KR20130131363A - 기질에 대한 세포의 결합을 제어하기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 통상 친화성이 없거나 매우 낮은 기질에 대한 세포의 접착을 촉진하기 위한 방법으로서, 상기 기질에 대한 세포의 접착을 세포에 비-근육 미오신 II 저해제인 블레비스타틴을 공급하여 충분한 친화성을 달리 갖지 않았을 표면에 세포를 부착시킬 수 있도록 함으로써 촉진하는 방법에 관한 것이다. 놀라운 것은 상기 세포에 저해제를 공급하면 통상 친화성이 없거나 매우 낮은 표면, 예를 들면 PTFE(Teflon^®)에 대한 이들 세포의 부착능이 증강된다는 점이다. 본 발명은 또한 비-근육 미오신 II 저해제인 블레비스타틴의 용도 및 적어도 하나의 표면이 통상 상기 표면에 대한 친화성이 없거나 매우 낮은 세포로 코팅되어 있는 기구에 관한 것이다.

Description

기질에 대한 세포의 결합을 제어하기 위한 방법{METHOD FOR CONTROLLING BINDING OF CELLS TO A SUBSTRATE}

본 발명은 통상적으로 친화성이 없거나 매우 낮은 기질에 대한 세포의 접착을 촉진시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 비-근육 미오신 II 저해제인 블레비스타틴(Blebbistatin)의 용도 및 적어도 하나의 표면이 상기 표면에 대한 친화성이 없거나 매우 낮은 세포로 코팅되어 있는 기구에 관한 것이다.

현재 사용되고 있는 대부분의 치료용 세포(성체 줄기 세포 포함)는 고착/부착-의존 방식으로 증식되고 있고 이 방식은 배아 줄기 세포와 유도 만능 줄기 세포(iPS)와 같은 잠재력 있는 대체 세포에 대해서도 적용되고 있다. 그러나 이러한 증식은 본질적으로 규모와 경제적인 면에서 심각한 한계와 결부되어 있다. 세포 배양 증식의 경우에, 전형적으로 세포는 평판 표면에 접종되어 수 시간 내에 부착되고, 증식되도록 한 후, 단백질 분해효소 및/또는 칼슘 제거에 의해 회수된다. 부착은 균질한 과정이 아니라 특정 구역, 소위 접착반(focal adhesion) 구역을 통해 이루어진다. 세포는 일단 부착되면 내부 운동 단백질에 의해 장력을 가하게 된다. 이에 따라 세포 골격은 조직화되고, 수송, 골격화(scaffolding)와 세포 생존을 포함하는 다양한 과정에서 기능한다. 세포 탈착시 이들 세포는 운동 단백질에 의해 구축된 내부 장력에 따라 급속하게 수축하게 되고 이미 조직화된 내부 구조(세포 골격 등)는 방해를 받게 된다. 이러한 세포가 표면에 재-부착할 수 없으면 부착-의존성 세포사멸/사멸과정(anoikis)으로서 기재된 세포사 프로그램을 개시하게 될 것이다.

US-A-2010 0009 442는 Rho GTP 가수분해효소의 효과기 분자이고 혈관수축과 신경 축삭 연장을 제어하는 것으로 알려진 Rho-관련 나선상 키나아제(ROCK)의 저해제(Y-27632, H-1152 또는 Fasudil과 같은)는 세포사멸/사멸과정의 저해제로서 이용될 수 있어 만능 줄기 세포, 특히 배아 줄기 세포의 생존율 및/또는 증식율을 향상시키는 것을 교시하고 있다. ROCK 저해제가 존재하는 상태에서 하위복제(subcloning) 또는 계대(passaging) 전 및/또는 후에 줄기 세포는 공급자 세포 및/또는 혈청없이도 배양될 수 있다.

세포 장력을 발생시키는 원인인 주요 세포 골격 운동 단백질은 비-근육 미오신 II(미오신 II라고 함)이다. Straight 등(2003)은 세포질 분열을 분석하려는 시도로서 비-근육 미오신 II의 특정한 소분자 저해제를 동정하였다. 이 활성이 큰 소분자는 세포 기포 형성(blebbing)을 억제하는 것으로 블레비스타틴으로 명명되었다. 이 화합물은 세포-투과성이고, 양성이며, 중요한 것은 쉽게 가역적이라는 것이다.

Walker 등(2010)은 인간 배아 줄기 세포와 유도 만능 줄기 세포를 포함하는 인간 만능 줄기 세포의 생존율을 증가시키기 위한 블레비스타틴의 용도를 개시하고 있다. 블레비스타틴을 처리하면 클론 밀도와 현탁 조건에서 인간 만능 줄기 세포의 생존율을 증가시킨다. 게다가 합성 기질과 조합한 블레비스타틴은 줄기 세포의 자기 복제를 위한 한정된 환경을 조성하는데 일조한다.

US-A-2010 0216 181은 혈청과 공급자 세포가 없는 배지에서 생존 인자로서 블레비스타틴 또는 ROCK 저해제를 사용하여 만능 줄기 세포를 배양하는 것을 개시하고 있다. 여기에서는 세포를 스피너 플라스크 또는 생물반응기에 배양함으로써 다수의 세포를 만들어낸다.

부착-의존성 세포는 현탁 조건에서 배양하는 동안 세포가 성장할 수 있는 표면적을 증가시킬 미소 담체(예를 들면 비드) 상의 생물 반응기에서 대량 생산할 수 있다. 예를 들면, 만능 및 배아 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포의 대량 생산 방법이 US-A-2010 0093 083에 알려져 있다. 여기에서는, 상기 세포를 복수 개의 미소 담체를 함유하는 무혈청 배지에서 배양한다. 상기 세포를 미소 담체에 접착하게 하고 제어된 조건의 생물 반응기에서 증식한다. 상기 배지에는 줄기 세포의 증식과 생존을 증대시키거나 분화를 예방하는 추가 성분, 예를 들면 효소 GSK3 또는 MEK의 저해제를 부가할 수 있다. 증식 후, 상기 세포를 효소 또는 비-효소 세포 해리제를 이용하여 미소 담체로부터 분리한다. 그러나 이 방법은 세포가 충분한 친화성을 가진 미소 담체만을 이용할 수 있다는 단점이 있다.

본 발명의 목적은 통상적으로 친화성이 없거나 매우 낮은 기질에 대한 세포의 접착을 촉진시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.

