ES2602078T3 - Composiciones y métodos para mejorar el potencial terapéutico de las células madre - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una población de células madre y blebistatina para uso en el tratamiento de una enfermedad susceptible de tratamiento con terapia de células madre.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos para mejorar el potencial terapeutico de las celulas madre Campo de la invencion

La invencion se refiere a composiciones y metodos relacionados con celulas madre.

Antecedentes de la invencion

La terapia de celulas madre es una estrategia auspiciosa relacionada con el trasplante de medula osea, piel, corazon y cornea, la enfermedad del injerto contra el hospedador, la insuficiencia hepatica y renal, la lesion pulmonar, la artritis reumatoide, el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa, la esclerosis multiple, el lupus y la diabetes; la prevencion del rechazo del aloinjerto, los trastornos neurologicos y la medicina cardiovascular.

Se pueden aislar celulas madre mesenquimales (MSC) y/o celulas progenitoras o precursoras a partir de una variedad de tejidos, tales como la medula osea, el musculo esqueletico, la pulpa dental, los huesos, el cordon umbilical y el tejido adiposo. Las MSC estan siendo objeto de un interes en aumento como fuente potencial para estrategias terapeuticas en la medicina regenerativa. Las celulas madre pueden autorrenovarse y tienen la capacidad de diferenciarse en tipos de celulas espedficos o pueden usarse terapeuticamente para la produccion y la secrecion de factores solubles que promoveran la regeneracion de los tejidos. En particular, las celulas madre/progenitoras adultas de origen autologo abundante tienen ventajas adicionales con respecto a los tipos de celulas madre embrionarias («ES») dada su gran disponibilidad, su tumorgenicidad baja y que permiten evitar cuestiones eticas controversiales asociadas a las celulas ES.

Para facilitar la capacidad de reparar o regenerar con eficiencia organos y tejidos con defectos o enfermedades, las celulas madre/progenitoras donantes debenan poseer propiedades terapeuticas convenientes, por ejemplo, efectos secundarios mmimos, la capacidad de integrarse al tejido hospedador, la diferenciacion en linajes celulares deseados, efectos paracrinos, la regulacion de la remodelacion de tejidos y la activacion de mecanismos de reparacion/regeneracion endogenos.

Se han empleado MSC en numerosos estudios preclmicos en roedores, conejos y babuinos, entre otros, para el trasplante de medula osea, piel, corazon y cornea, la enfermedad del injerto contra el hospedador, la insuficiencia hepatica y renal, la esclerosis multiple, la artritis reumatoide, las enfermedades del lupus y la diabetes. Los resultados preliminares de algunos de estos estudios han llevado a que en la actualidad se esten realizando ensayos clmicos en humanos. Estos ensayos involucran el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa, la esclerosis multiple y la diabetes mellitus tipo 1; la prevencion del rechazo del aloinjerto; y la mejora de la supervivencia de los injertos de medula osea y rinones; y el tratamiento de la enfermedad del injerto contra el hospedador resistente.

Un componente principal de la morbilidad y la mortalidad que se puede atribuir a la enfermedad cardiovascular se produce como consecuencia del bloqueo completo o parcial de vasos que transportan sangre en la vasculatura coronaria y/o periferica. Cuando esos vasos se encuentran parcialmente obstruidos, la falta de flujo sangumeo provoca isquemia en los tejidos musculares alimentados por ese vaso, lo cual inhibe la contraccion muscular y/o por funcion. La oclusion total del flujo sangumeo provoca la necrosis del tejido muscular.

La enfermedad arterial periferica (PAD, por sus siglas en ingles) afecta a 8 millones de estadounidenses. Es el resultado de la contraccion de las arterias en las piernas. Los smtomas mas comunes de PAD son los calambres, el dolor o el cansancio al caminar. Sin embargo, algunos pacientes con PAD pueden perder la capacidad de caminar y pueden sufrir amputaciones.

En algunos individuos, la obstruccion de los vasos sangumeos es compensada parcialmente por procesos naturales, en los cuales se forman nuevos vasos (un proceso que a menudo se denomina «angiogenesis») y se agrandan los vasos pequenos (lo cual se denomina «arteriogenesis») para remplazar la funcion de los vasos deteriorados. Estos nuevos conductos pueden facilitar la restauracion del flujo sangumeo hacia el tejido que lo necesite, constituyendo de esa manera «baipases naturales» alrededor de los vasos obstruidos.

Sin embargo, algunos individuos con la angiogenesis obstaculizada son incapaces de generar suficientes vasos colaterales para compensar de manera adecuada la disminucion del flujo sangumeo provocada por la enfermedad cardiovascular. Existe la necesidad de nuevas estrategias terapeuticas para tratar las enfermedades isquemicas.

Diversos estudios han evaluado el efecto terapeutico de las MSC en modelos animales preclmicos y han demostrado un gran potencial clmico. Sin embargo, persisten interrogantes importantes con respecto a la dosificacion optima de MSC, la via de administracion y el destino celular de las MSC despues de la infusion.

Por lo tanto, existe una gran necesidad de composiciones de MSC terapeuticas optimizadas y metodos para su uso, para mejorar los smtomas de diversas enfermedades en general y en el tratamiento de enfermedades vasculares en

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particular.

Walker et al., Nat Commun. Manuscrito del autor; disponible en 2010, describe en terminos generales que el tratamiento de celulas madre pluripotentes humanas (hPS, por sus siglas en ingles) tales como celulas madre embrionarias humanas (hES, por sus siglas en ingles) y celulas madre pluripotentes inducidas (hiPS, por sus siglas en ingles) con el inhibidor de la miosina no muscular II (NMII), la blebistatina, mejora la supervivencia de celulas hPS en condiciones de suspension e identidad clonal. La publicacion estadounidense n.° 20100216181 describe el cultivo de celulas madre pluripotentes en un medio libre de suero y celulas de alimentacion mediante el uso de blebistatina como factor de supervivencia. Se generan mayores cantidades de celulas mediante el cultivo de las celulas en matraces de agitacion o biorreactores. La solicitud PCT publicada WO2012062819 describe un metodo para controlar la union de celulas a un sustrato mediante el uso de la blebistatina como promotora para la adhesion de celulas con las cuales las celulas habitualmente tienen una afinidad nula o limitada.

Sin embargo, ninguna de estas referencias indica o sugiere los resultados inesperadamente superiores observados al tratar pacientes con una composicion que contiene celulas madre y un antagonista de la miosina no muscular II.

Compendio de la invencion

Un aspecto de la invencion se refiere a un metodo para tratar una enfermedad vascular que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de una composicion que comprende una poblacion de celulas y blebistatina, tratandose de ese modo la enfermedad vascular.

En una realizacion, la enfermedad vascular es una consecuencia de la diabetes. En una realizacion, la enfermedad vascular es una consecuencia de la aterosclerosis. En una realizacion adicional, la enfermedad vascular es una enfermedad vascular periferica (PVD, por sus siglas en ingles). En incluso otra realizacion, la enfermedad vascular es una enfermedad arterial periferica (PAD, por sus siglas en ingles). En incluso otra realizacion adicional, la enfermedad vascular esta asociada a un mdice de presion tobillo-brazo de aproximadamente o menos de 0.9. En aun otra realizacion, la enfermedad vascular esta asociada a un mdice de presion tobillo-brazo de aproximadamente o menos de 0.7. En incluso otra realizacion, la enfermedad vascular ha provocado una isquemia cntica de las extremidades. En otra realizacion, la enfermedad vascular ha provocado ulceraciones en la piel o gangrena. Eu una realizacion adicional, la composicion provoca o potencia la angiogenesis. En incluso otra realizacion, la composicion provoca o potencia la angiogenesis en al menos aproximadamente 20 por ciento en comparacion con el control.

En aun otra realizacion, una parte de la poblacion de las celulas comprende celulas pluripotentes. En incluso otra realizacion adicional, las celulas pluripotentes son celulas madre pluripotentes inducidas. En otra realizacion, una parte de la poblacion de las celulas comprende celulas multipotentes. En incluso otra realizacion, las celulas multipotentes son celulas madre mesenquimales o celulas estromales multipotentes. En incluso otra realizacion adicional, las celulas multipotentes derivan de celulas madre pluripotentes inducidas. En incluso otra realizacion, la composicion comprende un portador farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion adicional, la funcion de las extremidades en el paciente mejora en aproximadamente o al menos 2-3 grados en comparacion con el mismo paciente sin recibir la composicion. En otra realizacion, el flujo sangumeo en las extremidades del paciente mejora en aproximadamente o al menos 65-85 % con respecto al flujo sangumeo normal o sin tratamiento de las extremidades. En aun otra realizacion adicional, el dano isquemico en el paciente mejora en aproximadamente o al menos 2, 3 o 4 grados en comparacion con el mismo paciente sin recibir la composicion. En aun otra realizacion adicional, el dano isquemico en el paciente mejora a una velocidad mas rapida (o velocidad acelerada) en comparacion con el mismo paciente sin recibir la composicion.

En aun otra realizacion adicional, la composicion se administra por via intravenosa. En incluso otra realizacion, la composicion se administra por via intramuscular. En otra realizacion, la composicion se administra por via intramuscular en un sitio de dano isquemico o cerca de este.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un kit que comprende una poblacion de celulas multipotentes; blebistatina; un portador farmaceuticamente aceptable; y, opcionalmente, instrucciones para administrar estos a un paciente diagnosticado con una enfermedad susceptible de tratamiento mediante el uso de una terapia de celulas madre. En una realizacion, la enfermedad es una enfermedad cardiovascular. En otra realizacion, la enfermedad es una enfermedad arterial periferica.

En una realizacion, las celulas son MSC. En otra realizacion, el antagonista de la miosina no muscular II es la blebistatina. En otra realizacion, la enfermedad cardiovascular es una enfermedad arterial periferica. En una realizacion adicional, las celulas son MSC, el antagonista de la miosina no muscular II es la blebistatina y la enfermedad cardiovascular es una enfermedad arterial periferica. En incluso otra realizacion, el kit comprende ademas un farmaco cardiovascular. En una realizacion adicional, el kit comprende ademas un estent. En aun otra realizacion, el kit comprende ademas un estent de elucion de farmacos. En una realizacion, los artmulos que componen el kit se encuentran en envases separados. En otra realizacion, la poblacion de celulas multipotentes; el antagonista de la miosina no muscular II; y el portador farmaceuticamente aceptable se encuentran en el mismo envase, por ejemplo, una jeringa o un dispositivo de administracion automatica. El kit puede ser para una enfermedad arterial periferica. El kit puede tener celulas que sean MSC. Lo ideal es que el antagonista de la miosina no muscular II sea la blebistatina y

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la enfermedad sea una enfermedad arterial periferica. El kit puede comprender ademas un farmaco cardiovascular y/o un estent y/o un estent de elucion de farmacos. Los artmulos pueden encontrarse en envases separados, en el mismo envase o en una jeringa.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo para reducir la tasa de amputacion en un paciente con una enfermedad arterial periferica que se trata con una composicion que comprende MSC, que comprende la puesta en contacto con las MSC, en donde el antagonista de la miosina no muscular II es la blebistatina. En otra realizacion, la tasa se reduce en al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % o mas.

