KR20150131324A - 줄기세포의 치료 효능 개선을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

줄기세포의 치료 효능 개선을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 말초동맥 질환 등의 심혈관 질환의 치료 조성물 및 치료방법을 포함한다. 이 방법은 치료를 필요로 하는 환자에게 중간엽 줄기세포((MSCs) 등의 세포군 및 블렙비스타틴 같은 비근육 미오신 II 길항제를 포함한 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 수반한다. 비근육 미오신 II 길항제는 손상 조직의 MSCs-유발 재생을 현저히 촉진시키고, 또한 줄기세포 치료의 심각한 합병증을 대폭 감소시킨다고 기술하고 있다.

Description

줄기세포의 치료 효능 개선을 위한 조성물 및 방법 {COMPOSTIONS AND METHODS FOR ENHANCING THE THERAPEUTIC POTENTIAL OF STEM CELLS}
본 발명은 줄기세포 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
줄기세포 치료법은 골수, 피부, 심장 및 각막 이식, 이식편대 숙주병, 간부전 및 신부전, 폐손상, 류머티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 루프스 및 당뇨 같은 자가면역 질환, 동종이식편 거부반응, 신경 질환 및 심혈관계 약제 등의 순조로운 접근법이다.
중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs) 및/또는 조상세포나 전구체 세포 등을 각종 조직, 예컨대, 골수, 골격근, 치수, 골, 탯줄 및 지방 조직 등으로부터 분리할 수 있다. MSCs는 재생의학의 치료적 접근법에 이용될 잠재적 원료로 큰 관심을 모으고 있다. 줄기세포는 자가재생이 가능하며, 특정 종류의 세포로 분화하는 능력이 있거나 조직재생을 촉진할 가용성 인자들의 생성 분비에 치료학적으로 이용할 수 있다. 특히, 풍부한 자가 공급원(abundant autologous origin)으로부터 얻은 성숙 줄기세포/조상세포는 배아 줄기세포 (embryonic stem, "ES")와 비교해, 그들의 높은 이용가능성, 낮은 암원성 및 ES 세포에 관련된 도덕적 논란을 피할 수 있다는 장점도 추가로 수반한다.
결함이 있거나 병든 기관 및 조직을 효율적으로 복구 또는 재생하는 능력을 촉진하기 위해, 공여자의 줄기세포/조상세포는 바람직한 치료특성 (예를 들어, 최소의 부작용, 숙주 조직내 축적력, 원하는 세포 결합체로의 분화, 파라크린(측분비) 효과, 조직 리모델링 조절, 및 내인성 복구/재생 메카니즘의 활성화)을 동반해야 한다.
MSCs는 특히 설치류, 토끼류 및 개코 원숭이류에 있어서의 다수의 잠복기 연구에 있어서, 골수, 피부, 심장 및 각막 이식, 이식편대 숙주병, 간부전 및 신부전, 폐손상, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 당뇨 및 루프스 질환 등에 이용되어 왔다. 이러한 연구에서 얻은 초기 결과가 현재 수행중에 있는 인체에 대한 임상연구로 이어졌다. 이들 임상연구는 자가면역 질환 예컨대 크론병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증 및 제 1형 당뇨병 등의 치료; 동종이식편 거부반응; 골수 및 신장 이식의 생존률 향상; 및 저항성 이식편대 숙주병의 치료 등을 포함한다.
심혈관 질환에 기인하는 이병 및 치사의 대부분은 관상동맥 및/또는 말초 혈관구조내에서 혈액을 운반하는 혈관이 부분적으로 또는 완전히 폐색되어 일어난다. 이러한 혈관이 부분 폐색되면, 혈류 부족으로 인해 이들 혈관을 통해 혈액이 공급되어야 할 근육 조직에 국소 허혈을 야기하고, 결국은 근육 수축 및/또는 기능항진을 저해한다. 혈류가 완전 폐색되면, 근육조직의 괴사가 일어난다.
현재 800 만명의 미국인이 말초동맥 질환 (peripheral artery disease, PAD)을 갖고 있다. 이는 다리의 동맥이 좁아진 결과이다. PAD의 가장 일반적인 증상은 경련, 걸을 때의 통증이나 피로 등이다. 그러나 일부 PDA 환자는 보행 능력을 잃고 심지어 절단하기도 한다.
개인에 따라, 혈관 폐색은 자연적인 과정 즉, 새로운 혈관이 형성되거나 (이 과정을 종종 "혈관신생"이라 함) 또한 조혈관이 확장되어 ("동맥형성"이라 함), 손상된 혈관의 기능을 대신함으로써 부분적으로 보상되기도 한다. 이러한 새로운 혈관은 혈류가 공급되지 않았던 조직에 혈액이 다시 흐르도록 촉진하며, 따라서 폐색된 혈관 주변에 "자연적 우회로"를 구성한다.
그러나, 혈관신생 기능이 손상된 일부 개인의 경우는, 심혈관 질환에 의해 감소된 혈류를 적절히 보상하기 위한 부수적 혈관들을 충분히 생성할 수가 없다. 따라서 허혈성 질환을 치료하기 위한 새로운 치료학적 접근이 필요하다
다양한 연구를 통해 사전임상 동물 모델에서 MSCs의 치료 효과를 평가했고, 임상적 효능이 큰 것으로 확인되었다. 그러나, 아직도 최적의 MSC 용량, 투여 경로 및 주사후 MSC 세포의 상태 등에 관한 다수의 과제가 남아 있다.
이와 같이, 각종 일반적 질환의 증상를 완화하고, 특히 혈관 질환의 치료에 최적화된 치료용 MSC 조성물 및 그의 사용 방법이 크게 요구되는 실정이다.
Walker et al. (Nat Commun, Author manuscript; available in 2010)은, 인간 다분화능 (소위 '만능') 줄기(human pluripotent stem, hPS) 세포, 예컨대 인간 태아 줄기(human embryonic stem, hES) 및 유도 만능 줄기 (induced pluripotent stem, hiPS) 세포를 무근육 미오신 II (non-muscle myosin II, NMII), 블렙비스타틴의 억제제로 처리하면, 클론 밀도 및 현탁물 조건하에 hPS 세포의 생존율을 향상시킬 수 있다고 개시하고 있다. 미국 공보 제 20100216181호는, 블렙비스타틴을 생존 인자로 사용하여 혈청 및 배양보조세포가 함유되지 않은 배지에서 만능 줄기세포를 배양하는 방법을 개시하고 있다. 세포를 스피너 플라스크나 생체 반응기에서 배양하면, 세포수가 증가한다. PCT 출원 공개공보 WO 2012062819는, 세포가 대체로 거의 또는 제한된 친화력을 갖는 세포 결합 촉진제로서 블렙비스타틴을 이용하여 기질에 대한 세포의 결합을 제어하는 방법을 개시하고 있다.
그러나, 이들 참고문헌 중 어디에서도 줄기세포 및 비근육 미오신II 길항제를 함유하는 조성물을 이용하여 환자를 치료할 때 관측되는 예상치 못한 탁월한 결과에 대해 교시하거나 시사하는 바가 없다.
본 발명의 일 측면은 필요로 하는 환자에게 세포군 및 비근육 미오신 II 길항제로 된 조성물을 유효량만큼 투여하여 혈관 질환을 치료하는, 혈관 질환 치료방법에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 혈관 질환은 당뇨병의 결과이다. 다른 구현예에서, 혈관 질환은 죽상 동맥경화증의 결과이다. 또다른 구현예에서, 혈관 질환은 말초혈관 질환이다 (peripheral vascular disease, PVD). 또다른 구현예에서, 혈관 질환은 말초동맥 질환(peripheral artery diseae, FAD)이다. 또다른 구현예에서, 혈관 질환은 발목 상완 압력지수가 대략 또는 0.9 미만인 것과 관련이 있다. 또다른 구현에에서, 혈관 질환은 발목 상완 압력지수가 대략 또는 0.7 미만인 것과 관련이 있다. 또다른 구현예에서, 혈관 질환은 중증 사지 허혈로 진행했다. 또다른 구현예에서, 혈관 질환은 피부 궤양이나 피부 괴저로 진행했다. 또다른 구현예에서, 조성물은 혈관신생 효과를 가져오거나 혈관신생 효과를 개선한다. 또다른 구현예에서, 조성물은 혈관신생 효과를 가져오거나 혈관신생 효과를 대조군과 비교하여 적어도 약 20% 개선한다.
또다른 구현예에서, 세포군의 일부는 만능 세포를 포함한다. 또다른 구현예에서, 만능 세포는 유도 만능 줄기세포에 포함된다. 또다른 구현예에서, 세포군의 일부는 다분화능 세포를 포함한다. 또다른 구현예에서, 다분화능 세포는 다분화능 기조직 세포 또는 중간엽 조직 줄기세포이다. 또다른 구현예에서, 다분화능 세포는 유도 만능 줄기세포로부터 유래된다. 또다른 구현예에서, 조성물은 약제학적 수용가능한 담체를 포함한다.
또다른 구현예에서, 상기 조성물을 수용하지 않은 동일한 환자와 비교시, 환자의 사지 기능이 대략 또는 적어도 2등급 내지 3등급 향상된다. 또다른 구현예에서, 환자의 사지 혈류가 정상인 또는 치료하지 않은 사지 혈류의 대략 또는 적어도 65 내지 85% 까지 향상된다. 또다른 구현예에서, 상기 조성물을 수용하지 않은 동일한 환자와 비교시, 환자의 허혈 손상이 대략 또는 적어도 2, 3 또는 4등급 향상된다. 또다른 구현예에서,상기 조성물을 수용하지 않은 동일한 환자와 비교시, 환자의 허혈 손상이 더욱 빠른 속도로 (또는 가속적으로) 향상된다.
또다른 구현예에서, 본 조성물은 정맥 투여한다. 또다른 구현예에서, 본 조성물은 근육 투여한다. 또다른 구현예에서, 본 조성물은 허혈 손상 부위 또는 그 부위의 인접 위치에 근육 투여한다.
또다른 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 비근육 미오신 II 유전자 및/또는 단백질 발현을 크게 감소시킨다. 또다른 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 비근육 미오신 II 유전자 및/또는 단백질 발현을 크게 감소시키는 것을 목표로 하는 siRNA 이다. 대안적인 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 비근육 미오신 II 유전자 및/또는 단백질 발현을 크게 감소시키는 것을 목표로 하는 siRNA, miRNA 또는 항감지 RNA를 암호화하는 DNA 벡터이다. 또다른 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 안지오텐신 II 수용체 길항제이거나 안지오텐신 수용체 차단제이다. 또다른 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 안지오텐신-전환 효소(angiotensin-converting-enzyme, ACE) 억제제이다. 또다른 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 2,3-부탄디온-2-모노옥심 (BDM)이다. 또다른 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 블렙비스타틴이나 그 유사체, 유도체 또는 변형체이다. 또다른 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 피롤리디논류 중에서 선택된 분자이다.
본 발명의 다른 측면은 만능 세포군; 비근육 미오신 II 길항제; 약제학적 수용가능한 담체; 및, 선택적으로, 줄기세포 치료법에 따라 치료에 순응하는 질환을 가진 것으로 진단된 환자에게 상기 성분들을 투여하는 것에 대한 지시설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 질환은 심혈관 질환이다. 또다른 구현예에서, 이 질환은 말초동맥 질환이다.