이 목적은 기질에 대한 세포의 접착을 상기 세포에 비-근육 미오신 II 저해제인 블레비스타틴을 공급하여 충분한 친화성을 달리 갖지 않았을 표면에 세포를 부착시킬 수 있도록 함으로써 촉진하는 방법에 의해 해결된다. 놀라운 것은 상기 세포에 저해제를 공급하면 통상적으로 친화성이 없거나 매우 낮은 표면에 대한 이들 세포의 부착능이 증강된다는 점이다. 따라서 블레비스타틴은 사용자가 현탁 배양을 위한 미소 담체 또는 예를 들면 Teflon^®로 코팅한 표면과 같은 특정 기질에 대한 세포 부착을 촉진시킬 수 있는 일종의 촉진제로서 유리하게 사용될 수 있다. 따라서 블레비스타틴은 세포 배양을 위한 적합한 기질에 대한 선택의 폭을 넓혀 미소 담체에 대한 세포의 부착에 의존하는 세포 배양법을 최적화할 수 있고 이에 따라 크게 개선시킬 수 있는 유용한 수단이다. 배양할 세포가 접착될 수 있는 기질과 관련하여 훨씬 많은 선택권이 있기 때문에 배양 조건을 쉽게 개선하고 최적화한다. 게다가 다른 요구 조건에 대해서는 최적화되어 있지만 통상적으로 생체 세포에 대해서는 적합한 기질이 아닌 표면, 예를 들면 몇몇 의료 기구의 표면에는 블레비스타틴을 상기 세포에 첨가함으로써 콜로니를 형성할 수 있다. 이에 따라, 상기 저해제로 세포를 처리하면 이들 세포를 배양하기에 달리 적합하지 않은 표면에 대한 세포의 부착능과 증식능이 얻어진다. 본 발명에 따른 방법에 의하면, 세포 배양 및/또는 증식에 적합한 기질, 예를 들면 미소 담체 또는 의료 기구의 선택의 폭이 크게 넓어진다.

블레비스타틴은 세포 배양에 적용시 부착성이 부족하여 유발되는 세포사를 최소화하고 단일 세포 배양을 촉진하는 소분자이다. ROCK 저해제에 비해 블레비스타틴은 비-근육 미오신 II의 직접적이면서 비경쟁적인 저해제로서 작용한다. 블레비스타틴은 복잡한 신호전달 증폭경로(signaling cascade)에 간섭하지는 않지만 미오신-ADP-Pi 복합체에 결합함으로써 비-근육 미오신 II 및 비-근육 미오신 II과 액틴의 상호작용을 직접 표적으로 한다. 중요한 것은, 블레비스타틴이 미오신 II를 용이하게 조정할 수 있는 가역적인(양성) 저해제라는 점이다. 블레비스타틴은 충분한 친화성을 달리 갖지 않았을 표면에 대한 세포, 특히 부착-의존성 세포의 부착능을 증강시킨다. 따라서 블레비스타틴은 특정 기질에 대한 세포의 부착을 제어할 수 있는 접착 촉진제로서 이용될 수 있다. 또한 다른 한편으로 블레비스타틴은 절대적으로 부착에 의존하는 세포의 현탁액 생존율을 크게 증가시킨다. 상기 물질은 필요에 따라 배지에 쉽게 첨가할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 기질은 비-점착 물질 또는 적어도 부분적으로 비-점착 물질로 코팅된 물질이다. 상기 비-점착 물질은 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE, 상표명 (DuPont): Teflon^®), 폴리플루오로에틸렌(PFE), 퍼플루오로알콕시(PFA), 불소화 에틸렌 프로필렌(FEP), 이산화티탄 화합물 또는 이산화티탄을 포함하는 조성물, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다.

바람직하게는 상기 기질은 의료 기구, 바람직하게는 스텐트, 패치 또는 인공혈관 또는 기관의 표면이다. 이러한 기구는 대개 통상적으로 세포 배양에 적합하지 않은 재료로 제조되거나 코팅되어 예를 들면 혈액 세포, 단백질 등이 원하지 않게 부착되는 것을 방지하기 때문에 이들 기구를 세포로 콜로니화하는 것은 일반적으로 어렵다. 그러나 이러한 기구를 생체 세포, 바람직하게는 줄기 세포로 코팅하여 이들을 이식물, 대체 조직, 복구 탐침 등으로서 이용할 수 있도록 하는 것이 때로는 바람직할 수 있다. 또한 자가 세포로 이식물을 코팅함으로써 면역계에 의한 이식 거부증을 효율적으로 억제할 수 있다. 본 발명에 따르면, 세포에 블레비스타틴을 공급하여 상기 세포가 의료 기구를 콜로니화하여 이들 기구를 여러가지 의료용으로 제조하고 개량하도록 할 수 있어 유리하다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 기질은 복수 개의 미소 담체로서 상기 기질에 부착된 세포는 현탁 조건에서 배양될 수 있다. 이 실시형태에 있어서, 세포가 성장할 수 있는 표면적을 증가시켜 현탁 조건, 바람직하게는 적절한 생물 반응기에서 세포를 배양하면서 미소 담체, 바람직하게는 적절한 비드 상에서 상기 세포를 대량 생산될 수 있다. 본 발명에 따르면, Cytodex^TM(GE Healthcare, GB), Hillex(SoloHill, USA) 등과 같이 시판 중인 미소 담체를 이용할 수 있는 바, 이러한 미소 담체로는 온도 변화에 의해, 바람직하게는 감온에 의해 세포를 제거할 수 있는 온도-제어 미소 담체를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 세포 증식을 위해 세포수 증가를 위한 추가 부착 영역을 제공하도록 기존 배양물에 추가로 미소 담체를 첨가할 수 있다. 이에 따라, 더 많은 미소 담체의 단순히 첨가하는 것만으로 세포 배양물을 쉽게 증식할 수 있다. 소정의 용도에서는 서로 다른 크기의 미소 담체를 이용하는 것이 유익할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 세포는 부착-의존성 세포, 특히 성체 줄기 세포, 바람직하게는 간엽 줄기 세포이다. 그러나 본 발명에 따른 방법은 블레비스타틴에 의해 기질에 대한 친화성이 증진될 수 있는 모든 세포 유형을 포함한다.

블레비스타틴이 세포 생존율을 증가시키고 현탁 배양액에서 세포 응집을 감소시키기 때문에 세포는 현탁 배양 조건에서 증식이 용이할 수 있고, 바람직하게는 개략적으로 상술한 미소 담체 상에 고정화될 수 있다.

일부 용도에서는 세포를 저혈청 또는 무혈청 배양 배지에서 현탁하는 경우가 유리할 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 세포를 블레비스타틴이 존재하는 상태에서 동결 및/또는 해동한 다음, 상기 기질과 접촉시킨다. 유리한 것은, 이 경우에 블레비스타틴이 세포를 안정화시키므로 세포를 동결 및/또는 해동하는 동안 세포에 대한 보호효과를 갖게 된다는 점이다. 즉, 블레비스타틴은 세포의 저온 보존 회수율을 증가시키고 동결하기 전에 블레비스타틴을 첨가하는 것은 세포의 저온 보존을 위해 유익하다.