Otro aspecto de la invencion se refiere a una composicion de celulas madre para tratar una enfermedad susceptible de tratamiento con una terapia de celulas madre que comprende una poblacion de celulas multipotentes; y un antagonista de la miosina no muscular II, en donde el antagonista de la miosina no muscular II es la blebistatina. En una realizacion de este aspecto de la invencion, las celulas son MSC.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo para elaborar una composicion de celulas madre para tratar una enfermedad susceptible de tratamiento con una terapia de celulas madre que comprenda una poblacion de celulas multipotentes; y el antagonista de la miosina no muscular II blebistatina; en donde la poblacion de celulas multipotentes y la blebistatina se incuban juntas durante un penodo de tiempo antes de la administracion a un paciente.

Un aspecto adicional de la invencion esta dirigido a un metodo de aceleracion de la curacion de una enfermedad susceptible de tratamiento con una terapia de celulas madre que comprende tratar a un paciente con una composicion que comprende una poblacion de celulas multipotentes; y el antagonista de la miosina no muscular II blebistatina; en donde la composicion provoca que la enfermedad se cure con mayor rapidez que con la misma composicion sin el antagonista de la miosina no muscular II.

En determinadas realizaciones de estos aspectos, las celulas son MSC. En otras realizaciones, el antagonista de la NM II es la blebistatina. En aun otras realizaciones adicionales, la enfermedad es una enfermedad cardiovascular.

Breve descripcion de las figuras

Se puede obtener una comprension mas completa de la presente invencion por referencia a los dibujos anexos, considerados junto con la descripcion detallada posterior. Se pretende que las realizaciones que se ilustran en las figuras solamente ejemplifiquen la invencion y no debena interpretarse que limiten la invencion a las realizaciones ilustradas.

Las Figuras 1A-B muestran el flujo sangumeo (%) a lo largo del tiempo: La mediana en el grupo se calculo en todos los animales validos. La blebistatina (BB) acelera y potencia la regeneracion del flujo sangumeo mediante el implante de celulas madre mesenquimales. Las celulas madre administradas en presencia de blebistatina (1A, Grupo 4, diamante) mostraron una regeneracion mas rapida y mejorada del flujo sangumeo en los animales en comparacion con las celulas madre que se habfan tratado previamente con blebistatina pero que se implantaron en ausencia de blebistatina (1A. Grupo 5, cuadrado negro relleno). El control de medios que contema blebistatina (1A, Grupo 2, drculo) mostro efectos de recuperacion marginales asf como las MSC, que retomaron la recuperacion en instancias temporales posteriores (1A, Grupo 3, triangulo). La aplicacion intramuscular de MSC mostro efectos sistematicamente superiores con respecto a la aplicacion intravenosa. Los datos muestran que la blebistatina (BB) sola no tuvo efecto alguno en la regeneracion del flujo sangumeo pero que la blebistatina mejora y/o colabora con el potencial regenerativo de las MSC cuando se aplica junto con celulas madre.

Las Figuras 2A-B muestran la funcion de las extremidades (%) a lo largo del tiempo: La mediana en el grupo se calculo en todos los animales validos. Los datos muestran que la presencia de la blebistatina (BB) con MSC colabora con la rapida mejora de la funcion de las extremidades. A pesar de la mejora de la perfusion sangumea en otros grupos tratados, se observo un deterioro de la funcion de las extremidades y necrosis de las extremidades a partir del dfa 28 despues del tratamiento. El Grupo 3 mostro una mayor aparicion de amputaciones y una mayor distribucion entre los animales. Los datos muestran que el tratamiento intravenoso (2B) fue de alguna manera menos eficaz y provoco mas complicaciones en comparacion con el regimen de tratamiento intramuscular local (Figura 2A). Los ratones que recibieron MSC implantadas en presencia de blebistatina (2A, Grupo A, cuadrado sin relleno) mostraron una mejora constante y rapida de la funcion de las extremidades en forma sistematica a lo largo del tiempo despues del implante. Se detecto la misma tendencia en ratones con MSC tratadas previamente con blebistatina en un menor grado (2A, Grupo 5, triangulo). En cambio, la aplicacion de MSC solas mostro una ligera mejora hasta el dfa 20 y la funcion de las extremidades empeoro en instancias temporales posteriores. Los controles de medios presentaron solamente efectos marginales. Cabe senalar que una pendiente negativa significa una mejora de la funcion de las extremidades. Nuevamente, la aplicacion intramuscular de MSC (2A) mostro efectos sistematicamente superiores con respecto a la aplicacion intravenosa (2B). La aplicacion de MSC en presencia de la blebistatina tiene un mejor rendimiento que el potencial regenerativo de las MSC. Esta aplicacion mostro la mejora mas rapida en el potencial regenerativo.

La Figura 3A-B muestra el mdice de gravedad isquemica (%): La mediana en el grupo se calculo en todos los animales validos. Las MSC aplicadas junto con la blebistatina impiden la gravedad en el mdice isquemico. El analisis del mdice de gravedad isquemica a lo largo del tiempo muestra resultados sistematicamente mejores para el Grupo 4 y 5 con la aplicacion intramuscular, si bien los controles de medios variaron dentro de la dispersion. Cabe senalar que las MSC

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(Grupo 3) mostraron una alta varianza en el mdice para las aplicaciones intramuscular e intravenosa mientras que el Grupo 5 solo lo hizo para la aplicacion intravenosa. Nuevamente, la aplicacion intramuscular de las MSC se muestra en 3A; la aplicacion intravenosa se muestra en 3B.

La Figura 4 muestra la distribucion de pendientes de diagramas de caja para el flujo sangumeo (%), calculada como la tendencia lineal desde la cirugfa hasta el D^a 35 para el flujo sangumeo (%). El numero individual para cada animal representa su cambio en un criterio de valoracion a lo largo del tiempo. Estos diagramas proporcionan un metodo conveniente para presentar muchos grupos en un unico grafico. A modo de ejemplo, la evaluacion del flujo sangumeo (%) se ilustra como diagramas de caja de pendientes por grupo con el fin de senalar la baja variacion (indicada por los tamanos pequenos de las cajas) dentro de los controles y el grupo con el mejor rendimiento en el estudio BMMSC en DMEM + BB para la aplicacion intramuscular asf como la intravenosa.

La Figura 5 muestra que la blebistatina impide complicaciones graves durante el proceso de curacion. A menudo, un problema importante en los estudios preclmicos es la alta tasa de desercion de los animales debido a fallas relacionadas con el tratamiento (amputaciones despues del dfa 14 luego de la cirugfa) o no relacionadas con el tratamiento (por ejemplo, la muerte durante la anestesia o amputaciones antes del dfa 14 luego de la cirugfa). Solamente se han excluido unos pocos animales del analisis estadfstico por este ultimo motivo. Sin embargo, estos animales que mostraron efectos secundarios graves (amputacion) se clasificaron y sus datos se ingresaron en los analisis estadfsticos. Los datos demuestran claramente que la blebistatina (Grupos 4 y 8) mejora drasticamente el potencial regenerativo de las MSC y se destaca por tasas sorprendentemente bajas de complicaciones graves.

Descripcion detallada de la invencion

En la presente memoria se describen composiciones de MSC y metodos que permiten una curacion mas rapida y una regeneracion mejorada de tejidos enfermos o danados y al mismo tiempo reducen en gran medida las complicaciones durante la curacion. En particular, se describe en la presente memoria que las composiciones de MSC de la invencion tienen un gran potencial regenerativo en un modelo animal validado. En particular, se ha descubierto que la blebistatina acelera y mejora el potencial terapeutico de las MSC de manera drastica e inesperada, al tiempo que reduce complicaciones graves de la curacion.

El uso de los artmulos «un» o «una» junto con la expresion «que comprende» en las reivindicaciones y/o la memoria descriptiva pueden referirse a «uno/a», pero tambien concuerdan con el significado de «uno/a o mas», «al menos uno/a» y «uno/a o mas de uno/a».

En toda la solicitud, la expresion «aproximadamente» se utiliza para indicar que un valor incluye la variacion inherente de error para el dispositivo, donde el metodo se utiliza para determinar el valor o la variacion que existe entre los sujetos del estudio. Normalmente, se pretende que el termino abarque aproximadamente o menos de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 % de variabilidad, dependiendo de la situacion.

El uso del termino «o» en las reivindicaciones se emplea para hacer referencia a «y/o», a menos que se indique explfcitamente que hace referencia solamente a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, si bien la descripcion admite una definicion que haga referencia solamente a alternativas y a «y/o».

Como se emplea en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, las expresiones «que comprende» (y cualquier forma de «que comprende», tal como «comprender» y «comprende»), «que tiene» (y cualquier forma de «que tiene», tal como «tener» y «tiene»), «que incluye» (y cualquier forma de «que incluye», tal como «incluye» e «incluir») o «que contiene» (y cualquier forma de «que contiene», tal como «contiene» y «contener») son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas de metodos adicionales que no se hayan nombrado. Se contempla que se pueda implementar cualquier realizacion descrita en la presente memoria descriptiva con respecto a cualquier metodo o composicion de la invencion y viceversa. Asimismo, se pueden usar composiciones de la invencion para lograr metodos de la invencion.

«Tratar», «que trata» o «tratamiento» se usan en la presente memoria para hacer referencia a la administracion de una sustancia a un sujeto con el objetivo de curar, aliviar, mitigar, curar, prevenir o mejorar un trastorno, smtomas del trastorno, un estado de enfermedad secundario con respecto al trastorno o una predisposicion al trastorno. Una «cantidad efectiva» es una cantidad de la sustancia que es capaz de producir un resultado conveniente desde el punto de vista medico como se indica en la presente memoria en un sujeto tratado. El resultado conveniente desde el punto de vista medico puede ser objetivo (es decir, se puede medir mediante alguna prueba o indicador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicacion de o siente un efecto).

