JP2016144422A - 液滴形成用シャーレ及びそれを用いた電界撹拌方法 - Google Patents
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Abstract
Description
シャーレ中で化学反応や生体組織の染色等を行う際には、その化学反応や染色等の反応を促進するため、シャーレ中の内容液を撹拌することが好ましい。しかし、シャーレは平皿であり、内容液を撹拌することが難しく、振盪すると内容液がこぼれ易く、効率よく撹拌することができないという問題があった。そこで、振盪をしなくともシャーレの内容液を撹拌でき、かつ反応を促進することができる、新しい方法の開発が望まれていた。
この迅速免疫染色法は、検出目的となるタンパク質を発現している組織に、抗体を含む溶液を滴下して微小液滴を形成し、変動電界によりこの液滴を振動させて撹拌し、抗原抗体反応を促進するものである。具体的には、スライドガラス上に生体組織を載置し、その生体組織の上に抗体を含む微小液滴を形成する。そして、スライドガラスの下部に電極を配し、その電極と対向する側にも微小液滴に接触しないように電極を配して、この2つの電極間に変動電界を発生させる。この変動電界により微小液滴が撹拌され、短時間で抗原抗体反応を行うことができる。
そこで、本発明は、上記従来の状況に鑑み、振盪をしなくともシャーレの内容液を効率よく撹拌することができる、新たな方法及びその方法を可能とするシャーレを開発することを目的とする。
第1発明は、底面と、その全外周に配される側壁と、側壁が形成する開口部を有するシャーレにおいて、シャーレの底面上に注ぎ入れた溶液がシャーレの側壁と接することがないように、底面と側壁との内側境界部分に側壁よりも高さの低い台座を設け、溶液を台座の高さを越えるまで注ぎ入れた場合にドーム形状の液滴を形成できるようにしたことを特徴とするシャーレに関する。
第1発明のシャーレは、液滴に変動電界を印加して撹拌を行う電界撹拌に用いる電界撹拌用シャーレであることが好ましい。
上記シャーレにおいては、シャーレの側壁が形成するシャーレの開口部を覆う蓋をさらに有することが好ましい。このように蓋を設けた場合には、無菌的ガス交換を可能とする通気口をシャーレに設けることもできる。
さらに、上記のシャーレにおいては、液滴に変動電界を印加するための電極を有することが好ましい。
ここで、その電極は蓋に設けられていることが好ましい。
そして、その電極は、凸部を有するリング状又は円板状の電極とすることが好ましい。
上記のシャーレにおいては、台座が撥水性の材料を用いて形成されていることが好ましい。
さらに、上記のシャーレにおいては、台座が、1mm以上で且つ底面の幅の30%以下の長さの幅を有するリング状の台座であることが好ましい。
さらに、上記のシャーレにおいては、液滴が、2ml〜1000mlの容量の液滴であることが好ましい。
そして、上記のシャーレにおいては、底面を円形とすることが好ましい。
第2発明は、第1発明のシャーレ中に液滴を形成し、その液滴に変動電界を印加することで、液滴を振動させることを特徴とする電界撹拌方法に関する。
第3発明は、第1発明のシャーレ中に細胞培養液の液滴を形成し、その液滴に変動電界を印加することで、液滴を振動させて撹拌することを特徴とする細胞培養方法に関する。
第4発明は、第1発明のシャーレ中に反応溶液の液滴を形成し、その液滴に変動電界を印加することで、液滴を振動させて反応溶液の反応を促進することを特徴とする反応促進方法に関する。
第5発明は、第1発明のシャーレと、そのシャーレ中に形成した液滴に変動電界を印加する変動電界印加装置とを有することを特徴とする、電界撹拌システムに関する。
第6発明は、第1発明のシャーレと、そのシャーレ中に形成した細胞培養液の液滴に変動電界を印加する変動電界印加装置と、細胞培養液又は培養環境の温度を制御する温度制御装置とを有することを特徴とする、細胞培養システムに関する。
第2発明の電界撹拌方法及び第5発明の電界撹拌システムは、第1発明のシャーレを用いてシャーレ中に液滴を形成し、変動電界を印加することにより、液滴表面及び内部の電荷に周期的に変動するクーロン力が働いて、液滴が振動するため、シャーレを振盪することなく効率よくシャーレ中の溶液を撹拌することができる。
