CN111405898B - 一种破坏细胞机械稳态以及促进组织器官的再生修复的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种破坏细胞机械稳态的方法及其应用，尤其是涉及一种使用Myosin抑制剂破坏细胞机械稳态导致细胞软化降低组织器官纤维化的方法。以及一种促进组织器官的再生修复的方法及其应用。Myosin抑制剂能破坏细胞机械应力系统稳态，降低病理状态下组织器官的刚性，激发类似于低等生物再生过程中的应激反应和再生反应，利用这些特征极大抑制器官损伤过程中的纤维化，促进组织器官的再生修复。同时利用应激反应极大提高细胞遗传修复能力。其中所述Myosin抑制剂优选为(‑)‑Blebbistatin或其衍生物(‑)‑Blebbistatin O‑Benzoate。所述方法只需单个小分子或单因素处理，操作简单，重复性好，可作为激发应激反应、激发再生反应、提高细胞遗传修复能力和/或促进组织器官的再生修复的一种新方法。

Description

一种破坏细胞机械稳态以及促进组织器官的再生修复的方法 及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种破坏细胞机械稳态的方法及其相关应用，本发明还涉及一种促进组织器官的再生修复的方法及其相关应用。
背景技术
多细胞生物机体组织、器官由实质细胞和间质细胞及其分泌的胞外基质构成。实质细胞是指组织、器官的主要的结构和功能细胞(如脑的实质细胞就是神经元，肝脏实质细胞是肝细胞)，间质细胞和细胞外基质构成组织和器官的间质部分(主要有间质细胞、胶原蛋白、层黏连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、糖胺聚糖)，主要发挥机械支撑和连接作用，胞外基质构成和维持细胞生理活动的微环境，是细胞与细胞之间的进行信号传导的桥梁，参与并调控多种生理病理过程，在组织创伤修复、再生及纤维化过程中起重要作用。
低等生物再生过程中，损伤导致一个迅速的应激发应，一系列应激蛋白如热休克蛋白家族表达上调，应激反应在损伤24小时内发生；在受损后的第2-2.5天引发再生发应，一些再生起始相关基因和组织特化的基因上调；在再生最后阶段特定分化的组织细胞出现，再生出新的组织。
进化的原因，哺乳动物具有非常有限的再生能力。高等哺乳动物的组织细胞损伤后会引起组织细胞发生变性、坏死并伴随炎症反应。如果损伤很小，损伤的组织细胞周边正常的实质细胞将会发生增生修复，从而完全恢复正常的组织结构和功能。然而如果在较大损伤或反复损伤超出了周围实质细胞的再生修复能力时，为了防止流血过多和降低感染的风险，机体产生剧烈的应激保护机制产生凝血反应、免疫反应和炎症反应，并促进间质部分的纤维结缔组织(细胞外基质)将大量增生对缺损的组织进行修复，伴随发生纤维化的病理改变。尽管增生的纤维结缔组织虽然修复了缺损，以最大程度的保护了组织器官的相对完整性，但这种修复不仅抑制正常的再生修复使得这种修复无法具有原来器官的结构和功能。甚至会由于这种过度、过强和失控的修复反应导致器官的纤维化、硬化从而功能丧失。
在全世界范围内，组织器官的纤维化是许多疾病致残、致死的主要原因，组织器官纤维化在人体各主要器官的相关疾病的发生和发展过程中均起着重要作用。据有关统计资料显示，美国因各种疾病而致死的病人中，有接近45％可以归于组织器官纤维增生疾病。因此控制哺乳动物的纤维化进程是治疗多种疾病一个重要思路。
应力纤维是真核细胞中广泛存在的微丝束结构，由大量平行排列的微丝组成，与细胞间或细胞与基质表面的粘着有密切关系，在细胞形态发生、细胞分化和组织的形成等方面具有重要作用。其成分为肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α辅肌动蛋白。由应力纤维、胞外基质、细胞膜受体(如整合素)、核骨架和细胞骨架的链接器复合体、核纤层、染色体骨架等构成细胞主要的机械应力系统。机械应力系统赋予细胞机械硬度调控，参与细胞内外机械力的感应、传递和产生，调节遗传物质的组装、分布和表达。机械应力系统稳态是特定细胞特征性的指标之一。细胞机械应力系统稳态有助于维持和建立特定细胞属性，维持和稳定细胞特定遗传调控与表达特征，打破细胞机械稳态作为一种细胞损伤即激发细胞应激发应，激发强的细胞损伤修复能力。
本发明利用一种无丢失无流血的方式通过破坏细胞机械应力系统稳态，破坏了细胞机械硬度，软化了细胞，提高了细胞命运的可重塑性，在特定的条件下类似于干细胞可转换为不同命运的细胞。
本发明还利用一种无丢失无流血的方式通过破坏细胞机械应力系统稳态，激发了类似于低等生物再生过程中的应激反应和再生反应，利用应激反应可极大提高了细胞遗传修复能力。由于本发明处理简单，可作为提高哺乳动物在病变损伤过程中动员体在体体细胞参与细胞更新、抑制组织纤维化、提高组织修复及器官再生能力的一种新方法。也可作为提高细胞本底同源重组能力和双链断裂介导的同源重组能力的新手段。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：Myosin抑制剂能破坏细胞机械应力系统稳态，破坏细胞机械硬度，导致细胞软化，降低组织器官纤维化，进而完成了本发明。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及Myosin抑制剂在破坏细胞机械应力系统稳态中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在破坏细胞机械硬度中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在软化细胞中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在降低组织、器官纤维化中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在制备用于破坏细胞机械应力系统稳态的药物或试剂中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在制备用于破坏细胞机械硬度的药物或试剂中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在制备用于软化细胞的药物或试剂中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在制备用于降低组织、器官纤维化的药物或试剂中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在制备用于治疗与细胞机械应力系统稳态紊乱、细胞机械硬度紊乱或组织、器官纤维化相关的疾病的药物或试剂中的应用。
在一个实施方案中，所述Myosin抑制剂为(-)-Blebbistatin，缩写Ble或Bleb或Blebb。
在一个实施方案中，所述Myosin抑制剂为(-)-Blebbistatin O-Benzoate，缩写为S-Bleb-OB。
在本发明中使用的(-)-Blebbistatin(也表示为(S)-(-)-Blebbistatin或S-Bleb)是一种细胞渗透性抑制剂，作用于非肌球蛋白IIATPase，其不抑制肌球蛋白轻链激酶，抑制卵裂沟的缢缩，不干扰有丝分裂或收缩环的组装，其结构式如式(I)所示，分子量为292.33。
