CN1185178A - 植特产生的重组前十二指肠酶和多肽衍生物、及其制备方法和用途 - Google Patents

植特产生的重组前十二指肠酶和多肽衍生物、及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及应用含编码重组前十二指肠脂酶的cDNA或任何衍生自该cDNA的序列的重组核苷酸序列,转化植物细胞以获得重组前十二指肠脂酶或多肽衍生物。本发明还涉及遗传改造植物或其部分,或这些植物的提取物或重组前十二指肠脂酶或所得多肽衍生物在食品、或药物生产、或工业领域中的应用。

Description

植物产生的重组前十二指肠脂酶和多肽衍生物、及其制备方法和用途
本发明涉及通过植物产生重组前十二指肠脂酶(尤其是重组胃脂酶)的方法，涉及其具有脂酶活性的其他多肽衍生物，还涉及其应用，尤其是作为功能性食物或在药物组合物中或在农业食品或工业应用的酶配制物中。
狗胃脂酶(DGL)是一种分子量约为50千道尔顿(kDa)的379个氨基酸(AA)的糖蛋白，以氨基末端(NH2-末端)含信号肽的前体形式被合成，由狗胃的基底粘膜半数细胞分泌(Carrière F.等，1991)。
人胃脂酶(HGL)以前体形式天然合成，在Bodmer等(1987)的出版物中有述。成熟的HGL蛋白由379个氨基酸组成。信号肽(HGLSP)由19个氨基酸组成。
这些酶属于称为“前十二指肠”的脂酶家族，其中一些成员已被纯化，有些甚至已被克隆(Docherty A.J.P.等，1985；Bodmer M.W.等，1987；Moreau H.等，1988；欧洲专利0191061和0261016)。
长期以来，人们想当然地认为食物液的水解是在胰腺产生的酶作用下发生在小肠中(Bernard C.，1849)。
但是一些发现已提示甘油三酯的水解可能在前十二指肠酶的间接作用下发生在胃中(Volhard，F.，1901；Shonheyder，F.和Volquartz，K.，1945)。这些酶，尤其是狗胃脂酶具有区别于哺乳动物胰脂酶的酶学和物理化学性质。胃脂酶和胰脂酶的这些差别主要涉及以下几点：分子量、氨基酸组成、对胃蛋白酶的抗性、底物特异性、最适作用pH和在酸性介质中的稳定性。
但在体外某些条件下，胃脂酶和胰脂酶间可能显示对长链甘油三酯水解的协同作用(Gargouri，Y.等，1989)。
已知几种病理状态(胆囊纤维样变性、胰腺外分泌不足)中，病人完全或部分缺乏胰腺外分泌，从而缺乏水解食物所必需的酶(淀粉酶、脂酶、蛋白酶)。小肠中脂肪(尤其是长链甘油三酯)不吸收在这些病人中表现为皮脂溢非常明显地升高，在年轻病人中表现为非常令人关注的体重增长减慢。为了纠正这一状态，在进食时给予这些主体猪胰提取物。这种提取物的疗效经同时服用DGL可明显改善，这是因为后者对长链甘油三酯的特异性作用。
Carriere等(1991)的文章描述了DGL的纯化和NH2-末端序列的确定。该出版物中还描述了从狗胃中提取该酶的方法。该方法基本包括：在存在水溶性盐的酸性介质(pH2.5)中浸提狗的胃，水溶性盐可促进脂酶在所述介质中盐析。经分子筛过滤和离子交换层析步骤可将DGL纯化至均质。经这些方法获得的纯化DGL是分子量为49000D的糖蛋白，其中糖部分占6000，蛋白占43000。
难以弄到狗胃这一明显原因阻碍了这一方法在实验室和工业中的任何发展。这就需要发现一种能大量生产DGL而无需使用狗胃的方法。
测定DGL的核苷酸和肽序列以便用基因工程方法工业生产DGL。这些工作是1993年12月16日提交的国际申请WO94/13816的主题。
该国际申请中描述的重组DGL的生产方法以大肠杆菌作为生产DGL的转化宿主细胞。
在用大肠杆菌生产重组DGL的过程中遇到了一些难题，特别是需要在发酵罐中培养大量的大肠杆菌，费用高，这导致发明人寻求生产DGL的其他方法。
哺乳动物细胞当然更适合哺乳动物基因的表达。但这种应用产生蛋白成熟化的问题。实现翻译后成熟化的酶系统在组织间、器官间或种间各不相同。例如，已报道，如果从人血中获得蛋白或如果从重组细胞产生蛋白，如中国仓鼠卵巢细胞，或在转基因动物奶中获得蛋白，血浆蛋白质的翻译后成熟化并不相同。而且，哺乳动物细胞的表达水平低，需体外非常大体积地培养，费用很高。在转基因动物(小鼠、绵羊和奶牛)的奶中生产重组蛋白能降低生产费用并克服表达水平的问题。但仍有伦理问题和病毒、亚病毒(朊病毒)污染的问题。
由于这些原因，将哺乳动物基因转基因至植物细胞中，提供了一条大量生产新的重组蛋白的途径，生产费用降低，而且无病毒或亚病毒污染的危险。
几个实验室于1983年发现，可能将外源基因转移到植物细胞的基因组中(Bevan等，1983；Herrera-Estrella等，1983，a和b)并从这些遗传改造的细胞再生转基因植物。这样，所有的植物细胞都具有遗传改造的特征，并且经过有性受精传递给后代。
这些工作的结果是，许多实验组致力于在植物细胞或在转基因植物中生产哺乳动物重组蛋白(Barta等，1986；Marx，1982)。这一领域中最早令人关注的结果之一是在转基因烟草植物中生产抗体(Hiatt等，1989)。
为了在种子(蛋白在植物中的储存位点)中表达外源蛋白，Vandekerckhove工作组(1989)将Leu-脑啡肽的编码序列融合到编码Arabidopsis thaliana的2S白蛋白的基因上。应用这一结构，获得了在种子中以总蛋白0.1％左右的表达水平特异表达Leu-脑啡肽的转基因油菜植物。Sijmons及其同事于1990年将人血清白蛋白的基因转移到烟草和马铃薯的细胞中。无论信号肽的来源如何(植物或人)，在马铃薯叶、茎和块根中以总蛋白0.02％左右的水平获得了人血清白蛋白。
还在植物中生产了其他哺乳动物重组蛋白：乙型肝炎表面抗原(Mason等，1992)、干扰素(De Zoeten等1989；Edelbaum等，1992；Truve等，1993)；鼠抗链球菌变体抗体，龋齿药物(Hiatt和Ma，1992；Ma等，1994)，抗癌细胞抗体scFC片段(RusselD.，1994)，抗疱疹抗体(Russel D.，1994)，水蛭素(Moloney等，1994)，霍乱毒素(Hein R.，1994)，和人表皮生长因子(EGF)(Higo等，1993)。
所有这些研究表明，在植物细胞中产生重组蛋白是可能的，在动物细胞中从DNA序列到合成蛋白的机制是相似的。但在植物和动物细胞间存在一些差异，尤其是从多甘露糖苷聚糖到复杂聚糖的成熟化，或信号肽的切割位点，因而不能保证通过转化在植物细胞中获得有足够活性的哺乳动物蛋白。
本发明者已证明利用以适当重组核苷酸序列转化的植物细胞，能获得具有在工业应用中能开发利用的足够酶活性的重DGL或重组HGL或从中衍生的多肽。
本发明的目的是提供一种用植物生产具有酶活性(特别是脂酶活性)的哺乳动物重组前十二指肠脂酶，尤其是重组DGL或HGL，或其衍生多肽的新方法，所述重组脂酶或其衍生多肽可用于工业中。
本发明的另一目的是提供实施这一方法的工具，特别是新的重组核苷酸序列，遗传转化的植物细胞，遗传转化的植物或植物部分(尤其是叶、茎、果实、种子或谷拉、根)和这些植物或植物部分的遗传转化的碎片。
本发明的目的还在于提供新的哺乳动物重组前十二指肠脂酶或任何衍生多肽，它们具有酶活性，得自遗传转化的植物细胞或植物。
本发明的目的还在于提供可用于进行酶促反应(尤其是工业规模的)的新酶组合物。
本发明的目的还在于提供新的药物组合物，尤其用于治疗机体脂酶水平缺陷的相关疾病，如胆囊纤维样变性。
本发明的另一目的是提供新的燃料，也称为生物燃料，其具有比石油燃料污染小和生产费用低的优点。
借助下列附图说明本发明：
-图1显示cDNA的核苷酸序列，其中位于1-1137位核苷酸编码图2所示、相应于SEQ ID NO 2的DGL。
-图2显示DGL的氨基酸序列，相应于SEQ ID NO 2。
-图3显示衍生自图1所示cDNA的核苷酸序列，相应于SEQ ID NO1，所述衍生序列的1-1137位的核苷酸编码如图2所示并相应于图2的DGL。
-图4显示cDNA的核苷酸序列，其中位于47-1240位的核苷酸编码398个氨基酸的HGL前体，104-1240位的核苷酸编码379个氨基酸的成熟HGL。
-图5显示HGL的氨基酸系列，HGL前体由1-398位氨基酸界定，成熟HGL由20-398位氨基酸界定。
-图6、7、8显示本发明重组序列转化的Xanthi烟草叶和种子，油菜种子和马铃薯叶和果实所产生重组多肽的“western”型免疫检测试验的结果。
-图9和10分别显示抗从烟草叶纯化的DGL的抗脂酶抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和该胶转移到硝酸纤维素膜上的结果。
-图11显示膜上检测重组DGL糖残基的一个例子。
-图12显示纯化自油菜种子的DGL的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
-图13、14和15显示用本发明转化的种子对油酸甲酯进行的各种试验。
本发明涉及一种重组核苷酸序列转化植物细胞以从这些细胞或从这些细胞所获植物中获得活性酶形式的哺乳动物重组前十二指肠脂酶或一种(或多种)从后者衍生而来的如下定义的多肽的用途，所述重组核苷酸序列一方面含有编码任何哺乳动物前十二指肠脂酶的cDNA，即其编码核苷酸序列有至少约75％，特别是约77％-85％同源性，其氨基酸序列具有至少70％，特别是约80％-90％的同源性，且具有耐酸特性，在pH约1-5以下，特别是pH约1.5-2以下具有活性的脂酶，特别是编码任何哺乳动物胃脂酶的cDNA，或编码从上述前十二指肠脂酶经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸所衍生的任何多肽的cDNA，该衍生多肽具有如上所述的前十二指肠脂酶的特征；另一方面含有允许植物细胞产生所述cDNA编码的前十二指肠脂酶、或产生如上所定义的衍生多肽的元件，特别是被植物细胞转录机制所识别的转录启动子和转录终止子。
本发明特别涉及一种重组核苷酸序列转化植物细胞以从这些细胞或从这些细胞所获得植物中获得活性酶形式的重组DGL或一种(或多种)从后者衍生而来的如下定义的多肽的用途，所述重组核苷酸序列一方面含有如图2所示狗胃脂酶(DGL)的如图1所示cDNA，或从该cDNA衍生的核苷酸序列，特别是经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)核苷酸而衍生，所述衍生序列能够编码一种氨基酸序列与图2所示DGL相同的多肽，或编码从DGL经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允许植物细胞产生所述cDNA或上述衍生序列所编码多肽的元件，特别是被植物细胞转录机制(特别是植物细胞的RNA聚合酶)所识别的转录启动子和转录终止子。
本发明还涉及含有如图1所示cDNA或如上所述从所述cDNA衍生的核苷酸序列的任何重组核苷酸序列。
这方面，本发明特别涉及含图1所示cDNA的如上所述任何重组核苷酸序列，所述cDNA编码如图2所示的狗胃脂酶(DGL)。
本发明还特别涉及含图1所示cDNA所衍生核苷酸序列的上述任何重组核苷酸序列，所述衍生核苷酸序列如上所定义并编码图2中所示的狗胃脂酶(DGL)。这种衍生序列最好如图3所示，相应于图1所示序列，但其中12位核苷酸的A被G所代替，13位核苷酸T被C所代替，15位核苷酸A被T所代替。
本发明的重组核苷酸序列最好含有一个(或多个)负责将本发明的多肽(即重组DGL或上述衍生多肽)引向植物细胞特定腔室中的肽的编码序列，特别是引向内织同或液泡，或细胞外的果胶纤维素壁或细胞外空间(也称为质外体)。
在可用于本发明的植物细胞转化的转录终止子中可提及Franck等(1980)的文章中描述的花椰菜叶病毒(CaMV)的多聚A 35S终止子，或多聚A NOS终止子，后者相当于土壤根瘤杆菌产生胭脂碱菌株Ti质粒胭脂碱合成酶基因的3′-非编码区(Depicker等，1982)。
关于这方面，本发明涉及在所述cDNA或其衍生序列的下游含多聚A35S终止子或土壤根瘤杆菌的多聚A NOS终止子的上述任何重组核苷酸序列。
在可用于本发明的植物细胞转化的转录启动子中，可提及：
-CaMV的35S启动子或最好35S双结构启动子(pd35S)，这些启动子允许从本发明转化细胞获得的整个植物中表达本发明的重组多肽，并在Kay等(1987)的文章中有描述，
-小萝卜(radish)cruciferin基因的pCRU启动子，它允许只在本发明转化细胞所得植物的种子(或谷粒)中表达本发明的重组多肽，并在Dwepigny-This等(1992)的文章中有描述，
-分别相当于Arabidopsis thaliana储备蛋白基因GEA1和GEA6的5’非编码区的pGEA1和pGEA6启动子(Gaubier等，1993)，其允许谷粒中的特异性表达，
-作为嵌合启动子的超级启动子pSP(pCT/US 94/12946)，它由根瘤土壤杆菌章鱼碱合成酶基因的三个转录活化子、甘露碱合成酶基因启动子的转录活性元件和根瘤土壤杆菌甘露碱合成酶启动子融合而构成。
-McElroy等(1991)所述含于质粒pActl-F4中的后接稻actine内含子的稻actine启动子(pAR-IAR)，
-Reina等(1990)所述含于质粒pγ36中的玉米γzeine基因启动子(pγzeine)，其允许在玉米种子胚乳中表达。
关于这一点，本发明涉及在所述cDNA或其衍生序列上游含有CaMV双结构启动子(pd35S)，或radish cruciferin基因pCRU启动子，或Arabidopsis thaliana的pGEA1或pGEA6启动子，或根瘤土壤杆菌超级启动子pSP，或稻的pAR-IAR启动子，或玉米的Pγzeine启动子的上述任何重组核苷酸序列。
用于本发明的引导肽的编码序列可源自植物、人或动物。
植物来源的引导肽编码序列中，可提及：
-甜马铃薯中编码sporamin A 23个氨基酸前肽(信号肽)的69个核苷酸的核苷酸序列(在以下的实施例中描述)，该信号肽允许本发明的重组多肽进入本发明转化植物细胞的分泌系统(简单地讲是进入内织网)，
-甜马铃薯中编码sporamin A N-末端14个氨基酸的液泡引导原肽的42个核苷酸的核苷酸序列(在以下的实施例中描述)，其允许本发明的重组多肽在本发明的转化植物细胞的液泡中积累，
-编码由上述信号肽N-末端部分到C-末端部分23个氨基酸和其后的上述原肽14个氨基酸所组成的sporamin A 37个氨基酸前原肽的111个核苷酸的核苷酸序列(在以下的实施例中描述)，该前原肽允许本发明的重组多肽进入本发明转化植物细胞的分泌系统及在液泡中积累，上述三个序列在Murakami等(1986)和Matsuoka和Nakaura(1991)的文章中有描述，
-大麦植物血凝素的羧基末端原肽，特别在Schroeder等(1993)和Bedharek和Ralkhel(1991)的文章中有描述。
人或动物来源的引导肽编码序列中可提及编码人胃脂酶(HGL)信号肽的序列(如欧洲专利0191061中所述)，或编码兔胃脂酶信号肽的序列(如欧洲专利申请0542629中所述)，其序列在下述实施例中给出，或人胰脂酶(HPL)的或狗胃脂酶(DGL)的信号肽编码序列。
对引导肽的编码序列还可提及编码四肽KDEL并可引导至内织网的序列。
关于这一点，本发明涉及在所述cDNA或其衍生序列上游和所用启动子下游的含有全部或部分信号肽编码序列的上述任何重组核苷酸序列，如甜马铃薯的sporaminA信号肽或HGL的或RGL的或DGL的信号肽，使所述重组核苷酸序列编码的蛋白中，信号肽的C-末端最后一个氨基酸与所述cDNA或其衍生序列编码的多肽N-末端第一个氨基酸连接。
本发明还涉及在信号肽编码序列和所述cDNA或其衍生序列之间含有编码全部或部分液泡引导肽的序列的上述任何重组核苷酸序列，所述引导序列尤其为甜马铃薯的sporamin A液泡引导序列，编码液泡引导肽，这样使得所述重组核苷酸序列编码的蛋白中，液泡引导肽的N-末端第一个氨基酸与信号肽的C-末端最后一个氨基酸连接，所述引导肽的C-末端氨基酸与所述cDNA或其衍生序列所编码多肽的N-末端第一个氨基酸连接。
本发明还涉及在所述cDNA或其衍生序列下游含有编码全部或部分液泡引导肽的序列的上述任何重组核苷酸序列，所述引导肽尤其为大麦植物血凝素的液泡引导肽，编码液泡引导肽，这样使得所述重组核苷酸序列编码的蛋白中，液泡引导肽的N-末端第一个氨基酸与所述cDNA或其衍生序列编码的多肽C-末端最后一个氨基酸连接。
本发明更特别涉及下列重组核苷酸序列：
-在5’→3’方向上含有CaMV pd35S启动子，sporamin A信号肽编码序列，紧随后者的图3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pd35S-PS-DGL)，
-在5’→3’方向上含有CaMV pd35S启动子，sporamin A前原肽编码序列，紧随后者的图3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pd35S-PPS-DGL)，
-在5’→3’方向上含有CaMV pd35S启动子，RGL信号肽的一部分(即如下述实施例中所示的其头19个氨基酸组成的序列，编码最后3个C末端氨基酸的9个氨基酸缺失)，紧随后者的图1所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pd35S-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU启动子，sporamin A信号肽编码序列，紧随后者的图3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pCRU-PS-DGL)，
-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU启动子，sporamin A前原肽编码序列，紧随后者的图3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pCRU-PPS-DGL)，
-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pCRU-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有Arabidopsis thaliana的pGEA1启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pGEA1-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有Arabidopsis thaliana的pGEA6启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pGEA6-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有稻pAR-IAR启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S或根瘤土壤杆菌的多聚A NOS终止子的重组核苷酸序列(称为pAR-IAR-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有玉米pγzeine启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pγzeine-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有玉米pγzeine启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，四肽KDEL的编码序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL)。
本发明的重组核苷酸序列最好还含有可用作所述重组序列标记的核苷酸序列，尤其为了区别(从而选择)被所述重组序列转化的植物细胞和未转化的细胞。
可用作所述重组序列标记的核苷酸序列优先选自抗生素抗性基因，特别是卡那霉素抗性基因。
本发明还涉及在其复制非关键性位点上插入了本发明重组核苷酸序列的任何载体，特别是质粒载体。
本发明还涉及用如上所定义的载体转化的任何宿主细胞，特别是任何细菌，如根瘤土壤杆菌。
本发明还涉及活性酶形式重组DGL和/或尤其通过插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸而从中衍生的具有脂酶活性的一种(或多种)多肽的任何制备方法，其特征在于它包括：
-转化植物细胞使一种(或多种)本发明的重组核苷酸序列被整合在这些细胞的基因组中，
-适当时从上述转化细胞产生转化植物，
-特别通过提取，然后适当时纯化，回收所述细胞中或上述转化植物中产生的重组DGL和/或上述衍生多肽。
根据本发明上述方法的一种实施方案，通过将本发明的重组核苷酸序列转移至原生质中进行植物细胞的转化，特别是按Kreis等(1982)的文章中描述的方法在存在二价阳离子(Ca2+)的聚乙二醇(PEG)溶液中培养原生质后。
植物细胞的转化还可以通过电穿孔法进行，尤其是按Fromm等(1986)的文章中描述的方法。
植物细胞转化还可以用基因枪进行，基因枪可将包被有本发明重组核苷酸序列的金属颗粒以非常高的速度投射，从而将基因输入细胞核中，特别按Sanford(1988)的文章中描述的技术。
植物细胞转化的另一方法是如De La Penna等(1987)的文章中所述的细胞浆或细胞核微注射。
根据本发明上述方法的一个特别优选的实施方案，将植物细胞与用本发明载体转化的细胞宿主放在一起，所述细胞宿主能感染所述植物细胞，使原本含于上述载体基因组中的本发明重组核苷酸序列整合在植物细胞基因组中，从而使植物细胞转化。
上述细胞宿主最好是根瘤土壤杆菌，特别按Bevan(1984)和An等(1986)的文章中描述的方法，或为毛根土壤杆菌，特别按Jouanin等(1987)的文章中所述方法。
可在本发明中被转化的植物细胞中，可提及油菜、烟草、玉米、豌豆、胡萝卜、小麦、大麦、马铃薯、大豆、向日葵、莴苣、稻和苜蓿的细胞。
根据上述本发明方法的一种实施方案，在体外(特别是在生物反应器)中培养本发明转化的植物细胞，按Brodelius(1988)的文章中所述方法在液体培养基中培养，或按Brodelius等(1979)的文章中所述方法以固定化形式培养，或按Deno等(1987)的文章中所述方法体外培养转化的根。
然后收集上述体外培养基，以从中提取及适当时纯化(特别通过层析)所述转化细胞体外培养所产生的如上所定义的重组DGL和/或衍生多肽。
按照本发明重组DGL和/或衍生多肽的上述制备方法的一个优选实施方案，植物细胞转化后有一个在适当培养基中培养所述转化细胞产生转化植物的步骤。通过对整个植物或这些植物的部分(尤其是叶、茎或果实)，或对这些植物产的种子进行提取，获得所得整个植物的细胞所产生的重组DGL和/或衍生多肽，所述提取之后适当时进行重组DGL和/或衍生多肽的纯化。
用于在本发明上述方法中收获重组DGL和/或衍生多肽的转化植物是T0代植物，即本发明的转化细胞在适当培养基中培养所得到的植物，或最好为前代植物通过自授粉而得的后代植物(T1、T2等)，其中本发明的重组核苷酸序列按孟德尔法则复制。
实施本发明方法可获得的衍生自重组DGL的多肽中，可提及：
-由图2中位于55和379位氨基酸界定的多肽，也称为多肽(Δ54)，由SEQ ID NO 4代表，所述多肽由SEQ IF NO 3代表的核苷酸序列编码，
-由图2中位于5和379位氨基酸界定的多肽，也称为多肽(Δ4)，由SEQ ID NO 6代表，所述多肽由SEQ ID NO 5代表的核苷酸序列编码。
本发明还特别涉及制备图2所示重组DGL，适当时制备一种(或多种)衍生多肽，特别是上述多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的如上所述方法，所述方法的特征在于在植物细胞基因组中整合一方面含有图1所述cNDA，另一方面含有RGL 22氨基酸信号肽的编码序列(最好是RGL信号肽头19个氨基酸的编码序列)的上述重组序列来进行所述植物细胞的转化。
本发明特别涉及制备图2所示重组DGL，适当时多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的如上所述方法，其特征在于它包括：
-转化植物叶的外植体细胞，将后者与含有上述重组核苷酸序列pd35S-RGLSP-DGL的上述质粒转化的根瘤土壤杆菌菌株在适当培养基中接触，
-在含有卡那霉素的培养基上选择转化的外植体，
-上述转化的外植体在适当培养基中培养，产生转化植物，
-提取重组DGL和适当时的多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特别是通过在适当缓冲液中研磨上述转化植物的叶和/或种子和/或果实，离心并收集构成酶活性植物提取物的上清液，
