CN106701656A - 一种用于细胞培养的复合支架及其制备方法 - Google Patents
一种用于细胞培养的复合支架及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于细胞培养的复合支架及其制作方法，复合支架包括支架结构和支撑结构，其中，所述支架结构包括通过静电纺丝方法制得的纳米纤维膜，所述支撑结构包括中部封闭、两端分别具有端口一和端口二的空腔结构，所述支架结构贴合在所述支撑结构端口一的端面上。本发明用于细胞培养的复合支架能够模拟天然细胞外基质的结构特点，且克服现有技术中三维支架不易操作、刚性差、易受损的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及用于细胞培养的支架及其制备方法，特别涉及一种静电纺丝与3D打印技术相结合设计的用于模拟天然细胞外基质结构的三维支架及制备方法。
背景技术
细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、毒理学、新药研发、生物工程等各个领域，研究和观察细胞的形态结构和生命活动的技术手段已成为生命研究的一种必要的筛选和预实验手段。
目前，常规的细胞培养模式包括二维细胞培养，是在细胞培养板如2、4、6、12、24、48、96孔细胞培养板或细胞培养瓶、生物反应器等中进行，细胞在培养基中以一种二维方式单层贴壁生长。然而，多项研究发现在体外二维培养的细胞的基因表达、信号转导和形态学都可能与在生物体内三维生长的细胞有差异。
近年来，随着技术发展，建立了多种三维方式的细胞培养方法，以便能够充分模拟生物体内环境，提供适宜细胞生长的环境。例如纳米纤维支架和多孔支架三维培养(多孔磷酸钙支架，聚乳酸支架，聚乳酸和乙交酯共聚物支架，胶原蛋白支架，海藻酸钠支架等)，三维水凝胶支架培养(例如中国专利申请CN201110259019.4)，搅拌式、中空纤维、旋转烧瓶培养等方法。
其中，以静电纺丝技术获取的纳米纤维支架因其具有极高的比表面积、高孔隙率和相互连通的三维网络状结构,能够更好的模拟天然细胞外基质的结构特点,为种子细胞的生长和增殖提供良好的微环境,因此在生物和医学领域都具有广阔的应用前景(例如中国专利申请200480004293.5、CN200710134505.7、CN200910050507.7、CN201110397867.1)。
然而，以静电纺丝技术制备三维支架材料，由于其是在静电作用下形成的纺丝膜，其厚度受到一定的限制，形成的纺丝膜较薄(通常为纳米或微米级)，在细胞培养时，很难在不变形的情况下将其放到固定的培养容器中，也不利于后期对纺丝膜上的细胞进行鉴定，同时操作不当也会对纺丝膜造成一定程度上的损害。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于细胞培养的支架，能够模拟天然细胞外基质的结构特点，且克服现有技术中三维支架不易操作、刚性差、易受损的缺陷。
本发明的还一个目的是提供一种制作用于细胞培养的支架的方法。
为了实现本发明的目的，本发明一方面提供了一种用于细胞培养的复合支架，包括支架结构和支撑结构，其中，所述支架结构包括通过静电纺丝方法制得的纳米纤维膜，所述支撑结构包括中部封闭、两端分别具有端口一和端口二的空腔结构，所述支架结构贴合在所述支撑结构端口一的端面上。
优选的，所述支架结构为具有三维多孔结构的纳米纤维膜。
优选的，所述纳米纤维的直径为100～1000nm；更优选为200～600nm。
本发明中，所述支架结构的材料选自以下组中的一种或多种：聚己内酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、胶原蛋白、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝素蛋白、透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、肝素、琼脂、葡聚糖、褐藻酸；优选为聚己内酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、胶原蛋白中的一种或多种；更优选为聚己内酯、聚己内酯-胶原蛋白混合物。
