CN102803960A - 测试各种所选材料和/或表面结构用于细胞培养的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测不同的所选材料和/或表面结构用于细胞和/或微生物培养的方法,所述方法包括如下步骤:i)提供以杯形插入物形式的待检测的多个不同的所选材料和/或表面结构,其中,所述杯形插入物的尺寸以下述方式体现,即每一个杯形插入物能够基本上准确地以匹配的方式嵌入到多孔板的一个孔中来适合细胞培养,其中,所述每个杯形插入物具有壁、一个底部和一个与底部相对的一侧的开口,其中,所述杯形插入物的壁和底部是不漏水的,以及,所述每一个杯形插入物包含所选材料和/或所选表面结构,其至少包含在底部的内表面;ii)将所述杯形插入物插入到尺寸合适的多孔板的孔中,使得杯底部的外表面指向多孔板的孔底的内表面;iii)在杯形插入物的内腔中培养细胞。本发明还涉及一种实施该方法的试剂盒。
Description
在细胞培养中,与参与培养的细胞有任何类型接触的材料,其影响起到关键作用。例如,在医学工程、制药和生物技术中,新型高分子材料的开发和应用是作为检测与原核和/或真核细胞的相容性的一个结果,该检测通常是在新材料上生长(培养)细胞。理想的状态是提供一个细胞和/或组织培养的系统,在没有外来其他材料的干扰的情况下,以重现性好,经济和快速的方式实现检测聚合物基材料对细胞直接接触的影响,其中,该系统要从根本上适合高通量的应用。
一次性无菌细胞培养载体(“多孔板”)常常用于细胞和组织培养工程领域。这些载体目前仅有少数材料可以制备以及出售,优选为苯乙烯PS。商业上可获得的多孔板有多种规格,在可能的情况下,它们是标准化的。细胞培养载体可以进行消毒,最好可以适用于显微镜方法,旨在确保能够进行重复性测试。
由于在医学、生物学和生物技术领域的新兴应用(例如细胞治疗,组织工程,生物技术领域的生产工程),对新材料方面的要求有所增加。为了测试全新的材料,包括就化学上或物理上派生参数而言的材料改性,如表面结构,该材料被固定在细胞培养载体上并按照预定的时间与细胞共同孵育在液体细胞培养基中。为了将材料以一种稳定的方式固定在细胞培养载体上,材料通常用辅助固定以支持和负重,辅助固定来自于一种不同于待测材料的材料和/或细胞培养载体用到的材料(其中包括琼脂糖、玻璃、聚四氟乙烯、高钢级,和聚酯)。因此,测试结果是多个不同的材料对细胞的影响的后果,已不能仅仅归因于一种具体的材料。而且,由于辅助固定,在测试过程中不能排除材料的形状不会改变的可能性。例如,薄膜的平面结构可能会改变成一个起伏的结构。材料微结构和纳米结构的形貌是一个相当大的变化,其可能因此而导致对细胞和材料之间的相互作用产生相当大的影响。
本发明的目的是克服或减轻现有技术中存在的一个或多个缺陷。具体地,本发明的目的是提供一种方法,所述方法能够就培养细胞方面的适应性平行测定不同的材料和表面。
本发明提供一种检测不同的所选材料和/或表面结构用于细胞和/或微生物培养的方法,所述方法包括如下步骤:
i)提供以杯形插入物形式的待检测的多个不同的所选材料和/或表面结构,其中,所述杯形插入物的尺寸以下述方式体现,即每一个杯形插入物能够基本上准确地以匹配的方式嵌入到多孔板的一个孔中来适合细胞培养,其中,所述每个杯形插入物具有壁、一个底部和一个与底部相对的一侧的开口,其中,所述杯形插入物的壁和底部是不漏水的,以及,所述每一个杯形插入物包含所选材料和/或所选表面结构,其至少包含在底部的内表面;
ii)将所述杯形插入物插入到尺寸合适的多孔板的孔中,使得杯底部的外表面指向多孔板的孔底的内表面;
iii)在杯形插入物的内腔中培养细胞。
