WO2019159843A1 - 反応デバイス、電界撹拌装置、及び検出方法 - Google Patents

反応デバイス、電界撹拌装置、及び検出方法 Download PDF

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microplate
electric field
container
solution
upper electrode
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陽一 赤上
竜太 中村
佳弘 南谷
博 南條
秀洋 林
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秋田県
国立大学法人秋田大学
セルスペクト株式会社
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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Definitions

  • the present invention relates to a microplate having a plurality of minute volume containers (wells) used for biochemical analysis, clinical examination, and the like, and an electric field used for applying a varying electric field to the solution in the minute volume container to stir the solution.
  • the present invention relates to a reaction device including a stirring electrode.
  • the present invention also relates to an electric field stirring apparatus having an electric field stirring electrode, a power supply device for supplying a voltage to the electric field stirring electrode, and an absorptiometer.
  • the present invention relates to a detection method for detecting a target substance in a test sample by using a microplate and electric field stirring.
  • a microplate is an experimental / inspection instrument in which a large number of microcapacity containers are aligned vertically and horizontally by forming a large number of wells on the plate. If a microplate is used, a large number of reactions can be performed simultaneously in a large number of microcapacity containers on the plate. For this reason, it is used for clinical tests for diagnosing a large number of test samples simultaneously, scientific experiments for processing a large number of samples simultaneously, and the like. In particular, microplates are often used in ELISA (Enzyme-Linked Immuno Immunosorbent Assay) that detects proteins in a test sample by antigen-antibody reaction.
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Immunosorbent Assay
  • a primary antibody that binds to a protein to be detected is fixed to the bottom surface of a plurality of microvolume containers of the microplate.
  • a solution of each test sample and an enzyme-labeled secondary antibody that binds to the protein to be detected (one that binds to an epitope other than the epitope of the protein to which the antibody immobilized in the microvolume container binds) ) Solution is added to each minute volume container and an antigen-antibody reaction is carried out.
  • an enzyme-labeled secondary antibody that binds to the protein to be detected one that binds to an epitope other than the epitope of the protein to which the antibody immobilized in the microvolume container binds
  • a coloring reagent is added to cause color development.
  • a coloring reagent is added to cause color development.
  • a number of test samples can be determined as to whether or not the test sample contains the target protein. Can be inspected at the same time.
  • Patent Document 1 A method for promoting reaction and the like was developed (Patent Document 1). Furthermore, the present inventors have developed an invention relating to a microplate having a plurality of minute volume containers suitable for electric field stirring.
  • the present invention has a drawback in that the conventional structure of the microcapacity container has a large proportion of droplet molecules attracted to the side wall of the microcapacity container and becomes a meniscus, and a dome-shaped liquid droplet cannot be formed.
  • a pedestal is provided on the bottom so that the liquid droplets in the minute volume container do not touch the side wall.
  • the liquid droplets are poured until the height of the pedestal is exceeded.
  • the present inventors have developed a rapid immunostaining method in which immunostaining (immunohistochemistry: IHC) is performed in a short time using electric field stirring.
  • a droplet containing an antibody is dropped on a tissue expressing a protein to be detected to form a microdroplet, and the microdroplet is vibrated by applying a variable electric field.
  • This is a method of stirring and accelerating the antigen-antibody reaction to allow immunostaining in a short time (Patent Document 3, Non-Patent Document 1).
  • the present inventors have developed an apparatus for automatically performing a rapid immunostaining method using electric field stirring (Patent Document 4).
  • the present inventors also developed a method of cleaning using electric field stirring (Patent Document 5), an electrode for electric field stirring (Patent Document 6), and a petri dish for droplet formation used for electric field stirring (Patent Document 7). ing.
  • JP 2010-119388 A Japanese Patent No. 5839526 JP 2012-013598 A Japanese Patent No. 5696300 JP 2014-160061 A Japanese Patent No. 5825618 Japanese Patent No. 5857309
  • a microplate is a disposable one that is not repeatedly used, and is basically mass-produced by injection molding using a plastic mold. It is known that there is distortion in the shape of the microplate due to various stresses and the like caused by this molding. This distortion does not affect the reaction when the reaction is performed on the microplate without applying electric field stirring. However, in order to perform electric field stirring under the same conditions for the solutions in a plurality of minute volume containers, It became clear that it was necessary to eliminate distortion. Therefore, an object of the present invention is to eliminate the distortion of the microplate, apply a uniform electric field to the solution in a plurality of minute volume containers, and perform electric field stirring under the same conditions.
  • the present inventors have conducted intensive research.
  • the upper electrode and the lower electrode are used as the electrodes for electric field stirring
  • the microplate is placed on the upper portion of the lower electrode, It has been found that by using a reaction device having a structure that is pressed from the top, distortion of the shape of the microplate can be suppressed, and electric field stirring can be performed under the same conditions for each of the solutions in a plurality of minute volume containers. .
  • the first invention relates to a reaction device including a microplate having a plurality of minute volume containers and an electric field stirring electrode used for applying a varying electric field to a solution in the minute volume container,
  • the electric field stirring electrode has an upper electrode and a lower electrode, and has a structure in which the microplate is placed on the lower electrode, and the microplate can be pressed from above by the upper electrode.