Una «enfermedad susceptible de tratamiento con una terapia de celulas madre» se usa en la presente memoria para hacer referencia a cualquier procedimiento, condicion, trastorno, mal y/o enfermedad que pueda tratarse mediante la administracion de celulas madre. Esas enfermedades incluyen, pero no se limitan, al trasplante de medula osea, piel, corazon y cornea, la enfermedad del injerto contra el hospedador, la insuficiencia hepatica y renal, la lesion pulmonar, la artritis reumatoide, el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerativa, la esclerosis multiple, el lupus y la diabetes; la prevencion del rechazo del aloinjerto, los trastornos neurologicos y la medicina cardiovascular; asf como la leucemia linfoblastica aguda (ALL, por sus siglas en ingles), la

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leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en ingles), el linfoma de Burkitt, la leucemia mieloide cronica (CML, por sus siglas en ingles), la leucemia mielomonodtica juvenil (JMML, por sus siglas en ingles), el linfoma no Hodgkin, el linfoma de Hodgkin, la granulomatosis linfomatoide, el smdrome mielodisplasico (MDS, por sus siglas en ingles), la leucemia mielomonodtica cronica (CMML, por sus siglas en ingles), los smdromes de insuficiencia de la medula osea, la trombocitopenia amegacariocftica, la neutropenia autoinmunitaria (grave), la anemia diseritropoyetica congenita, la neutropenia dclica, la anemia de Diamond-Blackfan, el smdrome de Evan, la anemia de Fanconi, la enfermedad de Glanzmann, la dermatomiositis juvenil, el smdrome de Kostmann, la aplasia de los globulos rojos, el smdrome de Shwachman, la anemia aplasica grave, la anemia sideroblastica congenita, la trombocitopenia con ausencia de radio (smdrome TAR), la disqueratosis congenita, los trastornos de la sangre, la anemia de celulas falciformes (hemoglobina SS), la enfermedad de HbSC, la po talasemia falciforme, la a-talasemia mayor (hodropesfa fetal), la p-talasemia mayor (anemia de Cooley), la p-talasemia intermedia, la E-po talasemia, la E-p+ talasemia, los trastornos metabolicos, la adrenoleucodistrofia, la enfermedad de Gaucher (infantil), la leucodistrofia metacromatica, la enfermedad de Krabbe (leucodistrofia de celulas globoides), la enfermedad de Gunther, el smdrome de Hermansky-Pudlak, el smdrome de Hurler, el smdrome de Hurler-Scheie, el smdrome de Hunter, el smdrome de Sanfilippo, el smdrome de Maroteaux-Lamy, la mucolipidosis tipo II, III, la alfa manosidosis, el smdrome de Niemann Pick, tipo A y B, el smdrome de Sandhoff, la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Batten (lipofuscinosis ceroide neuronal heredada), la enfermedad de Lesch-Nyhan, las inmunodeficiencias, la ataxia-telangiectasia, la enfermedad granulomatosa cronica, el smdrome de DiGeorge, la deficiencia de IKK gamma, la poliendocrinopaffa por desregulacion inmunitaria, la mucolipidosis unida a X, tipo II, la mielocatexis, la inmunodeficiencia unida a X, la inmunodeficiencia combinada grave, la deficiencia de adenosina desaminasa, el smdrome de Wiskott-Aldrich, la agammaglobulinemia unida a X, la enfermedad linfoproliferativa unida a X, el smdrome de Omenn, la displasia reticular, la displasia ffmica, la deficiencia de adhesion leucocitaria, otra osteopetrosis, la histiocitosis de celulas de Langerhans, la linfohistiocitosis hemofagocftica, la enfermedad renal aguda y cronica, la enfermedad de Alzheimer, el antienvejecimiento, la artritis, el asma, la terapia de celulas madre cardfacas, el infarto cerebral (apoplejfa), la paralisis cerebral (apoplejfa), la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC), la insuficiencia cardfaca congestiva, la diabetes mellitus (tipo I y II), la fibromialgia, las deficiencias inmunitarias, la enfermedad caroffaca isquemica, el lupus, la esclerosis multiple, el infarto de miocardio, la osteoartritis, la osteoporosis, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad arterial periferica, la artritis reumatoide, la terapia de celulas madre en la cirugfa plastica, la lesion cerebral traumatica y las enfermedades neurologicas.

Una «enfermedad vascular o cardiovascular» como se emplea en la presente memoria se caracteriza por eventos cffnicos que incluyen smtomas cffnicos y signos cffnicos. Los smtomas cffnicos son aquellas experiencias senaladas por un paciente que indican al medico la presencia de una patologfa. Los signos cffnicos son aquellos hallazgos objetivos en examenes ffsicos o de laboratorio que indican al medico la presencia de una patologfa. «Enfermedad cardiovascular» incluye «enfermedad arterial coronaria» y «enfermedad vascular periferica», como se definiran estos terminos mas adelante. Los smtomas cffnicos en la enfermedad cardiovascular incluyen dolor en el pecho, dificultad para respirar, debilidad, desmayos, alteraciones de la conciencia, dolor en las extremidades, disnea nocturna paroxfstica, ataques isquemicos transitorios y otros fenomenos de ese tipo experimentados por el paciente. Los signos cffnicos en la enfermedad cardiovascular incluyen hallazgos tales como anormalidades en ECG, pulsos perifericos alterados, soplos arteriales, sonidos caroffacos anormales, estertores y sibilancias, distencion venosa yugular, alteraciones neurologicas y otros hallazgos de ese tipo definidos por el medico. Los smtomas cffnicos y signos cffnicos pueden combinarse en una enfermedad cardiovascular tal como un infarto de miocardio (MI, por sus siglas en ingles) o una apoplejfa (tambien denominada «accidente cerebrovascular» o «ACV»), en donde el paciente senalara determinados fenomenos (smtomas) y el medico percibira otros fenomenos (signos), todos estos indicadores de una patologfa subyacente. La «enfermedad cardiovascular» incluye enfermedades relacionadas con los trastornos cardiovasculares del trastorno de placas fragiles, el trastorno obstructivo y la estenosis. Por ejemplo, una enfermedad cardiovascular que surge a partir de un trastorno de placas fragiles, como se definira ese termino mas adelante, puede denominarse «enfermedad de placas fragiles». Los eventos cffnicos asociados a la enfermedad de placas fragiles incluyen los signos y smtomas en los que la ruptura de una placa fragil con una trombosis aguda posterior o con una embolizacion distal constituye una marca distintiva. Los ejemplos de enfermedad de placas fragiles incluyen determinadas apoplejfas e infartos de miocardio. En otro ejemplo, una enfermedad cardiovascular que surge a partir de un trastorno obstructivo puede denominarse «enfermedad obstructiva». Los eventos cffnicos asociados a una enfermedad obstructiva incluyen aquellos signos y smtomas en los que la obstruccion progresiva de una arteria afecta el grado de circulacion que llega a un tejido objetivo. La obstruccion arterial progresiva puede derivar en una isquemia progresiva que puede devenir en ultima instancia en la muerte de tejido si el grado de circulacion es insuficiente para mantener los tejidos. Los signos y smtomas de la enfermedad obstructiva incluyen la claudicacion, el dolor durante el reposo, la angina y la gangrena, asf como los hallazgos ffsicos y de laboratorio que indican una estenosis de los vasos y una perfusion distal disminuida. En aun otro ejemplo, una enfermedad cardiovascular que surge a partir de la restenosis trastorno obstructivo puede denominarse «enfermedad de estenosis en el estent». La enfermedad de estenosis en el estent incluye los signos y smtomas que surgen a partir del bloqueo progresivo de un estent arterial que se ha colocado como parte de un procedimiento tal como una angioplastia transluminal percutanea, en donde se pretende que la presencia del estent ayude a mantener el vaso en su configuracion recien expandida. Los eventos cffnicos que acompanan a la enfermedad de estenosis en el estent se pueden atribuir a la restenosis de la arteria reconstruida.

Una «enfermedad arterial coronaria» (EAC) se refiere a un trastorno vascular relacionado con el bloqueo de arterias

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que irrigan al corazon. El bloqueo puede producirse de manera repentina, mediante mecanismos tales como la ruptura de placas o la embolizacion. El bloqueo puede producirse de manera progresiva, con la contraccion de la arteria a traves de la hiperplasia miointimal y la formacion de placas. Esos signos y smtomas clmicos que surgen a partir del bloqueo de arterias que irrigan al corazon son manifestaciones de una enfermedad arterial coronaria. Las manifestaciones de la enfermedad arterial coronaria incluyen la angina, la isquemia, el infarto de miocardio, la cardiomiopaffa, la insuficiencia cardfaca congestiva, las arritmias y la formacion de aneurismas. Se entiende que la enfermedad de placas fragiles en la circulacion coronaria esta asociada a latrombosis arterial o la embolizacion distal que se manifiesta como un infarto de miocardio. Se entiende que la enfermedad obstructiva en la circulacion coronaria esta asociada a la estenosis arterial acompanada por smtomas de angina, una afeccion que comunmente se trata con intervenciones farmacologicas y con la angioplastia.

Una «enfermedad vascular periferica» (o «PVD») es una enfermedad cardiovascular que surge a partir del bloqueo de las arterias perifericas (es decir, no coronarias). El bloqueo puede producirse de manera repentina, mediante mecanismos tales como la ruptura de placas o la embolizacion, como ocurre en la enfermedad de placas fragiles. El bloqueo puede producirse de manera progresiva, con la contraccion de la arteria a traves de la hiperplasia miointimal y la formacion de placas, como en la enfermedad obstructiva. El bloqueo puede ser completo o parcial. Los signos y smtomas clmicos que surgen del bloqueo de arterias perifericas son manifestaciones de la enfermedad vascular periferica. Las manifestaciones de enfermedades vasculares perifericas incluyen, entre otras, la claudicacion, la isquemia, la angina intestinal, la insuficiencia renal vascular, los ataques isquemicos transitorios, la formacion de aneurismas, la embolizacion periferica y la apoplejfa. La enfermedad cerebrovascular isquemica es un tipo de enfermedad vascular periferica.

Ante la sospecha de PVD, se puede determinar el mdice de presion tobillo-brazo (ABPI, por sus siglas en ingles/ABI). Cuando los valores de la presion sangumea en los tobillos son menores que en los brazos, se puede sospechar de bloqueos en las arterias que proporcionan sangre del corazon al tobillo. Una relacion de ABI de aproximadamente 0,9 o menos concuerda con la PVD; los valores de ABI de aproximadamente 0,8 o menos indican una enfermedad moderada y aproximadamente 0,5 o menos involucran una enfermedad isquemica grave. Una relacion de ABI de aproximadamente 0,5 o 0,4 o menos puede usarse como un umbral para el diagnostico.

Es posible que las condiciones que refuerzan las paredes de los vasos (tales como las calcificaciones que se producen en el marco de la diabetes cronica) produzcan falsos negativos que habitualmente, aunque no siempre, son indicados por ABI anormalmente altos (aproximadamente o > 1,3). Esos resultados y sospechas ameritan una investigacion adicional y estudios de nivel superior. Si los ABI son anormales, el siguiente paso por lo general es un examen de ultrasonido doppler de las extremidades inferiores para observar el sitio y la extension de la aterosclerosis. Se puede realizar otro tipo de imagenologfa mediante angiograffa, en donde un cateter se inserta en la arteria femoral comun y se grna de manera selectiva hasta la arteria en cuestion. Durante la inyeccion de un agente de contraste radiodenso, se pueden realizar rayos X. Se puede identificar una estenosis limitante del flujo en los rayos X y tratarse mediante la aterectoirna, la angioplastia o la colocacion de un estent. Los escaneres de tomograffa computarizada (TC) multicorte pueden proporcionar la imagenologfa directa del sistema arterial como alternativa a la angiograffa. La TC puede facilitar la evaluacion de las arterias aorta y de la extremidad inferior sin la necesidad de la inyeccion arterial del agente de contraste de un angiograma.

