglycerolu, obsaženému * v semenech řepky.

Hlavní složka mastných kyselin řepky je kyselina olejová, referenční srovnávací látka je methylester kyseliny olejové. Sledování syntézy se provádí chromatografií na tenké vrstvě (CCM). Migrační rozpouštědlo je směs hexanu, diethyletheru a vody (70:10:1). Vyvolávání desek se provádí za tepla po pulverizaci kyselinou sírovou (5 %) v ethanolu.

V prvním pokusu bylo přidáno do 0,2 g řepkového oleje (0,22 mmolů) 27 μΐ methanolu (0,66 mmolů) a 0,02 g lipozymu: na úrovni referenčního methylesteru kyseliny olejové se neobjevila žádná skvrna (obr. 13, sloupec 2).

V druhém pokusu byl řepkový olej nahrazen 0,5 g semen řepky, rozdrcených za sucha a bylo přidáno 1 ml hexanu: došlo k syntéze methylesteru (obr. 13, sloupec 5).

' > V dalších pokusech byly opakovány výše uvedené podmínky s následujícími změnami: množství lipozymu bylo sníženo na 0,006 g a lipozym byl nahrazen králičí gastrickou lipázou (0,007 g JO 4002). Došlo k syntéze methylesteru kyseliny olejové v přítomnosti lipozymu, ale ne v přítomnosti JO 4002 (obr. 14, sloupec 2).

Nakonec, v posledním pokusu, byla dodána lipáza v semenech r .-

	_r - ··· ř ♦ ř ** ^r - 124 -
transformovaného	tabáku ' (1 g semen tabáku). Objevila se

charakteristická skvrna methylesteru (obr. 15, sloupec 3).

Z uvedeného vyplývá, že výše popsané výsledky dokazují, že jestliže jsou současně použita semena řepky, alkohol a rekombinantní psí gastrická lipáza, produkovaná transgenickým tabákem, dojde k reakci estrifikace, která vede k syntéze methylesteru, který může sloužit jako biopalivo.

Popis obrázků:

obr. 1: nukleotidová sekvence cDNA, kódující psi gastrickou lipázu, obr. 2: sekvence aminokyselin psí gastrické lipázy, obr. 3: nukleotidová sekvence odvozená od cDNA, kódující psí gastrickou lipázu a kódující psi gastrickou lipázu z obr. 2, obr. 4: nukleotidová sekvence cDNA, kódující lidskou gastrickou lipázu a sekvence aminokyselin lidské gastrické lipázy, obrů5 : yék v é n č é'a m i n o k y s el i h lidské gastrické lipázy, -----------------------obr. 6: imunodetekce rekombinantních polypeptidů, «

-···· produkovaných listy -a semeny - tabáku Xanthi a semen řepky, transformovaných konstrukty pBIOC26, pBIOC25 a pBIOC29; E, škála molekulových hmotností; LG, psí gastrická lipáza; F, listy tabáku a GT, semena tabáku, transformovaného konstruktem pBIOC25; GC, semena řepky, transformované konstruktem pBIOC29; T, listy netransformovaného tabáku, obr. 7: imunodetekce * rekombinantních . polypeptidu, _ ____________......

125 obr.

obr.

produkovaných listy tabáku, transformovaného konstruktem pBIOC25 nebo pBIOC41; E, škála molekulových hmotností; LG, psí gastrická lipáza; 1 _a 3, listy tabáku, transformovaného konstruktem pBIOC41; 2, listy tabáku, transformovaného konstruktem pBIOC25; T, listy netransformovaného tabáku,

8: imunodetekce rekombinantních polypeptidů, produkovaných listy a plody rajského jablka, transformovaných konstruktem pBIOC25 a pBIOC26: TI: netransformovaný plod rajského jablka, a 3: plody transformovaného rajského jablka,

2: listy transformovaného jablka,

E: škála molekulových hmotností,

LC: psí gastrická lipáza,

T2: listy netransformovaného rajského jablka,

9: analýza elektroforézou na polyakrylamidovém gelu v denaturujícím prostředí (SDS-PAGE),

1: extrakt semen řepky,

2: rekombinantní psí gastrická lipáza, produkovaná listy tabáku,

3: přírodní psí gastrická lipáza,

4: škála molekulových hmotností, 10: imunologické výsledek předcházející analýzy po přenosu na nitrocelulózovou membránu,

1: přírodní psí gastrická lipáza,

2: rekombinantní psí gastrická lipáza, produkovaná listy tabáku, obr.

3: extrakt semen řepky,

11: zjišťování přítomnosti glykanových residuí pomocí polyakrylového gelu po přenosu na nitrocelulózovou

- 126 membránu,

1: extrakty semen řepky,

2: rekombinantní psí gastrická lipáza, produkovaná listy tabáku,

3: přírodní psí gastrická lipáza, obr. 12: analýza SDS-PAGE imunopurifikací r-DGL, _s produkované v semenech řepky,

1: přírodní psí gastrická lipáza,

2: rekombinantní psí gastrická lipáza, ' až 6: nezadržené frakce, vymývané z imunopurifikační kolony, obr. 13: vyvolání desky chromatografie na tenké vrstvě (CCM);

1: řepkový olej, bez enzymu, 2: řepkový olej 1 lipozym;

3: methylester kyseliny olejové; 4: semena řepky, bez enzymu; 5: semena řepky 1 lipozym, obr. 14: vyvolání desky chromatografie na tenké vrstvě (CCM);

a 4 semena řepky bez enzymu; 2 semena řepky + JO

4002; 3: methylester kyseliny olejové; 5: semena řepky + lipozym, obr. 15: vyvolání desky chromatografie na tenké vrstvě (CCM);

1: monoolein, diolein, triolein; 2: methylester kyseliny ó 1 e j o v é; 3: transform ováná semena—řepky—+—semena----------------------tabáku. μ

BIBLIOGRAFICKÉ REFERENCE

An a kol., Plant Physiol., 81, 301=305 (1986).

An a kol., Plant Physiol., 81, 86-91 (1986).

Aoubala M., Daniel C., De Caro A., Ivanova M.G., Hirn M.

127

Sarda L. a Verger R., Eur. J. Biochem. 211, 99-104 (1993).

Barta a kol., Plant Mol. Biol., 6, 3 4 7-357 (1 986).

Bednarek S.Y. a Ralkhel N.V., The Plant Cell, 3, 1 195-1206 (1991).

Berg D.E., Berg. C.M., Biotechnology, 1, 4Í7-435 (1983).

Bernard C., C.R. Acad. Sci. 28, 249-253 (1849).

Bevan a kol., Nátuře, 304, 184-187 (1983).

Bevan M., Nucleic Acids. Res., 12, 871 1-8721 (1984).

Birnboim .C., Doly J., Nucl. Acids. Res., 7, 15 13-1 523 (1979).

Bodmer M.W. a kol., Biochem Biophys. Acta, 909, 237-244 (1987).

Bradford M., Anal Biochem., 72, 248 (1976).

Brodelius a kol:, FEBS Letters, 103, 93-97 (1979).

Brodelius, v: Moo-Young M. (Ed), Bioreactor Immobilized Enzymes and Cells: Fundamentals and Applications, Elsevier, Londýn (1988).

Carriére a kol., Eur. J. Biochem., 202, 75-83 (1991).

Carriěre F., Laugier R., Barrowman J.A., Douchet J., Piymenko

128

N. a Verger R., Scand. J. Gastroenterology, 28, 443-454 (1993).

Close J.J., Rodriguez R.L., Gene, 20, 305-3 16 (1982).

De La Penna a kol., Nátuře, 325, 274-276 (1987).

Děno a kol., J. Planí. Physiol., 131, 315-322 (1 987).

Depicker a kol., J. Mol.Appl.Genet., 1, 561-573 (1982).

Depigny-This a kol., Planí.Mol.Biol., 20, 467-479 (1992).

De Zoeten a kol., Virology, 172, 213-222 (1989).

Docherty A.J.P. a kol., Nucl. Ac. Res., 13, 1891-1903 (1985).

Edelbaum a kol., J. of Interferon Research, 12, 449-453 (1992).

Franěk a kol., Cell, 21, 285-294 (1980).

Fiilatti J.J., Kiser J.,

T> _Λ D _{Λ Λ} « í T

R u č c rx.. a v u in a i a-< .,

726-730 (T987).

Gamborg O.L., Miller R.A. a Ojima K.,- Exp. Cell. Res., 50, 1511 58 (1968).

Gargouri Y., Pietroni G., Rivieře C., Sauniěre J-F., Lowe P.A.,

Sarda L. a Verger R., Gastroenterology, 91, 919-925 (1986).

Gargouri Y. a kol., Biochem. Biophys. Act., 1006, 255-271 (1989). * ...............................