杯型插入物使用使得普通多孔板为基础的,关于某一材料和/或某一表面结构的细胞效应和/或细胞培养的检测得以在没有其它材料干扰的情况下实现。根据本发明问题的解决方案,主要是提供和插入一个杯形插入物,所述杯型插入物具有这样一种尺寸,该尺寸能够适合放入到市售可获得的标准的多孔板中。杯形插入物包括一种所选材料和/或一种所选表面结构,所述一种所选材料和/或一种所选表面结构至少存在于杯形插入物的底部内表面。杯形插入物的几何形状能够适应细胞的需要,包括X-Y方向(例如形成一个圆形的,星形的或者不同形状的插入物的区域)以及Z方向。所述X方向和Y方向描述插入物的在二维平面的扩展平行于多孔板的孔的开口的平面,而在Z方向描述了多孔板的孔可以延伸的深度的方向。杯形插入物提供一种精确限定的表面,所述表面能够通过化学和物理修饰的形式产生。因此,它能够确保细胞在培养时专门仅仅暴露在一种材料下,所述材料即待检测材料。在培养时,由于细胞在杯形插入物的管腔内进行培养,所述杯形插入物不能够在多孔板中浮动。因为所述杯形插入物的可移动性,其能够不费吹灰之力的转移到另外一个细胞培养载体中。由于所述杯形插入物适用于可市售获得的标准多孔板的尺寸,以往实验室所具有的细胞培养设备可以继续使用,没有任何限制。该系统具有适合灭菌、显微镜下检测以及供应繁殖的特点。不同的材料和/或表面结构以杯形插入物的形式用于传统的多孔板,因其能够利用标准化检测方法或者系统,所以与采用辅助手段将材料固定在多孔板的孔腔内的方法相比,更节省时间和节约成本。不同的材料和/或表面结构以杯形插入物的形式用于传统的多孔板,能够在高通量性质的应用范围内自动利用。由于杯形插入物能够简单的从第一个多孔板的孔中转移到另外一个孔中,也可能另外一个,第二个多孔板,检测程序能够以多样化的方式被延伸和/或改变。类似的细胞培养条件可以在单一的多孔板中进行。这种方式能够降低检测运行的系统误差。
在新聚合物系统发展的初期,仅有少量数目的新材料具有代表性地可利用。因为杯形插入物的生产的需求量远远少于整个多孔板的生产的需求量,基于本发明,极少量的新材料也能够同样有效地使用并供给检测。
根据本发明所述的方法,其是一种检测不同所选材料和/或所选结构用于细胞和/或微生物培养的方法。术语“细胞”被理解为单个细胞和一种类型的多个细胞或不同类型的细胞的混合物,以及联合细胞结构和组织部分和/或器官部分。原生起源或细胞系、细胞群或其他类型的混合物的细胞都可以使用。细胞可以包括或者由真核细胞组成,但也可以包括或者由原核细胞组成。本发明中,微生物被理解为单细胞生物,特别是细菌和真菌,例如酵母菌和藻类。
所述不同的所选材料在加工形式上基本不能溶于水,所述材料在正常细胞培养的条件下是以固体形式存在,例如在0°C到60°C的温度范围内。所述材料优选为聚合物材料,例如均聚物或共聚物,其中,所述聚合物材料能够聚合后进一步处理和/或修饰。
所述不同的所选的表面结构其固体表面不同,例如就材料组成来说,三维的形式、表面电压、多孔性、微结构和/或宏观结构、疏水性、亲水性和/或提供功能基团。所述固体可以是已知的固体材料,也可以是新种类的固体材料。例如,所选的表面结构可以通过修饰已存在的表面获得。
根据本发明所述的方法,待测试的材料和/或表面结构是以杯形插入物的形式提供的。杯形插入物的尺寸是以下述方式体现,即每一个杯形插入物能够基本上准确地以匹配的方式嵌入到多孔板的一个孔来适合细胞培养。一个适合细胞培养的多孔板可以理解为,它每一个载体上都拥有多个独立地用来接纳和培养细胞的小隔间,其中,所述载体为商业可获取的标准细胞培养载体。一个多孔板通常有一个底部和一个盖子,所述底部包括用来培养细胞的大量独立的孔,所述盖子通常用以盖住多孔板的所有孔。所述多孔板通常是由聚合物制成,具体地为聚苯乙烯。多孔板优选设计为4-孔、6-孔、12-孔、24-孔、48-孔、96-孔或者384-孔,更优选地,为24-孔的多孔板。所述多孔板的孔可以有一个底部,所述底部可以是平面的也可以是曲面的,优选地,所述多孔板的孔为平面底部。有大量的商业厂家在提供和售卖合适的多孔板,例如康宁公司,BD生物科技,Biochrom AG,Greiner GmbH,以及Nunc GmbH & Co.KG。