-适当时从上步所得提取物纯化重组DGL，特别是通过对上清液进行层析，导致制备基本纯的重组DGL。
本发明还涉及上述方法用于制备基本纯的多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，其中从上述方法中所得提取物中纯化所述多肽，特别是对提取上清液进行层析。
本发明还特别涉及上述多肽(Δ4)的制备，适当时制备基本纯的多肽(Δ4)，其中实施上述方法，该方法中用pd35S-RGLSP-DGL序列转化的细胞为茄科(特别是烟草或番茄)的外植体细胞。
根据上述方法的一个实施方案，从上述转化的烟草植物叶提取可特异性获得多肽(Δ4)，特别是在适当缓冲液中研磨这些叶子，离心并收集上清液。然后可从含有所述多肽(Δ4)的叶提取物中纯化多肽(Δ4)，特别是对所述上清液进行层析。
本发明特别涉及制备重组DGL和/或如上定义的从中衍生的一种(或多种)多肽的上述方法，其特征在于在植物细胞细胞基因组中整合入一方面含有图3所示核苷酸序列另一方面含有上述sporamin A信号肽编码序列的序列，进行植物细胞的转化步骤。
实施上述方法可获得的衍生自重组DGL的多肽中，可提及上述多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)。
本发明特别涉及上述重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的制备方法，其特征在于它包括：
-转化植物的外植体细胞(特别是叶的外植体)，将后者与含有重组核苷酸序列pd35S-PS-DGL和/或pd35S-PPS-DGL的上述质粒转化的根瘤土壤杆菌菌株接触，
-在含有卡那霉素的培养基上选择转化的外植体，
-上述转化的外植体在适当培养基中培养，产生转化植物，
-提取重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特别是通过在适当缓冲液中研磨上述转化植物的叶和/或种子和/或果实，离心并收集构成酶活性植物提取物的上清液，
-适当时从上步所得提取物纯化重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特别是通过对上清液进行层析，导致制备基本纯的重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)。
本发明还特别涉及上述多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的制备，其中实施上述方法，该方法中转化的细胞为茄科(特别是烟草或番茄)的外植体细胞。
根据本发明上述方法的一个特别的实施方案，从上述转化的烟草植物种子提取物中可特异性获得多肽(Δ54)，特别是在适当缓冲液中研磨这些种子，离心并回收上清液。然后可从含有所述多肽(Δ54)的上述种子提取物中纯化多肽(Δ54)，特别是对所述上清液进行层析。
本发明特别涉及制备重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的方法，其特征在于它包括：
-转化植物的外植体细胞，将后者与含有重组核苷酸序列pCPU-PPS-DGL和/或序列pCRU-PS-DGL和/或序列pGEA1-RGLSP-DGL和/或序列pGEA6-RGLSP-DGL和/或序列pAR-IAR-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL的上述质粒转化的根瘤土壤杆菌菌株接触，
-在含有卡那霉素的培养基上选择转化的外植体，
-上述转化的外植体在适当培养基中培养，产生转化植物，
-提取重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特别是通过在适当缓冲液中研磨上述转化植物的叶和/或种子和/或果实，离心并收集构成酶活性植物提取物的上清液，
-适当时从上步所得提取物纯化重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特别是通过对上清液进行层析，导致制备基本纯的重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)。
本发明特别涉及通过实施上述方法制备上述多肽(Δ54)的方法，其中转化的细胞是油菜和烟草的外植体细胞，通过研磨转化的种子而提取多肽(Δ54)。
上述方法中转化植物细胞最好选自烟草、油菜、玉米、豌豆、胡萝卜、小麦、大麦、马铃薯、大豆、向日葵、莴苣、稻和苜蓿的细胞。
本发明的一更特别的目的是重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的制备方法，其特征为在于它包括：
用带有含重组核苷酸序列pAR-IAR-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL的质粒的基因枪轰击，转化玉米愈伤组织，
-在含有选择试剂如卡那霉素的培养基上挑选转化的愈伤组织，
-在适当培养基中培养，从上述转化的愈伤组织产生转化的玉米植物，
-提取重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特别是通过在适当缓冲液中研磨上述转化植物的叶和/或种子和/或果实，离心并收集构成酶活性植物提取物的上清液，
适当时从上步所得提取物纯化重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特别是通过对上清液进行层析，导致制备基本纯的重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)。
本发明还涉及在其基因组中稳定地整合有一种(或多种)本发明上述重组核苷酸序列的任何遗传转化的植物细胞。
本发明还涉及含有一种(或多种)本发明重组多肽如重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的上述任何转基因植物细胞，所述植物细胞也称为酶活性(特别是如下定义的脂酶活性)植物细胞。
本发明还涉及在其基因组中稳定地整合有一种(或多种)本发明上述重组核苷酸序列的遗传转化种子。
本发明还涉及含有一种(或多种)本发明重组多肽如重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的上述任何转基因种子，所述种子也称为酶活性(特别是如下定义的脂酶活性)种子。
本发明的转化种子是从本发明的遗传植物收获的那些，这些转化植物为本发明转化细胞培养产生的上述T0代植物，或通过前代自授粉或植物杂交获得的后代植物(T1、T2等)(如上所示)。
本发明还涉及遗传转化的植物或植物部分(特别是外植体、茎、叶、根、花粉等)，特征在于在其基因组中稳定地整合有一种(或多种)本发明的上述重组核苷酸序列。
本发明还涉及含有一种(或多种)本发明重组多肽如重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的上述任何转基因植物或植物部分，所述植物或植物部分也称为酶活性(特别是如下定义的脂酶活性)植物或植物部分。
本发明特别涉及培养本发明的上述细胞或种子所获得的上述转化植物。
本发明的转化植物或植物部分最好选自油菜、烟草、玉米、豌豆、胡萝卜、小麦、大麦、马铃薯、大豆、向日葵、莴苣、稻和苜蓿，或这些植物的某些部分。
本发明涉及任何酶活性的特别是如下定义的脂酶活性的植物提取物，其通过实施上述本发明方法之一而制得，含有一种(或多种)本发明的重组多肽如重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)作为活性酶。
本发明植物或植物部分和酶活性提取物的脂酶(或脂解)活性，特别可按Gargouri的方法(Gargouri等，1986)用短链甘油三酯(如三丁精)作为底物而测定。酶活性用单位U表示，一个单位U相当于在37℃最佳pH条件下每分钟释放1μmmol游离脂肪酸所需酶量。
本发明酶活性植物提取物中酶活性重组多肽的重量百分比优选为这些提取物中总蛋白重量的约0.1-20％，特别是约1-15％，这相当于有0.5U/克叶鲜重(FW)到1000U/g叶鲜重，特别是约10-300U/g叶鲜重，或约1-5000U/g种子鲜重，特别是约10-1000U/g种子鲜重的酶活性水平。
本发明特别涉及下列酶活性植物提取物：
*用序列pd35S-RGLSP-DGL或序列pd35S-PS-DGL或序列pd35S-PPS-DGL按上述方法之一转化植物的外植体细胞所获植物的叶和/或种子和/或果实的提取物，其中含有重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特别是：
-用序列pd35S-PS-DGL或序列pd35S-PPS-DGL按上述方法转化烟草叶外植体细胞所得烟草叶的提取物，其中含有多肽(Δ54)和多肽(Δ4)，这两种多肽的混合物相对所述提取物中蛋白总重的重量百分比约为0.1-20％，所述提取物的酶活性约为100-300U/g鲜重，
-用序列pd35S-PS-DGL或序列pd35S-PPS-DGL按上述方法转化番茄叶或果实的外植体细胞所得番茄叶或果实的提取物，其中含有多肽(Δ54)和多肽(Δ4)，这两种多肽的混合物相对所述提取物中蛋白总重的重量百分比约为0.1-20％，所述提取物的酶活性约为100-300U/g鲜重，
-用序列pd35S-RGLSP-DGL按上述方法转化烟草叶外植体细胞所得烟草叶的提取物，其中含有多肽(Δ4)，该多肽相对所述提取物中蛋白总重的重量百分比约为0.1-20％，所述提取物的酶活性约为100-300U/g鲜重，
-用序列pd35S-PPS-DGL按上述方法转化烟草叶外植体细胞所得烟草叶的提取物，其中含有多肽(Δ54)，该多肽相对所述提取物中蛋白总重的重量百分比约为0.1-1％，所述提取物的酶活性约为10-300U/g鲜重，
*用序列pCPU-PS-DGL或序列pCRU-PPS-DGL，或序列pGEA1-RGLSP-DGL，或序列pGEA6-RGLSP-DGL按上述方法之一转化植物的外植体细胞所获植物种子的提取物，其中含有重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特别是：
-用序列pCPU-PS-DGL或序列pCRU-PPS-DGL，或序列pGEA1-RGLSP-DGL，或序列pGEA6-RGLSP-DGL按上述方法转化油菜叶外植体细胞所得油菜种子的提取物，其中含有多肽(Δ54)，该多肽相对所述提取物中蛋白总重的重量百分比约为0.1-1％，所述提取物的酶活性约为10-1000U/g鲜重，
*用序列pAR-IAR-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL按上述方法之一转化植物的外植体细胞所获植物种子的提取物，其中含有重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，特别是：
-用序列pAR-IAR-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL-KDEI按上述方法转化油菜叶外植体细胞所得油菜种子的提取物，其中含有多肽(Δ54)，多肽(Δ54)相对所述提取物中蛋白总重的重量百分比约为0.1-1％，所述提取物的酶活性约为10-1000U/g鲜重。
本发明还涉及氨基酸序列如图2所示的任何酶活性重组DGL，或从中衍生的多肽，特别是通过插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸，这些衍生多肽具有脂酶活性，它们是通过实施上述本发明方法以基本纯的形式获得的，这些方法包括本发明重组多肽的纯化步骤，特别是对如上所述的酶提取物进行层析。
作为从上述重组DGL衍生的多肽，本发明特别涉及上述多肽(Δ54)和(Δ4)，其分子量分别为约37kDa和约49kDa。
酶活性重组DGL或具有酶活性的衍生多肽应理解为按上述Gargouri方法测定具有脂酶活性的重组多肽。
例如，本发明重组多肽具有约1000U/mg重组多肽，最好约100600U/mg的脂酶活性。
本发明特别涉及从烟草叶或种子的酶活性提取物纯化获得的重组DGL，这些叶或种子来自转化的烟草植物，后者本身来自用序列pd35S-RGLSP-DGL按上述方法转化的烟草细胞，所述重组DGL具有上述脂酶活性。
本发明还涉及从植物叶和/或种子和/或果实的酶活性提取物纯化获得的多肽(Δ54)和多肽(Δ4)，这些植物尤其为茄科，如转化的烟草和番茄，植物本身得自用序列pd35S-PS-DGL或序列pd35S-PPS-DGL，或序列pd35S-RGLSP-DGL按上述方法转化的植物细胞，所述重组多肽(Δ54)和(Δ4)具有上述脂酶活性。
本发明还涉及从烟草种子或油菜种子的酶活性提取物纯化得到的多肽(Δ54)，这些种子分别来自转化的烟草或油菜植物，后者本身分别来自用序列pCPU-PS-DGL或序列pCRU-PPS-DGL按上述方法转化的烟草或油菜细胞，该重组多肽(Δ54)具有上述脂酶活性。
本发明还涉及从油菜种子酶活性提取物纯化获得的多肽(Δ54)和(Δ4)，这些种子来自转化的油菜植物，后者本身来自用序列pGEA1-RGLSP-DGL和/或序列pGEA6-RGLSP-DGL按上述方法转化的油菜细胞，该重组多肽(Δ54)和(Δ4)具有上述脂酶活性。
本发明还涉及从玉米种子酶活性提取物纯化获得的多肽(Δ54)和(Δ4)，这些种子来自转化的玉米植物，后者本身来自用序列pAR-IAR-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL和/或序列pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL按上述方法转化的玉米细胞，该重组多肽(Δ54)和(Δ4)具有上述脂酶活性。
本发明多肽(Δ54)和(Δ4)的表观分子量分别为37kDa和49kDa，系经聚丙烯酰胺凝胶分析和电转移至硝酸纤维素膜上后的免疫检测而测得(这些方法详见以下实施例)。
本发明还涉及抗本发明重组多肽的抗体，更具体为抗本发明的重组DGL和/或抗上述多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的那些抗体，它们也可识别HGL。
这种抗体可通过用这些多肽免疫动物，然后回收形成的抗体而获得。
当然这些抗体的产生不限于多克隆抗体。
这还涉及由杂交瘤产生的任何单克隆抗体，所述杂交瘤可通过常规方法从用本发明一种纯化多肽免疫的动物脾细胞(尤其是小鼠或大鼠的)和适当的骨髓瘤细胞形成，按照其产生识别开始用于免疫动物的上述多肽及HGL的单克隆抗体的能力筛选杂交瘤。
本发明还涉及本发明的转化植物、植物部分、植物细胞或种子在制备一种(或多种)本发明重组多肽如重组DGL或其上述衍生多肽中的应用，特别是经实施本发明上述方法之一，所述重组多肽是基本纯的形式或包括在上述定义的酶活性植物提取物中。
本发明还涉及本发明酶活性植物或植物部分或上述定义的酶活性提取物或本发明的重组多肽在人或动物食品中的应用，该重组多肽为如上述定义的重组DGL或其衍生多肽。
本发明特别涉及本发明的酶活性植物或植物部分，特别是叶、果实、种子作为食物的应用。
在这方面，本发明特别涉及含有如上所述的酶活性植物或植物部分的任何食品，后者特别是由植物产生的叶、果实、种子，其具有人和动物可食性特征。
本发明还涉及含有如上所述的一种(或多种)酶活性植物和/或该(这些)植物部分，特别是该(这些)植物的叶和/或种子和/或果实和/或一种(或多种)上述酶活性的植物提取物和/或本发明的一种(或多种)重组多肽的任何营养组合物，其中适当时可与一种(或多种)可食性组份组合。
含于上述营养组合物中的植物或植物部分最好是研碎材料的形式。
本发明的食品(又称功能性食品)或本发明的营养组合物更尤其有利于促进健康个体或患有一种或多种可能或可能不影响胃脂酶和/或胰脂酶产生水平的病变的个体，吸收所摄取的动物和植物脂肪。在这方面，本发明的食品或营养组合物最好用作营养添加剂。
本发明还涉及本发明酶活性的植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞，或如上定义的酶活性植物提取物，或本发明的重组多肽，例如如上定义的重组DGL或其衍生多肽，用于制备有利于促进健康个体或患有一种或多种可能或可能不影响胃脂酶和/或胰脂酶产生水平的病变的个体，吸收所摄取的动物和植物脂肪的药物(或药物组合物)。
尤其是，这些药物组合物最好应用于正在进行改变脂肪吸收机制的医学治疗的个体或老年人。
本发明的药物组合物还更尤其有利于与器官内脂酶(特别是胃和/或胰脂酶)缺乏相关的病变和如胆囊纤维样变性和胰腺外分泌不足的病变的治疗。
本发明更特别涉及含有一种(或多种)上述酶活性植物提取物和/或一种(或多种)本发明的重组多肽的任何药物组合物，其适当时可与药物可用的载体组合。
本发明更特别涉及含有基本纯的形式或上述酶活性提取物形式的重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的任何上述药物组合物。
本发明的药物组合物优选口服，特别是以胶囊、片剂或粉末形式。
如果所述药物组合物含有上述酶活性提取物，则人每天的剂量优选从约200mg到约1000mg，并且最好分配在正餐时间左右服用；如果所述药物组合物含有基本纯形式的本发明的重组多肽，则日剂量为约100mg到约500mg。
本发明还涉及本发明酶活性的植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞，或如上定义的酶活性植物提取物，或本发明的重组多肽，例如如上定义的重组DGL或其衍生多肽，用于进行工业、农业食品和农用工业领域中，特别是在脂肪工业、脂肪化学及奶品工业中的酶促反应。
在这方面，本发明特别涉及工业、农业食品和农用工业领域中，特别是在脂肪工业、脂肪化学及牛奶工业中，通过一个或多个酶促反应而进行的酶促生物转化或生物催化的方法，利用本发明酶活性的植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞，或如上定义的酶活性植物提取物，或本发明的重组多肽，例如如上定义的重组DGL或其衍生多肽进行这些酶促反应。
本发明更特别涉及可在工业、农用和农用工业使用的酶制剂，其可用于进行上述应用并含有一种(或多种)上述酶活性植物提取物，特别是重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)，其适当时可与能用于上述工业应用过程中的一种(或多种)附加物或其他酶相组合。
本发明更特别涉及本发明酶活性的植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞进行工业规模的酶促生物转化反应或生物催化反应的应用，例如酶促水解或转酯化作用。
本发明酶活性的植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞最好同时用作酶源和反应底物。
本发明还涉及应用本发明酶活性的植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞，更特别是含重组DGL和/或多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)的植物的任何生物催化方法，所述植物或植物部分同时用作酶源和反应底物。
本发明更特别涉及本发明酶活性的植物或这些植物部分用于生物燃料的制备。
在这方面，目前本发明涉及任何通过加入醇(尤其是甲醇或乙醇)到全部或部分本发明的转化植物，尤其是转化的油菜、向日葵或黄豆的磨碎物中，并回收生物燃料(特别是通过过滤)以制备生物燃料的方法。
本发明还涉及例如通过进行上述方法而得到的植物脂肪酸的酯，特别是油酸的甲酯。
本发明还涉及通过进行如上所述方法而得到的任何生物燃料，和更特别是含有植物脂肪酸酯的任何上述生物燃料。
本发明更特别涉及任何通过对油菜籽进行如上所述方法而得到的含有一种油酸甲酯的生物燃料。
本发明还涉及以抗本发明的重组多肽的上述抗体对可能含有DGL或HGL的生物样本中DGL或HGL进行检测或分析的用途。
本发明更特别涉及以这些抗体对与生物体中脂酶过多或相反不足或甚至缺乏相关的病变进行体外诊断的用途。
对取自患者的生物学标本所进行的体外诊断方法包括一个将该标本与一种或多种抗体混合的阶段，随后为检测任何在前一阶段中形成的抗体-HGL复合物的阶段。
在这方面，本发明还涉及用以进行体外检测或诊断的上述方法的试剂盒，其包括；
-上述抗体，最好用放射性或酶法标记，和由适于这些抗体和HGL进行免疫反应的介质组成的试剂。
-可检测这些抗体和HGL所形成的免疫复合物的试剂。
本发明更特别涉及一种重组核苷酸序列转化植物细胞以从这些细胞或从这些细胞所获得植物中获得活性酶形式的重组HGL或一种(或多种)从后者衍生而来的如下定义的多肽的用途，所述重组核苷酸序列一方面含有编码如图5所示人胃脂酶(HGL)的如图4所示cDNA，或从该cDNA衍生的核苷酸序列，特别是经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)核苷酸而衍生，所述衍生序列能够编码一种氨基酸序列与图5所示HGL相同的多肽，或编码从HGL经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允许植物细胞产生所述cDNA或上述衍生序列所编码多肽的元件，特别是被植物细胞转录机制(特别是植物细胞的RNA聚合酶)所识别的转录启动子和转录终止子。
在这方面，本发明还涉及任何以图4所示的编码HGL的核苷酸序列取代在转化植物以制备重组DGL中所述的、如图1或图3所示的编码DGL的核苷酸序列的重组核苷酸序列。
本发明更特别涉及下列重组核苷酸序列：
-在5’→3’方向上含有根瘤土壤杆菌的pSP启动子，HGL信号肽的编码序列，紧随后者的图4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pSP-HGLSP-HGL)，
-在5’→3’方向上含有根瘤土壤杆菌的pSP启动子，HPL信号肽的编码序列，紧随后者的图4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pSP-HPLSP-HGL)，
-在5’→3’方向上含有根瘤土壤杆菌的pSP启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pSP-RGLSP-DGL)。
本发明还涉及如上所述含有编码HGL和/或其衍生多肽的上述重组核苷酸序列的载体和这些载体转化的宿主细胞。
本发明还涉及活性酶形式重组HGL和/或尤其通过插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸而从中衍生的具有脂酶活性的一种(或多种)多肽的任何制备方法，其特征在于它包括：
-转化植物细胞使一种(或多种)本发明的重组核苷酸序列被整合在这些细胞的基因组中，
-适当时从上述转化细胞产生转化植物，
-特别通过提取，然后适当时纯化，回收所述细胞中或上述转化植物中产生的重组HGL和/或上述衍生多肽。
本发明更特别涉及通过实施如上所述的生产重组DGL和/或衍生多肽的方法，应用一种含有图4所示序列的上述重组序列以制备重组HGL的任何制备方法。
实施本发明方法可获得的衍生自重组HGL的多肽中，可提及：
-由图5中位于74和398位氨基酸界定的多肽，也称为多肽(Δ54HGL)，
-由图5中位于24和398位氨基酸界定的多肽，也称为多肽(Δ4HGL)。
本发明更特别涉及制备重组HGL和/或多肽(Δ54HGL)和/或多肽(Δ4HGL)的如上所述方法，其特征在于它包括：
转化植物叶的外植体细胞，将后者与含有上述重组核苷酸序列pSP-HGLSP-HGL和/或pSP-HPLSP-HGL和/或pSP-RGLSP-HGL的上述质粒转化的根瘤土壤杆菌菌株在适当培养基中接触，
-在含有卡那霉素的培养基上选择转化的外植体，
-上述转化的外植体在适当培养基中培养，产生转化植物，
-提取重组HGL和适当时的多肽(Δ54HGL)和/或多肽(Δ4HGL)，特别是通过在适当缓冲液中研磨上述转化植物的叶和/或种子和/或果实，离心并收集构成酶活性植物提取物的上清液，
-适当时从上步所得提取物纯化重组HGL，特别是通过对上清液进行层析，导致制备基本纯的重组HGL。
本发明还涉及在其基因组中稳定地整合有一种(或多种)本发明上述重组核苷酸序列的任何植物或该植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子。
本发明涉及任何酶活性的特别是如下定义的脂酶活性的植物提取物，其通过实施上述本发明方法之一而制得，含有一种(或多种)本发明的重组多肽如如重组HGL和/或多肽(Δ54HGL)和/或多肽(Δ4HGL)作为活性酶。