하나의 구현예에서, 세포는 MSCs이다. 다른 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 블렙비스타틴이다. 또다른 구현예에서, 심혈관 질환은 말초동맥 질환이다. 또다른 구현예에서, 세포는 MSCs이고, 비근육 미오신 II 길항제는 블렙비스타틴이며, 심혈관 질환은 말초동맥 질환이다. 또다른 구현예에서, 상기 키트는 심혈관계 약물을 더 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 키트는 스텐트를 더 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 키트는 약물 용출 스텐트를 더 포함한다. 하나의 구현예에서, 키트에 포함된 품목들은 별도의 용기에 수용되어 있다. 또다른 구현예에서, 만능 세포군, 비근육 미오신 II 길항제; 및 약제학적 수용가능한 담체는 동일한 용기, 예를 들어, 주사기나 자동 투여기구에 수용되어 있다. 이 키트는 말초동맥 질환 용도로 사용한다. 이 키트는 MSCs인 세포들을 함유할 수 있다. 비근육 미오신 II 길항제는 이상적으로는 블렙비스타틴이며 상기 질환은 말초동맥 질환이다. 이 키트는 심혈관계 약물, 및/또는 약물 용출 스텐트를 더 포함할 수 있다. 이들 품목은 별도의 용기, 동일한 용기 또는 주사기에 수용될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은, MSCs 함유 조성물로 치료한 말초동맥 질환 환자에 있어서, 치료전 MSC를 비근육 미오신 II 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, 절단율 감소 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 블렙비스타틴이다. 다른 구현예에서, 상기 절단율은 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 감소한다.
본 발명의 또다른 측면은 줄기세포 치료법을 이용한 치료에 순응할 수 있는 질환을 치료하기 위한 줄기세포 조성물로서, 만능 세포군; 및 비근육 미오신 II 길항제를 포함하는 줄기세포 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 국면에 따른 하나의 구현예에서, 상기 세포는 MSCs이다. 다른 구현예에서, 비근육 미오신 II 길항제는 블렙비스타틴이다.
본 발명의 또다른 측면은 줄기세포 치료법을 이용한 치료에 순응할 수 있는 질환을 치료하기 위한 것으로, 만능 세포군; 및 비근육 미오신 II 길항제를 포함하는 줄기세포 조성물의 제조방법으로서, 환자에 투여하기 전에 만능 세포군 및 NM II 길항제를 함께 소정 기간 동안 배양하는 것을 포함하는 줄기세포 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 줄기세포 치료법에 따른 치료에 순응하는 질환의 치유를 촉진하는 방법으로서, 만능 세포군; 및 비근육 미오신 II 길항제를 포함하는 조성물로 환자를 치료하는 것을 포함하고, 상기 조성물을 사용한 결과로, 비근육 미오신 II 길항제가 결여된 조성물보다 질환을 더욱 빨리 치유하게 되는 질환 치유 촉진 방법에 관한 것이다.
이들 측면의 특정 구현예에서, 세포는 MSCs이다. 다른 구현예에서, NM II 길항제는 블렙비스타틴이다. 또다른 구현예에서, 상기 질환은 심혈관 질환이다.
다음의 상세한 설명과 연계하여 검토시 첨부 도면을 참조하면 본 발명을 더욱 충실하게 이해할 수 있다. 도면에 개시된 구현예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 예시된 구현예에 한정되는 것으로 해석해서는 안된다.
도 1(a) 및 1(b)는 시간에 따른 혈류(%)를 나타낸다. 각 그룹의 평균치는 모든 유효 동물에 대해 산출하였다. 블렙비스타틴(BB)은 중간엽 줄기세포 이식으로 혈류 재생을 촉진 및 향상시킨다. 블렙비스타틴의 존재하에 투여한 줄기세포 (1A, 제 4군, 다이아몬드형)는, 블렙비스타틴으로 전처리했으나, 블렙비스타틴 없이 이식한 (1A, 제 5그룹, 실선 검정 사각형) 줄기세포와 비교하여, 동물내 혈류 재생이 더욱 빠르고 향상되었음을 보여준다. 블렙비스타틴을 함유하는 배지 대조군 (1A, 제 2그룹, 원형)은 MSCs와 더불어 최저 수준의 회복효과를 나타냈으며, 이는 후속 시점에서의 회복율로부터 확인할 수 있다 (1A, 제 3그룹, 삼각형). MSCs를 근육주사로 적용한 경우 일관적으로 정맥주사 투여보다 탁월한 효과를 보여주었다. 이들 데이터로부터, 블렙비스타틴(BB) 단독의 경우 혈류 재생에 효과적이지 않았으나, 이를 줄기세포와 함께 적용한 경우 MSCs의 재생능을 개선하거나 및/또는 이를 지원하는 것을 확인할 수 있다.
도 2A 및 2B는 시간에 따른 사지 기능(%)을 나타낸다. 각 군의 평균치는 모든 유효 동물에 대해 산출하였다. 데이터로부터, 블렙비스타틴(BB)이 MSCs와 함께 존재할 경우 사지 기능을 신속히 개선하는데 도움이 되는 것을 알 수 있다. 다른 처리군에서 혈액 관류가 개선됨에도 불구하고, 처리후 28일부터 사지 기능의 감소 및 사지 괴저 증가가 관측되었다. 제 3군은 절단이 더 많이 발생했고 동물간 분포도 역시 더 큰 것으로 나타났다. 이 데이터는 국소적인 근육주사 처리군과 비교시, 정맥주사 처리(2B)에서 다소 그 효과가 낮고 더 많은 합병증을 야기하였음을 보여준다 (도 2A). 블렙비스타틴의 존재하에 MSCs를 이식한 생쥐는 (2A, 제 4그룹, 개방 사각형) 이식후 시간 경과에 따라 일관적으로 소정의 빠른 사지 기능 개선효과를 나타냈다. 이와 동일한 경향이 소량 투여 생쥐에게서도 검출되었다 (2A, 제 5그룹, 삼각형). 대조적으로, MSCs 단독 사용시 20일까지 사지 기능이 약간 개선되나, 그 후부터 악화되는 것으로 나타냈다. 배지 대조군은 최저한도의 효과만을 보여주었다. 마이너스 경사도는 사지 기능의 개선을 나타낸다. 다시, MSCs의 근육주사 투여(2A)가 정맥주사 투여와 비교시 일관적으로 탁월한 효과를 나타냈다 (2B). 블렙비스타틴의 존재하에서 MSCs를 적용하면 MSCs 재생능이 탁월하다. 또한 재생능이 가장 신속히 개선되는 것을 보여주었다.
도 3A 및 3B는 허혈 중증도(%)를 나타낸다. 각 군내 평균치는 모든 유효 동물에 대하여 산출하였다. 블렙비스타틴과 함께 사용한 MSCs는 허혈지수 심화를 방해한다. 시간에 따른 허혈 중증도의 분석에서, 근육주사 투여한 제 4그룹 및 제 5그룹이 보다 우수한 결과를 가져오며, 배지 대조군은 분산 영역에 포함되는 것으로 나타났다. MSCs (제 3그룹)은, 정맥주사 투여만 행한 제 5그룹처럼, 근육주사 및 정맥주사 투여 모두에서 높은 수치 편차를 나타냈다. 또한, MSCs의 근육주사 투여의 결과는 도 3A에 도시한 바와 같으며, 정맥주사 투여의 결과는 도 3B에 도시한 바와 같다.
도 4는 수술후 35일까지의 혈류의 직선성과 비교하여, 혈류(%)의 박스플롯(box plot) 경사도 분포를 도시한다. 각 동물의 단일 수치는 시간에 따른 종료점(end point)에서의 변화를 나타낸다. 이들 플롯은 하나의 그래프 상에서 다수의 그룹을 표시하는데 편리한 방법이다. 예를 들어, 혈류(%) 평가치를 그룹별로 경사도 박스플롯으로 표시하여 대조군에서의 저편차 (소형 박스 크기), 또한 근육주사및 정맥주사 용도로 DMEM + BB에 용해된 BMMSC의 연구에서 최적의 실행 그룹을 가리킨다.
도 5는 블렙비스타틴이 치유 과정 중에서 발생하는 중증 합병증을 방지하는 것을 도시한다. 사전 임상연구의 주요 문제는 치료실패 (수술후 14일 후 절단)로 인한 동물 탈락율 및 치료와 무관한 (예, 마취중 사망 또는 수술후 14일 전 절단) 동물 탈락율이 높다는 것이다. 소수의 동물만 상기 후자의 이유로 통계 분석에서 제외되었다. 그러나 심각한 부작용 (절단)을 보인 이들 동물의 순위를 매기고 이 데이터를 통계 분석에 이용했다. 데이터로부터, 블렙비스타틴 (제 4그룹 및 제 8그룹)이 MSCs의 재생능을 현저히 개선하는 것을 분명히 확인할 수 있으며, 중증 합병증 발생률이 대폭 낮아지는 사실이 이를 뚜렷이 반영한다.
여기에서는 빠른 치유 및 질환이나 손상된 조직의 재생 효과를 개선하는 한편, 치유 과정에서 합병증을 크게 낮출 수 있는 MSC 조성물 및 그 제조방법에 대해 기술한다. 특히, 본 발명의 MSCs 조성물은 다양한 동물 모델에서 높은 재생능을 갖는다는 점을 개시한다. 특히, 블렙비스타틴은 MSCs의 치료효능을 예상 밖의 수준으로 현저하게 촉진 및 향상시키는 한편, 치유중 중증 합병증을 감소시키는 것으로 확인되었다.
특허청구범위 및/또는 명세서에서의 "포함하는"과 함께 기재되는 단수 관사 "a" 또는 "an" 는 "하나" 를 뜻하지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"의 의미와도 일치한다.
본원 전반에 걸쳐 "약"은 어떤 값이 해당 기구의 고유 오차 변이값을 결정하는데 이용되는 방법 또는 연구 대상체에 존재하는 편차도 포함한다는 점을 가리키는 것이다. 전형적으로, 이 용어는 대략 조건에 따라 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%이나 그 미만의 변동율을 포함하는 것을 뜻한다.
특허청구범위에서의 "또는"은 대안에 국한된 별도의 지시가 없을 경우, 또는 이러한 대안이 상호 배타적인 것이 아닐 경우, "및/또는"을 의미하고, 다만 명세서에서는 상기 대안과 "및/또는"을 뜻하는 정의를 뒷받침한다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 "포함하는" ("포함" 및 "포함한다" 등의 임의 형태), "갖는" ("갖고" 및 "갖다" 등의 임의 형태), "포함하는" ("포함" 및 "포함하다" 등의 임의 형태), "함유하는" ("함유" 및 "함유하다" 등의 임의 형태) 등의 용어는, 추가적인 및 언급하지 않은 구성요소나 방법의 단계들을 모두 포함하거나 한계를 정하지 않거나, 또는 이를 배제하지 않는다. 본 명세서에서 검토한 구현예들은 본 발명의 방법이나 조성물에 관련하여 수행될 수 있으며, 또는 그 반대의 경우도 있을 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 이용하여 본 발명의 방법을 달성할 수도 있다.
여기서의 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는 질병, 질병의 증상, 장애에 버금가는 질환 상태를 치료, 경감, 완화, 치료, 예방 또는 개선하기 위한 목적으로 어떤 대상에게 어떤 물질을 투여하는 것이다. "유효량"은 치료한 대상에게 상술한 바와 같은 의학적으로 바람직한 결과를 가져올 수 있는 어떤 물질의 양이다. 의학적으로 바람직한 결과는 객관적인 것 (예, 소정의 검사나 마커로 측정할 수 있는 것) 또는 주관적인 것 (예, 치료 대상자가 효과에 대한 느낌을 설명하는 것)일 수 있다.