根据本发明所述的方法,至少杯形插入物的一部分能够以如下方式体现,即杯形插入物能够基本上准确地以匹配的方式嵌入到4-孔、6-孔、12-孔、24-孔、48-孔、96-孔或者384-孔多孔板的孔中,优选为嵌入到24-孔多孔板的孔中。
所述杯形插入物是以这种方式形成和限定的,即杯形插入物可以基本上准确地以匹配的方式嵌入到孔多孔板的孔中。准确地以匹配的方式嵌入可以理解为所述杯形样式可以以如下方式嵌入孔中,即杯形插入物在孔中没有过多的间隙以至于一般的晃动不会打翻。具体地,所述杯形插入物的尺寸具有如下特征,即垂直的在孔中排放。杯形插入物的外壁和孔侧壁内表面的空隙不要大于5毫米,优选地,最小处不超过1毫米,且杯形插入物的外壁在某个区域接触到孔壁的内表面更好,所述区域可能会径向膨胀。所述杯形插入物的实际样式和尺寸是由所使用的多孔板的孔的样式和尺寸决定的。
所述杯形插入物有一个开口,杯壁和一个底部,其中,所述杯壁和底部限定了所述插入体的内腔,所述内腔的通过开口进入。所述杯形插入物的杯壁和底部是不漏液体的,因此,所形成的内腔以用来控制液体只能通过开口注入和/或移出。所述杯形插入物的杯壁和/或底部的厚度是以如下方式选择,即所述杯形插入物有足够的稳定性以自支撑方式保持其形状,且能够提供足够的管腔以便于细胞培养。所述底部的外表面和内表面的形状可以基本上是平面的或者曲面的,相互之间独立。就这一点而言,“基本上”的意思是至少75%的所述表面有相应的属性。优选地,内表面和和外表面这两者基本上平的。所述底部的内表面和/或外表美同样在边缘区域是曲面的,也就是说,杯形插入物的底部和壁之间是接触的。
所述杯形插入物可以有不同的基本形状,且可以(但不是必须)和相对应的孔的形状相同,只要所述杯形插入物可以基本上准确地以匹配的方式嵌入即可。例如,所述杯形插入物的开口、杯体和/或底部可以是圆形,椭圆形,星形或者其它形状,规则或者不规则,对称或者不对称的都可以。
所述杯形插入物需要有一定的深度,一方面由所采用的多孔板的孔的深度决定,另一方面,要确保所述杯形插入物有足够的管腔,以便能够在管腔中培养细胞。所述杯形插入物的底部深度和样式最好选择和匹配下述所说的相应的深度,这样一旦成功插入,杯形插入物的底部能够以平面的方式搁在孔的底部。该设计中,如果所述杯形插入物和所述多孔板是透明的,提供和确保显微镜下观察所述杯形插入物底部的内表面具有最佳的实施性。根据本发明所述的方法,至少部分所述杯形插入物优选为透明的。
所述杯形插入物的杯体可以选用如下方式,其内部尺寸(如直径、高度和体积)对应具有大于该数值的多孔板的孔的尺寸。因此,所述可利用的细胞培养的区域以及表面积与体积的比例可直接与具有大于该数值的尺寸的多孔板的孔相比较。
根据本发明所述的方法,至少部分杯形插入物可以是透明的。
根据本发明所述的方法,至少一部分所述杯形插入物是以下述方式体现的,一旦杯形插入物嵌入到多孔板的孔中,每个插入物的杯底平行位于孔底的上部。
根据本发明所述的方法,所述杯形插入物的使用要以下述手段实现,即确保所述杯形插入物固定在多孔板的一个孔中。所述固定可以理解为,一旦成功地插入到孔中,插入物保持大致的位置且不能再移动,至少是在一个方位不能移动。为此,所述杯形插入物可以在其上边沿有突出物,所述突出物接触到孔的上边沿,一旦杯形插入物插入,阻止进一步的穿过或者下沉到孔中。
根据本发明所述的方法,至少部分所述杯形插入物能够具有一些特征,该特征可以确保所述杯形插入物固定在多孔板的孔中,且至少有部分所述杯形插入物优选在杯的上边沿有突出物,一旦杯形插入物插入之后,突出物就能够接触到孔的上边沿。
所述每一个杯形插入物都包括一个所选材料和/或一个所选表面结构,至少在所述插入物的底部的内表面。在杯形插入物中,所述杯形插入物的整个内表面或所述杯形插入物的表面优选通过相应的选择材料和/或相应的选择表面结构抹盖插入物腔体提供。无论如何,所述杯形插入物只有杯底部包含或由相应的选择材料和/或相应的选择表面结构组成。优选地,整个杯形插入物由待检测的所选材料组成。
