JP2006280298A - 細胞培養用容器 - Google Patents

Abstract

【課題】 マイクロドロップ法のように少量の培養液中での細胞培養を目的とした使用方法においても、収容区画内を底部下方から顕微鏡観察が可能であり、容器内部を無駄なく区画して使用できる細胞培養用容器を提供する。
【解決手段】 底部２と側壁３とを有し、内部に既定の容量の培養系収容区画４が設けられてなる細胞培養用容器１であって、該培養系収容区画４は均一な厚みを有する底面４１と、壁面４２と、該底面４１および壁面４２を接続するなだらかな曲面４３とから構成されてなり、該培養系収容区画４の壁面４２は底面４１の鉛直方向に対して５〜２０°傾斜した状態で配置されてなることを特徴とする細胞培養用容器１。
【選択図】 図２

Description

本発明は、生殖補助技術（ＡＲＴ）での体外受精において、卵子と精子を受精させるために同一培養系に収容し、あるいは受精卵を一定期間培養するための細胞培養用容器に関する。

体外受精とは、卵管閉塞等の女性側因子、良好な精子の数が少ない等の男性側因子、あるいはその両方の因子に起因する不妊症例に対し行われるものであり、患者から採取した卵子と精子を体外で受精させ、ある程度培養した後に体内に戻す施術である。精子の数が少ない不妊症例においては、受精確率を上げるために、受精前の精子が浮遊している培養液層を小さくした、マイクロドロップ法と呼ばれる微小培養系での受精方法が多く採用されている。

従来、このマイクロドロップ法には、卵子と精子を同一の培養系にて受精させたり、受精卵を生体への移植時期まで培養したりするための容器として、底面が単一平面であり、直径が３０〜６０ｍｍのシャーレが使用されている。通常、該シャーレの底面には、卵子および精子と培養液からなる培養系、または受精卵と培養液からなる培養系が間隔をあけて数個作製され、３〜６日間培養される。培養中は、培養物の活動により発生する老廃物の増大、または培養液中の栄養成分の減少による悪影響を防ぐため、各培養系の培養液を数回交換する必要がある。しかしながら、上記シャーレを用いた場合、培養液の交換の際に、間隔をあけて作製されていた培養系が移動して別の培養液と合体してしまうおそれがあった。

一方、周壁で囲まれた培養物の収容区画が設けられた培養容器が公知である（例えば、特許文献１参照）。この容器は、培養物を各収容区画の底面に固定し、培養液を全収容区画を覆うように満たして培養物の培養を行うためのものである。該容器では、収容区画が容器の中央部にのみ設けられている。したがって、容器の縁部において培養液の液面が表面張力によって盛り上がることにより、縁部における容器底部からの培養物の顕微鏡観察ができないという不具合が生じるおそれがない。しかし、この容器は、培養物が底面に固定されない体外受精においては使用することができない。また、該容器は、容器の縁部における液面の盛り上がりを根本的に解決したものではないため、容器の縁部に収容区画を形成することはできず、縁部付近がデッドスペースとなってしまう。

また、容器底部に第一凹部が形成され、該第一凹部の底部にさらに第二凹部が形成された容器も提案されている（例えば、特許文献２参照）。この容器は、第一凹部全体に培養液を満たし、第二凹部に注入された精子が培養液中を移動し、第一凹部に到達したところを選択的に採取する、ｓｗｉｍ ｕｐ法に使用されるものである。しかし、該容器は、特許文献１で指摘する収容区画縁部における液面の表面張力による盛り上がりについての対策が取られていないため、マイクロドロップ法などに使用するために収容区画を小容量とした場合、収容区画内の底部からの顕微鏡観察を正確に行うことができない。

さらに、容器内が培養液を含有するゲル状物質等からなる壁面で区画された培養容器も公知である（例えば、特許文献３参照）。この容器は、収容区画に収容された培養液が培養液を含有するゲル状物質等からなる壁面と常に接触しているため、培養期間中に培養液の交換を行う必要がない。しかし、該容器もまた、収容区画縁部における液面の表面張力による盛り上がりについての対策が取られていないため、収容区画を小容量とした場合、収容区画内の底部からの顕微鏡観察を正確に行うことができない。