여기서 언급하는 "줄기세포 치료법을 이용한 치료에 순응할 수 있는 질환"은 줄기세포를 투여하여 치료할 수 있는 임의의 절차, 조건, 장애, 만성적 질환 및/또는 질병을 말한다. 이러한 질환은 제한되지 않으나 골수, 피부, 심장 및 각막 이식, 이식편대 숙주병, 간부전 및 신장 부전, 폐손상, 류마티스 관절염 등을 포함하고, 크론병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 루프스 및 당뇨병 같은 자가면역질환의 치료; 이식편 거부반응, 신경학적 장애 및 심혈관 질환의 예방; 및 급성 림프모구 백혈병 (Acute lymphoblastic leukemia, ALL); 급성 골수성 백혈병 (Acute myeloid leukemia, AML), 버킷 림프종, 만성 골수성 백혈병 (Chronic myeloid leukemia, CML), 소아 골수단핵세포 백혈병 (Juvenile myelomonocytic lenkemia, JMML), 비호지킨 림프종 호지킨 림프종, 림프종모양 육아종증, 골수형성이상 증후군 (Myelodysplastic syndrome, MDS), 만성 골수단핵세포 백혈병 (Chronic myelomonocytic leukemia, CMML), 골수 감퇴 증후군, 무거대핵세포 혈소판 감소증, 자가면역 호중성 백혈구 감소증 (중증), 선천성 적혈구 형성이상성 빈혈, 주기 호중성 백혈구 감소증, 다이아몬드-블랙판 빈혈, 에반스 증후군, 판코니 빈혈, 글란츠만 병, 소아 피부근육염, 코츠만 증후군, 적혈구 무형성, 슈바츠만 증후군, 중증 무형성 빈혈, 선천성 철적모구 빈혈, 부재 반원 혈소판 감소증 (TAR 증후군), 선천성 이상각화증, 혈액 질환, 시클 적혈구성 빈혈 (헤모글로빈 SS), HbSC 질환, 시클-βo 지중해 빈혈, 메이저 α-지중해 빈혈 (태아 수종), 메이저 β-지중해 빈혈 (쿨레이 빈혈), 중간 β-지중해 빈혈, E-βo 지중해 빈혈, E-β+ 지중해 빈혈, 대사성 장애, 부신백질장애 가우처 병 (유아형), 이염색성 백색질 장애, 크라베 병 (구상세포 백색질 장애), 군터 병, 헤르만스키-푸드락 증후군, 허를러 증후군, 허를러-쉐이에(Hurler-Scheie) 증후군, 헌터 증후군, 산필리포 증후군, 마로테우-라미(Maroteaux-Lamy) 증후군, II형 및 III형 점액지질증, 알파-만노사이드 축적증, A형 및 B형 니만 픽 증후군, 샌드호프 증후군, 타이-사하스(Tay-Sachs) 병, 바텐 병 (고유 뉴우런 세로이드 지질갈색소증), 레쉬-나이한(Lesch-Nyhan) 병, 면역결핍증, 운동실조증 모세혈관 확장증, 만성 육아종병, 디조지(DiGeorge) 증후군, IKK 감마 결핍증, 면역 조절장애 다발성 내분비 장애(polyendocrinopathy), II형 X-결합 점액지질증, 골수 배출장애 X-결합 면역결핍증, 중증 복합 면역결핍증, 아데노신 디아미나제 결핍증, 위스코트-알드리히 증후군, X-결합 무감마글로부린혈증, X-결합 림프구 증식병, 오멘 증후군, 망상 이형성증, 흉선 이형성증, 백혈구 흡착 결핍증, 기타 골화석증, 랑게르한스 세포 조직구증, 혈구포식성 림프 조직구증, 급성 & 만성 신장병, 알츠하이머병, 노화 방지, 관절염, 천식, 심장 줄기세포 치료, 뇌경색 (뇌졸중), 뇌성 마비 (뇌졸증), 만성 폐색성 폐질환 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD), 충혈성 심부전, 당뇨병 (I형 및 II형), 섬유근육통, 면역결핍증, 허혈성 심장질환, 루프스, 다발성 경화증, 심근경색, 골관절염, 골다공증, 파킨슨병, 말초 동맥질환, 류머티스 관절염, 성형수술시 줄기세포 치료법, 외상성 두부손상 및 신경질환 등을 포함한다.
여기에서 "혈관 또는 심혈관 질환"은 임상적 증상 및 임상적 징후를 포함한 임상적 사건을 특징으로 한다. 임상적 증상은 임상의에게 병리 상태를 알리기 위해 환자가 기록한 경험들이다. 임상적 징후는 임상의에게 병리 상태를 설명하는 물리적 또는 연구실험에서 객관적으로 확인한 사실이다. "심혈관 질환"은 "관상동맥 질환" 및 "말초혈관 질환"을 모두 포함하며 이들 두 용어는 다음과 같이 정의한다. 심혈관 질환의 임상적 증상는 흉통, 호흡 단축, 쇠약, 실신, 의식 변화, 극단적 통증, 경련성 야간 호흡곤란, 일과성 뇌허혈 뇌졸증 및 기타 환자가 경험한 유사현상들을 포함한다. 심혈관 질환의 임상적 징후는 EKG 이상성, 말초 맥박 변화, 동맥혈 이상음, 심장음 이상, 수포음 및 헐떡임, 목정맥 팽창, 신경학적 변화 및 기타 임상의가 인식하는 유사 발견들을 포함한다. 임상적 증상 및 임상적 징후는 심근경색(myocardial infarction, MI)이나 뇌졸증 (또는 "뇌혈관 상해"나 "CVA" 라고 함) 등의 심혈관 질환과 복합될 수 있으며, 환자는 특정 현상(증상)을 기록하고 임상의는 해당 병리를 나타내는 모든 다른 현상(징후)를 파악한다. "심혈관 질환"은 심혈관 장애에 관련된 질환들, 예컨대, 취약(fragile) 플라크 장애, 폐쇄성 장애 및 협착증 등을 포함한다. 예를 들어, 취약 플라크 장애로 생긴 심혈관 질환은 하기에서 정의하는 바와 같이, "취약 플라크 질환"이라고 할 수 있다. 이 취약 플라크 질환과 관련된 임상적 사건은 취약 플라크 파괴 및 이에 따른 급성 혈전증 또는 말단 색전술을 특징으로 하는 징후 및 증상들을 포함한다. 취약 플라크 질환의 예를 들면, 뇌졸증 및 심근경색을 포함한다. 다른 예로서, 폐쇄성 장애의 결과로 생긴 심혈관 질환을 "폐쇄성 질환"이라고 할 수 있다. 폐쇄성 질환과 관련된 임상적 사건은 점진적 동맥 폐쇄로 타겟 조직에 도달하는 혈액 순환량에 영향을 미치는 징후 및 증상를 포함한다. 점진적 동맥 폐쇄는 점진적 허혈증을 가져올 수 있으며, 혈액 순환량이 조직 유지에 충분치 않은 양일 경우, 이는 궁극적으로 조직 사멸로 이어진다. 폐쇄성 질환의 징후 및 증상는 파행(다리절기), 휴식후 통증, 협심증 및 괴저, 또한 혈관 협착 및 말단 관류 감소를 나타내는 물리적 및 연구발견을 포함한다. 또다른 예로서, 재협착으로 인한 심혈관 질환은 스텐트내 협착증 질환이라고 한다, 스텐트내 협착증 질환은 경피적 혈관확장술 등의 절차의 일부로 설치되었던 동맥 스탠트가 점차 차단되어 일어나는 징후 및 증상를 포함하며, 통상 스텐트는 새롭게 확장된 구성으로 혈관을 유지하는데 도움을 주기 위하여 설치하는 것이다. 스텐트내 협착증 질환에 수반되는 임상적 사건은 재구성된 동맥의 재협착에 기인하는 것들이다.
"관상동맥 질환" (cronary artery disease, CAD)은 심장으로 가는 동맥이 차단되어 일어나는 혈관 장애를 말한다. 이러한 차단은 혈소판 파괴나 색전 등의 기전에 의해 갑작스럽게 일어날 수 있다. 차단은 또한 동맥이 심근내막 과증식 및 혈소판 형성을 통해 동맥이 좁아지면서 점차적으로 일어날 수도 있다. 심장으로 가는 동맥이 차단되어 일어나는 이러한 임상적 징후 및 증상는 관상동맥 질환을 나타내는 것이다. 관상동맥 질환의 징후는 협심증, 허혈증, 심근경색, 심근증, 충혈성 심부전, 부정맥 및 동맥류 형성을 포함한다. 관상계 순환에서 취약 플라크 질환은 심근 경색으로 자체적으로 드러난 동맥 혈전증 또는 말단 폐색증과 관련 있는 것으로 이해해야 한다. 관상계 순환에서 폐쇄성 질환은 협심 증상가 수반된 동맥 협착증에 연루하며, 통상 약리학적 조절 및 혈관성형술로 치료하는 병리상태로 이해해야 한다.
"말초혈관 질환" (Peripheral Vascular Disease, "PVD")은 말초 (비관상) 동맥의 차단으로 인해 생기는 심혈관 질환이다. 이러한 차단은 취약 플라크 질환에서 발생하는 것과 유사하게, 플라크 파괴나 색전 등의 기전에 의해 갑작스럽게 일어날 수 있다. 또한 차단은 폐쇄성 질환에서와 유사하게, 동맥이 심근내막 과증식 및 혈소판 형성을 통해 동맥이 좁아지면서 점차적으로 일어날 수도 있다. 차단은 전체적으로 또는 부분적으로 일어날 수 있다. 말초동맥 차단으로 인한 징후 및 증상는 말초혈관 질환으로 나타난다. 이러한 말초혈관 질환은, 그 중에서도, 파행(다리절기), 허혈, 장내 협착증, 혈관계 신장기능 부전, 일과성 뇌허혈 발작, 동맥류 형성, 말초 색전 및 뇌졸증 등으로 표현된다. 허혈성 뇌혈관 질환은 말초혈관 질환의 일종이다.
PVD가 의심될 경우 발목 상완 압력지수 (ankle brachial pressure index, ABPI/ABI)를 측정할 수 있다. 발목의 혈압 판독값이 상완의 값보다 낮은 경우, 심장으로부터 발목으로 혈액을 공급하는 동맥의 차단을 의심해볼 수 있다. ABI 비가 대략 또는 0.9 미만이면 PVD와 일치하고, 대략 또는 0.8 아래면 경도의 질환을 나타내며, 대략 또는 0.5 아래면 중증 허혈성 질환을 암시한다. ABI 비가 대략 또는 0.5나 0.4 미만이면 진단을 위한 임계값(분기점)으로 사용할 수 있다.
혈관벽이 경직되는 병리상태 (만성 당뇨병이 있는 경우에 야기되는 석회 침착 등)는 항상 그런 것은 아니지만, 대체로 이상 고ABI값 (대략 또는 1.3 초과)가 가리키는 가음성(false negative) 결과를 형성할 수 있다. 이러한 결과 및 의심은 후속 조사 및 고수준 연구에 유리하다. ABI값이 비정상이면 후속 단계는 일반적으로 하지 도플러 초음파검사가 되며, 이는 해당 부위 및 동맥경화증의 정도를 확인하는 방법이다. 혈관 조영술로 다른 영상을 촬영할 수 있으며, 이는 카테터를 대퇴부 동맥 속으로 삽입하여 문제의 동맥까지 선별적으로 안내한다. 방사선 불투과 조영제를 주입하여 X-선을 촬영할 수도 있다. X-선으로 혈류를 제한하는 협착 부위를 발견하면 죽종절제술(atherectomy), 혈관성형술 또는 스텐트 시술 등으로 이를 확인 및 치료할 수 있다. 혈관조영술의 다른 대안으로는, 다중 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캐너로 동맥계를 직접 촬영하는 것이다. CT는 혈관조영 사진에 나타난 동맥에 주입할 필요없이 대동맥 및 하지동맥을 신속히 평가할 수 있게 해준다.