- 129 Gaubier a kol., Mol.Gen.Genet., 238, 409-418 (1993).

Giller a kol., J. Biol. Chem., 267, 16509-16516 (1992).

Guerineau F., Mullineaux P., Plant Molecular Biology LABFAX, Groy R.R.D. (Ed), Nios.Scientific Publishers, Blackwell Scientific Publications, 121-147 (1993).

Hanahan D., J.Mol.Biol., 166, 557-580 (1983).

Hein R., International Meeting of Production of Recombinant

Proteins in Planíš, Leicester, str. 22 (1994).

Herrera-Estrella a kol., Nátuře, 303, 209-213 (1983a).

Herrera-Estrella a kol., EMBO J., 2, 987-995 (1983b).

Hiatt a Ma, FEBS, 307, 71-75 (1992).

Hiatt a kol., Nátuře, 342, 76-79 (1989).

Higo a kol., Biosci. Biochem., 57, 1477-1481 (1993).

Holsters a kol., Mol. Gen. Genet., 163, 181-187 (1978).

Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholtz D. a Rogers

S.G., Science, 227, 1229-1231 (1985).

Jouanin a kol., Plant Sci. 53, 53-63 (1987).

r r r 9 r f · r

r r * f · r »

Ť · ·

144-156 (1993).

- 130 Kay a kol., Science, 236, 1299-1302 (1987).

Laemmli U.K., Nátuře, 227, 680-685 (1970).

Liu a kol., Mol. Plant. Microb. Interactions,

Lowry O.H., J. Biol. Chem., 173, 265-275 (1951).

Ma a kol., International Meeting of Production of Recombinant

Proteins in Plants, Leicester, str. 39-40 (1994).

McElroy a kol., Mol.Gen.Genet., 231, 150-160 (1991).

Marx, Science, 216, 1305-1307 (1982).

Mason a kol., Proč.Nati.Acad.Sci. USA, 89, 1 1745-1 1749 (1992).

Matsuoka K., Nakamura K., Proč.Nati.Acad.Sci. USA, 88, 834838 (1991).

Moloney a kol., International Meeting of Production of Recombinant Proteins ín Plant, Leicester, str. 36-38 (1994).

Moreau H. a £o/.; Biochemr Biophys. Act., 960, 268-293 (1988).

Murakami a kol., Plant Mol. Biol., 7, 343-355 (1986).

Murashige T. a Skoog F., Physiol. Planetarum, 15, 473-497 (1962).

Ni a kol., Plant J., 7, 661-676 (1995).

131

Reina a kol., Nucleic Acid Research, 18, 6426 (1990).

Renart J. a Sandoval J.V., Meth. Enzymol., 104, 455-460 (1984).

Russel D., International Meeting of Production of Recombinant

Proteins in Plants, Leicester, str. 43 (1994).

Sambrook a kol., Molecular Cloning Laboratory Manual, 2^nd

Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

Sanford J.C., Trends in Biotechnology, 6, 299-302 (1988).

Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977).

Šchroeder M.R., Borkhsenious O.N., Matsuoka K., Nakamura K. a

Ralkhel N.V., Plant Physiol. 101, 451-458 (1993).

Shonheyder F. a Volquatz K., Acta Physiol. Scand., 9, 57-67 (1945).

Sijmons a kol., Biotechnology, 8, 217-221 (1990).

Thomas B.R. a Pratt D., Theor.Appl.Genet., 59, 215-219 (1981).

Truve a kol., Biotechnology, 11, 1048-1052 (1993).

Vandekerckhove a kol., Biotechnology, 7, 929-932 (1989).

Volhard F., Z. Kliň. Med., 42, 414-429 (1901).

• · » ·

- 132 SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: BIOCEM S.A.

(B) ULICE: 24, avenue des Landais (C) MĚSTO: AUBIERE (E) ZEMĚ: FRANCIE (F) POŠTOVNÍ KÓD: 63170 (A) JMÉNO: INSTITUT DE RECHERCHE JOUVEINAL (B) ULICE: 3-9, rue de la Loge (C) MĚSTO: FRESNES (E) ZEMĚ: FRANCIE (F) POŠTOVNÍ KÓD: 94265 CEDEX (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: REKOMBINANTNÍ PREDUODENÁLNÍ LIPÁZY A POLYPEPTIDOVÉ DERIVÁTY PRODUKOVANÉ ROSTLINAMI, ZPŮSOB JEJICH ZÍSKÁVÁNÍ A POUŽITÍ (iii) POČET SEKVENCÍ: 6 (iv) FORMA VHODNÁ PRO POČÍTAČOVÉ ZPRACOVÁNÍ (A) DRUH NOSIČE: Pružný disk (B) POČÍTAČ: IBM PC compatible (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Release #1.0, ______ Version #1.25 (OEB).......

133

(vi) ÚDAJE, TÝKAJÍCÍ SE PŘEDCHÁZEJÍCÍ PŘIHLÁŠKY: ,, (A) ČÍSLO PODÁNÍ: FR 95.04754 . ...

(B) DATUM PODÁNÍ: 20. dubna 1995 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1 528 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jednoduchá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA pro mRNA (ix) DOPLŇKOVÁ CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..1137 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

rnmz~> X 1 O

TTT

/-'/''Λ

'-7\ 71 Γ' aavj

rn 1 1

m vai

η τι ' A^ft

•η t. ΛΛΌ

CCT

Gaa

GTG

ÁCC

ATG

AAT

ATÁ

48

Leu

Phe

Gly

Lys

Leu

His

Pro

Thr

Asn

Pro

Glu

Val

Thr

Met

Asn

Ile

1

5

10

15

AGT

CAG

ATG

ATC

ACC

TAC

TGG

GGA

TAC

CCA

GCT

GAG

GAA

TAT

GAA

GTT

96

Ser

Gin

Met

Ile

Thr

Tyr

Trp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Glu

Tyr

Glu

Val

r * • · * * • ·

GTG ACC

GAA GAC GGT TAT ATC

CTT Leu 40

GGG Gly

ATC Ile

GAC AGA ATT

CCT Pro

TAT Tyr

GGG Gly

144

Val

Thr

Glu Asp Gly 35

Tyr

Ile

Asp

Arg

Ile 45

AGG

AAA

AAT

TCA

GAG

AAT

ATA

GGC

CGG

AGA

CCT

GTT

GCA

TTT

TTG

CAA

192

Arg

Lys

Asn

Ser

Glu

Asn

Ile

Gly

Arg

Pro

Val

Ala

Phe

Leu

Gin

50

55

60

CAC

GGT

TTG

CTC

GCA

TCA

GCC

ACA

AAC

TGG

ATC

TCC

AAC

CTG

CCC

AAC

240

His

Gly

Leu

Ala

Ser

Ala

Thr

Asn

Trp

Ile

Ser

Asn

Leu

Pro

Asn

65

70

75

80

AAC

AGC

CTG

GCC

TTC

ATC

CTG

GCC

GAC

GCC

GGG

TAC

GAC

GTG

TGG

CTG

288

Asn

Ser

Leu

Ala

Phe

Ile

Leu

Ala

Asp

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp

Leu

85

90

95

GGG

AAC

AGC

AGG

GGC

AAC

ACC

TGG

GCC

AGG

AAT

CTG

TAC

TCG

336

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

Asn

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Leu

Tyr

Ser

100

105

110

ccc

Λ Γ*

GAA

TTC

Trzr: X ww

ΠΠΤ A

TTC

AGC

TTT

GAC

GAG

ATG

GCT

AAA

384

Pro'

Asp

Sér

Val

Gru

Phe

Trp Ala

Phe

Ser

-Phe”

Asp

Glu

Met

Ala-

Lys

—

115

120

125

TAT

GAC

CTT

CCC

GCC

ACC

ATT

GAC

TTC

ATC

TTG

AAG

AAA

ACG

GGA

CAG

432

Tyr

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys

Thr

Gly

Gin

130

135

140

GAC

AAG

CTA

CAC

TAC

GTT

GGC

CAT

TCC

CAG

GGC

ACC

ATT

GGT

TTC

480

Asp

Lys

Leu

His

Tyr

Val

Gly

His

Ser

Gin

Gly

Thr

Ile

Gly

Phe

145

150

155

160

• · ♦ · ·

- 135 -

ATC

GCC

TTT

TCC

ACC

AAT

CCC

AAG

CTG

GCG

AAA

CGG

ATC

AAA

ACC

TTC

Ile

Ala

Phe

Ser

Thr

Asn

Pro

Lys

Leu_;

Ala

Lys

Arg

Ile

Lys

Thr

Phe

165

170

175

<·

TAT

GCA

TTA

GCT

CCC

GTT

GCC

ACC

GTG

AAG

TAC

ACC

GAA

ACC

CTG

TTA

576

•

Tyr

Ala

Leu

Ala

Pro

Val

Ala

Thr

Val

Lys

Tyr

Thr

Glu

Thr

Leu

i?