本发明更特别涉及用序列pSP-HGLSP-HGL和/或pSP-HPLSP-HGL和/或pSP-RGLSP-HGL按上述方法之一转化植物的外植体细胞所获植物的叶和/或种子的提取物，其中含有重组HGL和/或多肽(Δ54HGL)和/或多肽(Δ4HGL)，特别是：
-用序列pSP-HGLSP-HGL和/或pSP-HPLSP-HGL和/或pSP-RGLSP-HGL按上述方法转化烟草叶外植体细胞所得烟草叶或种子的提取物，其中含有多肽(Δ54HGL)和多肽(Δ4HGL)，这两种多肽的混合物相对所述提取物中蛋白总重的重量百分比约为0.1-20％，所述提取物的酶活性约为100-300U/g鲜重，
-用序列pSP-RGLSP-HGL转化烟草叶的外植体细胞所得烟草叶的提取物，其中含有多肽(Δ4HGL)，该多肽相对所述提取物中蛋白总重的重量百分比约为0.1-20％，所述提取物的酶活性约为100-300U/g鲜重。
本发明还涉及氨基酸序列如图5所示的任何酶活性重组HGL，或从中衍生的多肽，特别是通过插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸，更加特别为多肽(Δ54HGL)和(Δ4HGL)，这些衍生多肽具有脂酶活性，例如它们是通过实施上述本发明方法以基本纯的形式获得的，这些方法包括本发明重组多肽的纯化步骤，特别是对如上所述的酶提取物进行层析。
如先前对重组DGL所作的描述，本发明还涉及：
-抗本发明的重组HGL或其衍生多肽的多克隆或单克隆抗体，及其如上所述的用途，
-基于本发明的如上定义的酶活性植物，或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子，或植物细胞或提取物，或重组HGL或其衍生多肽的食品、营养组合物或药物组合物、或工业用途的酶制剂，
-任何由本发明的重组HGL或其衍生多肽，或如上定义的酶活性植物，或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子，或植物细胞或提取物所进行的酶促生物转化方法或生物催化，或生物燃料制品。
在下面的所述重组核苷酸序列的制备和产生本发明重组多肽的转化植物的制备及制备生物燃料的方法的详细描述中，将进一步说明本发明。
1.编码重组狗胃脂酶蛋白并可在茄科的叶和种子中表达的嵌合基因的构建
I-A)编码重组GDL并可在烟草中表达的嵌合基因的构建
编码重组狗胃脂酶(GDL)的基因在烟草的叶和种子中表达需要下列调控序列：
1.双结构CaMV(花椰菜花叶病毒)启动子35S(pd35s)。
该序列相当于位于天然启动子35S的TATA元件上游并能激活转录的序列的重复(Kay等，1987)。
2.双链环状DNA的转录终止序列，终止子多聚A 35S，其对应于花椰菜花叶病毒序列的3’端非编码区，该终止子可形成35S的转录本(Frnaka等，1980)。
应用重组DNA技术(Sambrook等，1989)可从pBIOC4构建各种质粒。该二分质粒衍生自pGA492(An，1986)，在其转移DNA的左右边界之间含有如下源于质粒pTiT37的序列：
编码胭脂碱合成酶的nos基因的结构性启动子(Depicker等.1982)，头8个密码子缺失的编码新霉素磷酸转移酶II的npt11基因的编码序列(Berg和Berg，1983)，(其中起始密码子为甲硫氨酸ATG)，该序列连接到nos基因(Depicker等，1982)编码序列的头14个密码子上，nos终止子(Depicker等，1982)，随后为在编码氯霉素乙酰转移酶的cat基因(Close和Rodriguez，1982)和根瘤土壤杆菌的质粒pTiA6基因6的终止序列(Liu等，1993)之前的含多克隆位点(也称多接头)(Hind III-XbaI-SacI-HpaI-KpnI-ClaI-BglII)的区域。为了基本去除所有编码cat基因的序列，质粒pGA492经Sac1(多接头的限制性位点)和Sca1(存在于cat基因序列中的限制性位点)的两次酶切消化，然后根据使用说明进行T4 DNA多聚酶处理。修饰质粒(20ng)在含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)的10μL反应体系中，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Habahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。接着应用磷酸化的HindIII-EcoRI衔接子(Stratagene克隆系统)，将该克隆质粒DNA中保留的HindIII限制性酶切位点修饰成EcoRI限制性酶切位点。为了完成这一修饰，500ng的该克隆的质粒DNA用HindIII酶切消化，根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化，然后加入1500ng的HindIII-EcoRI衔接子、1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃共沉淀30分钟。12000g离心30分钟后，用70％乙醇洗涤沉淀的DNA，干燥，溶解于8μl水中，65℃保持10分钟，然后加入1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14C°连接16小时。65℃10分钟灭活T4 DNA连接酶之后，连接反应混合物经EcoRI酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后如上所述进行连接。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法提取所得克隆的质粒DNA，并分别进行HindIII和EcoRI限制性内切酶酶切分析。目的二分质粒仅含有编码cat基因序列的后9个密码子和一个EcoRI位点，被称为pBIOC4。
利用质粒pJIT163Δ可分离到由启动子pd35S和终止子多聚A 35S组成的表达盒。质粒pJIT163Δ衍生自pJIT163，而pJIT163本身衍生自pJlT60(Guerimeau和Mullineaux，1993)。质粒pJIT163在多接头的HindIII和SaII位点之间有一个ATG密码子。为了抑制该ATG并得到质粒pJIT163Δ，质粒pJIT163经HindIII和SalI的两次酶切消化，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后根据使用说明进行Klenow酶(New England Biolabs)处理，经1体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和1体积氯仿∶异戊醇(24∶1)的抽提去蛋白，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，最后加入1μl10×T4DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。为了分离到由启动子pd35S和终止子多聚A 35S组成的表达盒(SacI-XhoI片段)，克隆pJIT163Δ的质粒DNA经SacI和XhoI的酶切消化，带有表达盒的SacI-XhoI片段经0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后根据使用说明进行绿豆芽核酸酶(New England Biolabs)处理。pBIOC4质粒用EcoR1酶切消化，经绿豆芽核酸酶(New England Biolabs)处理并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化，将上述纯化的插入片段克隆于其中。在含2μll10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇和5U T4 DNA连接酶(Amersham)的10μl体积中，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所得质粒称为pBIOC21。
狗的胃脂酶(DGL)天然地合成为前体形式。成熟的DGL由379个氨基酸组成。DGL的互补DNA克隆于表达载体pRU303的BglII和SalI位点上，成为如国际申请W094/13816号中所述的载体pDGL5.303。pDGL5.303用于含PS-DGL的质粒pBIOC25和含PPS-DGL的质粒pBIOC26的构建，其中编码成熟DGL的序列之前分别有植物来源的信号肽(PS)和前肽(PPS，即后跟N-末端液泡定位序列的信号肽)。PS和PPS序列分别由23和37个氨基酸组成，它们都来自甜马铃薯块根的储存蛋白：sporamin A(Murakami等，1986；Matsukoa和Nakamura，1991)。
为了简单地融合成熟的DGL序列和导向信号序列，如PS或PPS，在成熟的DGL序列的第4和5号密码子上引入一附加的HindIII位点来修饰质粒pDGL5.303，这一修饰应用两个寡聚脱氧核苷酸通过PCR进行定点诱变，这两个寡聚脱氧核苷酸为5’caggagatc TTG TTT GGA AAG CTTCAT CCC 3′(含有质粒的单一BglII位点并产生附加的HindIII位点)和5′CAT ATT CCT CAG CTG GGT ATC 3′(含有质粒的单一PvuII位点)。在100μl的反应体系中应用PCR扩增BglII-PvuII片段，这一体系中含有10μl10×Taq DNA聚合酶缓冲液(500mg KCL，100mMTris-HCl，pH9.0，1％Triton×100)、6μl25mM MgCl2，3μl10mMdNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，上述两个寡聚脱氧核苷酸各100pM，5ng DNA(含有DGL互补DNA的表达载体pRU303)，2.5UTaq DNA聚合酶(Promega)和2滴凡士林油。DNA在94℃变性5分钟，然后进行30个循环，每一循环94℃变性5分钟，50℃杂交1分钟，72℃延伸1分钟，然后72℃延伸5分钟。该PCR反应在PERKINELMER  CETUS的″DNA热循环″仪上进行。氯仿抽提去除油。随后沉淀含在反应体系中的DNA片段：加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，用2种限制酶BglII和PvuII酶切消化。PCR产生的并消化过的DNA经2％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后连接到载体pDGL5.303的质粒DNA上。载体pDGL5.303经BglII和PvuII的两次酶切消化，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱，进行乙醇沉淀，干燥并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。上述100ng的去磷酸化载体和PCR产生的并消化过的DNA片段进行连接，10μl反应体系如上述含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hahahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法对部分克隆的质粒DNA进行测序加以验证。这一HindIII位点的引入没有影响DGL的遗传编码。实际上，天然DGL序列AAA TTA(Lys-Leu)变成了AAG CTT(Lys-Leu)。所得质粒称为pBIOC22，其含有成熟DGL蛋白的序列：
  LEU PHE GLY LYS LEU------THR ASP ASN LYS AMBagatcTTG TTT GGA AAG CTT------ACA GAT AAT AAG TAG TTCTAGA------           ------                              ----BglII            HindIII                             XbaI单一限制位点                                   单一限制位点
LEU：成熟DGL的第一个密码子，AMB：终止密码子
a..含有PS-DGL的二分质粒pBIOC25的构建
质粒pBIOC22用BglII完全酶切和HindIII部分酶切，以去除编码成熟DGL蛋白中的多肽Leu-Phe-Gly-Lys(前4个氨基酸)的序列。这一序列由编码含23个氨基酸的信号肽PS的序列(ATG AAA GCC TTC ACACTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCCAAT CCA GCC CAT TCC)所取代，并与编码成熟DGL蛋白的序列的头4个密码子相融合(″PS-成熟DGL的头4密码子″)。根据第I节中所述的PCR扩增的操作方法，应用下列2个寡聚脱氧核苷酸5′caggagatctgATGAAA GCC TTC ACA CTC GC 3′和5′G ATG AAG CTT TCC AAACAA GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G3′，利用质粒pMAT103(Matsuoka和Nakamura，1991)，PCR扩增序列″PS-成熟DGL的头4密码子″。经BglII和HindIII的双酶切后，PCR扩增得到的DNA片段进行2％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后连接到pBIOC22质粒DNA上。载体pBIOC22经BglII和HindIII双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。上述100ng的去磷酸化载体和PCR产生的并消化过的DNA片段进行连接，10μl反应体系如上述含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法对部分克隆的质粒DNA进行测序加以验证。成熟的DGL和PS的序列被克隆，并保持了其开放读码框架。PS和成熟DGL之间的剪接序列为Ser-Leu。该质粒称为pBIOC23。经BglII和XbaI双酶切从pBIOC23上将带有PS-DGL序列的BglII-XbaI片段切下来，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀和干燥。然后根据使用说明进行Klenow酶(New England Biolabs)处理该DNA片段并连接到质粒pBIOC21的DNA上，pBIOC21质粒DNA在HindIII位点酶切消化，经Klenow酶处理并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的载体和200ng带有PS-DGL的片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl10×T4DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl 50％的聚乙二醇8000和5U T4DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所得质粒称为pBIOC25。应用Pharmacia的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法对编码重组蛋白PS-DGL的片段的核苷酸序列进行测序加以验证。按照Holsters等的方法，二分载体pBIOC25的质粒DNA可通过直接转化导入到根瘤土壤杆菌中。有效克隆经导入质粒DNA的酶切加以鉴定。
b.含PPS-DGL的二分质粒的构建
质粒pBIOC22用BglII完全酶切和HindIII部分酶切，以去除编码成熟DGL蛋白中的多肽Leu-Phe-Gly-Lys(前4个氨基酸)的序列。这一序列由编码含37个氨基酸的信号肽PPS的序列(ATG AAA GCC TTC ACACTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCCAAT CCA GCC CAT TCC AGG TTC AAT CCC ATC CGC CTC CCCACC ACA CAC GAA CCC GCC)所取代，并与编码成熟DGL蛋白的序列的头4个密码子相融合(″PPS-成熟DGL的头4密码子″)。根据第1节中所述的PCR扩增的操作方法，应用下列2个寡聚脱氧核苷酸5′caggagatctg ATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3′和5′G ATGAAG CTT TCC AAA CAA GGC GGG TTC GTG TGT GGT TG 3′，利用质粒pMAT103(Matsuoka和Nakamura，1991)，PCR扩增序列″PPS-成熟DGL的头4密码子″。经BglII和HindIII的双酶切后，PCR扩增得到的DNA片段进行2％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后连接到pBIOC22质粒DNA上。载体pBIOC22经BglII和HindIII双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。上述100ng的去磷酸化载体和50ngPCR产生的并消化过的DNA片段进行连接，10μl反应体系如上述含有1μl 10×T4DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。
应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对部分克隆的质粒DNA进行测序加以验证。成熟的DGL和PPS的序列被克隆，并保持了其开放读码框架。PPS和成熟DGL之间的剪接序列为Ala-Leu。该质粒称为pBIOC24。经BglII和XbaI双酶切从pBIOC24上将带有PPS-DGL序列的BglII-XbaI片段切下来，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀和干燥。然后根据使用说明进行Klenow酶(New England Biolabs)处理该DNA片段并连接到质粒pBIOC21的DNA上，pBIOC21质粒DNA在HindIII位点酶切消化，经Klenow酶处理并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的载体和200ng带有PS-DGL的片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。该质粒称为pBIOC26。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法对编码重组蛋白PPS-DGL的片段的核苷酸序列进行测序加以验证。按照Holsters等的方法，二分载体pBIOC25的质粒DNA可通过直接转化导入到根瘤土壤杆菌中。有效克隆经导入质粒DNA的酶切加以鉴定。
c.含RGLSP-DGL的二分质粒的构建
兔胃脂酶合成为前体形式，该前体含有位于NH2末端及成熟脂酶多肽序列之前的22个氨基酸的信号肽。含有编码兔胃脂酶的完整cDNA的克隆pJO101如欧洲专利申请92 403 055.4号中所述。该专利申请由″Institut deRecherehe Jouveinal″于12.11.92提出，名为″编码兔胃脂酶和多肽衍生物的核酸，其生产这些多肽的应用和药物组合物″。
比较狗胃脂酶和兔胃脂酶前体的多肽序列，发现两种蛋白都存在LFGK序列。根据纯化的天然蛋白(Moreau等，1988)发现在兔脂酶的多肽序列中，前三个残基L、F和G不存在，它们构成了22个氨基酸的RGL信号肽的一部分。结果，无这三个共有氨基酸的兔胃脂酶信号肽融合到成熟的狗胃脂酶的蛋白序列。其多肽序列由以下19个氨基酸组成：MWVLFMVAALLSALGTTHG。
质粒pBIOC22用BglII完全酶切和HindIII部分酶切，以去除编码成熟DGL蛋白中的多肽Leu-Phe-Gly-Lys(前4个氨基酸)的序列。这一序列由编码19个氨基酸的兔胃脂酶信号肽RGLSP的序列(ATG TGG GTGCTT TTC ATG GTG GCAGCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACTACA CAT GGT)所取代，并与编码成熟DGL蛋白的序列的头4个密码子相融合(″RGLSP-成熟DGL的头4密码子″)。根据第I节中所述的PCR扩增的操作方法，应用下列2个寡聚脱氧核苷酸5′aggagatctcaaca ATGTGG GTG CTT TTC ATG GTG 3′和5′G ATG AAG CTT TCCAAA CAA ACC ATG TGT AGT TCC AAG TG 3′，利用pJO101，PCR扩增序列″RGLSP-成熟DGL的头4密码子″。经BglII和HindIII的双酶切后，PCR扩增得到的DNA片段进行2％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后连接到pBIOC22质粒DNA上。载体pBIOC22经BglII和HindIII双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。上述100ng的去磷酸化载体和50ngPCR产生的并消化过的DNA片段进行连接，10μl反应体系如上述含有1μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对部分克隆的质粒DNA进行测序加以验证。RGLSP和成熟的DGL的序列被克隆，并保持了其开放读码框架(就是说它们构成了单一的开放读码框架)。RGLSP和成熟DGL之间的剪接序列为Gly-Leu。该目的质粒称为pBIOC40。经BglII和XbaI双酶切从pBIOC40上将带有RGLSP-DGL序列的BglII-XbaI片段切下来，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀和干燥。然后根据使用说明进行Klenow酶处理该DNA片段并连接到质粒pBIOC21的DNA上，pBIOC21质粒DNA在HindIII位点酶切消化，经Klenow酶处理并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的载体和200ng带有RGLSP-DGL的片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl 10×T4DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5U T4DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。目的质粒称为pBIOC41。应用Pharmacia的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对编码重组蛋白RGLSP-DGL的片段的核苷酸序列进行测序加以验证。按照Holsters等(1978)的方法，二分载体pBIOC41的质粒DNA可通过直接转化导入到根瘤土壤杆菌LBA4404中。有效克隆经导入质粒DNA的酶切加以鉴定。
I-B)编码重组DGL并可在番茄中表达的嵌合基因的构建
所用构建质粒与用于烟草的遗传转化相同，名为pBIOC25、pBIOC26和pBIOC41。
II.编码重组狗胃脂酶蛋白并可在油菜仔中表达的嵌合基因的构建
a)含启动子pCRU的二分质粒pBIOC28的构建
在油菜仔中表达狗胃脂酶(DGL)要求将编码DGL的cDNA插入到下列调控序列之间：
1.启动子pCRU相当于种子的储存蛋白基因如小萝卜的cruciferin A的5端非编码区，可在种子中特异性表达。
2.双链环状DNA的转录终止序列，终止子多聚A 35S，其对应于花椰菜花叶病毒序列的3’端非编码区，该终止子可形成35S的转录本(Franck等，1980)。
为了得到类似于pBIOC21但其启动子pd35S由pCRU取代的二分质粒，应用pBI221衍生的质粒pBI221-CRURSP(Depigny-This等上市，1992)，分离含启动子pCRU的″Klenow酶处理的EcoRI-BamHI″片段。通过用启动子pCRU来取代35S，从pBI221(Clontech销售)衍生出质粒pBI221-CRURSP。