말초동맥 질환(PAD)은 말초혈관 질환(PVD)의 한가지 형태로서, 사지, 대체로 다리로 내려가는 혈관 공급을 부분적으로 또는 전체적으로 차단하여 조직내 혈류 부전 및 저산소증을 유발하게 된다. PAD가 진행되면 심각한 사지 허혈증 (critical limb ischemia, CLI) 단계에 도달하고 피부 궤양, 괴저 및 잠재적으로는 절단을 피할 수 없게 된다. 뒷다리 허혈증 동물 모델은 줄기세포 이식에 관련된 각종 치료적 접근을 평가하는데 이용했다.
현재 PAD 관리의 표준지침은 금연, 콜레스테롤 저감, 항혈소판제, 당뇨병 치료, 고혈압 치료, ACE-억제제, 운동 및 실로스타졸 등을 포함한다. 추가적인 치료 옵션으로 스텐트, 예컨대, 파클리탁셀-용출 스텐트 등의 약물 용출 스텐트를 동반할 수 있다. 여기서 기술한 방법 및 조성물은 모두 이와 같은 치료 사양을 동반하는 것으로 예상한다 (예를 들어, Bums et al. BMJ, 2003 March 15:326(7389):584-588 참조).
말초동맥 질환은 통상 1954년 허혈증에 관련하여 르네 폰테인이 소개한 폰테인 단계로 구분된다: 1) 보행시의 약한 통증 (파행), 불완적(부분적) 혈관 폐색; 2) 비교적 단거리 보행시의 심한 통증 (간헐적 파행), "단계(II-a)의 경우 150 m 초과 거리 및 단계(II-b)의 경우 150 m 미만 거리"를 보행할 때 생기는 통증; 3) 휴식시 주로 다리에 나타나는 통증 (휴식 통증), 하지를 들어올릴 때 통증 증가; 4) 생물학적 조직 손실 (괴저) 및 보행 곤란 등이다. 여기에 기술한 조성물 및 방법은 환자의 폰테인 단계를, 치료개시부터 또는 대조군과 비교하여, 대략 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36시간, 일, 주 또는 개월 이상의 기간에 걸쳐 적어도 1, 2, 3 또는 4단계 향상시켜서 말초동맥 질환을 개선하는 결과를 얻는 것으로 예상한다.
이와 별도로, 루더포드에 의한 말초 동맥질환 분류는 6단계로 구성된다: 1) 약한 파행; 2) 중간 파행; 3) 심각한 파행; 4) 휴식시 허혈성 통증; 5) 소폭의 조직 손실; 및 6) 대폭의 조직 손실이다. 여기에 기술한 조성물 및 방법은 환자의 루더포드 단계를, 치료개시부터 또는 대조군과 비교하여, 적어도 또는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36시간, 일, 주 또는 개월 이상의 기간에 걸쳐 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6단계 향상시켜서 말초동맥 질환을 개선하는 결과를 얻는 것으로 예상한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 특허청구범위에 따른 조성물은 혈관신생을 가져오거나 향상시킨다.
이상적으로, 상기 조성물은 대조군 대비 적어도 20%의 혈관신생을 가져오거나 향상시킨다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 특허청구범위에 따른 조성물은 약제학적 수용가능한 담체를 포함한다.
"사지 기능 평가"는 여기에서 개시한 방법 및 조성물의 효능에 대한 상대적 측정 결과를 말한다. 이와 별개로, 사지 기능 등급은: 발끝을 구부려 꼬리의 완만한 수축에 저항할 경우 "0"; 발바닥 구부림은 "1"; 발바닥 구부림 없이 발 끌기는 "2"; 및 발 끌기는 "3"으로 분류한다. 여기에 기술한 조성물 및 방법은, 치료개시부터 또는 대조군과 비교하여, 대략 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36시간, 일, 주 또는 개월 이상의 기간에 걸쳐 적어도 1, 2, 3 또는 4등급 향상시켜서 환자의 사지 기능을 개선하는 결과를 얻는 것으로 예상한다.
"허혈성 손상의 평가"는 줄기세포 이식에 기초한 다양한 치료적 접근을 평가하는데 이용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 허혈성 손상은 형태적 등급으로 표현할 수 있다. 형태적 등급은: 실질적으로 괴사가 없을 경우 "0": 발가락에 국한하여 괴사가 있을 경우 "1" (발가락 손실); 발등까지 확대된 괴사인 경우 "2" (발 손실); 정강이까지 확대된 괴사인 경우 "3" (무릎 손실); 대퇴부까지 확대된 괴사인 경우 "4" (뒷다리 전체 손실) 이다. 여기서 개시한 조성물 및 방법은, 치료개시부터 또는 대조군과 비교하여, 대략 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36시간, 일, 주 또는 개월 이상의 기간에 걸쳐 적어도 1, 2, 3 또는 4등급 향상시켜서 환자의 허혈성 손상을 감축시키는 결과를 얻는 것으로 예상한다.
"사지 혈류 평가"는 여기서 개시한 방법 및 조성물의 효능에 대한 또다른 상대적 측정방법을 말한다. 바람직하게, 양쪽 다리의 혈류는 예컨대, 치료 전후 비접촉 레이저 도플러로 측정한다. 여기서 개시한 조성물 및 방법은, 치료개시부터 또는 대조군과 비교하여, 대략 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36시간, 일, 주 또는 개월 이상의 기간에 걸쳐, 정상 혈액 관류 수준의 대략 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 또는 100 퍼센트까지 환자의 사지 혈류를 개선하는 결과를 얻는 것으로 예상한다.
"말초동맥 질환 환자의 절단율"은 감염이나 괴사 등으로 인해 사지, 손가락/발가락 및/또는 조직 절단이 필요한 PAD 환자 비율을 말하며, MSCs 치료에 관련된 표준 절단율은 결정하기 쉽다. 바람직하게, MSCs 및 NM II 길항제의 조합물을 포함하는 조성물로 환자를 치료하면, 표준(예, 간호 표준) 또는 대조군 (예, 조합물이 아닌 MSC 단독 치료 또는 NM II 길항제 단독 치료) 대비시, 대략, 적어도 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500 퍼센트 이상으로 절단율을 감소시킨다.
여기서 정의하는 "심혈관 질환 약물"은 당뇨병, 고혈압 (예, ACE-억제제), 콜레스테롤 (예, 스타틴) 관리에 유용한 약제, 항혈소판제 (예, 아스피린, 클로피도그렐), 항응고제 (예, 와르파린), 이뇨제 및 베타-차단제 등을 말한다. 또한, 실로스타졸이나 펜톡시파일린은 심혈관성 당뇨병 약제이다. "혈관신생" 이란 용어는 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 성장하는 것을 포함한 생리학적 과정으로 정의한다. "맥관 형성"은 자발적인 혈관 형성을, 장중첩증은 기존의 것을 분할하여 새로운 혈관을 형성하는 것을 각각 의미한다. 혈관신생은 성장 및 발달, 또한 상처치유의 정상 과정이다. 또한 휴면 상태에서 악성 상태로 종양이 전이하는 기본 단계이기도 하다. 혈관신생은, 혈관신생 전의 동일한 조직, 표준(예, 간호 표준) 또는 대조군 (예, 조합물이 아닌 MSC 단독 치료 또는 NM II 길항제 단독 치료)과 비교하여, 소정 영역에서의 신규 혈관 성장이 대략, 적어도 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500 퍼센트 이상일 때 일어나는 것이다.
"치유 촉진"은 줄기세포 치료법에 순응하는 질환이, 여기에서 개시한 조성물을 이용한 치료법에 대해 개선 징후 (해당 질환과 관련된 적절한 정성적 또는 정량적 형태학적 또는 기능적 측정에 있어서)을 나타내는 속도가 증가하는 것을 말한다. 바람직하게, 치유 속도는, 표준(예, 간호 표준) 또는 대조군 (예, 조합물이 아닌 MSC 단독 치료 또는 NM II 길항제 단독 치료)과 비교하여, 대략, 적어도 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500 퍼센트 이상 증가한다.
여기서 사용한 바와 같이 "환자"는 심혈관 질환이 있거나 발병 중으로 진단 또는 의심되는 포유류 대상체를 말한다. 예를 들면, 인간, 원숭이, 개, 돼지, 소, 고양이, 말, 염소, 양, 설치류 및 그외 줄기세포 치료법의 이득을 볼 수 있는 기타 포유류를 말한다.
여기서 "투여하는"은 본 발명의 조성물을 환자에게 제공하는 것을 말한다. 비제한적인 예로서, 주사 등의 조성물 투여 방법은 정맥(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 피내 (i.d.) 주사, 복강 (i.p.) 주사 또는 근육(i.m.) 주사 등을 포함한다. 한가지 이상의 경로를 이용할 수도 있다. 비경구 투여는 예를 들어, 볼루스(bolus) 주사나 시간에 따른 점진적 관류 방식을 들 수 있다. 이와 별도로 또는 이와 병행하여 경구 경로로 투여할 수 있다. 또한, 수술을 통한 세포 볼루스나 세포 펠릿 부착, 또는 스텐트 등의 의료기구를 세포 속으로 삽입함으로써 투여할 수도 있다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 허혈성 심혈관 환부, 예컨대, 허혈성 심혈관 병변 (예, 혈관 폐색/차단, 괴사 조직이나 괴저성 감염 부위)의 위치나 그 근방 (예, 이 위치로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50 밀리미터 거리)에 투여한다. 질환-관련 병변 부위나 근방에 정맥주사 또는 근육주사, 및/또는 허혈성 손상 부위 또는 근처에 근육주사로 투여할 수 있다.
여기서 "치료를 필요로 하는 환자"는 심혈관 질환이 있거나 발병 중인 것으로 진단 또는 의심되는 환자를 말한다. 하나의 구현예에서, 환자는 말초 동맥질환을 갖거나 발병하기 쉬운 상태이다.
"분화전능"이란 단일 세포가 분할하거나 및/또는, 배외 조직을 포함하여, 기관내 모든 분화 세포를 생성하는 능력을 말한다. 분화전능 세포는 포자와 접합체를 포함한다. 어떤 유기체에서 세포는 탈분화하여 분화전능을 다시 얻을 수 있다.
"만능"이란 다음과 같은 3가지 배아층 중 어느 것으로 분화하는 능력을 말한다: 내배엽 (내부 위벽, 위장관, 폐); 중배엽 (근육, 골, 혈액, 비뇨생식기); 또는 외배엽 (상피세포 및 신경계).
"만능 줄기세포"는 자연 만능 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포를 포함한다. 이들은 태아 또는 성숙 세포 종류를 생성할 수 있다. 그러나, 이들 단독으로는 태반 같은 배외 조직에 기여하는 능력이 없기 때문에, 태아 또는 성숙 기관으로 발달할 수가 없다.