  • the micro-capacity container has a bottom surface and a side wall located on an outer periphery of the bottom surface, On the bottom surface on the inner peripheral side than the side wall, has a surrounding frame, It is preferable that the bottom surface present on the inner peripheral side of the surrounding frame has a planar shape for measuring absorbance.
  • the ratio between the height of the surrounding frame and the diameter of the bottom surface existing on the inner peripheral side of the surrounding frame is 1: 2 to 1:20,
  • the volume of the container formed by the bottom surface and the surrounding frame is preferably 10 to 300 ⁇ l.
  • the upper electrode has a plurality of convex portions corresponding to the positions of the respective microcapacity containers of the microplate, It is preferable that the plurality of convex portions have a shape that can be inserted into the inner peripheral side of the side wall.
  • the convex portion has a columnar shape and the inner peripheral side of the side wall has a cylindrical shape.
  • the second invention relates to an electric field stirring device for applying a variable electric field to a microplate having a plurality of minute volume containers, An upper electrode and a lower electrode; A power supply for supplying a variable voltage to the upper electrode and / or the lower electrode; An absorptiometer for measuring the absorbance of the solution in the microvolume container;
  • the microplate is placed on top of the lower electrode and has a structure in which the microplate can be pressed from above by the upper electrode. Perform electric field stirring under the same conditions for the solution in the container, By measuring the absorbance of the solution in the microvolume container, A plurality of test samples can be tested simultaneously.
  • the test sample and the reagent are dispensed into each microcapacity container of a microplate having a plurality of microcapacity containers, and a varying electric field is applied thereto.
  • a detection method for detecting a target substance in the test sample Use the upper electrode and the lower electrode as the electrodes for applying the variable electric field, By placing the microplate on top of the lower electrode, by pressing the microplate from the top by the upper electrode, The shape distortion of the microplate is suppressed, and electric field stirring under the same conditions is performed on the solutions in the plurality of minute volume containers.
  • the microplate In the minute capacity container, it has a bottom surface and a side wall located on the outer periphery of the bottom surface, On the bottom surface on the inner peripheral side than the side wall, has a surrounding frame, By using a microplate in which the bottom surface present on the inner peripheral side of the surrounding frame is a planar shape, For the solution in the container formed by the bottom surface and the surrounding frame, the variation in depth due to the position is reduced, It is preferable to measure the absorbance of the solution by transmitting measurement light in the depth direction of the solution.
  • the microplate placed on the upper part of the lower electrode is pressed from the upper part by the upper electrode, thereby suppressing the distortion of the shape of the microplate, and the same conditions for the solutions in a plurality of minute capacity containers. Therefore, it is possible to perform a plurality of test samples with high accuracy by reducing variation in reaction.
  • FIG. 1A is a cross-sectional view showing a state in which a microplate is placed on the upper part of the lower electrode
  • FIG. 1B is a cross-sectional view showing a state in which the microplate is pressed from above by the upper electrode. is there.
  • FIG. 2A is a cross-sectional view illustrating a structure of a microcapacity container having a bottom surface, a side wall, and a surrounding frame, and the bottom surface is a planar shape.
  • FIG. 2B is a diagram of Patent Document 2.
  • FIG. 1A is a cross-sectional view of a microcapacity container having a curved bottom surface. It is drawing which shows typically the microplate which has multiple micro capacity
  • FIG. 3A shows a cross-sectional view of the microplate, and FIG. 3B shows a plan view of the microplate. It is drawing which shows a mode that the droplet of a solution vibrates by application of a fluctuation electric field.
  • 4A shows a state in which the positive voltage supplied to the upper electrode is the highest, and FIG. 4B shows a state in which the positive voltage supplied to the upper electrode is the lowest.
  • 2 is a design diagram of a microplate and an upper electrode manufactured in Example 1.
  • FIG. 1A is a cross-sectional view of a microcapacity container having a curved bottom surface. It is drawing which shows typically the microplate which has multiple micro capacity
  • FIG. 5A shows a cross-sectional design diagram of a microcapacity container of a microplate
  • FIG. 5B shows a cross-sectional design diagram of the upper electrode
  • FIG. 5C shows a plan view of the upper electrode.
  • a design drawing is shown.
  • 6 is a graph showing experimental results of Example 2.
  • FIG. 6A shows the result when ELISA is performed in a state where the microplate is pressed by the upper electrode to suppress the distortion of the shape of the microplate
  • FIG. 6B shows the result when the microplate is moved to the upper electrode. The result when not pressed by is shown.
  • the present invention relates to a reaction device including a microplate having a plurality of minute volume containers and an electric field stirring electrode used to apply a variable electric field to a solution in the plurality of minute volume containers. is there.
  • the electric field stirring electrode of the reaction device of the present invention has an upper electrode and a lower electrode, and these electrodes are counter electrodes. Stirring is performed by generating a fluctuating electric field between the upper electrode and the lower electrode using a power supply device, applying a fluctuating electric field to the solution in the microvolume container, and vibrating the droplets of the solution at high speed. Is possible.
  • the reaction device of the present invention has a structure in which a microplate is placed on top of a lower electrode and the microplate can be pressed from above by the upper electrode.
  • the reaction device of the present invention can suppress the distortion of the shape of the microplate and can perform electric field stirring under the same conditions for the solutions in a plurality of microcapacity containers.