第3発明の細胞培養方法及び第6発明の細胞培養システムは、第1発明のシャーレを用いてシャーレ中に細胞培養液の液滴を形成し、変動電界を印加することにより、液滴表面及び内部の電荷と変動電界との相互作用により液滴が振動するため、シャーレを振とうすることなく穏やかに液滴を撹拌することができる。このため、コンタミネーションのおそれを少なくし、適度な培養液の循環を行いつつ、シャーレ中で細胞を培養することができる。
第4発明の反応促進方法は、第1発明のシャーレを用いてシャーレ中で反応溶液の液滴を形成し、その液滴に変動電界を印加することで、液滴表面及び内部の電荷と変動電界との相互作用により液滴が振動するため、シャーレを振とうすることなく効率よく液滴を撹拌することができる。このため、コンタミネーションのおそれを少なくしつつ、シャーレ中で溶液の反応を促進することができる。また、本発明の反応促進方法は、従来の方法では得られかった撹拌を可能とするため、変動電界の印加条件を設定することにより、従来の方法では得られなかった反応結果を得ることができる可能性がある。
本発明のシャーレは、底面と、その外周に配される側壁と、側壁が形成する開口部とを有するシャーレにおいて、シャーレの底面上に注ぎ入れた溶液がシャーレの側壁と接することがないように、底面と側壁との内側境界部分に側壁よりも低い高さの台座を設けることにより、溶液を台座の高さを越えるまで注ぎ入れた場合にドーム形状の液滴を形成できるようになっている。
ここで、「シャーレ」とは、底面と側壁とを有し、広く試験研究一般に用いられる容器をいう。シャーレの材質は、例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリスチレン等を用いることができ、これを成形することにより製造することができる。シャーレは、内部に収容する溶液や細胞の様子を観察できるように、通常は透明な材料を用いるが、用途によっては着色することもできる。
図10(A)は従来のシャーレを示し、図10(B)は、シャーレの直径を通る鉛直面での断面図(以下、「断面図」という)を示したものである。従来のシャーレ(1)は、底面(2)とその外周に配される側壁(3)とからなる平皿状の容器である。シャーレに溶液(4)を注ぎ入れると、溶液(4)はシャーレの底面(2)と側壁(3)に接してシャーレ内部に保持されるが、側壁(3)が液体分子を引き付ける力により、側壁(3)の周辺で液面が屈曲してメニスカス(5)が生じる。
このように、従来のシャーレに溶液を注ぎ入れた場合には、表面張力により中央が盛り上がった液滴(ドロップ)を形成することができなかった。
シャーレ(1)の底面(2)に溶液(4)を注ぎ入れると、溶液(4)は底面(2)と台座(6)に接触した状態で嵩が増してゆく。しかし、溶液(4)の液面が台座(6)の高さを越えると、台座(6)に接触することができなくなり、溶液(4)の液体分子が台座(6)に引きつけられる力がなくなって、溶液(4)の表面張力により、溶液(4)は中央が盛り上がり、平坦な液面から半球に近づいた形状の液面を有する液滴(ドロップ)を形成する。
底面の形状を円形とした場合には、半球状に近い液滴を形成し、大きな振動をさせても崩れにくい液滴を形成できるので好ましい。ここで、「円形」とは、真円のみならず楕円等も含む形状である。
シャーレの底面の大きさは、円形のものである場合、通常その直径が1cm〜50cm程度であり、シャーレの側壁の高さは、通常0.5cm〜20cm程度である。
台座をリング状とする場合、液滴が側壁と接触しないようにする観点から、台座の幅は1mm以上とするのが好ましく、また、シャーレ中で台座が占める面積を少なくする観点から、台座の幅は底面の幅の30%以下、より好ましくは10%以下とすることが好ましい。ここで、「底面の幅」とは、底面の形状のうち最も短い長さとなる幅をいう。例えば、底面の形状が楕円である場合には、「底面の幅」は楕円の短径を意味し、底面の形状が四角形の場合には、「底面の幅」は短い方の辺の長さを意味する。
このような撥水性の材料としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、オルガノポリシロキサン等のシリコン系樹脂、ポリプロピレン等のポリオレフィン等を用いることができる。