在本发明中使用的(-)-Blebbistatin O-Benzoate(也表示为(S)-(-)-Blebbistatin O-Benzoate或S-Bleb-OB)是(-)-Blebbistatin的衍生物，其结构式如式(II)所示。
Figure GPA0000288509830000061
在一个实施方案中，所述纤维化为任何组织或器官的纤维化。
在一个实施方案中，所述纤维化为肝纤维化、肺纤维化、肌纤维化、皮肤疤痕或神经组织疤痕。
在一个实施方案中，所述肝纤维化为酒精性肝炎的引起肝纤维化、病毒性肝炎引起的肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎引起的肝纤维化、毒素或药物引起的肝纤维化、自身免疫性肝病引起的肝纤维化、肝淤血引起的肝纤维化、遗传代谢性疾病引起的肝纤维化或者其他病因引起的肝纤维化。
在一个实施方案中，所述肺纤维化为多种原因引起的肺纤维化，包括吸进无机粉尘、放射线损伤、吸进有机粉尘、药物损伤等原因导致的肺纤维化以及特发性肺纤维化。
在一个实施方案中，所述肌纤维化为遗传因素或先天因素导致的肌纤维化。
在一个实施方案中，所述皮肤疤痕为物理、生物、化学等因素的皮肤损害或遗传因素导致的皮肤纤维化。
在一个实施方案中，所述神经组织疤痕为机械损伤、缺氧、低血糖、感染、中毒等引起的中枢神经系统的损伤而导致胶质细胞增生等因素导致的神经组织纤维化。
在一个实施方案中，所述中枢神经系统包括脑组织或脊髓。
本发明的方法只需单个小分子或单因素处理，操作简单，重复性好，可作为提高哺乳动物在病变损伤过程中抑制组织、器官纤维化的一种新方法。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：Myosin抑制剂能破坏细胞机械应力系统稳态，激发类似于低等生物再生过程中的应激反应和再生反应，利用应激反应极大提高细胞遗传修复能力，进而完成了本发明。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及Myosin抑制剂在激发应激反应中的应用。
在一个实施方案中，本发明涉及Myosin抑制剂在通过破坏细胞机械应力系统稳态来激发应激反应中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在激发再生反应中的应用。
在一个实施方案中，本发明涉及Myosin抑制剂在通过破坏细胞机械应力系统稳态来激发再生反应中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在提高细胞遗传修复能力中的应用。
在一个实施方案中，本发明涉及Myosin抑制剂在通过破坏细胞机械应力系统稳态来提高细胞遗传修复能力中的应用。
在一个实施方案中，所述激发应激发应导致激活高的遗传损伤修复发应，进而提高本体同源重组修复基因的上调，提高重组能力。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在促进组织器官的再生修复中的应用。
在一个实施方案中，本发明涉及Myosin抑制剂在通过破坏细胞机械应力系统稳态来促进组织器官的再生修复中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在制备用于激发应激反应、激发再生反应、提高细胞遗传修复能力和/或促进组织器官的再生修复的药物或试剂中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在制备用于通过破坏细胞机械应力系统稳态来激发应激反应、激发再生反应、提高细胞遗传修复能力和/或促进组织器官的再生修复的药物或试剂中的应用。
在一个实施方案中，本发明还涉及Myosin抑制剂在制备用于治疗与应激反应、再生反应、细胞遗传修复能力和/或组织器官的再生修复相关的疾病的药物或试剂中的应用。
在一个实施方案中，所述疾病为硬皮病。
在一个实施方案中，所述Myosin抑制剂为(-)-Blebbistatin，缩写Ble或Bleb或Blebb。
在一个实施方案中，所述器官为肝。
本发明的方法只需单个小分子或单因素处理，操作简单，重复性好，可作为激发应激反应、激发再生反应、提高细胞遗传修复能力和/或促进组织器官的再生修复的一种新方法。
在一个实施方案中，本发明涉及一种破坏细胞机械应力系统稳态、破坏细胞机械硬度、软化细胞或者降低组织或器官纤维化的方法，其包括：向有所需要的受试者给药Myosin抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗与细胞机械应力系统稳态紊乱、细胞机械硬度紊乱或者组织或器官纤维化相关的疾病的药物，其包括：Myosin抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种激发应激反应、激发再生反应和/或提高细胞遗传修复能力的方法，其包括：向有所需要的受试者给药Myosin抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种促进组织器官的再生修复的方法，其包括：向有所需要的受试者给药Myosin抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗与应激反应、再生反应和/或细胞遗传修复能力相关的疾病的方法，其包括：向有所需要的受试者给药Myosin抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于激发应激反应、激发再生反应和/或提高细胞遗传修复能力的药物，其包括：Myosin抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种促进组织器官的再生修复的药物，其包括：Myosin抑制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗与应激反应、再生反应和/或细胞遗传修复能力相关的疾病的药物，其包括：Myosin抑制剂。
附图说明
图1显示Myosin抑制剂破坏细胞机械系统稳态并诱导细胞软化的图。
图2示出细胞软化在抑制CCl4诱导轻度肝纤维化中的应用，以及Myosin的抑制剂诱导的应激反应在治疗CCl4诱导轻度肝损伤修复中抑制纤维化、促进再生修复的应用。图2A显示治疗慢性轻度肝纤维化模型中的给药方案。图2B显示天狼星红免疫组织化学(左)和CCl4诱导的轻度肝损伤模型的肝组织天狼星红染色的定量分析(右)(n＝3只小鼠用于油处理组，n＝5只雌性小鼠用于CCl4造模组)。图2C显示H&E(上图)和天狼猩红(下图)免疫组织化学分析治疗效果(n＝6只小鼠每组)。图2D偏正光分析天狼星红染色结果。数据表示为平均值+SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(学生t-检验)。
图3示出细胞软化在抑制CCl4诱导的慢性重度肝纤维化中的应用，以及Myosin的抑制剂诱导的应激反应在治疗CCl4诱导慢性重度肝损伤修复中抑制纤维化、促进再生修复的应用。图3A显示治疗慢性重度肝纤维化模型中的给药方案。图3B天狼星红染色分析CCl4造模效果(n＝5只小鼠用于油处理组，n＝4只小鼠用于CCl4造模组)。图3C-3D分别用天狼星红组化染色和一型胶原免疫荧光染色分析治疗效果(3C，n＝每组至少5只小鼠；3D，n＝每组3只小鼠)。图3E-3F显示从转录水平分析纤维化相关指标在治疗过程中的变化(n＝每组3只小鼠，显著性分析来至于RNAseq数据)。数据表示为平均值±SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(学生t-检验)。
