WO2017030196A1 - 培養容器並びに該培養容器を使用した細胞培養方法及び細胞観察方法 - Google Patents

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慎一 五味
加川　健一
祐介 依田
真哉 三木
濱口　竜哉
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東京エレクトロン株式会社
トーカロ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a culture vessel, a method for culturing cells using the culture vessel, and a method for observing cells using the culture vessel.
  • a culture container in which the inner surface of a recess is hydrophilized As a culture container, a culture container in which the inner surface of a recess is hydrophilized is known (for example, Patent Document 1).
  • the hydrophilic treatment of the inner surface of the recess is performed for various purposes. For example, when culturing adherent cells, the inner surface of the recess is treated with oxygen plasma for the purpose of improving adhesion to the inner surface of the recess, such as cells and cell scaffolding materials (eg, extracellular matrix). As a result, surface charges are introduced, and as a result, the inner surface of the recess is hydrophilized.
  • the inner surface of the recess is subjected to a superhydrophilic treatment for the purpose of preventing adhesion of the recess such as a cell to the inner surface due to hydrophobic interaction.
  • the culture solution in the vicinity of the inner peripheral surface of the recess is strongly attracted to the inner peripheral surface of the recess.
  • the thickness of the portion in the vicinity of the inner peripheral surface is larger than the thickness of the other portions, and a phenomenon that the liquid surface of the culture solution bends in a concave shape, that is, a concave meniscus occurs.
  • the concave meniscus is also generated when the inner peripheral surface of the concave portion is not hydrophilized.
  • a concave meniscus is generated when components such as amino acids and proteins contained in the culture medium are adsorbed on the inner peripheral surface of the recess during cell culture and the inner peripheral surface of the recess changes to hydrophilic.
  • the concave meniscus causes various problems. For example, when seeding cells in a culture vessel, the amount of seeded cells per unit area on the bottom surface of the recess increases near the inner peripheral surface of the recess, making uniform cell seeding difficult. In addition, when observing cells in the culture vessel with an optical microscope after cell culture, the optical axis is distorted due to the tilt of the liquid surface in the vicinity of the inner peripheral surface of the recess, so that it exists in the vicinity of the inner peripheral surface of the recess. Observation of cells becomes difficult or impossible.
  • Known techniques for preventing the concave meniscus include a technique of inserting a cylindrical body having a water-repellent inner surface into a culture vessel during observation (Patent Document 2), a technique of floating a transparent flat plate on the culture medium (Patent Document 3), etc. It has been.
  • the present invention provides a culture vessel, a method for culturing cells using the culture vessel, and a cell using the culture vessel, which can prevent a concave meniscus without using a jig. It aims to provide a method of observation.
  • the present invention provides the following inventions.
  • a culture vessel comprising a substrate having a recess and a water repellent layer formed on an outer edge region of the bottom surface of the recess and an inner peripheral surface of the recess, wherein one surface of the water repellent layer is the A culture container exposed to the space in the recess.
  • the culture container according to (1) wherein the bottom surface of the recess is a flat surface.
  • the culture container according to (1) or (2), wherein a contact angle between one surface of the water repellent layer and water is 115 ° or more.
  • the culture container according to (4) further comprising an adhesion layer formed between the water repellent layer and the DLC layer.
  • (6) A method for culturing cells using the culture vessel according to any one of (1) to (5), wherein the outer edge of the bottom surface of the recess is seeded before the cells are seeded in the recess. Forming the extracellular matrix layer in a region other than the region.
  • (7) A method for observing cells using the culture vessel according to any one of (1) to (5), wherein the cells in the recesses are phase-differenced from the bottom surface side or the opening side of the recesses. A method comprising the step of observing with a microscope.
  • a culture vessel capable of preventing a concave meniscus without using a jig, a method of culturing cells using the culture vessel, and observing cells using the culture vessel A method is provided.
  • FIG. 1 is a perspective view of a culture vessel according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is an end view taken along the line AA of the culture vessel shown in FIG.
  • FIG. 3 is an enlarged view of a portion indicated by a symbol P in FIG.
  • FIG. 4 is a perspective view of a substrate provided in the culture vessel main body of the culture vessel shown in FIG.
  • FIG. 5 is an end view taken along line BB of the substrate shown in FIG.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining a process of forming an extracellular matrix layer.
  • FIG. 7A is a diagram for explaining a concave meniscus that occurs when a water repellent layer is not formed.
  • FIG. 7A is a diagram for explaining a concave meniscus that occurs when a water repellent layer is not formed.
  • FIG. 7B is a diagram for explaining that the formation of a concave meniscus is prevented by forming a water-repellent layer in the culture container shown in FIG. 1.
  • FIG. 8 is a schematic view of a transmission inverted microscope used for cell observation.
  • FIG. 9 is a perspective view of a culture vessel according to the second embodiment. 10 is a cross-sectional view of the culture vessel shown in FIG. 9 along the line CC.
  • FIG. 11 is an enlarged view of a portion represented by a symbol Q in FIG.
  • FIG. 12 is a perspective view of a culture vessel according to the third embodiment. 13 is an end view taken along line DD of the culture vessel shown in FIG.
  • FIG. 14 is a view showing a microscope observation image of a culture dish in which a water repellent layer is formed.
  • FIG. 15 is a view showing a microscope observation image of a culture dish in which a water repellent layer is formed.
  • FIG. 16 is a view showing a microscope observation image of a culture dish in which a water repellent layer is formed.
  • FIG. 17 is a microscopic observation image of a normal culture dish in which a water repellent layer is not formed.
  • FIG. 18 is a diagram showing the relationship between the contact angle and the range that can be observed with a phase-contrast microscope.
  • the culture vessel 10A according to the first embodiment is a culture vessel for microscope observation, that is, a culture vessel capable of culturing cells and observing cultured cells under a microscope. Accordingly, the culture container 10A is configured to satisfy the conditions required for the container for cell culture and the conditions required for the container for microscopic observation. However, the configuration of the culture vessel 10A can be appropriately changed as long as cell culture is possible. When the culture container is not for microscopic observation, it is not necessary to satisfy the conditions required for the container for microscopic observation.
  • Examples of cells cultured in the culture vessel 10A include floating cells and adherent cells.
  • Examples of the adherent cells include pluripotent stem cells (eg, embryonic stem cells (ES cells), inducible pluripotent stem cells (iPS cells), etc.), stem cells, progenitor cells, somatic cells, germ cells and the like.
  • Examples of the floating cells include blood cells such as T cells and B cells.
  • the cells cultured in the culture vessel 10A may form a tissue. Examples of the tissue include cartilage tissue, bone tissue, muscle tissue, corneal tissue, and vascular tissue. The tissue may be a tissue separated from a living body or a tissue differentiated from stem cells.
  • the culture vessel 10A includes a culture vessel main body 1A and a lid 2.
  • the culture vessel main body 1 ⁇ / b> A includes a base 3 having a recess 4, a water repellent layer 5 formed on an outer edge region 411 of a bottom surface 41 of the recess 4 and an inner peripheral surface 42 of the recess 4. Is provided. Of the two surfaces of any layer including the water repellent layer 5, the space-side surface in the recess 4 may be referred to as “one surface”, and the opposite surface may be referred to as the “other surface”. is there.
  • the base 3 is a dish having a diameter of ⁇ 100 mm, a diameter of ⁇ 60 mm, a diameter of ⁇ 35 mm, etc., and the number of recesses that the base 3 has is one.
  • the number of recesses of the substrate 3 can be appropriately changed according to the use of the culture vessel, and the number of recesses of the substrate 3 may be two or more.
  • each recess can be configured in the same manner as the recess 4.
  • Examples of the substrate having two or more recesses include a multiwell plate having cylindrical wells such as 6 holes, 24 holes, 48 holes, and 96 holes.
  • the base 3 has a bottom wall portion 31 and a side wall portion 32 that stands from the periphery of the bottom wall portion 31 and forms the recess 4.
  • the bottom wall part 31 and the side wall part 32 are integrally molded.
  • the bottom wall portion 31 is formed of a flat plate member having a substantially constant thickness, and the inner wall surface of the bottom wall portion 31 and the outer wall surface on the opposite side thereof are flat.
  • the side wall part 32 is comprised by the cylindrical member with substantially constant thickness, and the inner wall surface of the side wall part 32 and the outer wall surface on the opposite side are pillar surfaces (expandable surface).
  • the shape of the bottom wall part 31 and the side wall part 32 can be suitably changed according to the use of a culture container.
  • the flat inner wall surface of the bottom wall portion 31 is a preferable condition when the cells cultured in the culture vessel 10A are adherent cells.
  • the reason is the same as the reason (described later) that the bottom surface 41 of the recess 4 is preferably a flat surface.
  • That the inner wall surface of the bottom wall portion 31 and the outer wall surface on the opposite side are flat is a preferable condition when observing cells cultured in the recess 4 with a microscope. That is, when this condition is satisfied, the accuracy of microscopic observation using the light transmittance of the bottom wall portion 31 can be improved.
  • the microscope observation using the light transmittance of the bottom wall portion 31 for example, a transmission type upright microscope observation in which light is irradiated from below the culture vessel body 1A and the transmitted light is received above the culture vessel body 1A.
  • the entire inner wall surface of the bottom wall portion 31 and the entire inner wall surface of the side wall portion 32 are subjected to a hydrophilic treatment.
  • the hydrophilization treatment include introduction of a hydrophilic functional group on the inner wall surface, formation of a hydrophilic layer on the inner wall surface, and the like.
  • the hydrophilic treatment can be performed according to a hydrophilic treatment generally performed on a culture vessel.
  • a hydrophilic functional group can be introduced into the inner wall surface by a treatment such as plasma treatment, corona discharge treatment or ultraviolet irradiation.
  • a hydrophilic layer material solution for example, a solution of a hydrophilic substance such as collagen, gelatin, fibronectin, laminin, polylysine, thrombospondin, vitronectin
  • a hydrophilic layer is formed on the inner wall surface by curing.
  • the curing process can be performed using a heating method, standing at room temperature, a plasma method, or the like.
  • the hydrophilic layer may be bonded to the inner wall surface by a chemical reaction, a plasma reaction, an electron beam, radiation, or a reaction using ultraviolet rays.
  • the material constituting the bottom wall portion 31 is a light transmissive material.
  • the light transmissive material include plastic, glass, ceramics, and the like.
  • the plastic include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyester (for example, polyethylene terephthalate), acrylic resin (for example, polymethyl methacrylate), and the like.
  • the glass include silica glass.
  • ceramics include silica.
  • the material constituting the bottom wall portion 31 is a light transmissive material, which is a preferable condition for observing cells cultured in the recess 4 with a microscope. That is, when this condition is satisfied, the accuracy of microscopic observation using the light transmittance of the bottom wall portion 31 can be improved.
  • the material constituting the side wall portion 32 may be a light transmissive material or a light non-transparent material, but in the present embodiment, the bottom wall portion 31 and the side wall portion 32 are integrally formed. Therefore, the side wall portion 32 is made of a light-transmitting material like the bottom wall portion 31.
  • the light-impermeable material include ceramics such as alumina, plastics colored in white, black, and the like.
  • the recess 4 has a bottom surface 41, an inner peripheral surface 42 rising from the periphery of the bottom surface 41, and an opening 43 positioned on the opposite side of the bottom surface 41.
  • the bottom surface 41 of the recess 4 is partitioned into an outer edge region 411 and a central region 412 located inside the outer edge region 411 by a boundary line L1.
  • the boundary line L1 is a virtual line, and the outer edge region 411 and the central region 412 are virtual regions.
  • the boundary line L1 is an annular line located inside the outer peripheral line of the bottom surface 41.
  • the boundary line L1 is circular, but may be other annular shapes. Examples of the other ring include an elliptical shape and a rectangular shape.
  • the outer edge region 411 is an annular region that extends along the outer peripheral line of the bottom surface 41.
  • the outer peripheral line of the outer edge region 411 coincides with the outer peripheral line of the bottom surface 41, and the inner peripheral line of the outer edge region 411 coincides with the boundary line L1.
  • the outer edge region 411 has a width W1.
  • the width W1 is a distance between the outer peripheral line of the bottom surface 41 and the boundary line L1.
  • the width W1 of the outer edge region 411 is small. Is preferred.
  • the width W1 of the outer edge region 411 is preferably adjusted such that the ratio of the area of the outer edge region 411 to the area of the bottom surface 41 is 85% or less, It is more preferable to adjust so that it may become 50% or less.
  • the lower limit value of the ratio of the area of the outer edge region 411 to the area of the bottom surface 41 is not particularly limited, but is preferably 5%, more preferably 10%.
  • the width W1 of the outer edge region 411 is preferably adjusted to be 10 mm or less, and more preferably adjusted to be 5 mm or less.
  • the lower limit value of the width W1 of the outer edge region 411 is not particularly limited, but is preferably 0.5 mm, and more preferably 1 mm.
  • the bottom surface 41 of the recess 4 is formed by one surface of the inner wall surface of the bottom wall portion 31 of the base 3 or a hydrophilic layer formed on the inner wall surface, and the inner peripheral surface 42 of the recess 4 is the side wall of the base 3. It is formed by one surface of the inner wall surface of the part 32 or the hydrophilic layer formed on the inner wall surface.
  • the bottom surface 41 of the recess 4 is a flat surface, and the inner peripheral surface 42 of the recess 4 is a column surface (expandable surface).
  • the recess 4 has a circular shape in plan view, and the recess 4 has a rectangular cross-sectional shape.
  • the planar view shape and the cross-sectional view shape of the recess 4 can be appropriately changed.
  • the planar view shape of the recess 4 may be, for example, an elliptical shape, a rectangular shape, or the like.
  • the sectional view shape of the recess 4 may be, for example, a trapezoidal shape.
  • the shorter one of the upper and lower sides of the trapezoid is positioned on the bottom 41 side of the recess 4 so that the entire bottom surface 41 is visible from the opening 43. It is preferable.
  • the flat bottom surface 41 of the recess 4 is a preferable condition when the cells cultured in the culture vessel 10A are adherent cells. That is, if this condition is satisfied, it is advantageous when forming an extracellular matrix layer serving as a scaffold for adherent cells in the central region 412 of the bottom surface 41 of the recess 4. Specifically, as shown in FIG. 6, when forming the extracellular matrix layer, the extracellular matrix solution M added to the central region 412 of the bottom surface 41 of the recess 4 and spreading toward the periphery of the bottom surface 41 is added to the bottom surface 41. When the outer edge region 411 is reached, the water repellent layer 5 formed in the outer edge region 411 is repelled to form a droplet and stays in the central region 412.