La enfermedad arterial periferica (PAD) es una forma de enfermedad vascular periferica (PVD) en la que existe un bloqueo parcial o total del suministro de sangre a una extremidad, habitualmente la pierna, que lleva a un deterioro del flujo sangumeo e hipoxia en el tejido. Cuando la PAD avanza, llega a la etapa de isquemia cfftica de las extremidades (CLI, por sus siglas en ingles) con ulceraciones en la piel, gangrena y potencialmente amputaciones inevitables. Se han usado modelos animales con isquemia en las extremidades posteriores para evaluar diversas estrategias terapeuticas dirigidas al trasplante de celulas madre.

El estandar de cuidado para la PAD actual incluye dejar de fumar, la reduccion del colesterol, los agentes antiplaquetarios, el tratamiento de la diabetes, el tratamiento de la presion sangumea alta, los inhibidores de la ECA, el ejercicio y el cilostazol. Otras opciones de tratamiento pueden involucrar estents, por ejemplo, estents de elucion de farmacos. Tales como estents de elucion de paclitaxel. Se preve que todos los metodos y las composiciones que se describen en la presente memoria se proporcionen con esas opciones de tratamiento. Vease, por ejemplo, Bums et al., BMJ. 15 de marzo de 2003; 326(7389): 584-588.

La enfermedad arterial periferica comunmente se divide en las etapas de Fontaine, presentadas por Rene Fontaine en 1954 para la isquemia: 1) Dolor leve al caminar (claudicacion), obstruccion incompleta de vasos sangumeos; 2) Dolor grave al caminar distancias relativamente cortas (claudicacion intermitente), dolor desencadenado al caminar «despues de una distancia de > 150 m en la etapa IIa y despues de < 150 m en la etapa II-B»; 3) Dolor durante el reposo (dolor al reposar), principalmente en las patas, que aumenta cuando se levanta la extremidad; 4) Perdida de tejido biologico (gangrena) y dificultad al caminar. Se preve que las composiciones y los metodos que se describen en la presente provoquen la mejora de la enfermedad arterial periferica al mejorar la etapa de Fontaine de un paciente en aproximadamente o al menos 1, 2, 3 o 4 etapas en un peffodo de al menos o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 horas, dfas, semanas o meses a partir del inicio del tratamiento o en comparacion con el control.

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De manera alternativa, la clasificacion de la enfermedad arterial periferica segun Rutherford consiste en seis etapas: 1) Claudicacion leve; 2) Claudicacion moderada; 3) Claudicacion grave; 4) Dolor isquemico al reposar; 5) Perdida de tejido menor; y 6) Perdida de tejido mayor. Se preve que las composiciones y los metodos que se describen en la presente memoria provoquen la mejora de la enfermedad arterial periferica al mejorar la etapa de Rutherford de un paciente en aproximadamente o al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 etapas en un penodo de al menos o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 horas, dfas, semanas o meses a partir del inicio del tratamiento o en comparacion con el control.

En una realizacion de la invencion, la composicion que se reivindica en la presente provoca o mejora la angiogenesis.

Lo ideal es que la composicion provoque o potencie la angiogenesis en al menos 20 por ciento en comparacion con el control.

En una realizacion de la invencion, la composicion que se reivindica en la presente comprende un portador farmaceuticamente aceptable.

La «evaluacion de la funcion de las extremidades» se usa en la presente memoria para hacer referencia a una medicion relativa de la eficacia de los metodos y las composiciones que se describen en la presente. De manera alternativa, los grados de la funcion de las extremidades son: «0» para la flexion de los dedos para resistir el movimiento suave de la cola, «1» para la flexion plantar, «2» para el arrastre sin flexion plantar y «3» para el arrastre de la pata. Se preve que las composiciones y los metodos que se describen en la presente memoria provoquen la mejora de la funcion de las extremidades de un paciente en aproximadamente o al menos 1,2, 3 o 4 grados en un penodo de al menos o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 horas, dfas, semanas o meses a partir del inicio del tratamiento o en comparacion con el control.

Se puede usar una «evaluacion del dano isquemico» para evaluar diversas tacticas terapeuticas dirigidas al trasplante de celulas madre. En una realizacion, el dano isquemico puede expresarse como un grado morfologico. Los grados morfologicos son: «0» para la ausencia sustancial de necrosis, «1» para la necrosis sustancialmente limitada a los dedos (perdida de dedos), «2» para la necrosis que se extiende hasta el dorso de la pata (perdida de la pata), «3» para la necrosis que se extiende hasta la pierna (perdida de la rodilla); y «4» para la necrosis que se extiende hasta un muslo (perdida total de la extremidad posterior). Se preve que las composiciones y los metodos que se describen en la presente memoria provoquen la reduccion del dano isquemico en un paciente en aproximadamente o al menos 1,2, 3 o 4 grados en un penodo de al menos o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 horas, dfas, semanas o meses a partir del inicio del tratamiento o en comparacion con el control.

La «evaluacion del flujo sangumeo en las extremidades» se usa en la presente memoria para hacer referencia a una medicion relativa adicional de la eficacia de los metodos y las composiciones que se describen en la presente. Preferiblemente, el flujo sangumeo en las piernas de ambos lados se mide, por ejemplo, con un Doppler laser sin contacto, antes y despues del tratamiento. Se preve que las composiciones y los metodos que se describen en la presente memoria provoquen la mejora del flujo sangumeo en las extremidades de un paciente hasta aproximadamente o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,

61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,

93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 o 100 por ciento de los niveles de perfusion sangumea normales en un penodo de al menos o aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 horas, dfas, semanas o meses a partir del inicio del tratamiento o en comparacion con el control.

«Reducir la tasa de amputacion en un paciente con una enfermedad arterial periferica» hace referencia a la tasa de pacientes con PAD que requieren la amputacion de extremidades, dedos y/o tejidos debido a, por ejemplo, una infeccion o necrosis. Existen tasas de amputacion estandares asociadas al tratamiento con MSC que pueden determinarse facilmente. Preferiblemente, el tratamiento de pacientes con una composicion que incluye una combinacion de MSC y un antagonista de la NM II reduce las tasas de amputacion en aproximadamente o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,

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70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500 o mas por ciento en relacion con un estandar (por ejemplo, estandar de cuidado) o control (por ejemplo, tratamiento con mSc o tratamiento con antagonista de la NM II solos y no en combinacion).

Los «farmacos para enfermedades cardiovasculares» tal como se definen en la presente memoria hacen referencia a medicamentos utiles para el manejo de la diabetes, la hipertension (por ejemplo, inhibidores de la ECA), el colesterol (por ejemplo, estatinas) y los farmacos antiplaquetarios (por ejemplo, aspirina, clopidogrel), anticoagulantes (por ejemplo, warfarina), diureticos y betabloqueadores. De manera adicional, el cilostazol o la pentoxifilina son farmacos para la diabetes cardiovascular.

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El termino «angiogenesis» se define como un proceso fisiologico que involucra el crecimiento de nuevos vasos sangumeos a partir de vasos preexistentes. «Vasculogenesis» es el termino que se usa para la formacion espontanea de vasos sangumeos e «intususcepcion» es el termino que se usa para la formacion de nuevos vasos sangumeos mediante la division de algunos ya existentes. La angiogenesis es un proceso normal en el crecimiento y desarrollo, asf como en la curacion de heridas. Tambien es una etapa fundamental en la transicion de tumores de un estado inactivo a un estado maligno. Se dice que la angiogenesis tiene lugar cuando hay un aumento de aproximadamente o al menos

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La «aceleracion de la curacion» se refiere al aumento de la velocidad con la que una enfermedad susceptible de tratamiento con celulas madre muestra signos de mejora (con respecto a una medicion morfologica o funcional, cualitativa o cuantitativa asociada a la enfermedad en cuestion) en respuesta a la terapia con las composiciones que se describen en la presente. Preferiblemente, la velocidad de la curacion aumenta en aproximadamente o al menos 2,

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«Paciente», como se emplea en la presente memoria, se refiere a un sujeto marnffero al que se diagnostica una enfermedad cardiovascular o del que se sospecha que tiene o esta desarrollando una enfermedad cardiovascular. Los pacientes pueden ser, a modo de ejemplo, humanos, simios, perros, cerdos, vacas, gatos, caballos, cabras, ovejas, roedores y otros mairnferos que puedan beneficiarse con la terapia de celulas madre.

«Administrar» se usa en la presente memoria para hacer referencia al suministro de las composiciones de la invencion a un paciente. A modo de ejemplo, y sin limitacion, la administracion de la composicion, por ejemplo, inyeccion, puede realizarse mediante inyeccion intravenosa (i.v.), inyeccion subcutanea (s.c.), inyeccion intradermica (i.d.), inyeccion intraperitoneal (i.p.) o inyeccion intramuscular (i.m.). Se puede emplear una o mas de esas vfas. La administracion parenteral puede ser, por ejemplo, mediante inyeccion en bolo o mediante perfusion gradual con el tiempo. De manera alternativa, o simultanea, la administracion puede ser por via oral. De manera adicional, la administracion tambien puede ser mediante deposicion quirurgica de un bolo o granulo de celulas o mediante la colocacion de un dispositivo medico, por ejemplo, un estent, cargado con celulas. Preferiblemente, las composiciones de la invencion se administran en el sitio de la enfermedad cardiovascular isquemica, por ejemplo, en el sitio o cerca de (por ejemplo, aproximadamente o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 milfmetros con respecto a) a de la lesion de la enfermedad cardiovascular isquemica (por ejemplo, bloqueo/estenosis vascular, tejido nectrotico o el sitio de infeccion gangrenosa). La administracion puede ser intravenosa, intramuscular, en el sitio de una lesion asociada a la enfermedad o cerca de este y/o intramuscular en el sitio de dano isquemico o cerca de este.

«Un paciente que lo necesite» se usa en la presente memoria para hacer referencia a un paciente diagnosticado con una enfermedad cardiovascular o que se sospecha que la tiene. En una realizacion, el paciente tiene una enfermedad arterial periferica o es probable que la desarrolle.

La «totipotencia» se usa en la presente para hacer referencia a la capacidad de una celula individual de dividirse y/o producir todas las celulas diferenciadas en un organismo, incluidos los tejidos extraembrionarios. Las celulas totipotentes incluyen esporas y cigotos. En algunos organismos, las celulas pueden desdiferenciarse y recobrar la totipotencia.

«Pluripotencia» se usa en la presente para hacer referencia a la capacidad de diferenciarse en cualquiera de las tres capas germinales: endodermo (revestimiento interior del estomago, tracto gastrointestinal, pulmones), mesodermo (Musculo, hueso, sangre, aparato urogenital) o ectodermo (tejidos epidermicos y sistema nervioso).

