JP2013034396A

JP2013034396A - 細胞培養シャーレ

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Publication number: JP2013034396A
Application number: JP2011170633A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiko Kobayashi; 一彦小林; Norihisa Sasayama; 典久笹山; Yui Hagiwara; 由以萩原
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 2011-08-04
Filing date: 2011-08-04
Publication date: 2013-02-21
Anticipated expiration: 2031-08-04
Also published as: JP5853475B2

Abstract

【課題】胚などの細胞の培養に用いられるシャーレにおいて、ウェルを深くすることなく確実にドロップを作製することができる手段を提供する。
【解決手段】細胞培養シャーレ１０は、平らな第１底面１１及び第１底面１１の周りに立設された側壁１２を有する。第１底面１１は、周縁部１６を除く表面が疎水性である。第１底面１１には、第１底面から窪んだ凹部１３が設けられている。凹部１３及び周縁部１６は、表面が親水性である。これにより、胚の培養におけるドロップ５０は、凹部１３に対して親和性が高く、周縁部１６を除く第１底面１１へは移動し難くなるので、細胞培養シャーレ１０において、凹部１３を深くすることなく確実にドロップ５０を作製することができる。
【選択図】図４

Description

本発明は、胚等の細胞を培養するに適した細胞培養シャーレに関する。

従来より、マウスなどの哺乳動物の胚が体外で培養可能である。胚の培養方法として、平らなシャーレの底に、数十μＬの培養液のドロップを間隔をおいて複数個滴下して作製し、このドロップをミネラルオイルで覆った後に、胚をドロップに導入して培養するマイクロドロップ法と呼ばれる方法が知られている。また、同じマイクロドロップ法を用いて、ドロップ同士が付着することを防止できる手法として、シャーレの底にウェルを形成し、そのウェルに形成した少量のドロップ内において胚を培養する手法が知られている（特許文献１）。マイクロドロップ法の変法としては、シャーレの底をミネラルオイルで覆った後に、パスツールピペットなどを用いて、ウェル内に胚を含んだドロップを作製する手法も採用されている。

特開２００６−２８０２９８号公報

前述されたようなシャーレを用いた胚培養において、オイルで覆ったシャーレの底にドロップを作製することは、ピペットの先端から吐出されたドロップがオイル中で液滴になるため、吐出直後はオイル中に浮遊する状態になり、シャーレに接触せず、付着しにくい。シャーレ底面に液滴となっているドロップを付着させるには、ピペットの先端から吐出される液滴とシャーレの滴下面となるウェルとの接触面積が広い方が好ましい。また、シャーレの移動などによってオイルが揺れ動いても、ドロップがウェルから剥がれたり、隣り合うドロップが接触して結合しないことが培養するに当たって望まれる。このような観点から、シャーレに形成されるウェルには、ある程度の深さが必要であった。しかしながら、ウェルが深くなると、ドロップを作製するときにウェルの底にまでパスツールピペットの先端を到達させなければならず、その際にパスツールピペットの先端がウェルの縁に接触して破損したり、パスツールピペットをウェルより取り出す際にウェルの側壁に接触して破損するおそれがある。

本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、胚などの細胞の培養に用いられるシャーレにおいて、ウェルを深くすることなく確実にドロップを作製することができる手段を提供することを目的とする。

また、本発明の他の目的は、胚などの細胞培養に用いられるシャーレにおいて、ピペットの先端とウェルの縁との接触を回避し得る手段を提供することにある。

(1) 本発明は、平らな第１底面及び当該第１底面の周りに立設された側壁を有する細胞培養シャーレに関する。上記第１底面は、表面が疎水性である疎水領域と、当該疎水領域において上記第１底面から窪んだ凹部と、を有する。上記凹部及びその周縁部は、表面が親水性である。

凹部及びその周縁部の表面は親水性であり、その凹部の周縁部より外れた第１底面は疎水性である。これにより、胚の培養におけるドロップは、凹部に接触しやすく、第１底面へは移動し難くなる。