  • the extracellular matrix can be efficiently adsorbed to a part or the whole of the central region 412.
  • the other is that the adsorption of the extracellular matrix to the water-repellent layer 5 formed on the inner peripheral surface 42 of the recess 4 is suppressed, so that the cells are formed on the water-repellent layer 5 formed on the inner peripheral surface 42 of the recess 4.
  • the generation of a concave meniscus resulting from the adsorption of the outer matrix and the hydrophilic surface of the water repellent layer 5 can be prevented.
  • the concentration of the protein contained in the extracellular matrix solution M is very high, and the adsorptivity is very high compared to a general protein. If the water-repellent layer 5 is not formed in the outer edge region 411 of the bottom surface 41 and the water-repellent layer 5 is formed only on the inner peripheral surface 42, the extracellular matrix solution M can be easily applied to the inner peripheral surface 42 of the recess 4. Therefore, the water repellency is lowered, and the effect of suppressing the generation of the concave meniscus is impaired.
  • the water-repellent layer 5 is formed not only on the inner peripheral surface 42 of the recess 4 but also on a region (that is, the outer edge region 411) that further enters the bottom surface 41, thereby forming the outer edge region 411 on the bottom surface 41. Even if the extracellular matrix is adsorbed on the formed water-repellent layer 5 and water repellency is impaired, the extracellular matrix is adsorbed on the water-repellent layer 5 formed on the inner peripheral surface 42 of the recess 4 and the water-repellent layer is formed. It is possible to prevent the surface of the layer 5 from becoming hydrophilic. For this reason, it can prevent that the component in a culture solution is attracted to the water repellent layer 5 formed in the internal peripheral surface 42 of the recessed part 4, and generation
  • the bottom surface 41 and the inner peripheral surface 42 of the recess 4 have hydrophilicity.
  • the bottom surface 41 of the recess 4 it is preferable that at least the central region 412 has hydrophilicity when the cells cultured in the culture vessel 10A are adherent cells. That is, if this condition is satisfied, it is advantageous when forming an extracellular matrix layer serving as a scaffold for adherent cells in the central region 412 of the bottom surface 41 of the recess 4. Specifically, when the extracellular matrix layer is formed, components in the extracellular matrix solution added to the central region 412 of the bottom surface 41 of the recess 4 are easily adsorbed to the central region 412 of the bottom surface 41.
  • the water repellent layer 5 is formed on the outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the inner peripheral surface 42 of the recess 4.
  • “the water repellent layer is formed on the outer edge region of the bottom surface of the recess and the inner peripheral surface of the recess” means that the water repellent layer is formed on the entire outer edge region of the bottom surface of the recess and the entire inner peripheral surface of the recess.
  • the water repellent layer 5 is formed on the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4 via the intermediate layer 6A. ing.
  • one surface of the water repellent layer 5 is exposed in the space in the recess 4, and the other surface of the water repellent layer 5 is in contact with one surface of the intermediate layer 6A.
  • One surface of the intermediate layer 6A is in contact with the other surface of the water-repellent layer 5, and the other surface of the intermediate layer 6A is in contact with the outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the inner peripheral surface 42 of the recess 4. ing.
  • the intermediate layer 6 ⁇ / b> A is formed on the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4.
  • middle layers have the 1st part extended to the whole outer edge area
  • the edge of the first portion of the intermediate layer 6A on the inner peripheral surface 42 side is continuous with the edge of the second portion of the intermediate layer 6A on the bottom surface 41 side.
  • the edge of the first portion of the intermediate layer 6A on the boundary line L1 side coincides with the boundary line L1 in plan view.
  • the water repellent layer 5 is formed on the entire one surface of the intermediate layer 6A.
  • One surface of the intermediate layer 6A has a first region corresponding to the surface of the first portion of the intermediate layer 6A and a second region corresponding to the surface of the second portion of the intermediate layer 6A.
  • the water repellent layer 5 has a first portion that extends over the entire first region on one surface of the intermediate layer 6A and a second portion that extends over the entire second region of one surface of the intermediate layer 6A.
  • the edge portion on the inner peripheral surface 42 side of the first portion of the water repellent layer 5 is continuous with the edge portion on the bottom surface 41 side of the second portion of the water repellent layer 5.
  • the edge portion on the boundary line L1 side of the first portion of the water repellent layer 5 coincides with the boundary line L1 in plan view.
  • the water repellent layer 5 contains a water repellent.
  • the water repellent include polysiloxane, polysiloxane having an organic group and / or fluorine atom introduced, and a fluororesin.
  • the organic group introduced into the polysiloxane include an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, and a propyl group, and an aryl group such as a vinyl group and a phenyl group.
  • the fluororesin examples include polytetrafluoroethylene (PTFE), tetrafluoroethylene / perfluoroalkyl vinyl ether copolymer (PFA), tetrafluoroethylene / hexafluoropropylene copolymer (FEP), and tetrafluoroethylene / ethylene copolymer.
  • PTFE polytetrafluoroethylene
  • PFA perfluoroalkyl vinyl ether copolymer
  • FEP tetrafluoroethylene / hexafluoropropylene copolymer
  • PCTFE polychlorotrifluoroethylene
  • the water repellent layer 5 may contain a primer component.
  • the primer component has a functional group that can bind to a functional group of a substance that constitutes a layer adjacent to the water repellent layer 5 (in this embodiment, the adhesion layer 62A).
  • a silane coupling agent etc. are mentioned, for example.
  • the bonding force between the water-repellent layer 5 and the adhesion layer 62A can be improved by the silanol group of the silane coupling agent being bonded to the hydroxyl group of the substance constituting the adhesion layer 62A to form a siloxane bond. .
  • the thickness of the water repellent layer 5 is preferably 0.01 to 0.2 ⁇ m.
  • the water repellent layer 5 is prepared by applying a water repellent layer raw material liquid (for example, a water repellent solution) to the surface on which the water repellent layer 5 is to be formed using, for example, spraying, dipping, brushing, or the like. After coating, it can be formed by curing. The curing process can be performed using a heating method, standing at room temperature, a plasma method, or the like.
  • the water repellent layer 5 may be bonded to the surface on which the water repellent layer 5 is to be formed by a chemical reaction, a plasma reaction, an electron beam, radiation, or a reaction using ultraviolet rays.
  • water repellency means that the contact angle between one surface of the water repellent layer and water is 90 ° or more.
  • the contact angle between one surface of the water repellent layer 5 and water is preferably 105 ° or more, and more preferably 115 ° or more.
  • the contact angle here is a contact angle when pure water is used, and the ⁇ / 2 method is adopted as a method for measuring the contact angle.
  • a commercially available contact angle measuring device for example, PG-X manufactured by Matsubo Corporation can be used.
  • the intermediate layer 6A has a DLC layer 61A formed on the other surface side of the water repellent layer 5, and an adhesion layer 62A formed between the water repellent layer 5 and the DLC layer 61A.
  • DLC means diamond-like carbon.
  • the DLC layer 61 ⁇ / b> A is formed on the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4.
  • the adhesion layer 62A is formed on the entire one surface of the DLC layer 61A.
  • the water repellent layer 5 is formed on one entire surface of the adhesion layer 62A.
  • the DLC layer 61 ⁇ / b> A can improve the water repellency of the water repellent layer 5.
  • the DLC layer 61A also serves as a barrier layer for preventing the components of the adhesion layer 62A from dissolving the substrate 3.
  • the thickness of the DLC layer 61A is preferably 0.1 to 1.0 ⁇ m.
  • the DLC layer is a hard film containing hydrocarbon as a main component and is a mixture of a diamond structure (SP3 structure) and a graphite structure (SP2 structure) while being amorphous. Some of the hydrogen atoms contained in the DLC layer may be substituted with fluorine atoms.
  • Examples of the method for forming the DLC layer include an ionization vapor deposition method, an arc ion plating method, a high frequency / high voltage pulse superposition type film formation method, a plasma booster method, and a plasma CVD method.
  • Examples of the source gas used for forming the DLC layer include hydrocarbon gas.
  • hydrocarbon examples include CH 3 , CH 2 CH 2 , C 2 H 2 , CH 3 CH 2 CH 3 , CH 3 CH 2 CH 2 CH 3 , C 6 H 5 CH 3 , C 6 H 5 CH 2 CH. , C 6 H 4 (CH 3 ) 2 , CH 3 (CH 2 ) 4 CH 3 and the like.
  • the adhesion layer 62A can more firmly adhere the water repellent layer 5 and the DLC layer 61A.
  • the thickness of the adhesion layer 62A is preferably 0.1 to 1.5 ⁇ m.
  • Examples of the adhesion layer 62A include a silica layer, a zirconia layer, and a titania layer.
  • the adhesion layer 62A is formed on the surface on which the adhesion layer 62A is to be formed by using, for example, a method such as spraying, dipping, brushing, etc., and the raw material liquid of the adhesion layer 62A (in the case of a silica layer, for example, ethyl silicate In the case of a (TEOS) solution or zirconia layer, for example, a normal butyl zirconate (NBZ) solution or in the case of a titania layer, for example, a butyl titanate dimer (DBT) solution) is applied and then cured.
  • a silica layer for example, ethyl silicate In the case of a (TEOS) solution or zirconia layer
  • the curing process can be performed using a heating method, standing at room temperature, a plasma method, or the like.
  • the adhesion layer 62A may be bonded to the surface on which the adhesion layer 62A is to be formed by a reaction using a chemical reaction, plasma reaction, electron beam, radiation, or ultraviolet light.
  • a culture chamber is formed in the recess 4. .
  • One surface of the water repellent layer 5 is exposed in the space in the recess 4, and a region corresponding to the surface of the first portion of the water repellent layer 5 in one surface of the water repellent layer 5 is a culture chamber.
  • the region corresponding to the surface of the second portion of the water repellent layer 5 forms the inner peripheral surface of the culture chamber.
  • the region where the water repellent layer 5 is not formed is exposed to the space in the recess 4 and forms the center region of the bottom surface of the culture chamber. Thereby, hydrophilicity is provided to the central region of the bottom surface of the culture chamber.
  • the lid 2 is configured to be detachable from the culture vessel main body 1.
  • the opening 43 of the recess 4 is sealed. Thereby, mixing of impurities (contamination) into the recess 4 can be prevented.
  • the portion of the lid 2 that seals the opening 43 of the recess 4 is formed of a flat plate member having a substantially constant thickness, and the inner wall surface (wall surface on the opening 43 side) of the portion and the opposite side thereof.
  • the outer wall surface is flat.
  • the configuration of the lid 2 can be appropriately changed according to the use of the culture container.
  • the inner wall surface of the portion of the lid 2 that seals the opening 43 of the recess 4 and the outer wall surface on the opposite side are flat. It is a condition. That is, when this condition is satisfied, the accuracy of microscopic observation using the light transmittance of the lid member 2 can be improved.
  • a transmission type upright microscope observation in which light is irradiated from below the culture vessel body 1 ⁇ / b> A and the transmitted light is received above the culture vessel body 1 ⁇ / b> A
  • An episcopic microscope that irradiates light from above the culture vessel body 1A and receives reflected light above the culture vessel body 1A, irradiates light from above the culture vessel body 1A, and transmits transmitted light to the culture vessel body 1A. Examples include observation with a transmission inverted microscope that receives light downward.
  • the material constituting the lid 2 is a light transmissive material. Specific examples of the light transmissive material are the same as those of the culture vessel main body 1A. In microscopic observation, when the lid 2 is not attached to the culture vessel main body 1A, the material constituting the lid 2 may be a light-impermeable material.
  • the material constituting the lid 2 is a light transmissive material, which is a preferable condition for observing cells cultured in the recess 4 with a microscope. That is, when this condition is satisfied, the accuracy of microscopic observation using the light transmittance of the lid 2 can be improved.
  • the culture vessel body 1A is (A1) preparing a substrate 3 having a recess 4; (A2) masking the central region 412 of the bottom surface 41 of the recess 4; (A3) forming a DLC layer 61A on the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4; (A4) A step of forming the adhesion layer 62A on one entire surface of the DLC layer 61A formed in the step (A3), and (A5) a repelling property on the entire one surface of the adhesion layer 62A formed in the step (A4). It can be manufactured by a method including a step of forming the aqueous layer 5.
  • step (A1) for example, a commercially available substrate is prepared as the substrate 3 having the recess 4.
  • the substrate is usually marketed as a set with a lid.
  • a base for example, a base on which polystyrene constituting the bottom wall and the side wall is exposed on the inner wall surface of the bottom wall and the inner wall surface of the side wall is commercially available.
  • the cells cultured in the culture vessel 10A are adherent cells
  • a substrate that has been subjected to hydrophilization treatment at least in the central region of the bottom surface of the recess.
  • Use of such a substrate is advantageous when an extracellular matrix layer serving as a scaffold for adherent cells is formed in the central region of the bottom surface of the recess. Therefore, it is preferable to use as the substrate 3 a substrate in which the entire inner wall surface of the bottom wall portion and the entire inner wall surface of the side wall portion are subjected to hydrophilization treatment.
  • step (A2) for example, a commercially available masking material is used to cover the central region 412 of the bottom surface 41 of the recess 4.
  • the material and shape of the masking material are not particularly limited as long as the central region 412 can be protected from various processes (DLC layer forming process, adhesion layer forming, water repellent layer forming process, etc.) used in the subsequent steps.
  • the outer region 411 is formed with an arbitrary width on the bottom surface 41 of the recess 4 by covering the central region 412 with a masking material having an arbitrary diameter smaller than the diameter of the bottom surface 41 of the recess 4. Can do.
  • step (A3) the DLC layer 61A is formed on the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4 by using, for example, a plasma CVD method.
  • the plasma CVD method the source gas of the DLC layer 61 ⁇ / b> A is converted into plasma, and the DLC layer 61 ⁇ / b> A is formed on the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4.
  • the raw material liquid of the adhesion layer 62A is applied to the entire one surface of the DLC layer 61A and cured, whereby the DLC layer 61A
  • the adhesion layer 62A is formed on the entire one surface.
  • the raw material liquid of the water repellent layer 5 is applied to the entire one surface of the adhesion layer 62A and cured, whereby the adhesion layer 62A.
  • the water-repellent layer 5 is formed on the entire one surface.
  • the culture vessel main body 1A is used in combination with the lid 2, but the culture vessel main body 1A may be used alone.