  • the shape of the lower electrode may be any shape as long as the microplate can be placed on the upper portion. However, in order to stably place the microplate, the shape of the microplate may be changed. A corresponding shape is preferable. Since the microplate usually has a bottom surface on the same plane, the shape of the lower electrode is preferably a flat plate electrode. In order to apply a strong electric field in the microplate container of the microplate, it is preferable to place the microplate directly on the surface of the lower electrode, but in order to prevent electric shock and adhesion of the solution to the electrode, the lower electrode An insulating sheet or plate may be provided between the microplate and the microplate.
  • the reaction device of the present invention it is preferable to have a structure in which the lower electrode and the upper electrode can be relatively moved in order to press the microplate from the upper part by the upper electrode.
  • a structure in which the lower electrode and the upper electrode can be relatively moved in order to press the microplate from the upper part by the upper electrode.
  • it can be a structure that can move only the upper electrode up and down, can be a structure that can move only the lower electrode up and down, or A structure in which the upper electrode and the lower electrode can move vertically is possible.
  • it can also be set as the structure which can move an upper electrode freely up and down, right and left.
  • the microplate When the microplate is pressed from above by the upper electrode, it is preferable to press the upper electrode directly in contact with the microplate so that a strong electric field can be applied in the microvolume container of the microplate.
  • the microplate may be pressed by the upper electrode through the cover member after the microplate is covered with a cover member (microplate lid).
  • the shape of the upper electrode and / or the lower electrode is preferably a shape having a plurality of convex portions corresponding to the position of the minute capacity container. At the convex part of the electrode, the lines of electric force concentrate and a strong electric field can be applied to the solution.
  • a convex portion is provided only on the electrode to which the variable voltage is applied, and the other electrode is a flat plate electrode. It should be noted that both the case where the variable voltage is supplied to one of the electrodes and the case where the variable voltage is supplied to both the upper electrode and the lower electrode may be provided with a convex portion on both electrodes.
  • the convex portions When a plurality of convex portions are provided on the upper electrode, it is preferable that the convex portions have a shape that can be inserted into the side wall of the minute capacity container. This makes it possible to bring the convex part of the upper electrode closer to the solution in the microcapacity container and to apply a stronger electric field to the solution, and to accurately align the convex part with respect to the microcapacity container, It is possible to apply a varying electric field in the vertical direction to the solution and to perform suitable stirring.
  • FIG. 1A is a cross-sectional view showing a state in which a microplate is placed on the upper part of the lower electrode
  • FIG. 1B is a cross-sectional view showing a state in which the microplate is pressed from above by the upper electrode. is there.
  • the microplate 1 has a plurality of minute capacity containers 2a, 2b, 2c.
  • Each minute capacity container has bottom surfaces 3a, 3b, 3c, side walls 4a, 4b, 4c, and surrounding frames 5a, 5b, 5c.
  • Each of the bottom surfaces has a circular shape
  • each of the side walls has a cylindrical shape
  • each of the surrounding frames has a ring shape.
  • Liquid droplets 6a, 6b, 6c can be formed in a container formed by the bottom surfaces 3a, 3b, 3c and the surrounding frames 5a, 5b, 5c. Since the microplate 1 is made of plastic, there is a considerable amount of shape distortion due to the stress applied at the time of molding.
  • the shape distortion of the microplate 1 can be suppressed by pressing the microplate 1 from above with the upper electrode 8.
  • the upper electrode 8 can be driven up and down, and the microplate 1 can be pressed from above by moving the upper electrode 8 downward.
  • the upper electrode 8 has convex portions 9a, 9b, 9c at positions corresponding to the minute capacity containers 2a, 2b, 2c. Since electric lines of force are concentrated on the convex portion of the upper electrode, a strong electric field is generated in the region sandwiched between the convex portions 9a, 9b, 9c and the lower electrode 7, which is strong against the solutions 6a, 6b, 6c. An electric field can be applied.
  • the convex portions 9a, 9b, 9c of the upper electrode have a columnar shape and can be inserted into the inner peripheral side of the cylindrical side walls 4a, 4b, 4c. Thereby, the convex parts 9a, 9b, 9c can be brought close to the solutions 6a, 6b, 6c, and a stronger electric field can be applied to the solution.
  • the convex portion of the upper electrode by inserting the convex portion of the upper electrode on the inner peripheral side of the side wall, it is possible to accurately align the convex portions 9a, 9b, 9c and the solutions 6a, 6b, 6c.
  • This makes it possible to suitably perform electric field stirring by applying a vertically varying electric field to the solution and vibrating the solution droplets in the vertical direction. If the alignment between the convex portion and the solution is not accurate, an oblique variation electric field is applied to the solution, making it difficult to efficiently perform electric field stirring.
  • the diameter of the convex portions 9a, 9b, 9c is preferably smaller than the inner diameter of the side walls 4a, 4b, 4c, and a slight gap is provided between them. Thereby, it can prevent that a strong force is added to a side wall by a convex part, and can prevent distortion and breakage of a microplate.
  • a microplate has a plurality of minute volume containers, and any kind of container can be used as long as it performs reaction, mixing, stirring, etc. of the solution in the container. Also good.