(2) 上記第１底面には、複数個の上記凹部が疎水領域を介在させて配置されていてもよい。

一つのシャーレにおいて複数個のドロップを作製することができ、かつシャーレが揺らされても各ドロップが接触して結合することが防止される。

(3) 上記凹部は、厚みが均一であり且つ平らな平面領域を有する第２底面と、当該第２底面の周りから起立して上記第１底面と連続する側面と、を有してもよい。

凹部の第２底面が平面領域を有することにより、平面領域に存在するドロップを顕微鏡にて観察することが容易である。

(4) 上記第２底面の中央と上記側面の上端とを結ぶ第１仮想直線と上記第２底面とがなす第１角度は、上記第２底面の中央と上記側壁の上端とを結ぶ第２仮想直線と上記第２底面とがなす第２角度より小さくてもよい。

細胞培養シャーレに対して、先端が凹部の第２底面の中央付近に到達するように挿入されるピペットが側壁と当接しないためには、ピペットの軸線と第２底面とがなす角度が第２角度より大きくなるように、ピペットを傾斜させなければならない。このように傾斜されたピペットは、凹部の側面の上端、すなわち凹部と第１底面との境界となる縁部に接触することがない。

本発明によれば、細胞培養シャーレにおける凹部及びその周縁部の表面が親水性であり、その周縁部より外れた第１底面が疎水性であるので、胚の培養におけるドロップは、凹部に対して親和性が高く、第１底面へは移動し難くなる。これにより、細胞培養シャーレにおいて、凹部を深くすることなく確実にドロップを作製することができる。

また、本発明によれば、凹部における第２底面の中央と側面の上端とを結ぶ第１仮想直線と第２底面とがなす第１角度が、第２底面の中央と側壁の上端とを結ぶ第２仮想直線と第２底面とがなす第２角度より小さいので、先端が凹部の第２底面の中央付近に到達するように挿入されるピペットの軸線と第２底面とがなす角度が第２角度より大きくなる。これにより、ピペットが、凹部の側面の上端、すなわち凹部と第１底面との境界となる縁部に接触することがなく、ピペットの先端側の破損が防止される。

図１は、本発明の実施形態に係る細胞培養シャーレ１０の外観構成を示す斜視図である。図２は、本発明の実施形態に係る細胞培養シャーレ１０の外観構成を示す平面図である。図３は、図２におけるIII-III切断線の断面構造を示す断面図である。図４は、細胞培養シャーレ１０の使用方法を示す断面図である。

以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。

図１，２に示されるように、細胞培養シャーレ１０は、平面視においてほぼ長方形の外形を呈しており、上側が開口された容器形状をなすものである。細胞培養シャーレ１０は、平らな第１底面１１と、第１底面１１の周りに立設された側壁１２と、を有する。細胞培養シャーレ１０は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアミドなど、電子線滅菌や放射線滅菌が可能であり、かつ透明度の高い合成樹脂を素材として成型されたものである。なお、細胞培養シャーレ１０の外形は特に限定されず、例えば、上側が開口された円柱形や多角柱形の容器形状であってもよい。

第１底面１１は、細胞培養シャーレ１０の底板における上面である。第１底面１１の表面の全域（周縁部１６を除く）は疎水性である。つまり、後述される周縁部１６を除く第１底面１１の表面の全域が、本発明における疎水領域に相当する。疎水性とは、一般的には水分子との親和性が小さい性質をいう。ここでは、第１底面１１の表面と水との親和性が小さいことが疎水性と称される。したがって、疎水性は、水の濡れ性が弱いと換言されてもよい。濡れ性は、一般的には固体表面と流体との界面現象をいう。例えば、オイル中に水を滴下して、オイル及び水の２種の流体が第１底面１１に接触している場合、液滴をなす水とオイルとの界面は、第１底面１１と所定の接触角をなす。この接触角が９０°より大きければ、水よりオイルの方が濡れ性が強い、つまり、水の濡れ性が弱いこととなる。逆に、接触角が９０°より小さければ、水がオイルより濡れ性が高いこととなる。なお、第１底面１１の疎水性は、後述される凹部１３及び周縁部１６の親水性との対比において水の濡れ性が弱ければよく、必ずしも接触角が９０°より大きくなくてもよい。