  • the culture vessel main body 1A and the lid body 2 are preferably sterilized before being used for cell culture.
  • the sterilization method include a method of heat treatment in an autoclave, a method of sterilization with ethylene oxide gas, a method of irradiating radiation such as gamma rays, electron beams, and ultraviolet rays. It has been confirmed that the water-repellent layer 5 composed of a compound containing a fluorinated polysiloxane maintains the surface function (that is, water repellency) even after sterilization with autoclave, ethylene oxide, and gamma rays.
  • a culture material such as a cell or a culture solution is accommodated in the recess 4 of the culture vessel body 1A (cell seeding step).
  • the water repellent layer 5 is not formed on the inner peripheral surface 42 of the recess 4, and the inner peripheral surface 42 of the hydrophilic recess 4 is exposed to the space in the recess 4. .
  • FIG. 7 when the culture solution S is accommodated in the recess 4, the culture solution S is strongly attracted to the inner peripheral surface 42, and as a result, a portion of the culture solution S near the inner peripheral surface 42.
  • the thickness of S1 is larger than the thickness of the other portions, and the phenomenon that the liquid surface of the culture solution S bends in a concave shape, that is, a concave meniscus occurs.
  • a portion S1 in the vicinity of the inner peripheral surface 42 has a width W2.
  • the width W2 is a distance between the inflection point of the liquid surface of the culture medium S and the inner peripheral surface 42 of the recess 4.
  • the thickness of the portion S1 in the vicinity of the inner peripheral surface 42 of the culture solution S1 is larger than the thickness of the central portion due to the influence of the concave meniscus.
  • the per cell seeding amount increases in the vicinity of the inner peripheral surface 42 of the recess 4 and the cell seeding becomes uneven.
  • the water repellent layer 5 is formed on the bottom surface 41 and the inner peripheral surface 42 of the recess 4, so that the culture solution in the vicinity of the inner peripheral surface 42 of the recess 4 is It cannot be strongly attracted to the inner peripheral surface 42 of the recess 4. Therefore, generation of a concave meniscus is prevented. Further, when the generation of the concave meniscus is prevented, the liquid level is flattened, and the thickness of the portion in the vicinity of the inner peripheral surface 42 of the recess 4 does not become larger than the thickness of the other portions. The cell seeding amount per area does not increase in the vicinity of the inner peripheral surface 42 of the recess 4. Therefore, uniform cell seeding is possible.
  • the lid 2 is attached to the culture vessel main body 1A, and the opening 43 of the recess 4 is sealed (lid attachment step). Note that when the culture vessel main body 1A is used alone, the lid mounting step is omitted.
  • cells are cultured in the recesses 4 (cell culture process).
  • components such as amino acids and proteins contained in the culture solution are difficult to adsorb on the water-repellent layer 5 formed on the inner peripheral surface 42 of the recess 4. Therefore, it is possible to prevent the formation of a concave meniscus resulting from the adsorption of components in the culture solution to the water-repellent layer 5 formed on the inner peripheral surface 42 of the recess 4 and the surface of the water-repellent layer 5 becoming hydrophilic. it can. That is, a state where no concave meniscus is generated can be maintained through the cell culture process.
  • the cell culture method using the culture vessel 10A can be applied to a part or the whole of the central region 412 of the bottom surface 41 of the recess 4 before the cell seeding step. It is preferable to include a step of forming an outer matrix layer (extracellular matrix layer forming step).
  • the extracellular matrix layer contains extracellular matrix constituents (for example, proteins and the like).
  • the extracellular matrix is a material that becomes a scaffold for cells when the cells are cultured.
  • an extracellular matrix solution is added to the central region 412 of the bottom surface 41 of the recess 42, and the extracellular matrix is adsorbed to a part or the whole of the central region 412. Form a layer.
  • the addition of the extracellular matrix solution to the central region 412 is preferably carried out little by little (for example, dropwise) so that the added extracellular matrix solution gradually spreads toward the periphery of the bottom surface 41.
  • the extracellular matrix solution can be prepared, for example, by diluting a commercially available extracellular matrix at a recommended concentration in an appropriate solvent (for example, phosphate buffered saline).
  • an appropriate solvent for example, phosphate buffered saline.
  • the extracellular matrix solution added to the central region 412 is left, for example, in a 37 ° C. environment for 2 hours or longer or in a 4 ° C. environment for one night or longer, thereby allowing the extracellular matrix solution to partially or entirely in the central region 412. Can be adsorbed. After standing, the remaining extracellular matrix solution is removed.
  • the extracellular matrix solution M added to the central region 412 spreads toward the periphery of the bottom surface 41, but when reaching the outer edge region 411, the water repellent layer 5 formed in the outer edge region 411 It bounces into a droplet and remains in the central region 412. Accordingly, the extracellular matrix can be efficiently adsorbed to a part or the whole of the central region 412. This produces the following two big effects.
  • the other is that the adsorption of the extracellular matrix to the water-repellent layer 5 formed on the inner peripheral surface 42 of the recess 4 is suppressed, so that the cells are formed on the water-repellent layer 5 formed on the inner peripheral surface 42 of the recess 4.
  • the generation of a concave meniscus resulting from the adsorption of the outer matrix and the hydrophilic surface of the water repellent layer 5 can be prevented.
  • the culture vessel main body 1A is used in combination with the lid 2, but the culture vessel main body 1A may be used alone.
  • the cell observation method using the culture vessel 10A includes a step of observing the cells in the recess 4 from the bottom 41 side or the opening 43 side of the recess 4 with a microscope.
  • Examples of the microscope used for observation include an optical microscope such as a phase contrast microscope.
  • Examples of the microscope used when observing the cells in the recess 4 from the bottom surface 41 side of the recess 4 include an inverted microscope (an epi-type inverted microscope or a transmission inverted microscope).
  • Examples of the microscope used when observing the cells in the recess 4 from the opening 43 side of the recess 4 include an upright microscope (an epi-type upright microscope or a transmission upright microscope).
  • a transmission-type inverted microscope When using a transmission-type inverted microscope, for example, light from the light source installed above the culture vessel 10A is irradiated into the recess 4 through the lid 2, and the light transmitted through the recess 4 is used as the culture vessel main body 1A.
  • the cells in the recesses 4 can be observed by receiving light with a transmission inverted microscope installed below the culture vessel 10 ⁇ / b> A through the bottom wall 31.
  • the culture vessel main body 1A is used in combination with the lid 2, but the culture vessel main body 1A may be used alone.
  • the transmission inverted microscope 8 is a phase contrast microscope that includes an illumination optical system 81, a stage 82, an observation optical system 83, and an image sensor 84 and can capture a phase difference image of a cell.
  • the culture vessel 10A after cell culture is placed with the lid 2 attached to the culture vessel main body 1A.
  • the cultured cells and the culture solution used for the culture are accommodated.
  • the cell in the recessed part 4 is an observation object.
  • the illumination optical system 81 generates illumination light suitable for generating a phase difference image and irradiates the culture vessel 10A held on the stage 82.
  • the illumination optical system 81 can be configured in the same manner as an illumination optical system generally used for an optical microscope.
  • the illumination optical system 81 adjusts the light generated from a light source such as a halogen lamp to uniform illumination light suitable for generating a phase difference image by passing through a field lens, ring diaphragm, condenser lens, etc. Irradiate the culture vessel 10 A on 82.
  • Stage 82 supports culture vessel 10A and adjusts the position of culture vessel 10A.
  • the stage 82 is preferably movable in the vertical direction (direction along the optical axis) and the horizontal direction (direction perpendicular to the optical axis) by a motor or the like.
  • the observation optical system 83 includes, for example, an objective lens, a phase difference plate, an imaging lens, and the like.
  • the observation optical system 83 receives light irradiated from the illumination optical system 81 and transmitted through the concave portion 4, and forms a phase difference image. .
  • the image sensor 84 captures a phase difference image of the observation object imaged by the observation optical system 83.
  • the imaging element 84 includes, for example, a CCD (Charge-Coupled Device) image sensor, a CMOS (Complementary Metal-Oxide Semiconductor) image sensor, and the like.
  • the operations of the illumination optical system 81, the stage 82, the observation optical system 83, and the image sensor 84 are controlled by a control unit (not shown).
  • an eyepiece or the like for a human to observe an observation object with the naked eye may be provided instead of the image sensor 84.
  • Irradiation light R ⁇ b> 1 is irradiated from the irradiation optical system 81 to the culture container 10 ⁇ / b> A held on the stage 82.
  • Irradiation light R ⁇ b> 1 enters the recess 4 through the lid 2 and passes through the recess 4.
  • the transmitted light R2 transmitted through the bottom wall portion 31 of the culture vessel main body 1A is received by the observation optical system 83, and a phase difference image is formed.
  • the phase difference image of the observation object imaged by the observation optical system 83 is captured by the image sensor 84. In this way, the cells in the recess 4 are observed using the transmission inverted microscope 8.
  • the inner peripheral surface 42 of the concave portion 4 having hydrophilicity is exposed to the space in the concave portion 4. For this reason, as shown in FIG. 7A, when the culture solution S is accommodated in the recess 4, the culture solution S is strongly attracted to the inner peripheral surface 42. As a result, a portion of the culture solution S near the inner peripheral surface 42 is obtained.
  • the thickness of S1 is larger than the thickness of the other portions, and the phenomenon that the liquid surface of the culture solution S bends in a concave shape, that is, a concave meniscus occurs.
  • the optical axis is distorted due to the inclination of the liquid surface in the vicinity of the inner peripheral surface 42, so that it is difficult or impossible to observe cells existing in the portion S 1 in the vicinity of the inner peripheral surface 42.
  • the water-repellent layer 5 is formed on the bottom surface 41 and the inner peripheral surface 42 of the recess 4, so the inner peripheral surface of the recess 4
  • the culture medium S near 42 is not strongly attracted to the inner peripheral surface 42 of the recess 4. Therefore, generation of a concave meniscus is prevented. Therefore, distortion of the optical axis due to the inclination of the liquid surface does not occur in the vicinity of the inner peripheral surface 42, and cells existing in the vicinity of the inner peripheral surface 42 can be observed. That is, the microscope observation field is enlarged.
  • the outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 becomes a region where cells are difficult to adhere due to the formation of the water-repellent layer 5, so that the cells cultured in the culture vessel 10A are adherent cells. , There are no or few cells in this area. Even if the concave meniscus is prevented, if the width W1 of the outer edge region 411 is equal to or greater than the width W2, the effect of enlarging the microscope observation field by preventing the concave meniscus is lost. Accordingly, the width W1 of the outer edge region 411 is preferably smaller than the width W2.
  • the width W2 is about 10 mm when it is large.
  • the width W1 of the outer edge region 411 is preferably 10 mm or less, more preferably 5 mm or less.
  • the lower limit value of the width W1 of the outer edge region 411 is not particularly limited, but is preferably 0.5 mm, and more preferably 1 mm.
  • the culture container 10B according to the second embodiment is a culture container for microscopic observation, that is, a culture container capable of culturing cells and microscopically observing cultured cells. Therefore, the culture container 10B is configured to satisfy the conditions required for the container for cell culture and the conditions required for the container for microscopic observation. However, the configuration of the culture vessel 10B can be appropriately changed as long as cell culture is possible. When the culture container is not for microscopic observation, it is not necessary to satisfy the conditions required for the container for microscopic observation.
  • the culture vessel 10B includes a culture vessel main body 1B and a lid 2.
  • the difference between the culture container 10B and the culture container 10A will be mainly described, and the description regarding the culture container 10A is applied to other points.
  • the culture container body 1B is in accordance with the first embodiment in that the water-repellent layer 5 is formed on the outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the inner peripheral surface 42 of the recess 4 via the intermediate layer 6B.
  • the other points are the same as the culture vessel main body 1A.
  • the member or part same as the culture container main body 1A is represented by the same code
  • the intermediate layer 6 ⁇ / b> B is formed on the entire bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4, so that the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 and the inside of the recess 4 are formed. It is different from the intermediate layer 6 ⁇ / b> A that is formed on the entire peripheral surface 42 but is not formed in the central region 412 of the bottom surface 41.
  • the intermediate layer 6B is formed on the entire bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4.
  • the intermediate layer 6B includes a first portion that extends over the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41, a second portion that extends over the entire inner peripheral surface 42, and a third portion that extends over the entire central region 412 of the bottom surface 41.
  • Have The edge portion on the inner peripheral surface 42 side of the first portion of the intermediate layer 6B is continuous with the edge portion on the bottom surface 41 side of the second portion of the intermediate layer 6B, and the central region of the first portion of the intermediate layer 6B.
  • the edge portion on the 412 side is continuous with the edge portion of the third portion of the intermediate layer 6B.
  • one surface of the intermediate layer 6B has a first region corresponding to the surface of the first portion of the intermediate layer 6B and a second region corresponding to the surface of the second portion of the intermediate layer 6B. And a third region corresponding to the surface of the third portion of the intermediate layer 6B.
  • the first portion of the water repellent layer 5 is formed in the first region of one surface of the intermediate layer 6B
  • the second portion of the water repellent layer 5 is formed in the second region of one surface of the intermediate layer 6B.
  • the edge portion on the boundary line L1 side of the first portion of the water repellent layer 5 coincides with the boundary line L1 in plan view.
  • the intermediate layer 6B includes a DLC layer 61B formed on the other surface side of the water repellent layer 5, and an adhesion layer 62B formed between the water repellent layer 5 and the DLC layer 61B.
  • the DLC layer 61B and the adhesion layer 62B are configured similarly to the DLC layer 61A and the adhesion layer 62A.
  • the water repellent layer 5 is formed on the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4 via the intermediate layer 6B, so that a culture chamber is formed in the recess 4. .
  • One surface of the water repellent layer 5 is exposed in the space in the recess 4, and a region corresponding to the surface of the first portion of the water repellent layer 5 in one surface of the water repellent layer 5 is a culture chamber.
  • the region corresponding to the surface of the second portion of the water repellent layer 5 forms the inner peripheral surface of the culture chamber.
  • water repellency is imparted to the outer edge region and the inner peripheral surface of the bottom surface of the culture chamber.
  • a region corresponding to the surface of the third portion of the intermediate layer 6B is exposed to the space in the recess 4 and forms a central region on the bottom surface of the culture chamber. Thereby, hydrophilicity is provided to the central region of the bottom surface of the culture chamber.