  • the capacity of the microvolume container of the microplate is usually 0.1 to 2000 ⁇ l per piece.
  • a microplate can typically have 2 to 10,000 microvolume containers.
  • the number of micro-capacity containers (wells) is 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536, etc., depending on the application, and microplates in which these are aligned vertically and horizontally are commercially available.
  • the micro-capacity container of the microplate used in the present invention can be a micro-capacity container having a bottom surface and side walls located on the outer periphery thereof, like a commercially available microplate.
  • a microplate having a surrounding frame on the bottom surface on the inner peripheral side of the side wall of the minute capacity container By providing such an enclosing frame, it prevents the molecules of the solution from being attracted to the side wall to form a meniscus, and by pouring the solution until it slightly exceeds the height of the enclosing frame, the shape where the center is raised Can be formed.
  • Such a droplet can be vibrated up and down by applying a fluctuating electric field and efficiently stirred.
  • capacitance container is planar shape. Since the container for storing the solution is formed by the surrounding frame and the bottom surface on the inner peripheral side thereof, variation in the depth of the solution depending on the position can be reduced by making the bottom surface flat. By reducing the variation in the depth of the solution depending on the position, the measurement light is transmitted when measuring the concentration of the solution and the degree of color development by transmitting the measurement light in the depth direction of the solution using an absorptiometer. Since it is possible to reduce the variation in the distance through which the light due to the difference in position passes through the solution, it is possible to accurately measure the absorbance.
  • the ratio between the height of the surrounding frame and the diameter of the bottom surface existing on the inner peripheral side of the surrounding frame is 1: 2 to 1:20.
  • a microplate is manufactured.
  • the volume of the container formed by the bottom surface of the minute volume container and the surrounding frame is set to 10 ⁇ l or more. It is preferable to do.
  • the volume of the container is preferably 300 ⁇ l or less.
  • the microplate can usually be manufactured by plastic molding.
  • a water-repellent material is not limited to these, but for example, a fluorine resin such as polytetrafluoroethylene, a silicon resin such as organopolysiloxane, a polyolefin such as polypropylene, or the like may be used. it can.
  • FIG. 2A is a cross-sectional view illustrating a structure of a microcapacity container having a bottom surface, a side wall, and a surrounding frame, and having a bottom surface in a planar shape.
  • FIG. 2B is a cross-sectional view of a microcapacity container having a curved bottom surface described in FIG.
  • the 2A has a bottom surface 3 and a side wall 4 provided on the outer periphery of the bottom surface 3.
  • the bottom surface 3 is circular and the side wall 4 is cylindrical.
  • An enclosing frame 5 is provided on the bottom surface on the inner peripheral side of the side wall 4 of the minute capacity container 2.
  • the surrounding frame 5 has a circular ring shape, and a container is formed by the surrounding frame 5 and the bottom surface 3.
  • the bottom surface present on the inner peripheral side of the surrounding frame 5 has a planar shape.
  • the variation which arises when the depth of the solution 6 changes with positions can be made small.
  • the measurement light 10 is transmitted when measuring the concentration of the solution and the degree of color development by transmitting the measurement light in the depth direction of the solution using an absorptiometer. Since the variation in the distance through which the light passes through the solution due to the difference in position can be reduced, the absorbance can be measured with high accuracy.
  • the ratio between the height A of the surrounding frame 5 and the diameter B of the bottom surface existing on the inner peripheral side of the surrounding frame 5 is in the range of 1: 2 to 1:20.
  • the ratio By setting the ratio within such a range, it is possible to form droplets having a shape that can be efficiently stirred by applying a varying electric field.
  • the solution when the solution is excessively poured into the surrounding frame 5, the solution can overflow beyond the surrounding frame, and a space is provided between the side wall 4 and the surrounding frame 5. The solution overflowing from 5 can be accommodated.
  • FIG. 2 (B) is a cross-sectional view of a microcapacity container having a curved bottom surface described in FIG. 1 (A) of Patent Document 2 (Japanese Patent No. 5839526). It is also possible to use a microplate having a minute capacity container.
  • the microcapacity container 2 has a bottom surface 3 and side walls 4 located on the outer periphery thereof.
  • the bottom surface 3 is circular and the side wall 4 is cylindrical.
  • a water-repellent surrounding frame (pedestal) 5 is provided adjacent to the inner peripheral side of the side wall 4.
  • the surrounding frame (pedestal) 5 has a circular ring shape, and a container is formed by the surrounding frame 5 and the bottom surface 3.
  • the solution 6 When the solution 6 is injected into the container, the solution 6 does not contact the side wall 4 and therefore does not form a meniscus. Since the surrounding frame (pedestal) is water-repellent, the solution can be poured far beyond the height of the surrounding frame 5, resulting in a dome-shaped droplet whose center is greatly raised due to surface tension.
  • a dome-shaped droplet having a large bulge at the center can be formed, and the bottom surface 3 has a curved shape instead of a flat shape, so that the solution 6 is in the center.
  • the degree of deepening is remarkable. For this reason, when measuring the concentration of the solution and the degree of color development using an absorptiometer, the variation in the distance through which the light passes through the solution increases due to the difference in the position where the measurement light 10 is transmitted. The accuracy is lower than that in the case of FIG.