実開平４−１２８９８号公報 特開２００３−２８９８５０号公報 特開２００４−１４１１１０号公報

そこで本発明は、マイクロドロップ法のように少量の培養液中での細胞培養を目的とした使用方法においても、収容区画内を底部下方から顕微鏡観察が可能であり、容器内部を無駄なく区画して使用できる細胞培養用容器を提供することを目的とする。

本発明者は、鋭意検討を行った結果、収容区画の底面と壁面との境界部を曲面とし、かつ、収容区画の壁面を底面の鉛直方向に対して傾斜した状態で配置することで、収容区画内の底面下方からの顕微鏡観察を収容区画の縁部まで正確に行え、さらに収容区画を小容量に設計することが可能な容器を提供することができることを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、
（１） 底部と側壁とを有し、内部に既定の容量の培養系収容区画が設けられてなる細胞培養用容器であって、該培養系収容区画は均一な厚みを有する底面と、壁面と、該底面および壁面を接続するなだらかな曲面とから構成されてなり、該培養系収容区画の壁面は底面の鉛直方向に対して５〜２０°外側に傾斜した状態で配置されてなることを特徴とする細胞培養用容器、
（２） 前記培養系収容区画の底面と壁面は、曲率半径が０．１〜１．０ｍｍの曲面で接続されてなる（１）記載の細胞培養用容器、
（３） 前記培養系収容区画の容量は、０．０１〜０．１０ｍＬである（１）または（２）に記載の細胞培養用容器、
（４） 前記培養系収容区画の底面は、前記細胞培養用容器の底部を利用したものであり、該培養系収容区画の壁面は、該細胞培養用容器の底部上面に前記曲面を介して接続されたものである（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養用容器、
（５） 前記培養系収容区画は、前記細胞培養用容器の底部に設けられた凹部であり、該培養系収容区画の壁面の上端が該細胞培養用容器の底部上面と面一である（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞培養用容器、
（６） 前記培養系収容区画は、前記細胞培養用容器内部に複数個設けられてなる（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞培養用容器
に関する。

本発明の細胞培養用容器は、培養系収容区画の底面と壁面とがなだらかな曲面で接続され、かつ、培養系収容区画の壁面を底面の鉛直方向に対して外側に傾斜した状態で配置することで、従来の容器のように収容区画の縁部で培養系の液面が表面張力により盛り上がることを抑制することができる。したがって、培養系収容区画の縁部においても底面下方からの顕微鏡観察を正確に行うことができる。また、培養系収容区画を小容量に設計すること、および該培養系収容区画を細胞培養用容器の縁部に配置することが可能であるため、細胞培養用容器の小型化を図ることができる。さらに、培養系収容区画の底面の縁部が曲面であるため、培養後の培養物の採取を容易に行うことができる。

以下に、本発明の細胞培養用容器を添付図面に示す好適な実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの説明に限定されるものではない。
図１は本発明の細胞培養用容器の一実施例を示す上面図であり、図２は図１に示される細胞培養用容器の断面図、図３は図１に示される細胞培養用容器の側面図である。また、図４は本発明の細胞培養用容器の他の実施例を示す上面図である。

図２に示されるように、本発明の細胞培養用容器１は、底部２と側壁３とを有してなり、内部に規定の容量の培養系収容区画４が設けられてなる。該容器１を構成する材料としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアミドなど、電子線滅菌が可能であり、かつ、透明性の高いものが好ましく採用される。
該細胞培養用容器１の形状としては、円筒状や多角柱状の他、該細胞培養用容器１を側壁３の外側から把持しうることが容易な形状であれば特に限定されない。該細胞培養用容器１の大きさもまた特に限定されないが、マイクロドロップ法のように少量の培養液中での細胞培養を目的とした使用方法に用いられる場合は、培養系収容区画４を必要数備えた上で、必要最小限に小さく設計されることが好ましく、具体的には外径が３０〜６０ｍｍ程度であることが好ましい。