图4示出细胞软化抑制组织纤维化、促进肝细胞增殖、促进肝脏再生，以及Myosin的抑制剂诱导的应激反应抑制组织纤维化促进肝细胞增殖促进肝脏再生。图4A血生化分析治疗组与对照组中肝损伤及肝功能相关的指标(n＝每组3只小鼠)。图4B利用Alb Cre小鼠示踪肝细胞在治疗组和对照组中ALB蛋白的表达情况。图4C通过共染ALB与Ki-67分析治疗组和对照组中肝细胞增殖情况。图4D利用TUNEL染色分析治疗组和对照组肝组织凋亡情况。图4E转录水平定量治疗组和对照组肝组织肝功能相关的指标(n＝每组3只小鼠)。数据表示为平均值±SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图5示出细胞软化降低肝损伤过程中的组织器官硬化中的应用，以及Myosin的抑制剂降低肝损伤过程中的组织刚性。图5A，利用Mark 10ESM303测量治疗前后新鲜肝脏组织的机械刚性(WT组，n＝4只小鼠，n＝至少6只小鼠其它组)。图5B，利用二次谐波活体扫描治疗组与对照组纤维的含量及拓扑分布(n＝每组5只小鼠)。数据表示为平均值+SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(学生t-检验)。
图6示出细胞软化在抑制胆管结扎诱导的肝纤维化中的应用，以及Myosin的抑制剂诱导的应激反应在胆管结扎的肝损伤中的应用。图6A，Bleb治疗胆管结扎诱导肝损伤的流程图。图6B，治疗组与对照组小鼠状态。图6C显示在治疗15天，天狼星红组化染色及αSMA免疫荧光分析胶原纤维堆积及肌成纤维细胞活化的情况(天狼星红，n＝每组6只小鼠；αSMA，n＝每组至少4只小鼠)。图6D显示在治疗30天，天狼星红组化染色显示胶原纤维堆积情况(n＝每组至少3只小鼠)。图6E显示在治疗组和对照组中肝组织细胞增殖情况。数据表示为平均值+SD。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(学生t-检验)。
图7示出细胞软化抑制皮肤纤维化及其在治疗硬皮病中的应用，以及Myosin的抑制剂诱导的应激反应在治疗硬皮病中的应用。图7A显示Bleb治疗博来霉素诱导硬皮病的流程图。图7B治疗7天皮肤结构变化情况。图7C治疗后黑色素存积与新毛发生长情况。图7D H&E组化及Masson染色分析硬化区皮肤结构及纤维堆积情况。图7E分析治疗后硬化区表皮和真皮厚度(n＝每组至少3只小鼠)。图7F分析治疗后硬化区毛囊数目(n＝每组至少3只小鼠)。图7G分析治疗后硬化区增殖情况。图7H鉴定毛囊与腺体再生情况。图7I鉴定毛囊增殖情况。图7J-K免疫荧光分析FGF9及NeuN的表达。
图8：细胞软化在抑制肺纤维化中的应用。图8A显示Bleb治疗博来霉素诱导肺纤维化的流程图。图8B显示Bleb治疗显著提高肺纤维化小鼠的存活率。图8C-8D小动物CT成像显示Bleb治疗显著抑制非体积降低。图8E上图苏木精-伊红染色法(HE)显示Bleb治疗缓解肺损伤程度。图8E下图天狼星红染色(Sirus Red)显示Bleb治疗缓解肺纤维化。
图9(A)～(C)显示了Myosin抑制剂破坏细胞机械系统稳态破坏诱导再生相关的应激发应及再生起始与组织发生相关反应。
图10示出(-)-Blebbistatin激发应激发应激活的高的遗传损伤修复发应，提高本体同源重组修复的基因上调。图10(A)显示5-50微摩尔(-)-Blebbistatin处理人的成纤维细胞，6小时转录组分析，DNA复制相关、同源重组相关基因，错配修复相关基因、核苷酸切除修复及碱基切除修复基因显著上调。图10(B)显示进一步分析发现几乎所有参与同源重组相关重要基因都显著上调。
图11(A)～(E)示出(-)-Blebbistatin激发应激反应激活的高的遗传损伤修复发应，在提高本体同源重组修复的基因过程中的应用。显示激发应激反应伴随的高的遗传损伤修复反应提高本底同源重组基因修复过程的图。
图12(A)～(C)示出Myosin的抑制剂激发应激反应在促进人肝细胞体外扩增中的应用。
图13(A)～(F)示出Myosin的抑制剂抑制TGF-β1诱导小鼠星形细胞mHSCs向肌成纤维转化及胞外基质合成，其中，图13(A)示出实施例9-1的具体方案，图13(B)中没有TGF-β1诱导组作为阴性对照(Control)，标记为“Con”，TGF-β1诱导组分别DMSO和Bleb处理记为“TGFB+DMSO”，“TGFB+Bleb”I为免疫荧光染色结果，II为定量PCR鉴定结果。三次重复，图13(C)显示了Bleb显著抑制TGF-β1诱导小鼠MEFs向肌成纤维转化及胞外基质合成，图13(D)显示了Bleb显著抑制TGF-β1诱导小鼠不同脏器原代间质细胞向肌成纤维转化及胞外基质合成，在图13(E)中没有TGF-β1诱导组作为阴性对照(Control)，标记为“Con”，TGF-β1诱导组分别DMSO和Bleb处理记为“TGFB+DMSO”，“TGFB+Bleb”，三次重复。图13(F)和图13(G)显示出不同的化合物包括Bleb和S-Bleb-OBd等对于对TGF-β1诱导肌成纤维活化的抑制作用。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如本文所用，就特定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。
如在本说明书中所使用的，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的，当与单词“包含”一起使用时，单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。
在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
贯穿本申请，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化，该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。
在本文中，“分化”是较不特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。“去分化”是这样的细胞过程，其中部分或终末分化的细胞回复到更早期发育阶段，如多能性或多潜能性。“转分化”是将一种分化细胞类型转化为另一种分化细胞类型的过程。典型地，通过编程发生转分化而细胞不经过中间多能性阶段-即，细胞直接从一种分化细胞类型编程为另一种分化细胞类型。
如本文所用，术语“受试者”或“有需要的受试者”是指任何年龄的雄性或雌性的需要细胞或组织移植的哺乳动物，优选人。通常，受试者需要细胞或组织移植(在本文中也称为受体)，这是由于适合经由细胞或组织移植治疗的病症或病理或不期望的状况、状态或综合征或身体、形态学或生理学异常。
在本文中涉及的一些术语的定义如下：