Las «celulas madre pluripotentes» incluyen celulas madre pluripotentes naturales y celulas madre pluripotentes inducidas. Estas pueden dar origen a cualquier tipo de celula fetal o adulta. Sin embargo, en solitario por lo general no pueden desarrollarse y convertirse en un organismo fetal o adulto dado que carecen de la capacidad de contribuir con el tejido extraembrionario, tal como la placenta.

Las «celulas madre pluripotentes inducidas» (o «celulas iPS») son similares a las celulas madre pluripotentes naturales, tales como las celulas madre embrionarias (ES), en muchos aspectos, tales como la expresion de determinados genes de celulas madre y/orteins, patrones de metilacion de cromatina, el tiempo de duplicacion, la formacion de cuerpos embrioides, la formacion de teratomas, la formacion de quimeras viables y la potencia y capacidad de diferenciacion. Las celulas pluripotentes inducidas pueden derivar, por ejemplo, de celulas adultas del

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estomago, el tugado, la piel y la sangre. Las celulas iPS pueden obtenerse mediante la transfeccion de determinados genes asociados a celulas madre en celulas no pluripotentes, tales como los fibroblastos adultos. En determinadas realizaciones, se puede lograr la transfeccion a traves de vectores virales, tales como los retrovirus, por ejemplo. Los genes transfectados pueden incluir, pero no se limitan a, los reguladores transcripcionales principales Oct-3/4 (Pou5fl) y Sox2 Oct-4, y los transgenes Nanog y Lin28 transgenes. Las subpoblaciones de celulas transfectadas pueden empezar a asemejarse morfologica y bioqmmicamaente a celulas madre pluripotentes y pueden aislarse a traves de la seleccion morfologica, el tiempo de duplicacion, o a traves de un gen reportero y la seleccion de antibioticos.

«Multipotencia» se usa en la presente para hacer referencia a celulas progenitoras multipotentes que tienen la capacidad de dar origen a multiples tipos de celulas, pero a una cantidad de linajes mas limitada que una celula madre pluripotente. Por ejemplo, una celula madre multipotente es una celula hematopoyetica que puede desarrollarse y convertirse en varios tipos de globulos, pero no puede desarrollarse y convertirse en celulas del cerebro u otros tipos de celulas.

«Celulas madre mesenquimales o celulas estromales multipotentes» (a ambas se las denomina «MSC») se entiende en la presente memoria que son celulas estromales multipotentes que pueden diferenciarse en una variedad de tipos de celulas, que incluyen, pero no se limitan a: osteoblastos (celulas oseas), condrocitos (celulas de los cartflagos) y adipocitos (celulas de grasa).

En una realizacion, las celulas madre mesenquimales se obtienen a partir de la medula osea. En otra realizacion, las celulas madre mesenquimales se obtienen a partir de brotes de dientes en desarrollo del tercer molar mandibular. En otra realizacion, las MSC se obtienen a partir del lfquido amniotico. En otra realizacion, las MSC pueden obtenerse a partir del tejido del cordon umbilical, por ejemplo, de la gelatina de Wharton y la sangre del cordon umbilical. En una realizacion adicional, las MSC se afslan del tejido adiposo. De manera alternativa, las MSC se afslan de la gelatina de Wharton. En otra realizacion, las MSC derivan de celulas iPS, por ejemplo, como se describe en Giuliani et al. “Human mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells downregulate NK cell cytolytic machinery,” Blood, 29 de julio de 2011.

Preferiblemente, las MSC tienen un cuerpo celular pequeno con unos pocos procesos celulares que son largos y finos. El cuerpo celular puede contener un nucleo grande y redondo con un nucleolo prominente, rodeado por partmulas de cromatina finamente dispersadas, que otorgan al nucleolo una apariencia transparente. El resto del cuerpo celular contiene una pequena cantidad de aparatos de Golgi, retmulo endoplasmatico rugoso, mitocondria y polirribosomas. Las MSC que son largas y finas, se encuentran ampliamente dispersadas y la matriz extracelular adyacente se encuentra poblada por unas pocas fibrillas reticulares pero desprovista de otros tipos de fibrillas de colageno.

La union celular no es un proceso homogeneo, sino que se produce en zonas particulares, denominadas «zonas de adhesion focal». Una vez unidas, las celulas ejercen tension por medio de protemas motoras internas. De esta manera, el citoesqueleto puede organizarse y funciona en una variedad de procesos que incluyen el transporte, el andamiaje y la supervivencia celular. Al separar las celulas, estas pueden constrenirse rapidamente en funcion de la acumulacion de tension interna por parte de las protemas motoras y las estructuras internas organizadas previamente (citoesqueleticas y otras) pueden verse alteradas. Si no se permite que vuelvan a unirse a las superficies, esas celulas pueden iniciar programas de muerte celular que se han descrito como apoptosis/anoikis dependiente de la union.

Las «miosinas» incluyen una familia de protemas motoras dependientes de ATP y por lo general se conocen por su funcion en la contraccion muscular y por su participacion en una amplia variedad de procesos de motilidad eucariotica. Por lo general, son responsables de la motilidad basada en actina. Por lo general, la miosina II (tambien conocida como miosina convencional) es el tipo de miosina responsable de la contraccion muscular en celulas musculares.

La principal protema motora citoesqueletica responsable de generar la tension celular es la miosina no muscular II (denominada «miosina II»). La «miosina no muscular II» o «NM II» es una protema de union a la actina que tiene reticulacion de actina y propiedades de contraccion y es regulada en parte a traves de la fosforilacion de sus cadenas ligeras y pesadas. Al igual que la miosina muscular II, las moleculas de NM II estan compuestas por tres pares de peptidos: dos cadenas pesadas de 230 kDa, dos cadenas ligeras reguladoras (RLC, por sus siglas en ingles) de 20 kDa y dos cadenas ligeras esenciales (ELC, por sus siglas en ingles) de 17 kDa que estabilizan la estructura de la cadena pesada. Si bien en la presente se hace referencia a estas miosinas como miosinas «no musculares» II para distinguirlas de sus homologas musculares, las primeras tambien se encuentran presentes en celulas musculares, en donde tienen funciones distintas durante el desarrollo y la diferenciacion del musculo esqueletico, asf como en el mantenimiento de la tension en el musculo liso.

Por lo general, tres isoformas de NM II mamfferas tienen propiedades comunes y particulares. Los dos dominios de cabeza globular de la NM II contienen un sitio de union para aTp y actina y son sucedidos por regiones de cuello, cada una de las cuales se unen a las dos cadenas ligeras diferentes desde el punto de vista funcional. El dominio de cuello actua como un brazo de palanca para amplificar la rotacion de la cabeza mientras la energfa qrnmica del ATP se convierte en el movimiento mecanico de la cabeza de la miosina. Este dominio de cuello es sucedido por una espiral a-helicoidal larga, que forma un dominio con forma de varilla que efectua la dimerizacion entre las cadenas pesadas y termina en una cola no helicoidal relativamente corta. Los dominios de varilla de la NM II se autoasocian para formar filamentos bipolares (disposiciones antiparalelas de moleculas de miosina), que son mas pequenos que aquellos que

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se encuentran en el musculo cardfaco y esqueletico.

La NM II actua para integrar procesos que impulsan la migracion y adhesion celular. Tambien es un punto final importante en el que convergen muchas vfas de senalizacion, en gran medida a traves de GTPasas Rho. La NMII en s^ misma esta regulada estrechamente en diferentes niveles, incluso al nivel de pliegue, montaje y desmontaje de filamentos de miosina, union a la actina y actividad motora y de ATPasa. La regulacion del citoesqueleto de actina mediante la NM II controla multiples procesos interrelacionados, tales como la migracion, la adhesion celula-celula y celula-matriz, la diferenciacion celular, la morfogenesis y el desarrollo de tejido. La regulacion espacial-temporal de la NM II mediante la ubicacion subcelular y la activacion de sus cinasas reguladoras en diferentes celulas y tejidos tiene repercusiones importantes en el control de la funcion de la NM II.

La regulacion de la hidrolisis de Mg2+-ATP y la formacion de filamentos de la NM II involucra la fosforilacion reversible de aminoacidos espedficos presentes en el par de RLC de 20 kDa y las cadenas pesadas. La funcion del par de ELC consiste en estabilizar la NMHC y no existe evidencia de que experimenten una fosforilacion reversible. Vease tambien Vicente-Manzanares et al., Nat Rev Mol Cell Biol. noviembre de 2009; 10(11): 778-790.

«Antagonista de la miosina no muscular II» se refiere a un agente que de manera directa o indirecta inhibe, bloquea o revierte la actividad de la Miosina II tal como se produce de manera natural o en los tejidos enfermos o danados de pacientes que sufren una enfermedad cardiovascular. Un agente de ese tipo puede ser una molecula pequena (por ejemplo, la blebistatina), acido nucleico, lo cual incluye ARNr, ARNm, ARNt, miARN, ARNip (vease, por ejemplo, Ma et al., Mol. Biol. Cell 15 de noviembre de 2010 vol. 21 n.° 22 3952-3962 o Kim et al., J Biol chem. 10 ago 2012;287(33):27345-58), ARN antisentido, ADN, ARN/ADN tubrido, ribozima, APN, aptamero, (cualquiera o la totalidad de los cuales puede incluir bases de nucleotidos sinteticas o no naturales); peptidos; o protemas, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, moleculas similares a anticuerpos o anticuerpos de cadena simple, asf como fosfatasas y cinasas. Por ejemplo, el antagonista de la NM II puede ser un ARNip dirigido para inactivar la expresion del ARNm que codifica la NM II o el ARNm de un gen asociado a la regulacion por aumento de la NM II; o un vector que codifica un ARNip de ese tipo.

Los antagonistas II incluyen los antagonistas del receptor de la angiotensina II tipo 1 (por ejemplo, el antagonista del receptor de AT1 no peptfdico FK-739, vease Fuji et al., Hypertension, 1999;33:975- 980) asf como los antagonistas del receptor de la angiotensina II, tambien conocidos como bloqueadores del receptor de la angiotensina (ARB, por sus siglas en ingles), los antagonistas del receptor de AT1 o sartanos son un grupo de agentes farmaceuticos que modulan el sistema de renina-angiotensina-aldosterona. Sus usos principales tienen que ver con el tratamiento de la hipertension (presion sangumea alta), la nefropatfa diabetica (dano renal provocado por la diabetes) y la insuficiencia cardfaca congestiva. El losartano, irbesartano, olmesartano, candesartano y valsartano incluyen el grupo tetrazol (un anillo con cuatro nitrogenos y un carbono). El losartano, irbesartano, olmesartano, candesartano y telmisartano incluyen uno o dos grupos imidazol.