따라서 충분한 친화성을 달리 갖지 않았을 기질에 대한 세포의 접착을 촉진시키기 위해 블레비스타틴을 사용하는 것이 본 발명의 중요한 요지이다.

의료 기구, 바람직하게는 스텐트, 패치 또는 인공혈관 또는 기관의 표면을 상기 표면에 대한 친화성이 없거나 매우 낮은 세포로 코팅하기 위해 블레비스타틴을 사용하는 것이 본 발명의 또 다른 중요한 요지이다.

본 발명의 또 다른 중요한 요지는 적어도 하나의 표면이 상기 표면에 대한 친화성이 통상적으로 없거나 매우 낮은 세포로 코팅되어 있는 기구에 관한 것이다. 상기 표면은 비-점착 물질, 바람직하게는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE, 상표명(DuPont): Teflon^®), 폴리플루오로에틸렌(PFE), 퍼플루오로알콕시(PFA), 불소화 에틸렌 프로필렌(FEP), 이산화티탄 화합물 또는 이산화티탄을 포함하는 조성물, 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 기구의 표면은 부착-의존성 세포, 특히 성체 줄기 세포, 바람직하게는 간엽 줄기 세포로 코팅된다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 기구는 의료 기구, 바람직하게는 스텐트, 패치 또는 인공혈관 또는 기관이다.

기본적으로 본 발명에 따른 개념은 충분한 친화성을 달리 갖지 않았을 기질에 대한 세포의 접착을 촉진하고, 현탁 배양액으로 세포를 전위하는 중에 세포사를 예방/감소시키며, 세포 생존율을 향상시키고, 달리 적합하지 않은 표면에 세포를 재배치할 수 있도록 하며, 마지막으로 세포, 바람직하게는 부착 의존성 세포의 증식을 강화시키기 위한 블레비스타틴의 유익한 용도에 관한 것이다. 배양물에 블레비스타틴을 사용하는 실익이 있는 세포 유형의 범주는 매우 넓고 치료학적으로 유용한 공지의 세포들 뿐 아니라 인간 배아 줄기 세포(HES)와 유도 만능 줄기 세포(iPS)와 같은 현재 개발 중에 있는 후보 세포들을 포함한다. HES 세포는 통상적으로 응집물로서 성장하고 증식을 위해 수시로 효소 분리를 필요로 한다. 그러나 이 과정에서 세포사/손실이 일어나고 블레비스타틴을 사용하는 실익이 있을 수 있으며, 실제로 블레비스타틴의 사용은 HES 세포의 완전한 현탁 배양 증식을 향한 단계일 수 있다. 성체 줄기 세포와 iPS 세포의 평판 배양물은 매우 견고한 반면에, 블레비스타틴의 사용은 계대 중에도 유익하고 중요한 것은 성체 세포의 완전 현탁 배양 증식을 향한 단계로서 유익하다는 점이다. 만능 성체 줄기 세포의 증식은 특히 중요하지만, 이 개념에 대한 세포 유형은 줄기 세포로 한정되어서는 안되며 모든 부착 의존성 세포 유형을 포함한다.

본 명세서에서 사용하는 "비-근육 미오신 II의 저해제" 또는 "미오신 II 저해제"는 미오신 II를 직접 표적으로 하여 비-근육 미오신 II의 기능을 억제하는 분자 또는 복수 개의 분자이다. 따라서 본 발명에 따른 개념은 비-근육 미오신 II에 대해 직접적인 영향이 있는 저해제를 포함한다. 이러한 저해제에 대한 일례는 블레비스타틴 또는 이들의 유사체 또는 유도체이다. 그러나 이 예로 본 발명이 한정되는 것은 아니며 비-근육 미오신 II에 대한 유사한 효과를 가진 다른 저해제들도 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용하는 "부착-의존성 세포"는 일반적으로 유체 중에 현탁되는 경우에는 생존할 수 없지만 생존과 성장을 위해 고체 기질에 접착해야 하는 세포이다.

본 명세서에서 사용하는 "체성 줄기 세포"라고도 알려져 있는 "성체 줄기 세포"는 자기 복제가 가능하고 다수의 서로 다른 세포 유형, 특히 유래된 조직 또는 기관의 모든 세포 유형의 후대를 만들어낼 수 있는 다능성 세포이다. "성체 줄기 세포"는 간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 신경 줄기 세포와 이들의 변형물을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용하는 "성체 줄기 세포"는 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포)를 포함하지는 않는다.

본 명세서에서 사용하는 "유도 만능 줄기 세포"(iPS 세포)는 특정 전사 인자의 발현을 유도하여 재편성한 비-만능 체세포로부터 유도된 만능 세포이다. iPS 세포는 만능성 면에서 배아 줄기 세포와 유사하다.

본 명세서에서 사용하는 "배아 줄기 세포"는 3개의 모든 배엽(내배엽, 외배엽과 중배엽)과 생식계열 세포로 분화할 수 있는 만능 세포이다.