BMP4：骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein，bmp4)。
高糖DMEM：一种高糖型DMEM培养基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)，即一种含各种葡萄糖和氨基酸的商品化的培养基，在MEM培养基的基础上研制的。
N2B27：一种以DMEM/F12基础培养基和neurobasal基础培养基以1∶1混合而成，包含N2添加剂和B27添加剂的成分明确的细胞培养液，报道有利于小鼠胚胎干细胞向神经方向分化。
DMEM/F12：一种以DMEM培养基和F12培养基1∶1混合而成的商品化的基础培养液，适于克隆密度的培养。
Neurobasal：有利于神经细胞培养的商品化基础培养基。
GlutaMAX：一种细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的L-谷氨酰胺。
双抗：青霉素和链霉素是细胞培养常用的两种抗生素，防止细胞培养过程中的细菌污染。
N2添加剂：一种商品化无血清的细胞培养添加剂。
B27添加剂：一种商品化无血清的细胞培养添加剂。
KOSR：商品化血清替代物(Knockout serum replacement，KOSR)。
CHIR99021：一种GSK-3α/β抑制剂，常用作Wnt信号通路激活剂。
A83-01：一种具有选择性的TGF-β抑制剂，能够显著抑制ALK4，ALK5和ALK7的活性。
CCl4：四氯化碳，一种有机化合物，作为诱导肝损伤的试剂。
博来霉素：一种化疗药物，作为诱导皮肤硬皮病和肺纤维化模型的试剂。
Sirius Red：天狼星红，一种强酸性染料与胶原分子结合一起后加强双折光现象，使不同颜色和形态的胶原纤维得以区分。
Masson染色：一种鉴定胶原纤维的方法，由两种或三种阴离子染料混合，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。用来显示组织中纤维以及炎性因子的染色方法之一。
α-SMA：α平滑肌肌动蛋白，又称Acta2，在纤维化组织，作为肌成纤维细胞(主要的合成分泌胶原纤维等胞外基质的细胞)的标记蛋白，用来鉴定肌成纤维细胞的活化。正常生理也表达于血管平滑肌细胞。
DMSO：二甲基亚砜，一种有机溶剂。
PEG400：聚乙二醇400，为液体、它具有与各种溶剂的广泛相容性，是很好的溶剂和增溶剂，被广泛用于液体制剂，如口服液、滴眼液等。
Tween 80：失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚，用做注射液及口服液的增溶剂或乳化剂。
本发明涉及Myosin抑制剂在破坏细胞机械应力系统稳态、破坏细胞机械硬度、软化细胞或者降低组织或器官纤维化中的应用。
在本发明一个具体的实施方式中，器官纤维化是例如肝纤维化。肝纤维化是一个在病理生理过程中由各种生理及致病因子所致肝内结缔组织异常增生并伴随肝组织大量胞外基质存积。任何类型的肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都伴随有不同程度的肝纤维化，如果损伤因素长期不能去除，不仅影响肝再生修复及肝脏正常功能，而且纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化甚至肝癌。抗肝纤维化的治疗主要包括：针对原发病去除致病因素，如，抗各类肝炎病毒治疗，抗寄生虫如血吸虫治疗，戒酒及养成良好的生活习惯等。在针对纤维化本身的治疗，可以通过抑制炎症、脂质过氧化，或者抑制肝星状细胞的增生活化及促进胶原降解等。但目前在临床上仍然没有安全有效的手段治疗和预防肝纤维化手段。因此急切需要寻找和开发新的抗纤维化靶点及其调控手段。在本文中，对于导致肝纤维化的原因没有具体的限定，例如肝纤维化为酒精性肝炎的引起肝纤维化、病毒性肝炎引起的肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎引起的肝纤维化、毒素或药物引起的肝纤维化、自身免疫性肝病引起的肝纤维化、肝淤血引起的肝纤维化、遗传代谢性疾病引起的肝纤维化或者其他病因引起的肝纤维化。而本申请采用抑制Myosin破坏细胞骨架稳态，实现了软化细胞，并验证了mysoin的小分子化合物抑制剂，例如(-)-Blebbistatin(缩写为Ble，Bleb或Blebb)或(-)-Blebbistatin O-Benzoate能在多种类型的肝损伤模型中抗纤维化及促进再生修复的效果。
本发明显示利用Myosin抑制剂能够显著抑制轻度的肝损伤过程中的肝纤维化。本发明显示利用Myosin抑制剂能够显著抑制慢性重度的肝损伤过程中的肝纤维化。本发明显示利用Myosin抑制剂能够显著促进肝损伤后细胞增殖，减少肝损伤过程中的细胞凋亡。本发明显示Myosin抑制剂通过抑制肝损伤纤维化、促进肝细胞增殖和减少细胞凋亡促进肝脏再生，从而维持肝功能。进一步，本发明显示利用Myosin的抑制剂诱导的应激反应抑制组织纤维化、促进肝细胞增殖促进肝脏再生。本发明显示利用Myosin的抑制剂能够降低肝损伤过程中的组织刚性。
进一步本发明显示利用Myosin的抑制剂能够显著抑制胆管结扎造成的胶原纤维的存积、促进胆管结扎过程中肝细胞增殖。
在发明的一个具体的实施方式中，器官纤维化是指肺纤维化，肺纤维化是由成纤维细胞增殖及大量细胞外基质堆积并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征病理性改变，即是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常(疤痕形成)。肺纤维化会严重影响人体呼吸功能，表现为各种呼吸困难并随着病情、肺部损伤的加重及患者呼吸功能不断恶化。据报道特发性肺纤维化在世界范围内的发病率和死亡率逐年增加，诊断后的平均生存期不到3年，高于大多数肿瘤，因此又被称为一种“类肿瘤疾病”。因此找到能有效抑制肺纤维化的新靶点及药物在治疗和预防肺纤维化相关疾病具有重要的应用价值。在本发明中，对于导致肺纤维化的原因没有进一步的限定，本发明所指的肺纤维化为多种原因引起的肺纤维化，包括吸进无机粉尘、放射线损伤、吸进有机粉尘、药物损伤等原因导致的肺纤维化以及特发性肺纤维化。
在本发明中，利用Myosin抑制剂能够抑制肺损伤过程中的组织损伤及纤维化。
本发明涉及Myosin抑制剂在制备用于治疗与应激反应、再生反应和/或细胞遗传修复能力相关的疾病的药物或试剂中的应用。在一个具体的实施方式中，与组织器官的再生修复相关的疾病为硬皮病。在本发明中，利用Myosin抑制剂可以促进硬结区黑色素存积及新生毛发生长，显著降低间质纤维的存积，促进毛囊或腺体的数目。在本发明中，利用Myosin抑制剂可以促进毛囊细胞增殖，从而促进毛囊形。进一步，在本发明中，利用Myosin抑制剂可以治疗硬皮病。
在本发明中，利用Myosin抑制剂能够使得与一般应激响应相关的基因的表达上调，能够使再生起始相关基因如FST和神经发生相关基因的明显上调。
在本发明中，利用Myosin抑制剂能够显著上调DNA复制相关、同源重组相关基因，错配修复相关基因、核苷酸切除修复及碱基切除修复基因的表达。
实施例
以下通过具体实施例来详细阐述和说明本发明的实施方式，但以下内容不应理解为对本发明作任何限制，实施例中采用的物质等如果没有特殊说明均为市售产品。