Los antagonistas de la miosina no muscular II tambien incluyen inhibidores de la ECA. Un inhibidor de la ECA (o inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina) es una droga farmaceutica para medicacion que se usa principalmente para el tratamiento de la presion sangumea alta (hipertension) y la debilidad del musculo cardfaco (insuficiencia cardfaca congestiva). Se ha demostrado que los ejemplos de inhibidores de la ECA que incluyen aptopril, zofenopril, enalapril, ramipril, quinapril, perindopril, lisinopril, benazepril, imidapril, zofenopril, trandolapril, fosinopril, casoquininas y lactoquininas, asf como los lactotripeptidos Val-Pro-Pro e Ile-Pro-Pro producidos por el probiotico Lactobacillus helveticus o derivados de la casema, tienen funciones de inhibicion de la ECA y antihipertensiva.

Los antagonistas de la miosina no muscular II tambien incluyen 2,3-butanodiona-2-monoxima (BDM, por sus siglas en ingles) e inhibidores de la actividad de la adenosina trifosfataasa (ATPasa) de la miosina II.

Un antagonista de la NM II es la blebistatina (un derivado de 1 -fenil-2-pirrolidinona) que es un inhibidor farmacologico espedfico del musculo esqueletico y la actividad de la adenosina trifosfatasa (ATPasa) de la miosina no muscular II. La blebistatina es una molecula pequena altamente activa que inhibe la formacion de vesmulas. Este compuesto tiene permeabilidad celular, es benigno y, cabe destacar, facilmente reversible. Se ha descrito como un factor de supervivencia en cultivos de celulas madre. Tambien se ha descrito como un promotor de la adhesion de las celulas a un sustrato con el cual las celulas habitualmente tienen una afinidad nula o solamente baja (WO2012062819), por ejemplo, para el recubrimiento de dispositivos medicos implantados tales como marcapasos, implantes de cadera o huesos o estents.

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A continuacion se muestra la blebistatina:

imagen1

En algunas realizaciones, el termino «blebistatina» incluye una mezcla racemica. En algunas realizaciones, el termino «blebistatina» se refiere a la R-blebistatina. En algunas realizaciones, el termino «blebistatina» se refiere a la S-blebistatina.

La presente descripcion abarca variantes, analogos y derivados de la blebistatina. Las variantes, los analogos y los derivados adicionales de la blebistatina y los antagonistas de la miosina no muscular II adecuados y previstos para usarse en la presente memoria se describen en la pub. estadounidense n.° 20080021035. Vease, por ejemplo, tambien: Straight et al., Science 299 (5613): 1743-47; Kovacs et al., (Aug 2004), J Biol Chem. 279 (34): 35557-63; Limouze et al., (2004) J Muscle Res Cell Motil. 25 (4-5): 337—41.

En determinadas realizaciones, las composiciones terapeuticas que se describen en la presente contienen o estan asociadas al menos a un antagonista de la miosina no muscular II, mediante lo cual cada uno del o de los antagonistas de la miosina no muscular II se encuentra presente en una dosis individual en una concentracion de aproximadamente,

al menos o mas de 0,1, 0, 2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52,

53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80

, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 cada vez 10'9, 10

74 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 10'710'710'610'510'410'310'210'1 molar

por dosis. Preferiblemente, el antagonista de la miosina no muscular II se encuentra presente en una dosis individual con una concentracion de entre aproximadamente 1-100, 2-60, 3-50, 4-40, 5-30, 6-20, 7-15, 8-10, 2-18, 3-16, 4-14, 5-12, 6-10 o 7-8 |JM.

En determinadas realizaciones, las composiciones terapeuticas descritas en la presente se administran en una dosis de aproximadamente o al menos o mas de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19, 20, 21,22, 23 o 24 veces por dfa, semana o mes en un penodo de aproximadamente o al menos o mas de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 dfas, semanas o meses.

En determinadas realizaciones, el antagonista de la NM II se incuba con las celulas de la composicion al menos o mas

de 0,1, 0, 2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23,

24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56,

57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,

89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 minutos, horas o dfas antes de la administracion al paciente.

Determinadas realizaciones involucran un kit que comprende celulas y un antagonista de la NM II. Determinadas realizaciones de kits comprenden (a) un envase que contiene al menos un antagonista de la NM II; y (b) un envase con celulas madre. La NM II puede encontrarse en una solucion o en forma liofilizada. El kit puede incluir opcionalmente instrucciones para (i) el uso de la solucion o (ii) la reconstitucion y/o el uso de la formulacion liofilizada; o (iii) el uso del contenido para tratar la enfermedad cardiovascular. El kit puede comprender ademas (iii) un amortiguador, (iv) un diluyente, (v) un filtro, (vi) una aguja, (v) una jeringa y/o (vi) un dispositivo medico automatico. En una realizacion, el envase se selecciona del grupo que consiste en: una botella, un vial, una jeringa, un tubo de ensayo o un envase multiuso. En otra realizacion, la composicion de peptidos objetivo se encuentra liofilizada.

Una dosis individual de las composiciones terapeuticas descritas en la presente puede contener al menos o aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,

31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62,

63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94,

95, 96, 97, 98, 99 o 100 cada vez 1, 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 101°o mas celulas por kilogramo de peso

corporal del paciente. En determinadas realizaciones, una dosis contiene aproximadamente, al menos o mas de 1-20, 2-19, 3-18, 4-17, 5-16, 6-15, 7-14, 8-13, 9-12 o 10-11 cada vez 106 celulas madre.

En determinadas realizaciones, la incorporacion del antagonista de la NM II en las composiciones de la invencion permiten que el medico proporcione a un paciente una dosis menor de las celulas madre que la que de otro modo se

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necesitana para lograr el mismo efecto terapeutico alcanzado con una poblacion de celulas madre que carece del antagonista de la NM II. En determinadas realizaciones, la incorporacion del antagonista de la NM II en las composiciones de la invencion permite que el medico proporcione a un paciente al menos o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 por ciento menos celulas madre por dosis que las que se necesitanan de otro modo para lograr el mismo efecto terapeutico durante un penodo de tiempo definido.

En la presente memoria se describen metodos y composiciones para el tratamiento de una enfermedad cardiovascular; y metodos para reducir las complicaciones (por ejemplo, amputacion) del tratamiento de la enfermedad cardiovascular al emplear MSC. Ademas, se describen kits que incluyen celulas, antagonistas de la NM II, portadores farmaceuticamente aceptables y, opcionalmente, instrucciones apropiadas.

La invencion tambien se refiere a un metodo para reducir la tasa de amputacion en un paciente con enfermedad arterial periferica que se trata con una composicion que comprende MSC, que comprende poner en contacto las MSC con un antagonista de la miosina no muscular II antes del tratamiento. Lo ideal es que el antagonista de la miosina no muscular II sea la blebistatina.

En algunas realizaciones, los metodos de tratamiento pueden involucrar por lo general una inyeccion intramuscular de una dosis de una composicion de MSC tratadas con un antagonista de la NM II tal como la blebistatina en el sitio de las lesiones que surgen a partir de una ECV tal como una PAD o cerca de este. Esas inyecciones por lo general provocan un aumento de la funcion de las extremidades, el flujo sangumeo y los smtomas isquemicos. Ademas, el uso de un antagonista de la NM II tal como la blebistatina en la composicion acelera drasticamente la regeneracion de los tejidos danados desencadenada por las MSC. Asimismo, la aplicacion de la blebistatina con MSC reduce drasticamente las complicaciones graves asociadas a la PAD y/o el trasplante de MSC a un paciente que sufre una PAD.

Los metodos y kits tambien pueden incluir farmacos o dispositivos medicos cardiovasculares tales como, por ejemplo, estents (que pueden o no ser de elucion de farmacos). En otra realizacion, esos estents pueden estar cargados con MSC que se hayan puesto en contacto con antagonistas de la NM II durante o antes del implante.

Referencias adicionales:

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Stabile E., Burnett M.S., Watkins C., Kinnaird T, Bachis A., la Sala A., Miller J.M., Shou M., Epstein S.E., Fuchs S. Impaired arteriogenic response to acute hindlimb ischemia in CD4- knockout mice. Circulation. 2003;15;108(2):205-210

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Ejemplos

Ejemplo 1 - Configuracion experimental

En la presente se describe el analisis de BM MSC en un modelo de raton para la isquemia periferica de las extremidades posteriores. La enfermedad arterial periferica (PAD) es una forma de enfermedad vascular periferica (PVD) en la que existe un bloqueo parcial o total del suministro de sangre a una extremidad, habitualmente la pierna, que lleva a un deterioro del flujo sangumeo e hipoxia en el tejido. Cuando la PAD avanza, llega a la etapa de isquemia cntica de las extremidades (CLI, por sus siglas en ingles) con ulceraciones en la piel, gangrena y amputaciones inevitables. Uno de los tratamientos innovadores mas auspiciosos para las complicaciones vasculares diabeticas son los productos basados en celulas madre que potencian la angiogenesis (TRefl-3) Se han usado modelos animales con isquemia en las extremidades posteriores para evaluar diversas estrategias terapeuticas dirigidas al trasplante de celulas madre.

La manipulacion de los animales se realizo de conformidad con el Instituto Nacional de la Salud (NIH, por sus siglas en ingles) y la Asociacion para la Evaluacion y Acreditacion del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC, por sus siglas en ingles). Los animales se mantuvieron en jaulas de polisulfona (PSU) (7-8/jaula) que median 42,5 x 265,6 x 18,5 cm, con una rejilla superior de acero inoxidable con instalaciones para comida granulada y agua para beber en botellas de policarbonato transparentes; se usaron lechos de cascara de arroz limpia esterilizada con vapor (Harlan, Sani-chip, Cat n.° 106S8216) y el material de los lechos se cambio junto con la jaula dos veces por semana. Los animales se alimentaron ad libitum siguiendo una dieta comercial para roedores (dieta de protemas de 18 % de Teklad Certified Global cat n.°: 106S8216). Los animales tienen acceso libre a agua para beber acidificada (pH entre 2,5 y 3,5) obtenida de la red de abastecimiento municipal. Los animales se mantuvieron en condiciones de laboratorio estandares, con aire acondicionado y filtracion (HEPA F6/6) con un suministro de aire fresco adecuado (con un mmimo de 15 cambios de aire/hora). Los animales se mantuvieron en un entorno con clima controlado. El intervalo de temperaturas era de 20-24 °C y el intervalo de HR era de 30-70 % con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Especie/Cepa: Raton/Lampino atfmico; Genero/Cantidad/Edad: Macho/152/9-10 semanas; Origen: Harlan Laboratories, Israel; Peso corporal: El peso corporal promedio al momento de iniciar el estudio fue de 28,4 g (dfa 1). Los pesos mmimos y maximos del grupo se encontraban dentro de un intervalo de ±20 % de peso medio del grupo; Penodo de aclimatacion: 5-10 dfas; Identificacion: Tres muescas de posicion en las orejas y tarjetas de las jaulas. Ningun animal se encontro en condicion moribunda o demostro un dolor grave y signos duraderos de afliccion grave. El dfa de la cirugfa se definio como el «DfA 0» en este estudio. El dfa de la cirugfa se indujo anestesia mediante isoflurano al 1,5 a 3,0 %, N2O al 1,5 % y O2 al 0,5 %.