前記培養系収容区画４とは、卵子や精子、受精卵などの培養物と、セファロチン等の抗生物質や緩衝液としてのＨｅｐｅｓ等を含む培養液とからなる培養系を収容しうる区画された小室である。該培養系収容区画４は底面４１と壁面４２とで構成され、該底面４１と壁面４２とはなだらかな曲面４３で接続されている。また、該培養系収容区画４を構成する壁面４２は、底面４１の鉛直方向に対して５〜２０°外側に傾斜して配置されてなる。このような構成により、該培養系収容区画４内に収容された培養系の液面が縁部において表面張力により盛り上がることを抑制することができる。したがって、培養系収容区画４の縁部においても底面４１下方からの顕微鏡観察を正確に行うことができる。また、該培養系収容区画４内に収容された培養物を採取する際、ピペット等の器具の挿入および操作が行いやすい。前記壁面４２の傾斜が５°よりも小さいと、培養系の表面張力により液面の盛り上がりを抑制する効果が少なく、また傾斜が２０°を超えると、培養物が壁面４２に乗り上がってしまい、底面４１下方からの顕微鏡観察を正確に行うことができなくなるおそれがある。

前記培養系収容区画４を構成する曲面４３の形状は、なだらかな曲面であって該培養系収容区画４の底面４１縁部に角を形成しないものであれば特に限定されないが、具体的には、曲率半径が０．１〜１．０ｍｍの曲面であることが好ましい。該曲面４３の曲率半径が０．１ｍｍよりも小さいと、培養物が底面４１と壁面４２の間に挟まりピペットやカテーテルによる採取が困難となる。また、該曲面４３の曲率半径が１．０ｍｍよりも大きいと、培養物が培養中に曲面４３上に乗り上がりやすくなり、その部分においては底面４１下方からの顕微鏡観察が正確に行えないおそれがある。該曲面４３を有することにより、本発明の細胞培養用容器１は、培養系収容区画４から培養後の培養物の採取をより容易に行うことができる。

前記培養系収容区画４は、マイクロドロップ法に用いる場合には、好ましくは０．０１〜０．１０ｍＬの容量を有するものであり、さらに具体的には、底面４１が直径２〜１０ｍｍの円形であり、壁面４２の高さが１〜５ｍｍであることが好ましい。本発明の培養系収容区画４は、縁部まで底面４１下方からの顕微鏡観察が可能であるため、前記容量より大きい容量を有するものであっても、培養系の量に応じて必要最小限の容量に設定することが可能である。

前記培養系収容区画４は、底面４１として細胞培養用容器１の底部２を利用して壁面４２が該底部２上面に配置されたものであってもよいし、細胞培養用容器１の底部２に設けられた凹部であってもよい。
前者において、該培養系収容区画４の底面４１が細胞培養用容器１の底部２を利用するとは、該細胞培養用容器１の底部２が該培養系収容区画４の底面４１を兼ねている状態を指す。すなわち、該培養系収容区画４は、細胞培養用容器１の内部を壁面４２を用いて区切ることにより形成される。該壁面４２は、曲面４３を介して細胞培養用容器１の底部２上面に接続される。
一方、後者においては、図２に示されるように、該培養系収容区画４の底面４１が、細胞培養用容器１の底部２よりも一段窪んだ位置に形成される。該培養系収容区画４の壁面４２の上端は、該細胞培養用容器１の底部２上面と面一であることが好ましい。細胞培養用容器１内に収容される培養系は、培養液の蒸発を防ぐために表面がパラフィン等のオイルで覆われる場合があるが、後者の構成を有する細胞培養用容器１においては、該オイルを底部２表面を満たすように使用すればよい。