实施例1：Myosin抑制剂破坏细胞机械系统稳态并诱导细胞软化
图1A为激光共聚焦扫描示意图，图1B显示DMSO(对照)，(-)-Blebbistatin(也简称为Blebbistatin或Ble)(20微摩尔)处理人的成纤维细胞，鬼笔环肽换染色，对照组(上一行)细胞具有丰富的平行排列的应力纤维，细胞核边缘光滑呈圆形或椭圆形，实验组Ble处理后应力纤维解体，细胞核出现褶皱呈不规则。图1C显示核纤层蛋白A/C在DNA外围有较强的均匀分布，在基底-舌尖方向上有明显的极性，舌尖部分核纤层蛋白A/C明显高于基底部分。异染色质HP1蛋白显示对照组明显强于实验组。图1D结果显示实验组大于90％的细胞中应力效应蛋白YAP1/TAZ核定位信号明显强于胞质定位，而实验组药物处理只有35％的细胞有较明显的和定位。图1E定量PCR测定细胞机械硬度调控相关的蛋白在小分子处理后均明显下调。利用氟代尿嘧啶核苷标记核糖体转录RNA，如图1F显示对照组转录活性区主要集中于靠近细胞核中心，实验组则显示氟代尿嘧啶核苷标记活跃转录区在靠近细胞核外围也有分布，三次生物学重复。免疫荧光染色Bleb对表观遗传的影响，结果如图1G显示Bleb在第4天显著降低H3K27三甲基化的修饰，进一步验证H3K27三甲基化的修饰复合体成分EZH2发现对照组EZH2明显核定位，Ble处理EZH2蛋白水平下调且显示为胞质定位，如图1H所示。
实施例2：细胞软化抑制肝纤维化在治疗肝纤维化相关疾病中的应用
肝纤维化是一个在病理生理过程中由各种生理及致病因子所致肝内结缔组织异常增生并伴随肝组织大量胞外基质存积。任何类型的肝脏损伤在肝脏修复愈合的过程中都伴随有不同程度的肝纤维化，如果损伤因素长期不能去除，不仅影响肝再生修复及肝脏正常功能，而且纤维化的过程长期持续就会发展成肝硬化甚至肝癌。抗肝纤维化的治疗主要包括：针对原发病去除致病因素，如，抗各类肝炎病毒治疗，抗寄生虫如血吸虫治疗，戒酒及养成良好的生活习惯等。在针对纤维化本身的治疗，可以通过抑制炎症、脂质过氧化，或者抑制肝星状细胞的增生活化及促进胶原降解等。但目前在临床上仍然没有安全有效的手段治疗和预防肝纤维化手段。因此急切需要寻找和开发新的抗纤维化靶点及其调控手段。本申请的发明人发现抑制Myosin破坏细胞骨架稳态，软化细胞，并验证了mysoin的小分子化合物抑制剂(-)-Blebbistatin(缩写为Ble，Bleb或Blebb)能在多种类型的肝损伤模型中抗纤维化及促进再生修复的效果。
实施例2-1细胞软化在抑制CCl4诱导轻度肝纤维化中的应用
实验使用ICR，C57B1/6小鼠购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司，四氯化碳购于阿拉丁试剂(上海)有限公司(C131583-1L)，玉米油购于Sigma(C8267)。CCl4轻度肝损伤实验流程如图2A所示，选用8周龄雌鼠，在屏障内饲养一周，随机分为两组，分别注射CCl4/玉米油(配制体积2∶5)和玉米油，CCl4剂量为0.5毫升/千克，每周两次，连续4周。4周后采用5％水合氯醛麻醉小鼠，取出部分肝页，用4％多聚甲醛固定，脱水浸蜡，使用天狼星红(Y-Y-R20384-100ML)试剂盒进行纤维化染色，其中胶原纤维呈红色，如图2B所示。鉴定造模成功后，进行给药治疗。采用腹腔注射或尾静脉注射的方式进行。小分子溶解于二甲基亚砜，浓度1毫克或3毫克每千克每天，依次加入2～5％DMSO+30％丙二醇+2％Tween 80+ddH2O，对照组为“Control”图中缩写为“Con”。腹腔注射方法为：1毫升注射器吸取药物，用皮下注射器刺破皮肤和腹壁肌，并把液体注射到腹腔内，注意不要伤到膈膜和其他脏器，停留一会再拔针，避免液体渗漏出来。尾静脉注射方法为：将小鼠固定在固定器内，将尾巴拉直绷紧，注射后用棉花止血。连续注射1-2周，停止注射。再次进行天狼星红染色鉴定，结果如图2C，2D所示，Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin显著抑制纤维化。上述实验可以看出Myosin的抑制剂诱导的应激反应在治疗CCl4诱导轻度肝损伤修复中抑制纤维化、促进再生修复的应用。
实施例2-2细胞软化在抑制CCl4诱导的慢性重度肝纤维化中的应用
实验使用ICR，C57B1/6小鼠购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司，四氯化碳购于阿拉丁试剂(上海)有限公司(C131583-1L)，玉米油购于Sigma(C8267)。CCl4重度肝损伤实验流程如图3A所示，选用8-10周龄雌鼠，在屏障内饲养一周，随机分为两组，分别注射CCl4/玉米油(配制体积1∶2)和玉米油，CCl4剂量为2毫升/千克，每周两次，连续4周。6周后采用5％水合氯醛麻醉小鼠，取出部分肝页，用4％多聚甲醛固定，脱水浸蜡，使用天狼星红(Y-Y-R20384-100ML)试剂盒进行纤维化染色，其中胶原纤维呈红色，如图3B所示。鉴定造模成功后，进行给药治疗。采用腹腔注射或尾静脉注射的方式进行。小分子溶解于二甲基亚砜，浓度1毫克或3毫克每千克每天，依次加入2-5％DMSO+30％丙二醇+2％Tween 80+ddH2O，对照组为“Control”图中缩写为“Con”。腹腔注射方法为：1毫升注射器吸取药物，用皮下注射器刺破皮肤和腹壁肌，并把液体注射到腹腔内，注意不要伤到膈膜和其他脏器，停留一会再拔针，避免液体渗漏出来。尾静脉注射方法为：将小鼠固定在固定器内，将尾巴拉直绷紧，注射后用棉花止血。连续注射6-8周，停止注射。再次进行天狼星红染色(用于鉴定胶原纤维)鉴定，结果如图3C、进行一型胶原Col I染色结果如图3D所示，进一步通过定量PCR鉴定了跟纤维化相关基因Acta2(肌成纤维标记蛋白)、Col1a1(代表一型胶原)、Col1a2(代表一型胶原)、Col6a1(代表胶原)、Col6a2(代表胶原)、Vim(代表成纤维细胞)的表达如图3E、图3F(续)。Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin抑制CCl4诱导慢性重度肝损伤过程中胶原纤维的堆积，肌成纤维的活化从而抑制组织的纤维化。同时也可以看出Myosin的抑制剂诱导的应激反应在治疗CCl4诱导慢性重度肝损伤修复中抑制纤维化、促进再生修复的应用。
实施例2-3细胞软化在抑制组织纤维化、促进肝细胞增殖促进肝脏再生
血生化分析(取样前空腹12-16小时)进一步证实Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin能降低肝损伤指标如ALT、AST和GGT等的含量，如图4A所示。进一步利用Alb-cre×mTmG杂交小鼠，其成熟肝细胞表达GFP，CCl4进行纤维化造模，药物治疗处理后，大部分表达GFP的细胞表达Alb，而DMSO一部分表达GFP的细胞不表达Alb，说明Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin能阻止肝损伤过程中肝功能丧失，如图4B所示。进一步染色鉴定发现(-)-Blebbistatin显著促进肝损伤后细胞增殖，如图4C所示，且减少肝损伤过程中的细胞凋亡，如图4D所示。进一步转录水平分析肝功能相关指标发现，Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin处理后相比于对照组显著维持肝脏细胞相关基因(Alb、G6P、Hnf4a、Hnf1a、TF、Cy3a1)、胆管相关基因(CK19、Hnf1b)及增殖相关基因(Ki67)等高水平的表达，如图4E(续)。综上所述，Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin通过抑制肝损伤纤维化、促进肝细胞增殖和减少细胞凋亡促进肝脏再生，从而维持肝功能。通过上述结果也可以看出Myosin的抑制剂诱导的应激反应抑制组织纤维化、促进肝细胞增殖促进肝脏再生。