优选的，所述支架结构通过粘接的方式进行贴合。更优选的，通过医用胶黏剂进行贴合。
本发明中，所述贴合也可通过超声或熔融焊接的方式进行贴合；所述医用胶黏剂可为非细胞毒性的聚合物材料，如聚氨酯、天然橡胶、丙烯酸酯、胶原蛋白等，具体可为，α-氰基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、骨水泥、芳香族多甲基丙烯酸聚氨酯等本领域常规医用胶黏剂，本发明对此不作限定。
优选的，所述支撑结构通过3D打印制作。
本发明中支撑结构也可通过注塑等方式制作。本领域技术人员知晓，3D打印技术(又称3D快速成型技术或增材制造技术)是指在计算机控制下，根据物体的计算机辅助设计(CAD)模型或计算机断层扫描(CT)等数据，通过材料的精确3D堆积，快速制造任意复杂形状3D物体的新型数字化成型技术。其中，熔融沉积成型(FDM)是采用热熔喷头，使得熔融状态的材料按计算机控制的路径挤出、沉积，并凝固成型，经过逐层沉积、凝固，最后除去支撑材料，得到所需的三维产品。该技术具有成型产品精度高、表面质量好、成型机结构简单、无环境污染等优点，可快速、准确、简便的制作所需形状和构造的支撑结构。
优选的，所述支撑结构做成适合细胞培养平板孔、培养室、培养瓶和/或生物反应器的尺寸。具体的，所述支撑结构可做成适合细胞培养平板孔的尺寸，例如2孔板、4孔板、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板和96孔板。
优选的，所述支撑结构的横截面为圆形，纵截面为正方形、矩形或梯形。
本领域技术人员知晓，所述支撑结构的横截面不仅限于圆形，也可为椭圆形、三角形、方形、矩形、规则多边形等，只要其能与培养结构匹配即可。例如，当细胞培养室为长方体时，支撑结构截面为矩形。
更优选的，所述支撑结构的横截面为圆形，纵截面为梯形，且所述端口一的直径小于端口二的直径。
本发明在设计支撑结构的形状和尺寸时，可参考细胞培养平板孔尺寸。通过将端口一的直径设计为小于端口二的直径，一方面，便于在细胞实验中对常规的二维培养和本发明三维培养进行平行对比实验，支撑结构在细胞培养平板孔中更稳定、不易滑落；另一方面，采用该设计可以使纳米纤维膜与培养器皿之间有一段距离，使细胞更好的形成三维结构，也可实现细胞的共培养。例如，当将复合支架置于6孔板进行试验时，支撑结构端口二的直径可按照6孔板尺寸，端口一的直径按照12孔板尺寸设计，此时复合支架中用于细胞培养的纳米纤维膜的尺寸也与12孔板尺寸匹配，在进行平行对比试验时，二维对比组采用12孔板即可。同理，置于12孔板时，端口二的直径按照12孔板尺寸，端口一的直径按照24孔板尺寸设计；置于24孔板时，端口二的直径按照24孔板尺寸，端口一的直径按照48孔板尺寸；依次类推。以上具体尺寸的说明不用于限制本发明的保护范围，仅用于说明本发明技术方案的设计思路以举例说明一些优选的具体实施方式。
优选的，所述支撑结构还包括一固定环，所述固定环套接在所述端口一外侧。更优选的，所述固定环为圆环，所述圆环内壁设置有柱状凸起，优选的，所述柱状凸起沿圆环内壁周向均匀分布。
本发明中，在支撑结构上设置固定环，该固定环一方面可用于将纳米纤维膜更好的固定在端面上，使其不脱落；另一方面，可以使纳米纤维膜与培养器皿之间有一段距离，使细胞更好的形成三维结构，也可实现细胞的共培养。
优选的，所述支撑结构端口二包括向外延伸的边缘，所述边缘上设置有凸起，该凸起的作用是便于抓持和/或移动所述支撑结构，在一个具体的实施方式凸起可为便于抓持的把手，可为条状、柱状、板状，可为平整的或凹凸不平的，本发明对其形状和结构不作具体限定。
本发明中，可将支撑结构端口二的边缘放置在细胞培养平板孔上，采用设置在其上的把手方便的移动复合支架。