带有启动子pCRU的″Klenow处理过的EcoRI-BamHI″片段经0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥并连接到pJIT163质粒DNA中。pJIT163质粒DNA首先经KpnI酶切，并根据使用说明进行T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)处理，然后用BamHI酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的载体和200ng″Klenow处理过的EcoR1-BamH1″片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所得质粒称为pBIOC27。
质粒pBIOC27经Xho1完全酶切和随后的EcoR1部分酶切，可分离到由启动子pCRU和终止子多聚A 35S组成的表达盒。该片段经0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥，根据使用说明用Klenow酶(New England Biolabs)处理并连接到质粒pBIOC24 DNA的EcoR1位点上，该酶切位点已根据使用说明用Klenow酶处理和牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的载体和200ng XhoI-EcoRI片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μll10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所得质粒称为pBIOC28。b.含PPS-DGL的二分质粒pBIOC29的构建
I-A-b中已描述了带有PPS-DGL序列的BglII-XbaI片段的分离。该片段被连接到连接到质粒pBIOC28 DNA的EcoRI位点上，该酶切位点已根据使用说明用Klenow酶处理和牛小肠碱性磷酸酶(BoehringerMannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的载体和200ng BglII-XbaI片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hahahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所得质粒称为pBIOC29。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对编码重组蛋白PPS-DGL的核苷酸序列进行测序加以验证。按照Holsters等(1978)的方法，二分载体pBIOC29的质粒DNA可通过直接转化导入到根瘤土壤杆菌LBA4404中。有效克隆经导入质粒DNA的酶切加以鉴定。c)含pGEA1D启动子的二分质粒pBIOC90和pBIOC91的构建
编码重组狗胃脂酶(DGL)的动物基因在油菜仔中表达需要下列调控序列：
1.启动子pGEA1相当于种子的储存蛋白基因Arabidopsis thaliana的GEA1的5′端非编码区，可在种子中特异性表达。
2.双链环状DNA的转录终止序列，终止子多聚A 35S，其对应于花椰菜花叶病毒序列的3’端非编码区，该终止子可形成35S的转录本(Franck等，1980)。
为了得到类似于pBIOC21但其启动子pd35S由pGEA1D取代的二分质粒pBIOC90，从质粒pGUS2-pGEA1中分离带有启动子pGEA1并经Klenow酶处理的HindIII-BamHI片段。通过启动子pGEA1代替启动子pd35S，从pBI221衍生得到克隆pGUS-2-pGEA1。该质粒含有2个ATG：GEA1(Em2)基因的ATG和gus基因的ATG。应用两个寡聚脱氧核苷酸：5′CAAACGTGTACAATAGCCC 3′和5′CCCGGGGATCCTTTTTTG 3′，PCR扩增SalI位点和克隆pGUS-2-pGEA1中GEA1基因的ATG上游序列之间的DNA片段。调整杂交温度。PCR扩增片段经SalI和BamHI酶切消化，2％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后连接到pGUS-2-pGEA1质粒DNA上。载体pGUS-2-pGEA1经SalI和BamHI双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥。100ng载体和50ng PCR产生的并酶切过的DNA片段进行连接，10μl反应体系如上述含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对部分克隆测序加以验证。所得克隆称为pGUS-2-pGEA1D。
带有来自pGUS-2-pGEA1D的启动子pGEA1D的HindIII-BamHI片段，根据使用说明(Biolabs)用Klenow酶处理，经0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥并连接到pBIOC21质粒DNA的KpnI和HindIII位点上，这些酶切位点已根据使用说明用T4 DNA聚合酶(Biolabs)处理。20ng上述去磷酸化的载体和200ng XhoI-EcoRI DNA片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所得质粒称为pBIOC90。
为了得到二分质粒pBIOC91，来自pBSII-pGEA1D的表达盒″pGEA1D-tNOS″被导入到二分质粒pSCV1.2中，pSCV1.2可通过常规的克隆方法将带有Fromm等(1986)所述的表达盒″p35S-nptII-tNOS″的HindIII片段克隆到Edwards G.A.1990年构建的pSCV1的HindIII位点上。
经两个阶段得到质粒pBSII-pGEA1D：
一方面，带有根瘤土壤杆菌的tNOS(胭脂碱合成酶基因的终止子)的Sac1-EcoR1片段，根据使用说明用T4 DNA聚合酶(Biolabs)处理并纯化后，克隆至Stratagene销售的pBSIISK+的EcoRV位点上，这一酶切位点已根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。20ng去磷酸化的载体和200ng上述含tNOS的DNA片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对部分克隆测序加以验证。所得质粒称为pBSII-tNOS。
另一方面，带有pGEA1D的片段经HindIII酶切后Klenow处理和BamHI酶切，纯化，克隆到质粒pBSII-tNOS的″BamHI和Klenow处理的XbaI″位点上。100ng上述载体和50ng上述DNA片段进行连接，10μl反应体系含有1μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。目的克隆称为pBSII-pGEA1D。
然后，含在Klenow处理的Xba1-HindIII片段中的″pGEA1D-tNOS″表达盒克隆至pSCV1.2的SmaI位点上，这一酶切位点已根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。20ng去磷酸化的载体和200ng带有″pGEA1D-tNOS″表达盒的片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl 50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所得质粒称为pBIOC91。
d)含pGEA6D启动子的二分质粒pBIOC92的构建
编码重组狗胃脂酶(DGL)的动物基因在油菜仔中表达需要下列调控序列：
1.启动子pGEA6相当于种子的储存蛋白基因Arabidopsis thaliana的GEA6的5′端非编码区，可在种子中特异性表达。
2.双链环状DNA的转录终止序列，终止子多聚A 35S，其对应于花椰菜花叶病毒序列的3’端非编码区，该终止子可形成35S的转录本(Franck等，1980)。
为了得到类似于pBIOC21但其启动子pd35S由pGEA6D取代的二分质粒pBIOC92，从质粒pGUS2-pGEA6中分离带有启动子pGEA6D并经Klenow酶处理的EcoRI-BamHI片段。从pUC18衍生得到的克隆pGUS-2-pGEA6含有2个ATG：GEA6(Em6)基因的ATG和gus基因的ATG。GEA6基因的ATG被破坏。应用两个寡聚脱氧核苷酸：5′AAGTACGGCCACTACCACG 3′和5′CCCGGGGATCCTGGCTC3′，PCR扩增AccI位点和克隆pGUS-2-GEA6中GEA6基因的ATG上游序列之间的DNA片段。调整杂交温度。
PCR扩增片段经AccI和BamHI酶切消化，2％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后连接到pGUS-2-GEA6质粒DNA上。载体pGUS-2-GEA6经Acc1和BamHI双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥。100ng上述载体和50ng上述PCR产生的并酶切过的DNA片段进行连接，10μl反应体系含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对部分克隆测序加以验证。所得克隆称为pGUS-2-pGEA6D。
带有来自pGUS-1-pGEA6D的启动子pGEA6D的EcoRI-BamHI片段，根据使用说明(Biolabs)用Klenow酶处理，经0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥并连接到修饰过的pBIOC21质粒DNA的Klenow处理的Xho1位点上。质粒pBIOC21经HindIII酶切后Klenow处理和KpnI酶切，去掉含pd35S的片段并用含有pSBIISK+的KpnI-XhoI-SalI-ClaI-HindIII-BamHI-SmaI-EcoRI-EcoRV位点的多接头的KpnI-EcoRV片段来代替，从而得到修饰的pBIOC21质粒。
20ng去磷酸化的修饰过的pBIOC21和200ng上述EcoRI-BamHI片段进行连接。20μl反应体系含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所述质粒称为pBIOC92。
e)含RGLSP-DGL的二分质粒pBIOC93、pBIOC94、pBIOC95、pBIOC96和pBIOC97的构建
质粒pBIOC40如上所述。该质粒含有带有RGLSP-DGL序列的BglII-XbaI片段。
经BglII和XbaI双酶切分离到该片段，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱，进行乙醇沉淀，干燥，Klenow酶处理并连接到经EcoRI酶切、Klenow处理和去磷酸化的pBIOC28(上述)中；或经EcoRI酶切、Klenow处理和去磷酸化的pBIOC90中；或经SmaI消化和去磷酸化的pBIOC91中；或经HindIII酶切、Klenow处理和去磷酸化的pBIOC92中，以分别得到pBIOC93、pBIOC94、pBIOC95和pBIOC96。
带有表达盒″pGEA6D-RGLSP-DGL-t35S″的KpnI-EcoRI片段，经0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱，进行乙醇沉淀，干燥并连接到经Sma1酶切和去磷酸化的pSCV1.2，得到质粒pBIOC97。表达盒″pGEA6D-RGLSP-DGL-t35S″来自pBIOC92。
III.编码重组人胃脂酶蛋白并能组成性表达(如在烟草的叶和种子)的嵌合基因的构建
a)含嵌合启动子超级启动子pSP的二分质粒pBIOC82的构建
编码重组人胃脂酶(HDL)的基因在烟草的叶中表达需要下列调控序列：
1.嵌合启动子超级启动子(pSP；PCT/US94/12946)。它是通过融合根瘤土壤杆菌的章鱼碱合成酶基因的启动子的三个转录激活元件和甘露氨酸合成酶启动子及其一个转录激活元件而成；
2.双链环状DNA的转录终止序列，终止子多聚A 35S，其对应于花椰菜花叶病毒序列的3’端非编码区，该终止子可形成35S的转录本(Franck等，1980)。
为了得到类似于pBIOC21但其启动子pd35S由pSP取代的二分质粒，从质粒pBISNI(PCT/US92/12946)中分离得到带有启动子pSP的pvuII-SalI片段，经Klenow酶处理，1％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥并连接到pBIOC81质粒DNA。pBIOC81质粒已由KpnI和EcoRI双酶切，并根据使用说明用T4DNA聚合酶处理和牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。质粒pBIOC81相当于XbaI位点缺失的pBIOC21。为了得到pBIOC81，pBIOC81质粒经XbaI酶切，Klenow酶处理并由T4 DNA连接酶连接。
20ng上述去磷酸化的修饰过的载体和200ng上述带有pSP的DNA片段进行连接。20μl反应体系含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl 50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。目的质粒称为pBIOC82。
如Bodmer等(1987)的文章中所述，人胃脂酶(HGL)天然合成为前体形式。成熟的HGL蛋白由379个氨基酸组成。其信号肽(HGLSP)由19个氨基酸组成。HGLSP和HGL之间的限制性位点为Gly-Leu。
编码HGL前体的序列被用于含HGLSP-HGL的pBIOC85、含HPLSP-HGL的pBIOC87和含RGLSP-HGL的pBIOC89二分质粒的构建，这些质粒中编码HGL的序列分别跟随于HGL天然信号肽、人的胰脂酶信号肽(HPLSP；Giller等，1992)和兔的胃脂酶信号肽(RGLSP；前文已作描述；欧洲专利92.403055.4号)的编码序列之后。
经PstI和DraI双酶切分离得到编码HGL前体的序列，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥。然后将该片段克隆至Stratagene销售的pBSIISK+的PstI和SpeI位点(已根据使用说明用T4 DNA聚合酶(Biolabs)处理)上。100ng载体和50ng上述带有HGL前体编码序列的DNA片段进行连接，10μl反应体系含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。目的克隆称为pBIOC83。
应用两个寡聚脱氧核苷酸通过PCR进行定点诱变，在第9和10号密码子上引入一先前不存在的BamHI位点，对编码成熟HGL的序列加以修饰，这两个寡聚脱氧核苷酸为5’aaactgcaggctcgag TTG TTT GGA AAATTA CAT CCT GGA TCC CCT GAA GTG ACT ATG 3′(含有单一PstI、XhoI和BamHI位点)和5′AAT GGT GGT GCC CTG GGAATG GCC AAC ATA GTG TAG CTG C 3′(含有质粒pBIOC83的单一MscI位点)。
在100μl的反应体系中应用PCR扩增PstI-MscI片段，这一体系中含有10μl10×Taq DNA聚合酶缓冲液(500mM KCL，100mM Tris-HCl，pH9.0，1％TritonX100)、6μl 25mM MgCl2，3μl 10mM dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，上述两个寡聚脱氧核苷酸各100pM，5ng基质DNA(载体pBIOC83)，2.5U Taq DNA聚合酶(Promega)和2滴凡士林油。DNA在94℃变性5分钟，然后进行30个循环，每一循环94℃变性1分钟，65℃杂交1分钟，72℃延伸1分钟，然后72℃延伸5分钟。该PCR反应在PERKIN ELMER CETUS的″DNA热循环″仪上进行。氨仿抽提去除油。随后沉淀含在反应体系中的DNA片段，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，用2种限制酶PstI和MscI酶切消化。PCR产生的并消化过的DNA经2％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后连接到载体pBIOC83的质粒DNA上。载体pBIOC83经BglII和PvuII的两次酶切消化，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱，进行乙醇沉淀，干燥。上述100ng载体和50ng PCR产生的并消化过的DNA片段进行连接，10μl反应体系如上述含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对部分克隆测序加以验证。BamHI位点的引入没有影响HGL的遗传编码。实际上，天然HGL序列GGA GAC(Gly-Ser)变成了GGA TCC(Gly-Ser)。所得质粒称为pBIOC84。
b)含HGLSP-HGL的二分质粒pBIOC85的构建
经PstI和XbaI双酶切从pBIOC83上将带有HGLSP-HGL序列的PstI-XbaI片段切下来，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀和干燥。然后根据使用说明用T4 DNA聚合酶(Biolabs)处理该DNA片段并连接到质粒pBIOC82的DNA上，pBIOC82质粒DNA经EcoRI位点酶切消化，并根据使用说明用Klenow酶(Biolabs)处理和牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的载体和200ng上述带有HGLSP-HGL的片段进行连接。20μl反应体系含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl 50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所得质粒称为pBIOC85。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对编码重组蛋白HGLSP-HGL的片段的核苷酸序列进行测序加以验证。按照Holsters等的方法，双载体pBIOC85的质粒DNA可通过直接转化导入到根瘤土壤杆菌LBA4404中。有效克隆经导入质粒DNA的酶切加以鉴定。
c)含HPLSP-HGL的二分质粒pBIOC86的构建
质粒pBIOC84经PstI和BamHI的两次酶切，以去除编码信号肽HGLSP和成熟HGL蛋白的前8个氯基酸(Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly)的序列。这一序列由编码信号肽HPLSP的16个氨基酸的序列(ATG CTG CCA CTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCAGTA GCA GGA)所取代，并与编码成熟HGL蛋白的序列的头8个密码子的序列相融合(″HPLSP-成熟HGL的头8个密码子″)。根据先前所述的PCR扩增的操作方法(见上文第I节)，应用两个寡聚脱氧核苷酸5′aaactgcaggctcgagaacaATGC 3′和5′CAGG gga TCC AGG ATGTAA TTT TCC 3′，从基质5′  aaactgcaggctcgagaacaATG CTG CCACTT TGG ACT CTT TCA CTG CTG CTG GGA GCA GTA GCA GGATTG TTT GGAAAA TTA CAT CCT GGA TCC CCT G3′中，PCR扩增序列″HPLSP-成熟HGL的头8个密码子″。调节杂交温度。经PstI和BamHI的双酶切后，PCR扩增得到的DNA片段进行2％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后连接到pBIOC84质粒DNA上。载体pBIOC84已用PstI和BamHI双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。上述100ng载体和50ng PCR产生的并酶切过的DNA片段进行连接，10μl反应体系含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对部分克隆测序加以验证。HPLSP和成熟的HGL的序列被克隆，并保持了其开放读码框架(就是说它们组成了唯一的开放读码框架)。HPLSP和成熟的HGL之间的剪接序列为Gly-Leu。该质粒称为pBIOC86。
经PstI和XbaI双酶切从pBIOC86上将带有HPLSP-HGL序列的PstI-XbaI片段切下来，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀和干燥。然后根据使用说明进行T4 DNA聚合酶(Biolabs)处理该DNA片段并连接到质粒pBIOC82的DNA上，pBIOC82质粒DNA在EcoRI位点酶切消化，并根据使用说明用Klenow酶(Biolabs)处理和牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的载体和200ng上述带有HPLSP-HGL的DNA片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl 50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hahahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。该质粒称为pBIOC87。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对编码重组蛋白HPLSP-HGL的片段的核苷酸序列进行测序加以验证。按照Holsters等(1978)的方法，双载体pBIOC87的质粒DNA可通过直接转化导入到根瘤土壤杆菌LBA4404中。有效克隆经导入质粒DNA的酶切加以鉴定。
d)含RGLSP-HGL的二分质粒pBIOC89的构建
质粒pBIOC84经PstI和BamHI的两次酶切，以去除编码信号肽HGLSP和成熟HGL蛋白的前8个氨基酸(Leu-Phe-Gly-Lys-Leu-His-Pro-Gly)的序列。这一序列由编码信号肽RGLSP的19个氨基酸的序列(ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCACTT GGA ACT ACA CAT GGT)所取代，并与编码成熟HGL蛋白的序列的前8个密码子的序列相融合(″RGLSP-成熟HGL的头8个密码子″)。根据先前所述的PCR扩增的操作方法(见上文第I节)，应用两个寡聚脱氧核苷酸5′aaactgcaggctcgagaacaATG TGG3′和5′AGG ggaTCC AGG ATG TAA TTT TCC 3′，从基质5′aaactgcaggctcgagaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCTTTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT TTG TTT GGAAAA TTA CAT CCT GGA TGG CCT G3′中，PCR扩增序列″RGLSP-成熟HGL的头8个密码子″。调节杂交温度。经PstI和BamHI的双酶切后，PCR扩增得到的DNA片段进行2％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，加入1/10体积的3M乙酸钠(pH4.8)、2.5倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30分钟，12000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，然后连接到pBIOC84质粒DNA上。载体pBIOC84已用PstI和BamHI双酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀，干燥并根据使用说明用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。上述100ng载体和50ng PCR产生的并酶切过的DNA片段进行连接，10μl反应体系含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对部分克隆测序加以验证。RGLSP和成熟的HGL的序列被克隆，并保持了其开放读码框架(就是说它们组成了唯一的开放读码框架)。RGLSP和成熟的HGL之间的剪接序列为Gly-Leu。该质粒称为pBIOC88。