図２に示されるように、第１底面１１には、複数の凹部１３が設けられている。凹部１３は、第１底面１１から下方へ窪んだ丸皿形状である。凹部１３は、長方形の外形をなす第１底面１１において、長辺方向に沿って３行、短辺方向に沿って４列の合計１２個が、相互に独立した状態で配置されている。凹部１３が相互に独立しているとは、隣り合う凹部１３及び周縁部１６が直接に連続しておらず、その間に周縁部１６を除く第１底面１１が介在していることをいう。各凹部１３は、いずれも同じ形状なので、以下には一つの凹部１３について詳細な説明がなされる。なお、凹部１３の個数は特に限定されないので、１２個より増減されてもよい。また、各凹部１３は丸皿形状である必要はなく、例えば角皿形状や円筒形状などであってもよい。更に、各凹部１３は、必ずしも同一の形状でなくてもよい。

図３に示されるように、凹部１３は、円形の第２底面１４と、第２底面１４の周りから起立して第１底面１１と連続する円周形状の側面１５と、を有する。第２底面１４は、細胞培養シャーレ１０の底板の上面の一部である。第２底面１４において、底板の厚みは均一である。また、第２底面１４の表面は平らである。第２底面１４の表面が、本発明における平面領域に相当する。側面１５は、第２底面１４の周縁から斜め上方へ傾斜して第１底面１１と連続している。つまり、側面１５は、第１底面１１から第２底面１４へ向かってテーパ状に縮径した円周面である。第１底面１１と側面１５との境界、及び第２底面１４と側面１５との境界はラウンド加工（Ｒ加工）が施されている。

ここで、第２底面１４の中央と側面１５の上端とを結ぶ第１仮想直線１０１と第２底面１４とがなす角度を第１角度θ１とする。また、第２底面１４の中央と側壁１２の上端とを結ぶ第２仮想直線１０２と第２底面１４とがなす角度を第２角度θ２とする。第１角度θ１と第２角度θ２とを比較すると、第１角度θ１が第２角度θ２より小さい（第１角度θ１＜第２角度θ２）。

なお、第２角度θ２は、凹部１３と側壁１２との距離が長くなるほど小さくなるので、第２仮想直線１０２を側壁１２の上端のいずれの位置とするかによって第２角度θ２が変化することになるが、ここでは、最も第２角度θ２が小さくなるように、第２仮想直線１０２は、凹部１３から最も遠い側壁１２の上端と第２底面１４の中央とを結ぶものとする。また、第１底面１１における凹部１３の位置が変わると、第１角度θ１は凹部１３が同一形状であれば同じであるが、第２角度θ２は、各凹部１３と側壁１２までの距離が変わるので変化する。したがって、第１角度θ１は、各凹部１３における第２角度θ２のいずれよりも小さいものとする。

第２底面１４及び側面１５の全域は親水性である。また、第１底面１１における凹部１３の周縁部１６も親水性である。なお、周縁部１６は、図２において破線で示される領域である。親水性とは、一般的には水分子との親和性が大きい性質をいう。ここでは、第２底面１４、側面１５及び周縁部１６と水との親和性が大きいことが親水性と称される。したがって、親水性は、水の濡れ性が強いと換言されてもよい。なお、第２底面１４、側面１５及び周縁部１６の親水性は、前述された第１底面１１の疎水性との対比において水の濡れ性が強ければよく、必ずしも接触角が９０°より小さくなくてもよい。このような親水性は、例えば凹部１３の表面領域のみをプラズマ処理するなど、公知の表面処理により付与することができる。