本发明中，所述支撑结构的材料包括非细胞毒性和不易降解的热缩性高分子如：聚乳酸、聚左旋乳酸、ABS、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷等。
本发明中，所述复合支架可单独使用，也可放入细胞培养器皿中配合使用。
本发明中，对所述复合支架的使用形式不作限制，例如，当将复合支架置于细胞培养平板孔中时，可独立的将其置于任一培养孔中，也可将多个复合支架连接成一体式结构，每个支撑结构的端口二边缘相互连接，形成一体式结构，每个端口一分别与细胞培养孔位置相对应。
本发明还一方面提供了一种制作用于细胞培养的复合支架的方法，包括如下步骤：
(1)制备电纺液，在一定的电压、接收距离、流速、收集时间下进行静电纺丝，采用接收器接收静电纺丝，得到纳米纤维膜支架结构；
(2)通过3D打印或注塑制作支撑结构，所述支撑结构包括中部封闭、两端分别具有端口一和端口二的空腔结构；
(3)将步骤(1)得到的支架结构贴合在步骤(2)得到的支撑结构的端口一的端面上，形成复合支架。
本发明中，所述电纺液通过如下方法制备：将支架材料溶于一定的溶剂中，得到电纺液；其中，所述支架材料选自以下组中的一种或多种：聚己内酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、胶原蛋白、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝素蛋白、透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、肝素、琼脂、葡聚糖、褐藻酸；优选为聚己内酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、胶原蛋白中的一种或多种；更优选为聚己内酯、聚己内酯-胶原蛋白混合物。
所述溶剂可以为甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它们任意比例的混合物。上述的支架材料和溶剂的重量和比例等可参照现有技术。
优选的，步骤(1)中所述电纺液为聚己内酯或聚己内酯-胶原蛋白混合物的六氟异丙醇溶液。所述聚己内酯和胶原蛋白按重量比为1～3:1，优选为1.5～2.5:1，溶液的浓度为5～10％，优选为6～8％。
优选的，步骤(1)中所述静电纺丝的参数为：电压5～40KV、接收距离5～25cm、流速0.2～2.0mL/h、收集时间0.2～2h。更优选的，电压10～20KV、接收距离10～20cm、流速0.5～1mL/h、收集时间0.5～1h。
优选的，步骤(1)中接收器为PBS缓冲液或盖玻片。
优选的，步骤(2)通过3D打印制作支撑结构。优选的，通过计算机设计出3D支撑结构，采用热熔喷头，使得熔融状态的材料按计算机控制的路径挤出、沉积，并凝固成型，得到支撑结构。具体3D打印方法可参照本领域现有技术，本发明对此不作赘述。
优选的，本发明支撑结构设计为适合细胞培养平板孔、培养室、培养瓶和/或生物反应器的尺寸，具体可为本发明如前所述的支撑结构。
本发明所述支撑结构的材料包括非细胞毒性和不易降解的热缩性高分子如：聚乳酸、聚左旋乳酸、ABS、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷等。优选为聚乳酸。
优选的，步骤(3)中通过粘接的方式进行贴合。更优选的，通过医用胶黏剂进行贴合。
本发明中，所述贴合也可通过超声或熔融焊接的方式进行贴合；所述医用胶黏剂可为非细胞毒性的聚合物材料，如聚氨酯、天然橡胶、丙烯酸酯、胶原蛋白等，具体可为，α-氰基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、骨水泥、芳香族多甲基丙烯酸聚氨酯等本领域常规医用胶黏剂，本发明对此不作限定。
本发明有益效果：
1.本发明复合支架包括通过静电纺丝得到具有多孔结构的三维纳米纤维膜支架结构，能够很好的模拟天然细胞外基质的结构特点。
2.本发明复合支架中设计支撑结构，将支架结构贴合在支撑结构上，克服现有技术中三维支架不易操作、刚性差、易受损的缺陷；使支架结构在转移和细胞培养中能承受正常的机械操作，保证支架的多孔的结构不发生变形和受损。