該培養系収容区画４は、内部に収容される培養系が底面４１を介して該底面４１下方から顕微鏡によって観察される。したがって、該底面４１は均一な厚みを有しており、該厚みの平均値が０．５〜３ｍｍであることが好ましいが、該厚みのばらつきが±０．１ｍｍ程度で有れば顕微鏡観察に支障をきたすことはない。
また、底面４１は顕微鏡観察を考慮して、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアミドなどの透明度の高い材料で構成される。該透明度としては、波長４５０ｎｍ光の透過率が５５％以上であれば顕微鏡観察は可能であるが、透過率が９０％以上であることが観察の精度がより高いものとなり好ましい。

前記培養系収容区画４は、図１に示されるように細胞培養用容器１内部に複数個配置されていてもよい。該培養系収容区画４の配置方法は特に限定されず、図１に示されるようにマトリクス様に配置されていてもよいし、図４に示されるように環状に配置されていてもよい。さらに、該培養系収容区画４には、それぞれの区画４を認識するための識別記号４４や、起点となる記号４５が表示されてあってもよい。該記号４４および４５は、培養系収容区画４の底面４１あるいは壁面４２や、細胞培養用容器１の底部２または側壁３などに適宜表示することができる。
該培養系収容区画４が複数配置する場合、該培養系収容区画４同士の間隔は特に限定されず、各培養系収容区画４内部に収容される培養系が振動などによって互いに混合しない程度の距離であればよい。該間隔が大きすぎると、細胞培養用容器１の小型化が行えなくなるおそれがある。本発明の培養系収容区画４は縁部で培養系の液面が表面張力により盛り上がることを抑制できるため、細胞培養用容器１の縁部であっても問題なく配置することができ、細胞培養用容器１内部を無駄なく区画して使用することができる。

本発明の細胞培養用容器１には、さらに側壁３の外周面に、図３に示されるような凸部３１が形成されていてもよい。該凸部３１は、細胞培養用容器１を側壁３の外側から把持する際に滑り止めとしての効果を有する。該凸部３１は側壁３の外周面全周にわたって設けられていてもよいが、外周面に断続的に設けられていてもよい。
また、該側壁３は底部２に対して鉛直方向に配置されていていてもよいし、図３に示されるように底部２の鉛直方向に対してわずかに傾斜するように配置されていてもよい。該側壁３が底面２の鉛直方向から傾斜している場合、細胞培養用容器１を側壁３の外側から把持する際の滑り止め効果が向上しより好ましい。

本発明の細胞培養用容器の一実施例を示す上面図である。 本発明の図１に示される細胞培養用容器の断面図である。 本発明の図１に示される細胞培養用容器の側面図である。 本発明の本発明の細胞培養用容器の他の実施例を示す上面図である。

符号の説明

１ 細胞培養用容器
２ 底部
３ 側壁
３１ 凸部
４ 培養系収容区画
４１ 底面
４２ 壁面
４３ 曲面
４４ 識別記号
４５ 記号

Claims (6)

1. 底部と側壁とを有し、内部に既定の容量の培養系収容区画が設けられてなる細胞培養用容器であって、該培養系収容区画は均一な厚みを有する底面と、壁面と、該底面および壁面を接続するなだらかな曲面とから構成されてなり、該培養系収容区画の壁面は底面の鉛直方向に対して５〜２０°外側に傾斜した状態で配置されてなることを特徴とする細胞培養用容器。
2. 前記培養系収容区画の底面と壁面は、曲率半径が０．１〜１．０ｍｍの曲面で接続されてなる請求項１記載の細胞培養用容器。
3. 前記培養系収容区画の容量は、０．０１〜０．１０ｍＬである請求項１または２に記載の細胞培養用容器。
4. 前記培養系収容区画の底面は、前記細胞培養用容器の底部を利用したものであり、該培養系収容区画の壁面は、該細胞培養用容器の底部上面に前記曲面を介して接続されたものである請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養用容器。
5. 前記培養系収容区画は、前記細胞培養用容器の底部に設けられた凹部であり、該培養系収容区画の壁面の上端が該細胞培養用容器の底部上面と面一である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養用容器。
6. 前記培養系収容区画は、前記細胞培養用容器内部に複数個設けられてなる請求項１〜５のいずれかに記載の細胞培養用容器。

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