180

185

190

AAC

AAA

CTC

ATG

CTC

GTC

CCT

TCG

TTC

CTC

TTC

AAG

CTT

ATA

TTT

GGA

624

Asn

Lys

Leu

Met

Leu

Val

Pro

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys

Leu

Ile

Phe

Gly

195

200

205

AAC

AAA

ATA

TTC

TAC

CCA

CAC

TTC

TTT

GAT

CAA

TTT

CTC

GCC

ACC

672

Asn

Lys

Ile

Phe

Tyr

Pro

His

Phe

Asp

Gin

Phe

Leu

Ala

Thr

210

215

220

GAG

GTA

n; e

Tee

cGC

GAG

ACG

GTG

GAT

CTC

TGC

AGC

AAC

GCC

CTG

720

Glu

Val

Cys

Ser

Arg

Glu

Thr

Val

Asp

Leu

Cys

Ser

Asn

Leu

225

230

235

240

$ i.·

rprprp X X A

ΆΠΤ* nx

ATT

ΦΓϊΦ X SU X

GGA

rpqírn X X Λ

nk, x

ά mr¹nx ό

η λ n nns—

rnrn/“· i 1U

Ά Λ /-« nnL

ATG

/-»rn Λϋ X

CGC

TTG

7 68

Phe

Ile

Cys

Gly

Phe

Asp

Thr

Met

Asn

Leu

Asn

Met

Ser

Arg

Leu

245

250

255

GAT

GTG

TAT

CTG

TCA

CAT

AAT

CCA

GCA

GGA

ACA

TCG

GTT

CAG

AAC

GTG

816

Asp

Val

Tyr

Leu

Ser

His

Asn

Pro

Ala

Gly

Thr

Ser

Val

Gin

Asn

Val.

260

265

270 *

- 136 -

CTC CAC TGG

TCC CAG GCT

GTT Val

AAG TCT GGG AAG TTC CAA GCT

TTT GAC Phe Asp

864

Leu

His

Trp 275

Ser

Gin Ala

Lys 280

Ser

Gly Lys

Phe

Gin Ala 285

TGG

GGA

AGC

CCA

GTT

CAG

AAC

ATG

CAC

TAT

CAT

CAG

AGC

ATG

CCT

912

Trp

Gly

Ser

Pro

Val

Gin

Asn

Met

His

Tyr

His

Gin

Ser

Met

Pro

290

295

300

CCC

TAC

AAC

CTG

ACA

GAC

ATG

CAT

GTG

CCA

ATC

GCA

GTG

TGG

AAC

960

Pro

Tyr

Asn

Leu

Thr

Asp

Met

His

Val

Pro

Ile

Ala

Val

Trp

Asn

305

310

315

320

GGT

GGC

AAC

GAC

TTG

CTG

GCC

GAC

CCT

CAC

GAT

GTT

GAC

CTT

TTG

CTT

1008

Gly

Asn

Asp

Leu

Ala

Asp

Pro

His

Asp

Val

Asp

Leu

325

330

335

TCC

AAG

CTC

CCC

AAT

CTC

ATT

TAC

CAC

AGG

AAG

ATT

CCT

TAC

AAT

1056

Ser

Lys

Leu

Pro

Asn

Leu

Ile

Tyr

His

Arg

Lys

Ile

Pro

Tyr

Asn

340

345

350

CAC

TTG

GAC

TTT

ATC

TGG

λ m/^-· Λΐΰ

GAT

r*/-·/» U77

771

CAA

777

71 1

<t>7\ in7

7\ 7\ Τ’ ΓΎΠ.Χ

i 1 η λ X X W 1

His

Leu

Asp

Phe

Ile

Trp

Ala

Met

Asp Ala

Pro

Gin

Ala

Val

Tyr

Asn

355

360

365

GAA

ATT

GTT

TCC

ATG

GGA

ACA

GAT

AAT

AAG

TAGTTCTAGA

TTTAAGGAAT 1157

Glu

Ile

Val

Ser

Met

Gly

Thr

Asp

Asn

Lys

GACACGGTGA TTGTTCCCAT GGTTTTGATT TCAGAAATGT GTTAGCATCA ACAATCTTTC 1277

TATTCTTTTA TTGTTCCAAA ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCATGTTTGA 1217 • « ♦

137

	CATTGGTAAT	TTTTGAATTT	AAAATGATTT	TTAAATTTGG	GGCATCTGGG	TGGCTCAGTT	1337
	GGCTAAGTCG	TCTGCCTTGG	CTTAAGTCAT	GATCTCGGGG	TCCTAGGATG_:	GAGCCTTGTG	1397
IX	TCTGGGCTCC	TGCCGGGGCG	GGGGTCTGCT	TCTCCTCCTG	CTGCTCCCCC	CTGCTGCTGT	1457
i-	GTGCACACAC	GCTCTCTCTC	TCTCAAATAA	ATAAATAAAT	AAATACTTAA	TAAAATAAAA	1517
%	AAAAAAAAAA	A					1528

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 379 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

9

T JJC LA 1

Phe

ox y

T « Xjy o

T XJC LA 5

ti 4 « iixo

Pro

mu ~. A11X

’7\ noii

rxO 10

/“· Ί - UXU

Val

Thr

Met

Asn 15

Ile

Ser

Gin

Met

Ile

Thr

Tyr

Trp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Glu

Tyr

Glu

Val

20

25

30

Val

Thr

Glu

Asp

Gly

Tyr

Ile

Leu

Gly

Ile

Asp

Arg

Ile

Pro

Tyr

Gly

Arg Lys 50

Asn Ser

Glu

Asn

Ile Gly Arg Arg 55

Pro

Val 60

Ala

Phe

Leu

Gin

His

Gly

Leu

Ala

Ser

Ala

Thr

Asn

Trp

Ile

Ser

Asn

Leu

Pro

Asn

65

70

75

80

•5

Asn

Ser

Leu

Ala

Phe

Ile

Leu

Ala

Asp

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp

Leu

<F,

85

90

95

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

Asn

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Leu

Tyr

Ser

100

105

110

Pro

Asp

Ser

Val

Glu

Phe

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Asp

Glu

Met

Ala

Lys

115

120

125

Tyr

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys

Thr

Gly

Gin

130

135

140

Asp

Lys

Leu

His

Tyr

Val

Gly

His

Ser

Gin

Gly

Thr

Ile

Gly

Phe

145

150

155

160

*,

Ile

Ala

Phe

Ser

Thr

Asn

Pro

Lys

Leu

Ala

Lys

Arg

Ile

Lys

Thr

Phe

1 c c

í ΊΛ

1 IC

V

X / V

X / O

Tyr

Ala

Leu

Ala

Pro

Val

Ala

Thr

Val

Lys

Tyr

Thr

Glu

Thr

Leu

180

185

190

Asn

Lys

Leu

Met

Leu

Val

Pro

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys

Leu

Ile

Phe

Gly

195

200

205 * *

Asn Lys Ile Phe TLr Pro His His

Phe Phe Asp Gin Phe Leu Ala Thr

210

215

220

Glu

Val

Cys

Ser Arg

Glu

Thr

Val

Asp

Leu

Cys

Ser

Asn

Ala

Leu

225

230

235

240

4

Phe

Ile

Cys Gly

Phe

Asp

Thr

Met

Asn

Leu

Asn

Met

Ser

Arg

Leu

4

245

250

255

1¾

Asp

Val

Tyr

Leu Ser

His

Asn

Pro

Ala

Gly

Thr

Ser

Val

Gin

Asn

Val

260

265

270

Leu

His Trp

Ser

Gin

Ala

Val

Lys

Ser

Gly

Lys

Phe

Gin

Ala

Phe

Asp

275

280

285

Trp

Gly Ser

Pro

Val

Gin

Asn

Met

His

Tyr

His

Gin

Ser

Met

Pro

290

295

300

Pro

Tyr Tyr

Asn

Leu

Thr

Asp

Met

His

Val

Pro

Ile

Ala

Val

Trp

Asn

305 310 315 320

Gly Gly Asn Asp Leu Leu Ala Asp

Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu i*

325

330

335

Ser Lys

Leu

Pro Asn 340

Leu

Ile

Tyr

His 345

Arg

Lys

Ile

Pro

Pro 350

Tyr

Asn

His

Leu

Asp

Phe

Ile

Trp

Ala

Met

Asp

Ala

Pro

Gin

Ala

Val

Tyr

Asn

355

360

365

- 140 -

Glu Ile Val Ser Met Met Gly Thr Asp Asn Lys

370

375 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1048 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvojitá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) DOPLŇKOVÁ CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..975 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