  • the culture vessel main body 1B is (B1) a step of preparing the base body 3 having the recesses 4; (B2) Step of forming the DLC layer 61B on the entire bottom surface 41 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4, and (B3) forming the adhesion layer 62B on the entire one surface of the DLC layer 61B formed in step (B2). And (B4) the water repellent layer 5 in the region corresponding to the outer edge region 411 of the bottom surface 41 and the region corresponding to the inner peripheral surface 42 among the one surface of the adhesion layer 63B formed in the step (B3). It can be manufactured by a method including a forming step.
  • Processes (B1) to (B4) can be performed in the same manner as the manufacturing process of the culture vessel body 1A.
  • step (B4) a region other than the region where the water-repellent layer 5 is formed on one surface of the adhesion layer 62B may be covered with a masking material.
  • the culture vessel 10B can be used for a cell culture method and a cell observation method in the same manner as the culture vessel 10A.
  • the culture vessel 10C according to the third embodiment is a culture vessel for microscopic observation, that is, a culture vessel capable of cell culture and microscopic observation of cultured cells. Therefore, the culture container 10C is configured to satisfy the conditions required for the container for cell culture and the conditions required for the container for microscopic observation. However, the configuration of the culture vessel 10C can be appropriately changed as long as cell culture is possible. When the culture container is not for microscopic observation, it is not necessary to satisfy the conditions required for the container for microscopic observation.
  • the culture vessel 10 ⁇ / b> C includes a culture vessel main body 1 ⁇ / b> C and a lid 2.
  • the difference between the culture container 10C and the culture container 10A will be mainly described, and the description relating to the culture container 10A is applied to other points.
  • the culture container main body 1C is the first embodiment in that the water-repellent layer 5 is formed on the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4 via the intermediate layer 6C.
  • the other points are the same as those of the culture vessel main body 1A.
  • the same members or parts as those of the culture vessel main body 10A are denoted by the same reference numerals.
  • the intermediate layer 6C has a DLC layer 61A, but differs from the intermediate layer 6A having the DLC layer 61A and the adhesion layer 62A in that it does not have the adhesion layer 62A.
  • the other configuration of the intermediate layer 6C is the same as that of the intermediate layer 6A.
  • the water repellent layer 5 is formed on the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4 via the intermediate layer 6C, whereby a culture chamber is formed in the recess 4. .
  • One surface of the water repellent layer 5 is exposed in the space in the recess 4, and a region corresponding to the surface of the first portion of the water repellent layer 5 in one surface of the water repellent layer 5 is a culture chamber.
  • the region corresponding to the surface of the second portion of the water repellent layer 5 forms the inner peripheral surface of the culture chamber.
  • water repellency is imparted to the outer edge region and the inner peripheral surface of the bottom surface of the culture chamber.
  • the region where the water repellent layer 5 is not formed is exposed to the space in the recess 4 and forms the center region of the bottom surface of the culture chamber. Thereby, hydrophilicity is provided to the central region of the bottom surface of the culture chamber.
  • the culture vessel main body 1C is (C1) preparing a substrate 3 having a recess 4; (C2) masking the central region 412 of the bottom surface 41 of the recess 4; (C3) A step of forming the DLC layer 61A on the entire outer edge region 411 of the bottom surface 41 of the recess 4 and the entire inner peripheral surface 42 of the recess 4, and (C4) one of the DLC layers 61A formed in the step (C3) It can be manufactured by a method including a step of forming the water repellent layer 5 on the entire surface.
  • Processes (C1) to (C4) can be performed in the same manner as the manufacturing process of the culture vessel main body 1A.
  • the culture vessel 10C can be used for the cell culture method and the cell observation method in the same manner as the culture vessel 10A.
  • Example 1 A commercially available polystyrene ⁇ 35 mm culture dish (FALCON, model number 353001) was prepared. This culture dish has a circular bottom wall portion and a peripheral wall portion that stands up from the periphery of the bottom wall portion to form a recess, and is integrally formed of a polystyrene material.
  • the surface of the recess is composed of a bottom surface formed by the bottom wall portion and an inner peripheral surface rising from the periphery of the bottom surface. The entire surface of the recess is hydrophilized.
  • a region other than the outer edge region of the bottom surface of the recess was covered with a commercially available masking material.
  • the outer edge region was set as an annular region having an outer peripheral line coinciding with the outer peripheral line of the bottom surface of the concave portion and an inner peripheral line having a distance of 5 mm from the outer peripheral line of the bottom surface of the concave portion.
  • a diamond-like carbon (DLC) coating layer was formed on the entire outer edge region of the bottom surface of the recess and the entire inner peripheral surface of the recess.
  • the DLC layer was formed with a film thickness of 0.5 ⁇ m by plasma CVD.
  • a film forming gas a mixed gas of C 2 H 2 and C 6 H 5 CH 3 was used.
  • an SiO 2 layer was formed as an adhesion layer on the DLC layer.
  • the SiO 2 layer was formed with a film thickness of 1.0 ⁇ m by applying TEOS (manufactured by High-Purity Science Co., Ltd.) on the DLC layer by spraying, followed by drying and curing.
  • TEOS manufactured by High-Purity Science Co., Ltd.
  • a water repellent layer was formed on the adhesion layer.
  • the water repellent layer was formed with a film thickness of 0.1 ⁇ m by applying a compound containing polysiloxane fluorinated by a spray method onto the DLC layer, followed by drying and curing.
  • the masking material was removed.
  • the contact angle with pure water on the surface of the water repellent layer was measured by the ⁇ / 2 method (PG-X manufactured by Matsubo Co., Ltd.), the contact angle was 110 ° to 120 ° (center value 115 °).
  • ReproFF2 ReproCell, model number RCHEMD006A
  • the inside of the recess into which the culture solution was introduced was observed according to a conventional method. Microscopic observation was performed under the conditions of standing for 8 days in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, as in normal cell culture conditions.
  • the ratio of the observable region in the microscopic field is 84% immediately after the introduction of the culture solution, 99% on the first day of culture, 100% on the second day of culture, and 96% on the third day of culture.
  • the fourth day of culture 89%, on the seventh day of culture, 99%, and on the eighth day of culture, 95%.
  • 95% of the whole could be observed with a phase contrast microscope, and only 5% of the whole area could not be observed with a phase contrast microscope.
  • Example 2 A commercially available polystyrene ⁇ 35 mm culture dish (FALCON, model number 353001) was prepared. Of the bottom surface of the recess, the region other than the outer edge region was covered with a commercially available masking material. The outer edge region was set as an annular region having an outer peripheral line coinciding with the outer peripheral line of the bottom surface of the concave portion and an inner peripheral line having a distance of 5 mm from the outer peripheral line of the bottom surface of the concave portion.
  • Example 2 As in Example 1, a DLC layer as a barrier layer, a SiO 2 layer as an adhesion layer, and a water repellent layer were formed.
  • the masking material was removed.
  • the contact angle with pure water on the surface of the water repellent layer was measured by the ⁇ / 2 method (PG-X manufactured by Matsubo Co., Ltd.), the contact angle was 110 ° to 120 ° (center value 115 °).
  • Vitronectin-N life technologies, model number A14700 is coated as a protein that serves as a scaffold for adherent cells in a region other than the outer edge region (the region where the water-repellent layer is not formed) on the bottom surface of the recess according to normal conditions. did.
  • iPS cells were cultured using ReproFF2 (ReproCell, model number RCHEMD006A), which is a culture solution for iPS cell culture.
  • ReproFF2 ReproCell, model number RCHEMD006A
  • Cell culture was performed under the conditions of standing in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 10 days, as in normal cell culture conditions.
  • FIGS. 15 and 16 are microscopic observation images of a culture dish in which a water repellent layer is formed
  • FIG. 17 is a microscopic observation image of a normal culture dish in which a water repellent layer is not formed.
  • the ratio of the observable region in the microscopic field is 98% on the first culture day, 96% on the second culture day, and on the third culture day. 93%, 97% on the 4th day of culture, 96% on the 5th day of culture, 87% on the 6th day of culture, 98% on the 7th day of culture, 87% on the 8th day of culture, 98% on the 9th day of culture
  • the 10th day of culture was 94%. On average up to the 10th day, 94% of the whole could be observed with a phase contrast microscope, and only 6% of the total area could not be observed with a phase contrast microscope. Moreover, as shown in FIG.
  • the phase contrast microscope observation was also possible for the cells cultured very close to the inner peripheral surface of the recess. Furthermore, no problems were found with iPS cells, and it was confirmed that they can be cultured as usual. In addition, in the outer edge area
  • the ratio of the observable region in the microscopic field is 37% on the first day of culture and 43% on the second day of culture. %, 44% on the third day of culture, 34% on the fourth day of culture, 41% on the fifth day of culture, and 45% on the sixth day of culture. On average up to the 6th day, only 41% of the whole could be observed with a phase contrast microscope, and the remaining 59% could not be observed with a phase contrast.
  • Example 3 A commercially available polystyrene ⁇ 35 mm culture dish (FALCON, model number 353001) was prepared.
  • the contact angle with the pure water on the surface of the water-repellent layer is 60 °, 90 °, 100 ° to 110 ° in the contact angle measurement by the ⁇ / 2 method (PG-X manufactured by Matsubo Co., Ltd.) over the entire inner peripheral surface of the recess.
  • PG-X manufactured by Matsubo Co., Ltd.
  • ReproFF2 ReproCell, model number RCHEMD006A
  • the inside of the recess into which the culture solution was introduced was observed according to a conventional method.
  • FIG. 18 is a diagram showing the relationship between the contact angle and the range that can be observed with a phase-contrast microscope. As shown in FIG. 18, the ratio of the observable region in the microscope field is 31% at a contact angle of 60 °, 34% at a contact angle of 90 °, and 66 at a contact angle of 100 ° to 110 ° (center value 105 °). And 88% at a contact angle of 110 ° to 120 ° (center value 115 °).
  • the contact angle is 90 ° or more
  • the effect of suppressing the concave meniscus is manifested.
  • the contact angle is 105 ° or more
  • the suppression effect is further improved
  • the contact angle is 115 ° or more
  • the suppression effect is obtained. Further improvement has been shown.
  • the effect of the water-repellent layer shown in the above examples does not depend on the type of the culture vessel.
  • the surface of the recesses is hydrophilized. It is also demonstrated in various commercially available culture vessels including untreated culture dishes.