3.本发明复合支架可独立使用或与常规的细胞培养装置配合使用，且通过合理设计支撑结构的结构和尺寸，使其能够更好的与二维培养作比对，此外，还可以实现二维、三维共培养的目的。
附图说明
图1本发明复合支架的结构示意图
图2本发明支撑结构示意图
图3本发明支撑结构三视图
图4本发明固定环结构示意图
图5本发明PCL纳米纤维膜支架电镜图
图6本发明PCL-胶原蛋白纳米纤维膜支架电镜图
图7神经瘤母细胞SY5Y的CCK-8检测结果
图8神经胶质细胞的CCK-8检测结果
图9神经瘤母细胞SY5Y和神经胶质细胞染色结果图，其中，左侧为神经瘤母细胞SY5Y细胞染色结果图，右侧为神经质细胞染色结果图
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步阐述，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，本领域的普通技术人员根据实施例所作出等效变换或等效替代均包含在本发明的保护范围内。
参见附图1-2，本发明用于细胞培养的复合支架1包括支架结构2和支撑结构3，其中，支架结构2包括通过静电纺丝方法制得的纳米纤维膜，支撑结构3包括中部封闭、两端分别具有端口一4和端口二5的空腔结构6，支架结构2贴合在支撑结构3端口一4的端面上。
本发明中，支撑结构做成适合细胞培养平板孔、培养室、培养瓶和/或生物反应器的尺寸。在一个具体的实施方式中，支撑结构可做成适合细胞培养平板孔的尺寸，例如6孔板、12孔板、24孔板、48孔板和96孔板。
在一个具体的实施方式中，支撑结构设计为筒形，其横截面为圆形、纵截面为矩形。
在一个具体的实施方式中，参见附图3，支撑结构的横截面为圆形，纵截面为梯形，且端口一4的直径小于端口二5的直径。
采用该设计，通过将端口一的直径设计为小于端口二的直径，一方面，便于在细胞实验中对常规的二维培养和本发明三维培养进行平行对比实验，支撑结构在细胞培养平板孔中更稳定、不易滑落；另一方面，采用该设计可以使纳米纤维膜与培养器皿之间有一段距离，使细胞更好的形成三维结构，也可实现细胞的共培养。
本发明支撑结构的尺寸和形状的设计以细胞培养平板孔为例进行说明，当将复合支架置于6孔板进行试验时，支撑结构端口二的直径可按照6孔板尺寸，端口一的直径按照12孔板尺寸设计，此时复合支架中用于细胞培养的纳米纤维膜的尺寸也与12孔板尺寸匹配，在进行平行对比试验时，二维对比组采用12孔板即可。同理，置于12孔板时，端口二的直径按照12孔板尺寸，端口一的直径按照24孔板尺寸设计；置于24孔板时，端口二的直径按照24孔板尺寸，端口一的直径按照48孔板尺寸；依次类推。
在一个具体的实施方式中，参见附图4，支撑结构还包括一固定环7，固定环7套接在端口一4外侧。具体的，固定环7可为圆环，圆环内壁设置有柱状凸起8，柱状凸起8沿圆环内壁周向均匀分布。
本发明在支撑结构上设置固定环，该固定环一方面可用于将纳米纤维膜更好的固定在端面上，使其不脱落；另一方面，可以使纳米纤维膜与培养器皿之间有一段距离，使细胞更好的形成三维结构，也可实现细胞的共培养。
在一个具体的实施方式中，参见附图1-3，支撑结构端口二5包括向外延伸的边缘9，边缘9上设置有便于抓持的把手10。在使用中，可将支撑结构端口二的边缘放置在细胞培养平板孔上，采用设置在其上的把手方便的移动复合支架。
实施例1：PCL纳米纤维膜支架结构的制作
利用静电纺丝技术进行静电纺丝。静电纺丝试验条件如下：以六氟异丙醇(HFIP)为溶剂，配制6％聚己内酯(PCL)溶液，接收距离为20.5cm，流速为1.0mL/h，电压为9.5kv-10.0kv，收集时间为0.5h，氮气压力为0.1Mpa，以PBS缓冲液为接收器得到纳米纤维膜，晾干后得到支架结构。电镜结果如图5所示，得到纳米纤维膜为直径为300nm+/-20nm。
实施例2：PCL-胶原蛋白纳米纤维膜支架结构的制作