ATA Ile 1

GGC Gly

CGG Arg

AGA CCT

GTT GCA TTT TTG CAA CAC GGT TTG CTC GCA TCA

48

Arg

Pro 5

Val

Ala

Phe

Leu Gin ¹ 10

His

Gly

Leu

Ala 15

Ser

GCC

ACA

AAC

TGG

ATC

TCC

AAC

CTG

CCC

AAC

AGC

CTG

GCC

TTC

ATC

96

Ala

Thr

Asn

Trp

Ile

Ser

Asn

Leu

Pro

Asn

Ser

Leu

Ala

Phe

Ile

20

25

30

CTG

GCC

GAC

GCC

GGG

TAC

GAC

GTG

TGG

CTG

GGG

AAC

AGC

AGG

GGC

AAC

146

Leu

Ala

Asp

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp

Leu

Gly

Asn

Ser

Arg

Gly

Asn

®

ACC Thr

TGG GCC AGG AGG

AAT Asn

CTG Leu 55

TAC Tyr

TCG Ser

CCC GAC TCC GTC

GAA TTC

192

Trp 50

Ala

Arg

Pro Asp ' 60

Ser

Val

Glu

Phe

TGG

GCT

TTC

AGC

TTT

GAC

GAG

ATG

GCT

AAA

TAT

GAC

CTT

CCC

GCC

ACC

240

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Asp

Glu

Met

Ala

Lys

Tyr

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

65

70

75

80

ATT

GAC

TTC

ATC

TTG

AAG

AAA

ACG

GGA

CAG

GAC

AAG

CTA

CAC

TAC

GTT

288

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys

Thr

Gly

Gin

Asp

Lys

Leu

His

Tyr

Val

85

90

95

GGC

CAT

TCC

CAG

GGC

ACC

ATT

GGT

TTC

ATC

GCC

TTT

TCC

ACC

AAT

336

Gly

His

Ser

Gin

Gly

Thr

Ile

Gly

Phe

Ile

Ala

Phe

Ser

Thr

Asn

100

105

110

CCC

AAG

CTG

GCG

AAA

CGG

ATC

AAA

ACC

TTC

TAT

GCA

TTA

GCT

CCC

GTT

384

Pro

Lys

Leu

Ala

Lys

Arg

Ile

Lys

Thr

Phe

Tyr

Ala

Leu

Ala

Pro

Val

115

120

125

GCC

ACC

GTG

AAG

TAC

ACC

GAA

ACC

CTG

TTA

AAC

AAA

CTC

ATG

CTC

GTC

432

Ala

Thr

Val

Lys

Tyr

Thr

Glu

Thr

Leu

Asn

Lys

Leu

Met

Leu

Val

130

135

140

CCT

TCG

TTC

CTC

TTC

AAG

CTT

ATA

TTT

GGA

AAC

AAA

ATA

TTC

TAC

CCA

480

Pro

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys

Leu

Ile

Phe

Gly

Asn

Lys

Ile

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

- 142 -

CAC His

TTC Phe

TTT Phe

GAT Asp 165

CAA Gin

TTT Phe

CTC Leu

GCC Ala

ACC Thr 170

GAG Glu

GTA Val

TGC Cys

TCC Ser

CGC Arg 175

GAG Glu

528

ACG

GTG

GAT

CTC

TGC

AGC

AAC

GCC

CTG

TTT

ATC

ATT

TGT

GGA

TTT

576

ΓΠΚ v X l.X

Val

Asp

Leu

Cys

Ser

Asn

Ala

Leu

Phe

Ile

Cys

Gly

Phe

180

185

190

GAC

ACT

ATG

AAC

TTG.

AAC

ATG

AGT

CGC

TTG

GAT

GTG

TAT

CTG

TCA

CAT

62 4

Asp

Thr

Met

Asn

Leu

Asn

Met

Ser

Arg

Leu

Asp

Val

Tyr

Leu

Ser

His

195

200

205

AAT

CCA

GCA

GGA

ACA

TCG

GTT

CAG

AAC

GTG

CTC

CAC

TGG

TCC

CAG

GCT

672

Asn

Pro

Ala

Gly

Thr

Ser

Val

Gin

Asn

Val

Leu

His

Trp

Ser

Gin

Ala

210

215

220

GTT

AAG

TCT

GGG

AAG

TTC

CAA

GCT

TTT

GAC

TGG

GGA

AGC

CCA

GTT

CAG

720

Val

Lys

Ser

Gly

Lys

Phe

Gin

Ala

Phe

Asp

Trp

Gly

Ser

Pro

Val

Gin

225

230

235

240

AAC

ATG

CAC

TAT

CAT

CAG

AGC

ATG

CCT

CCC

TAC

AAC

CTG

ACA

768

Asn

Met

His

Tyr

His

Gin

Ser

Met

Pro

Tyr

Asn

Leu

Thr

245

250

255

GAC

ATG

CAT

GTG

CCA

ATC

GCA

GTG

TGG

AAC

GGT

GGC

AAC

GAC

TTG

CTG

816

Asp

Met

His

Val

Pro

Ile

Ala

Val

Trp

Asn

Gly

Asn

Asp

Leu

260

265

270

GCC

GAC

CCT

CAC

GAT

GTT

GAC

CTT

TTG

CTT

TCC

AAG

CTC

CCC

AAT

CTC

864

Ala

Asp

Pro

His

Asp

Val

Asp

Leu

Ser

Lys

Leu

Pro

Asn

Leu

275

280

285 ♦ r ? *

ATT TAC CAC AGG AAG ATT CCT CCT TAC

Ile Tyr His Arg Lys Ile Pro Pro Tyr

' 290	295
z’·/-’/·»	CCT CAA GCG GTT TAC
Ala Met Asp Ala	Pro Gin Ala Val Tyr
305	310

AAT Asn	CAC His	TTG Leu 300	GAC Asp	TTT Phe	ATC Ile	TGG Trp	912
AAT	GAA	ATT	GTT	TCC	ATG	ATG	960
Asn	Glu	Ile	Val	Ser	Met	Met
	315					320

GGA ACA GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT TATTCTTTTA TTGTTCCAAA 1015

Gly Thr Asp Asn Lys

325

ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCA

1048 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 325 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina KONFIGURACE^ lineární — (i i) τ Y P M O L E K U L Y: p r o t e i n - (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

Ile Gly Arg Rrg Pro Val Ala Phe Leu Gin His Gly Leu Leu Ala Ser

- 144 Ala Thr Asn Trp Ile Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Phe Ile

Leu Ala Asp Ala Gly Sr Asp Val

Trp Leu Gly Asn Ser Arg Gly Asn

Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Sr

Sr Ser Pro Asp Ser Val Glu Phe

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Asp

Glu

Met

Ala

Lys

Tyr

Asp

Leu

Pro

Ala

Thr

65

70

75

80

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys

Thr

Gly

Gin

Asp

Lys

Leu

His

Tyr

Val

85

90

95

Gly

His

Ser

Gin

Gly

Thr

Ile

Gly

Phe

Ile

Ala

Phe

Ser

Thr

Asn

100

105

110

Pro

Lys

Leu

Ala

Lys

Arg

Ile

Lys

Thr

Phe

Tyr

Ala

Leu

Ala

Pro

Val

115

120

125

Ala

Thr

Val

Lys

Tyr

Thr

Glu

Thr

Leu

Asn

Lys

Leu

Met

Leu

Val

1 > Λ ΛΟϋ

135

140

Pro

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys

Leu

Ile

Phe

Gly

Asn

Lys

Ile

Phe

Tyr

Pro

145

150

155

160

His

Phe

Asp

Gin

Phe

Leu

Ala

Thr

Glu

Val

Cys

Ser

Arg

Glu

165

170

175 ,,. 9 · - - * · ♦ ⁹ * ♦ * . . e » · * * · · · ♦ » · » · · · · · » * * · · »♦·· ♦ <· · 9 · · ♦ ··· * - , a « a· ··· ·· ·♦

- 145 -

Thr

Val

Asp

Leu 180

Leu Cys

Ser

Asn Ala 185

Leu

Phe

Ile

Cys 190

Gly

Phe

Asp

Thr

Met

Asn

Leu

Asn

Met

Ser

Arg

Leu

Asp

Val

Tyr

Leu

Ser

His

195

200

205

Asn

Pro

Ala

Gly

Thr

Ser

Val

Gin

Asn

Val

Leu

His

Trp

Ser

Gin

Ala

210

215

220

Val

Lys

Ser

Gly

Lys

Phe

Gin

Ala

Phe

Asp

Trp

Gly

Ser

Pro

Val

Gin

225

230

235

240

Asn

Met

His

Tyr

His

Gin

Ser

Met

Pro

Tyr

Asn

Leu

Thr

245

250

255

Asp

Met

His

Val

Pro

Ile

Ala

Val

Trp

Asn

Gly

Asn

Asp

Leu

260

265

270

Ala

Asp

Pro

His

Asp

Val

Asp

Leu

Ser

Lys

Leu

Pro

Asn

Leu

275

280

285

ύ·

Ile

Tyr

His

Arg

Lys

Ile

Pro

Tyr

Asn

His

Leu Asp

Phe

Ile

Trp át

290

295

300

ř..