经PstI和XbaI双酶切从pBIOC88上将带有RGLSP-HGL序列的PstI-XbaI片段切下来，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱(Sambrook等1989)，进行乙醇沉淀和干燥。然后根据使用说明进行T4 DNA聚合酶(Biolabs)处理该DNA片段并连接到质粒pBIOC82的DNA上，pBIOC82质粒DNA在XbaI位点酶切消化，并根据使用说明用Klenow酶(Biolabs)处理和牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。20ng上述去磷酸化的载体和200ng上述带有RGLSP-HGL的DNA片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl 50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经12μg/ml四环素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。该质粒称为pBIOC89。应用Pharmacia销售的T7TM测序试剂盒，通过双脱氧核苷酸法(Sanger等，1977)对编码重组蛋白RGLSP-HGL的片段的核苷酸序列进行测序加以验证。按照Holsters等(1978)的方法，双载体pBIOC89的质粒DNA可通过直接转化导入到根瘤土壤杆菌LBA4404中。有效克隆经导入质粒DNA的酶切加以鉴定。
IV.编码重组狗胃脂酶蛋白并可在玉米种子中表达的嵌合基因的构建
a)含RGLSP-DGL并能在玉米种子中组成性表达的质粒pBIOC98和pBIOC99的构建
编码重组狗胃脂酶(DGL)的动物基因在玉米种子中组成型表达需要下列调控序列：
1.两种允许组成型表达的启动子之一：
-其后带有水稻肌动蛋白内含子的水稻肌动蛋白启动子，如McElroy(1992)等所述位于质粒pAct1-F4中；
-CaMV(花椰菜花叶病毒)的双结构组成型启动子35S(pd35S)，该序列为位于天然启动子35S的TATA元件上游并能激活转录的序列的重复(Kay等，1987)。
2.两种终止子之一：
-双链环状DNA的转录终止序列，多聚A 35S终止子，其对应于花椰菜花叶病毒序列的3’端非编码区，该终止子可形成35S的转录本(Frank等，1987)。
-转录终止序列，多聚A NOS终止子，其对应于根瘤土壤杆菌胭脂碱株的Ti质粒中胭脂碱合成酶基因的3’端非编码区。
通过将带有RGLSP-DGL编码序列的BgllI-XbaI片段克隆至pBSII-pAR-IAR-tNOS的″NcoI和SalI″位点，得到RGLSP-DGL编码序列由pAR-IAR调控的质粒pBIOC98。
经BglII和XbaI双酶切从pBIOC88上将带有RGLSP-DGL序列的BglII-XbaI片段切下来，0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱，进行乙醇沉淀，干燥并根据使用说明用Klenow酶处理。pBSII-pAR-IAR-tNOS质粒经SalI和NcoI双酶切，纯化，根据使用说明用绿豆芽核酸酶(Biolabs)处理和牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim)去磷酸化。20ng去磷酸化的载体和200ng上述带有RGLSP-DGL的DNA片段进行连接。20μl反应体系如上述含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所得质粒称为pBIOC98。
将带有来自pAct1-F4，相当于″gus基因编码序列的pAR-IAR-起点″序列的SnaBI-KpnI片段，克隆到pBSIISK+的″KpnI和Klenow处理的Eco01091″位点上，得到质粒pBSII-pAR-IAR-tNOS。上述100ng载体和50ng DNA片段进行连接，10μl反应体系含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。
将带有来自Clontech销售的pBI121的带tNOS序列的SacI-EcoRI片段，克隆到Stratagene销售的pBSIISK+的去磷酸化EcoRV位点上，得到质粒pBSII-tNOS。质粒pBI121经SacI和EcoRV双酶切，2％琼脂糖凝胶电泳纯并用T4 DNA聚合酶处理。上述20ng去磷酸化的载体和200ng带有tNOS序列的DNA片段进行连接。20μl反应体系含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。
将带有来自上述pBIOC41、相当于″pd35S-RGLSP-DGL″序列的Kpn1-BamH1片段，克隆到pBSIISK+的″Kpn1和BamHI″位点上，得到RGLSP-DGL编码序列由pd35S调控的质粒pBIOC99。上述100ng载体和50ngDNA片段进行连接，10μl反应体系含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。
将带有来自pJIT163的带t35S序列的Sma1-EcoRV片段，克隆到Stratagene销售的pBSIISK+中Klenow处理过的去磷酸化EcoRV位点上，得到质粒pBSII-t35S。质粒pJIT163经SmaI和EcoRV双酶切，2％琼脂糖凝胶电泳纯并用T4 DNA聚合酶处理。上述20ng去磷酸化的载体和200ng带有t35S序列的DNA片段进行连接。20μl反应体系含有2μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2μl 50％的聚乙二醇8000和5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃进行连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。
b)分别含RGLSP-DGL和RGLSP-DGL-KDEL并能在玉米种子的胚乳中表达的质粒pBIOC100和pBIOC101的构建
编码重组狗胃脂酶(DGL)的动物基因在玉米种子中表达需要下列调控序列：
1.如Reina等，1990所述的质粒pγ63中带有的玉米(pγzeine)γ-zeine基因启动子。在质粒pUC18的HindIII和EcoRI之间含有pBI221的″p35S-gus-tNOS”表达盒，由Clontech销售，在其HindIII和XbaI位点上克隆pγzeine，可以得到质粒pγ63。该启动子能在玉米种子的胚乳中表达。
2.转录终止序列，多聚ANOS终止子，其对应于根瘤土壤杆菌胭脂碱株的Ti质粒中胭脂碱合成酶基因的3’端非编码区。
将来自pBIOC41(上述)的″Klenow酶处理的XbaI-BglII″片段，克隆到质粒Pγ63的″BamHI和T4 DNA聚合酶处理的SscI″位点上，得到RGLSP-DGL编码序列由pγzeine调控的质粒pBIOC100。上述100ng载体和50ngDNA片段进行连接，10μl反应体系含有1μl10×T4 DNA连接酶缓冲液(Amersham)、2.5U T4 DNA连接酶(Amersham)，14℃连接16小时。转化预先制备的大肠杆菌DH5α(Hanahan，1983)。经50μg/ml氨苄青霉素筛选，用碱裂解法(Birnboim和Doly，1979)提取所得到克隆的质粒DNA，并进行限制性内切酶酶切分析。所得克隆称为pBIOC100。
按照上述的方法，通过PCR扩增，由带有四肽KDEL(可定位于内织网)编码序列的NcoI-AflII片段取代pBIOC100的NcoI-AflII片段并位于终止密码子之前，可得到质粒pBIOC101。PCR反应中所用的两个寡聚脱氧核苷酸为：5′AAT CAC TTG GAC TTT ATC TGG GCC ATGGAT GCC 3′(单一NcoI位点)和5′ATT CTT AAG AAA CTT TATTGC CAA ATG TTT GAA CGA TCG GGG AAA TTC GAC GCG TCTAGA ACT ATA GCT CAT CCT TAT TAT CTG TTC CCA TCA TGG3′(该序列编码KDEL并有单一AflII位点)。杂交温度为70C°。克隆过程如上所述。
V.转基因油菜植物的制备实例
春季油菜(Brassica napus cvWESTAR或Limagrain种)的种子在15％的Dometos溶液中消毒40分钟。无菌水清洗4次后，在直径7cm高10cm的罐中，以每罐20粒种子种于装有含30g/l蔗糖并经5g/l琼脂胶固化的Murashige and Skoog矿物质培养基(Sigma M 5519)中。这些罐置于26℃、光照期为16小时/8小时、光照强度为80μEm-2S-1的培养室中。
萌发5天后，无菌条件下切下子叶节1mm上方的每一叶柄，取下子叶。
同时，含质粒pBIOC29(或pBIOC25)的根瘤土壤杆菌LBA4404株在加有10ml细菌培养基2YT(Sambrook等，1989)的50ml锥形瓶中，28℃预培养36小时，培养基中添加了可用于筛选使用菌株的抗生素。质粒pBIOC29(或pBIOC25)为在质粒pGAEZ中插入了编码狗胃脂酶并融合到导向信号PPS(或PS)的序列，该序列由启动子pCRU或(pd35S)调控。
预培养物以1％的量接种到同样条件制备的新鲜细菌培养基中。14小时后，将培养物3,000g离心15分钟，菌体用等体积的液体发芽培养基悬浮，该悬浮液以5ml/皿的量分到5cm培养皿中。
叶柄的切断端在上述的准备好的土壤杆菌培养物内浸泡几秒钟，插入再生培养基几毫米。再生培养基具备萌发培养基的基本成分，并按4mg/l加入了一种可促进新芽萌生的植物激素苄基-氨基嘌呤(BAP)。每一直径9cm的培养皿(Greiner货号664102)种入十棵外植体(带叶柄的子叶)。
在与萌发相同的环境条件下共培养2天后，取出外植体并植入含上述培养基的Phytatray箱(Sigma，货号P1552)，培养基中添加了选择剂：45mg/l硫酸卡那霉素(Sigma，货号K4000)和600mg/l的制菌剂：1/6(重量比)的棒酸钾盐和5/6的阿莫西林钠盐(Augmentin，可注射)的混合物。
连续取出外植体并植入新的上述培养基中，间隔为三周。
在第二或第三次移植时出现绿芽，将其从外植体上分离，于含有无BAP的上述培养基的直径5cm高10cm的透明罐中单独生长。生长三周后，将转化幼芽的茎切断并移植到新的培养基罐中。3-4周后，胚根充分发育可以适应人工气候室。弃去不是绿色或无根胚芽。将这些胚芽移植到内有水饱和土壤的(标准NF U44551：40％棕泥、30％精选石南灌丛和30％砂)7cm边的碗中。在人工气候室中两周(温度21℃，光照时间16h/8h，相对湿度84％)后，将胚芽移植到直径12cm、含添加了慢作用肥料(Osmocote，4g/l土壤)的相同土壤的罐中，随后移植到室温18℃的温室(S2级)中，每天浇水两次，每次2分钟。
当花出现时，将花置于袋中(Crispac，货号SM 570y300mm*700mm)，以避免交叉受精。
豆英成熟后，收获、干燥并碾碎。所获得的种子用以生化活性分析。转基因子代通过萌发于含有100-150mg/l(决定于基因型)的硫酸卡那霉素的培养基上加以选择。除了在玻璃试管中进行萌发并且每管一粒种子之外，操作条件与上述相同。只有前三周内长出二级根的胚芽在进入温室前能适应人工气候室。
VI.转基因茄科植物的制备实例
a)转基因烟草植物的制备
用于转基因实验的烟草植物(Nicotiana tabacum var.Xanthi NC和PBD6)体外培养于Murashige和Skoog(1962)的基础培养基，按Gamborg等(1968，Sigma参考号M0404)，在培养基中加入维生素、20g/l蔗糖和8g/l琼脂(Merck)。培养基的pH用事先120℃20分钟灭菌的碳酸钾调整到5.8。烟草胚芽每三十天一次从植物节间切取并移植到MS20复合培养基。
所有体外培养在下列条件的气候控制室内进行：
-光照强度为30μE·m-2·S-1；光照期为16小时；
-白天保温在26℃，夜间24℃。
使用的转化技术来自Horsch等(1985)。
含质粒pBIOC29或pBIOC26或pBIOC25的根瘤土壤杆菌LBA4404株在LB培养基(Sambrook等，1989)中28℃振荡预培养48小时，培养基中添加了适当的抗生素(利福平和四环素)。预培养物50倍稀释到同样的培养基中，在同样的条件下培养。过夜后，离心培养物(10分钟，3,000g)，菌体用等体积的液体培养基MS30(30g/l蔗糖)悬浮，该悬浮液稀释10倍。
从上述培养的叶切下1cm的外植体。随后它们在菌悬液中浸泡1小时，然后在滤纸上快速干燥并置于共培养培养基中(固体MS30)。
两天后，外植体被转至培养皿中的再生培养基MS30中，该培养基含有选择剂卡那霉素(200mg/l)，抑菌剂Augmentin(400mg/l)和胚芽生长所需激素(BAP，1mg/l和ANA，0.1mg/l)。生长两周后，外植体再移植到同样的培养基中。再过两周后，胚芽移植到培养皿中的生长培养基上，该培养基为加入了卡那霉素和Augmentin的MS20培养基。15天后，移植半数的芽。生根约需20天，最后，胚芽可通过节间切取而克隆或置于温室。
b)转基因番茄植物的制备
番茄种子cv.UC82B在10％的Dometos溶液中消毒15分钟并用无菌水清洗3次。最后一次为振荡10分钟。
消毒的种子在培养基MSSV/2(Murashige和Skoog的基础培养基(1962，Sigma货号M6899/2)，并按Nitsch(Thomas Pratt，1981)添加了维生素、30g/l蔗糖和8g/l琼脂(Merck)，pH5.9)中于气候控制室7到8天(光照强度为30μE·m-2·S-1，光照期为16小时/8小时，26℃)萌发。
使用的转化技术来自Fillatti等(1987)。
含质粒pBIOC25或pBIOC26的根瘤土壤杆菌LBA4404株在LB培养基中28℃振荡预培养24小时，培养基中添加了适当的抗生素(利福平和四环素)。预培养物50倍稀释到同样的培养基中，在同样的条件下培养过夜。于600nm测量OD，离心土壤杆菌(10分钟，3,000g)，菌体用等体积的液体培养基KMCS(如Fillatti等，1987的文章所述)悬浮，使得600nm的OD为0.8。
在操作中所使用的技术改进如Fillatti等(1987)所述。
除了KCMS培养基中添加了乙酰丁香酮(200nM)之外，外植体的预培养和共培养如Fillatti等(1987)所述进行。
2Z清洗培养基的区别在于添加了500mg/l氨噻肟头孢霉素，以代替羧苄青霉素。所用的生长培养基为按Nitsch(Thomas Pratt，1981)添加了维生素、20g/l蔗糖、50mg/l卡那霉素、200mg/l augmentin、1mg/l ANA和0.5mg/l玉米素的Murashige和Skoog的基础培养基(Sigma MS6899)。
VII.转基因玉米植物的制备
a)作为遗传转化靶子的玉米愈伤组织的制备和应用
不论应用哪种方法(电转移；土壤杆菌；微管；基因枪)，玉米的遗传转化一般要求使用快速分裂的未分化的细胞，该细胞具有再生整个植物的能力。这类细胞包括玉米胚发生性愈伤组织(称II型)。
根椐Armstrong所述的方法和培养基(Malze Handbook；(1994)M.Freeling，V.Walbot Eds.；pp.625-671)，从未成熟的基因型H1 II或(A188 X B73)的胚获得愈伤组织。用这种方法获得的愈伤组织通过在初始培养基上每15天一次的连续种植进行增殖和保存。
根据Vain等所述的方法(植物细胞组织和器官培养(1989)，18：143-151)，通过调节细胞的激素和渗透平衡，从这些愈伤组织中再生小植物。然后，将这些植物适应温室，它们可进行杂交和自受精。
b)应用基因枪进行玉米的道传转化
上一段描述了转化所必须的细胞系的制备和再生；这里所描述的遗传转化方法将导致修饰基因稳定地整合在植物的基因组中。这种方法需应用与J.Finer(植物细胞报道(1992)11：323-328)所述相同的基因枪；靶细胞为段落1中所述的愈伤组织碎片。在轰击前4小时，将这些表面积为10-20mm2的碎片放在培养皿的中央，每个培养皿16个。培养皿中所含的培养基与初始培养基相同，其中添加了0.2M甘露醇和0.2M山梨醇。按操作说明，将带有待导入基因的质粒进行Qiagen柱纯化。然后按Klein所述的方法(自然(1987)327：70-73)沉淀在钨粒(M10)上。根据J.Finier(植物细胞报道(1992)11：323-328)所述的方法，用基因枪将包被的颗粒射入靶细胞。
装有如此轰击过的愈伤组织的平皿用Scellofrais封口，然后在27℃黑暗培养。24小时后第一次传代，每15天一次传3个月，培养基与初始培养基相同，其中添加了选择剂，选择剂的类型和浓度根椐所用基因而不同(见段落3)。可用的选择剂一般为某些除草剂(Basta，Round up)或抗生素(潮霉素，卡那霉素)的活性组分。
三个月后或早一些，可得到生长未被选择剂抑制的愈伤组织，通常该愈伤组织的大部分细胞是由一个将一个或多个拷贝的筛选基因整合到其基因中的细胞分裂而来。这种愈伤组织的收率约为每个轰击平皿0.8个。
这些愈伤组织被鉴定，独立化，扩增然后培养，以再生小植物(参见段落a)。为了避免非转化细胞的影响，所有的操作都在含选择剂的培养基中进行。
这些再生植物适应后并培养于温室，它们可进行杂交和自受精。
VIII.转基因烟草植物中狗胃脂酶表达的分析
a)方法：
从温室烟草植物上摘取烟草叶提取脂酶的方法如下：取1克(鲜重)烟草叶于液氮中研碎，4℃加入5ml pH7.5的含1mM EDTA及10mM巯基乙醇的25mM Tris-HCI缓冲液(缓冲液A)，或pH3的含1mM EDTA10mM β-巯基乙醇、0.2％Triton X-100及250mM NaCl的25mM甘氨酸-HCl缓冲液(缓冲液B)。全部的粉状物立即10000g，4℃离心15分钟。
用缓冲液B提取烟草种子，每4ml缓冲液加0.1克烟草种子。
在pH稳定剂存在的情况下，以丁酸甘油酯为底物，采用Gargouri等(1986)的滴定法测定脂酶活性。丁酸甘油酯乳剂(每30ml乳剂中加入4ml)是在胆盐(1.04g/L)、牛白蛋白(0.1g/L)及NaCl(9g/L)中于振荡器上制备的。分析是指当pH5.5和37℃时，用碳酸钠溶液中和脂酶作用下所释放的丁酸。1单位脂酶相当于在最佳pH值(5.5)和37C°时，作用1分钟可释放1mmol脂肪酸的酶量。天然(纯化的)狗胃脂酶的比活性为570U/mg蛋白。全部粉沫、沉淀或离心上清的脂酶活性都可进行测定。
离心上清(缓冲液A)中总可溶性蛋白的分析采用Bradford法(1976)。
用两批天然抗DGL多克隆抗体，对离心上清进行夹层ELISA实验(Carrière等，1993)。第一批为与人胃脂酶反应的抗体，该抗体为总抗血清经连接有人胃脂酶的Affigel 10柱(Aoubala等，(1993))亲和纯化的。这些抗体以1μg/ml的浓度用于包被ELISA板的孔。第二批抗体为不识别人脂酶的抗体。这些抗体依次进行琼脂糖柱纯化、结合蛋白A及结合生物素。固定后的抗体通过间接链抗生物素蛋白/过氧化物酶偶联法检测，其酶活性用底物邻苯二胺来确定。得到的结果为定性值，结果采用+、-符号记录。在提取缓冲液中加入CHAPS型去污剂(3-(3-胆酰胺丙)二甲基-铵基-1-丙烷磺酸盐)(SIGMA)可提高提取产量。实际上，在这一条件下，上清中的提取产量可提高100％(参见表1)。
                        表11％CHAPS存在下4株pBIOC25遗传转化而来的烟草植物的提取物中脂酶活性(U/g鲜重)
植物 0.2M NaCl/1mM EDTApH3.0     0.2M NaCl/1mM EDTApH3.0+1％CHAPS
    1234     80404354     11210410992
b)利用植物信号肽的表达；对pBIOC25及pBIOC26转化的烟草叶和种子分析；ELISA检测
表2所示为Xanthi基因型(15-20叶期)98株T0植物得到的结果。分析样品均为离心前的叶或种子的粉末。每种类型的酶活性依转化子的不同有很大差异。约20％的植物无酶活性或活性过低而无法检测。平均活性和最大活性见表2。
三种类型的蛋白总量是相似的，叶子中平均为7和8mg/g鲜重，种子中平均为34、31和38mg/g鲜重。
pBIOC26转化的叶子的平均脂酶活性为34U/g鲜重，即总蛋白中有0.8％的表达。种子的平均酶活性为36U/g，即0.2％表达。活性最高的转化子其活性分别为146U/g鲜重(叶，2.5％表达)及148U/g鲜重(种子，0.7％表达)。
对pBIOC25转化植物的酶活性分析与此类似。叶中的平均活性为34U/g鲜重(0.8％表达)，最大活性为134U/g鲜重(总蛋白的3％)。种子中的平均活性为42U/g鲜重(0.3％)，最大活性为159U/g鲜重(1％)。
pBIOC29转化的植物中，叶内未检测到酶活性(种子特异性启动子)。种子内平均酶活性为12U/g鲜重(0.1％表达)，最大酶活性为137U/g鲜重(0.7％)。
一般来说，同一转化中的叶和种子的表达是平行的。
ELISA检测的结果也与酶活性分析是一致的，即具有酶活性的植物在ELISA检测中为阳性。
对于这些同样的植物，随后所得到的结果显示脂酶的活性在植物的生长过程中可发生变化。确实，就总蛋白而言，有表达的植物12-15叶期时表达3％，此后的分析(有花的成熟植物)显示6％表达。
            表2：XANTHI烟草叶及种子的脂酶表达
  构建体     器官     总蛋白mg/g鲜重     脂酶活性
  U/g鲜重 表达(％总蛋白)
  最低-最高(平均)    最低-最高(平均)   最低-最高(平均)
pBIOC26     叶(n＝34)种子(n＝34)     3-15(7)24-43(34)     0-145.6(34.4)0-147.6(36.3)     0-2.5(0.8)0-0.7(0.2)
pBIOC25     叶(n＝35)种子(n＝35)     3-18(8)17-35(31)   0-133.5(34)0-158.5(41.9)      0-3(0.8)0-1(0.3)
pBIOC29     种子(n＝29)     29-55(38)     0-137.4(11.8)      0-0.7(0.1)
鲜重：新鲜重量；最低：转化物中表达的最低值；最高：转化物中表达的最高值；n：，所分析的转化物数量
b)利用RGL信号肽的表达；烟草叶脂酶活性分析。
44株Xanthi及pBD6基因型T0植物的分析结果如下：
所有分析均使用离心前的叶混合粉末。酶活性分析显示不同转化体间差异很大。约20％植无活性或活性过低无法检出。对于pBIOC41转化的叶的平均脂酶活性，Xanthi基因型为38U/g鲜重，pBD6型为48U/g鲜重。最大活性分别为152及226U/g鲜重。
IX.转基因蕃茄植物中狗胃脂酶表达的分析
a)方法
除将1g新鲜样品浸于4ml缓冲液B中之外，由番茄的叶和果实中提取脂酶的方法与烟草叶所述的相同。脂酶活性的测定按烟草叶所述。
b)番茄果实的分析
对三十个原代转化物的果实进行了分析。
相同的转化物不同果实所分析的脂酶的活性是不同的。成熟果实平均为5U/g鲜重，不成熟的果实为35U/g鲜重，而与试验的构建物类型无关(pBIOC25或pBIOC26)。
应该指出的是，在果实成熟的过程中，活性下降。例如，对于给定的原代转化物，直径10cm的绿色果实其脂酶的活性为132U/g鲜重，直径33mm的红绿色果实为44U/g鲜重，直径45mm的红色果实为36U/g鲜重。
X.″WESTERN″型重组DGL的免疫检测
a)转基因烟草和油菜的叶和种子所表达的DGL