利用静电纺丝技术进行静电纺丝。静电纺丝试验条件如下：以HF I P为溶剂，配制8％PCL-胶原蛋白溶液，PCL与胶原蛋白比例为11：5，接收距离为20.5cm，流速为0.5mL/h，电压为9.5kv-10.0kv，收集时间为0.5h，氮气压力为0.1Mpa，以PBS缓冲液为接收器。电镜结果如图6所示，得到纺丝膜为直径为560nm+/-20nm。由图可知，静电纺丝PCL-胶原得到的纺丝膜直径较粗，同时由于胶原具有一定的亲水性，利于细胞的生长。
实施例3：筒形结构PLA支撑结构的制作
通过3D打印以聚乳酸(PLA)为原料，根据细胞培养平板孔6、24、96孔板的尺寸和结构设计支撑结构。设计尺寸如下表1所示：
其中柱形结构同样需要把静电纺丝膜用医学黏胶粘到不带把手的柱形底部，其中柱形尺寸如表所示：
表1：与6、24、96孔板匹配的筒形支撑结构尺寸
| 参数(单位mm) | 6孔板 | 24孔板 | 96孔板 |
| 端口一直径 | 34.0 | 14.0 | 5.6 |
| 厚度 | 1.0 | 1.0 | 0.5 |
| 端口二边缘长度 | 2.0 | 2.0 | 1.0 |
| 端口二边缘厚度 | 1.0 | 1.0 | 0.5 |
| 把手长度 | 4.0 | 3.0 | 3.0 |
| 高度 | 13.05 | 13.05 | 13.05 |
实施例4：梯形截面PLA支撑结构的制作
通过3D打印以聚乳酸(PLA)为原料，根据细胞培养平板孔6、12、24孔板的尺寸和结构设计支撑结构。设计尺寸如下表2所示：
表2：与6、12、24孔板匹配的支撑结构尺寸
| 参数(单位mm) | 6孔板 | 12孔板 | 24孔板 |
| 端口二直径 | 31.07 | 19.09 | 13.55 |
| 端口一直径 | 23.79 | 16.61 | 11.21 |
| 厚度 | 0.80 | 0.50 | 0.50 |
| 端口二边缘长度 | 3.34 | 2.00 | 2.00 |
| 端口二边缘厚度 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 把手长度 | 2.66 | 2.04 | 3.00 |
| 高度 | 13.05 | 13.05 | 13.05 |
实施例5：含固定环的PLA支撑结构的制作
通过3D打印以聚乳酸(PLA)为原料，根据细胞培养平板孔6、24孔板的尺寸和结构设计支撑结构，在本实施例中，固定环为圆环，记为外环，支撑结构的主体为内环。设计尺寸如下表3所示：
表3：与6、24孔板匹配的支撑结构尺寸
实施例6：神经瘤母细胞和神经胶质细胞细胞培养试验
采用本发明实施例1所述支架结构作为细胞三维培养的支架，以本发明设计的6孔板匹配的支撑结构为例进行试验，将PCL纳米纤维膜支架结构采用医用胶黏剂贴合在支撑结构上制备得到复合支架，对神经瘤母细胞核神经胶质细胞进行细胞培养试验，并对其分别进行CCK8检测和死活染色检测。
如图7和表4所示，为神经瘤母细胞SY5Y的CCK-8检测结果，对照组为二维培养及本公司另一产品(将静电纺丝膜采用胶黏剂黏贴在硬质塑料上，记为PCL-塑料)；如图8和表5所示，为神经胶质细胞的CCK-8检测结果，对照组为二维培养及三维支架离心培养；图9为两种细胞的染色结果。
表4：神经瘤母细胞SY5Y的CCK-8检测结果
表5：神经胶质细胞的CCK-8检测结果
由上述结果可知，对于神经瘤母细胞，其中采用PCL三维支架的两种处理方式下的细胞生长状态良好，与2D培养相比第三天到第六天细胞在PCL上生长速率要明显高一些，死活染色结果也表明在该材料中培养细胞并没有对细胞有毒性；此外，采用本发明PCL复合支架产品与直接将PCL黏贴在硬质塑料上相比，采用本发明结构PCL外观更加均匀且结构不易被破坏。
对于神经胶质细胞，比较了静止和离心接种方式下，细胞生长状态。胶质细胞属于原代细胞株，所以增值能力不强，PCL材料对细胞无毒性，但增值能力有限。从结果来看离心方法下，细胞在第3天到第5天有一个比较好的增殖率，但整体来看离心接种方式下各孔之间差异较大，平行性不好。因此，在试验中可采用点种静置方法接种细胞。该材料可以作为原代细胞三维培养的一种很好的选择。