Ala

Met

Asp

Ala

Pro

Gin

Ala

Val

Tyr

Asn

Glu

Ile Val

Ser

Met

305

310

315

320

Gly

Thr

Asp

Asn

Lys

325

• · * * » *

- 146 r *· ·

9 9 9 9 · 9 f »»

T 9999 · · · «“··· r · ·♦· * · » 9 9 9· ť · · ς » ··» «« c * « » · · · * · »· · (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: .

(A) DÉLKA: 1198 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvojitá (D) KONFIGURACE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomická) (ix) DOPLŇKOVÁ CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..1125 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

CTT Leu 1

CAT His

CCC Pro

ACA Thr

AAC CCT GAA GTG ACC ATG AAT ATA

AGT Ser

CAG ATG ATC

48

Asn 5

Pro

Glu Val

Thr

Met 10

Asn

Ile

Gin

Met 15

Ile

ír

ACC

TAC

TGG

GGA

TAC

CCA·

GCT

GAG

GAA

TAT

GAA

GTT

GTG

ACC

GAA

GAC

96

Thr

Tyr

Trp

Gly

Tyr

Pro

Ala

Glu

Tyr

Glu

Val

Thr

Glu

Asp

*

20

25

30

GGT

TAT

ATC

CTT

GGG

ATC

GAC

AGA

ATT

CCT

TAT

GGG

AGG

AAA

AAT

TCA

144

Gly

Tyr

Ile

Leu

Gly

Iie

Asp

Arg

Ile

.Pro

Tyr

Gly

Arg

Lys

Asn

Ser

35

40

45

GAG

AAT

ATA

GGC

CGG

AGA

CCT

GTT

GCA

TTT

TTG

CAA

CAC

GGT

TTG

CTC

192

Glu

Asn

Ile

Gly

Arg

Pro

Val

Ala

Phe

Leu

Gin

His

Gly

Leu

» ♦

- 147 -

GCA Ala 65

TCA GCC

ACA Thr

AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC AAC AGC

CTG GCC

240

Ser

Ala

Asn Trp 70

Ile

Ser

Asn

Leu

Pro ‘ 75

Asn

Ser

Leu

Ala 80

TTC

ATC

CTG

GCC

GAC

GCC

GGG

TAC

GAC

GTG

TGG

CTG

GGG

AAC

AGC

AGG

n o áOO

Phe

Ile

Leu

Ala

Asp

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp

Leu

Gly

Asn

Ser

Arg

85

90

95

GGC

AAC

ACC

TGG

GCC

AGG

AAT

CTG

TAC

TCG

CCC

GAC

TCC

GTC

336

Gly

Asn

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Leu

Tyr

Ser

Pro

Asp

Ser

Val

100

105

110

GAA

TTC

TGG

GCT

TTC

AGC

TTT

GAC

GAG

ATG

GCT

AAA

TAT

GAC

CTT

CCC

384

Glu

Phe

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Asp

Glu

Met

Ala

Lys

Tyr

Asp

Leu

Pro

115

120

125

GCC

ACC

ATT

GAC

TTC

ATC

TTG

AAG

AAA

ACG

GGA

CAG

GAC

AAG

CTA

CAC

432

Ala

Thr

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys

Thr

Gly

Gin

Asp

Lys

Leu

His

130

135

140

TAC

GTT

GGC

CAT

TCC

CAG

GGC

ACC

ATT

GGT

TTC

ATC

GCC

TTT

TCC

480

Tyr

Val

Gly His

Ser

Gin Gly

Thr

Ile

Gly

Phe

Ile

Ala

Phe

Ser

145

150

155

160

ACC

AAT

CCC

AAG

CTG

GCG

AAA

CGG

ATC

AAA

ACC

TTC

TAT

GCA

TTA

GCT

528

Thr

Asn

Pro

Lys

Leu

Ala

Lys

Arg

Ile

Lys

Thr

Phe

Tyr

Ala

Leu

Ala

165

170

175 r • ·

- 148

CCC Pro

GTT Val

GCC ACC

GTG Val

AAG Lys

TAC Tyr

ACC Thr

bAA ACC

CTG Leu

TTA AAC AAA CTC

ATG Met

576

Ala

Thr 180

Glu 185

Thr

Leu Asn

Lys 190

Leu

CTC

GTC

CCT

TCG

TTC

CTC

TTC

AAG

CTT

ATA

TTT

GGA

AAC

AAA

ATA

TTC

624

$

Leu

Val

Pro

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys

Leu

Ile

Phe

Gly

Asn

Lys

Ile

Phe

v

195

200

205

g

TAC

CCA

CAC

TTC

TTT

GAT

CAA

TTT

CTC

GCC

ACC

GAG

GTA

TGC

TCC

672

Tyr

Pro

His

Phe

Asp

Gin

Phe

Leu

Ala

Thr

Glu

Val

Cys

Ser

210

215

220

CGC

GAG

ACG

GTG

GAT

CTC

TGC

AGC

AAC

GCC

CTG

TTT

ATC

ATT

TGT

720

Arg

Glu

Thr

Val

Asp

Leu

Cys

Ser

Asn

Ala

Leu

Phe

Ile

Cys

225

230

235

240

GGA

TTT

GAC

ACT

ATG

AAC

TTG

AAC

ATG

AGT

CGC

TTG

GAT

GTG

TAT

CTG

768

Gly

Phe

Asp

Thr

Met

Asn

Leu

Asn

Met

Ser

Arg

Leu

Asp

Val

Tyr

Leu

245

250

255

TCA

CAT

AAT

CCA

GCA

GGA

ACA

TCG

GTT

CAG

AAC

GTG

CTC

CAC

TGG

TCC

816

á 4'

Ser

His

Asn

Pro

Ala

Gly

Thr

Ser

Val

Gin

Asn

Val

Leu

His

Trp

Ser

(·

260

^r n c c Z.

270

CAG GCT GTT AAG TCT GGG AAG TTC CAA GCT

TTT GAC TGG GGA AGC CCA

864

Gin Ala Val Lys

275

GTT CAG AAC ATG

Val Gin Asn Met

Ser Gly Lys Phe

280

ATG CAC TAT CAT

Met His Tyr His

Gin Ala Phe Asp

CAG AGC ATG CCT

Gin Ser Met Pro

Trp Gly Ser Pro

285

CCC TAC TAC AAC

Pro Tyr Tyr Asn

290

295

300

912

A » • ·

CTG ACA GAC

ATG Met

CAT His

GTG Val 310

CCA Pro

ATC Ile

GCA Ala

GTG Val

TGG AAC Trp Asn 315

GGT Gly

GGC AAC Gly Asn

GAC Asp 320

960

Leu 305

Thr

Asp

TTG

CTG

GCC

GAC

CCT

CAC

GAT

GTT

GAC

CTT

TTG

CTT

Trp X x^x^

AAG

Γ·ΦΓ· v Iv

CCC

1008

Leu

Ala

Asp

Pro

His

Asp

Val

Asp

Leu

Ser

Lys

Leu

Pro

•

325

330

335

*r ΐ

AAT

CTC

ATT

TAC

CAC

AGG

AAG

ATT

CCT

TAC

AAT

CAC

TTG

GAC

TTT

1056

Asn

Leu

Ile

Tyr

His

Arg

Lys

Ile

Pro

Tyr

Asn

His

Leu

Asp

Phe

340

345

350

ATC

TGG

GCC

ATG

GAT

GCC

CCT

CAA

GCG

GTT

TAC

AAT

GAA

ATT

GTT

TCC

1104

Ile

Trp

Ala

Met

Asp

Ala

Pro

Gin

Ala

Val

Tyr

Asn

Glu

Ile

Val

Ser

355 360 365

ATG	ATG GGA ACA GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT TATTCTTTTA	1155
Met	Met	Gly	Thr	Asp	Asn	Lys
	370					375

TTGTTCCAAA ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCA

1198 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 375 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) KONFIGURACE: lineární