  • FIG. 3 schematically shows a microplate having a plurality of microcapacity containers shown in FIG.
  • FIG. 3A shows a cross-sectional view of the microplate
  • FIG. 3B shows a plan view of the microplate.
  • the microplate 1 has five microcapacity containers 2 in the lateral direction.
  • Each microcapacity container 2 has a bottom surface 3 and a side wall 4 positioned on the outer periphery of the bottom surface, and has a surrounding frame 5 on the bottom surface on the inner peripheral side of the side wall 4.
  • the bottom surface 3 is circular, and the side wall 4 is cylindrical.
  • a solution 6 is accommodated in a container formed by the bottom surface 3 and the surrounding frame 5.
  • the surrounding frame 5 has a circular ring shape, and the solution 6 has a circular shape.
  • the present invention provides an electric field stirring device that applies a variable electric field to a microplate having a plurality of minute volume containers.
  • the electric field stirrer of the present invention is i) an upper electrode and a lower electrode; ii) a power supply for supplying a variable voltage to the upper electrode and / or the lower electrode; iii) It has an absorptiometer for measuring the absorbance of the solution in the minute volume container.
  • the upper electrode and the lower electrode in the electric field stirring apparatus of the present invention have a structure in which a microplate is placed on the upper part of the lower electrode and the microplate can be pressed from above by the upper electrode.
  • the structure of the upper electrode and the lower electrode is as described in 1-1.
  • the electric field stirrer of the present invention suppresses the distortion of the shape of the microplate by pressing the microplate placed on the upper part of the lower electrode from the upper part by the upper electrode, and the solution in the plurality of microcapacity containers. Since electric field agitation can be performed under the same conditions, variation in reaction can be reduced and a plurality of test samples can be inspected with high accuracy.
  • the power supply device used in the electric field stirring device of the present invention is a device that supplies a variable voltage to both the upper electrode and the lower electrode or to either the upper electrode or the lower electrode.
  • a variable voltage is supplied to one of the upper electrode and the lower electrode, the other electrode can be at ground potential.
  • a high-voltage amplifier and a function generator are used as a power supply device, and a signal with a waveform that periodically changes from the function generator is A voltage that periodically changes from the high-voltage amplifier to the upper electrode can be supplied to the amplifier.
  • these functions can be integrated into a single device and a periodically changing voltage can be supplied.
  • the electric field generated by the upper and lower electrodes and the power supply device may be in any voltage, period, and waveform conditions as long as it causes the liquid droplets to vibrate.
  • the magnitude of the variable electric field varies depending on the size of the droplet, it is preferably 350 to 3500 V / mm, more preferably 700 to 2500 V / mm, in order to produce a sufficient stirring effect. Is good.
  • a voltage calculated according to the distance between the electrodes is applied between the upper and lower electrodes so as to obtain such an electric field strength.
  • the signal for generating the applied variable electric field is preferably 0.1 to 800 Hz.
  • a square wave with a large instantaneous change should be used. Is preferred.
  • a signal for generating a fluctuating electric field a waveform biased to plus can be used, but a waveform that inverts between plus and minus or a waveform biased to minus can also be used.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a state in which a solution droplet vibrates by application of a varying electric field.
  • 4A shows a state in which the positive voltage supplied to the upper electrode is the highest
  • FIG. 4B shows a state in which the positive voltage supplied to the upper electrode is the lowest.
  • a positive voltage is supplied from the high voltage amplifier 11 to the upper electrode 8.
  • the voltage of the high voltage amplifier 11 is periodically changed from the high voltage amplifier 11 to the upper electrode 8 by being supplied with a signal having a waveform that periodically changes in the positive direction from the function generator 12.
  • a positive voltage is supplied.
  • FIG. 4A shows a state in which the positive voltage supplied to the upper electrode 8 is maximized, and the amount of the positive charge 13 accumulated in the upper electrode 8 is maximized at this point. Then, the negative charge 14 on the surface of the solution droplet 6 is strongly attracted by the positive charge 13 accumulated in the upper electrode 8, and the droplet 6 has a raised shape at the center.
  • FIG. 4B shows a state in which the positive voltage supplied to the upper electrode 8 is the smallest, and the amount of the positive charge 13 accumulated in the upper electrode 8 is minimized at this point. Since the amount of the positive charge 13 accumulated in the upper electrode 8 is small, the upward force attracting the droplet 6 becomes extremely weak, and the droplet 6 falls downward due to its own weight and becomes flat.
  • the positive voltage supplied to the upper electrode 8 changes periodically and reciprocates periodically between the state shown in FIG. 4A and the state shown in FIG. As shown in FIG. 4 (B), the droplet 6 falls downward due to its own weight, but bounces due to the reaction at the bottom surface 3 and promptly changes to the state of FIG. 4 (A) in accordance with the change of the electric field. You can go back. For this reason, the droplet 6 vibrates according to the cycle of the varying electric field, and the inside of the droplet is agitated. Although the amplitude of the droplet is small, the vibration speed (frequency) of the droplet is large, so that the droplet can be efficiently stirred.
  • the absorptiometer used in the electric field stirrer of the present invention transmits the measurement light of a specific wavelength through the sample solution and measures the amount of light that has passed through the solution, so that the light absorbed by the solution can be measured. It is a device that measures quantity.