台座が液滴と接触する部分である台座の側面は、底面に対して垂直とすることもでき、また、底面に垂直な面に対して傾斜を持たせることもできる。台座の側面を、底面に垂直な面に対して側壁側に20度以上傾斜させた場合には、メニスカスを生じにくくさせることができる。
まだ、台座は、側壁を階段状に折り曲げたような形状となるように成形することにより、台座部分ができるようにしてもよい。
シャーレに溶液を注入するなどの操作を可能とするため、シャーレの蓋は着脱可能又は開閉可能とすることが好ましい。蓋の形状は、側壁が形成する開口部を覆うことができるものであればどのようなものでもよく、シャーレ内部を完全に密閉するものに限らず、わずかな通気を可能とするものであってもよい。
蓋に設ける電極は、液滴に十分な変動電界を印加することができるように、蓋の内側(裏側)に設けることが好ましい。しかし、液滴に変動電界を印加することができれば、電極を蓋の外側(表側)に設けてもよい。
電界撹拌方法の詳細については、以下に説明する。
本発明の電界撹拌方法は、本発明のシャーレ中に液滴を形成し、液滴に変動電界を印加することで、液滴を振動させ、液滴を撹拌する方法である。
ここで、「変動電界」とは、周期的に強さが変動する電界を意味する。この変動電界により、液滴の表面又は内部の電荷にクーロン力が働くことによって、液滴が振動する。
この液滴(4)に変動電界を印加するため、電極(10)と電極(17)と高圧アンプ(13)とファンクションジェネレータ(14)とこれらを電気的に接続するリード線(11)とを有する変動電界印加装置を用いる。この変動電界印加装置は、ファンクションジェネレータ(14)で発生させた信号を高圧アンプ(13)で昇圧させ、この電圧をシャーレの上部に設置した電極(10)とシャーレの下部に設置した電極(17)に、それぞれ対となる端子から供給する。電極(10)に正の電圧が供給されるときには、電極(17)にはこれとは符号が逆の負の電圧が供給されるため、電極(10)にプラス電荷(15)が蓄積される一方、電極(17)にはマイナス電荷(12)が蓄積される。信号は周期的に変化する信号であり、電極(10)に対してはプラス側に偏った信号であるので、電極(10)には常にプラス電荷(15)が蓄積し、その量は周期的に変動する。一方、電極(17)にはマイナス電荷(12)が常に蓄積し、その量が周期的に変化する。図3(A)は、電極(10)及び電極(17)に供給される電圧信号の絶対値が最小となっているときであり、両電極に蓄積した電荷が最小となっている状態である。
この液滴(4)の周期的な振動により、液滴内部の液体は撹拌される。液滴の振動の振幅は機械的な振盪と比較して小さいものであるが、液滴の振動の速度(周期)は機械的な振盪と比較して極めて大きいため、液滴(4)を効率よく撹拌することができる。
また、印加する変動電界の強度や、周波数、波形等を制御することによって、液滴の振動や液滴の撹拌の程度を適したものに調整することが可能である。
変動電界を印加する電極の形状は、どのようなものでもよく、これらに限定されるわけではないが、例えば、平板状の電極や、凸部を有する電極等を用いることができる。
液滴の上部を覆う平板状の電極の場合には、液滴全体に一様な変動電界を印加することができる。凸部を有する電極を用いた場合には、凸部に電荷が集中するため、集中した変動電界を液滴に印加することができる。
図4(A)及び(B)は、リング状の電極を蓋に備えたシャーレの例を示す。図4(A)は、シャーレの断面図を示し、図4(B)はシャーレの蓋を裏側から見た図を示す。円形の平板電極と比べて、リング状の電極(10´)は面積が小さくなっているため、より電荷密度が高くなり電界を集中させることができる。リング状の電極(10´)にプラスの電荷が蓄積しているときには、液滴表面のマイナスの電荷は矢印の方向に引き付けられる。
本発明のシャーレにおいて電界撹拌を行うためには、リング状の電極又は円板状の電極に一箇所以上の凸部を設けた電極とすると、電界が集中するため好適に液滴を撹拌することができる。
図7(A)及び(B)に示すように、蓋に備えた電極は二つのリング電極(10´,10´´)からなる二重リング構造となっている。そして、二つのリング電極(10´,10´´)はリード線(11)により連結されている。そして、シャーレの底面(2)の外側には、平板電極(17)が設置されている。