实施例2-4细胞软化在降低肝损伤过程中的组织器官硬化中的应用
实验使用ICR、C57B1/6小鼠购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司，弯头镊子、指头镊子、剪子、持针器、缝合针、缝合线购于亚速旺商贸有限公司，抗生素购于Gibco(15240-062)。构建CCl4诱导的慢性重度肝损伤(同实施例四)，造模后颈椎脱臼处死小鼠，利用Mark-10 ESM303检测新鲜肝组织杨氏模量，与非造模组相比，CCl4造模组肝脏显著提高肝组织的杨氏模量(如图6A中“WT”与“CCl4造模”)，造模成功小鼠平均分成两组，分别进行DMSO(图中“Con”)处理和(-)-Blebbistatin治疗，在治疗第7天后，椎脱臼处死小鼠，利用Mark-10 ESM303检测新鲜肝组织杨氏模量，结果显示Myosin在第七天显著降低肝组织的刚性，如图5A中“治疗7天-Con”与“治疗7天-Bleb”。同时二次谐波活体扫描结果显示，(-)-Blebbistatin治疗组(图5B右)降低了肝组织大量的平行排列的纤维(图5B，中间箭头指示)，呈现更加接近正常小鼠的网格状。根据上述结果可以看出Myosin的抑制剂降低肝损伤过程中的组织刚性。
实施例2-5细胞软化在抑制胆管结扎诱导的纤维化中的应用
实验使用ICR、C57B1/6小鼠购买于斯贝福(北京)生物技术有限公司，弯头镊子、指头镊子、剪子、持针器、缝合针、缝合线购于亚速旺商贸有限公司，抗生素购于Gibco(15240-062)。
选用8周龄雌鼠，实验前禁食禁水24小时，采用5％水合氯醛麻醉小鼠，8毫升/千克腹腔注射，麻醉后固定小鼠，腹中切口，暴露出脏器，找到挨近胃端的十二指肠，轻轻牵拉十二指肠找出胆管，用镊子小心剥离出胆管，用缝合线结扎胆管，滴加抗生素，后缝合关闭腹腔。手术后禁食禁水12小时。
术后14-20天，可以观察到小鼠皮肤呈黄绿色，进行给药治疗。造模组平均分成两组，实验组腹腔注射(-)-Blebbistatin。给药方式为溶于DMSO的(-)-Blebbistatin依次加入2-5％DMSO(终浓度，体积比)+30％PEG400(终浓度，体积比)+2％Tween 80(终浓度，体积比)，对照组注射不加小分子的溶剂含等量DMSO(记为“Con”)。
图6A显示(-)-Blebbistatin(以下缩写为Bleb)治疗胆管结扎导致肝损伤纤维化实验的流程图。结果6B显示肝纤维化模型对照组二甲基亚砜处理小鼠萎靡，活动能力减弱，相比于Myosin抑制剂Bleb显著抑制处理组小鼠更加活跃，充满精力。图6C显示天狼星红(Sirius Red)和a-SMA染色结果显示Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin治疗15天显著抑制胆管结扎造成的胶原纤维的存积(6C上层)及肌成纤维细胞的增殖(6C下层)。在治疗30天，Bleb相比较于对照组(对照组为“Control”图中缩写为“Con”)仍然显著抑制胆管结扎造成的胶原纤维的存积(如图6D)。细胞增殖蛋白Ki-67染色结果显示Bleb促进胆管结扎过程中肝细胞增殖(图6E)。
根据上述结果显示了Myosin的抑制剂诱导的应激反应在胆管结扎的肝损伤中的应用。
实施例3：细胞软化抑制皮肤纤维化在治疗硬皮病中的应用
硬皮病是一种以局限性或弥漫性皮肤及内脏器官的纤维化进而硬化和萎缩为特征的结缔组织疾病。此病可以引起多系统损害，目前其确切病因及发病机制仍未明确，亦无切实有效的治疗手段。本发明采用博来霉素(bleomycin，BLM)局部注射于ICR或C57B1/6鼠背部成功诱发小鼠皮肤硬化，腹腔给药Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin进行治疗，实验流程如图7A所示。
博来霉素注射1周后，小鼠背部注射部位皮肤即出现皮肤增厚变硬、弹性差、毛发未见生长的改变，直至注射结束，同时在注射部位出现硬结、结痂，伴随出现浅表溃疡。生理盐水对照组小鼠背部已剃毛的注射区毛发继续生长，未见明显皮肤硬化、增厚的表现，如图7B所示。治疗组(Bleb)：腹腔给药Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin(1-3mg/kg/天，溶于2-5％DMSO+30％PEG400+2％Tween 80+ddH2O)；对照组(con)：不含(-)-Blebbistatin含有相同计量DMSO。治疗3周后，治疗组能明显降低硬结、结痂程度，伴随更小程度的浅表溃疡，如图7B所示。进一步的实验验证Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin促进硬结区黑色素存积及新生毛发生长如图7C。H&E及Massion纤维染色结果显示(-)-Blebbistatin显著降低间质纤维的存积，如图7D指示。进一步分析结果显示(-)-Blebbistatin治疗显著降低表皮和真皮厚度如图7E，促进毛囊或腺体的数目如图8F。Ki-67染色结果显示(-)-Blebbistatin促进毛囊细胞增殖，从而促进毛囊形成如图7G。进一步通过免疫染色鉴定(-)-Blebbistatin治疗组KRT17(毛囊标记蛋白)阳性细胞远远多于KRT18(腺体的标记蛋白)阳性细胞，如图7H(续)；通过免疫共染KRT17和增殖标记蛋白PCNA，发现(-)-Blebbistatin是通过促进毛囊细胞增殖促进毛囊再生，如图7I(续)。进一步发现(-)-Blebbistatin治疗组表达更多的FGF9，这是被报道促进毛囊再生，如图7J(续)。令人感到意外的是，(-)-Blebbistatin能促进硬结区神经命运出现，一些细胞(-)-Blebbistatin治疗表达核定位的成熟神经元的Marker NeuN如图7K，暗示是否神经命运的诱导出现有助于损伤修复和组织再生有待于进一步研究。根据上述结果也显示了Myosin的抑制剂诱导的应激反应在治疗硬皮病中的应用。
实施例4细胞软化抑制肺纤维化在治疗肺纤维化相关疾病中的应用
肺纤维化是由成纤维细胞增殖及大量细胞外基质堆积并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征病理性改变，即是正常的肺泡组织被损坏后经过异常修复导致结构异常(疤痕形成)。肺纤维化会严重影响人体呼吸功能，表现为各种呼吸困难并随着病情、肺部损伤的加重及患者呼吸功能不断恶化。据报道特发性肺纤维化在世界范围内的发病率和死亡率逐年增加，诊断后的平均生存期不到3年，高于大多数肿瘤，因此又被称为一种“类肿瘤疾病”。因此找到能有效抑制肺纤维化的新靶点及药物在治疗和预防肺纤维化相关疾病具有重要的应用价值。