Claims (13)
1.一种用于细胞培养的复合支架，包括支架结构和支撑结构，其中，所述支架结构包括通过静电纺丝方法制得的纳米纤维膜，所述支撑结构包括中部封闭、两端分别具有端口一和端口二的空腔结构，所述支架结构贴合在所述支撑结构端口一的端面上。
2.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于：所述支架结构为具有三维多孔结构的纳米纤维膜。
3.如权利要求2所述的复合支架，其特征在于：所述纳米纤维的直径为100～1000nm。
4.如权利要求1-3任一项所述的复合支架，其特征在于：所述支架结构的材料选自以下组中的一种或多种：聚己内酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、胶原蛋白、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝素蛋白、透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、肝素、琼脂、葡聚糖、褐藻酸。
5.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于：所述支撑结构通过3D打印制作。
6.如权利要求5所述的复合支架，其特征在于：所述支撑结构的横截面为圆形，纵截面为正方形、矩形或梯形。
7.如权利要求6所述的复合支架，其特征在于：所述支撑结构的横截面为圆形，纵截面为梯形，且所述端口一的直径小于端口二的直径。
8.如权利要求5-7任一项所述的复合支架，其特征在于：所述支撑结构端口二包括向外延伸的边缘，所述边缘上设置有凸起。
9.如权利要求5-7任一项所述的复合支架，其特征在于：所述支撑结构还包括一固定环，所述固定环套接在所述端口一外侧，所述固定环内壁设置有柱状凸起。
10.一种制作如权利要求1-9任一项所述用于细胞培养的复合支架的方法，包括如下步骤：
(1)制备电纺液，在一定的电压、接收距离、流速、收集时间下进行静电纺丝，采用接收器接收静电纺丝，得到纳米纤维膜支架结构；
(2)通过3D打印或注塑制作支撑结构，所述支撑结构包括中部封闭、两端分别具有端口一和端口二的空腔结构；
(3)将步骤(1)得到的支架结构贴合在步骤(2)得到的支撑结构的端口一的端面上，形成复合支架。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述电纺液通过如下方法制备：将支架材料溶于一定的溶剂中，得到电纺液；其中，所述支架材料选自以下组中的一种或多种：聚己内酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羟基丁酸戊酸酯、聚羟基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、胶原蛋白、壳聚糖、改性壳聚糖、淀粉、纤维素、改性纤维素、明胶、纤维蛋白、丝素蛋白、透明质酸、海藻酸、硫酸软骨素、肝素、琼脂、葡聚糖、褐藻酸；所述溶剂选自以下组中的一种或多种：甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、六氟异丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述电纺液为聚己内酯或聚己内酯-胶原蛋白混合物的六氟异丙醇溶液；所述聚己内酯和胶原蛋白按重量比为1～3:1，溶液的浓度为5～10％；
和/或，所述步骤(1)中所述静电纺丝的参数为：电压5～40KV、接收距离5～25cm、流速0.2～2.0mL/h、收集时间0.2～2h；
和/或，所述步骤(1)中接收器为PBS缓冲液或盖玻片。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于：步骤(2)通过3D打印制作支撑结构。
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