  • the degree of color development and the concentration that increase in accordance with the degree of reaction can be measured with an absorptiometer. It is possible to detect a specific substance (including measurement), screen a substance having a target function, and the like.
  • the test sample or reagent is dispensed into the minute volume container, the fluctuation electric field is applied to the minute volume container, the minute volume container is washed, and the solution in the minute volume container is removed.
  • the electric field agitating apparatus of the present invention can shorten the reaction and washing time by electric field agitation, so that it is possible to test a large number of test samples very quickly due to a synergistic effect with automation.
  • the detection result can be obtained automatically by measuring the absorbance.
  • the present invention promotes the reaction between a test sample and a reagent by dispensing a test sample and a reagent into each microcapacity container of a microplate having a plurality of microcapacity containers and applying a variable electric field. And a detection method for detecting a target substance in a test sample.
  • an upper electrode and a lower electrode are used as electrodes for applying a varying electric field. Then, by placing the microplate on the upper part of the lower electrode and pressing the microplate from the upper part with the upper electrode, the shape distortion of the microplate is suppressed, and the same condition is applied to the solution in the plurality of microcapacity containers. Since electric field agitation can be performed, variation in reaction can be reduced and a plurality of test samples can be inspected with high accuracy.
  • a microplate having the following structure is preferably used as the microplate. i) It has a bottom face and a side wall located on the outer periphery of the bottom face in the minute capacity container. ii) It has a surrounding frame on the bottom surface on the inner circumference side than the side wall. iii) The bottom surface present on the inner peripheral side of the surrounding frame has a planar shape.
  • An example of the microplate having such a structure is as shown in FIG.
  • the structures i) and ii) make it possible to form a liquid droplet with a raised center, and by applying a varying electric field, it is possible to vibrate up and down to efficiently perform stirring. Is possible.
  • the variation in the depth of the solution depending on the position can be reduced by the structure iii).
  • the measurement light is transmitted when measuring the concentration of the solution and the degree of color development by transmitting the measurement light in the depth direction of the solution using an absorptiometer. Since the variation in the distance through which the light passes through the solution due to the difference in position can be reduced, the absorbance can be measured with high accuracy.
  • the detection method of the present invention is not limited to these.
  • antigen-antibody reaction such as ELISA for reacting an antigen protein with an antibody, or hybridization for reacting a nucleic acid with a complementary nucleic acid probe.
  • detect substances such as target proteins, nucleic acids, polysaccharides, lipids, etc. in a test sample by carrying out a reaction that binds a specific polysaccharide or lipid to a dye or toxin having an affinity for it.
  • Detection sensitivity can be obtained.
  • “detection” includes not only determining whether or not a target substance exists, but also measuring the amount of the target substance.
  • FIG. 5A shows a design drawing of a cross section of the minute capacity container.
  • the upper electrode which has eight convex parts which can be inserted in the inner peripheral side of the side wall of said microcapacity container was manufactured. Each convex part has a diameter of 6.0 mm and a height of 0.5 mm.
  • FIG. 5B shows a cross-sectional design of the upper electrode
  • FIG. 5C shows a plan view of the plane.
  • ELISA experiment Using the microplate and the upper electrode prepared in Example 1, and a flat lower electrode, ELISA was performed by performing electric field stirring in the antigen-antibody reaction and the color development reaction. The microplate was placed on the lower electrode, and the ELISA was performed in a state where the shape distortion of the microplate was suppressed by pressing the microplate from the upper part with the upper electrode. The ELISA was performed according to the following protocol using a trastuzumab ELISA kit (trade name: Kuon Test) manufactured by Cell Spectrum Co., Ltd.
  • a test sample (12 ⁇ l) containing a known concentration of trastuzumab was injected into a microplate, and trastuzumab in the test sample was reacted with the primary antibody immobilized on the bottom surface in the microvolume container. .
  • the test sample was removed, and the inside of the microvolume container was washed with a washing solution.
  • a secondary antibody reaction was performed by injecting a solution (12 ⁇ l) of a secondary antibody (labeled enzyme binding) binding to trastuzumab into a microvolume container. 4) The secondary antibody solution was removed, and the inside of the microvolume container was washed with a washing solution.
  • a color development reaction was performed by injecting a chromogenic substrate solution (10 ⁇ l) of the labeled enzyme into a microvolume container. 6) A solution (5 ⁇ l) of a reaction terminator was injected into a minute volume container to stop the color reaction, and absorbance at a wavelength of 450 nm was measured.
  • ELISA conventional method
  • ELISA electric field stirring method
  • Electric field stirring was performed by applying a fluctuation voltage of 4 kV and 40 Hz between the upper and lower electrodes.
  • the primary antibody reaction time and the secondary antibody reaction time are both 1 hour, and the color reaction time is 30 minutes.
  • the secondary antibody reaction time was 10 minutes, and the color development reaction time was 10 minutes.
  • tests were performed using test samples in which the concentration of trastuzumab in the test sample was 0 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml, and 200 ng / ml, respectively. The result is shown in the graph of FIG. In FIG. 6A, the horizontal axis indicates the concentration of trastuzumab in the test sample, and the vertical axis indicates the result of measuring the absorbance.