根据本发明所述的方法,至少部分所述杯形插入物在其整个内表面包含相应的所选材料和/或相应的所选表面结构。
根据本发明所述的方法,至少部分所述杯形插入物可以由如下方式构成,即只有杯底包含或者由相应的所选材料和/或相应的所选表面结构组成。
根据本发明所述的方法,至少部分所述杯形插入物可以由相应的所选材料组成。
取决于要测试的材料的类型和性质,所述杯形插入物可以通过已知的方法制造。所述方法包括用于可塑成型的方法。例如,可以使用热成型方法,以及喷射造型法、压铸法、压缩成型法、热成型法以及发泡成型法。也可以使用合金的成型的方法,例如浸渍、真空铸造和/或镀层。其它成型方法也同样适用,比如固体材料的机械加工。不同的制作方法也可以组合,例如喷射-压缩造型法、内部气压法、结构泡沫塑性法、微发泡成型法以及夹物模压法。
假如待测试的材料不适合整个杯形插入物的制造,只要面向内腔的杯底的内表面包含待测试的材料和/或待测试的表面结构就足够了。为此,待测试的材料可以提供给所述杯形插入物,如通过反向注射的方式。
原则上,杯形插入物的制造类型与本发明所述的方法不相关。所述杯形插入物的制造方法优选为不使用溶剂。例如,这类方法包括热成型方法或者熔融处理,如喷射模塑法,压铸法,压缩成型法以及热成型法。
根据本发明所述的方法,至少部分所述杯形插入物可以通过反注入的方法制造。
例如,根据本发明所述的方法,杯形插入物可能受其在制造之后表面改性的影响,因此,提供表面结构的测试是必须的。所述表面的改性可能包括化学反应引起的修饰,比如通过引入官能团改变至少一种所处理表面的性质,以及等离子体处理和/或其它会引起物理表面修饰的方法。物理方法包括如下方法,其中,所述插入物至少一种内腔表面通过一种组分处理,所述组分为作为一种溶剂用于溶解所述插入物用到的材料,随后通过添加一种组分组成沉淀剂用于产生溶液。这种加工方法不仅改变了杯皿的表面形态,同时必要时也可以进一步实现表面改性,例如通过后续的化学修饰。所述方法同时也包括超临界状态气体的使用,优选为超临界态CO2,例如通过发泡处理法以实现表面改性。表面结构同样可以仅仅通过制造杯形插入物的方法来制造,例如在反向注射的情况下。最后,这些方法也包含不同表面改性方法的组合。
杯形插入物的表面具有可变参数,比如,就表面材料的组成而言,表面势能、孔隙率、微观结构和/或宏观结构、疏水性、亲水性和/或所提供的官能团,其可以由表面修饰提供以用于测试。
根据本发明所述的方法,至少一个所述杯形插入物的杯皿的内表面包含表层结构,所述表层结构仅在杯形插入物成型后形成。
根据本发明所述的方法,所述杯形插入物分别插入到具有相应尺寸的多孔板的孔中,以便使得杯底部的外表面指向其对应的多孔板的孔底部的内表面。根据本发明所述的方法,每个所述杯形插入物都单独插入到具有合适尺寸的多孔板中一个孔中,以至杯底的外表面指向对应的多孔板孔的底部的内表面。这样一旦成功插入,所述杯形插入物的内腔能够保持通过开口与外界接触,从而使得试剂可以通过这里供给细胞培养。
根据本发明所述的方法,进一步,细胞随后在插入到相应孔中的杯形插入物的管腔里进行培养。细胞培养的条件以及对所获测试结果的参数的评估依赖于相应研究问题。根据本发明所述的方法,其不限于特定细胞的培养,或者特殊材料的测试,或选择的环境,而是适用于多样应用。
本发明涉及一种试剂盒,所述试剂盒用以实施根据本发明所述的方法,气质,所述试剂盒的特征在于,其包括大量不同的上述详细描述的杯形插入物。优选地,一个试剂盒中包括杯形插入物的数目可以被多孔板的孔数整除,所述杯形插入物与所述多孔板的尺寸相匹配。所述试剂盒还包括试剂盒中杯形插入物所用到材料和/或表面结构的说明书。
附图:
图1显示了用于由美国康宁公司制造的24-孔的多孔板的杯形插入物的一种装置,其中,立体图见图示(A),侧视图见图示(B),A-A剖视图见图示(C),而顺着A-A剖视图的剖面示意图见图示(D)。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
实施例:
应用于美国康宁公司生产的24-孔多孔板的杯形插入物的设计:
所述杯形插入物由图(A)到(D)示意说明,其具有一个开口1,外壁2和底部3。插入物具有截顶圆锥的基本形状,其中开口1的面积比底部3的面积大。在插入物远离底部3的一端,插入物有一个突出物,用来在孔中固定插入体。底部3大致平坦,且有一个磨光的外表面。在面向内腔的内表面上,底部3包含了一种待测试的材料。插入物的深度由以下方式选择,即一旦插入物成功地插入到由康宁公司生产的24-孔多孔板的一个孔中,插入物的底部3以平面的方式支撑在孔的底部上。如果插入物和多孔板均是透明的,在插入物底部内表面生长的细胞可以使用传统的显微镜检测,所述显微镜是在细胞制备中通常用的显微镜(例如倒置显微镜)。
Claims (11)
1.一种检测不同的所选材料和/或表面结构用于细胞和/或微生物培养的方法,所述方法包括如下步骤:
i)提供以杯形插入物形式的待检测的多个不同的所选材料和/或表面结构,其中,所述杯形插入物的尺寸以下述方式体现,即每一个杯形插入物能够基本上准确地以匹配的方式嵌入到多孔板的一个孔中来适合细胞培养,其中,所述每个杯形插入物具有壁、一个底部和一个与底部相对的一侧的开口,其中,所述杯形插入物的壁和底部是不漏水的,以及,所述每一个杯形插入物至少在底部的内表面上具有所选材料和/或所选表面结构;
ii)将所述杯形插入物插入到尺寸合适的多孔板的孔中,使得杯底部的外表面指向多孔板的孔底的内表面;
iii)在杯形插入物的内腔中培养细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,至少一部分所述杯形插入物具有如下尺寸,即所述杯形插入物能够基本上准确地以匹配的方式嵌入到4-孔、6-孔、12-孔、24-孔、48-孔、96-孔或者384-孔多孔板的孔中,优选嵌入到24-孔多孔板的孔中。
3.根据上述任一项权利要求所述的方法,其特征在于,至少一部分所述杯形插入物具有确保所述杯形插入物固定在多孔板的孔中的方法,优选地,至少一部分所述杯形插入物在杯的上边沿有突出物,一旦杯形插入物嵌入,所述突出物与孔的上边沿接触。
4.根据上述任一项权利要求所述的方法,其特征在于,至少一部分所述杯形插入物是透明的。
5.根据上述任一项权利要求所述的方法,其特征在于,至少一部分所述杯形插入物的尺寸以下述方式体现,即一旦插入物嵌入到多孔板的孔中,所述杯形插入物的底部平行位于孔底的上部。
6.根据上述任一项权利要求所述的方法,其特征在于,至少一些所述杯形插入物包括相应的所选材料和/或相应的所选表面结构,其中,所述相应的所选材料和/或相应的所选表面结构覆盖所述杯形插入物的内表面。
7.根据上述任一项权利要求所述的方法,其特征在于,至少一些所述杯形插入物由相应的所选材料组成。
8.根据权利要求1~5任一项所述的方法,其特征在于,至少一些所述杯形插入物的组成具有如下特点,即仅所述杯底包括或由所述相应的可选材料和/或可选表面结构组成。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,至少一部分所述杯形插入物通过反向注射的方法获得。
10.根据上述任一项权利要求所述的方法,其特征在于,至少一个所述杯形插入物在其杯的内表面具有一种表层结构,所述表层结构仅在杯形插入物成型后形成。
11.一种用以实施根据权利要求1~10任一项所述的方法的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括多种不同的杯形插入物。
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