"유도 만능 줄기세포" 또는 ("iPS 세포")는 예컨대 소정의 줄기세포 유전자 및/또는 테인(tein) 발현, 크로마틴 메틸화 패턴, 배가 시간, 태아체 형성, 기형종 형성, 키메라 형성가능성, 및 효능과 분화력 등의 여러 측면에 있어서, 태아 줄기(ES) 세포 등의 자연 만능 줄기세포와 유사하다. 유도 만능 세포는 예를 들어 성체의 위, 간, 피부 세포 및 혈액 세포로부터 유래될 수 있다. iPS 세포는 소정의 줄기세포 관련 유전자를, 예컨대, 성체 섬유아세포 등의 비만능 세포에 형질주입하여 유도할 수 있다. 어떤 구현예에서, 형질주입은 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 등을 통해 달성할 수 있다. 형질주입 유전자는, 제한되지 않으나, 마스터 전사 조절자 Oct-3/4 (Pou5f1) 및 Sox2 Oct-4, Nanog 및 Lin28 형질전환 유전자를 포함한다. 소그룹의 형질주입 세포가 형태학적으로 및 생화학적으로 만능 줄기세포와 유사하게 변하기 시작하며, 이를 형태학적 선별, 배가 시간, 또는 리포터 유전자와 항생제 선택으로 분리할 수 있다.
여기서 "다분화능"은 복수종의 세포를 생성할 수 있는 능력이 있는 다분화능 전구세포를 말하며, 다만 다수의 만능 줄기세포보다 리니지(lineage) 수가 제한되어 있다. 예를 들어, 다분화능 줄기세포는 여러 종류의 혈액 세포로 발달할 수 있는 조혈 세포이며, 단 뇌세포나 다른 세포종류로는 발달할 수 없다.
여기서 "중간엽 줄기세포 또는 다분화능 기조직 세포" (양쪽 모두 "MSCs"라고 함)는 각종 세포류, 특히 제한되지는 않으나, 골아세포 (골세포), 연골세포 (물렁뼈 세포) 및 지방세포 (지방 세포) 등을 포함하는 세포들로 분화될 수 있는 다분화능 기조직 세포이다.
어떤 구현예에서, 중간엽 줄기세포는 골수에서 얻는다. 또다른 구현예에서, 중간엽 줄기세포를 아랫턱의 3번째 어금니로 발달 중인 치아싹으로부터 얻는다. 또다른 구현예에서, MSCs는 동공축소액으로부터 얻는다. 또다른 구현예에서, MSCs는 탯줄조직, 즉, 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 및 제대혈로부터 얻을 수 있다. 그밖의 구현예에서, MSCs는 지방조직으로부터 분리한다. 또는, MSCs을 바르톤 젤리로부터 분리한다. 또다른 구현예에서, MSCs는 예를 들어, Guiliani 등이 개시한 바와 같이 iPS 세포로부터 유래된다 ("Human mesenchymal stem cells derived from induced pluripotent stem cells downregulate NK cell cytolytic machinery," Blood, July 29, 2011 참조).
MSCs는, 바람직하게는 가늘고 긴 수개의 세포 프로세스로 된 소세포체를 갖는다. 세포체는 돌출핵이 포함된 큰 원형의 핵을 함유할 수 있으며, 이 돌출핵은 작은 분산된 염색질 입자들로 둘러싸여 있어 핵이 뚜렷한 외형을 가질 수 있다. 세포체의 나머지 부분은 소량의 골지체, 거친 소포체, 미토콘드리아 및 폴리리보솜을 함유한다. 가늘고 긴 MSCs는 널리 분산되어 있으며 인접한 세포외 기질에는 소수의 세망 섬유가 군집화되어 있고, 다만 다른 종류의 콜라겐 섬유는 존재하지 않는다.
세포 부착은 균질한 과정이 아니지만, 특정 영역, 소위 초점 접착 영역을 통해 일어난다. 부착된 세포는 내부 모터 단백질로 장력을 제공한다. 이에 따라, 세포골격이 조직되며 다양한 과정, 예컨대, 전달, 족장형성(scaffolding) 및 세포 생존 등의 과정에 작용한다. 세포 탈착시, 이들 세포는 모터 단백질에 의해 형성된 내부 장력의 작용으로 재빨리 수축하며, 사전 조직된 내부 구조물 (세포골격 등)이 방해를 받을 수 있다. 표면에 재부착되지 못하면, 이들 세포는 부착성 관련 세포자살/세포사멸 등으로 기재된 세포사 프로그램을 개시하게 된다.
"미오신"은 ATP-의존 모터 단백질 그룹을 포함하며 일반적으로 근육수축에 있어서의 이들의 역할 및 광범위한 기타의 진핵세포 운동 과정에 이들이 수반되는 것으로 공지되어 있다. 이들은 통상 액틴계 운동성에 응답한다. 일반적으로, 미오신 II (종래 미오신으로도 공지되어 있는)는 근육 세포내 근육 수축을 일으키는데 응답하는 미오신 종류이다.
세포 장력 발생에 응답하는 주요 세포골격 모터 단백질은 비근육 미오신 II (미오신 II 라고 함)이다. "비근육 미오신 II" 또는 "NM II"은 액틴 가교 및 수축성을 갖는 한편, 경사슬 및 중사슬의 포스포릴화를 통해 부분적으로 조절되는 액틴-결합 단백질이다. 근육 미오신 II와 마찬가지로, NM II 분자는 3쌍의 펩티드로 구성되어 있다: 2개의 230 kDa 중사슬, NM II 활성을 조절하는 2개의 20 kDa 조절형 경사슬 (regulatory light chains, RLCs), 및 중사슬 구조를 안정화하는 2개의 17 kDa 필수 경사슬 (essential light chains, ELCs)이다. 이들 미오신을 여기서 "비근육" 미오신 IIs 라고 하여 이들의 근육 대조체(counterpart)와 구분하고 있으나, 이들 역시 근육 세포 내에 존재하며, 이 안에서 골격근 발달 및 분화 과정, 또한 연근육내 장력 유지 과정에서 뚜렷이 구별되는 작용을 한다.
일반적으로, 3종의 포유류 NM II 이성체는 서로 중복되거나 다른 특징을 갖는다. NM II의 2개의 구형 헤드 영역은 ATP 및 액틴의 결합 위치를 포함하며, 그 뒤에 이어진 목 부위는 각각 2개의 기능적으로 상이한 경사슬과 결합하고 있다. 목 부위는 지렛대(lever arm) 역할을 하여 헤드의 회전을 증폭시키는 동안, ATP의 화학에너지가 미오신 헤드의 기계적 운동에너지로 전환된다. 목 부위 다음에는 긴 α-나선형 코일이 연결되고 이는 긴 막대형 영역을 형성하여, 중사슬 간의 이합체화 (dimerization) 반응에 작용하며, 비교적 짧은 비나선형 꼬리로 종결된다. 상기 NM II의 막대 영역이 자가 결합하여 쌍극 필라멘트 (미오신 분자의 비평형 배열)을 형성하며, 이는 심장 및 골격 근육에서 확인되는 것보다 크기가 작다.
NM II는 세포 이동 및 접착을 구동시키는 과정들을 통합하는 역할을 한다. 또한, 다수의 신호화 경로가 Rho GTP 분해효소를 통해 집중되는 중요한 종말점이기도 하다. NM II 자체는, 폴딩, 미오신 필라멘트 조립 및 분해, 액틴 결합 및 ATP 분해효소와 모터의 활성 등의 다양한 단계에서 치밀하게 조절된다. NM II에 의한 액틴 세포골격화 조절은 다수의 상호관련 과정들, 예컨대, 이동, 세포-세포간 및 세포-기질간 접착, 세포 분화, 조직 형태화 및 발달 등을 제어한다. 각종 세포 및 조직 내의 조절 키나제의 준세포 국소화 및 활성화에 따른 NM II의 시공간 조절은 NM II 작용을 제어하는데 중요한 영향을 미친다.
Mg2 +-ATP 가수분해반응 및 NM II의 필라멘트 형성의 조절은 20 kDa RLCs와 중사슬 쌍에 존재하는 특이적 아미노산의 가역성 포스포릴화 반응을 동반한다. ELC 쌍의 역할은 NMHC을 안정화시키는 것이며, 이들이 가역성 포스포릴화 반응한다는 것을 입증하는 증거는 없다 (Vicente-Manzanares et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 November; 10(11): 778-790 참조).
"비근육 미오신 II 길항제"는, 미오신 II의 활성이 자연적으로 발생하거나 또는 심혈관 질환 환자의 질환이나 손상된 조직에서 발생할 때, 직접 또는 간접적으로 미오신 II의 활성을 억제, 차단 또는 역전시키는 작용제를 말한다. 이러한 작용제는 소형 분자 (예, 블렙비스타틴); rRNA, mRNA, tRNA, miRNA, siRNA 등을 포함한 핵산 (예, Ma et al., Mol. Biol. Cell November 15, 2010 vol. 21 no. 22 3952-3962 or Kim et al, J Biol Chem. 2012 Aug 10;287(33):27345-58 참조), 항감지 RNA, DNA, RNA/DNA 하이브리드, 리보자임, PNA, 엡타머 (이들 중 일부 또는 전체는 합성 또는 비천연 누클레오티드 염기를 포함할 수 있다); 펩티드; 또는 단백질, 예, 항체, 항체 절편, 항체 유사 분자나 단일사슬 항체, 및 포스파타제와 키나제 등을 포함한다. 예를 들어, NM II 길항제는 mRNA를 암호화하는 NM II 또는 NM II의 상향 조절과 관련된 유전자의 mRNA의 발현을 없애는 것을 타겟으로 한 siRNA; 또는 이러한 siRNA를 암호화하는 벡터일 수 있다.
바람직하게, NM II 길항제는 안지오텐신 II 1형 수용체 길항제, (예, 무펩티드 AT1 수용체 길항제 FK-739; Fuji et al., Hypertension, 1999;33:975-980 참조) 및 안지오텐신 수용체 차단제 (angiotensin receptor blockers, ARBs)로도 공지된 안지오텐신 II 수용체 길항제를 포함하고, AT1-수용체 길항제나 사르탄스는 레닌-안지오텐신-알도스테론계를 조절하는 약제군이다. 이들의 주요 용도는 고혈압 (높은 혈액 압력), 당뇨성 신장병 (당뇨병으로 인한 신장 손상) 및 충혈성 심부전의 치료이다. 로자탄, 이르베자탄, 올메자탄, 칸대자탄 및 발자탄은 테트라졸기 (4개의 질소 및 1개의 탄소를 가진 고리)를 포함한다. 로자탄, 이르베자탄, 올메자탄, 칸데자탄 및 텔미자탄은 1개 또는 2개의 이미다졸기를 포함한다.
비근육 미오신 II 길항제는 또한 ACE 억제제를 포함한다. ACE 억제제 (또는 안지오텐신-전환-효소 억제제)는 일차적으로 높은 혈액 압력 (고혈압) 및 약한 심근육 (충혈성 심부전)을 치료하기 위한 약제이다. ACE 억제제의 예를 들면, 캅토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 이미다프릴, 조페노프릴, 트란돌라프릴, 포시노프릴, 카소키닌스 및 락토키닌스 등을 포함하며, 또한 프로바이오틱 락토바실루스 헬베티쿠스로부터 제조하거나 카제인에서 유래한 락토트리펩티드 Val-Pro-Pro 및 Ile-Pro-Pro 등도 ACE-억제 및 항고혈압 기능을 가진 것으로 확인되었다.
비근육 미오신 II 길항제는 또한 2,3-부탄디온-2-모녹심 (BDM) 및 미오신 II 아데노신 트리포스파타제 (adenosine triphosphatase, ATPase) 활성 억제제도 포함한다.