Artfculos de prueba: Celulas madre mesenquimales de la medula osea humanas (Lonza Cologne GmbH). Vetnculos: DMEM + FCS al 10 %, Opcional: 10 pM de blebistatina (BB).

Bajo los efectos de la anestesia, el raton se coloco con el lado ventral hacia arriba. Se realizo una incision de 0,5-1,0 cm en la piel en el area inguinal. La arteria femoral se ligo dos veces con hilo de seda 6-0 y se seccionaron transversalmente entre las ligaduras. La herida se cerro con hilo de seda 4-0 y se permitio que el raton se recuperara.

El DfA 1, 24 horas despues de la cirugfa, cada animal tratado recibio una inyeccion intramuscular en dos sitios (el lado proximal y distal de la herida quirurgica) o intravenosa en la vena de la cola. Para la inyeccion intramuscular, se inyecto a los animales 50 pl en cada sitio, en total 100 pl por animal. Para la inyeccion intravenosa, se inyecto a los animales 200 pl por animal. Vease la Tabla 1 para consultar la distribucion de los grupos.

Tabla 1 Distribucion de los grupos

Grupo

Cantidad de animales Tratamiento (lote)

1

15 DMEM

2

17 DMEM + BB 10 |JM

3

15 BM.MSC en DMEM

4

15 BM.MSC en DMEM + BB 10jM

5

15 BM.MSC tratadas previamente con BB inyectadas en DMEm

6

15 DMEM

7

15 DMEM + BB 10 jM

8

15 BM.MSC en DMEM

9

15 BM.MSC en DMEM + 10 jM de BB

10

15 BM.MSC tratadas previamente con BB inyectadas en DMEm

Dia del Cantidad de Nfia de

tratamiento celulas administracion:

(24 horas despues de la cirug^a)

i.m. en 2 sitios

0

0,25x105 mL

en 0,1

0,25x105 mL

en 0,1

0,25x105 mL

en 0,1

0

0

0,25x105 mL

en 0,2

0.25x105 mL

en 0,2

0.25x105 mL

en 0,2

i.v en lavena de la cola

0

El peso corporal se midio en el dfa de estudio -1 antes de la cirugfa y despues una vez por semana. Medicion del flujo sangumeo: Se midio el flujo sangumeo en las piernas de ambos lados con un Doppler laser sin contacto, antes de la 5 cirugfa y los dfas: 1, 3, 7, 14, 21, 28 y 35 despues de la operacion. Las mediciones del flujo sangumeo se expresaron como la relacion del flujo en la extremidad isquemica con respecto al flujo en la extremidad normal (Goto et al. Tokai J Exp Clin Med., Vol. 31, n.° 3, pp. 128-132, 2006). Sistematicamente, la mejor regeneracion se dio en los animales del Grupo 4 tratados con MSC + BB (Fig. 1). Evaluacion macroscopica de la gravedad isquemica: La evaluacion macroscopica de la extremidad isquemica se realizo una vez a la semana despues de la operacion mediante el uso de 10 grados morfologicos para el area necrotica (Goto et al.): Vease la tabla 2.

Tabla 2 Grados morfologicos para el area necrotica

Grado

Descripcion

0

ausencia de necrosis

1

necrosis limitada a los dedos (perdida de dedos)

2

necrosis extendida al dorso de la pata (perdida de la pata)

3

necrosis que se extiende hasta una pierna (perdida de la rodilla)

4

necrosis que se extiende hasta un muslo (perdida total de la extremidad posterior)

Evaluacion in vivo de la funcion de las extremidades y el dano isquemico. Se realizo una evaluacion semicuantitativa del uso disminuido de la extremidad isquemica una vez a la semana despues de la cirugfa mediante el uso de la 15 siguiente escala (Stabile et al., Circulation. 2003;15;108(2):205-210). Vease la tabla 3.

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Tabla 3 Evaluaciones de la funcion de las extremidades

Grado

Descripcion

0

flexion de los dedos para resistir el movimiento suave de la cola

1

flexion plantar

2

sin arrastre pero sin flexion plantar

3

arrastre de pata

La funcion de las extremidades se califica como «no aplicable» en caso de amputacion parcial o total de las extremidades. En ese caso, las mediciones del flujo sangumeo no se incluyeron en el analisis estadfstico.

Evaluacion in vivo de la funcion de las extremidades. Se realizo una evaluacion semicuantitativa del uso disminuido de la extremidad isquemica los d^as 7 a 35 mediante el uso de escalas funcionales en grados. Se encontro una mejora en la funcion de las extremidades a partir del dfa 14 en animales del grupo 4 tratados con celulas en comparacion con los grupos de animales de control 1 y 2 (Fig. 2A). Esa mejora se encontro en los grupos de animales 3 y 5 el dfa 35 despues de la isquemia. En los animales a los que se administro el artmulo de prueba por via intravenosa, se encontro una mejora en la funcion de las extremidades a partir del dfa 28 en el grupo 9 en comparacion con los grupos de control 6 y 7 (Fig. 2B).

EJEMPLO 2 - Analisis estadfstico

El objetivo de este estudio fue analizar la eficacia de las celulas madre examinadas como un posible tratamiento para aliviar los smtomas de la HLI en un modelo de raton lampino animal.

Los criterios de valoracion del estudio fueron: fndice clmico; Mediciones del peso corporal; Mediciones del flujo sangumeo

Analisis de clasificacion: A cada grupo se le asigno una clasificacion de 1 a 10 en cada uno de los 3 primeros criterios de valoracion medidos (% de flujo sangumeo, funcion de las extremidades e mdice de gravedad isquemica). La clasificacion = 1 es la mas alta y la clasificacion = 10 es la mas baja. Cuando dos grupos estan igualados, ambos reciben la misma clasificacion «en el medio»; por ejemplo, si dos grupos estaban igualados en la Clasificacion = 4, ambos recibfan el mdice 4,5 (que multiplicado por dos es igual a la suma de los indices 4 y 5). Para cada criterio de valoracion, se calculo la mediana para cada grupo (la mediana se uso para asegurarse que el valor extremo no afectara los resultados). En cada criterio de valoracion, los grupos se ordenaron por mediana y a cada uno se le asigno su clasificacion respectiva. Se calculo la clasificacion promedio para cada grupo con respecto a todos los criterios de valoracion.

Se realizo un analisis estadfstico mediante el uso del modelo mixto en SAS®. Las principales comparaciones presentadas son entre los dos tratamientos mas eficaces y todos los demas. En la presente se proporcionan los resultados completos del analisis estadfstico. Los valores P que se proporcionan en el informe y en los anexos no estan ajustados por multiplicidad. Para determinar la significancia, usese P < 0,0056. Existen muchas maneras de realizar ajustes aqu para un analisis multiple en funcion de la interpretacion de analisis que son significativos y aquellos que no lo son. Dado que esto es un ensayo exploratorio, se decidio que el ajuste se considerana dentro de cada grupo por separado. De esta manera, por ejemplo, el Grupo 4 se comparo con otros 9 grupos de forma tal que se determino que un resultado significativo es P < 0,05/9 = 0,0056.

Pendiente: La pendiente calculada corresponde a la tendencia lineal desde la cirugfa hasta el Dfa 35. Este numero individual para cada animal representa su cambio en un criterio de valoracion a lo largo del tiempo. Se proporciona la distribucion de pendientes para cada grupo en cada uno de los criterios de valoracion (excluido el peso), mediante el uso de diagramas de caja. Estos diagramas proporcionan un metodo conveniente para presentar muchos grupos en un unico grafico. Esto se debena leer de la siguiente manera: el 25 % de los puntos de datos (en este caso, las pendientes) se encuentra entre la bisagra inferior y la parte de abajo de la caja—percentiles 0 a 25; 50 % de los puntos de datos se ubican entre la parte de abajo y la parte de arriba de la caja—percentiles 25 a 75. Esto tambien se denomina «rango intercuarfflico» (IQR, por sus siglas en ingles). El 25 % de los puntos de datos se ubican entre la parte de arriba de la caja y la bisagra superior—percentiles 75 a 100. Sin embargo, las vallas superior e inferior estan definidas por una distancia de 1,5*IQR desde la parte de abajo y de arriba de la caja. Si bien no se muestran efectivamente en el diagrama, los valores por fuera de estas vallas se consideran atfpicos. Asf que, si existen puntos de datos por encima de la valla superior, o por debajo de la valla inferior, estos se indican por separado en el diagrama de caja; en otras palabras, los puntos extremos no se incluyen entre las bisagras inferior y superior del diagrama de caja.

imagen2

Grupo de tratamiento

Disposicion Total

Excluidos1

Imputados2 Completados3

N

% N % N % N %

(1) DMEM(im)

1 6,7 1 6,7 13 86,7 15 100,0

(2) DMEM+BB (im)

3 17,6 0 0 14 82,4 17 100,0

(3) BM.MSC en DMEM (im)

0 0 6 40,0 9 60,0 15 100,0

(4) BM.MSC en DMEM+BB (im)

1 6,7 0 0 14 93,3 15 100,0

(5) BM.MSC en DMEM, pre-BB (im)

0 0 1 6,7 14 93,3 15 100,0

(6) DMEM (iv)

1 6,7 0 0 14 93,3 15 100,0

(7) DMEM+BB (iv)

1 6,7 0 0 14 93,3 15 100,0

(8) BM.MSC en DMEM (iv)

0 0 5 33,3 10 66,7 15 100,0

(9) BM.MSC en DMEM+BB (tv)

0 0 1 6,7 14 93,3 15 100,0

(10) BM.MSC en DMEM, pre-BB (iv)

2 13,3 7 46,7 6 40,0 15 100,0

Total

9 5,9 21 13,8 12,2 80,3 152 100,0

1. Excluidos de todos los analisis adicionales debido a:

5 a) la amputacion antes o durante el dfa 14 despues de la cimg^a - atribuida a la falla del modelo, b) muerte no relacionada con el tratamiento.

2. Imputados debido a la amputacion despues del d^a 14, es decir, a partir del d^a 21 - atribuida a la falla del tratamiento.

3. Completaron el seguimiento de 35 dfas.

10 En analisis adicionales, la imputacion de los datos faltantes se realiza de la siguiente manera: Flujo sangumeo (%): Valor de la primera medicion despues de la cirugfa (se asume que el tratamiento fallo por lo que no hay ninguna mejora mas alla de lo que se observo inmediatamente despues de la cirugfa); fodice de gravedad isquemica: 1 = «Perdida total de las extremidades posteriores» (el peor mdice posible); Funcion de las extremidades: 3 = «Arrastre de la pata» (el peor mdice posible); Peso (g): El peso mas bajo del animal en cualquiera de las instancias en que se midio hasta el 15 dfa de la amputacion inclusive.