本发明采用博来霉素(bleomycin，BLM)肺气管滴注ICR或C57B1/6小鼠成功构建肺纤维化的小鼠模型，并通过腹腔给药Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin进行治疗，验证了(-)-Blebbistatin具有抑制肺纤维化并显著促进肺纤维化小鼠存活。具体实验流程如图8A所示，具体博来霉素注射流程如下：
(1)博来霉素稀释：母液50mg/ml稀释25倍终浓度为2mg/ml；
(2)腹腔注射0.5％戊巴比妥钠(100μl/10g b.w.)麻醉小鼠；
(3)75％酒精颈部皮肤消毒，切开颈部皮肤后钝性分离气管上粘膜与肌肉，暴露气管，注意勿损伤甲状腺；
(4)用胰岛素注射器按5mg/kg剂量于气管软骨间隙注入50μl(20g体重)博来霉素，拔出针头后，立即将操作台直立，左右旋转1min，缝合皮肤，小鼠自然苏醒后自由饮水进食。
(5)术后7天利用小动物CT进行扫描，结果如图8C，8D，(-)-Blebbistatin抑制博来霉素诱导肺损伤过程中肺的体积减少。进行鉴定并平均分成两组分别腹腔注射DMSO(图8记为Con)和(-)-Blebbistatin(图8记为Bleb，1-3mg/kg/天)分别溶于2-5％DMSO+30％PEG400+2％Tween 80+ddH2O。腹腔注射/天，尾静脉注射/3天，记录小鼠的生存状态。结果如图8B所示对照组在治疗8天已全部死亡，而Bleb治疗组在治疗第15天的存活率在40％。统计分析(-)-Blebbistatin显著提高博来霉素诱导肺纤维化，每组10只小鼠。
(6)D8(造模D14)进行小动物CT扫描，心脏灌注取材并固定，进行切片H&E及天狼星红染色。结果如图8D所示(-)-Blebbistatin抑制博来霉素诱导肺损伤过程中的组织损伤及纤维化。
实施例5细胞机械系统稳态破坏诱导再生相关的应激发应及再生起始与组织发生相关反应
(-)-Blebbistatin处理人的成纤维细胞，分别收集处理0小时、6小时、1天、2天样品进行转录组测序，数据分析如图9(A)所示，在诱导早期6小时大量HSP70家族和HSP90等一般应激响应相关的基因上调。在1天和2天这些基因表达mRNA开始下调。在神经诱导体系下诱导22天，再生起始相关基因如FST和神经发生相关基因明显上调，如图9(B)和图9(C)所示。
实施例6(-)-Blebbistatin激发应激发应激活的高的遗传损伤修复发应，提高本体同源重组修复的基因上调
如图10A所示，5-50微摩尔(-)-Blebbistatin处理人的成纤维细胞，6小时转录组分析，DNA复制相关、同源重组相关基因，错配修复相关基因、核苷酸切除修复及碱基切除修复基因显著上调。如图10B所示，进一步分析发现几乎所有参与同源重组相关重要基因都显著上调。
实施例7(-)-Blebbistatin激发应激反应激活的高的遗传损伤修复发应，在提高本体同源重组修复的基因过程中的应用
实验流程如图11A所示，首先构建同源重组修复的报告质粒系统，只有当外源同源序列与细胞同源片段发生同源重组时细胞发绿色荧光。同时转入mRuby红色荧光蛋白，用来标记转染细胞的效率，通过流式分析绿色荧光蛋白与mRuby的比率来判断发生同源重组的效率。对照组在转染换液后18h用DMSO处理4h，实验组分别在转染换液后18h、24h、36h用(-)-Blebbistatin处理4h，转染后72h流式分析HDR效率。结果显示(-)-Blebbistatin显著提高本底同源重组效率，如11(B)～(C)所示。由于Nrf2是氧化应激反应显著上调基因，是氧化应激的效应蛋白，通过小分子Nrf激活剂模拟氧化应激进一步验证应激反应能提高同源重组能力，如图11(D)～(E)所示。实验流程如下，对照组在转染换液后用DMSO处理，实验组在转染换液后用250nM RTA408处理，转染后72h流式分析HDR效率。
实施例8 Myosin的抑制剂激发应激反应在促进人肝细胞体外扩增中的应用
实施例1-6展示Myosin的抑制剂激发应激反应能在不同小鼠肝损伤或皮肤损伤模型中抑制肝或皮肤纤维化，促进肝细胞或毛囊细胞的增殖从而促进肝脏或毛囊的再生。本实施例进一步验证了Myosin的抑制剂人肝细胞体纤维化并促进肝细胞增殖，这对该方法进一步用于治疗人肝损伤及相关疾病提供进一步的证据支撑。
实施例8-1人胎肝细胞的培养
人胚胎肝细胞复苏：从液氮罐中取出人胚胎肝细胞(流产胎儿，冻存日期为2014年1月15号，冻存液为cell banker 2，冻存细胞数为2×107/管)，迅速放入37度水浴锅中，待溶化后立即吸入含有5ml肝细胞培养基(对照组)的15ml离心管中，离心50g，4度，5分钟。弃上清，用500ul肝细胞培养基重悬计数为1.16×106，则细胞复苏率为5.8％。
人胚胎肝细胞接种：接种密度为1×105/24孔板，分别加500μl肝细胞培养基(对照组)，含10μM小分子肝细胞培养基和含20μM小分子肝细胞培养基，接种24小时后每组分别取3孔消化下来细胞计数，计算得到贴壁率。接种72小时后，每组分别消化3孔细胞并计数。72小时细胞数比24小时细胞数，则可得到细胞数变化倍数。分别取每孔一部分细胞(细胞计数的2/5)用于RNA提取检测人肝细胞相关基因表达。
人胚胎肝细胞第一次传代：细胞分别接种到鼠尾胶原包被的24孔板中(如上所述)，接种密度为原代培养72小时细胞数的3/5。每组3个复孔。细胞培养72小时后，消化计数。该细胞数比接种时的细胞数，则可得到第一次传代扩增的倍数。取每孔一部分细胞(细胞计数的2/5)用于RNA提取检测人肝细胞相关基因表达。
人胚胎肝细胞第二次传代：细胞分别接种到鼠尾胶原包被的24孔板中(如上所述)，接种密度为第一次传代培养72小时细胞数的3/5。由于control组第一次传代培养72小时后大部分细胞死亡，只剩一少部分细胞，所以这些细胞全部接种。每2天换液，继续培养144小时(6天)后，细胞消化计数，此时细胞数比接种时细胞数即为第二次传代扩增倍数。分别取每孔细胞培养上清液用于检测人白蛋白浓度，一部分细胞(细胞计数的2/5)用于RNA提取检测人肝细胞相关基因表达。
结果：人胚胎肝细胞液氮冻存3年半后，复苏效率约为5.8％。如图12(A)和12(B)所示，经过小分子培养基传代(共3代)培养12天后，10μm小分子培养基可使其扩增约22.1倍(SD＝4.2)，20μM Bleb培养基可使其扩增约13倍(SD＝3.39)，图12(B)。此时，细胞形态仍然为典型的肝细胞形态，呈现出不规则的多边形。然而，经对照组培养基传代培养后，由于在第一次传代培养后大部分细胞死亡，剩下的小部分细胞经过培养后在12天时扩增倍数达58.3倍(SD＝13.9)，但此时细胞呈典型的成纤维细胞形态，细长扁平状，如图12(A)。如图12(C)，实时定量PCR检测人肝细胞特异的基因白蛋白(ALB，ALBUMIN)和甲胎蛋白(AFP，Alphafetoprotein)，结果显示，人肝细胞经10μM和20μM小分子培养基传代培养12天后，仍然表达人肝细胞特异的基因，而control培养基传代12天后得到的细胞检测到极低的白蛋白表达和检测不到甲胎蛋白基因表达，证明此时的细胞已经不是肝细胞，和图12(A)和12(B)的结果一致。
实施例8-2成人肝细胞小分子扩增