NM II 길항제 중 하나는 골격근 및 무근육 미오신 II 아데노신 트리포스파타제 (ATPase) 활성의 특이 약리학적 억제제인 특이 약리학적 억제제인 블렙비스타틴 (1-페닐-1-2-피롤리디논 유도체)이다. 블렙비스타틴은 세포의 물집 형성을 억제하는 고활성 소분자이다. 이 화합물은 세포-침투성 및 양성이고, 쉽게 역전되는 점이 중요한 특성이다. 이는 줄기세포 배양시 생존 지수로 소개되었다. 또한 세포가 대체로 친화성을 갖지 않거나 친화성이 낮은 기질에 대한 이들 세포의 접착을 위한 촉진제 (WO 2012062819), 예를 들어, 페이스 마커, 둔부나 골 이식편 또는 스텐트 등의 이식된 의료기구를 코팅하는 용도로 개시되었다. 블렙비스타틴은 다음과 같이 표시한다:
Figure pct00001
어떤 구현예에서, "블렙비스타틴"은 라세미 혼합물을 포함한다. 어떤 구현예에서, 블렙비스타틴은 R-블렙비스타틴을 말한다. 어떤 구현예에서, 블렙비스타틴은 S-블렙비스타틴을 말한다.
본 명세서는 블랍비스타틴 변형체, 유사체 및 유도체를 모두 포함한다. 또다른 블렙비스타틴 변형체, 유사체 및 유도체, 또한 사용하기에 적합하고 여기에 포함되는 비근육 미오신 II 길항제 등이 미국 공보 제 2008-0021035호에 개시되어 있다 (예, Straight et al., Science 299 (5613): 1743-47; Kovacs et al., (Aug 2004), J Biol Chem. 279 (34): 35557-63; Limouze et al., (2004) J Muscle Res Cell Motil. 25 (4-5): 337-41 등을 참조).
어떤 구현예에서, 여기에 개시된 치료 조성물에는 적어도 하나의 비근육 미오신 II 길항제가 포함되거나 이와 관련이 있으며 이들 각각의 적어도 하나의 비근육 미오신 II 길항제는 단일 용량에, 대략, 적어도 또는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99의 농도이고 각 회 용량당 10-9, 10-8, 10-7, 10-7, 10-6, 10-5 , 10-4, 10-3, 10-2, 10-1 몰이 함유되어 있다. 바람직하게, 비근육 미오신 II 길항제는 약 1 내지 100, 2 내지 60, 3 내지 50, 4 내지 40, 5 내지 30, 6 내지 20, 7 내지 15, 8 내지 10, 2 내지 18, 3 내지 16, 4 내지 14, 5 내지 12, 6 내지 10, 또는 7 내지 8 μM 농도의 단일 용량으로 존재한다.
어떤 구현예에서, 여기에 개시된 치료 조성물을 대략 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24일, 주일 또는 개월의 기간에 걸쳐 일일, 일주일 또는 1개월당 대략, 적어도 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24회 이상의 용량으로 투여한다.
어떤 구현예에서, NM II 길항제를 환자에 투여하기에 앞서, 대략, 적어도 또는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 분, 시간 또는 일 이상 조성물로 세포 배양한다.
어떤 구현예는 세포와 NM II 길항제를 포함하는 키트를 수반한다. 어떤 키트 구현예는 (a) 적어도 하나의 NM II 길항제가 함유된 용기; 및 (b) 줄기세포가 함유된 용기를 포함한다. NM II는 용액 또는 동결건조 형태일 수 있다. 키트는 선택적으로 심혈관 질환을 치료하기 위한 (i) 용액의 용도 또는 (ii) 동결건조 제형의 재구성 및/또는 용도; 또는 (iii) 내용물의 사용법에 대한 지시설명서를 더 포함할 수 있다. 이 키트는, (iii) 완충액, (iv) 희석액, (v) 필터, (vi) 주사바늘, (v) 주사기 또는 (vi) 자동 의료기구 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 용기는: 병, 유리병, 주사기, 시험관 또는 다목적 용기 중에서 선택된다. 다른 구현예에서, 타겟 펩티드 조성물을 동결건조한다.
여기에 개시된 치료 조성물은 단일 용량에 적어도 또는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100의 농도이고 각 회당 환자의 체중 1 kg 당 1, 10, 102, 101, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 또는 그 이상의 세포가 함유되어 있다. 어떤 구현예에서, 1회 용량은 대략, 적어도 또는 1 내지 20, 2 내지 19, 3 내지 18, 4 내지 17, 5 내지 16, 6 내지 15, 7 내지 14, 8 내지 13, 9 내지 12 또는 10 내지 11 이상의 농도로서 각 회당 106 줄기세포가 함유되어 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물에 NM II 길항제를 첨가하면 임상의는, NM II 길항제 없이 줄기세포군으로 달성한 것과 동일한 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 양보다 적은 용량의 줄기세포를 환자에게 공급할 수 있다. 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물을 NM II 길항제를 첨가하면 임상의는, 소정 기간 동안 동일한 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 1회 용량당 적어도 또는 대략 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 퍼센트 이상 감소된 양의 줄기세포를 환자에게 공급할 수 있다.
심혈관 질환을 치료하는 양 방법 및 조성물; 및 MSCs를 사용하여 심혈관 질환을 치료시 합병증 (예, 절단)을 감소시키는 방법에 대해 개시한다. 덧붙여, 세포 NM II 길항제, 약제학적 수용가능한 담체, 또한 -선택적으로- 적절한 지시 설명서를 포함하는 키트도 개시한다.
뵨 발명은 또한, MSCs를 포함하는 조성물로 말초동맥 질환 환자를 치료시 절단율을 감소시키는 방법으로서, 치료 전 MSCs를 비근육 미오신 II 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는 감소 방법에 관한 것이다. 이상적으로, 상기 비근육 미오신 II 길항제는 블렙비스타틴이다.
일부 구현예에서, 상기 치료방법은 일반적으로 블렙비스타틴 같은 NM II 길항제로 치료한 MSCs의 조성물을 소정 용량으로 PAD 같은 CVD에서 야기된 병변의 위치 또는 그 부근에 근육 주사하는 것을 수반할 수 있다. 주사에 의해 사지 기능, 혈류, 및 허혈성 증상가 향상되는 결과를 얻을 수 있다. 또한, 조성물에 블렙비스타틴 같은 NM II 길항제를 이용할 경우, 손상 조직의 MSC-유발 재생을 현저히 촉진시킬 수 있다. 또한 MSCs와 함께 블렙비스타틴을 응용하여, PAD 및/또는 PAD로 고통받는 환자에 대한 MSCs 이식에 관련된 심각한 합병증을 현저히 감소시킨다.
상기 방법과 키트는 또한 예를 들어 스텐트 (약물 용출이 있거나 없는) 같은 의료기구 또는 추가적인 심혈관 약물을 포함할 수 있다. 또다른 구현예에서, 이식 전 또는 이식 과정에서 NM II 길항제와 접촉한 MSCs를 상기의 스텐트에 충전할 수 있다.
참고 문헌:
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실시예
실시예 1 - 실험 준비
뒷다리 말초 허혈의 생쥐 모델에서 BM MSCs을 시험하는 방법을 개시한다. 말초동맥 질환(PAD)은 말초혈관 질환(PVD)의 한 형태로서 사지, 통상은 다리에 대한 혈액 공급이 부분 또는 전체적으로 차단되어 조직내 혈류 손상 및 저산소증을 야기한다. PAD가 진행되면 피부 궤양, 괴저 및 피할 수 없는 절단 문제가 수반되는 심각한 사지 허혈 (CLI) 단계에 이른다. 당뇨성 혈관 합병증에 대한 가장 바람직한 혁신적 치료방법 중 하나는 혈관신생을 개선하는 줄기세포계 제품 (TRef1-3)을 사용하는 것이다. 뒷다리 허혈의 동물 모델을 이용하여 줄기세포 이식을 위한 다양한 치료적 접근법을 평가하였다.
동물은 국립 연구소 (National Institute of Health, NIH) 및 실험동물 관리보호 인증협회 (Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC)의 지침에 따라 취급했다. 크기가 42.5 x 265.6 x 18.5 cm 이고, 펠릿형 먹이 및 음용수가 담긴 투명한 폴리카보네이트 병을 설치하기 위한 설비가 구비된 스테인리스 스틸의 상판 그릴을 포함한 폴리술폰(PSU) 케이지 (7 내지 8마리/케이지)에 동물을 넣고; 깔짚을 깔아주고; 스팀 멸균한 깨끗한 곡물 껍질 (Harlan, Sani-chip, Cat#: 10658216)을 사용했으며, 주당 적어도 2회 케이지와 함께 깔짚도 교환했다. 시판 설치류 먹이 (Teklad Certified Global 18% Protein Diet cat #: 106S8216)를 동물에게 무제한 공급했다. 동물은 시당국에서 공급하는 오토클레이브 및 산성화 처리된 음용수 (pH 2.5 내지 3.5)에 자유롭게 접근하도록 했다. 동물은 표준 실험실 조건하에, 신선한 공기를 공급하여 (시간당 최소 15회 공기 교체) 에어컨 및 여과처리된 (HEPA F6/6) 환경에서 사육했다. 기후 제어 환경에서 동물을 유지하고 온도 범위는 20 내지 24℃로 하고, 12시간 빛을 쬐고 12시간 어둡게 하는 명암 주기하에 상대습도 (RH)는 30 내지 70%으로 했다. 품종/가슴샘 없는 누드 마우스; 성별/마리수/연령:
수컷/152/9 내지 10주; 공급처: 할란 래버러토리 (Harlan Laboratories, Israel); 체중: 평균 체중은 연구 개시 시점에 28.4 g (제 1일). 그룹의 최소 및 최대 체중은 평균치의 ±20%의 범위였다; 환경 적응기간: 5 내지 10일; 동정: 귀의 3곳에 새김처리 및 케이지 카드. 빈사 상태나 심각한 통증 및 심각한 고통의 징후를 보이는 동물은 발견되지 않았다. 본 연구에서 수술 당일을 "제 0일"로 정의하였다. 수술 당일 1.5 내지 3.0%의 이소플루란, 1.5% N2O 및 0.5% O2 로 마취했다.
시험체: 인간 골수 중간엽 줄기세포 (Lonza Cologne GmbH). 비히클: DMEM + 10 % FCS, 선택 사양: 10 μM 블렙비스타틴 (BB).
마취 상태에서 생쥐를 복부 측이 위로 오도록 눕혔다. 서혜부의 피부를 0.5 내지 1.0 cm 길이로 절개했다. 대퇴부 동맥을 6-0 실크사로 2회 결찰하고, 결찰사 사이를 횡단 절개했다. 상처부를 4-0 실크사로 봉합한 뒤 생쥐를 회복시켰다.
수술후 24시간인 제 1일, 각각의 처리 동물에 대해 2곳 부위 (수술 상처에서 가까운 곳과 먼 곳)에 근육 주사하거나 꼬리 정맥에 정맥 주사했다. 근육주사의 경우, 각 위치에 50 ㎕를 주사하므로 동물당 총 주사량은 100 ㎕이었다. 정맥 주사의 경우 각 동물당 200 ㎕를 주사했다. 그룹 할당은 표 1에 도시한 바와 같다.