- 150 (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

i í r

Leu 1 Thr

His Tyr

Pro Trp

Thr Asn 5

Pro Glu Val

Thr Met Asn Ile Ser Gin Met

Ile Asp

10

Val

Thr 30

15 Glu

Gly 20

Tyr

Pro

Ala Glu

Glu Tyr 25

Glu

Gly

Tyr

Ile

Leu

Gly

Ile

Asp

Arg

Ile

Pro

Tyr

Gly

Arg

Lys

Asn

Ser

35

40

45

Glu

Asn

Ile

Gly

Arg

Pro

Val

Ala

Phe

Leu

Gin

His

Gly

Leu

50

55

60

Ala Ser Ala Thr Asn Trp Ile

Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala

Phe

Ile

Leu

Ala

Asp

Ala

Gly

Tyr

Asp

Val

Trp

Leu

Gly

Asn

Ser

Arg

ii¹

85

90

95

” . Gly

Asn

Thr

Trp

Ala

Arg

Asn

Leu

Tyr

Ser

Pro

Asp

Ser

Val

100

105

110

Glu

Phe

Trp

Ala

Phe

Ser

Phe

Asp

Glu

Met

Ala

Lys

Tyr

Asp

Leu

Pro

115

120

125

Ala

Thr

Ile

Asp

Phe

Ile

Leu

Lys

Thr

Gly

Gin

Asp

Lys

Leu

His

130

135

140 • · ·

- 151 -

Tyr Val Gly His Ser Gin Gly Thr Thr	Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser
145	150	155	160

Thr	Asn	Pro	Lys	Leu	Ala	Lys	Arg Ile	Lys	Thr Phe Tyr Ala Leu Ala
				165				170	175	:*
Pro	Val	Ala	Thr	Val	Lys	Sr	Thr Glu	Thr	Leu Leu Asn Lys Leu Met	«1 ,φ Λ
			180				185		190

Leu Val

Pro 195

Ser

Phe

Leu

Phe

Lys 200

Leu

Ile

Phe Gly

Asn 205

Lys

Ile

Phe

Tyr

Pro

His

Phe

Asp

Gin

Phe

Leu

Ala

Thr

Glu

Val

Cys

Ser

210

215

220

Arg

Glu

Thr

Val

Asp

Leu

Cys

Ser

Asn

Ala

Leu

Phe

Ile

Cys

225

230

235

240

Gly

Phe

Asp

Thr

Met

Asn

Leu

Asn

Met

Ser

Arg

Leu

Asp

Val

Tyr

Leu

9 A G

O GA

£* *3

w

Ser

His

Asn

Pro

Ala

Gly

Thr

Ser

Val

Gin

Asn

Val

Leu

His

Trp

Ser

. .

260

....

- ..

-265

-270

.=.

..... -.----- - -« .....

Gin Ala Val

Lys

Ser Gly Lys

Phe 280

Gin

Ala

Phe

Asp Trp Gly 285

Ser

Pro

275

Val

Gin

Asn

Met

His

Tyr

His

Gin

Ser

Met

Pro

Tyr

Asn

290

295

300 r i

- 152

Leu 305

Thr

Asp Met

His

Val 310

Pro

Ile

Ala

Val

Trp Asn Gly Gly Asn Asp

315

320

Leu

Ala

Asp

Pro

His

Asp

Val

Asp

Leu

Ser

Lys

Leu

Pro

325

330

335

Asn

Leu

Ile

Tyr

His

Arg

Lys

Ile

Pro

Tyr

Asn

His

Leu

Asp

Phe

340

345

350

Ile

Trp

Ala

Met

Asp

Ala

Pro

Gin

Ala

Val

Tyr

Asn

Glu

Ile

Val

Ser

355

360

365

Met

Gly

Thr

Asp

Asn

Lys

370

375

Zastupuje:

Claims

PATENTOVÉ N

1. Použití rekombinantní nukleotidové sekvence, obsahující na jedné straně preduodenální lipázy, to jest sekvence, které je kódují, homologie alespoň okolo 75 85 % a že jejich sekvence procento homologie alespoň % do okolo 90 % a vykazují vlastnost odolnosti proti kyselému prostředí a jsou účinné při pH od asi 1 do asi 5 a obzvláště při pH od asi gastrické odvozené cDNA kóduj ící takové, všechny savčí že nukleotidové lipázy vykazují mezi %, zejména od okolo 77 % do okolo aminokyselin vykazují mezi sebou okolo 70 %, obzvláště od okolo 80 sebou procento

1,5 do asi 2, zejména cDNA kódující všechny savčí lipázy nebo cDNA kódující všechny polypeptidy, od uvedených preduodenálních lipáz adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, přičemž tento polypeptid vykazuje výše uvedené vlastnosti preduodenálních lipáz, a obsahující do voluj ící kódované rostlinné buňce produkovat uvedenou cDNA nebo na druhé straně prvky, preduodenální lipázy, produkovat <* odvozený t AT TV*» 1 ΤΊ Q +· f\ t* V V A AIX A AA <4 W A rl p fí n nit α n v M V Á 1 XI V T Ca AA J t r a n skřipce, rozpoznávané rostlinných buněk, pro transformaci rostlinných buněk za -účelem- zí skání s pomo cítěchto buněk nebo s pomocí ro s11 in, získaných z těchto buněk, rekombinantní lipázy ve formě účinného enzymu nebo polypeptidů, odvozených od této lipázy definovány výše.

η η 1 vn p n 11 rl pvijyvy viu, transkripčni m mechanismem savčí preduodenální jednoho nebo více takových, jaké byly
2. Použití podle nároku 1 rekombinantní nukleotidové sekvence, obsahující na jedné straně cDNA, znázorněnou na obr.

154

1 a kódující psí gastrickou lipázu (LGC) znázorněnou na obr. 2 nebo nukleotidovou sekvenci odvozenou od této cDNA, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jednoho nebo více nukleotidů, přičemž uvedená odvozená sekvence může kódovat polypeptid, jehož sekvence aminokyselin je identická sekvenci psí gastrické lipázy, znázorněné na obr. 2 nebo polypeptid odvozený od psí gastrické lipázy adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin a tento odvozený polypeptid vykazuje účinek lipázy, a obsahující na druhé straně prvky, dovolující rostlinné buňce produkovat polypeptid, kódovaný uvedenou cDNA nebo výše uvedenou odvozenou sekvencí, zejména promotor a terminátor transkripce, rozpoznávané transkripčním mechanismem rostlinných buněk, pro transformaci rostlinných buněk za účelem získání s pomocí těchto buněk nebo s pomocí rostlin, získaných z těchto buněk, rekombinantní psí gastrické lipázy ve formě účinného enzymu nebo jednoho nebo více polypeptidů, odvozených od této lipázy takových, jaké byly definovány výše.
3. Použití podle nároku 1 rekombinantní nukleotidové sekvence, obsahující na jedné straně cDNA, znázorněnou na obr. 4 a kódující lidskou gastrickou lipázu (LGH) znázorněnou na obr. 5 nebo nukleotidovou sekvenci odvozenou od této cDNA, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jednoho nebo více nukleotidů, přičemž uvedená odvozená sekvence může kódovat polypeptid, jehož sekvence aminokyselin je identická sekvenci lidské gastrické lipázy, znázorněné na obr. 5 nebo polypeptid odvožený od lidské gastrické lipázy adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin a tento odvozený polypeptid vykazuje účinek lipázy, a obsahující na druhé straně prvky, dovolující rostlinné buňce produkovat

9 9 _Γ · e * *· » ·“ * *· * r f· r 9 9 r · ♦· - - * ř re r · r · * ř

- 155 - ’·· .....

polypeptid, kódovaný uvedenou cDNA nebo výše uvedenou odvozenou sekvencí, zejména promotor a terminátor transkripce, rozpoznávané transkripční m mechanismem rostlinných buněk, pro transformaci rostlinných buněk za účelem získání s pomocí těchto buněk nebo s pomocí rostlin, získaných z těchto buněk, rekombinantní lidské gastrické lipázy ve formě účinného enzymu nebo jednoho nebo více polypeptidů, odvozených od této lipázy takových, jaké byly definovány výše.
4. Rekombinantní nukleotidová sekvence, vyznačující se tím, že obsahuje na jedné straně cDNA, znázorněnou na obr. 1 a kódující psí gastrickou lipázu (LGC) znázorněnou na obr. 2 nebo nukleotidovou sekvenci odvozenou od této cDNA, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jednoho nebo více nukleotidů, jako je sekvence znázorněná na obr. 3, přičemž uvedená odvozená sekvence může kódovat polypeptid, jehož sekvence aminokyselin je identická sekvenci psí gastrické lipázy, znázorněné na obr. 2 nebo polypeptid odvozený od psí gastrické lipázy adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin a tento odvozený polypeptid vykazuje účinek lipázy a tím, že obsahuje na druhé straně prvky, d o vo 1 u j í c í-^ro s t li ηné buňce produkovat póly p e p t i d, k ódo v a n ý---------------uvedenou cDNA nebo výše uvedenou odvozenou sekvencí, zej mé na p rom o tor -a terminát o r - transkripce,- rozpoznávané -™ transkripčním mechanismem rostlinných buněk.
5. Rekombinantní nukleotidová sekvence, vyznačující se tím, že obsahuje na jedné straně cDNA, znázorněnou na obr. 4 a kódující lidskou gastrickou lipázu (LGH) znázorněnou na obr. 5 nebo nukleotidovou sekvenci odvozenou od této cDNA, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jednoho nebo více ♦ <· * r r