成人肝细胞复苏及培养：成人肝细胞(M00995-P Male human，BioreclamationIVT)从液氮罐中取出，迅速放入37度水浴锅中，带融化后加入到37度预热的5ml肝细胞接种培养基中(In VitroGRO CP Medium)，计数后，以9×104/孔接种于24孔板中，2-4小时肝细胞贴壁后，吸弃肝细胞接种培养基，分别加入肝脏细胞培养对照培养基，10μm小分子培养基和20μm小分子培养基。每2天换液。在第2天时通过照片估算细胞数。4天后20μm小分子培养基组改成10μm小分子培养基培养。共培养6天时细胞计数。取一部分细胞用于RNA提取检测人肝细胞特异基因的表达。
成人肝细胞传代：将上述对照组培养的肝细胞4.7×104和10μm小分子培养基培养的肝细胞8×104分别重新接种到鼠尾胶原包被的24孔板中，每两天换液，培养6天，拍照记录细胞生长状况。
小分子培养基扩增的成人肝细胞CYP1A2诱导：3×105肝细胞接种于鼠尾胶原包被的24孔板中，用10μm小分子培养基培养24小时后，换成含有50μm奥美拉唑(Omeporazole)的10μm小分子培养基，对照组为含有DMSO的10μm小分子培养基，48小时后，收集细胞检测CYP1A2基因的表达。
结果：成人肝细胞接种后5小时贴壁效率类似，2天后，对照组，10μm小分子组和20μm小分子组细胞均大量死亡。拍照并估算活细胞贴壁数(2.53×104，SD＝0.09)。而在4天时，小分子组细胞开始出现扩增克隆，而对照组无明显扩增。此时，20μm培养基组换液用10μm小分子培养基(命名为protocol#，即20μm培养4天，10μm培养两天)。继续培养两天后，小分子组细胞克隆进一步扩增，而对照组无明显变化(如图12(D))。培养6天，细胞数分别为对照组1.59×104(SD＝0.28)、10μm组为6.47×104(SD＝1.24)，#组为9.47×104(SD＝0.98)。用第6天细胞数比第2天细胞数即为细胞扩增倍数，结果显示小分子对成人肝细胞具有明显的扩增作用(图12(D)和图12(E))。增殖细胞核抗原基因(PCNA)的表达小分子组显著高于对照组，进一步证明小分子对细胞增殖具有作用(图12(F))。小分子扩增的成人肝细胞仍然表达人肝细胞特异基因ALBUMIN，AFP，CYP1A2，CYP3A4(图12(G))。10um小分子培养基可以是人肝细胞传代培养，而对照培养基则不能使成人肝细胞传代(图12(H))。传代培养的成人肝细胞经奥美拉唑诱导后，可以提高CYP1A2基因的表达，提示小分子扩增的肝细胞仍然具有功能(图12(I))。
实施例9-1：Bleb抑制TGF-beta介导的肌成纤维细胞活化及纤维化相关蛋白的表达
在纤维化中肌成纤维细胞过度活化是导致纤维化症状的主要细胞机制。损伤过程中促纤维因子，如细胞因子、炎症因子等促进损伤部位附近的纤维细胞、周皮细胞、成体干细胞或祖细胞、内皮细胞及上皮细胞向肌成纤维细胞转化。这种肌成纤维细胞过度增殖、收缩并合成分泌大量的胞外基质，主要包括胶原等。这导致组织变硬形成纤维化，妨碍组织或器官的再生修复，严重损害组织或器官功能。其中转化生长因子beta 1(TGF-β1)是导致肌成纤维细胞活化及纤维化最主要、最有效的生长因子之一。
在本实施例中，分别建立了TGF-β1诱导小鼠肝星形细胞(mouse HepaticStellate Cells，mHSCs，图13(B))，小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts，MEFs，图13(C))，小鼠成体肝、肺、心脏来源的间质细胞(primary Mesenchymal Cells，priMCs，图13(D))及人肝星形细胞(hLX-2，图13(E))向肌成纤维细胞活化的体外纤维化的细胞模型。具体实验流程如9A，起始细胞培养含有10％血清的培养基，24小时后换成低血清的培养液(或提前饥饿处理16小时)，同时加入3ng/ml TGF-β1与DMSO或Bleb(20μM)，7天后鉴定肌成纤维细胞活化标记蛋白(Acta2)，胶原(Col1a1，Col1a2，Col3a1，Col1a2)及基质金属蛋白酶及抑制剂((胶原酶：MmP8，MmP13；明胶酶：MmP2，MmP9；金属蛋白酶抑制剂：Timp1/2/3)的表达。
上述实验结果显示，Bleb显著抑制TGF-β1诱导小鼠星形细胞mHSCs向肌成纤维转化及胞外基质合成，如图13(B)所示。此外，图13(C)显示了Bleb显著抑制TGF-β1诱导小鼠MEFs向肌成纤维转化及胞外基质合成。如图13(D)的结果显示，Bleb显著抑制TGF-β1诱导小鼠不同脏器原代间质细胞向肌成纤维转化及胞外基质合成。如图13(E)的结果显示，Bleb显著抑制TGF-β1诱导人星形细胞hLX-2向肌成纤维转化及胞外基质合成，同时促进胞外基质降解的金属蛋白酶表达上调及其抑制剂的下调。
综上所述，Bleb显著抑制小鼠或人多种间质细胞(包括肝星形细胞，成纤维细胞，脏器间质细胞等)向肌成纤维转化及胞外基质合成，同时促进胞外基质降解的金属蛋白酶表达上调及其抑制剂的下调，进而抑制损伤过程中的纤维化。这一效果在不同物种、不同间质细胞类型上具有保守性。
实施例9-2：Bleb衍生物及纤维状肌动蛋白(F-actin)组装抑制剂可以抑制TGF-beta介导的肌成纤维细胞活化及纤维化相关蛋白的表达
进一步评估了Bleb((S)-(-)-Blebbistatin)衍生物的影响，评估方案如实施例9-1所描述，发现相比于DMSO，Bleb能破坏MEFs细胞伸展状态(图13(F)中的I和II)。失活型对映异构体(R)-(+)-Blebbistatin(缩写为R-Bleb)不影响MEFs纤维状形态，对TGF-β1诱导肌成纤维活化没有抑制作用如图13(G)，这表明Bleb在手性羟基是抑制纤维化活性所必需的(图13(F)中的III)。实验结果显示另一种衍生物(S)-(-)-Blebbistatin O-Benzoate(S-Bleb-OB)(20μM)也具有好的活性，能破坏MEFs细胞伸展状态(图13(F)中的IV)，也能够对TGF-β1诱导肌成纤维活化如图13(G)。这说明对Bleb进行修饰而产生的新的衍生物有可能比Bleb具有更好的生物活性。
Bleb靶向Myosin，而Myosin是肌动球蛋白(actomyosin)主要成分之一，肌动球蛋白是细胞产生收缩力的主要结构基础。这显示，Myosin组成肌动球蛋白细胞骨架系统可作为一个抑制肌成纤维细胞活化及组织器官纤维化有效的靶点。
前面仅仅示出了本发明的原理，应理解，本发明的范围不预期限制在本文所述的示例性方面，而应包括所有当前已知的和未来开发的等同物。另外，应当指出，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以作出若干改进和修改，这些改进和修改也应被视为本发明的范围。

Claims (3)

1.(-)-Blebbistatin在制备用于降低组织或器官纤维化的药物或试剂中的应用，其特征在于，所述纤维化为肺纤维化。
2.(-)-Blebbistatin在制备用于治疗与组织或器官纤维化相关的疾病的药物或试剂中的应用，其特征在于，所述纤维化为肺纤维化。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肺纤维化为多种原因引起的肺纤维化，包括吸进无机粉尘、放射线损伤、吸进有机粉尘、药物损伤或其他原因导致的肺纤维化以及特发性肺纤维化。
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