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Abstract

本発明は、治具を使用することなく、凹型メニスカスを防止することができる、培養容器を提供することを目的とし、かかる目的を達成するために、凹部（４）を有する基体（３）と、凹部（４）の底面（４１）の外縁領域（４１１）及び凹部（４）の内周面（４２）に形成された撥水層（５）とを備える、培養容器（１Ａ）であって、撥水層（５）の一方の面が凹部（４）内の空間に露出する、培養容器（１Ａ）を提供する。

Description

培養容器並びに該培養容器を使用した細胞培養方法及び細胞観察方法
　本発明は、培養容器、該培養容器を使用して細胞を培養する方法、及び、該培養容器を使用して細胞を観察する方法に関する。
　培養容器として、凹部の内表面が親水化処理された培養容器が知られている（例えば、特許文献１）。凹部の内表面の親水化処理は、様々な目的で行われる。例えば、接着細胞を培養する場合、細胞、細胞の足場となる材料（例えば、細胞外マトリックス）等の凹部の内表面への接着性を向上させることを目的として、凹部の内表面を酸素プラズマ処理して表面電荷を導入し、その結果として凹部の内表面が親水化処理される。また、浮遊細胞を培養する場合、疎水性相互作用による細胞等の凹部の内表面への付着を防止することを目的として、凹部の内表面が超親水化処理される。
　凹部の内表面が親水化処理された培養容器を使用して細胞培養を行うと、凹部の内周面近傍の培養液が凹部の内周面に強く引きつけられる結果、培養液のうち、凹部の内周面近傍の部分の厚みが、それ以外の部分の厚みよりも大きくなり、培養液の液面が凹状に屈曲する現象、すなわち、凹型メニスカスが生じる。
　凹型メニスカスは、凹部の内周面が親水化処理されていない場合にも生じる。例えば、細胞培養中に、培養液に含有されるアミノ酸、タンパク質等の成分が凹部の内周面に吸着され、凹部の内周面が親水性に変化すると、凹型メニスカスが生じる。
　凹型メニスカスは、様々な問題を引き起こす。例えば、培養容器に細胞を播種する際、凹部の底面の単位面積あたりの細胞播種量が凹部の内周面近傍で増加するため、均一な細胞播種が困難となる。また、細胞培養後に、培養容器内の細胞を光学顕微鏡で観察する際、凹部の内周面近傍では液面が傾斜している影響で光軸が歪むため、凹部の内周面近傍に存在する細胞の観察が困難又は不可能となる。
　凹型メニスカスを防止する手法として、観察時に、撥水性内面を有する筒体を培養容器中に挿入する手法（特許文献２）、培養液上に透明な平板を浮かせる手法（特許文献３）等が知られている。
　一方、複数の凹部が形成されたマイクロプレートにおいて、ある凹部から試料が漏れ出して隣接する凹部に混入することを防止する手法として、マイクロプレートの凹部の内表面のうち、凹部の開口部と底面との中間部から、凹部の開口部までの間に、撥水性である第１領域を設けるとともに、凹部の底面から第１領域までの間に、親水性である第２領域を設ける手法（特許文献４）が知られている。
特表２００１－５０７２１８号公報 特開昭６２－６９９７９号公報 特開平５－１８１０６８号公報 特開２００４－２４５７２７号公報
　しかしながら、特許文献２の手法では、筒体が凹部の内周面近傍に位置するため、凹部の内周面近傍の細胞の観察は依然として困難又は不可能である。また、特許文献２及び特許文献３の手法では、治具（筒体又は平板）の使用に起因する培養液への不純物の混入（コンタミネーション）が懸念される。さらに、特許文献４の手法では、凹部の開口部と底面との中間部から、凹部の底面までの領域（第２領域）が親水性であるため、凹型メニスカスを防止することができない。
　そこで、本発明は、治具を使用することなく、凹型メニスカスを防止することができる、培養容器、該培養容器を使用して細胞を培養する方法、及び、該培養容器を使用して細胞を観察する方法を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の発明を提供する。
（１）凹部を有する基体と、前記凹部の底面の外縁領域及び前記凹部の内周面に形成された撥水層とを備える、培養容器であって、前記撥水層の一方の面が前記凹部内の空間に露出する、培養容器。
（２）前記凹部の底面が平面である、（１）に記載の培養容器。
（３）前記撥水層の一方の面と水との接触角が１１５°以上である、（１）又は（２）に記載の培養容器。
（４）前記撥水層の他方の面側に形成されたＤＬＣ層をさらに備える、（１）～（３）のいずれかに記載の培養容器。
（５）前記撥水層と前記ＤＬＣ層との間に形成された密着層をさらに備える、（４）に記載の培養容器。
（６）（１）～（５）のいずれかに記載の培養容器を使用して細胞を培養する方法であって、前記凹部内に細胞を播種する前に、前記凹部の底面のうち前記外縁領域以外の領域に細胞外マトリックス層を形成する工程を含む、方法。
（７）（１）～（５）のいずれかに記載の培養容器を使用して細胞を観察する方法であって、前記凹部内の細胞を、前記凹部の底面側又は開口部側から位相差顕微鏡で観察する工程を含む、方法。
　本発明によれば、治具を使用することなく、凹型メニスカスを防止することができる培養容器、該培養容器を使用して細胞を培養する方法、及び、該培養容器を使用して細胞を観察する方法が提供される。
図１は、第１実施形態に係る培養容器の斜視図である。 図２は、図１に示す培養容器のＡ－Ａ線端面図である。 図３は、図２中の符号Ｐで表される部分の拡大図である。 図４は、図１に示す培養容器の培養容器本体が備える基体の斜視図である。 図５は、図４に示す基体のＢ－Ｂ線端面図である。 図６は、細胞外マトリックス層を形成する工程を説明するための図である。 図７Ａは、撥水層が形成されていない場合に生じる凹型メニスカスを説明するための図である。 図７Ｂは、図１に示す培養容器において、撥水層が形成されていることにより、凹型メニスカスの発生が防止されることを説明するための図である。 図８は、細胞観察に使用される透過型倒立顕微鏡の概略図である。 図９は、第２実施形態に係る培養容器の斜視図である。 図１０は、図９に示す培養容器のＣ－Ｃ線端面図である。 図１１は、図１０中の符号Ｑで表される部分の拡大図である。 図１２は、第３実施形態に係る培養容器の斜視図である。 図１３は、図１２に示す培養容器のＤ－Ｄ線端面図である。 図１４は、撥水層を形成した培養ディッシュの顕微鏡観察像を示す図である。 図１５は、撥水層を形成した培養ディッシュの顕微鏡観察像を示す図である。 図１６は、撥水層を形成した培養ディッシュの顕微鏡観察像を示す図である。 図１７は、撥水層を形成していない通常の培養ディッシュの顕微鏡観察像である。 図１８は、接触角と位相差顕微鏡観察可能範囲との関係を示す図である。
　以下、図面に基づいて本発明の実施形態を説明する。
〔第１実施形態〕
　第１実施形態に係る培養容器１０Ａは、顕微鏡観察用培養容器、すなわち、細胞培養が可能であるとともに、培養された細胞の顕微鏡観察が可能である培養容器である。したがって、培養容器１０Ａは、細胞培養のために容器に要求される条件と、顕微鏡観察のために容器に要求される条件とを満たすように構成されている。但し、培養容器１０Ａの構成は、細胞培養が可能な範囲で適宜変更可能である。培養容器が顕微鏡観察用でない場合、顕微鏡観察のために容器に要求される条件を満たす必要はない。
　培養容器１０Ａで培養される細胞としては、例えば、浮遊細胞、接着細胞等が挙げられる。接着細胞としては、例えば、多能性幹細胞（例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等）、幹細胞、前駆細胞、体細胞、生殖細胞等が挙げられる。浮遊細胞としては、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞等の血球系細胞等が挙げられる。培養容器１０Ａで培養される細胞は、組織を形成していてもよい。組織としては、例えば、軟骨組織、骨組織、筋組織、角膜組織、血管組織等が挙げられる。組織は、生体から分離した組織であってもよいし、幹細胞から分化させた組織であってもよい。
　図１及び図２に示すように、培養容器１０Ａは、培養容器本体１Ａ及び蓋体２を備える。
　図１及び図２に示すように、培養容器本体１Ａは、凹部４を有する基体３と、凹部４の底面４１の外縁領域４１１及び凹部４の内周面４２に形成された撥水層５とを備える。なお、撥水層５を含む任意の層が有する２つの面のうち、凹部４内の空間側の面を「一方の面」といい、それと反対側の面を「他方の面」という場合がある。
　本実施形態において、基体３は、φ１００ｍｍ径、φ６０ｍｍ径、φ３５ｍｍ径等のディッシュであり、基体３が有する凹部の数は１である。但し、基体３が有する凹部の数は培養容器の用途に応じて適宜変更可能であり、基体３が有する凹部の数は２以上であってもよい。基体３が有する凹部の数は２以上である場合、それぞれの凹部は凹部４と同様に構成することができる。２以上の凹部を有する基体としては、例えば、６穴、２４穴、４８穴、９６穴等の円筒形ウェルを有するマルチウェルプレート等が挙げられる。
　図４及び図５に示すように、基体３は、底壁部３１と、底壁部３１の周縁から起立して凹部４を形成する側壁部３２とを有する。本実施形態において、底壁部３１及び側壁部３２は一体成形されている。底壁部３１は、厚みが略一定の平板状部材で構成されており、底壁部３１の内壁面及びそれと反対側の外壁面は平面である。側壁部３２は、厚みが略一定の筒状部材で構成されており、側壁部３２の内壁面及びそれと反対側の外壁面は柱面（可展面）である。但し、底壁部３１及び側壁部３２の形状は、培養容器の用途に応じて適宜変更可能である。
　底壁部３１の内壁面が平面であることは、培養容器１０Ａで培養される細胞が接着細胞である場合の好ましい条件である。その理由は、凹部４の底面４１が平面であることが好ましい理由（後述）と同様である。
　底壁部３１の内壁面及びそれと反対側の外壁面が平面であることは、凹部４内で培養された細胞を顕微鏡で観察する場合の好ましい条件である。すなわち、この条件が満たされると、底壁部３１の光透過性を利用した顕微鏡観察の精度を向上させることができる。なお、底壁部３１の光透過性を利用した顕微鏡観察としては、例えば、培養容器本体１Ａの下方から光を照射し、透過光を培養容器本体１Ａの上方で受光する透過型正立顕微鏡観察、培養容器本体１Ａの上方から光を照射し、透過光を培養容器本体１の下方で受光する透過型倒立顕微鏡観察、培養容器本体１Ａの下方から光を照射し、反射光を培養容器本体１Ａの下方で受光する落射型倒立顕微鏡等が挙げられる。
　底壁部３１の内壁面全体及び側壁部３２の内壁面全体には、親水化処理が施されている。親水化処理としては、例えば、内壁面への親水性官能基の導入、内壁面への親水層の形成等が挙げられる。親水化処理は、培養容器に対して一般的に行われる親水化処理に従って行うことができる。例えば、プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等の処理によって、内壁面へ親水性官能基を導入することができる。また、親水層の原料液（例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリリジン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン等の親水性物質の溶液）を、内壁面に対して、例えば、スプレー、ディッピング、刷毛塗り等の方法によって塗布した後、硬化させることにより、内壁面に親水層を形成することができる。硬化処理は、加熱法、常温放置、プラズマ法等を用いて行うことができる。親水層を形成する際、化学反応、プラズマ反応、電子線、放射線又は紫外線を使用した反応により、親水層を、内壁面に結合させてもよい。
　本実施形態において、底壁部３１を構成する材料は光透過性材料である。光透過性材料としては、例えば、プラスチック、ガラス、セラミックス等が挙げられる。ブラスチックとしては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート）、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート）等が挙げられる。ガラスとしては、例えば、シリカガラス等が挙げられる。セラミックスとしては、シリカ等が挙げられる。
　底壁部３１を構成する材料は光透過性材料であることは、凹部４内で培養された細胞を顕微鏡で観察する場合の好ましい条件である。すなわち、この条件が満たされると、底壁部３１の光透過性を利用した顕微鏡観察の精度を向上させることができる。
　側壁部３２を構成する材料は、光透過性材料であってもよいし、光不透過性材料であってもよいが、本実施形態では、底壁部３１及び側壁部３２が一体成形されているので、側壁部３２は、底壁部３１と同様に光透過性材料で構成されている。なお、光不透過性材料としては、例えば、アルミナ等のセラミック、白色、黒色等に着色されたプラスチック等が挙げられる。
　図４及び図５に示すように、凹部４は、底面４１と、底面４１の周縁から起立する内周面４２と、底面４１の反対側に位置する開口部４３とを有する。
　図４及び図５に示すように、凹部４の底面４１は、境界線Ｌ１によって、外縁領域４１１と、外縁領域４１１の内側に位置する中央領域４１２とに区画されている。なお、境界線Ｌ１は仮想線であり、外縁領域４１１及び中央領域４１２は仮想領域である。
　境界線Ｌ１は、底面４１の外周線よりも内側に位置する環状線である。本実施形態において、境界線Ｌ１は円形状であるが、その他の環状であってもよい。その他の環状としては、例えば、楕円形状、矩形状等が挙げられる。
　外縁領域４１１は、底面４１の外周線に沿って延在する環状領域である。外縁領域４１１の外周線は底面４１の外周線と一致し、外縁領域４１１の内周線は境界線Ｌ１と一致する。外縁領域４１１は幅Ｗ１を有する。幅Ｗ１は、底面４１の外周線と境界線Ｌ１との距離である。
　外縁領域４１１は、撥水層５が形成されることにより、細胞が接着しにくい領域となるので、培養容器１０Ａで培養される細胞が接着細胞である場合、外縁領域４１１の幅Ｗ１は小さいことが好ましい。培養容器１０Ａで培養される細胞が接着細胞である場合、外縁領域４１１の幅Ｗ１は、底面４１の面積に対する外縁領域４１１の面積の割合が８５％以下となるように調整されることが好ましく、５０％以下となるように調整されることがさらに好ましい。なお、底面４１の面積に対する外縁領域４１１の面積の割合の下限値は特に限定されないが、好ましくは５％、さらに好ましくは１０％である。例えば、底面４１の半径が１７．５ｍｍ以上である場合、外縁領域４１１の幅Ｗ１は、１０ｍｍ以下となるように調整されることが好ましく、５ｍｍ以下となるように調整されることがさらに好ましい。なお、外縁領域４１１の幅Ｗ１の下限値は特に限定されないが、好ましくは０．５ｍｍ、さらに好ましくは１ｍｍである。
　凹部４の底面４１は、基体３の底壁部３１の内壁面又は該内壁面に形成された親水層の一方の面によって形成されており、凹部４の内周面４２は、基体３の側壁部３２の内壁面又は該内壁面に形成された親水層の一方の面によって形成されている。
　凹部４の底面４１は平面であり、凹部４の内周面４２は柱面（可展面）である。凹部４の平面視形状は円形状であり、凹部４の断面視形状は矩形状である。但し、凹部４の平面視形状及び断面視形状は適宜変更可能である。凹部４の平面視形状は、例えば、楕円形状、矩形状等であってもよい。凹部４の断面視形状は、例えば、台形状等であってもよい。凹部４の断面視形状が台形状である場合、底面４１全体が開口部４３から視認可能となるように、台形の上辺及び下辺のうち長さが短い方が凹部４の底面４１側に位置することが好ましい。