도 1은 골수(BM-MSC) 유래 간엽 줄기 세포의 세포집합(A: 현미경 사진), 세포생존(B: 막대 그래프)과 세포사멸(C: 막대 그래프)에 대한 블레비스타틴의 효과를 보여주는 도면이다.
도 2는 다양한 저해제 농도로 처리하고 접착/정지 조건(A) 또는 현탁/진탕 조건(B)에서 배양한 BM-MSC의 아넥신 V 염색과 후속 FACS-분석에 의해 밝혀진 세포사멸 수준을 보여주는 도면이다.
도 3은 프로피디움 요오드화물 및 다양한 저해제 농도로 처리하고 접착/정지 조건(A) 또는 현탁/진탕 조건(B)에서 배양한 BM-MSC의 후속 FACS-분석에 의해 밝혀진 세포사율을 보여주고 있는 도면이다.
도 4.1-4.3은 프로피디움 농도에 의해 밝혀지고 딥-웰의 현탁/진탕 조건에서 배양된 세포주기 형태(G1/G0과 G2)를 보여주고 있는 도면이다.
도 5.1-5.3은 프로피디움 요오드화물 및 다양한 저해제 농도로 처리하고 6-웰의 정지 조건에서 배양한 세포의 FACS-분석에 의해 밝혀진 세포주기 형태(G1/G0와 G2)를 보여주고 있는 도면이다.
도 6은 블레비스타틴을 처리하지 않은 Lumox-바이오 호일 백의 소수성 면에서 배양한 BM-MSC(대조군)를 보여주고 있는 도면이다.
도 7은 Lumox-biofoil bag의 소수성 면에서 배양한 BM-MSC를 보여주고 있는 도면이다.
도 8은 세포를 전위하는 동안에 골수 유래 간엽 줄기 세포(BM-MSC)에 대한 블레비스타틴과 Y-27632의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다.
도 9는 글루코오스 소비량(A), 락토오스 생산량(B)과 미소 담체에 부착된 골수 유래 간엽 줄기 세포(BM-MSC)의 세포수(C)를 보여주는 막대 그래프이다.
도 10은 배양 6일 후 도 9에 따른 미소 담체의 현미경 사진이다(담체 위 BM-MSC의 DAPI-염색).
도 11은 코팅된 배양 디쉬에서 배양한 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 현미경 사진이다.
도 12는 골수 유래 간엽 줄기 세포(BM-MSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다.
도 13은 제대혈 유래 줄기 세포(CB-USSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다.
도 14는 골수 유래 간엽 줄기 세포(BM-MSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다.
도 15는 제대혈 유래 줄기 세포(CB-USSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다.
도 16은 저혈청 EGM2+Dex-배지(3% 혈청)에서 배양한 제대혈 유래 줄기 세포(CB-USSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다.
도 17은 무혈청 MSCGM-CD 배지에서 배양한 제대혈 유래 줄기 세포(CB-USSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다.
도 18은 PTFE 용기(PTFE = 폴리테트라플루오로에틸렌, 상표명(DuPont): Teflon^®) 위의 제대혈 유래 염색된 줄기 세포(CB-USSC)를 보여주는 사진이다.
도 19는 미오신-억제 유무에 따라 저온 보존 전후 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 생존 세포 밀도(막대)와 회수율(삼각형)을 보여주는 그래프이다(BB = 블레비스타틴).
도 20은 저온 보존된 세포를 해동한 후 2일과 4일째에 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 평균 총수를 보여주는 막대 그래프이다.

도면을 참조하여 본 발명을 더욱 예시적으로 기재한다.

도 1은 골수(BM-MSC) 유래 간엽 줄기 세포의 세포응집(A: 현미경 사진), 세포생존(B: 막대 그래프)과 세포사멸(C: 막대 그래프)에 대한 블레비스타틴의 효과를 보여주고 있다. 7일까지 서로 다른 블레비스타틴 농도의 유무에 따라 세포응집(A), 세포생존(B)과 세포사멸(C)을 분석하였다. ROCK 저해제(Y-27532)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 접착 성장에 도움을 주지 않는 딥-웰(deep-well)에 세포를 첨가하였다. 서로 다른 농도의 블레비스타틴과 Y-27632를 BM-MSC(10% FBS 함유 배지)의 현탁액(딥-웰, 130RPM)과 접착(6-웰) 배양액에서 시험하였다. 블레비스타틴은 세포 응집을 예방하거나 적어도 크게 감소시키고, 세포생존을 가능하게 하며, 간엽 줄기 세포의 딥-웰 배양액에서 세포사멸을 감소시킨다는 것을 분명히 알 수 있다.

A: 10 μM 블레비스타틴으로 처리하면 세포 집락을 예방하는 반면에, 대조군 세포(DMSO, PBS)와 10 μM 미만의 블레비스타틴으로 처리한 세포는 단일 응집체를 형성하였다.

B: 색소-배제 분석(프로피디움 요오드화물)을 이용하는 FACS에 의해 생체 세포를 정량화하였다. 대조군 배양액(DMSO, PBS)에 비해 5 μM 초과 농도의 블레비스타틴으로 처리한 세포는 평판 배양액 중의 세포와 유사한 생존도를 나타내었다(~90%). 블레비스타틴의 생존율-증가 효과는 10 μM에서 농도에 의존하는 최고치를 나타내었고 더 높고 낮은 블레비스타틴 농도에서는 감소하였다.

C: 사멸세포를 아넥신 V-분석(프로피디움 요오드화물)을 이용한 FACS에 의해 정량화하였다. 대조군 배양액(DMSO, PBS)에 비해 10 μM 블레비스타틴으로 처리한 세포는 세포사멸로부터 보호되었다.

도 2는 다양한 저해제 농도로 처리하고 접착/정지 조건(A) 또는 현탁/진탕 조건(B)에서 배양한 BM-MSC의 아넥신 V 염색과 후속 FACS-분석에 의해 밝혀진 세포사멸 수준을 보여주고 있다. 여기에서 블레비스타틴은 현탁 배양액 중에서 세포사를 줄이고 Y-27632와 비슷하거나 더 큰 항-세포사멸 효과를 나타낸다는 것은 분명하다. 5 μM 미만에서 블레비스타틴의 효과는 제한적일 뿐으로 10 μM에서 가장 큰 효과가 얻어진다.

도 3은 프로피디움 요오드화물 및 다양한 저해제 농도로 처리하고 접착/정지 조건(A) 또는 현탁/진탕 조건(B)에서 배양한 BM-MSC의 후속 FACS-분석에 의해 밝혀진 세포사율을 보여주고 있다. 이 분석으로부터 블레비스타틴이 특히 농도 10-50 μM, 최적 농도 10 μM에서 세포사를 유의적으로 줄인다는 것을 알 수 있다.

도 4.1-4.3은 프로피디움 농도에 의해 밝혀지고 딥-웰의 현탁/진탕 조건에서 배양된 세포주기 형태(G1/G0과 G2)를 보여주고 있다. BM-MSC 배양물이 BrdU에 연속 도입되도록 하고 서로 다른 시점에서(3일까지) 시료를 취하였다. 대부분의 세포는 G1/G0기(밀도가 매우 높은 배양물)에 있지만, G2-세포 또한 일부 존재한다. >4N 세포는 없었다(다핵화 세포는 미검출). 결과적으로, 현탁 배양액에서 세포주기에 대한 블레비스타틴의 유의적인 효과가 없다.

도 5.1-5.3은 프로피디움 요오드화물 및 다양한 저해제 농도로 처리하고 6-웰의 정지 조건에서 배양한 세포의 FACS-분석에 의해 밝혀진 세포주기 형태(G1/G0와 G2)를 보여주고 있다. BM-MSC 배양물이 BrdU에 연속 도입되도록 하고 서로 다른 시점(3일까지)에서 시료를 취하였다. 대부분의 세포는 G1/G0기(밀도가 매우 높은 배양물)에 있지만 G2-세포 또한 존재한다. >4N 세포는 없었다(다핵화 세포 미검출). 접착성이 있는 T-플라스크에서 배양물(G2/M)을 연속 처리하는 동안에 세포주기가 다소 느려진다는 것이 관찰되었다.