図8(A)及び(B)に示すように、蓋に備えた電極は二つのリング電極(10´,10´´)からなる二重リングの構造となっている。
尚、液滴に印加される電界が、左右方向にのみ電気力線が流れる電界とならないように、2つのリング電極(10´)と(10´´)の間の距離は、リング電極(10´)と底面(2)との間の距離よりも長くする。
図9(A)に示すように、蓋(8)に備えた二重リング電極のうち、リング電極(10´)とリング電極(10´´)とは、高圧アンプ(13)の正負の端子にリード線(11)を介して接続されている。また、下皿(7)に備えた二重リング電極のうち、リング電極(17´)とリング電極(17´´)とは、高圧アンプ(13)の正負の端子にリード線(11)を介して接続されている。そして、ファンクションジェネレータ(14)で発生させた信号を高圧アンプ(13)で昇圧させてこれらの4つの電極に供給すると、リング電極(10´)とリング電極(17´´)には同じ電圧信号が供給される。そして、この電圧信号とは符号が逆の電圧信号が、リング電極(10´´)とリング電極(17´)とに供給される。したがって、液滴(4)には、矢印に示すように、2方向のクーロン力がかかり、液滴(4)には二つの盛り上がったピークが形成されることとなる。そして、電圧信号の周期的な変動により、液滴(4)はピークの衝突・分離を繰り返す複雑な振動を行う。
尚、左右方向のみの電界とならないように、2つのリング電極(10´)と(10´´)の間の距離は、上下の2つのリング電極(10´)と(17´)の間の距離よりも長くする。
本発明の細胞培養方法は、本発明のシャーレ中に細胞培養液の液滴を形成し、その液滴に変動電界を印加することで、液滴を振動させることを特徴とする方法である。
本発明の細胞培養方法では、シャーレに微生物等が混入するといったコンタミネーションを防ぐため、蓋を有するシャーレを使用することが好ましい。ただし、蓋を有するシャーレを用いて細胞培養を行うには、細胞の呼吸に必要なガス交換を行うため、シャーレの蓋や側壁等に無菌的ガス交換を可能とする通気口を設けることが好ましい。例えば、これらに限定されるわけではないが、微生物を通さないフィルターやメンブレンを用いた通気口を設けることができる。
本発明の細胞培養方法で用いる「細胞培養液」とは、細胞と水と、細胞の増殖に必要な栄養素とを含むものである。
ここで、「細胞」とは、細胞株だけでなく、クローン化されていない細胞や、いろいろな細胞が集合した組織も含む。したがって、本発明の細胞培養方法では、本発明のシャーレ中に、生体組織を含む細胞培養液の液滴を形成し、組織培養を行うこともできる。
また、本発明の細胞培養方法は、従来の方法では得られかった撹拌を可能とし、様々なパターニングの電極をシャーレに施し、様々な波形の信号を用いることにより、液滴の振動を自在に制御することが可能である。したがって、再生医療の分野で、高品位かつ迅速な培養手法を確立できる可能性がある。
本発明の反応促進方法は、本発明のシャーレ中に反応溶液の液滴を形成し、その液滴に変動電界を印加することで、液滴を振動させて反応溶液の反応を促進することを特徴とする方法である。
本発明の反応促進方法に用いる「反応溶液」とは、水等の溶媒と化学物質、生体分子、生物試料などを含む溶液であって、反応を生じるものであれば如何なるものでもよい。「反応溶液」の例としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、化学反応又は化学分解を生じる1種類以上の化学物質を有する反応溶液、抗原と抗体とを有する反応溶液、生体組織とその組織中のタンパク質に反応する抗体とを有する反応溶液、生体組織とその生体組織を染色する色素とを有する反応溶液、DNAとプライマーとヌクレオチドとDNAポリメラーゼとを有する反応溶液、繊維とその繊維を染色する色素とを有する反応溶液等が挙げられる。
また、本発明の反応促進方法は、従来の方法では得られかった撹拌を可能とし、様々なパターニングの電極をシャーレに施し、様々な波形の信号を用いることにより、液滴の振動を自在に制御することが可能である。したがって、従来の方法では得られなかった反応結果を得ることができる可能性がある。