　凹部４の底面４１が平面であることは、培養容器１０Ａで培養される細胞が接着細胞である場合の好ましい条件である。すなわち、この条件が満たされると、接着細胞の足場となる細胞外マトリックス層を、凹部４の底面４１の中央領域４１２に形成する際に有利である。具体的には、図６に示すように、細胞外マトリックス層を形成する際、凹部４の底面４１の中央領域４１２に添加され、底面４１の周縁に向かって広がる細胞外マトリックス溶液Ｍが底面４１の外縁領域４１１に到達すると、外縁領域４１１に形成された撥水層５で弾かれて液滴状となり、中央領域４１２に留まる。したがって、中央領域４１２の一部又は全体に細胞外マトリックスを効率よく吸着させることができる。このことは以下の２つの大きな効果を生む。１つは、細胞外マトリクス溶液Ｍを、細胞培養を行なう中央領域４１２にのみ選択的に導入することができるため、一般に高価である細胞外マトリクスの損失が少ない。もう１つは、凹部４の内周面４２に形成された撥水層５への細胞外マトリックスの吸着が抑制されるので、凹部４の内周面４２に形成された撥水層５に細胞外マトリクスが吸着して撥水層５の表面が親水化することに起因する凹型メニスカスの発生を防止することができる。通常、細胞外マトリクス溶液Ｍに含まれるタンパク質の濃度は非常に高濃度であり、かつ一般的なタンパク質に比較して吸着性が非常に高い。底面４１の外縁領域４１１に撥水層５が形成されておらず、撥水層５が内周面４２にのみ形成されていると、細胞外マトリクス溶液Ｍが凹部４の内周面４２に容易に到達し、その撥水性を低下させるため、凹型メニスカスの発生を抑制する効果が損なわれる。したがって、凹部４の内周面４２だけでなく、そこからさらに底面４１側の一部に入り込んだ領域（すなわち外縁領域４１１）まで撥水層５を形成することにより、底面４１の外縁領域４１１に形成された撥水層５については細胞外マトリックスが吸着して撥水性が損なわれたとしても、凹部４の内周面４２に形成された撥水層５に細胞外マトリックスが吸着して撥水層５の表面が親水化することを防止することができる。このため、凹部４の内周面４２に形成された撥水層５に培養液中の成分が引きつけられることを防止することができ、凹型メニスカスの発生を防止することができる。
　底壁部３１の内壁面全体及び側壁部３２の内壁面全体には、親水化処理が施されているので、凹部４の底面４１及び内周面４２は親水性を有している。凹部４の底面４１のうち、少なくとも中央領域４１２が親水性を有することは、培養容器１０Ａで培養される細胞が接着細胞である場合の好ましい条件である。すなわち、この条件が満たされると、接着細胞の足場となる細胞外マトリックス層を、凹部４の底面４１の中央領域４１２に形成する際に有利である。具体的には、細胞外マトリックス層を形成する際、凹部４の底面４１の中央領域４１２に添加された細胞外マトリックス溶液中の成分が底面４１の中央領域４１２に吸着されやすくなる。
　図１及び図２に示すように、撥水層５は、凹部４の底面４１の外縁領域４１１及び凹部４の内周面４２に形成されている。本発明において、「撥水層が凹部の底面の外縁領域及び凹部の内周面に形成されている」とは、撥水層が、凹部の底面の外縁領域全体及び凹部の内周面全体に、直接、あるいは、１又は２以上の層で構成される中間層を介して形成されていることを意味する。本実施形態では、図１及び図２に示すように、撥水層５が、凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体に、中間層６Ａを介して形成されている。
　図１及び図２に示すように、撥水層５の一方の面は、凹部４内の空間に露出しており、撥水層５の他方の面は、中間層６Ａの一方の面と接している。中間層６Ａの一方の面は、撥水層５の他方の面と接しており、中間層６Ａの他方の面は、凹部４の底面４１の外縁領域４１１及び凹部４の内周面４２と接している。
　図１及び図２に示すように、中間層６Ａは、凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体に形成されている。中間層６Ａは、底面４１の外縁領域４１１全体に延在する第１部分と、内周面４２全体に延在する第２部分とを有する。中間層６Ａの第１部分の内周面４２側の端縁部は、中間層６Ａの第２部分の底面４１側の端縁部と連続している。中間層６Ａの第１部分の境界線Ｌ１側の端縁部は、平面視において境界線Ｌ１と一致する。
　図１及び図２に示すように、撥水層５は、中間層６Ａの一方の面全体に形成されている。中間層６Ａの一方の面は、中間層６Ａの第１部分の面に相当する第１領域と、中間層６Ａの第２部分の面に相当する第２領域とを有する。撥水層５は、中間層６Ａの一方の面の第１領域全体に延在する第１部分と、中間層６Ａの一方の面の第２領域全体に延在する第２部分とを有する。撥水層５の第１部分の内周面４２側の端縁部は、撥水層５の第２部分の底面４１側の端縁部と連続している。撥水層５の第１部分の境界線Ｌ１側の端縁部は、平面視において境界線Ｌ１と一致する。
　撥水層５は、撥水剤を含有する。撥水剤としては、例えば、ポリシロキサン、有機基及び／又はフッ素原子が導入されたポリシロキサン、フッ素樹脂等が挙げられる。ポリシロキサンに導入される有機基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等のアルキル基、ビニル基、フェニル基等のアリール基等が挙げられる。フッ素樹脂としては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、テトラフルオロエチレン・パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体（ＰＦＡ）、テトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）、テトラフルオロエチレン・エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリクロロトリフルオロエチレン（ＰＣＴＦＥ）等が挙げられる。撥水層５には、撥水剤以外に、プライマー成分が含有されていてもよい。プライマー成分は、撥水層５に隣接する層（本実施形態では、密着層６２Ａ）を構成する物質の官能基と結合可能な官能基を有する。プライマー成分としては、例えば、シランカップリング剤等が挙げられる。例えば、シランカップリング剤のシラノール基が、密着層６２Ａを構成する物質の水酸基と結合してシロキサン結合を形成することにより、撥水層５と密着層６２Ａとの接合力を向上させることができる。
　撥水層５の厚みは、好ましくは０．０１～０．２μｍである。撥水層５は、撥水層５を形成すべき面に対して、例えば、スプレー、ディッピング、刷毛塗り等の方法を使用して、撥水層の原料液（例えば、撥水剤溶液）を塗布した後、硬化させることにより形成することができる。硬化処理は、加熱法、常温放置、プラズマ法等を用いて行うことができる。撥水層５を形成する際、化学反応、プラズマ反応、電子線、放射線又は紫外線を使用した反応により、撥水層５を、撥水層５を形成すべき面に結合させてもよい。
　撥水層５が有する２つの面のうち、凹部４内の空間に露出する一方の面は、撥水性を有する。本発明において、「撥水性」とは、撥水層の一方の面と水との接触角が９０°以上であることを意味する。撥水層５の一方の面と水との接触角は、好ましくは１０５°以上、さらに好ましくは１１５°以上である。ここでの接触角は、純水を使用した場合の接触角であり、接触角の測定方法としては、θ／２法を採用している。接触角の測定には、市販の接触角測定装置（例えば、株式会社マツボー製ＰＧ－Ｘ等）を使用することができる。
　図３に示すように、中間層６Ａは、撥水層５の他方の面側に形成されたＤＬＣ層６１Ａと、撥水層５及びＤＬＣ層６１Ａの間に形成された密着層６２Ａとを有する。なお、本発明において「ＤＬＣ」はダイヤモンドライクカーボンを意味する。
　ＤＬＣ層６１Ａは、凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体に形成されている。密着層６２Ａは、ＤＬＣ層６１Ａの一方の面全体に形成されている。撥水層５は、密着層６２Ａの一方の面全体に形成されている。
　ＤＬＣ層６１Ａは、撥水層５の撥水性を向上させることができる。また、ＤＬＣ層６１Ａは、密着層６２Ａの成分が基体３を溶かさないようにするためのバリア層にもなる。
　ＤＬＣ層６１Ａの厚みは、好ましくは０．１～１．０μｍである。ＤＬＣ層は、炭化水素を主成分とする硬質膜であって、非晶質（アモルファス）でありながらダイヤモンド構造（ＳＰ３構造）とグラファイト構造（ＳＰ２構造）とが混在したものである。ＤＬＣ層に含まれる水素原子の一部はフッ素原子で置換されていてもよい。ＤＬＣ層の形成方法としては、例えば、イオン化蒸着法、アークイオンプレーティング法、高周波・高電圧パルス重畳型成膜法、プラズマブースター法、プラズマＣＶＤ法等が挙げられる。ＤＬＣ層の形成に用いられる原料ガスとしては、例えば、炭化水素ガス等が挙げられる。炭化水素としては、例えば、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２、Ｃ２Ｈ２、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、Ｃ６Ｈ５ＣＨ３、Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ＣＨ、Ｃ６Ｈ４（ＣＨ３）２、ＣＨ３（ＣＨ２）４ＣＨ３等が挙げられる。
　密着層６２Ａは、撥水層５とＤＬＣ層６１Ａとをより強固に密着させることができる。
　密着層６２Ａの厚みは、好ましくは０．１～１．５μｍである。密着層６２Ａとしては、例えば、シリカ層、ジルコニア層、チタニア層等が挙げられる。密着層６２Ａは、密着層６２Ａを形成すべき面に対して、例えば、スプレー、ディッピング、刷毛塗り等の方法を使用して、密着層６２Ａの原料液（シリカ層の場合は、例えば、エチルシリケート（ＴＥＯＳ）溶液、ジルコニア層の場合は、例えば、ノルマルブチルジルコネート（ＮＢＺ）溶液、チタニア層の場合は、例えば、ブチルチタネートダイマー（ＤＢＴ）溶液）を塗布した後、硬化させることにより形成することができる。硬化処理は、加熱法、常温放置、プラズマ法等を用いて行うことができる。密着層６２Ａを形成する際、化学反応、プラズマ反応、電子線、放射線又は紫外線を使用した反応により、密着層６２Ａを、密着層６２Ａを形成すべき面に結合させてもよい。
　凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体に、中間層６Ａを介して撥水層５が形成されることにより、凹部４内には培養室が形成されている。撥水層５の一方の面は、凹部４内の空間に露出しており、撥水層５の一方の面のうち、撥水層５の第１部分の面に相当する領域は、培養室の底面の外縁領域を形成しており、撥水層５の第２部分の面に相当する領域は、培養室の内周面を形成している。これにより、培養室の底面の外縁領域及び内周面には撥水性が付与されている。凹部４の底面４１のうち、撥水層５が形成されていない領域、すなわち、中央領域４１２は、凹部４内の空間に露出しており、培養室の底面の中央領域を形成している。これにより、培養室の底面の中央領域には親水性が付与されている。
　蓋体２は、培養容器本体１に対して着脱自在に構成される。蓋体２が培養容器本体２に装着されると、凹部４の開口部４３が封止される。これにより、凹部４内への不純物の混入（コンタミネーション）を防止することができる。
　蓋体２のうち、凹部４の開口部４３を封止する部分は、厚みが略一定の平板状部材で構成されており、その部分の内壁面（開口部４３側の壁面）及びそれと反対側の外壁面は平面である。蓋体２の構成は、培養容器の用途に応じて適宜変更可能である。
　蓋体２のうち、凹部４の開口部４３を封止する部分の内壁面及びそれと反対側の外壁面が平面であることは、凹部４内で培養された細胞を顕微鏡で観察する場合の好ましい条件である。すなわち、この条件が満たされると、蓋材２の光透過性を利用した顕微鏡観察の精度を向上させることができる。なお、蓋体２の光透過性を利用した顕微鏡観察としては、例えば、培養容器本体１Ａの下方から光を照射し、透過光を培養容器本体１Ａの上方で受光する透過型正立顕微鏡観察、培養容器本体１Ａの上方から光を照射し、反射光を培養容器本体１Ａの上方で受光する落射型正立顕微鏡、培養容器本体１Ａの上方から光を照射し、透過光を培養容器本体１Ａの下方で受光する透過型倒立顕微鏡観察等が挙げられる。
　本実施形態において、蓋体２を構成する材料は光透過性材料である。光透過性材料としては、培養容器本体１Ａと同様の具体例が挙げられる。顕微鏡観察において、蓋体２が培養容器本体１Ａに装着されない場合、蓋体２を構成する材料は、光不透過性材料であってもよい。
　蓋体２を構成する材料が光透過性材料であることは、凹部４内で培養された細胞を顕微鏡で観察する場合の好ましい条件である。すなわち、この条件が満たされると、蓋体２の光透過性を利用した顕微鏡観察の精度を向上させることができる。
　培養容器本体１Ａは、
（Ａ１）凹部４を有する基体３を準備する工程、
（Ａ２）凹部４の底面４１の中央領域４１２をマスキングする工程、
（Ａ３）凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体に、ＤＬＣ層６１Ａを形成する工程、
（Ａ４）工程（Ａ３）で形成されたＤＬＣ層６１Ａの一方の面全体に密着層６２Ａを形成する工程、及び
（Ａ５）工程（Ａ４）で形成された密着層６２Ａの一方の面全体に撥水層５を形成する工程
を含む方法によって製造することができる。
　工程（Ａ１）では、凹部４を有する基体３として、例えば、市販の基体を準備する。基体は、通常、蓋体とセットで市販されている。例えば、底壁部の内壁面全体及び側壁部の内壁面全体に親水化処理が施されている基体、底壁部の内壁面全体及び側壁部の内壁面全体に親水化処理が施されていない基体（例えば、底壁部及び側壁部を構成するポリスチレンが底壁部の内壁面及び側壁部の内壁面に露出する基体）等が市販されている。培養容器１０Ａで培養される細胞が接着細胞である場合、少なくとも凹部の底面の中央領域に親水化処理が施された基体を使用することが好ましい。このような基体を使用すると、接着細胞の足場となる細胞外マトリックス層を、凹部の底面の中央領域に形成する際に有利である。したがって、底壁部の内壁面全体及び側壁部の内壁面全体に親水化処理が施されている基体を基体３として使用することが好ましい。また、底壁部の内壁面全体及び側壁部の内壁面全体に親水化処理が施されていない基体を使用する場合には、少なくとも凹部の底面の中央領域に親水化処理を施した後に基体３として使用することが好ましい。なお、親水化処理に関する説明は上記と同様であるので省略する。
　工程（Ａ２）では、例えば、市販のマスキング材を使用して、凹部４の底面４１の中央領域４１２を被覆する。マスキング材の材質および形状は、その後の工程で用いられる各種処理（ＤＬＣ層形成処理、密着層形成、撥水層形成処理等）から、中央領域４１２を保護し得る限り特に限定されない。工程（Ａ２）において、凹部４の底面４１の直径より小さい任意の直径のマスキング材を用いて中央領域４１２を被覆することで、凹部４の底面４１に外縁領域４１１を任意の幅で形成することができる。