도 6은 블레비스타틴을 처리하지 않은 Lumox-바이오 호일 백의 소수성 면에서 배양한 BM-MSC(대조군)를 보여주고 있다. <0.1% DMSO로 48시간 처리한 후 관찰된 콜로니와 부착 세포가 나타나 있다. 유의적인 세포 부착은 관찰할 수 없었다.

도 7은 Lumox-바이오 호일 백의 소수성 면에서 배양한 BM-MSC를 보여주고 있다. 10μM 블레비스타틴으로 48시간 처리한 후 관찰된 콜로니와 부착 세포가 나타나 있다. 상당수의 세포가 소수성 표면에 부착되어 있다. 이에 따라 도 6(대조군)과 비교하면 블레비스타틴으로 처리하면 상기 표면에 대한 BM-MSC의 친화성이 증가한다.

도 8은 세포를 전위하는 동안에 골수 유래 간엽 줄기 세포(BM-MSC)에 대한 블레비스타틴과 Y-27632의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다. 미융합 상태의(subconfluent) BM-MSC를 4시간 전처리(10 μM 블레비스타틴 또는 10 μM Y-27632 대 대조군)한 다음, 3분 동안 37℃에서 트립신/EDTA와 함께 배양하였다. 특정한 코팅(A)없이 조직 배양 플라스크의 표면으로부터 세포를 전위한 후에 세포수를 측정하였다. 대조군 조건(블레비스타틴 없음) 보다 미오신 II 억제 상태에서 더 적은 세포가 전위된다. 전위된 세포에는 약물-처리된 조건의 응집체가 없다. 이에 따라 블레비스타틴과 Y-27632 모두는 세포 전위와 군집에 대해 보호효과를 나타내는데, 즉 세포는 기질에 안정적으로 부착 상태에 있게 되고 세척에 의해 쉽게 제거될 수 없다. 세포를 재접종하였고(동일 밀도: 5000 세포/cm²에서 모든 조건) 약물이 없는 배지에서 7일간 추가 배양하였다. 7일후 세포수(B)와 생존율(C)을 측정하였다. BM-MEC를 기질로부터 전위시켜 추가 배양을 위해 재접종하는 경우에, 블레비스타틴은 세포에 대한 상당한 보호효과를 갖게 되어 배양 7일 후 증식과 생존율이 증가한다. 후속 무-약물 계대(7일)에서 전위 전에 블레비스타틴 처리에 의한 세포 증식(수율과 생존율) 증가가 관찰되었고 Y-27632 처리군에 대해서는 더 적은 증가가 관찰되었다.

도 9는 글루코오스 소비량(A), 락토오스 생산량(B)과 미소 담체에 부착된 골수 유래 간엽 줄기 세포(BM-MSC)의 세포수(C)를 보여주는 막대 그래프이다. 10 μM 블레비스타틴의 존재 또는 부재 상태에서 현탁 배양을 위해 미소 담체에 BM-MSC를 접종하고 6일간 증식시켰다. 교반없이 24시간 배양한 후, 상기 배양물의 시료를 취하여 세포수, 글루코오스 소비량과 세포 접종량을 측정하였다. 교반과 함께 5일간 더 배양한 후, 글루코오스 소비량(A), 락테이트 생산량(B), 세포수(C)와 담체 위 세포 접종량(담체에 대한 세포의 DAPI-염색, 도11)을 재측정하였다. 24시간 후, 대조군에 비해 블레비스타틴이 존재하는 상태에서 세포 접종량이 크게 증가하였다. 6일 후 블레비스타틴은 BM-MSC의 글루코오스 소비량과 락테이트 생산량 모두에 대해 효과가 없는 것으로 보이는 반면에, 상기 저해제로 처리한 후 세포수는 크게 증가한다. 따라서 블레비스타틴은 세포에 대한 보호효과를 가져 미소 담체 위에서 6일간 성장한 후의 증식을 증가시킨다.

도 10은 배양 6일 후 도 9에 따른 미소 담체의 현미경 사진이다(담체 위 BM-MSC의 DAPI-염색). 여기에는, 저해제가 없는 상태(A, 대조군)보다 블레비스타틴(B)이 존재하는 상태에서 훨씬 많은 세포들이 미소 담체에 부착되는 것이 분명하게 나타나 있다.

도 11은 코팅된 배양 디쉬에서 배양한 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 현미경 사진이다. 상기 세포를 Matrigel^®로 코팅한 배양 디쉬에 혈청 또는 동물-유래 성분을 전혀 함유하지 않은 특정 X-VIVO 매질에서 배양하였다. A: 저해제 무처리군(대조군), B: 10 μM 블레비스타틴으로 일시적 처리군(좌측 현미경 사진: 4 배율, 우측 현미경 사진: 10 배율), C: 블레비스타틴을 제거한 후 1일째 배양군. X-VIVO에서 hESC의 분할 후 부착도는 낮았다(A: 5-15%). 상기 배양물을 분할할 때(EDTA 계대), 배지에 10 μM의 블레비스타틴을 부가하였다. 이에 의해 hESC의 부착이 X-VIVO에서 무-블레비스타틴 hESC 배양물의 분할 후 부착에 비해 현저하게 증가되었다(B: 80-95%). 실제로, 개별화된 hESC도 매우 잘 부착되었다. 상기 배양물의 배지를 24시간 후 무-블레비스타틴 X-VIVO로 대체하여 블레비스타틴 없이 세포가 어떻게 부착된 상태로 증식하는지 지켜보았다. 여기에서는 유의적인 변화를 전혀 관찰할 수 없었다(C).

도 12는 골수 유래 간엽 줄기 세포(BM-MSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다. 4일간 친화성이 없는 Teflon^® 호일 위에서 MSC를 10 μM Bb와 함께 배양하고 4일째에 상기 호일에 부착된 세포를 계수하였다. 막대는 웰 당 세포수를 나타낸다. 대조군 배양물: 저해제가 없는 DMSO 또는 PBS 중의 BM-MSC. 대조군에 비해 미오신 억제 상태에서 세포 수율이 유의적으로 증가하는 것이 관찰되었다. 따라서, BM-MSC는 Teflon^® 호일에 부착하여 증식한다.

도 13은 제대혈 유래 줄기 세포(CB-USSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다. 4일간 친화성이 없는 Teflon^® 호일 위에서 USSC를 10 μM Bb와 함께 배양하고 4일째에 상기 호일에 부착된 세포를 계수하였다. 막대는 웰 당 세포수를 나타낸다. 대조군 배양물: 저해제가 없는 DMSO 또는 PBS 중의 CB-USSC. 대조군에 비해 미오신 억제 상태에서 세포 수율이 크게 유의적으로 증가하는 것이 관찰되었다. 따라서, CB-USSC는 Teflon^® 호일에 부착하여 증식한다.