本発明の電界撹拌システムは、本発明のシャーレと、シャーレ中に形成した液滴に変動電界印加する変動電界印加装置とを有することを特徴とする。
ここで、「変動電界印加装置」としては、変動する電界を特定の場所に印加することができる装置であれば、どのようなものを用いてもよく、複数の装置を組み合わせたものであったもよい。変動電界印加装置としては、例えば、電圧アンプと、電圧アンプに信号を供給するファンクションジェネレータと、電圧アンプにより発生した変動電圧を供給されて電界を発生させる電極とを有する装置を用いることが好ましい。
ここで、「変動電界装置」としては、上記と同じものを用いることが好ましく、「温度制御装置」としては、温度計測器と加熱器と場合によっては加湿器を有する装置構成をとることが好ましい。
2 底面
3 側壁
4 溶液、液滴
5 メニスカス
6 台座
7 下皿
8 蓋
9 縁部
10,10´,10´´ 上部の電極
11 リード線
12 マイナス電荷
13 高圧アンプ
14 ファンクションジェネレータ
15 プラス電荷
16 凸部
17,17´,17´´ 下部の電極
Claims (16)
- 底面と、前記底面の全外周に配される側壁と、前記側壁が形成する開口部を有するシャーレにおいて、
前記底面上に注ぎ入れた溶液が前記側壁と接することがないように、前記底面と前記側壁との内側境界部分に前記側壁よりも高さの低い台座を設けることにより、前記溶液を前記台座の高さを越えるまで注ぎ入れた場合にドーム形状の液滴を形成できるようにしたことを特徴とするシャーレ。 - 液滴に変動電界を印可して撹拌を行う電界撹拌に用いることを特徴とする、請求項1に記載のシャーレ。
- 前記開口部を覆う蓋をさらに有することを特徴とする、請求項1又は2に記載のシャーレ。
- 前記液滴に変動電界を印加するための電極をさらに有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載のシャーレ。
- 前記液滴に変動電界を印加するための電極が、前記蓋に設けられていることを特徴とする、請求項3に記載のシャーレ。
- 前記電極は凸部を有するリング状または円板状の電極であることを特徴とする、請求項4又は5に記載のシャーレ。
- 前記台座は、撥水性の材料を用いて形成されていることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載のシャーレ。
- 前記台座が、1mm以上で且つ底面の幅の30%以下の長さの幅を有するリング状の台座であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載のシャーレ。
- 前記液滴が、2ml〜1000mlの容量の液滴であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれかに記載のシャーレ。
- 前記底面は円形であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれかに記載のシャーレ。
- 無菌的ガス交換を可能とする通気口を設けたことを特徴とする、請求項3に記載のシャーレ。
- 請求項1〜11のいずれかのシャーレ中に液滴を形成し、前記液滴に変動電界を印加することで、前記液滴を振動させることを特徴とする電界撹拌方法。
- 請求項1〜11のいずれかのシャーレ中に細胞培養液の液滴を形成し、前記液滴に変動電界を印加することで、前記液滴を振動させて撹拌することを特徴とする細胞培養方法。
- 請求項1〜11のいずれかのシャーレ中に反応溶液の液滴を形成し、前記液滴に変動電界を印加することで、前記液滴を振動させて反応溶液の反応を促進することを特徴とする、反応促進方法。
- 請求項1〜11のいずれかのシャーレと、前記シャーレ中に形成した液滴に変動電界印加する変動電界印加装置とを有することを特徴とする、電界撹拌システム。
- 請求項1〜11のいずれかのシャーレと、前記シャーレ中に形成した細胞培養液の液滴に変動電界を印加する変動電界印加装置と、前記細胞培養液又は培養環境の温度を制御する温度制御装置とを有することを特徴とする、細胞培養システム。
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