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Abstract

【課題】本発明は、マイクロプレートの歪みを無くし、複数の微小容量容器内の溶液に対して均一な変動電界を加えて、同一条件の電界撹拌を行うことを可能とする反応デバイスを提供することを目的とする。 【解決手段】本発明は、複数の微小容量容器２を有するマイクロプレート１と、前記微小容量容器２内の溶液６に変動電界を印加するために用いる電界撹拌用電極とを含む反応デバイスにおいて、　前記電界撹拌用電極は上部電極８と下部電極７とを有しており、前記下部電極７の上部に前記マイクロプレート１を載置し、前記マイクロプレート１を前記上部電極８によって上部から押さえ付けることができる構造を有する反応デバイスを提供する。

Description

反応デバイス、電界撹拌装置、及び検出方法
　本発明は、生化学的分析や臨床検査等に使用する複数の微小容量容器（ウェル）を有するマイクロプレートと、微小容量容器内の溶液に変動電界を印加して溶液を撹拌するために用いる電界撹拌用電極とを含む反応デバイスに関する。また、本発明は、電界撹拌用電極と、電界撹拌用電極に電圧を供給する電源装置と、吸光光度計とを有する電界撹拌装置に関する。さらに本発明は、マイクロプレートと電界撹拌を用いることにより、被検試料内の目的物質を検出する検出方法に関する。
　マイクロプレートとは、プレート上に多数のくぼみ（ウェル）を形成することにより、多数の微小容量容器が縦横に整列している実験・検査用の器具である。マイクロプレートを用いれば、プレート上の多数の微小容量容器の中で、多数の反応を同時に行うことができる。このため、多数の被検試料を同時に診断する臨床検査や、多数のサンプルを同時に処理する科学実験等に用いられている。マイクロプレートは、特に、抗原抗体反応により被検試料中のタンパク質を検出するＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）によく使用されている。例えば、マイクロプレートを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法では、まず、検出目的となるタンパク質に結合する１次抗体をマイクロプレートの複数の微小容量容器の底面等に固定させる。次に、各被検試料の溶液と、検出目的となるタンパク質に結合する酵素標識付きの２次抗体（微小容量容器内に固定した抗体が結合するタンパク質のエピトープとは別のエピトープに結合するもの）の溶液とを、各微小容量容器内に加えて、抗原抗体反応を行う。これにより、微小容量容器－１次抗体－タンパク質－２次抗体という複合体が微小容量容器内に形成される。そして、結合しなかった２次抗体を洗浄した後に、発色試薬を加えて発色させる。これにより、目的のタンパク質を含む被検試料を加えた微小容量容器のみが発色することとなり、吸光度の測定により、被検試料が目的のタンパク質を含んでいるか否かについて、多数の被検試料を同時に検査することができる。
　本発明者らは以前に、液滴に変動電界を印加して高速に振動させることにより、液滴の撹拌を行うことができる「電界撹拌」を用いることによって、抗原抗体反応、ハイブリダイゼーション、発色反応等を促進する方法を開発した（特許文献１）。
　さらに、本発明者らは、電界撹拌に適した複数の微小容量容器を有するマイクロプレートに関する発明を開発した。この発明は、従来の微小容量容器の構造では、液滴の分子が微小容量容器の側壁に引き付けられてメニスカスになってしまう割合が大きく、ドーム形状の液滴を形成することができないという欠点を克服するため、微小容量容器内の液滴が側壁と接することがないように底面に台座を設けたものであり、液滴を台座の高さを超えるまで注ぎ入れて、ドーム状の液滴を形成することにより、液滴に変動電界を印加して電界撹拌を行うことを可能としている。（特許文献２）
　本発明者らは、電界撹拌を用いて免疫染色（免疫組織化学：ＩＨＣ）を短時間で行う迅速免疫染色法を開発している。この迅速免疫染色法は、検出目的となるタンパク質を発現している組織に、抗体を含む液滴を滴下して微小液滴を形成し、変動電界を印加することより微小液滴を振動させて撹拌し、抗原抗体反応を促進して短時間で免疫染色を行うことを可能とする方法である（特許文献３、非特許文献１）。
　さらに、本発明者らは、電界撹拌を用いた迅速免疫染色法を自動で行う装置を開発している（特許文献４）。
　本発明者らは、また、電界撹拌を用いて洗浄を行う方法（特許文献５）、電界撹拌用電極（特許文献６）、電界撹拌に用いる液滴形成用シャーレ（特許文献７）を開発している。
特開２０１０－１１９３８８号公報 特許第５８３９５２６号公報 特開２０１２－０１３５９８号公報 特許第５６９６３００号公報 特開２０１４－１６００６１号公報 特許第５８２５６１８号公報 特許第５８５７３０９号公報
戸田洋、外９名、アクタ・ヒストケミカ・エト・サイトケミカ（Acta Histochemica et Cytochemica、略号Acta Cytochem. Cytochem.）、日本組織細胞化学会、２０１１年６月３日発行、４４巻、３号、ｐ．１３３－１３９
　マイクロプレートは繰り返し使用せずに使い捨てにするもので、プラスチック製の金型を用いた射出成形による大量生産が基本である。この成形時に起因する多様な応力等が原因となりマイクロプレートの形状に歪みが存在することが知られている。電界撹拌を適用せずにマイクロプレートで反応を行う場合は、この歪みは反応に影響ないが、複数の微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うためには、マイクロプレートの歪みを無くす必要があることが明らかとなった。
　そこで、本発明は、マイクロプレートの歪みを無くし、複数の微小容量容器内の溶液に対して均一な変動電界を加えて、同一条件の電界撹拌を行うことを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究をした結果、電界撹拌用の電極として上部電極と下部電極を用い、下部電極の上部にマイクロプレートを載置し、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付ける構造を有する反応デバイスとすることにより、マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の微小容量容器内の溶液に対して、それぞれ同一条件下の電界撹拌を行うことができることを見出した。