以下、細胞培養シャーレ１０の一使用方法が説明される。細胞培養シャーレ１０は、哺乳動物の胚などを培養する際に用いられる。マイクロドロップ法と称される方法により胚が培養されるときには、図４に示されるように、細胞培養シャーレ１０にミネラルオイル５１を注いで第１底面１１を覆い、パスツールピペット５２の先端を凹部１３の第２底面１４に接触させながら、胚を含む培養系の液体をパスツールピペット５２から吐出させてドロップ５０を作製する。

細胞培養シャーレ１０に対して、先端が凹部１３の第２底面１４の中央付近に到達するように挿入されるパスツールピペット５２が側壁１２と当接しないためには、パスツールピペット５２の軸線１０３と第２底面１４とがなす第３角度θ３が第２角度θ２より大きくなるように、パスツールピペット５２を傾斜させなければならない（第３角度θ３＞第２角度θ２）。つまり、いずれの凹部１３においても、第３角度θ３は、必ず第１角度θ１より大きいこととなる（第３角度θ３＞第１角度θ１）。このように傾斜されたパスツールピペット５２は、凹部１３の側面１５の上端、すなわち凹部１３と第１底面１１との境界となる縁部に接触することがない。

パスツールピペット５２から吐出された液体は、凹部１３に接触する。凹部１３及び周縁部１６の表面は親水性であり、凹部１３の周囲において周縁部１６を除く第１底面１１は疎水性である。これにより、ドロップ５０は、凹部１３に対して親和しやすく、第１底面１１へは移動し難くなる。したがって、凹部１３を深くすることなく確実にドロップ５０を作製することができる。

前述された操作を繰り返して、１２個の凹部１３にそれぞれドロップ５０を作製する。各凹部１３は、相互に独立しており、その間に疎水性の第１底面１１が介在するので、細胞培養シャーレ１０がインキュベータ等に移動される際に揺らされても、各ドロップ５０が凹部１３から離れて他のドロップ５０と接触して結合することがない。また、凹部１３の周囲である周縁部１６の表面が親水性であるので、ドロップ５０が凹部１３と周縁部１６との境界において立ち上がることが防止できる。これにより、凹部１３の表面のみが親水化されている場合よりも、細胞培養シャーレ１０が揺らされたときにドロップ５０同士が結合するリスクを低減することができる。

また、培養の過程においてドロップ５０の胚を観察するには、細胞培養シャーレ１０の凹部１３に顕微鏡の焦点を合わすことになるが、凹部１３は、厚みが均一であり且つ平らな第２底面１４を有するので、顕微鏡による観察が容易である。また、凹部１３の周囲である周縁部１６の表面が親水性であるので、凹部１３の表面のみが親水化されている場合よりも、ドロップ５０の上側の面がなだらかなドーム形状となり、ドロップ５０を顕微鏡にて観察することが一層容易となる。

１０・・・細胞培養シャーレ
１１・・・第１底面（疎水領域）
１２・・・側壁
１３・・・凹部
１４・・・第２底面
１５・・・側面
１６・・・周縁部

Claims

平らな第１底面及び当該第１底面の周りに立設された側壁を有する細胞培養シャーレであって、
上記第１底面は、表面が疎水性である疎水領域と、当該疎水領域において上記第１底面から窪んだ凹部と、を有しており、
上記凹部及びその周縁部は、表面が親水性である細胞培養シャーレ。
上記第１底面には、複数個の上記凹部が疎水領域を介在させて配置されている請求項１に記載の細胞培養シャーレ。
上記凹部は、厚みが均一であり且つ平らな平面領域を有する第２底面と、当該第２底面の周りから起立して上記第１底面と連続する側面と、を有する請求項１又は２に記載の細胞培養シャーレ。
上記第２底面の中央と上記側面の上端とを結ぶ第１仮想直線と上記第２底面とがなす第１角度は、上記第２底面の中央と上記側壁の上端とを結ぶ第２仮想直線と上記第２底面とがなす第２角度より小さい請求項３に記載の細胞培養シャーレ。