　工程（Ａ３）では、例えば、プラズマＣＶＤ法を使用して、凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体にＤＬＣ層６１Ａを形成する。プラズマＣＶＤ法では、ＤＬＣ層６１Ａの原料ガスをプラズマ化し、凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体にＤＬＣ層６１Ａを形成する。
　工程（Ａ４）では、例えば、スプレー、ディッピング、刷毛塗り等の方法を使用して、ＤＬＣ層６１Ａの一方の面全体に密着層６２Ａの原料液を塗布して硬化させることにより、ＤＬＣ層６１Ａの一方の面全体に密着層６２Ａを形成する。
　工程（Ａ５）では、例えば、スプレー、ディッピング、刷毛塗り等の方法を使用して、密着層６２Ａの一方の面全体に撥水層５の原料液を塗布して硬化させることにより、密着層６２Ａの一方の面全体に撥水層５を形成する。
　以下、培養容器１０Ａを使用した細胞培養方法を説明する。本実施形態では、培養容器本体１Ａが蓋体２と組み合わせて使用されるが、培養容器本体１Ａが単独で使用されてもよい。
　培養容器本体１Ａ及び蓋体２は、細胞培養に使用する前に滅菌されていることが好ましい。滅菌法としては、例えば、オートクレーブ中で熱処理する方法、エチレンオキサイドガスで滅菌する方法、ガンマ線、電子線、紫外線等の放射線を照射する方法等が挙げられる。フッ素化したポリシロキサンを含む化合物により構成された撥水層５は、オートクレーブ、エチレンオキサイド、ガンマ線滅菌処理後も表面機能（すなわち、撥水性）を維持することが確認されている。
　培養容器１０Ａを使用した細胞培養方法では、まず、培養容器本体１Ａの凹部４内に細胞、培養液等の培養材料を収容する（細胞播種工程）。従来の、一般的な培養容器の場合、凹部４の内周面４２に撥水層５が形成されておらず、親水性を有する凹部４の内周面４２が凹部４内の空間に露出する。このため、図７に示すように、凹部４内に培養液Ｓが収容されると、培養液Ｓが内周面４２に強く引きつけられる結果、培養液Ｓのうち、内周面４２近傍の部分Ｓ１の厚みが、それ以外の部分よりも厚みよりも大きくなり、培養液Ｓの液面が凹状に屈曲する現象、すなわち、凹型メニスカスが生じる。培養液Ｓのうち、内周面４２近傍の部分Ｓ１は幅Ｗ２を有する。なお、幅Ｗ２は、培養液Ｓの液面の変曲点と凹部４の内周面４２との距離である。従来の、一般的な培養容器では、凹型メニスカスの影響により、培養液Ｓ１のうち、内周面４２近傍の部分Ｓ１の厚みが、中央部分の厚みより大きいため、凹部４の底面４１の単位面積あたりの細胞播種量が凹部４の内周面４２近傍で増加し、細胞播種が不均一となる。これに対して、本実施形態における培養容器本体１Ａでは、凹部４の底面４１及び内周面４２に撥水層５が形成されているので、凹部４の内周面４２近傍の培養液は、凹部４の内周面４２に強く引きつけられない。したがって、凹型メニスカスの発生が防止される。また、凹型メニスカスの発生が防止されると液面が平坦化され、凹部４の内周面４２近傍の部分の厚みがそれ以外の部分の厚みよりも大きくならないので、凹部４の底面４１の単位面積あたりの細胞播種量が凹部４の内周面４２近傍で増加しない。したがって、均一な細胞播種が可能である。
　次いで、培養容器本体１Ａに蓋体２を装着し、凹部４の開口部４３を封止する（蓋体装着工程）。なお、培養容器本体１Ａを単独で使用する場合、蓋体装着工程は省略される。
　次いで、常法に従って、凹部４内で細胞を培養する（細胞培養工程）。細胞培養工程において、培養液に含有されるアミノ酸、タンパク質等の成分は、凹部４の内周面４２に形成された撥水層５に吸着しにくい。したがって、凹部４の内周面４２に形成された撥水層５に培養液中の成分が吸着して撥水層５の表面が親水化することに起因する凹型メニスカスの発生を防止することができる。すなわち、細胞培養工程を通じて、凹型メニスカスが発生しない状態を維持することができる。
　凹部４内で培養される細胞が接着細胞である場合、培養容器１０Ａを使用した細胞培養方法は、細胞播種工程の前に、凹部４の底面４１の中央領域４１２の一部又は全体に、細胞外マトリックス層を形成する工程（細胞外マトリックス層形成工程）を含むことが好ましい。
　細胞外マトリックス層は、細胞外マトリックス構成成分（例えば、タンパク質等）を含有する。細胞外マトリックスは、細胞が培養される際、細胞の足場となる材料である。
　細胞外マトリックス層形成工程では、例えば、凹部４２の底面４１の中央領域４１２に、細胞外マトリックス溶液を添加し、中央領域４１２の一部又は全体に細胞外マトリックスを吸着させることにより、細胞外マトリックス層を形成する。
　中央領域４１２への細胞外マトリックス溶液の添加は、添加された細胞外マトリックス溶液が、徐々に、底面４１の周縁に向かって広がるように、少量ずつ添加（例えば、滴下）することが好ましい。
　細胞外マトリックス溶液は、例えば、市販の細胞外マトリックスを推奨濃度で適当な溶媒（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に希釈することにより調製することができる。中央領域４１２に添加された細胞外マトリックス溶液を、例えば、３７℃環境下で２時間以上又は４℃環境下で一晩以上放置することにより、中央領域４１２の一部又は全体に細胞外マトリックスを吸着させることができる。放置後、残存する細胞外マトリックス溶液は除去される。
　図６に示すように、中央領域４１２に添加された細胞外マトリックス溶液Ｍは、底面４１の周縁に向かって広がるが、外縁領域４１１に到達すると、外縁領域４１１に形成された撥水層５で弾かれて液滴状となり、中央領域４１２に留まる。したがって、中央領域４１２の一部又は全体に細胞外マトリックスを効率よく吸着させることができる。このことは以下の２つの大きな効果を生む。１つは、細胞外マトリクス溶液Ｍを、細胞培養を行なう中央領域４１２にのみ選択的に導入することができるため、一般に高価である細胞外マトリクスの損失が少ない。もう１つは、凹部４の内周面４２に形成された撥水層５への細胞外マトリックスの吸着が抑制されるので、凹部４の内周面４２に形成された撥水層５に細胞外マトリクスが吸着して撥水層５の表面が親水化することに起因する凹型メニスカスの発生を防止することができる。
　以下、培養容器１０Ａを使用した細胞観察方法を説明する。本実施形態では、培養容器本体１Ａが蓋体２と組み合わせて使用されるが、培養容器本体１Ａが単独で使用されてもよい。
　培養容器１０Ａを使用した細胞観察方法は、凹部４内の細胞を、凹部４の底面４１側又は開口部４３側から顕微鏡で観察する工程を含む。
　観察に使用される顕微鏡としては、例えば、位相差顕微鏡等の光学顕微鏡等が挙げられる。凹部４内の細胞を、凹部４の底面４１側から観察する場合に使用される顕微鏡としては、例えば、倒立顕微鏡（落射型倒立顕微鏡又は透過型倒立顕微鏡）等が挙げられる。凹部４内の細胞を、凹部４の開口部４３側から観察する場合に使用される顕微鏡としては、例えば、正立顕微鏡（落射型正立顕微鏡又は透過型正立顕微鏡）等が挙げられる。
　落射型倒立顕微鏡を使用する場合、例えば、培養容器１０Ａの下方に設置された光源から、培養容器本体１Ａの底壁部３１を通じて、凹部４内へ光を照射し、凹部４内の細胞で反射された光を、培養容器本体１Ａの底壁部３１を通じて、培養容器１の下方に設置された落射型倒立顕微鏡で受光することにより、凹部４内の細胞を観察することができる。
　透過型倒立顕微鏡を使用する場合、例えば、培養容器１０Ａの上方に設置された光源から、蓋体２を通じて、凹部４内へ光を照射し、凹部４内を透過した光を、培養容器本体１Ａの底壁部３１を通じて、培養容器１０Ａの下方に設置された透過型倒立顕微鏡で受光することにより、凹部４内の細胞を観察することができる。
　落射型正立顕微鏡を使用する場合、培養容器１０Ａの上方に設置された光源から、蓋体２を通じて、凹部４内へ光を照射し、凹部４内の細胞で反射された光を、蓋体２を通じて、培養容器１０Ａの上方に設置された落射型正立顕微鏡で受光することにより、凹部４内の細胞を観察することができる。
　透過型正立顕微鏡を使用する場合、培養容器１０Ａの下方に設置された光源から、培養容器本体１Ａの底壁部３１を通じて、凹部４内へ光を照射し、凹部４内を透過した光を、蓋体２を通じて、培養容器１の上方に設置された透過型正立顕微鏡で受光することにより、凹部４内の細胞を観察することができる。
　以下、透過型倒立顕微鏡を使用する場合の一実施形態を説明する。本実施形態では、培養容器本体１Ａが蓋体２と組み合わせて使用されるが、培養容器本体１Ａが単独で使用されてもよい。
　図８に示すように、透過型倒立顕微鏡８は、照明光学系８１、ステージ８２、観察光学系８３及び撮像素子８４を備える、細胞の位相差像の撮像が可能な位相差顕微鏡である。
　ステージ８２には、細胞培養後の培養容器１０Ａが、培養容器本体１Ａに蓋体２が装着された状態で載置されている。細胞培養後の培養容器１０Ａの凹部４内には、培養された細胞及び培養に使用された培養液が収容されている。凹部４内の細胞が観察対象物である。
　照明光学系８１は、位相差像の生成に適した照明光を生成し、ステージ８２上に保持された培養容器１０Ａに照射する。照明光学系８１は、光学顕微鏡に一般的に用いられる照明光学系と同様に構成することができる。照明光学系８１は、例えば、ハロゲンランプ等の光源から生じた光を、フィールドレンズ、リング絞り、コンデンサレンズ等を通過させることにより、位相差像の生成に適した均一照明光に調整し、ステージ８２上の培養容器１０Ａに照射する。
　ステージ８２は、培養容器１０Ａを支持し、培養容器１０Ａの位置を調整する。ステージ８２は、モータ等によって、垂直方向（光学軸に沿った方向）及び水平方向（光学軸に垂直な方向）に移動可能であることが好ましい。
　観察光学系８３は、例えば、対物レンズ、位相差板、結像レンズ等を備えており、照明光学系８１から照射され、凹部４内を透過した光を受光し、位相差像を結像させる。
　撮像素子８４は、観察光学系８３によって結像された観察対象物の位相差像を撮像する。撮像素子８４は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサ、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサ等を備える。
　照明光学系８１、ステージ８２、観察光学系８３及び撮像素子８４の動作は、不図示の制御部によって制御される。
　透過型倒立顕微鏡８において、例えば、撮像素子８４の代わりに人間が肉眼で観察対象物を観察するための接眼レンズ等が設けられていてもよい。
　透過型倒立顕微鏡８を使用した観察は、次のように行われる。照射光学系８１から、ステージ８２上に保持された培養容器１０Ａへ照射光Ｒ１が照射される。照射光Ｒ１は、蓋体２を通じて、凹部４内に入り、凹部４内を透過する。培養容器本体１Ａの底壁部３１を通じて透過した透過光Ｒ２は、観察光学系８３で受光され、位相差像が結像される。観察光学系８３によって結像された観察対象物の位相差像は、撮像素子８４によって撮像される。こうして、透過型倒立顕微鏡８を使用して、凹部４内の細胞が観察される。
　凹部４の内周面４２に撥水層５が形成されていない場合、親水性を有する凹部４の内周面４２が凹部４内の空間に露出する。このため、図７Ａに示すように、凹部４内に培養液Ｓが収容されると、培養液Ｓが内周面４２に強く引きつけられる結果、培養液Ｓのうち、内周面４２近傍の部分Ｓ１の厚みが、それ以外の部分よりも厚みよりも大きくなり、培養液Ｓの液面が凹状に屈曲する現象、すなわち、凹型メニスカスが生じる。凹型メニスカスが生じると、内周面４２近傍では液面が傾斜している影響で光軸が歪むため、内周面４２近傍の部分Ｓ１に存在する細胞の観察は困難又は不可能である。これに対して、図７Ｂに示すように、本実施形態における培養容器本体１Ａでは、凹部４の底面４１及び内周面４２に撥水層５が形成されているので、凹部４の内周面４２近傍の培養液Ｓは、凹部４の内周面４２に強く引きつけられない。したがって、凹型メニスカスの発生が防止される。このため、内周面４２近傍において液面の傾斜に起因する光軸の歪みが生じず、内周面４２近傍に存在する細胞の観察が可能である。すなわち、顕微鏡観察視野が拡大する。
　図７Ｂに示すように、凹部４の底面４１の外縁領域４１１は、撥水層５が形成されることにより、細胞が接着しにくい領域となるので、培養容器１０Ａで培養される細胞が接着細胞である場合、この領域には細胞が存在しない又はほとんど存在しない。凹型メニスカスが防止されても、外縁領域４１１の幅Ｗ１が幅Ｗ２以上であると、凹型メニスカス防止による顕微鏡観察視野の拡大効果が失われる。したがって、外縁領域４１１の幅Ｗ１は、幅Ｗ２よりも小さいことが好ましい。本実施形態のように、凹部４の半径が幅Ｗ２よりも十分に大きい場合（例えば、凹部４の半径が１７．５ｍｍ以上である場合）、幅Ｗ２は、大きい際には１０ｍｍほどにもなる。この場合、外縁領域４１１の幅Ｗ１は、好ましくは１０ｍｍ以下、さらに好ましくは５ｍｍ以下である。なお、外縁領域４１１の幅Ｗ１の下限値は特に限定されないが、好ましくは０．５ｍｍ、さらに好ましくは１ｍｍである。
〔第２実施形態〕
　第２実施形態に係る培養容器１０Ｂは、顕微鏡観察用培養容器、すなわち、細胞培養が可能であるとともに、培養された細胞の顕微鏡観察が可能である培養容器である。したがって、培養容器１０Ｂは、細胞培養のために容器に要求される条件と、顕微鏡観察のために容器に要求される条件とを満たすように構成されている。但し、培養容器１０Ｂの構成は、細胞培養が可能な範囲で適宜変更可能である。培養容器が顕微鏡観察用でない場合、顕微鏡観察のために容器に要求される条件を満たす必要はない。
　図９及び図１０に示すように、培養容器１０Ｂは、培養容器本体１Ｂと蓋体２とを備える。なお、以下では、培養容器１０Ｂが培養容器１０Ａと異なる点について主に説明され、それ以外の点については、培養容器１０Ａに関する説明が適用される。
　培養容器本体１Ｂは、撥水層５が、凹部４の底面４１の外縁領域４１１及び凹部４の内周面４２に、中間層６Ｂを介して形成されている点で、第１実施形態に係る培養容器本体１Ａと異なるが、それ以外の点は培養容器本体１Ａと同一である。第２実施形態に係る培養容器本体１Ｂについて、培養容器本体１Ａと同一の部材又は部分は同一の符号で表されている。
　図９及び図１０に示すように、中間層６Ｂは、凹部４の底面４１全体及び凹部４の内周面４２全体に形成されている点で、底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体には形成されているが、底面４１の中央領域４１２には形成されていない中間層６Ａと異なる。
　図９及び図１０に示すように、中間層６Ｂは、凹部４の底面４１全体及び凹部４の内周面４２全体に形成されている。中間層６Ｂは、底面４１の外縁領域４１１全体に延在する第１部分と、内周面４２全体に延在する第２部分と、底面４１の中央領域４１２全体に延在する第３部分とを有する。中間層６Ｂの第１部分の内周面４２側の端縁部は、中間層６Ｂの第２部分の底面４１側の端縁部と連続しており、中間層６Ｂの第１部分の中央領域４１２側の端縁部は、中間層６Ｂの第３部分の端縁部と連続している。