- 156 - nukleotidů, přičemž uvedená odvozená sekvence může kódovat polypeptid, jehož sekvence aminokyselin je identická sekvenci

- - lidské gastrické lipázy, znázorněné na obr. 5 nebo polypeptid odvozený ód lidské gastrické lipázy adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin a tento odvozený ^f polypeptid vykazuje účinek lipázy a tím, že obsahuje na druhé » straně prvky, dovolující rostlinné buňce produkovat polypeptid, kódovaný uvedenou cDNA nebo výše uvedenou odvozenou i

sekvencí, zejména promotor a terminátor transkripce, rozpoznávané transkripčním mechanismem rostlinných buněk.
6. Rekombinantní nukleotidová sekvence podle nároku 4 nebo nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje

- v přední části uvedené cDNA nebo sekvence od ní odvozené, terminátor polyA 35S viru mozaiky květáku (CaMV) nebo terminátor polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- v zadní části uvedené cDNA nebo sekvence od ní odvozené, promotor nebo dvojitý konstitutivní promotor 35S (pd35S) viru CaMV nebo promotor pCRU genu kruciferinu ředkvičky nebo promotor pGEAl nebo pGEAó Arabidopsis thaliana nebo chimérický promotor pSP Agrobacterium tumefaciens nebo promotor pAR-IAR rýže nebo promotor pyzein kukuřice.

⁴
7. Rekombinantní nukleotidová sekvence podle jednoho z nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci kódující peptid, zodpovídající za směrování rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo odvozeného polypeptidu nebo polypeptidů do určeného prostoru rostlinné buňky.
8. Rekombinantní nukleotidová sekvence podle jednoho z nároků 4, 6 a 7, vyznačující se tím, že je zvolena ze souboru * 9

- 157 - zahrnuj ícího:

- sekvenci (označenou pd35S-PS-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pd35S viru CaMV, sekvenci kódující signální peptid sporaminu A, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvenci (označenou pd35S-PPS-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pd35S viru CaMV, sekvenci, kódující prepropeptid sporaminu A, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvenci (označenou pd35S-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'^3' promotor pd35S viru CaMV, sekvenci, kódující část signálního peptidů králičí gastrické lipázy, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvenci (označenou pCRU-PS-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pCRU kruciferinu, sekvenci, kódující signální peptid sporaminu A, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 3 a nakonec ____________u k o n če n á-t e r m i n á t o r e m p ó l y A 3-5 S~vi r u C a M V-,____________________________________________

- sekvenci (označenou pCRU-PPS-LGC), obsahující ve směru 5/-).3/ promotor pCRU kruciferinu, sekvenci, kódující prepropeptid sporaminu A, která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvenci (označenou pCRU-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'-»3' promotor pCRU kruciferinu, sekvenci, kódující část signálního peptidů králičí gastrické lipázy (tak, jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou

158 sekvencí znázorněnou na obr. 1 nebo obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvenci (označenou pGEA 1-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'—>3' promotor pGEAl Arabidopsis thaliana, sekvenci, kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, ^f jak byla popsána výše), která je okamžitě následována « nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 nebo na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

V¹

- sekvenci (označenou pGEA6-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pGEAó Arabidopsis thaliana, sekvenci, kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 nebo na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvenci (označenou pAR-IAR-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pAR-IAR rýže, sekvenci, kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 nebo na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV nebo terminátorem polyA NOS Agrobacterium tumefaciens,

- sekvenci (označenou pyzein-PSLGL-LGC), obsahující ve směru 5'->3' promotor pyzein kukuřice, sekvenci, kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou sekvencí znázorněnou na obr. 1 nebo na obr. 3 a nakonec ukončená terminátorem polyA 35S viru CaMV,

- sekvenci (označenou pyzein-PSLGL-LGC-KDEL), obsahující ve směru 5'->3' promotor pyzein kukuřice, sekvenci, kódující část signálního peptidu králičí gastrické lipázy (tak, jak byla popsána výše), která je okamžitě následována nukleotidovou r *·

- 160 -
9- Γ
11. Vektor, zejména plasmid, obsahující nukleotidovou sekvenci podle jednoho z nároků 5, 6, 7 a 9 v místě, které není podstatné pro jeho replikaci.
12. Hostitelská buňka, zejména bakterie jako Agrobacterium tumefaciens, transformovaná vektorem podle nároku 1 0 nebo 11.
13. Způsob výroby rekombinantní psí gastrické lipázy ve formě aktivního enzymu nebo jednoho nebo více polypeptidů, odvozených od této lipázy, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, přičemž tyto polypeptidy vykazují účinek lipázy, vyznačující se tím, že zahrnuje:

- transformaci rostlinných buněk, zejména pomocí hostitelské buňky podle nároku 12, která je sama transformována vektorem podle nároku 10, takovým způsobem, že do genomu buněk je vložena rekombinantní nukleotidová sekvence podle jednoho z nároků 4, 6, 7 a 8,

- v případě potřeby získání transformované rostliny z uvedených transformovaných buněk, _ _ _____

- získání rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo výše uvedeného polypeptidu nebo polypeptidů z ní odvozených, produkované nebo produkovaných uvedenými transformovanými buňkami nebo rostlinami, zejména extrakcí, následovanou v případě potřeby etapou purifikace.
14. Způsob výroby rekombinantní lidské gastrické lipázy ve formě aktivního enzymu nebo jednoho nebo více polypeptidů, odvozených od této lipázy, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo r r

- 161 substitucí jedné nebo více aminokyselin, přičemž tyto polypeptidy vykazují účinek lipázy, vyznačující se tím, že zahrnuj e:

- transformaci rostlinných buněk, zejména pomocí hostitelské buňky podle nároku 12, která je sama transformována vektorem podle nároku 11, takovým způsobem, že do genomu _iff buněk je vložena rekombinantní sekvence podle jednoho z nároků 5, 6, 7 a 9,

- v případě potřeby získání transformované rostliny z uvedených transformovaných buněk,

- získání rekombinantní lidské gastričké lipázy a/nebo výše uvedeného polypeptidu nebo polypeptidů . z ní odvozených, produkované nebo produkovaných uvedenými transformovanými buňkami nebo rostlinami, zejména extrakcí, následovanou v případě potřeby etapou purifikace.
15. Rostliny nebo části rostlin, zejména listy a/nebo plody a/nebo semena a/nebo rostlinné buňky, geneticky transformované, vyznačující se tím, že obsahují jednu nebo více rekombinantních nukleotidových sekvencí podle jednoho z * nároků 4 až 9, které jsou stálým způsobem integrovány do jejich * genomu a v případě potřeby rekombinantní psí gastrickou lipázu ·$· a/nebo rekombinantní lidskou gastrickou lipázu a/nebo jeden nebo více polypeptidů, odvozených od těchto lipáz a že se jedná o rostliny nebo části rostlin, zvláště listy a/nebo plody a/nebo semena a/nebo rostlinné buňky s enzymatickým účinkem a zvláště s účinkem lipázy, zvolené zejména ze souboru zahrnujícího řepku, tabák, kukuřici, hrách, rajské jablko, mrkev, pšenici, ječmen, brambory, sóju, slunečnici, salát, rýži, vojtěšku, řepu nebo části těchto rostlin.

r r

P r r r

- 162 9 • · ·
16. Enzymaticky aktivní rekombinantní psí gastrická lipáza, jejíž sekvence aminokyselin je znázorněna na obr. 2 nebo polypeptidy odvozené od uvedené lipázy, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, jako je polypeptid omezený aminokyselinami, nacházejícími se v ·· polohách 55 až 379, označovaný jako polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid, omezený aminokyselinami, nacházejícími se v polohách 5 až 379 na obr. 2, označovaný jako polypeptid (Δ.4), ₄ přičemž uvedené polypeptidy vykazují účinek lipázy, získané ve formě v podstatě čisté prováděním způsobu podle nároku 13, přičemž tento způsob zahrnuje etapu purifikace rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo výše uvedených odvozených polypeptidů, zejména chromatografií získaných enzymatických extraktů.
17. Enzymaticky aktivní rekombinantní lidská gastrická lipáza, jejíž sekvence aminokyselin je znázorněna na obr. 5 nebo polypeptidy odvozené od uvedené lipázy, zejména adicí a/nebo supresí a/nebo substitucí jedné nebo více aminokyselin, jako je polypeptid omezený aminokyselinami, nacházejícími se v polohách 74 až 398 na obr. 5, označovaný jako polypeptid « (A54LGH) a/nebo polypeptid, omezený aminokyselinami, » nacházejícími se v polohách 24 až 398 na obr. 5, označovaný jako polypeptid (A4LGH), přičemž uvedené polypeptidy vykazují účinek lipázy, získané ve formě v podstatě čisté prováděním způsobu podle nároku 14, přičemž tento způsob zahrnuje etapu purifikace rekombinantní psí gastrické lipázy a/nebo výše uvedených odvozených polypeptidů, zejména chromatografií získaných enzymatických extraktů.