a.1)用植物信号肽表达；pBIOC25、pBIOC26和pBIOC29转化的烟草和油菜的叶和种子的免疫检测
对烟草和油菜的叶和种子用缓冲液A和B提取(提取方法见上文)的蛋白，进行狗胃脂酶的″Western′型的免疫检测实验(″蛋白印迹法″)(Renart和Sandoval，1984)。为了进行这些实验，首先按照Laemmli U.K.(1970)的技术，将提取的蛋白(每个样本30μg总蛋白)于12.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶中分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。由几内亚猪得到的抗狗胃脂酶的多克隆抗体作为探针，利用碱性磷酸酶标记的抗几内亚猪的IgG抗体进行检测。
对照蛋白为天然狗胃脂酶(LC.图6)，该蛋白以单一条带的形式迁移至表观分子量约50kDa处。狗胃脂酶在非转化的烟草叶提取物中的迁移速度稍慢(图6，LC+T)。
非转化的烟草和油菜的叶和种子的蛋白提取物没有检测到条带。烟草叶所产生的脂酶为两条带。量最大的条带具有约37kDa的表观分子量，与上述的多肽(Δ54)相一致。量小的条带具有约49kDa的表观分子量，与上述的多肽(Δ4)相一致(图6，F)。在种子的蛋白提取物中，只能看到低分子量的条带(图6，GT和GC)。
a.2)用RGL的信号肽表达；pBIOC41转化的烟草叶和种子的免疫检测
对烟草叶和种子用缓冲液B提取(提取方法见上文)的蛋白，进行蛋白印迹(Renart和Sandoval，1984)。首先按照Laemmli U.K.(1970)的技术，将提取的蛋白于12.5％的变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)中分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。由几内亚猪得到的抗狗胃脂酶的多克隆抗体作为探针，利用碱性磷酸酶标记的抗几内亚猪的IgG抗体进行检测。
图7所示为一个烟草叶的蛋白印迹实例。对照蛋白为天然狗胃脂酶(LC.图6)，该蛋白以单一条带的形式迁移至表观分子量约50kDa处。非转化的烟草叶的蛋白提取物无检测条带(T)。叶子提取物中所得的脂酶为具有约48-49kDa的表观分子量的主带，与上述的多肽(D4)相一致。
在pBIOC41转化的烟草种子中，重组脂酶与叶子的形式相同。
b)转化烟草叶蛋白提取物中的DGL：去糖基化实验
用于去糖基化实验的蛋白的提取方法如下：0.5g叶子(鲜重)在液氮中磨碎，然后加入1ml变性缓冲液(100mM磷酸缓冲液，pH7.5，加入1％β-巯基乙醇，25mM EDTA和1％SDS)，置于4℃。磨碎的样品10000g、4℃离心15分钟。上清液100℃孵育5分钟，以变性蛋白，接着10000g离心2分钟。然后上清液用去糖基化缓冲液(100mM磷酸缓冲液，pH7.5，加入1％β-巯基乙醇，25mM EDTA，1％SDS和1％辛基葡糖苷)稀释10倍。以每100μl上清液1U的量加酶(N-糖苷酶F，PNGase Boehringer)。每份样品设置一无酶对照。对照蛋白(狗或兔的胃脂酶)的去糖基化反应在同样的条件下进行。各种蛋白样品室温下孵育8小时。然后如上段所示，将这些蛋白经聚丙烯酰胺胶电泳分离，并转移到硝酸纤维素膜上。
根据″蛋白印迹″的结果所示，作为对照的胃脂酶的表观分子量约为50kDa。去糖基化以后其表观分子量仅约为43kDa。
烟草叶所形成的脂酶，除了没有PNGase外，在上述的条件下孵育后，出现表观分子量为49(多肽(Δ4))，37(多肽(Δ54))和28kDa的三条带。分子量为28kDa的条带无疑是室温孵育8小时过程中发生蛋白降解的结果。去糖基化反应之后，三条带的分子量减少了约1-2kDa，这表明烟草叶所形成的蛋白被糖基化。
c)转基因番茄的叶和果实中表达的DGL
对番茄的叶和果实用缓冲液B提取(提取方法见上文)的蛋白，进行狗胃脂酶的″Western″型的免疫检测实验。为了进行这些实验，如段落X.a)所示，将提取的蛋白(叶和果实分别为15μg和6μg可溶性总蛋白)于变性聚丙烯酰胺胶中分离。
对照蛋白为天然狗胃脂酶(泳道4，图8)，该蛋白以单一条带的形式迁移至表观分子量约50kDa处。
非转化的番茄的叶和果实的蛋白提取物没有检测到条带。
番茄的叶和果实所产生的脂酶为两条带，无论使用哪种质粒(pBIOC25或pBIOC26)。量大的条带具有约37kDa的表观分子量，与上述的多肽(Δ54)相一致。量小的条带具有约49kDa的表观分子量，与上述的多肽(Δ4)相一致(图8)。
XI.植物中狗胃脂酶的纯化
a)烟草叶中DGL的纯化
烟草叶所产生的狗胃脂酶的活性采用滴定法测定，应用pH稳定剂(Mettler-Toledo-DL25)调节pH保持在5.5，温度为37℃，以三丁酸甘油酯为底物：1ml三丁酸甘油酯经涡旋振荡器乳化至29ml 0.15M NaCl的水溶液中。此分析为在剧烈机械振荡以保持乳化状态的同时，通过加入0.02的碳酸钠中和脂酶作用下释放的丁酸。一脂酶单位相当于在这些pH和温度条件下，每分钟释放1毫摩尔脂肪酸。
首次层析后，参照Gargouri等(1986)所示的分析方法，取1ml三丁酸甘油酯和29ml的0.15M NaCl，2mM牛璜脱氧胆酸和1.5μM牛血清白蛋白的溶液形成的乳剂0.5ml，作为分析样本，来确定脂酶的活性。
1克冻干的叶于4℃，在30ml pH5.2的20mM甘氨酸缓冲液中磨碎，温和搅拌混合物15分钟。浸泡过程中，加入1N HCL，以保持pH为2.5。浸泡物15000g离心5分钟。加入1N NaOH调节上清液的pH到4。经MIRACLOTH(Calbiochem)过滤后，所有上清液以每分钟1ml的流速上样于10ml(直径1.6cm)阳离子交换树脂柱(S-琼脂糖快流速树脂Pharmacia)，柱子已用pH4.0的20mM乙酸钠缓冲液和20mM NaCl平衡过。以2ml一份收集。上清液滤过后，用40ml平衡缓冲液洗柱，滞留在柱子上的蛋白按照下列方法洗脱：
-以20mM，pH4.0的乙酸钠缓冲液中20mM至210mM NaCl的线性梯度在30分钟的过程中洗脱第一组无脂酶活性的蛋白峰，取1ml分析样本进行测定，
-210mM NaCl稳定20分钟
-以20mM，pH4.0的乙酸钠缓冲液中210mM至500mM NaCl的线性梯度在30分钟的过程中洗脱第二组蛋白峰。用0.5ml分析样本测出脂酶活性在第二梯度中离子强度为300-400mM时被洗脱。
收集活性流份，用分子量限为30kDa的OMEGACELL浓缩室(Filtron技术公司)进行浓缩。
在10mM Tris-HCl，pH8缓冲液中透析浓缩物12小时，然后上样于经10mM Tris-HCl，pH8缓冲液平衡的阴离子交换树脂柱(MonoQ HR5/5，直径0.5cm，高5cm-Pharmacia)。取0.5ml分析样本测定脂酶活性。流速保持在每分钟1ml，即压力为2.0mPa。洗脱未滞留的组份之后，用10ml 10mM Tris-HCl，pH8缓冲液冲洗，于60分钟内进行离子强度为0mM至400mM NaCl的线性梯度洗脱。具有脂酶活性的部分在100mM至200mM之间洗脱。
收集活性部分，并用分子量限为30KDa的OMEGACELL浓缩器浓缩。浓缩物为纯化的烟草叶提取的狗胃脂酶。
按M.Bradford(1976)的方法，测定浓缩上清中蛋白的浓度，并根据O.H.Lowry(1951)的方法测定第一次离子交换层析后的溶液。
按照U.K.Laemmli(1970)的技术，在纯化过程的各阶段进行变性聚丙烯酰胺胶(SDS-PAGE)电泳分析。聚丙烯酰胺胶电泳分离的蛋白，一方面用考马斯亮蓝染色，另一方面在20mM Tris碱，150mM亮氨酸和20％乙醇中以每cm2 2.3mA电流经半干电转移技术(Transblot SD，BIORAD)转移到硝酸纤维素膜上。转移到硝酸纤维素膜上的重组狗胃脂酶按下述方法进行免疫检测：
-用来自几内亚猪的狗胃脂酶多克隆抗体标记靶蛋白，抗体用加入5％脱脂奶粉和0.1％的Tween 20的PBS缓冲液1/5000稀释，室温标记一小时。
-用加入5％脱脂奶粉和0.1％的Tween 20的PBS缓冲液水浴，连续浸膜三次，每次10分钟。
-用加入5％脱脂奶粉和0.1％的Tween 20的PBS缓冲液1/2000稀释的结合了过氧化物酶(Sigma)的抗-几内亚猪抗体，室温标记1小时。
-用加入5％脱脂奶粉和0.1％的Tween 20的PBS缓冲液水浴，连续浸膜三次，每次10分钟。
-在H2O2中，过氧化物酶作用于4-氯-1-萘酚(Sigma)，能产生长时间稳定的蓝色，以此进行检测。
叶中产生的脂酶为约49(多肽(Δ4))kDa和37(多肽(Δ54))kDa的两条带。
b)烟草叶中DGL的纯化的另一方案
参照Gargouri等(1986)所述的滴定法，应用pH稳定剂(Mettler-Toledo-DL25)测定烟草叶所产生的狗胃脂酶的活性。
以三丁酸甘油酯为底物，对短链甘油三酯进行分析：1ml三丁酸甘油酯乳化至29ml 0.15M NaCl，2mM牛璜脱氧胆酸钠(NaTDC)和1.5μM牛血清白蛋白(BSA)的水溶液中。调节pH保持在5.5，温度为37℃。
此分析为在剧烈机械振荡以保持乳化状态的同时，通过加入0.02N的碳酸钠中和脂酶作用下释放的丁酸。
对长链甘油三酯进行的分析以30％纯化的大豆油、1.2％纯化的卵磷脂、1.67％无水甘油(IntralipidTM 30％-PHARMACIA ABStockholm，Sweden)的水相乳剂为底物。10ml该悬液被乳化到20ml的0.15M NaCl、30μM BSA和3.5mM CaCl2的水溶液中。调节pH保持在4.0，温度为37℃。
该分析为在剧烈机械振荡以保持乳化状态的同时，pH值从4跃升至9之后，通过加入0.2N的碳酸钠中和脂酶作用下释放的脂肪酸。
一脂酶单位相当于在这些pH和温度条件下，每分钟释放1毫摩尔脂肪酸。
2克冻干的叶于4℃，在60ml pH3的0.2M NaCl中磨碎，温和搅拌混合物15分钟。浸泡过程中，加入1N HCL，以保持pH为3。浸泡物10000g离心10分钟。加入1N NaOH调节上清液的pH到4。经MIRACLOTH(Calbiochem)和0.45μ的MILLIPORE过滤后，所有上清液以每分钟8ml的流速(240cm/h)上样于阳离子交换树脂柱(RESOURCE S 6ml-Pharmacia-16mm i.d.x 30mm)，柱子已用pH3的20mM乙酸钠缓冲液和0.2M NaCl平衡过。
未滞留的组份通过之后，用30倍柱体积的平衡缓冲液洗柱，滞留在柱子上的蛋白以7个柱体积的20mM(pH3)的乙酸钠缓冲液中0.2M至0.5M NaCl的线性梯度洗脱。以4ml一份收集。
用0.5ml分析样本测出脂酶活性在离子强度为0.35M NaCl时被洗脱。
收集活性部分，并用分子量限为30kDa的OMEGACELL浓缩器浓缩。
按O.H.Lowry(1951)方法，测定浓缩上清中蛋白的浓度。
显示了聚丙烯酰胺胶和该胶转移到硝酸纤维素膜并用抗狗胃脂酶抗体进行检测的结果的一个实例(图9和10)。通过在激活剂中过氧化物酶对鲁米那(ECL蛋白印迹-AMERXHAM LIFE SCIENCE)的作用进行检测并记录于光敏胶片上。
-采用以下方法测定蛋白上的多糖残基：
.将蛋白固定于硝酸纤维素膜上
.用过碘酸处理
.与碱性磷酸酶偶联的链亲和素进行特异性反应
.用碱性磷酸酶(GLYCOTARCK OXFORD GLYLOSYSTEM)进行显色反应。
显示了检测多糖残基的膜的一个实例(图11)。
经高效液相色谱确定组份的纯度。
色谱WATERS 625 LC
二极管射线检测器WATERS 991
柱VYDAC C4
洗脱条件：
  时间(分钟)   流速(毫升/分钟)     ％A     ％B
    0     1     100     0
    35     1     40     60
    40     1     40     60
    45     1     20     80
    50     1     100     0
缓冲液A：89.9％H2O、10％乙氰、  0.1％三氟乙酸
缓冲液B：100％乙氰纯化表：重组DGL
  总单位数* 蛋白毫克数 比活性 纯化因子     收率
    匀浆     3200     /     /     /     /
  上清     2800     230     13     1     88％
  来源物     1600     6     250     20     50％
*三丁酰甘油酯单位天然狗胃脂酶和重组狗胃脂酶(r-DGL)比活性的比较
    n-DGL*     从烟草叶中提取的r-DGL
三丁酰甘油酯     570U/mg     250U/mg
  30％内脂   1000U/mg     950U/mg
*参考：Carrière等，(1991)欧洲生化杂志，202，75-83c)油菜籽中DGL的纯化油菜籽产生的重组DGL的活性测定与叶提取物的方法相同。10克油菜籽在液氮中磨碎。粉状物先浸于4℃的己烷中轻振脱脂12小时。倾析后，去除己烷。然后粉状物两次浸于4℃100ml己烷中轻振，每次1/2小时。倾析去除己烷。粉状物于旋转蒸发器上干燥(HEIDOLPH94200)。脱脂粉末储存于-20℃。
将脱脂粉末浸于4℃的pH3(1N HCl)0.2M NaCl溶液中30分钟来提取DGL，每0.1g粉末加入2ml NaCl溶液。浸泡生成的产物10000g 4C°离心10分钟。
弃去沉淀。上清含有菜籽提取物。
菜籽提取物经含10mM乙酸钠(pH4)、140mM NaCl、3mM KCl的缓冲液透析，然后通过免疫亲和柱，该柱由结合有从几内亚猪所得到的抗狗胃脂酶多克隆抗体的树脂(hydrazide Avidgel-BIOPROBEINTERNATIONAL，Inc.)构成。
树脂和菜籽提取物在温和振荡下4℃结合30分钟。然后浸泡在10倍柱体积的10mM乙酸钠(pH4)、150mM NaCl、3mM KCl的缓冲液中。用5倍柱体积的0.2M甘氨酸(pH2.8)、150mM NaCl的缓冲液洗脱DGL。收集的部分为1倍的柱体积，并含有1/20(V/V)的1M Tris(pH9)缓冲液。变性聚丙烯酰胺胶电泳分析显示出一分子量为37kDa的蛋白(参见图12)。
XII.脂肪酸酯的合成
用非转化的油菜籽进行测定，提供的脂酶为：
-固定化酶制剂(lipozyme(NOVO))或游离形式(兔胃脂酶(J04002))，
-或以狗胃脂酶基因转化的烟草种子的形式(烟草T14-44 0.85％的表达)
在旋转台(250rpm)上的密闭瓶塞玻璃瓶中，37℃进行酯化反应12小时。所用有机溶剂为己烷，脂肪酸在己烷中是可溶的。据菜籽中三酰甘油酯的理论含量加入计量的甲醇。
油菜中脂肪酸的主要成分为油酸，所选择的参照也为油酸的甲基酯。合成反应用薄层层析(TLC)来检测。展开剂为己烷、乙醚和水(70∶10∶1)的混合物。将溶于乙醇的5％硫酸溶液喷于层析板后，加热进行检测。
第一项实验中，27μl甲醇(0.66mmol)和0.02g脂酶(lipozyme)加入到0.2g菜籽油(0.22mmol)中：与油酸甲酯参照的水平相比，无点出现(图13，第2栏)。
第二项实验中，菜籽油被0.5g干的油菜籽粉末代替，加入1ml己烷：合成了甲基酯(图13，栏5)。
在下列实验中，经下列修改后重复上述条件：脂酶(lipozyme)的量减少到0.006g而且脂酶(lipozyme)换成兔胃脂酶(0.007g的JO4002)。有脂酶(lipozyme)存在时，油酸甲酯才被合成，而JO4002存在则无合成(图14，栏2)。
最后，在最后的实验中，脂酶由转化的烟草种子所提供(1g烟草种子)。出现一甲酯特定的点(图15，栏3)。
总之，上述结果证实了，如果将油菜籽提取物、醇和转基因烟草所产生的狗胃脂酶混合，可产生导致用作生物燃料的甲酯合成的酯化反应。
图表注释：
-图1：编码DGL的cDNA核苷酸序列，
-图2：DGL的氨基酸序列，
-图3：由编码DGL的cDNA核苷酸序列所衍生的、编码图2所示的DGL的核苷酸序列，
图4：编码HGL的cDNA核苷酸序列和HGL的氨基酸序列，
图5：HGL的氨基酸序列
-图6：pBIOC26、pBIOC25和pBIOC29转化的Xanthi烟草叶和种子及油菜籽所产生的重组多肽的免疫检测；E，分子量范围；LC，狗胃脂酶；F，烟草叶；GT，pBIOC25转化的烟草种子；GC，pBIOC29转化的油菜籽；T，非转化的烟草叶，
-图7：pBIOC25和pBIOC41转化的烟草叶所产生的重组多肽的免疫检测；E，分子量范围；LC，狗胃脂酶；1和3，pBIOC41转化的烟草叶；2，pBIOC25转化的烟草叶；T，非转化的烟草叶，
-图8：pBIOC25和pBIOC26转化的番茄的叶和果实所产生的重组多肽的免疫检测：
T1：非转化的番茄果实
1和3：转化的番茄果实
2：转化的番茄的叶
R：分子量范围
LC：狗胃脂酶
T2：非转化的番茄的叶
-图9：变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)
1：油菜籽提取物
2：烟草叶所产生的重组狗胃脂酶
3：天然狗胃脂酶
4：分子量范围
-图10：转移到硝酸纤维素膜后进一步的免疫检测分析
1：天然狗胃脂酶
2：烟草叶所产生的重组狗胃脂酶
3：油菜籽提取物
-图11：从聚丙烯酰胺凝胶转移到硝酸纤维素膜后的多糖残基的检测
1：油菜籽提取物
2：烟草叶所产生的重组狗胃脂酶
3：天然狗胃脂酶
-图12：油菜籽产生的r-DGL的免疫纯化物的SDS-PAGE分析
1：天然狗胃脂酶
2：重组狗胃脂酶
3-6：从免疫纯化柱洗脱的非保留部分
-图13：TLC板检测；1：菜籽油，无酶；2：菜籽油+脂酶；3：油酸甲酯；4：油菜籽，无酶；5：油菜籽+脂酶，
-图14：TLC板检测；1和4：油菜籽，无酶；2：菜籽油+J04002；3：油酸甲酯；5：油菜籽+脂酶，
-图15：TLC板检测；1：单油酸甘油酯，二油酸甘油酯，三油酸甘油酯；2：油酸甲酯；3：油菜籽+转化的烟草种子。
            参考文献An等，植物生理学，81，301-305(1986)An G.，植物生理学，81，86-91(1986)Aoubala M.，Daniel C.，De Caro A.，Ivanova M.G.，Hirn M.，Sarda L.和Verger R.，欧洲生化杂志，211，99-104(1993)Barta等，植物分子生物学，6，347-357(1986)Bednarek S.Y.和Ralkhel N.V.，植物细胞，3，1195-1206(1991)Berg D.E.，Berg C.M.，生物技术，1，417-435(1983)Bernard C.，C.R.Acad.Sci.，28，249-253(1849)Bevan等，自然，304，184-187(1983)Bevan M.，核酸研究，12，8711-8721(1984)Birnboim H.C.，Doly J.，核酸研究，7，1513-1523(1979)Bodmer M.W.等，生化生物物理杂志，909，237-244(1987)Bradford M.，生化文集，72，248(1976)Brodelius等，FEBS通讯，103，93-97(1979)Brodelius，于：Moo-Young M.编辑，固定化酶和细胞反应器：基础和应用，Elsevier，Londres(1988)Carriere等，欧洲生化杂志，202，75-83(1991)Carriere F.，Laugier R.，Barrowman J.A.，Douchet I.，Piymenko N.和Verger R.，肠胃病学杂志28，443-445(1993)Close J.J.，Rodriguez R.L.，基因，20，305-316(1982)De La Penna等，自然，325，274-276(1987)Deno等，植物生理学杂志，131，315-322(1987)Depicker等，应用分子遗传学杂志，1，561-573(1982)Depigny-Tris等，植物分子生物学20，467-479(1992)De Zoeten等，病毒学，172，213-222(1989)Docherty A.J.P.等，核酸研究，13，1891-1903(1985)Edelbaum等，干扰素研究杂志，12，449-453(1992)Franck等，细胞，21，285-294(1980)Fillatti J.J.，Kiser J.，Rose R.和Comai L.，生物技术5，726-730(1987)Gamborg O.L.，Miller R.A.和Ojima K.，细胞研究快讯50，151-158(1968)Gargouri Y.，Pieroni G.，Rivière C.，Saunière J-F.，Lowe P.A.，Sarda L.和Verger R.，肠胃病学，91，919-925(1986)Gargouri Y.等，生化生物物理杂志，1006，255-271(1989)Gaubier等，分子基因遗传学，238，409-418(1993)Giller等，生物化学杂志，16509-16516(1992)Guerineau F.，Mullineaux P.，植物分子生物学LABFAX，Groy R.R.D.(编辑)，Nios.科学报刊出版社，Blackwell科学报刊出版社，Blackwell科学报刊出版社，121-124(1993)Hanahan D.，分子生物学杂志，166，577-580(1983)Hein R.，植物中生产重组蛋白的国际会议，累斯特p.22(1994)Herrera-Estrella等，自然，303，209-213(1983a)Herrera-Estrella等，EMBO杂志，2，987-995(1983b)Hiatt和Ma，FEBS，307，71-75(1992)Hiatt等，自然，342，76-79(1989)Higo等，生物科学生化，57，1477-1481(1993)Holsters等，分子基因遗传学，163，181-187(1978)Horsch R.B.，Fry J.E.，Hoffman N.L.，Eichholtz D.和Rogers S.G.，科学，227，1229-1231(1985)Jouanin等，植物科学，53，53-63(1987)Kay等，科学，236，1299-1302(1987)Laemmli U.K.，自然，227，680-685(1970)Liu等，分子植物微生物关系，6，144-156(1993)Lowry O.H.，生物化学杂志，，173，265-275(1951)Ma等，植物中生产重组蛋白的国际会议，累斯特，p.39-40(1994)McElroy等，分子基因遗传学，231，150-160(1994)Marx，科学，216，1305-1307(1982)Mason等，美国科学院院报，89，11745-11749(1992)Matsouka K.，Nakamura K.，美国科学院院报，88，834-838(1991)Moloney等，植物中生产重组蛋白的国际会议，累斯特，p.36-38(1994)Moreau H.等，生化生物物理杂志，960，268-293(1988)Murakami等，植物分子生物学，7，343-355(1986)Murashige T.和Skoog F.，植物生理15，473-497(1962)Ni等，植物杂志，7，661-667(1995)Reina等，核酸研究，18，6426(1990)Renart J.和SandoValI.V.，酶学方法，104，455-460(1984)Russel D.，植物中生产重组蛋白的国际会议，累斯特，p.43(1994)Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室发行(1989)Sanford J.C.，生物技术学进展，6，299-302(1988)Sanger等，美国科学院院报，74，5463-5467(1977)Schroeder M.R.Borkhsenious O.N.，Matsouka K.，Nakamura K.和Ralkhel N.V.，植物生理学，101，451-458(1993)Shonheyder F.和Volquartz K.，Acta Physiol.Scand.，9，57-67(1945)Sijmons等，生物技术，8，217-221(1990)Thomas B.R.和Pratt D.，理论应用遗传学59，215-219(1981)Truve等，生物.技术，11，1084-1052(1993)VandekerckoVe F.等，生物技术，7，929-932(1989)Volhard F.，Z.，临床医学，42，414-429(1901)
               序列表(1)一般信息
(i)申请人
   (A)姓名：BIOCEM  S.A.