　図９及び図１０に示すように、中間層６Ｂの一方の面は、中間層６Ｂの第１部分の面に相当する第１領域と、中間層６Ｂの第２部分の面に相当する第２領域と、中間層６Ｂの第３部分の面に相当する第３領域とを有する。撥水層５の第１部分は、中間層６Ｂの一方の面の第１領域に形成されており、撥水層５の第２部分は、中間層６Ｂの一方の面の第２領域に形成されている。撥水層５の第１部分の境界線Ｌ１側の端縁部は、平面視において境界線Ｌ１と一致する。
　図１１に示すように、中間層６Ｂは、撥水層５の他方の面側に形成されたＤＬＣ層６１Ｂと、撥水層５及びＤＬＣ層６１Ｂの間に形成された密着層６２Ｂとを有する。ＤＬＣ層６１Ｂ及び密着層６２Ｂは、ＤＬＣ層６１Ａ及び密着層６２Ａと同様に構成される。
　凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体に、中間層６Ｂを介して撥水層５が形成されることにより、凹部４内には培養室が形成されている。撥水層５の一方の面は、凹部４内の空間に露出しており、撥水層５の一方の面のうち、撥水層５の第１部分の面に相当する領域は、培養室の底面の外縁領域を形成しており、撥水層５の第２部分の面に相当する領域は、培養室の内周面を形成している。これにより、培養室の底面の外縁領域及び内周面には撥水性が付与されている。中間層６Ｂの一方の面のうち、中間層６Ｂの第３部分の面に相当する領域は、凹部４内の空間に露出しており、培養室の底面の中央領域を形成している。これにより、培養室の底面の中央領域には親水性が付与されている。
　培養容器本体１Ｂは、
（Ｂ１）凹部４を有する基体３を準備する工程、
（Ｂ２）凹部４の底面４１全体及び内周面４２全体に、ＤＬＣ層６１Ｂを形成する工程、（Ｂ３）工程（Ｂ２）で形成されたＤＬＣ層６１Ｂの一方の面全体に密着層６２Ｂを形成する工程、及び
（Ｂ４）工程（Ｂ３）で形成された密着層６３Ｂの一方の面のうち、底面４１の外縁領域４１１に対応する領域及び内周面４２に対応する領域に撥水層５を形成する工程
を含む方法によって製造することができる。
　工程（Ｂ１）～（Ｂ４）は、培養容器本体１Ａの製造工程と同様に実施することができる。
　工程（Ｂ４）において、密着層６２Ｂの一方の面のうち、撥水層５を形成する領域以外の領域をマスキング材で被覆してもよい。
　培養容器１０Ｂは、培養容器１０Ａと同様にして、細胞培養方法及び細胞観察方法に使用することができる。
〔第３実施形態〕
　第３実施形態に係る培養容器１０Ｃは、顕微鏡観察用培養容器、すなわち、細胞培養が可能であるとともに、培養された細胞の顕微鏡観察が可能である培養容器である。したがって、培養容器１０Ｃは、細胞培養のために容器に要求される条件と、顕微鏡観察のために容器に要求される条件とを満たすように構成されている。但し、培養容器１０Ｃの構成は、細胞培養が可能な範囲で適宜変更可能である。培養容器が顕微鏡観察用でない場合、顕微鏡観察のために容器に要求される条件を満たす必要はない。
　図１２及び図１３に示すように、培養容器１０Ｃは、培養容器本体１Ｃと蓋体２とを備える。なお、以下では、培養容器１０Ｃが培養容器１０Ａと異なる点について主に説明され、それ以外の点については、培養容器１０Ａに関する説明が適用される。
　培養容器本体１Ｃは、撥水層５が、凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体に、中間層６Ｃを介して形成されている点で、第１実施形態に係る培養容器本体１Ａと異なるが、それ以外の点は培養容器本体１Ａと同一である。第３実施形態に係る培養容器本体１Ｃについて、培養容器本体１０Ａと同一の部材又は部分は同一の符号で表されている。
　図１２及び図１３に示すように、中間層６Ｃは、ＤＬＣ層６１Ａを有するが、密着層６２Ａを有しない点で、ＤＬＣ層６１Ａ及び密着層６２Ａを有する中間層６Ａと異なる。中間層６Ｃのそれ以外の構成は、中間層６Ａと同様である。
　凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体に、中間層６Ｃを介して撥水層５が形成されることにより、凹部４内には培養室が形成されている。撥水層５の一方の面は、凹部４内の空間に露出しており、撥水層５の一方の面のうち、撥水層５の第１部分の面に相当する領域は、培養室の底面の外縁領域を形成しており、撥水層５の第２部分の面に相当する領域は、培養室の内周面を形成している。これにより、培養室の底面の外縁領域及び内周面には撥水性が付与されている。凹部４の底面４１のうち、撥水層５が形成されていない領域、すなわち、中央領域４１２は、凹部４内の空間に露出しており、培養室の底面の中央領域を形成している。これにより、培養室の底面の中央領域には親水性が付与されている。
　培養容器本体１Ｃは、
（Ｃ１）凹部４を有する基体３を準備する工程、
（Ｃ２）凹部４の底面４１のうち中央領域４１２をマスキングする工程、
（Ｃ３）凹部４の底面４１の外縁領域４１１全体及び凹部４の内周面４２全体に、ＤＬＣ層６１Ａを形成する工程、及び
（Ｃ４）工程（Ｃ３）で形成されたＤＬＣ層６１Ａの一方の面全体に撥水層５を形成する工程
を含む方法によって製造することができる。
　工程（Ｃ１）～（Ｃ４）は、培養容器本体１Ａの製造工程と同様に実施することができる。
　培養容器１０Ｃは、培養容器１０Ａと同様にして、細胞培養方法及び細胞観察方法に使用することができる。
〔実施例１〕
　市販のポリスチレン製のφ３５ｍｍ培養ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社，型番３５３００１）を準備した。この培養ディッシュは、円形の底壁部と、該底壁部の周縁から起立して凹部を形成する周壁部とを有し、ポリスチレン材料により一体成型されている。凹部の表面は、底壁部によって形成される底面と、該底面の周縁から起立する内周面とから構成される。凹部の表面全面には親水化処理が施されている。
　凹部の底面のうち外縁領域以外の領域を市販のマスキング材で覆った。外縁領域は、凹部の底面の外周線と一致する外周線と、凹部の底面の外周線からの距離が５ｍｍである内周線とを有する環状領域として設定した。
　凹部の底面の外縁領域全体及び凹部の内周面全体に、ダイヤモンドライクカーボン（ＤＬＣ）コーティング層を形成した。ＤＬＣ層は、プラズマＣＶＤ法により、膜厚０．５μｍで形成した。成膜用ガスには、Ｃ２Ｈ２及びＣ６Ｈ５ＣＨ３の混合ガスを用いた。
　ＤＬＣ層の形成後、ＤＬＣ層上に、密着層として、ＳｉＯ２層を形成した。ＳｉＯ２層は、スプレー法によりＴＥＯＳ（高純度科学（株）製）をＤＬＣ層上に塗布し、乾燥硬化させて、膜厚１．０μｍで形成した。
　密着層の形成後、密着層上に、撥水層を形成した。撥水層は、スプレー法によりフッ素化したポリシロキサンを含む化合物をＤＬＣ層上に塗布し、乾燥硬化させて、膜厚０．１μｍで形成した。
　撥水層の形成後、マスキング材を除去した。撥水層の表面における純水との接触角を、θ／２法（株式会社マツボー製ＰＧ－Ｘ）によって測定したところ、接触角は１１０°～１２０°（中心値１１５°）であった。
　その後、ｉＰＳ細胞培養用培養液であるＲｅｐｒｏＦＦ２（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社，型番ＲＣＨＥＭＤ００６Ａ）を凹部内に導入した。
　その後、常法に従って倒立型位相差顕微鏡（オリンパス社，型番ＩＸ－８１）を使用して、培養液が導入された凹部内の観察を行なった。
　顕微鏡観察は、通常の細胞培養条件と同じく、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で８日間静置する条件で行った。
　顕微鏡観察結果を図１４に示す。図１４に示すように、顕微鏡視野のうち観察可能な領域の割合は、培養液導入直後は８４％、培養１日目は９９％、培養２日目は１００％、培養３日目は９６％、培養４日目は８９％、培養７日目は９９％、培養８日目は９５％であった。８日目まで平均すると、全体の９５％が位相差顕微鏡観察可能であり、位相差顕微鏡観察が不可能であった領域は、全体のわずか５％であった。
　これらの結果から、凹部の内周面及び底面の外縁領域に撥水層を形成することにより、凹型メニスカスを抑制し、広範囲にわたって明瞭な観察が実現可能であることが示された。また、凹型メニスカス抑制効果は、８日間以上持続されることが示された。
〔実施例２〕
　市販のポリスチレン製のφ３５ｍｍ培養ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社，型番３５３００１）を準備した。
　凹部の底面のうち外縁領域以外の領域を市販のマスキング材で覆った。外縁領域は、凹部の底面の外周線と一致する外周線と、凹部の底面の外周線からの距離が５ｍｍである内周線とを有する環状領域として設定した。
　実施例１と同様に、バリア層であるＤＬＣ層、密着層であるＳｉＯ２層、及び、撥水層を形成した。
　撥水層の形成後、マスキング材を除去した。撥水層の表面における純水との接触角を、θ／２法（株式会社マツボー製ＰＧ－Ｘ）によって測定したところ、接触角は１１０°～１２０°（中心値１１５°）であった。
　その後、凹部の底面の外縁領域以外の領域（撥水層が形成されていない領域）に、接着細胞の足場となるタンパク質として、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ－Ｎ（ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，型番Ａ１４７００）を、通常条件に従ってコーティングした。
　その後、ｉＰＳ細胞培養用培養液であるＲｅｐｒｏＦＦ２（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社，型番ＲＣＨＥＭＤ００６Ａ）を使用して、ｉＰＳ細胞の培養を実施した。細胞培養は、通常の細胞培養条件と同じく、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で１０日間静置する条件で行った。
　経時的に常法に従って倒立型位相差顕微鏡（オリンパス社，型番ＩＸ－８１）を使用して凹部内を観察し、撥水層を形成していない通常の培養用ディッシュと比較を行なった。
　顕微鏡観察結果を図１５～１７に示す。図１５及び図１６は、撥水層を形成した培養ディッシュの顕微鏡観察像であり、図１７は、撥水層を形成していない通常の培養ディッシュの顕微鏡観察像である。
　図１５に示すように、撥水層を形成した培養ディッシュにおいて、顕微鏡視野のうち観察可能な領域の割合は、培養１日目は９８％、培養２日目は９６％、培養３日目は９３％、培養４日目は９７％、培養５日目は９６％、培養６日目は８７％、培養７日目は９８％、培養８日目は８７％、培養９日目は９８％、培養１０日目は９４％であった。１０日目まで平均すると、全体の９４％が位相差顕微鏡観察可能であり、位相差顕微鏡観察が不可能であった領域は、全体のわずか６％であった。また、図１６に示すように、凹部の内周面のごく近傍で培養された細胞も、位相差顕微鏡観察が可能であった。さらに、ｉＰＳ細胞についても問題は見られず、通常通りに培養できることが確認された。なお、凹部の底面の外縁領域、すなわち、接着細胞の足場となるタンパク質が塗布されていない部分では、細胞が、培養ディッシュ内の培養液中に浮遊した状態で観察された。
　一方、図１７に示すように、撥水層が形成されていない通常の培養用ディッシュにおいて、顕微鏡視野のうち観察可能な領域の割合は、培養１日目は３７％、培養２日目は４３％、培養３日目は４４％、培養４日目は３４％、培養５日目は４１％、培養６日目は４５％であった。６日目まで平均すると、全体の４１％のみが位相差顕微鏡観察可能であり、残りの５９％については位相差観察が不可能であった。
　これらの結果から、凹部の底面の外縁領域及び凹部の内周面に撥水層を形成することにより、凹型メニスカスを抑制し、広範囲にわたって明瞭な観察が実現可能であることが示された。凹型メニスカス抑制効果は、ｉＰＳ細胞を培養する条件下で１０日間以上持続されることが示された。
〔実施例３〕
　市販のポリスチレン製のφ３５ｍｍ培養ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社，型番３５３００１）を準備した。
　凹部の内周面全体を、θ／２法による接触角測定（株式会社マツボー製ＰＧ－Ｘ）において、撥水層の表面における純水との接触角が６０°、９０°、１００°～１１０°（中心値１０５°）又は１１０°～１２０°（中心値１１５°）となるように撥水処理した後、ｉＰＳ細胞培養用培養液であるＲｅｐｒｏＦＦ２（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社，型番ＲＣＨＥＭＤ００６Ａ）を凹部内に導入した。その後、常法に従って倒立型位相差顕微鏡（オリンパス社，型番ＩＸ－８１）を使用して、培養液が導入された凹部内の観察を行なった。
　結果を図１８に示す。図１８は、接触角と位相差顕微鏡観察可能範囲との関係を示す図である。図１８に示すように、顕微鏡視野のうち観察可能な領域の割合は、接触角６０°では３１％、接触角９０°では３４％、接触角１００°～１１０°（中心値１０５°）では６６％、接触角１１０°～１２０°（中心値１１５°）では８８％であった。
　これらの結果から、接触角が９０°以上であると、凹型メニスカスの抑制効果が発現し、接触角１０５°以上であると抑制効果がより向上し、接触角１１５°以上であると抑制効果がさらに向上することが示された。
　以上の実施例に示される撥水層の作用効果は、培養容器の種類に依存するものではなく、本実施例で使用した培養ディッシュ（ＦＡＬＣＯＮ社，型番３５３００１）の他、凹部の表面が親水化処理されていない培養ディッシュを含め市販されている様々な培養容器でも発揮される。
１０Ａ～１０Ｃ　　培養容器
１Ａ～１Ｃ　　　　培養容器本体
２　　　　　　　　蓋体
３　　　　　　　　基体
４　　　　　　　　凹部
４１　　　　　　　凹部の底面
４１１　　　　　　凹部の底面の外縁領域
４１２　　　　　　凹部の底面の中央領域
４２　　　　　　　凹部の内周面
５　　　　　　　　撥水層
６Ａ～６Ｃ　　　　中間層
６１Ａ，６１Ｂ　　ＤＬＣ層
６２Ａ，６２Ｂ　　密着層

Claims (7)

  1. 　凹部を有する基体と、
    　前記凹部の底面の外縁領域及び前記凹部の内周面に形成された撥水層と
    を備える、培養容器であって、
    　前記撥水層の一方の面が前記凹部内の空間に露出する、培養容器。
  2. 　前記凹部の底面が平面である、請求項１に記載の培養容器。
  3. 　前記撥水層の一方の面と水との接触角が１１５°以上である、請求項１又は２に記載の培養容器。
  4. 　前記撥水層の他方の面側に形成されたＤＬＣ層をさらに備える、請求項１～３のいずれか一項に記載の培養容器。
  5. 　前記撥水層と前記ＤＬＣ層との間に形成された密着層をさらに備える、請求項４に記載の培養容器。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の培養容器を使用して細胞を培養する方法であって、
    　前記凹部内に細胞を播種する前に、前記凹部の底面のうち前記外縁領域以外の領域に細胞外マトリックス層を形成する工程を含む、方法。
  7. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の培養容器を使用して細胞を観察する方法であって、
    　前記凹部内の細胞を、前記凹部の底面側又は開口部側から位相差顕微鏡で観察する工程
    を含む、方法。
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