F F

163
18. Rostlinný extrakt s enzymatickým účinkem, získaný prováděním způsobu podle nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní psí gastrickou lipázu a/nebo jeden nebo více polypeptidů, odvozených od této lipázy, jako je polypeptid (Δ54) a/nebo polypeptid (Δ4), definované v nároku 16.
19. Rostlinný extrakt s enzymatickým účinkem, získaný prováděním způsobu podle nároku 14, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní lidskou gastrickou lipázu a/nebo jeden nebo více polypeptidů, odvozených od této lipázy, jako je polypeptid (A54LGH) a/nebo polypeptid (Ů4LGH), definované v nároku 17.
20. Rostlinný extrakt s enzymatickým účinkem podle nároku 18 nebo nároku 19, vyznačující se tím, že hmotnostní procento enzymaticky účinných rekombinantní ch polypeptidů představuje od okolo 0,1 % do 20 % a zejména od okolo 1 % do okolo 15 %, měřeno vzhledem k celkové hmotnosti proteinů, přítomných v uvedeném extraktu, což odpovídá míře enzymatického účinku od okolo 0,5 U na jeden gram čerstvé hmotnosti (PF) listů do okolo 1000 U na gram čerstvé hmotnosti listů, zejména účinku od okolo 10 U na jeden gram čerstvé hmotnosti (PF) listů do okolo 300 U na gram čerstvé hmotnosti listů nebo od okolo 1 U na jeden gram čerstvé hmotnosti semen do okolo 5000 U na gram čerstvé hmotnosti semen, zejména účinku od okolo 10 U na jeden gram čerstvé hmotnosti (PF) semen do okolo 1000 U na gram čerstvé hmotnosti semen.
21. Použití rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen a/nebo buněk, geneticky transformovaných, podle nároku 15 nebo rekombinantní psí • ♦

- 164 9 gastrické lipázy nebo polypeptidů, odvozených od této lipázy podle nároku 16 nebo rekombinantní lidské gastrické lipázy nebo polypeptidů, odvozených od této lipázy podle nároku 17 nebo enzymatických extraktů podle jednoho z nároků 18 až 20, pro získání léčiv, určených k usnadnění absorpce rostlinných nebo živočišných tuků, které požilo individuum, které je buď zdravé nebo zasažené jednou nebo více patologiemi, které ovlivňují nebo neovlivňují úroveň produkce gastrických a/nebo pankreatických lipáz, zejména individuum, které se podrobuje lékařskému působení, měnícímu mechanismus absorpce tuků nebo stará osoba a obzvláště pro získání léčiv, určených pro léčení patologií, vázaných k nedostatečné úrovni lipáz (zejména gastrické lipázy nebo lipáz a/nebo pankreatické lipázy nebo lipáz) v organismu a obzvláště u patologií jako je mucoviscidóza a exokrinní pankreatická nedostatečnost.
22. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje rekombinantní psí gastrickou lipázu a/nebo rekombinantní lidskou gastrickou lipázu a/nebo jeden nebo více polypeptidů, odvozených od těchto lipáz podle nároku 16 nebo podle nároku 17 a/nebo jeden nebo více enzymatických extraktů podle jednoho z nároků 18 až 20, v případě potřeby v asociaci s farmaceuticky přijatelným vehikulem.
23. Použití rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen a/nebo rostlinných buněk, geneticky transformovaných, podle nároku 15, nebo rekombinantní psí gastrické lipázy nebo polypeptidů, odvozených od této lipázy podle nároku 16 nebo rekombinantní lidské gastrické lipázy nebo polypeptidů, odvozených od této lipázy podle nároku 17 nebo enzymatických extraktů podle jednoho z nároků 18 až 20, r r r '

9 9

- 165 - pro získání lidské potravy nebo krmivá pro zvířata, zejména funkční potravy nebo krmivá určeného obzvláště k usnadnění absorpce živočišných nebo rostlinných tuků, které požilo individuum, které je buď zdravé nebo zasažené jednou nebo více patologiemi, které ovlivňují nebo neovlivňují úroveň produkce gastrických a/nebo pankreatických lipáz.

e
24. Funkční potrava nebo krmivo, vyznačující se tím, že , zahrnuje jednu nebo více rostlin a/nebo částí této nebo těchto rostlin podle nároku 15 a/nebo rekombinantní psí gastrickou lipázu a/nebo rekombinantní lidskou gastrickou lipázu a/nebo

- jeden nebo více polypeptidů, odvozených od těchto lipáz podle nároku 16 nebo podle nároku 17 a/nebo jeden nebo více enzymatických extraktů podle jednoho z nároků 18 až 20.
25. Použití rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen a/nebo rostlinných buněk, geneticky transformovaných, podle nároku 15, nebo rekombinantní psí gastrické lipázy nebo polypeptidů, odvozených od této lipázy podle nároku 16 nebo rekombinantní lidské gastrické lipázy nebo polypeptidů, odvozených od této lipázy podle nároku 17 f nebo enzymatických extraktů podle jednoho z nároků 18 až 20, pro provádění enzymatických reakcí v průmyslové agroalimentární nebo zemědělsko-průmyslové oblasti, zejména v ft průmyslu mastných látek, v lipochemii a mlékárenství.
26. Způsob, zejména enzymatická biokonverze nebo biokatalýza, provádění jedné nebo více enzymatických reakcí v průmyslové, agroalimentární nebo zemědělsko-průmyslové oblasti, zejména v průmyslu mastných látek, v lipochemii a mlékárenství, přičemž uvedené enzymatické reakce jsou

166 _{Γ r} Γ 9 r r- · <·<<· r - f r 9 f * ^r ' ;

r r /9^9 rrr r r r r *r - · r ^r ' ^r ' prováděny s využitím rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen a/nebo rostlinných buněk, geneticky transformovaných, podle nároku 15, nebo rekombinantní psí gastrické lipázy nebo polypeptidů, odvozených od této lipázy podle nároku 16 nebo rekombinantní lidské gastrické lipázy nebo polypeptidů, odvozených od této lipázy podle nároku 17 nebo enzymatických extraktů podle jednoho z nároků 18 až 20.
27. Enzymatické přípravky určené pro průmyslovou, agroalimentární nebo zemědělsko-průmyslovou oblast, které mohou být použity v rámci provádění způsobu podle nároku 26 a zahrnující jeden nebo více rostlinných extraktů s enzymatickým účinkem podle jednoho z nároků 18 až 20 a/nebo rekombinantní psí gastrickou lipázu a/nebo rekombinantní lidskou gastrickou lipázu a/nebo jeden nebo více polypeptidů, odvozených od těchto lipáz podle nároku 16 nebo 17.
28. Použití rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen a/nebo rostlinných buněk, geneticky transformovaných, podle nároku 15, pro provádění γ průmyslovém měřítku reakcí enzymatické biokonverze nebo biokatalýzy, jako jsou například hydrolýzy nebo enzymatická · transesterifikace.
29. Způsob provádění biokatalýzy, používající rostliny nebo části rostlin, zejména listy a/nebo plody a/nebo semena a/nebo rostlinné buňky, geneticky transformované, podle nároku 15, ve kterém jsou uvedené rostliny nebo uvedené části rostlin nebo buňky nebo semena používány současně jako enzymatický zdroj a jako reakční substrát.

167 r ' ⁹ r - ⁹t ‘9
30. Použití rostlin nebo částí rostlin, zejména listů a/nebo plodů a/nebo semen a/nebo rostlinných buněk, geneticky transformovaných, podle nároku 15, pro získání biopaliva.
31. Způsob získání biopaliv adicí alkoholu, zejména methanolu nebo ethanolu, k rozdrceným rostlinám nebo částem rostlin, geneticky transformovaným, podle nároku 15 a získáním * biopaliv, zejména filtrací.

ír
32. Estery mastných kyselin rostlinného původu, získané prováděním způsobu podle nároku 31, zejména methylester kyseliny olejové.
33. Biopalivo, získané prováděním způsobu podle nároku 31 a obsahující estery mastných kyselin rostlinného původu, zejména methylester kyseliny olejové.