도 14는 골수 유래 간엽 줄기 세포(BM-MSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다. 융합 상태에 도달할 때까지 친화성이 없는 Teflon^® 호일 위에서 MSC를 10 μM Bb와 함께 배양하고 세포 접종 후 6일째에 상기 호일에 부착된 세포를 계수하였다. 막대는 웰 당 세포수를 나타낸다. 대조군 배양물: 저해제가 없는 DMSO 또는 PBS 중의 BM-MSC. BM-MSC는 Teflon^® 호일 위에 완전히 융합된 층을 형성하지는 않는다. 대조군과 비교하여 미오신 억제 상태에서 세포 수율의 차이는 없었고, 4-일 실험과 명백히 일치하지 않은 것은 더 긴 배양기간(6일 대 4일) 및/또는 더 많은 초기 세포수(부착된 세포의 2배량은 접종할 ECM을 분비하는데 있어 더 효율적이었을 것임)가 원인일 수 있다.

도 15는 제대혈 유래 줄기 세포(CB-USSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다. 융합 상태에 도달할 때까지 친화성이 없는 Teflon^® 호일 위에서 USSC를 10 μM Bb와 함께 배양하고 세포 접종 후 6일째에 상기 호일에 부착된 세포를 계수하였다. 막대는 웰 당 세포수를 나타낸다. 대조군 배양물: 저해제가 없는 DMSO 또는 PBS 중의 CB-USSC. CB-USSC는 미오신 억제 상태에서 Teflon^® 호일 위에 융합층을 형성하고, 대조 배양물과 비교하여 미오신 억제 상태에서 세포 수율의 유의적인 증가가 관찰되었다.

도 16은 저혈청 EGM2+Dex-배지(3% 혈청)에서 배양한 제대혈 유래 줄기 세포(CB-USSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다. 친화성이 없는 Teflon^® 호일 디쉬 위에서 USSC를 10 μM Bb와 함께 배양하고 세포 접종 후 4일째에 계수하였다. 막대는 웰 당 세포수를 나타낸다. 대조군 배양물: 저해제가 없는 DMSO 또는 PBS 중의 CB-USSC. USSC는 미오신 저해제 처리 상태에서 유의적으로 증대된 증식을 보인다. 저혈청(EGM2) 배지의 Teflon^® 호일 위에서 USSC 부착과 증식은 미오신 억제에 의해 증대된다.

도 17은 무혈청 MSCGM-CD 배지에서 배양한 제대혈 유래 줄기 세포(CB-USSC)에 대한 블레비스타틴(Bb, (-) 거울상이성질체)의 효과를 보여주고 있는 막대 그래프이다. 친화성이 없는 Teflon^® 호일 디쉬 위에서 USSC를 10 μM Bb와 함께 배양하고 세포 접종 후 4일째에 계수하였다. 막대는 웰 당 세포수를 나타낸다. 대조군 배양물: 저해제가 없는 DMSO 또는 PBS 중의 CB-USSC. USSC는 미오신 억제와 무관하게 무혈청 배지에서 Teflon^® 호일에 부착하지만 유의적으로 증식하지는 않는다. 대조군과 비교하여 미오신 억제 상태에서 세포 수율의 명백한 증가를 관찰할 수 없었다.

도 18은 PTFE 용기(PTFE = 폴리테트라플루오로에틸렌, 상표명(DuPont): Teflon^®) 위의 제대혈 유래 염색된 줄기 세포(CB-USSC)를 보여주는 사진이다.

A) DMSO 대조군,

B) PBS 대조군,

C) 10μM (-)블레비스타틴.

대조군 배양물과 달리 USSC를 친화성이 없는 PTFE-용기 재료 위에서 3일간 10μM Bb와 함께 배양하였다. 대조군에 비해 미오신-억제 상태에서 세포 퍼짐이 현저하게 증대되었지만 응집체 형성은 관찰되지 않았다.

도 19는 미오신-억제 유무에 따라 저온 보존 전후 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 생존 세포 밀도(막대)와 회수율(삼각형)을 보여주는 그래프이다(BB = 블레비스타틴).

도 20은 저온 보존된 세포를 해동한 후 2일과 4일째에 인간 배아 줄기 세포(hESC)의 평균 총수를 보여주는 막대 그래프이다. 통상적으로 세포 집락만이 저온 보존될 수 있을 뿐 단일 ES 세포는 저온 보존될 수 없다. 이 도면을 통해 미오신 억제는 저온 보존 후 단일 세포 생존율을 크게 증가시킴을 알 수 있다.

요약하면, 도 19와 20으로부터 블레비스타틴은 단일 hESC의 저온 보존 회수율을 hESC 집락의 회수율의 비슷한 수준까지 증가시킨다는 것을 알 수 있다. 게다가, 동결 전에 블레비스타틴을 첨가하는 것은 단일 hESC를 저온 보존하는데 유익하다.

위에 나타낸 실험 데이터에 의하면, 블레비스타틴과 같은 비-근육 미오신 II의 직접 저해제는 세포 배양, 특히 부착-의존성 세포의 배양에 대해 여러 긍정적인 효과가 있다는 것은 분명하다. 예를 들면, 직접 미오신 II 저해제는

- 현탁 배양액에서 세포 생존율을 증가시키고,

- 현탁 배양액에서 세포 응집을 감소시키고,

- 세포 배양에 달리 적합하지 않은 기질에서 부착과 증식을 촉진하고,

- 특정 기질에 대한 세포의 부착을 제어하기 위한 수단을 제공하고,

- 세포 전위 중에 보호 효과를 갖고,

- 세포의 동결 및/또는 해동 중에 세포에 대한 보호효과를 갖고,

- 세포 분류(예를 들면 FACS) 중에 보호효과를 갖고,

- 제대혈과 골수 유래 MNC-분리물(1차 조직)로부터 초기 세포 부착을 향상시키고,

- 미오신 억제는 Teflon^® 호일 상에서 BM-MSC의 접종을 완만하게 증대시키고 CB-USSC의 부착을 크게 증대시키고,

- 미오신-억제는 Teflon^® 상에서 CB-USSC와 융합 성장시키고,

- 미오신 억제에 의해 MSC-GM(무혈청 배지) 중 무혈청 조건에서 접종은 긍정적으로 영향을 받고,

- 미오신 억제에 의해 EGM2-MV 중 저혈청 조건에서 접종과 증식은 긍정적으로 영향을 받는다.