   (B)街道：24，avenue des Landais
   (C)城市：AUBIERE
   (E)国家：法国
   (F)邮政编码(ZIP)：63170
   (A)名称：INSTITUT DE TRCHERCHE JOUVEINAL
   (B)街道：3-9，rue de la Loge
   (C)城市：FRESNES
   (E)国家：法国
   (F)邮政编码(ZIP)：94265 CEDEX
(ii)发明题目：植物产生的重组前十二指肠脂酶和多肽衍生物、及其制备方法和用途
(iii)序列数目：6
(iv)计算机可读形式：
   (A)介质类型：软盘
   (B)计算机：IMB PC兼容
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatenIn Release#1.0，版本#1.25(EP0)
(vi)在先申请资料：
   (A)申请号：FR 9504754
   (B)申请日：1995年4月20日(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：
(A)长度：1528碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA到mRNA(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..1137(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：TTG TTT GGA AAG CTT CAT CCC ACA AAC CCT GAA GTG ACC ATG AAT ATA      48Leu Phe Gly Lys Leu His Pro Thr Asn Pro Glu Val Thr Met Asn Ile1               5                  10                  15AGT CAG ATG ATC ACC TAC TGG GGA TAC CCA GCT GAG GAA TAT GAA GTT           96Ser Gln Met Ile Thr Tyr Trp Gly Tyr Pro Ala Glu Glu Tyr Glu Val
         20                  25                  30GTG ACC GAA GAC GGT TAT ATC CTT GGG ATC GAC AGA ATT CCT TAT GGG          144Val Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Leu Gly Ile Asp Arg Ile Pro Tyr Gly
     35                  40                  45AGG AAA AAT TCA GAG AAT ATA GGC CGG AGA CCT GTT GCA TTT TTG CAA          192Arg Lys Asn Ser Glu Asn Ile Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gln
 50                  55                  60CAC GGT TTG CTC GCA TCA GCC ACA AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC          240His Gly Leu Leu Ala Ser Ala Thr Asn Trp Ile Ser Asn Leu Pro Asn65                  70                  75                  80AAC AGC CTG GCC TTC ATC CTG GCC GAC GCC GGG TAC GAC GTG TGG CTG          288Asn Ser Leu Ala Phe Ile Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Val Trp Leu
             85                  90                  95GGG AAC AGC AGG GGC AAC ACC TGG GCC AGG AGG AAT CTG TAC TAC TCG          336Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Ash Leu Tyr Tyr Ser
        100                 105                 110CCC GAC TCC GTC GAA TTC TGG GCT TTC AGC TTT GAC GAG ATG GCT AAA          384Pro Asp Ser Val Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys
    115                 120                 125TAT GAC CTT CCC GCC ACC ATT GAC TTC ATC TTG AAG AAA ACG GGA CAG          432Tyr Asp Leu Pro Ala Thr Ile Asp Phe Ile Leu Lys Lys Thr Gly Gln
130                 135                 140GAC AAG CTA CAC TAC GTT GGC CAT TCC CAG GGC ACC ACC ATT GGT TTC          480Asp Lys Leu His Tyr Val Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile Gly Phe145                 150                 155                 160ATC GCC TTT TCC ACC AAT CCC AAG CTG GCG AAA CGG ATC AAA ACC TTC          528Ile Ala Phe Ser Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg Ile Lys Thr Phe
            165                 170                 175TAT GCA TTA GCT CCC GTT GCC ACC GTG AAG TAC ACC GAA ACC CTG TTA          576Tyr Ala Leu Ala Pro Val Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu
        180                 185                 190AAC AAA CTC ATG CTC GTC CCT TCG TTC CTC TTC AAG CTT ATA TTT GGA          624Asn Lys Leu Met Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu Ile Phe Gly
    195                 200                 205AAC AAA ATA TTC TAC CCA CAC CAC TTC TTT GAT CAA TTT CTC GCC ACC          672Asn Lys Ile Phe Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gln Phe Leu Ala Thr
210                 215                 220GAG GTA TGC TCC CGC GAG ACG GTG GAT CTC CTC TGC AGC AAC GCC CTG          720Glu Val Cys Ser Arg Glu Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu225                 230                 235                 240TTT ATC ATT TGT GGA TTT GAC ACT ATG AAC TTG AAC ATG AGT CGC TTG         768Phe Ile Ile Cys Gly Phe Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu
            245                 250                 255GAT GTG TAT CTG TCA CAT AAT CCA GCA GGA ACA TCG GTT CAG AAC GTG         816Asp Val Tyr Leu Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gln Asn Val
        260                 265                 270CTC CAC TGG TCC CAG GCT GTT AAG TCT GGG AAG TTC CAA GCT TTT GAC         864Leu His Trp Ser Gln Ala Val Lys Ser Gly Lys Phe Gln Ala Phe Asp
    275                 280                 285TGG GGA AGC CCA GTT CAG AAC ATG ATG CAC TAT CAT CAG AGC ATG CCT         912Trp Gly Ser Pro Val Gln Asn Met Met His Tyr His Gln Ser Met Pro
290                 295                 300CCC TAC TAC AAC CTG ACA GAC ATG CAT GTG CCA ATC GCA GTG TGG AAC         960Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr Asp Met His Val Pro Ile Ala Val Trp Asn305                 310                 315                 320GGT GGC AAC GAC TTG CTG GCC GAC CCT CAC GAT GTT GAC CTT TTG CTT         1008Gly Gly Asn Asp Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu
            325                 330                 335TCC AAG CTC CCC AAT CTC ATT TAC CAC AGG AAG ATT CCT CCT TAC AAT         1056Ser Lys Leu Pro Asn Leu Ile Tyr His Arg Lys Ile Pro Pro Tyr Asn
        340                 345             350CAC TTG GAC TTT ATC TGG GCC ATG GAT GCC CCT CAA GCG GTT TAC AAT         1104His Leu Asp Phe Ile Trp Ala Met Asp Ala Pro Gln Ala Val Tyr Asn
    355                 360                 365GAA ATT GTT TCC ATG ATG GGA ACA GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT       1157Glu Ile Val Ser Met Met Gly Thr Asp Asn Lys
370                 375TATTCTTTTA TTGTTCCAAA ATACGTTCTT CTCTCACACG TGGTTTTCTA TCATGTTTGA       1217GACACGGTGA TTGTTCCCAT GGTTTTGATT TCAGAAATGT GTTAGCATCA ACAATCTTTC       1277CATTGGTAAT TTTTGAATTT AAAATGATTT TTAAATTTGG GGCATCTGGG TGGCTCAGTT       1337GGCTAAGTCG TCTGCCTTGG CTTAAGTCAT GATCTCGGGG TCCTAGGATG GAGCCTTGTG       1397TCTGGGCTCC TGCCGGGGCG GGGGTCTGCT TCTCCTCCTG CTGCTCCCCC CTGCTGCTGT       1457GTGCACACAC GCTCTCTCTC TCTCAAATAA ATAAATAAAT AAATACTTAA TAAAATAAAA       1517AAAAAAAAAA A                                                            1528(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：
(A)长度：379氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Leu Phe Gly Lys Leu His Pro Thr Asn Pro Glu Val Thr Met Asn Ile1               5                  10                  15Ser Gln Met Ile Thr Tyr Trp Gly Tyr Pro Ala Glu Glu Tyr Glu Val
         20                  25                  30Val Thr Glu Asp Gly Tyr Ile Leu Gly Ile Asp Arg Ile Pro Tyr Gly
     35                  40                  45Arg Lys Asn Ser Glu Asn Ile Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gln
 50                  55                  60His Gly Leu Leu Ala Ser Ala Thr Asn Trp Ile Ser Asn Leu Pro Asn65                  70                  75                  80Asn Ser Leu Ala Phe Ile Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Val Trp Leu
             85                  90                  95Gly Asn Ser Arg Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser
        100                 105                 110Pro Asp Ser Val Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys
    115                 120                 125Tyr Asp Leu Pro Ala Thr Ile Asp Phe Ile Leu Lys Lys Thr Gly Gln
130                 135                 140Asp Lys Leu His Tyr Val Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile Gly Phe145                 150                 155                 160Ile Ala Phe Ser Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg Ile Lys Thr Phe
            165                 170                 175Tyr Ala Leu Ala Pro Val Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu
        180                 185                 190Asn Lys Leu Met Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu Ile Phe Gly
    195                 200                 205Asn Lys Ile Phe Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gln Phe Leu Ala Thr
210                 215                 220Glu Val Cys Ser Arg Glu Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu225                 230                 235                 240Phe Ile Ile Cys Gly Phe Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu
            245                 250                 255Asp Val Tyr Leu Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gln Asn Val
        260                 265                 270Leu His Trp Ser Gln Ala Val Lys Ser Gly Lys Phe Gln Ala Phe Asp
    275                 280                 285Trp Gly Ser Pro Val Gln Asn Met Met His Tyr His Gln Ser Met Pro
290                 295                 300Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr Asp Met His Val Pro Ile Ala Val Trp Asn305                 310                 315                 320Gly Gly Asn Asp Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu
            325                 330                 335Ser Lys Leu Pro Asn Leu Ile Tyr His Arg Lys Ile Pro Pro Tyr Asn
        340                 345                 350His Leu Asp Phe Ile Trp Ala Met Asp Ala Pro Gln Ala Val Tyr Asn
    355                 360                 365Glu Ile Val Ser Met Met Gly Thr Asp Ash Lys
370                 375(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：
(A)长度：1048碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA到mRNA(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..975(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：ATA GGC CGG AGA CCT GTT GCA TTT TTG CAA CAC GGT TTG CTC GCA TCA           48Ile Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gln His Gly Leu Leu Ala Ser1               5                  10                  15GCC ACA AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC AAC AGC CTG GCC TTC ATC           96Ala Thr Asn Trp Ile Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Phe Ile
         20                  25                  30CTG GCC GAC GCC GGG TAC GAC GTG TGG CTG GGG AAC AGC AGG GGC AAC          144Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Val Trp Leu Gly Asn Ser Arg Gly Asn
     35                  40                  45ACC TGG GCC AGG AGG AAT CTG TAC TAC TCG CCC GAC TCC GTC GAA TTC          192Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Glu Phe
 50                  55                  60TGG GCT TTC AGC TTT GAC GAG ATG GCT AAA TAT GAC CTT CCC GCC ACC          240Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala Thr65                  70                  75                  80ATT GAC TTC ATC TTG AAG AAA ACG GGA CAG GAC AAG CTA CAC TAC GTT          288Ile Asp Phe Ile Leu Lys Lys Thr Gly Gln Asp Lys Leu His Tyr Val
             85                  90                  95GGC CAT TCC CAG GGC ACC ACC ATT GGT TTC ATC GCC TTT TCC ACC AAT          336Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser Thr Asn
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    115                 120                 125GCC ACC GTG AAG TAC ACC GAA ACC CTG TTA AAC AAA CTC ATG CTC GTC          432Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met Leu Val
130                 135                 140CCT TCG TTC CTC TTC AAG CTT ATA TTT GGA AAC AAA ATA TTC TAC CCA          480Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu Ile Phe Gly Asn Lys Ile Phe Tyr Pro145                 150                 155                 160CAC CAC TTC TTT GAT CAA TTT CTC GCC ACC GAG GTA TGC TCC CGC GAG         528His His Phe Phe Asp Gln Phe Leu Ala Thr Glu Val Cys Ser Arg Glu
            165                 170                 175ACG GTG GAT CTC CTC TGC AGC AAC GCC CTG TTT ATC ATT TGT GGA TTT         576Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe Ile Ile Cys Gly Phe
        180                 185                 190GAC ACT ATG AAC TTG AAC ATG AGT CGC TTG GAT GTG TAT CTG TCA CAT         624Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu Asp Val Tyr Leu Ser His
    195                 200                 205AAT CCA GCA GGA ACA TCG GTT CAG AAC GTG CTC CAC TGG TCC CAG GCT         672Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gln Asn Val Leu His Trp Ser Gln Ala
210                 215                 220GTT AAG TCT GGG AAG TTC CAA GCT TTT GAC TGG GGA AGC CCA GTT CAG         720Val Lys Ser Gly Lys Phe Gln Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro Val Gln225                 230                 235                 240AAC ATG ATG CAC TAT CAT CAG AGC ATG CCT CCC TAC TAC AAC CTG ACA         768Asn Met Met His Tyr His Gln Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr
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        260                 265                 270GCC GAC CCT CAC GAT GTT GAC CTT TTG CTT TCC AAG CTC CCC AAT CTC         864Ala Asp Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro Asn Leu
    275                 280                 285ATT TAC CAC AGG AAG ATT CCT CCT TAC AAT CAC TTG GAC TTT ATC TGG         912Ile Tyr His Arg Lys Ile Pro Pro Tyr Asn His Leu Asp Phe Ile Trp
290                 295                 300GCC ATG GAT GCC CCT CAA GCG GTT TAC AAT GAA ATT GTT TCC ATG ATG         960Ala Met Asp Ala Pro Gln Ala Val Tyr Asn Glu Ile Val Ser Met Met305                 310                 315                 320GGA ACA GAT AAT AAG TAGTTCTAGA TTTAAGGAAT TATTCTTTTA TTGTTCCAAA         1015Gly Thr Asp Asn Lys
            325ATACGTTCTT   CTCTCACACG   TGGGTTTTCTA   TCA                             1048(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：
(A)长度：325氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Ile Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gln His Gly Leu Leu Ala Ser1               5                  10                  15Ala Thr Asn Trp Ile Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala Phe Ile
         20                  25                  30Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Val Trp Leu Gly Asn Ser Arg Gly Asn
     35                  40                  45Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Asp Ser Val Glu Phe
 50                  55                  60Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro Ala Thr65                  70                  75                  80Ile Asp Phe Ile Leu Lys Lys Thr Gly Gln Asp Lys Leu His Tyr Val
             85                  90                  95Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser Thr Asn
        100                 105                 110Pro Lys Leu Ala Lys Arg Ile Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala Pro Val
    115                 120                 125Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met Leu Val
130                 135                 140Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu Ile Phe Gly Asn Lys Ile Phe Tyr Pro145                 150                 155                 160His His Phe Phe Asp Gln Phe Leu Ala Thr Glu Val Cys Ser Arg Glu
            165                 170                 175Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe Ile Ile Cys Gly Phe
            180             185                 190Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu Asp Val Tyr Leu Ser His
    195                 200                 205Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gln Asn Val Leu His Trp Ser Gln Ala
210                 215                 220Val Lys Ser Gly Lys Phe Gln Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro Val Gln225                 230                 235                 240Asn Met Met His Tyr His Gln Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn Leu Thr