표 1 - 그룹 할당
그룹 동물 마리수 처리 (로트) 처리일 세포량 투여경로
1 15 DMEM


수술후
24시간




 0

2곳에 근육주사
2 15 DMEM + 10 μM BB 0
3 15 DMEM에 용해된 BM.MSC 0.1 mL 당 0.25x105
4 15 DMEM에 용해된 BM.MSC + 10 μM BB 0.1 mL 당 0.25x105
5 15 DMEM에 주입한 BB로 전처리한 BM.MSC 0.1 mL 당 0.25x105
6 15 DMEM 0

꼬리정맥에 정맥주사
7 15 DMEM + 10 μM BB 0
8 15 DMEM에 용해된 BM.MSC 0.1 mL 당 0.25x105
9 15 DMEM에 용해된 BM.MSC + 10 μM BB 0.1 mL 당 0.25x105
10 15 DMEM에 주입한 BB로 전처리한 BM,MSC 0.1 mL 당 0.25x105
수술 전일 (-1 일) 체중을 측정하고, 그 후 매주 1회 측정했다. 혈류 측정: 수술전 및 수술후 제 1일, 제 3일, 제 7일, 제 14일, 제 21일, 제 28일 및 제 35일에 각각 양쪽 다리의 혈류를 비접촉식 레이저 도플러로 측정했다. 혈류 측정은 허혈성 사지의 혈류 대 정상 사지의 혈류의 상대비로 표시했다 (Goto et al. Tokai J Exp Clin Med., Vol. 31, No. 3, pp. 128-132, 2006 참조). MSC + BB로 처리한 제 4그룹에서 일관적으로 가장 우수한 재생 결과를 나타냈다 (도 1). 허혈증의 중증도 육안 평가: 허혈성 사지에 대한 육안 평가는 괴사 면적에 대한 형태학적 등급을 이용하여 수술후 매주 1회 실시하였다 (Goto et al.): 표 2를 참조한다.
표 2 - 괴사 면역의 형태학적 등급
등급 설명
0 괴사 없음
1 발가락에 국한된 괴사 (발가락 손실),
2 발등부로 확장된 괴사 (발 손실),
3 정강이로 확장된 괴사 (무릎 손실)
4 대퇴부로 확장된 괴사 (뒷다리 전체 손실)
사지 기능 및 허혈 손상에 대한 체내 평가. 허혈성 사지의 기능 손상에 대한 반-정량적 평가를 다음과 같은 척도로 수술후 매주 1회 실시했다 (Stabile et al., Circulation. 2003;15;108(2):205-210). 표 3을 참조한다.
표 3 - 사지 기능 평가
등급 설명
0 꼬리의 완만한 수축에 견디기 위한 발가락 구부림
1 발바닥 구부림
2 발 끌기는 없으나 발바닥 구부림도 없음
3 발 끌기
부분적 또는 전체 사지 절단시 "사용할 수 없음"으로 사지 기능을 등급화한다. 이 경우 혈류 측정은 통계 분석에 포함시키지 않았다.
체내 평가에서, 허혈성 사지의 기능 손상에 대한 반-정량적 평가는 등급 분류한 기능 척도를 이용하여 제 7일 내지 최대 제 35일까지 실시했다. 제 14일부터 시작된 사지 기능의 개선은, 대조군 동물 제 1그룹 및 제 2그룹과 대비시, 세포로 처리한 제 4그룹의 동물에서 확인되었다 (도 2a 참조). 이 개선 효과는 허혈 후 제 35일에 제 3그룹 및 제 5그룹의 동물에게서 확인되었다. 시험체를 정맥 투여한 동물에서, 제 28일부터 시작된 사지 기능의 개선은, 대조군 동물 제 6그룹 및 제 7그룹과 대비시, 제 9그룹에서 확인되었다 (도 2b 참조).
실시예 2 - 통계 분석
본 연구의 목적은, 동물 누드 생쥐 모델에서 HLI 증상를 완화하기 위한 치료에 있어서 본 시험 줄기세포의 효능을 시험하는 데 있다.
연구의 종료점(end point)은 다음과 같다: 임상실험 성적; 체중 측정; 혈류 측정 등급 분석: 각 그룹에서 최초 측정된 3개의 종료점 (혈류(%), 사지 기능 및 허혈 중증도 값) 각각에 대해 1 내지 10까지 순위를 정했다. 순위 = 1이 가장 높고 순위 = 10이 가장 낮다. 2개 그룹이 동점이면 양측 모두 "중간" 순위가 되며; 즉, 2개 그룹이 4순위로 동점이면 양측 모두 4.5로 점수를 매진다 (그의 2배가 4순위 및 5순위의 합이 됨). 각 종료점에서, 중간값을 각 그룹에 대해 산출하였다 (극단값이 결과에 영향을 미치지 않도록 하기 위해 중간값을 사용했다). 각 종료점에서, 모든 그룹을 중간값 기준으로 분류하여 각각의 순위를 매겼다. 모든 종료점에 대해 각 그룹별로 평균 순위를 산출했다.
통계적 실험은 SAS®의 복합 모델을 이용하여 실시했다. 2종류의 가장 효율적인 처리방법과 그 외의 방법들을 서로 비교한다. 전체적인 통계실험 결과를 여기에 제공한다: 보고서 및 별지에 기록된 P-값은 다양성을 목적으로 조정하지 않는다. 유의성을 결정하기 위하여, P < 0.0056 를 이용한다. 유의미한 실험 및 무의미한 실험의 해석에 기초하여, 다수의 방식으로 다양한 실험을 조정한다. 이것은 추정 실험이므로, 각 그룹별로 조정 여부를 고려했다. 따라서, 예를 들어, 제 4그룹을 나머지 9개 그룹과 비교하여 유의성 있는 결과가 P < 0.05/9 = 0.0056 인 것을 확인한다.
경사도: 산출된 경사도는 수술시부터 제 35일까지 선형의 추세이다. 각 동물의 단일 숫자는 시간 경과에 따른 종료점의 변화를 나타낸다. 박스 플롯을 이용하여 각 종료점 (체중 제외)에서 각 그룹의 경사도 분포가 제공된다. 이들 플롯으로 단일 그래프 상에서 다수의 그룹을 표현하는 편리한 방법을 제공한다. 플롯은 다음과 같이 판독한다: 25%의 데이터점 (여기에서는, 경사도)이 박스-0 내지 25 백분위값의 하단 모서리 및 저부 사이에 존재하고; 50%의 데이터점이 박스-25 내지 75 백분위값의 저부와 상부 사이에 위치한다. 이는 또한 "사분위 범위" (inter-quartile range, IQR) 라고 한다. 25%의 데이터점은 박스의 상부 및 상단 모서리-75 내지 100 백분위값 사이에 위치한다. 그러나, 상부 및 하부 펜스는 박스의 저부 및 상부로부터 1.5*IQR의 지점으로 한정한다. 이는 플롯 상에서 실제로 확인되지는 않으나 이들 펜스 외부의 값을 플롯외 값으로 간주한다. 그러므로 상단 펜스 위나 하단 펜스 아래에 데이터점이 존재할 경우, 이들은 박스플롯 상에 별도로 표시한다; 다시 말하면, 극단점들은 박스플롯의 하단 및 상단 모서리 사이에 포함되지 않는다.
Figure pct00002
표 4 - 동물 배치
처리 그룹 배치
총합
제외 1 귀속 2 완료 3
N % N % N % N %
(1) DMEM (im) 1 6.7 1 6.7 13 86.7 15 100.0
(2) DMEM+BB (im) 3 17.6 0 0 14 82.4 17 100.0
(3) DMEM에 용해된 BMMSC (im) 0 0 6 40.0 9 60.0 15 100.0
(4) DMEM+BB에 용해된 BMMSC (im) 1 6.7 0 0 14 93.3 15 100.0
(5) DMEM에 용해된 BMMSC, pre-BB (im) 0 0 1 6.7 14 93.3 15 100.0
(6) DMEM (iv) 1 6.7 0 0 14 93.3 15 100.0
(7) DMEM+BB (iv) 1 6.7 0 0 14 93.3 15 100.0
(8) DMEM에 용해된 BMMSC (iv) 0 0 5 33.3 10 66.7 15 100.0
(9) DMEM+BB에 용해된 BMMSC (iv) 0 0 1 6.7 14 93.3 15 100.0
(10) DMEM에 용해된 BMMSC, pre-BB (iv) 2 13.3 7 46.7 6 40.0 15 100.0
총합 9 5.9 21 13.8 122 80.3 152 100.0
1. 다음중 하나에 기인하여 모든 추가 분석에서 제외함:
a) 수술전 또는 수술후 제 14일에 절단 - 모델 탈락.
b) 처리와 무관한 사망.
2. 제 14일 이후, 예, 제 21일부터 개시된 절단은 귀속됨 - 치료 실패.
3. 35일간 계속되면 완료.
추가 분석에서, 손실된 데이터를 다음의 방식으로 귀속시킨다: 혈류(%), 수술후 최초 측정값 (수술 직후 개선점이 관측되지 않아, 치료 실패로 추정함); 허혈 중증도 값: 4 = "전체 뒷다리 손실" (가장 나쁜 값일 수 있음); 사지 기능: 3 = "발 끌기" (가장 나쁜 값일 수 있음); 중량 (g): 절단 당일을 포함하여 측정 시점에서 동물의 최저 무게.
한 쌍의 값을 비교하여, 통계적 관련성이 있으며 그래프 상에서 명확히 도시될 수 있는 방식으로 중간값을 표시한다. 데이터는 종료점에 대해 일관적이며, 또한 다양한 분석에서도 일관성이 있다. 이러한 도면을 얻기 위하여, 중량을 고려하지 않기로 했다. 도식적인 통계값과 시험 결과에 따르면, 중량은 시험 모델의 효능 측정에 큰 의미가 없는 것으로 나타났다. 각 그룹은 나머지 3개의 종료점에 관하여 제 35일에 순위를 매기고 그룹별 평균 순위 - 모든 종료점으로부터 얻은 측정값의 조합 결과를 평가했다
제 35일에 모든 변수들을 함께 평가한다. 절차: 각 변수 (혈류(%), 사지 기능 및 허혈성 중증도)에 있어서, 그룹내 모든 동물의 중간값을 산출했다. 모든 그룹은 1 내지 10의 중간값 (이때 1이 가장 우수함)에 기초하여 다음과 같은 변수 각각에 대해 순위를 매겼다: 혈류 (%)-최고치 1 및 최저치 10; 사지 기능 - 최고치 10 및 최저치 1 (최저 범주는 3이며, 가장 우수한 값은 0); 허혈성 중증도 - 최고치 10 및 최저치 1 (최저 범주는 4이며, 가장 우수한 값은 0); 마지막으로, 각 그룹에 대해 상기 3가지 변수 전체에 대한 평균 순위를 산출했다.
표 5 - 제 35일의 처리 그룹의 순위, 귀속 데이터
그룹 혈류 (%) 사지 기능 허혈성 중증도 평균 순위 인자 * 인자 2**
(4) 처리군: DMEM+BB에 용해된 BMMSC (im) 1 1 1.5 1.2
(5) 처리군: DMEM에 용해된 BMMSC, pre-BB (im) 3 5 1.5 3.2 2.0 2.0
(9) 처리군: DMEM+BB에 용해된 BMMSC (iv) 2 5 6 4.3 3.2 1.2
(3) 양성 대조군:DMEM에 용해된 BMMSC (im) 4 5 6 5.0 3.8 0.7
(2) 음성 대조군: DMEM+BB (im) 6.5 5 6 5.8 4.7 0.8
(7) 음성 대조군: DMEM+BB (iv) 6.5 5 6 5.8 4.7 0.0
(6) 음성 대조군: DMEM(iv) 8 5 6 6.3 5.2 0.5
(1) 음성 대조군: DMEM (im) 9 5 6 6.7 5.5 0.3
(8) 양성 대조군: DMEM에 용해된 BMMSC (iv) 5 9.5 6 6.8 5.7 0.2
(10) 처리군:DMEM에 용해된 BMMSC, pre-BB (iv) 10 9.5 10 9.8 8.7 3.0
처리군당 중간값을 이용함
* 인자: 평균 순위에 있어서 상위 그룹(4)과 차이를 야기하는 변수
** 인자 2 -인접 순위 그룹들의 순위별 차이
상기 표에서, 4가지 순위간 간격을 확인할 수 있다: 제 4그룹 (DMEM+BB에 용해된 BM.MSC (im))이 최상위를 차지하고 제 2순위의 효과를 가진 그룹(5)과 큰 차이가 있다: 평균 순위 = 1.2, 후속 순위 그룹과의 차이는 2이다.