본 발명의 또 다른 요지는 기질에 대한 세포, 특히 부착-의존성 세포의 부착을 제어하여 세포의 고수율 생산과 저손상 탈착에 적합한 기질을 선택할 수 있는 방법을 제공하는데 있다. 특히 비-근육 미오신 II를 직접적으로 억제하는 저해제 분자를 세포에 공급함으로써 기질에 대한 상기 세포의 접착을 제어하는 방법을 제공한다. 상기 세포에 저해제를 공급하면 충분한 친화성을 달리 갖지 않았을 표면에 대한 이들 세포의 부착능을 증강시킨다. 이에 따라, 비-근육 미오신 II를 직접 억제하는 상기 저해제 분자는 사용자가 현탁 배양을 위한 미소 담체와 같은 특정 기질에 대한 세포 부착을 제어하기 위해 사용할 수 있는 일종의 촉진제로서 유리하게 사용될 수 있다. 게다가 본 발명에 따른 저해제는 세포 배양을 위해 적합한 기질의 선택의 폭을 넓혀 미소 담체에 대한 세포의 부착에 의존하는 세포 배양법을 최적화할 수 있고 이에 따라 크게 개선시킬 수 있는 유용한 수단이다.

바람직하게는 상기 기질에 대한 세포의 접착은 세포에 저해제 분자를 공급함으로써 촉진된다. 상기 세포를 저해제로 처리하면 이들 세포를 배양하는데 달리 적합하지 않은 표면에 대한 세포의 부착능과 증식능이 얻어진다. 즉, 본 발명에 따른 방법에서는 세포를 배양 및/또는 증식시키는데 적합한 기질, 예를 들면 미소 담체의 선택의 폭이 크게 넓어진다. 이에 따라, 배양할 세포가 접착될 수 있는 기질과 관련하여 훨씬 많은 선택권이 있기 때문에 배양 조건을 쉽게 개선하고 최적화한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 기질은 복수 개의 미소 담체로서 상기 기질에 부착된 세포가 현탁 조건에서 배양된다. 이 실시형태에 있어서, 세포가 성장할 수 있는 표면적을 증가시켜 현탁 조건, 바람직하게는 적절한 생물 반응기에서 세포를 배양하면서 미소 담체, 바람직하게는 적절한 비드 위에서 상기 세포를 대량 생산할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 세포는 부착-의존성 세포, 특히 성체 줄기 세포, 바람직하게는 간엽 줄기 세포이다. 그러나 본 발명에 따른 방법은 비-근육 미오신 II를 직접 억제하는 저해제에 의해 기질에 대한 친화성이 영향을 받을 수 있는 모든 세포 유형을 포함한다.

본 발명의 중요한 일 요지는 상술한 바와 같이 표면에 대한 세포의 접착을 제어하기 위한 블레비스타틴의 용도이다.

본 발명의 또 다른 요지에 있어서, (a) 세포를 현탁시키고, (b) 상기 세포를 복수 개의 미소 담체의 표면에 부착되도록 하고, (c) 현탁 조건에서 상기 미소 담체에 부착된 세포를 배양하는 것을 포함하는 세포 증식 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 단계 (a)에서 세포를 현탁하기 전 및/또는 도중에 비-근육 미오신 II을 직접적으로 억제하는 저해제 분자로 세포를 처리한다. 이 방법에서, 세포가 성장할 수 있는 표면적이 크게 증가되어 현탁 조건, 바람직하게는 적절한 생물 반응기에서 세포를 배양하면서 미소 담체, 바람직하게는 적절한 비드 위에서 상기 세포를 대량 생산할 수 있다. 상기 저해제는 미소 담체에 대한 세포의 접착을 촉진하고 친화성을 전혀 또는 충분한 친화성을 달리 갖지 않았을 표면에 대한 세포, 바람직하게는 부착-의존성 세포의 부착능을 증강시킨다.

몇몇 요지에 있어서, 단계 (a)와 (b) 중 적어도 하나의 단계 전에 상기 세포를 동결 및 해동한다. 놀라운 것은 본 발명에 따른 방법의 진행과정에서 세포를 동결 및 해동하면 증식 중 세포의 접착과 생존이 향상되어 세포의 수율이 크게 증가할 수 있다는 점이다. 또한 여기에서 미오신 II 저해제는 세포의 동결 및 해동시 세포에 대한 보호효과를 갖는다.

바람직한 실시형태에 따르면, 상기 세포는 부착-의존성 세포, 특히 성체 줄기 세포, 바람직하게는 간엽 줄기 세포이다. 그러나 본 발명에 따른 방법은 비-근육 미오신 II를 직접 억제하는 저해제가 존재하는 상태에서 효율적으로 증식할 수 있는 모든 세포 유형을 포함한다.

본 발명의 중요한 또 다른 요지는 복수 개의 미소 담체에 접착된 세포를 증식시키기 위한 블레비스타틴의 용도로서, 상기 미소 담체에 부착된 세포를 현탁 조건에서 배양하는 용도이다.

본 발명의 또 다른 요지에 있어서, 조직으로부터 세포를 분리하기 위한 방법으로서, (a) 비-근육 미오신 II를 직접 억제하는 저해제 분자가 존재하는 상태에서 상기 조직을 해리하고, (b) 상기 조직으로부터 해리된 세포로부터 대상 세포를 분리하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 놀랍게도 본 발명에 따른 저해제는 1차 분리물로부터 세포의 생존과 회수를 크게 향상시키는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명에 따른 방법은 현탁 상태에 함침된 조직으로부터 세포의 전이가 개선되는 장점이 있다. 이에 따라, 상기 세포를 분리하는 동안 저해제 분자로 처리하면 높은 수율로 나타나고 경우에 따라 조직으로부터 새로운 세포 유형을 동정할 수 있다.

대상 세포를 분리한 후, 이들 세포를 현탁 배양 조건에서 증식하여 추가 사용을 위한 더 많은 수의 세포를 생산할 수 있다. 바람직하게는, 비-근육 미오신 II을 직접 억제하는 저해제 분자가 존재하는 상태에서 대상 세포를 증식한다.

대상 세포는 부착-의존성 세포, 특히 성체 줄기 세포, 바람직하게는 간엽 줄기 세포일 수 있다. 부착-의존성 세포가 분리되었다면, 이들을 상기 저해제 분자가 없는 부착-의존성 세포 배양 조건에서 증식시키는 것이 적절할 수 있다.