Si bien se realizaron comparaciones por pares, los resultados centrales se muestran de manera tal que sean pertinentes desde el punto de vista estadfstico y se puedan ilustrar claramente en los graficos. Los datos son coherentes a traves de los criterios de valoracion y son coherentes a traves de los diferentes analisis. Para obtener esta imagen, se elimino el peso de la consideracion. Los analisis y las estadfsticas descriptivas indicaron que el peso 20 no fue una medida significativa de la eficacia en el modelo. Cada grupo se clasifico en cuanto a los 3 criterios de valoracion restantes el dfa 35 y en la Clasificacion promedio de los grupos evaluada - una medicion que combina los

5

10

15

20

25

resultados de todos los criterios de valoracion.

Evaluacion de todos los parametros de manera simultanea el d^a 35. Procedimiento: Para cada parametro (flujo sangumeo (%), funcion de las extremidades e mdice de gravedad isquemica), se calculo la mediana en el grupo en todos los animales. Se clasificaron todos los grupos basados en su mediana de 1 a 10, donde 1 es el mejor valor, en cada uno de los siguientes parametros: Flujo sangumeo (%)—el valor mas alto es 1, el valor mas bajo es 10; Funcion de las extremidades—el valor mas alto es 10, el valor mas bajo es 1 (la peor categona es 3, la mejor es 0); fndice de gravedad isquemica—el valor mas alto es 10, el valor mas bajo es 1 (la peor categona es 4, la mejor es 0); Finalmente, para cada grupo se calculo la clasificacion promedio de los tres parametros.

Tabla 5 Clasificacion de los grupos de tratamiento el dia = 35, datos imputados

Grupo

Flujo sangumeo (%) Funcion de las extremidades indice de gravedad isquemica Clasificacion promedio Factor * Factor 2 **

(4) Tratamiento: BM.MSC en DMEM+BB (im)

1 1 1,5 1,2

(5) Tratamiento: BM.MSC en DMEM, pre-BB (im)

3 5 1,5 3,2 2,0 2,0

(9) Tratamiento: BM.MSC en DMEM+BB (iv)

2 5 6 4,3 3,2 1,2

(3) Control positivo: BMMSC en DMEM

4 5 6 5,0 3,8 0,7

(2) Control negativo: DMEM+BB (im)

6,5 5 6 5,8 4,7 0,8

(7) Control negativo: DMEM+BB (iv)

6,5 5 6 5,8 4,7 0,0

(6) Control negativo: DMEM (iv)

8 5 6 6,3 5,2 0,5

(1) Control negativo: DMEM (im)

9 5 6 6,7 5,5 0,3

(8) Control positivo: BM.MSC en DMEM

5 9,5 6 6,8 5,7 0,2

(10) Tratamiento: BMMSC en DMEM, pre-BB (iv)

10 9,5 10 9,8 8,7 3,0

Se uso la mediana por grupo de tratamiento

* Factor por el cual la clasificacion promedio difiere del grupo con mejor clasificacion (4)

** Factor 2 - Diferencia entre las clasificaciones de grupos con clasificaciones adyacentes

A partir de la tabla, se puede observar que existen cuatro magnitudes generales de clasificacion:

El grupo 4 (BM.MSC en DMEM+BB (im)) tiene la clasificacion mas alta y se encuentra muy por delante del 2.° grupo con mayor eficacia (5): Clasificacion promedio = 1,2, la diferencia con respecto al grupo siguiente es de 2.

El grupo 5 esta muy por detras del Grupo (tal como se indica en la vineta anterior) pero por delante de los grupos que lo siguen. Espedficamente, se encuentra 1,2 puntos por encima del 3.° grupo mas eficaz (9).

Los siguientes siete grupos (9, 3, 2, 7, 6, 1 y 8) se encuentran en la 3.a categona con una diferencia entre la mejor y la peor - 2,5 (6,8-4,3), que es menor de manera equivalente a la distancia entre el 1.° y 3.° lugar (3,1).

Grupo 10 (BM.MSC en DMEM, pre-BB (iv)) se encuentra muy por detras del «bloque de los siete grupos» en la vineta anterior - 3 puntos. Cabe senalar que el Grupo 10 resulto ser especialmente ineficaz debido a una gran cantidad de amputaciones y, por lo tanto, se imputaron valores ineficaces para el Dfa 35.

En la Tabla 6, se ilustran los resultados del Analisis de significancia. Los dos mejores grupos se comparan con todos los demas en todos los criterios de valoracion.

5

10

15

20

25

30

Tabla 6 Comparaciones por pares, Grupos 4 y 5 en comparacion con todos los demas, datos imputados

Flujo sangumeo (%) Funcion de las extremidades indice de gravedad isquemica

Grupo de tratamiento

(4) (5) (4) (5) (4) (5)

(1) Control negativo: DMEM (im)

< 0,0001 < 0,0001 0,0014 0,9614 0,0208 0,2723

(2) Control negativo: DMEM+BB (im)

< 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,2760 0,0509 0,4688

(3) Control positivo: BM.MSC en DMEM (im)

< 0,0001 0,0034 < 0,0001 0,4911 < 0,0001 0,0008

(4) Tratamiento: BM.MSC en DMEM+BB (im)

0,0001 0,0010 0,2036

(5) Tratamiento: BM.MSC en DMEM, pre-BB (im)

0,0001 — 0,0010 — 0,2036 —

(6) Control negativo: DMEM (iv)

< 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0709 0,0025 0,0660

(7) Control negativo: DMEM+BB (iv)

< 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 0,0208 < 0,0001 0,0050

(8) Control positivo: BM.MSC en DMEM (iv)

0,0002 0,9142 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001

(9) Tratamiento: BM.MSC en DMFM+BB (iv)

0,0002 0,9442 < 0,0001 0,4314 0,0003 0,0137

(10) Tratamiento: BM.MSC en DMEM, pre-BB (iv)

< 0,0001 0,7473 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001 < 0,0001

Nota: Los valores P menores que 0,05 se encuentran subrayados.

La angiogenesis obstaculizada es una de las caractensticas de las enfermedades isquemicas. Sin embargo, los ensayos clmicos para aliviar la isquemia han sido decepcionantes, lo cual indica la necesidad de nuevas moleculas y objetivos terapeuticos para tratar las enfermedades isquemicas. La terapia de celulas madre es una estrategia auspiciosa en la medicina cardiovascular. Con el fin de evaluar la actividad terapeutica de las celulas madre en el tejido isquemico, se usa el modelo de isquemia de las extremidades posteriores en ratones.

En la presente memoria se describe que las MSC mostraron un potencial regenerativo en un modelo de raton animal, mientras que la sustancia Blebistatina por sf sola no tuvo ningun efecto beneficioso. Esto valido el modelo.

En estos experimentos, una unica administracion IV o local en la extremidad isquemica de las celulas analizadas restauro de manera sorprendente e inesperada la perfusion sangumea hasta el 65-84 % de sus valores normales. La restauracion del flujo sangumeo fue compatible con otros resultados que mostraron una mejora en la funcion de las extremidades y una disminucion y demora de la gravedad isquemica en el modelo de isquemia de las extremidades posteriores en ratones. Este efecto se logro en los grupos tratados con celulas analizadas localmente (grupos 4 y 5) o por via intravenosa (grupo 9).

La blebistatina acelero drasticamente la regeneracion de tejidos danados desencadenada por las MSC. La aplicacion de la blebistatina con MSC reduce drasticamente las complicaciones graves en la curacion tal como lo demostro claramente el Grupo 4 (BM.MSC en DMEM + BB (im)) que tiene mayor eficacia que todos los grupos en el % de flujo sangumeo y la funcion de las extremidades, incluido el grupo 5 BM.MSC en DMEM, pre-BB (im). Ademas, la blebistatina mejora drasticamente el potencial regenerativo de las MSC al reducir las complicaciones graves en la curacion.

El Grupo 4 (BM.MSC en DMEM + BB (im)) tiene mayor eficacia que todos los grupos en el % de flujo sangumeo y la funcion de las extremidades, incluido el grupo 5 BM.MSC en DMEm, pre-BB (im).

Los resultados que se presentan en la presente demuestran que la aplicacion de BM.MSC en presencia de la blebistatina proporciona la mayor eficacia cuando se aplica de manera intramuscular. Esta aplicacion combinada mostro la recuperacion mas rapida de la lesion, lo cual derivo en el tratamiento mas eficaz. La variacion relativamente pequena en el mejor grupo indica el caracter sistematico de la eficacia en todos los animales. A menos que se defina lo contrario, todo termino tecnico y cientffico, y cualquier acronimo que se use en la presente, tiene el mismo significado que le asigna normalmente el experto en la tecnica en el campo de la presente invencion. Si bien se puede usar cualquier composicion, metodo, kit y medio para la comunicacion de informacion similar o equivalente a los que se describen en la presente para poner en practica esta invencion, las composiciones, los metodos, los kits y los medios para la comunicacion de informacion preferidos son los que se describen en la presente.

Claims (9)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion que comprende una poblacion de celulas madre y blebistatina para uso en el tratamiento de una enfermedad susceptible de tratamiento con terapia de celulas madre.
2. 2. Composicion para uso segun la reivindicacion 1, donde la enfermedad se selecciona del grupo de una enfermedad que sea consecuencia de la diabetes, una enfermedad que sea consecuencia de la aterosclerosis, una enfermedad vascular, una enfermedad arterial periferica (PAD).
3. 3. Composicion para uso segun la reivindicacion 1 o 2, donde la enfermedad esta asociada a un mdice de presion tobillo-brazo de aproximadamente o menos de 0,9 o un mdice de presion tobillo-brazo de aproximadamente o menos de 0,7.
4. 4. Composicion para uso segun las reivindicaciones 1 a 3, donde la enfermedad ha derivado en una isquemia cntica de las extremidades y/o la enfermedad ha derivado en ulceraciones en la piel o gangrena.
5. 5. Composicion para uso segun las reivindicaciones 1 a 4, donde una parte de la poblacion de las celulas comprende celulas pluripotentes y/o donde las celulas pluripotentes se inducen celulas madre pluripotentes y/o donde una parte de la poblacion de las celulas comprende celulas multipotentes y/o donde las celulas multipotentes son celulas estromales multipotentes o celulas madre mesenquimales y/o donde las celulas multipotentes derivan de celulas madre pluripotentes inducidas.
6. 6. Composicion para uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las celulas madre son MSC.
7. 7. Un kit para tratar una enfermedad susceptible de tratamiento con una terapia de celulas madre que comprende:

   a. blebistatina;

   b. un portador farmaceuticamente aceptable;

   c. una poblacion de celulas madre; y

   d. opcionalmente, instrucciones para administrar los artmulos (a)-(c) a un paciente diagnosticado con una enfermedad cardiovascular.
8. 8. El kit de la reivindicacion 7, donde las celulas son celulas multipotentes.
9. 9. El kit de la reivindicacion 7, donde las celulas son MSC.