제 5그룹은 제 4그룹보다 훨씬 하측에 있으며 (상기의 표에서 표시한 바와 같이) 또한 그의 후순위 그룹보다 위에 있다. 특히, 제 3순위의 효과를 가진 그룹(9)보다 1.2 순위 위에 있다.
후속의 7개 그룹 (제 9, 3, 2, 7, 6, 1 및 8 그룹)은 3순위 범위에 속하며 최고값 (6.8) 및 최저값 (4.3) 차이가 2.5로서, 이는 제 1위치와 제 3위치 간의 간격 (3.1)보다 작다.
제 10 그룹 (DMEM에 용해된 BM.MSC, pre-BB (iv))은 상기 표에 나타낸 상기의 "7개 그룹의 블록" (제 3순위)의 훨씬 아래에 있다. 제 10 그룹은 특히 다수의 절단 탓에 효과가 없었으며, 무효한 값이 제 35일에 귀속되었다.
표 6에서, 유의성 시험 결과를 나타낸다. 모든 종료점에서 2개의 가장 우수한 그룹을 기타 다른 그룹들과 비교한다.
표 6- 제 4그룹 및 제 5그룹 대 그 밖의 모든 그룹의 쌍별 비교, 귀속 데이터
혈류(%) 사지 기능 허혈성 중증도
처리 그룹 (4) (5) (4) (5) (4) (5)
(1) 음성 대조군: DMEM (im) <.0001 <.0001 0.0014 0.9614 0.0208 0.2723
(2) 음성 대조군: DMEM+BB (im) <.0001 <.0001 <.0001 0.2760 0.0509 0.4688
(3) 앙성 대조군: DMEM에 용해된 BM.MSC(im) <.0001 0.0034 <.0001 0.4911 <.0001 0.0008
(4) 처리군:DMEM+BB에 용해된 BM.MSC (im) - 0.0001 - 0.0010 - 0.2036
(5) 처리군: DMEM에 용해된 BM.MSC , pre-BB (im) 0.0001 - 0.0010 - 0.2036 -
(6) 음성 대조군: DMEM (iv) <.0001 <.0001 <.0001 0.0709 0.0025 0.0660
(7) 음성 대조군: DMEM+BB (iv) <.0001 <.0001 <.0001 0.0208 <.0001 0.0050
(8) 양성 대조군: DMEM에 용해된 BM.MSC (iv) 0.0002 0.9142 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001
(9) 처리군:DMEM+BB에 용해된 BM.MSC (iv) 0.0002 0.9442 <.0001 0.4314 0.0003 0.0137
(10) 처리군:DMEM에 용해된 BM.MSC, pre-BB (iv) <.0001 0.7473 <.0001 <.0001 <.0001 <.0001
참고: 0.05 미만의 P-값은 밑줄로 표시함
혈관신생 손상은 허혈성 질환의 특징 중 하나이다. 그러나, 허혈증을 완화시키는 임상 실험은 그 결과가 실망스러웠으며, 이는 허혈성 질환을 치료하기 위한 새로운 분자 및 치료 타겟이 필요함을 나타낸다. 줄기세포 치료법은 현재 심혈관계 약제에 있어 바람직한 접근이다. 허혈성 조직에서의 줄기세포의 치료 활성을 평가하기 위하여, 마우스 뒷다리 허혈 모델을 사용한다.
여기서는 동물 마우스 모델에서 MSCs가 재생능력을 나타내며, 반면에 블렙비스타틴 단독으로는 유익한 효과를 얻을 수 없다는 점을 개시한다. 이는 상기 모델을 통해 입증되었다. 이들 실험에서, 시험 세포를 단일 정맥 주사나 허혈성 사지에 국소 투여로 예상 밖의 놀라운 효과를 나타냈으며, 즉, 혈액 관류가 정상값의 약 65 내지 84% 까지 회복되었다. 마우스 뒷다리 허혈 모델에서, 혈류 회복은 사지 기능 개선, 허혈 중증도 감소 및 지연 등 다른 결과와도 양립하였다. 이 효과는 시험 세포로 국소 처리한 그룹들 (제 4그룹 및 제 5그룹) 또는 정맥 주사한 그룹 (제 9그룹)에서 얻어졌다.
블렙비스타틴은 손상 조직의 MSC-유발 재생작용을 현저히 촉진시켰다. 블렙비스타틴을 MSCs와 함께 응용하면, 제 4그룹 (DMEM + BB에 용해된 BM.MSC (im))에서 뚜렷이 확인되는 바와 같이, 치유시 심각한 합병증을 대폭 감소시킬 수 있으며, 혈류(%) 및 사지 기능에 있어서 제 5그룹(DMEM에 용해된 BM.MSC, pre-BB (im))을 포함한 다른 모든 그룹들보다 훨씬 효과적이다. 또한, 블렙비스타틴은 치유중 심각한 합병증을 감소시킴으로써 MSCs의 재생능을 현저히 개선한다.
제 4그룹 (DMEM + BB에 용해된 BM.MSC (im))은 혈류(%) 및 사지 기능에 있어서 제 5그룹(DMEM에 용해된 BM.MSC, pre-BB (im))을 포함한 다른 모든 그룹들보다 훨씬 효과적이다.
여기에서 얻은 결과로부터, 블렙비스타틴의 존재하에 BM.MSC을 응용할 경우 근육주사 투여시 큰 효능을 얻을 수 있음을 확인하였다. 상기와 같이 조합하여 사용하면 병변이 훨씬 빨리 회복하므로 가장 효과적인 치료가 된다. 가장 우수한 그룹에서는 비교적 변동폭이 작아 동물들에 미치는 효능이 일관성 있음을 나타낸다. 별도의 언급이 없을 경우, 여기서 사용한 모든 기술용어 및 과학 용어와 머릿글자는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 자식을 가진 자가 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 여기에 기술한 바와 유사하거나 균등한 정보를 전달하기 위해 사용하는 조성물, 방법, 키트 및 기타 수단들을 이용하여 본 발명을 실시할 수 있으나, 여기에서는 정보 전달을 위한 보다 바람직한 조성물, 방법, 키트 및 수단에 대해 기술하였다.
여기서 인용한 모든 참고문헌은 법으로 허용한 한도에서 전문을 참조로 수록하였다. 이들 문헌은 단지 저자들이 주장한 내용을 요약하기 위하여 검토하였다. 문헌 (또는 문헌 내용 중 일부)은 모두 종래 기술에 관한 것으로 사용 허가를 받을 필요가 없다. 출원인은 종래 인용 문헌의 정확성 및 적합성에 대해 동물 면역성을 검사할 권리가 있다.

Claims (16)

  1. 세포군 및 비근육 미오신 II 길항제를 포함하는, 줄기세포 치료법을 이용한 치료에 순응할 수 있는 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 질환은 당뇨병의 결과인 질환, 죽상 동맥경화증의 결과인 질환, 혈관계 질환, 말초동맥 질환 (peripheral artery disease, PAD)으로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 질환은 대략 또는 0.9 미만의 발목 상완압력 지수, 또는 대략 또는 0.7 미만의 발목 상완압력 지수와 관련이 있는 조성물.
  4. 제 1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환은 심각한 사지 허혈을 가져오거나 및/또는 상기 질환은 피부 궤양이나 괴저를 가져오는 조성물.
  5. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포군의 일부는 만능세포를 포함하고, 및/또는 상기 만능세포는 유도 만능 줄기세포이거나, 및/또는 상기 세포군은 다분화능 세포를 포함하고, 및/또 상기 다분화능 세포는 다분화능 기조직 세포 또는 중간엽 줄기세포이거나, 및/또는 상기 다분화능 세포는 유도 만능 줄기세포로부터 유래되는 조성물.
  6. 제 1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 사지 기능이, 상기 조성물을 수용하지 않은 동일한 환자와 비교시, 대략 또는 적어도 2 내지 3등급 향상되거나, 및/또 환자의 사지 혈류가, 치료되지 않은 사지 혈류의 대략 또는 적어도 65% 내지 85%로 향상되거나, 및/또는 환자의 허혈 손상이 상기 조성물을 수용하지 않은 동일한 환자와 비교시, 대략 또는 적어도 2, 3 또는 4등급 향상되는 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비근육 미오신 II 길항제는:
    비근육 미오신 II 유전자 및/또는 단백질 발현을 현저히 감소시키는 것을 타겟으로 한 siRNA;
    siRNA를 암호화하는 DNA 벡터;
    비근육 미오신 II 유전자 및/또는 단백질 발현을 현저히 감소시키는 것을 타겟으로 한 miRNA 또는 항감지 RNA;
    안지오텐신 II 수용체 길항제 또는 안지오텐신 수용체 차단제;
    안지오텐신-전환-효소(ACE) 억제제, 2,3-부탄디온-2-모노옥심(BDM), 블렙비스타틴, 또는 이들의 유사체, 유도체 또는 변형체;
    피롤리돈 유도체; 및
    피롤리돈류로부터 나온 분자로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  8. 줄기세포 치료법을 이용한 치료에 순응할 수 있는 질환의 치료용 키트로서,
    a. 비근육 미오신 II 길항제;
    b. 선택적으로, 약제학적 수용가능한 담체;
    c. 선택적으로, 심혈관 질환으로 진단받은 환자에게 상기 항목 (a) 내지 (c)를 투여하는 것에 관한 지시설명서; 및
    d. 다분화능 세포군을 포함하는 키트.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 세포는 MSCs인 키트.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 비근육 미오신 II 길항제는 블렙비스타틴인 키트.
  11. 줄기세포 치료법을 이용한 치료에 순응할 수 있는 질환을 치료하기 위한 것으로서, 다분화능 세포군; 및 비근육 미오신 II 길항제를 포함하는 줄기세포 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 세포는 MSCs인 줄기세포 조성물.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 비근육 미오신 II 길항제는 블렙비스타틴인 줄기세포 조성물.
  14. 줄기세포 치료법을 이용한 치료에 순응할 수 있는 질환의 치료를 위한 줄기세포 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 조성물은 다분화능 세포군; 및 비근육 미오신 II 길항제를 포함하고, 상기 다분화능 세포군 및 NM II 길항제를 환자에 투여하기에 앞서 소정 기간 동안 함께 배양하는 것을 포함하는 제조방법.
  15. 다분화능 세포군; 및 비근육 미오신 II 길항제를 포함하고, 치유에 순응할 수 있고, 줄기세포 치료법을 이용한 치료에 순응할 수 있는 질환의 치유 과정에서 사용하기 위한 조성물로서, 상기 비근육 미오신 II 길항제가 결핍된 동일 조성물보다 더욱 신속하게 질환을 치유할 수 있는 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 세포는 MSCs이고, 및/또는 상기 NM II 길항제는 블렙비스타틴이고, 및/또는 상기 질환은 심혈관 질환인 조성물.
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