            245                 250                 255Asp Met His Val Pro Ile Ala Val Trp Asn Gly Gly Asn Asp Leu Leu
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290                 295                 300Ala Met Asp Ala Pro Gln Ala Val Tyr Asn Glu Ile Val Ser Met Met305                 310                 315                 320Gly Thr Asp Asn Lys
            325(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特征：
(A)长度：1198碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA到mRNA(ix)特征：
(A)名称/关键词：CDS
(B)位置：1..1125(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CTT CAT CCC ACA AAC CCT GAA GTG ACC ATG AAT ATA AGT CAG ATG ATC           48Leu His Pro Thr Asn Pro Glu Val Thr Met Asn Ile Ser Gln Met Ile1               5                  10                  15ACC TAC TGG GGA TAC CCA GCT GAG GAA TAT GAA GTT GTG ACC GAA GAC           96Thr Tyr Trp Gly Tyr Pro Ala Glu Glu Tyr Glu Val Val Thr Glu Asp
         20                  25                  30GGT TAT ATC CTT GGG ATC GAC AGA ATT CCT TAT GGG AGG AAA AAT TCA           144Gly Tyr Ile Leu Gly Ile Asp Arg Ile Pro Tyr Gly Arg Lys Asn Ser
     35                  40                  45GAG AAT ATA GGC CGG AGA CCT GTT GCA TTT TTG CAA CAC GGT TTG CTC           192Glu Asn Ile Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gln His Gly Leu Leu
 50                  55                  60GCA TCA GCC ACA AAC TGG ATC TCC AAC CTG CCC AAC AAC AGC CTG GCC           240Ala Ser Ala Thr Asn Trp Ile Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala65                  70                  75                  80TTC ATC CTG GCC GAC GCC GGG TAC GAC GTG TGG CTG GGG AAC AGC AGG           288Phe Ile Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Val Trp Leu Gly Asn Ser Arg
             85                  90                  95GGC AAC ACC TGG GCC AGG AGG AAT CTG TAC TAC TCG CCC GAC TCC GTC           336Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Asp Ser Val
        100                  105                 110GAA TTC TGG GCT TTC AGC TTT GAC GAG ATG GCT AAA TAT GAC CTT CCC           384Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro
    115                 120                 125GCC ACC ATT GAC TTC ATC TTG AAG AAA ACG GGA CAG GAC AAG CTA CAC           432Ala Thr Ile Asp Phe Ile Leu Lys Lys Thr Gly Gln Asp Lys Leu His
130                 135                 140TAC GTT GGC CAT TCC CAG GGC ACC ACC ATT GGT TTC ATC GCC TTT TCC           480Tyr Val Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser145                 150                 155                 160ACC AAT CCC AAG CTG GCG AAA CGG ATC AAA ACC TTC TAT GCA TTA GCT           528Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg Ile Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala
            165                 170                 175CCC GTT GCC ACC GTG AAG TAC ACC GAA ACC CTG TTA AAC AAA CTC ATG           576Pro Val Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met
        180                 185                 190CTC GTC CCT TCG TTC CTC TTC AAG CTT ATA TTT GGA AAC AAA ATA TTC           624Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu Ile Phe Gly Asn Lys Ile Phe
    195                 200                 205TAC CCA CAC CAC TTC TTT GAT CAA TTT CTC GCC ACC GAG GTA TGC TCC           672Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gln Phe Leu Ala Thr Glu Val Cys Ser
210                 215                 220CGC GAG ACG GTG GAT CTC CTC TGC AGC AAC GCC CTG TTT ATC ATT TGT         720Arg Glu Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe Ile Ile Cys225                 230                 235                 240GGA TTT GAC ACT ATG AAC TTG AAC ATG AGT CGC TTG GAT GTG TAT CTG         768Gly Phe Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu Asp Val Tyr Leu
            245                 250                 255TCA CAT AAT CCA GCA GGA ACA TCG GTT CAG AAC GTG CTC CAC TGG TCC         816Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gln Asn Val Leu His Trp Ser
        260                 265                 270CAG GCT GTT AAG TCT GGG AAG TTC CAA GCT TTT GAC TGG GGA AGC CCA         864Gln Ala Val Lys Ser Gly Lys Phe Gln Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro
    275                 280                 285GTT CAG AAC ATG ATG CAC TAT CAT CAG AGC ATG CCT CCC TAC TAC AAC         912Val Gln Asn Met Met His Tyr His Gln Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn
290                 295                 300CTG ACA GAC ATG CAT GTG CCA ATC GCA GTG TGG AAC GGT GGC AAC GAC         960Leu Thr Asp Met His Val Pro Ile Ala Val Trp Asn Gly Gly Asn Asp305                 310                 315                 320TTG CTG GCC GAC CCT CAC GAT GTT GAC CTT TTG CTT TCC AAG CTC CCC         1008Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro
            325                 330                 335AAT CTC ATT TAC CAC AGG AAG ATT CCT CCT TAC AAT CAC TTG GAC TTT         1056Asn Leu Ile Tyr His Arg Lys Ile Pro Pro Tyr Asn His Leu Asp Phe
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(A)长度：375氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Leu His Pro Thr Asn Pro Glu Val Thr Met Asn Ile Ser Gln Met Ile1               5                  10                  15Thr Tyr Trp Gly Tyr Pro Ala Glu Glu Tyr Glu Val Val Thr Glu Asp
         20                  25                  30Gly Tyr Ile Leu Gly Ile Asp Arg Ile Pro Tyr Gly Arg Lys Asn Ser
     35                  40                  45Glu Asn Ile Gly Arg Arg Pro Val Ala Phe Leu Gln His Gly Leu Leu
 50                  55                  60Ala Ser Ala Thr Asn Trp Ile Ser Asn Leu Pro Asn Asn Ser Leu Ala65                  70                  75                  80Phe Ile Leu Ala Asp Ala Gly Tyr Asp Val Trp Leu Gly Asn Ser Arg
             85                  90                  95Gly Asn Thr Trp Ala Arg Arg Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Asp Ser Val
        100                 105                 110Glu Phe Trp Ala Phe Ser Phe Asp Glu Met Ala Lys Tyr Asp Leu Pro
    115                 120                 125Ala Thr Ile Asp Phe Ile Leu Lys Lys Thr Gly Gln Asp Lys Leu His
130                 135                 140Tyr Val Gly His Ser Gln Gly Thr Thr Ile Gly Phe Ile Ala Phe Ser145                 150                 155                 160Thr Asn Pro Lys Leu Ala Lys Arg Ile Lys Thr Phe Tyr Ala Leu Ala
            165                 170                 175Pro Val Ala Thr Val Lys Tyr Thr Glu Thr Leu Leu Asn Lys Leu Met
        180                 185                 190Leu Val Pro Ser Phe Leu Phe Lys Leu Ile Phe Gly Asn Lys Ile Phe
    195                 200                 205Tyr Pro His His Phe Phe Asp Gln Phe Leu Ala Thr Glu Val Cys Ser
210                 215                 220Arg Glu Thr Val Asp Leu Leu Cys Ser Asn Ala Leu Phe Ile Ile Cys225                 230                 235                 240Gly Phe Asp Thr Met Asn Leu Asn Met Ser Arg Leu Asp Val Tyr Leu
            245                 250                 255Ser His Asn Pro Ala Gly Thr Ser Val Gln Asn Val Leu His Trp Ser
        260                 265                 270Gln Ala Val Lys Ser Gly Lys Phe Gln Ala Phe Asp Trp Gly Ser Pro
    275                 280                 285Val Gln Asn Met Met His Tyr His Gln Ser Met Pro Pro Tyr Tyr Asn
290                 295                     300Leu Thr Asp Met His Val Pro Ile Ala Val Trp Asn Gly Gly Asn Asp305                 310                 315                 320Leu Leu Ala Asp Pro His Asp Val Asp Leu Leu Leu Ser Lys Leu Pro
            325                 330                 335Asn Leu Ile Tyr His Arg Lys Ile Pro Pro Tyr Asn His Leu Asp Phe
        340                 345                 350Ile Trp Ala Met Asp Ala Pro Gln Ala Val Tyr Asn Glu Ile Val Ser
    355                 360                 365Met Met Gly Thr Asp Asn Lys
370                 375

Claims (33)

1.一种重组核苷酸序列转化植物细胞以从这些细胞或从这些细胞所获植物中获得活性酶形式的哺乳动物重组前十二指肠脂酶或一种(或多种)从后者衍生而来的如下定义的多肽的用途，所述重组核苷酸序列一方面含有编码任何哺乳动物前十二指肠脂酶的cDNA，即其编码核苷酸序列有至少约75％，特别是约77％-85％同源性，其氨基酸序列具有至少70％，特别是约80％-90％的同源性，且具有耐酸特性，在pH约1-5以下，特别是pH约1.5-2以下具有活性的脂酶，特别是编码任何哺乳动物胃脂酶的cDNA，或编码从上述前十二指肠脂酶经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸所衍生的任何多肽的cDNA，该衍生多肽具有如上所述的前十二指肠脂酶的特征；另一方面含有允许植物细胞产生所述cDNA编码的前十二指肠脂酶、或产生如上所定义的衍生多肽的元件，特别是被植物细胞转录机制所识别的转录启动子和转录终止子。
2.根据权利要求1的一种重组核苷酸序列转化植物细胞以从这些细胞或从这些细胞所获得植物中获得活性酶形式的重组DGL或一种(或多种)从后者衍生而来的如下定义的多肽的用途，所述重组核苷酸序列一方面含有编码如图2所示狗胃脂酶(DGL)的如图1所示cDNA，或从该cDNA衍生的核苷酸序列，特别是经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)核苷酸而衍生，所述衍生序列能够编码一种氨基酸序列与图2所示DGL的相同的多肽，或编码从DGL经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允许植物细胞产生所述cDNA或上述衍生序列所编码多肽的元件，特别是被植物细胞转录机制所识别的转录启动子和转录终止子。
3.根据权利要求1的一种重组核苷酸序列转化植物细胞以从这些细胞或从这些细胞所获得植物中获得活性酶形式的重组HGL或一种(或多种)从后者衍生而来的如下定义的多肽的用途，所述重组核苷酸序列一方面含有编码如图5所示人胃脂酶(HGL)的如图4所示cDNA，或从该cDNA衍生的核苷酸序列，特别是经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)核苷酸而衍生，所述衍生序列能够编码一种氨基酸序列与图5所示HGL的相同的多肽，或编码从HGL经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允许植物细胞产生所述cDNA或上述衍生序列所编码多肽的元件，特别是被植物细胞转录机制所识别的转录启动子和转录终止子。
4.重组核苷酸序列，其特征为它一方面含有编码如图2所示狗胃脂酶(DGL)的如图1所示cDNA，或从该cDNA衍生的核苷酸序列，特别是经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)核苷酸而衍生，所述衍生序列能够编码一种氨基酸序列与图2所示DGL的相同的多肽，或编码从DGL经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允许植物细胞产生所述cDNA或上述衍生序列所编码多肽的元件，特别是被植物细胞转录机制所识别的转录启动子和转录终止子。
5.重组核苷酸序列，其特征为它一方面含有编码如图5所示人胃脂酶(HGL)的如图4所示cDNA，或从该cDNA衍生的核苷酸序列，特别是经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)核苷酸而衍生，所述衍生序列能够编码一种氨基酸序列与图5所示HGL的相同的多肽，或编码从DGL经插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸所衍生的多肽，所述衍生多肽具有脂酶活性；另一方面含有允许植物细胞产生所述cDNA或上述衍生序列所编码多肽的元件，特别是被植物细胞转录机制所识别的转录启动子和转录终止子。
6.根据权利要求4或5的重组核苷酸序列，其特征为它含有：
-在所述cDNA或其衍生序列的下游，含花椰菜花叶病毒(CaMV)的多聚A 35S终止子或土壤根瘤杆菌的多聚A NOS终止子。
-在所述cDNA或其衍生序列上游，含CaMV的35S启动子或双结构35S启动子(pd35S)或小萝卜cruciferin基因pCRU启动子或Arabidopsis thaliana的pGEA1或pGEA6启动子或根瘤土壤杆菌超级启动子pSP或稻的pAR-IAR启动子或玉米的pγzeine启动子
7.根据权利要求4到6之一的重组核苷酸序列，其特征为它含有一个负责将重组DGL和/或衍生多肽引向植物细胞特定腔室中的肽的编码序列。
8.根据权利要求4、6和7之一的重组核苷酸序列，其特征为它们是从下列序列中选择：
-在5’→ 3’方向上含有CaMV pd35S启动子，sporamin A信号肽编码序列，紧随后者的图3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pd35S-PS-DGL)，
-在5’→3’方向上含有CaMV pd35S启动子，sporamin A前原肽编码序列，紧随后者的图3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pd35S-PPS-DGL)，
-在5’→3’方向上含有CaMV pd35S启动子，RGL信号肽的一部分(即如下述实施例中所示的其头19个氨基酸组成的序列，编码最后3个C末端氨基酸的9个核苷酸缺失)，紧随后者的图1所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pd35S-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU启动子，sporamin A信号肽编码序列，紧随后者的图3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pCRU-PS-DGL)，
-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU启动子，sporamin A前原肽编码序列，紧随后者的图3所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pCRU-PPS-DGL)，
-在5’→3’方向上含有cruciferin的pCRU启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pCRU-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有Arabidopsis thaliana的pGEA1启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pGEA1-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有Arabidopsis thaliana的pGEA6启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pGEA6-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有稻pAR-IAR启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S或根瘤土壤杆菌的多聚A NOS终止子的重组核苷酸序列(称为pAR-IAR-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有玉米pγzeine启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pγzeine-RGLSP-DGL)，
-在5’→3’方向上含有玉米pγzeine启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如上所述)，紧随后者的图1或图3所示cDNA，四肽KDEL的编码序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pγzeine-RGLSP-DGL-KDEL)。
9.根据权利要求5到7之一的重组核苷酸序列，其特征为它们是从下列序列中选择：
-在5’→3’方向上含有根瘤土壤杆菌的pSP启动子，HGL信号肽的编码序列，紧随后者的图4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pSP-HGLSP-HGL)，
-在5’→3’方向上含有根瘤土壤杆菌的pSP启动子，HPL信号肽的编码序列，紧随后者的图4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pSP-HPLSP-HGL)，
-在5’→3’方向上含有根瘤土壤杆菌的pSP启动子，RGL信号肽的一部分的编码序列(如权利要求8所述)，紧随后者的图4所示核苷酸序列，和CaMV的多聚A 35S终止子的重组核苷酸序列(称为pSP-RGLSP-DGL)。
10.在其复制非关键性位点上插入了权利要求4、6、7和8之一的核苷酸序列的载体，特别是质粒。
11.在其复制非关键性位点上插入了权利要求5、6、7和9之一的核苷酸序列的载体，特别是质粒。
12.用权利要求10或权利要求11的载体转化的细胞宿主，特别是细菌如根瘤土壤杆菌。
13.活性酶形式重组DGL和/或一种(或多种)尤其通过插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸而从中衍生的具有脂酶活性的多肽的制备方法，其特征在于它包括：
-植物细胞的转化，特别是用根据权利要求12的细胞宿主转化，该细胞宿主本身被根据权利要求10的载体转化，这样使得权利要求4、6、7和8之一的重组核苷酸序列被整合在这些细胞的基因组中，
-适当时从上述转化细胞产生转化植物，
-特别通过提取，然后适当时纯化，回收所述细胞中或上述转化植物中产生的重组DGL和/或上述衍生多肽。
14.活性酶形式重组HGL和/或一种(或多种)尤其通过插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸而从中衍生的具有脂酶活性的多肽的制备方法，其特征在于它包括：
-植物细胞的转化，特别是用根据权利要求12的细胞宿主转化，细胞宿主本身被根据权利要求11的载体转化，这样使得权利要求5、6、7和9之一的重组核苷酸序列被整合在这些细胞的基因组中，
-适当时从上述转化细胞产生转化植物，
-特别通过提取，然后适当时纯化，回收所述细胞中或上述转化植物中产生的重组HGL和/或上述衍生多肽。
15.遗传转化植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞，其特征为它们含有在其基因组中稳定地整合的一种(或多种)根据权利要求4到9之一的重组核苷酸序列和适当时的重组DGL和/或重组HGL和/或一种(或多种)衍生多肽，其也称为酶活性植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞，其特别选自油菜、烟草、玉米、豌豆、番茄、胡萝卜、小麦、大麦、马铃薯、大豆、向日葵、莴苣、稻、苜蓿和甜菜根(beetroot)，或这些植物的某些部分。
16.氨基酸序列如图2所示的酶活性重组DGL或从中衍生的多肽，特别是通过插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸衍生的，例如图2中位于55和379位的氨基酸界定的多肽，也称为多肽(Δ54)，和/或图2中位于5和379位氨基酸界定的多肽，也称为多肽(Δ4)，这些衍生多肽具有脂酶活性，例如它们是通过实施根据权利要求13的方法以基本纯的形式获得的，这方法包括重组DGL和/或上述衍生多肽的纯化步骤，特别是对得到的酶提取物进行层析。
17.氨基酸序列如图5所示的酶活性重组HGL或从中衍生的多肽，特别是通过插入和/或缺失和/或取代一个(或多个)氨基酸衍生的，例如图5中位于74和398位的氨基酸界定的多肽，也称为多肽(Δ54HGL)，和/或图5中位于24和398位氨基酸界定的多肽，也称为多肽(Δ4HGL)，这些衍生多肽具有脂酶活性，例如它们是通过实施根据权利要求14的方法以基本纯的形式获得的，这方法包括重组DGL和/或上述衍生多肽的纯化步骤，特别是对得到的酶提取物进行层析。
18.实施根据权利要求13的方法所得到的酶活性植物提取物，其特征为含有重组DGL和/或一种(或多种)衍生多肽，例如权利要求16中所定义的多肽(Δ54)和/或多肽(Δ4)。
19.实施根据权利要求14的方法所得到的酶活性植物提取物，其特征为含有重组HGL和/或一种(或多种)衍生多肽，例如权利要求17中所定义的多肽(Δ54HGL)和/或多肽(Δ4HGL)。
20.根据权利要求18或权利要求19的酶活性植物提取物，其特征为酶活性重组多肽的重量百分比为这些提取物中总蛋白重量的约0.1-20％，特别是约1-15％，这相当于0.5U/克叶鲜重(FW)到1000U/g叶鲜重，特别是约10-300U/g叶鲜重，或约1-5000U/g种子鲜重，特别是约10-1000U/g种子鲜重的酶活性水平。
21.根据权利要求15的遗传转化植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞或根据权利要求16的重组DGL或从其中衍生的多肽，或根据权利要求17的重组HGL或从其中衍生的多肽，或根据权利要求18到20之一的酶活性植物提取物，用于制备有利于促进健康个体或患有一种或多种可能或可能不影响胃脂酶和/或胰脂酶产生水平的病变的个体，特别是正在进行改变脂肪吸收机制的医学治疗的个体或老年人吸收所摄取的动物和植物脂肪的药物，更特别的是制备有利于治疗与器官内脂酶(特别是胃和/或胰脂酶)缺乏相关的病变及更特别的是如胆囊纤维样变性和胰腺外分泌不足的病变的药物的用途。
22.药物组合物，其特征为含有根据权利要求16或17的重组DGL和/或重组HGL和/或一种(或多种)衍生多肽，和/或一种(或多种)根据权利要求18到20之一的酶活性提取物，其适当时可与药物可用的载体组合。
23.根据权利要求15的遗传转化植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞，或根据权利要求16的重组DGL或从其中衍生的多肽，或根据权利要求17的重组HGL或从其中衍生的多肽，或根据权利要求18到20之一的酶活性植物提取物，用于生产食品、特别是功能性食品，更特别是用于促进健康个体或患有一种或多种可能或可能不影响胃脂酶和/或胰脂酶产生水平的病变的个体吸收所摄取的动物和植物脂肪的食品的用途。
24.功能性食品，其特征为含有根据权利要求15的一种(或多种)植物和/或该(这些)植物部分，和/或根据权利要求16或17的重组DGL和/或重组HGL和/或一种(或多种)衍生多肽，和/或一种(或多种)根据权利要求18到20之一的酶活性提取物。
25.根据权利要求15的遗传转化植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞，或根据权利要求16的重组DGL或从其中衍生的多肽，或根据权利要求17的重组HGL或从其中衍生的多肽，或根据权利要求18到20之一的酶活性植物提取物，用于进行工业、农业食品和农用工业领域中，特别是在脂肪工业、脂肪化学及奶品工业中的酶促反应的用途。
26.特别是工业、农业食品和农用工业领域中，特别是在脂肪工业、脂肪化学及奶品工业中，通过一个或多个酶促反应而进行的酶促生物转化或生物催化的方法，利用根据权利要求15的遗传转化植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞，或根据权利要求16的重组DGL或从其中衍生的多肽，或根据权利要求17的重组HGL或从其中衍生的多肽，或根据权利要求18到20之一的酶活性植物提取物进行这些酶促反应。
27.可在工业、农业食品和农用工业中使用的酶制剂，其可用于实施根据权利要求26的方法并含有一种(或多种)根据权利要求18到20之一的酶活性植物提取物和/或根据权利要求16或17的重组DGL和/或重组HGL和/或一种(或多种)从其中衍生的多肽。
28.根据权利要求15的遗传转化植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞，进行工业规模的生物转化或生物催化酶促反应的用途，例如酶促水解或酯基转移作用。
29.应用根据权利要求15的遗传转化植物或植物部分，特别是植物的叶和/或果实和/或种子和/或植物细胞进行生物催化的方法，所述植物或植物碎片或细胞同时用作酶源和反应底物。
30.根据权利要求15的遗传转化植物或植物部分，特别是叶和/或果实和/或种子或植物细胞生产生物燃料的用途。
31.制备生物燃料的方法，其中通过加入醇，尤其是甲醇或乙醇，到根据权利要求15的转化植物全部或部分的研碎材料中，并回收生物燃料，特别是通过过滤。
32.通过实施根据权利要求31的方法而得到的植物脂肪酸的酯，特别是油酸的甲酯。
33.通过实施根据权利要求31的方法而得到的生物燃料，其含有植物脂肪酸的酯，特别是油酸的甲酯。
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