상기 저해제 분자는 블레비스타틴일 수 있다. 블레비스타틴은 세포 배양에 적용시 부착성이 부족하여 유발되는 세포사를 최소화하고 단일 세포 배양을 촉진하는 소분자이다. ROCK 저해제에 비해 블레비스타틴은 비-근육 미오신 II의 직접적이면서 비경쟁적인 저해제로서 작용한다. 블레비스타틴은 복잡한 신호전달 증폭경로에 간섭하지는 않지만 미오신-ADP-Pi 복합물에 결합함으로써 비-근육 미오신 II 및 비-근육 미오신 II과 액틴의 상호작용을 직접 표적으로 한다. 중요한 것은, 블레비스타틴이 미오신 II의 용이하게 조정할 수 있는 가역적(양성)인 저해제라는 점이다. 다른 한편으로 블레비스타틴은 절대적으로 부착에 의존하는 세포의 현탁액 생존율을 크게 증가시킨다. 상기 물질은 필요에 따라 배지에 쉽게 첨가할 수 있고 그 효과는 상기 물질을 제거함으로써 직접적이면서 즉각적으로 완전히 가역적이다. 상기 분자는 - 초기 현탁 단계 중에 세포사를 최소화함으로써 - 현탁 배양을 위한 전이 뿐 아니라 - 추출, 즉 조직-함침된 상태 또는 위치로부터 현탁 상태로 전이하는 중에 세포사를 최소화함으로써 - 조직으로부터 새로운 세포를 동정하는데 있어 중요한 도구이다.

본 발명의 중요한 요지는 블레비스타틴이 조직-함침 상태로부터 현탁 상태로 전이하는 중에 부착-의존성 세포를 분리하기 위해, 특히 부착-의존성 세포의 수율을 증가시키기 위해 유익하게 사용될 수 있다는 점이다.

본 발명의 또 다른 중요한 요지는 부착-의존성 세포, 바람직하게는 성체 줄기 세포, 특히 간엽 줄기 세포에 대한 성장 인자의 효과를 증대시키기 위한 블레비스타틴의 용도이다.

본 발명의 또 다른 중요한 요지는 부착-의존성 세포, 바람직하게는 성체 줄기 세포, 특히 간엽 줄기 세포의 무혈청 배양 중에 부착 인자를 대체하기 위한 블레비스타틴의 용도이다.

비-근육 미오신 II을 직접 억제하는 저해제 분자, 바람직하게는 블레비스타틴으로 세포를 처리하면 필연적으로 세포의 특성에 영향을 주게 되어 처리된 세포는 미처리 세포와는 다른 새로운 성질과 능력을 나타낸다. 결과적으로, 미오신 II 저해제로 처리된 세포는 적어도 어느 정도는 서로 다른 형태와 생화학적 조성을 갖는 새로운 종류의 세포이다.

따라서 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 증식 또는 분리한 세포, 바람직하게는 줄기 세포, 보다 바람직하게는 성체 줄기 세포, 특히 간엽 줄기 세포를 포함한다. 즉, 본 발명은 비-근육 미오신 II를 직접 억제하는 저해제 분자, 바람직하게는 블레비스타틴이 존재하는 상태에서 배양 또는 분리되는 모든 세포에 관한 것이다.

게다가, 본 발명에 따른 방법과는 독립적으로, 본 발명은 비-근육 미오신 II을 직접 억제하는 저해제 분자, 바람직하게는 블레비스타틴이 존재하는 상태에서 처리 또는 배양된 임의의 세포, 바람직하게는 줄기 세포, 보다 바람직하게는 성체 줄기 세포, 특히 간엽 줄기 세포을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 적어도 하나의 세포, 바람직하게는 줄기 세포, 보다 바람직하게는 성체 줄기 세포, 특히 간엽 줄기 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 세포의 생존율 확보에 적합한 세포 배양 배지 또는 또 다른 용액을 포함할 수 있다. 그러나 본 발명은 이러한 조성물에 한정되는 것은 아니다. 이와 달리, 예를 들면 본 발명에 따른 조성물은 적절한 보호 물질에 현탁된 동결 세포를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 세포, 바람직하게는 줄기 세포, 보다 바람직하게는 성체 줄기 세포, 특히 간엽 줄기 세포와 비-근육 미오신 II을 직접 억제하는 저해제 분자, 바람직하게는 블레비스타틴을 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 조성물 중 적어도 하나에는 실질적으로 혈청이 없다. 예를 들면, 상기 조성물은 블레비스타틴을 포함하는 무혈청 배양 배지 중 간엽 줄기 세포의 현탁액을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 및/또는 조성물은 비-의료 실험실용 키트에 포함되거나 약제학적 제제의 일부로서 포함될 수 있다.

문헌:

Straight 등: Science, 2003, 299, 1743-1747

Walker, A., Su, H., Conti, M.A., Harb, N., Adelstein, R.S., Sato, N.: Nature Communications, 2010, DCI: 10.1038, ncomms1074

Claims (15)

1. 기질에 대한 세포의 접착을 촉진하기 위한 방법으로서, 기질에 대한 세포의 접착을 상기 세포에 비-근육 미오신 II 저해제인 블레비스타틴을 공급하여 충분한 친화성을 달리 갖지 않았을 표면에 세포를 부착시킬 수 있도록 함으로써 촉진하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 기질이 비-점착 물질이거나 적어도 부분적으로 비-점착 물질로 코팅되는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 비-점착 물질이 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리플루오로에틸렌(PFE), 퍼플루오로알콕시(PFA), 불소화 에틸렌 프로필렌(FEP), 이산화티탄 화합물 또는 이산화티탄을 포함하는 조성물, 또는 이들의 조합물을 포함하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질이 의료 기구, 바람직하게는 스텐트, 패치 또는 인공혈관 또는 기관의 표면인 방법.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질이 복수 개의 미소 담체인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 부착-의존성 세포, 특히 성체 줄기 세포, 바람직하게는 간엽 줄기 세포인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 현탁 배양 조건에서 증식되는 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 저혈청 또는 무혈청 배양 배지에 현탁되는 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 블레비스타틴이 존재하는 상태에서 동결 및/또는 해동된 다음, 상기 기질과 접촉시키는 방법.
10. 충분한 친화성을 달리 갖지 않았을 기질에 대한 세포의 접착을 촉진하기 위한 블레비스타틴의 용도.
11. 의료 기구, 바람직하게는 스텐트, 패치 또는 인공혈관 또는 기관의 표면을 상기 표면에 대한 친화성이 달리 없거나 매우 낮은 세포로 코팅하기 위한 블레비스타틴의 용도.
12. 적어도 하나의 표면이 상기 표면에 대한 친화성이 통상적으로 없거나 매우 낮은 세포로 코팅되어 있는 기구.
13. 제12항에 있어서, 상기 표면이 비-점착 물질, 바람직하게는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 폴리플루오로에틸렌(PFE), 퍼플루오로알콕시(PFA), 불소화 에틸렌 프로필렌(FEP), 이산화티탄 화합물 또는 이산화티탄을 포함하는 조성물, 또는 이들의 조합물을 포함하는 기구.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 세포가 부착-의존성 세포, 특히 성체 줄기 세포, 바람직하게는 간엽 줄기 세포인 기구.
15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기구가 의료 기구, 바람직하게는 스텐트, 패치 또는 인공혈관 또는 기관인 기구.

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