　すなわち、本発明は、反応デバイスに関する下記の第１の発明と、電界撹拌装置に関する下記の第２の発明と、検出方法に関する下記の第３の発明を提供する。
（１）　第１の発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートと、前記微小容量容器内の溶液に変動電界を印加するために用いる電界撹拌用電極とを含む反応デバイスに関するものであり、
　前記電界撹拌用電極は上部電極と下部電極とを有しており、前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有することにより、
　前記マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の前記溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことを特徴とする。
（２）　第１の発明の反応デバイスにおいては、前記微小容量容器は、底面と、前記底面の外周に位置する側壁とを有しており、
　前記側壁よりも内周側の前記底面上に、囲み枠を有しており、
　前記囲み枠の内周側に存在する前記底面は、吸光度の測定のため平面形状であることが好ましい。
（３）　前記（２）の反応デバイスにおいては、前記囲み枠の高さと、前記囲み枠の内周側に存在する底面の径との比が、１：２～１：２０であり、
　前記底面と前記囲み枠とで形成される容器の容量が、１０～３００μｌであることが好ましい。
（４）　前記（２）又は（３）の反応デバイスにおいては、前記上部電極は、前記マイクロプレートの各微小容量容器の位置に対応する、複数の凸部を有しており、
　前記複数の凸部が、前記側壁の内周側に挿入できる形状であることが好ましい。
（５）　前記（４）の反応デバイスにおいては、前記凸部が円柱形状であり、前記側壁の内周側が円筒形状であることが好ましい。
（６）　第２の発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートに変動電界を印加する電界撹拌装置に関するものであり、
　上部電極及び下部電極と、
　前記上部電極及び／又は下部電極に変動電圧を供給する電源装置と、
　前記微小容量容器内の溶液の吸光度を測定する吸光光度計と
を有し、
　前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有することにより、前記マイクロプレートの形状歪みを抑制することで、前記微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行い、
　前記微小容量容器内の溶液の吸光度を測定することにより、
複数の被検試料について同時に検査を行うことができることを特徴とする。
（７）　第２の発明の電界撹拌装置においては、前記微小容量容器内への被検試料又は試薬の分注、前記微小容量容器内の溶液への変動電界の印加、前記微小容量容器内の洗浄、及び前記微小容量容器内の溶液の吸光度の測定を自動で行う機構を有することが好ましい。
（８）　第３の発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートの各微小容量容器内に、被検試料と試薬を分注し、変動電界を印加することにより前記被検試料と前記試薬との反応を促進し、前記被検試料内の目的物質を検出する検出方法に関するものであり、
　変動電界を印加するための電極として、上部電極と下部電極を使用し、
　前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることにより、
　前記マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の前記微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことを特徴とする。
（９）　第３の発明の検出方法においては、
　前記マイクロプレートとして、
　前記微小容量容器内に、底面と、前記底面の外周に位置する側壁とを有しており、
　前記側壁よりも内周側の前記底面上に、囲み枠を有しており、
　前記囲み枠の内周側に存在する前記底面が、平面形状である
マイクロプレートを使用することにより、
　前記底面と前記囲み枠とにより形成される容器の中の溶液について、位置による深さのバラツキを小さくし、
　前記溶液の深さ方向に測定光を透過させて、前記溶液の吸光度を測定することが好ましい。
　本発明によれば、下部電極の上部に載置したマイクロプレートを、上部電極によって上部から押さえ付けることにより、マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことができるため、反応のバラツキを少なくして、複数の被検試料の検査を精度良く行うことができるという効果を奏する。
本発明の反応デバイスの一つの実施形態を模式的に示す図面である。図１（Ａ）は、下部電極の上部にマイクロプレートを載置した状態を示す断面図であり、図１（Ｂ）は、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けた状態を示す断面図である。 本発明で使用するマイクロプレートの微小容量容器の構造について、２つの実施形態を模式的に示す図面である。図２（Ａ）は、底面と、側壁と、囲み枠とを有し、底面を平面形状とした微小容量容器の構造を示す断面図であり、図２（Ｂ）は、特許文献２の図１（Ａ）に記載された底面が湾曲形状の微小容量容器の断面図である。 図２（Ａ）に示される微小容量容器を縦横に複数有するマイクロプレートを模式的に示す図面である。図３（Ａ）は、マイクロプレートの断面図を示し、図３（Ｂ）は、マイクロプレートの平面図を示す。 変動電界の印加により溶液の液滴が振動する様子を模式的に示す図面である。図４（Ａ）は、上部電極に供給される正の電圧が最も大きくなった状態を示し、図４（Ｂ）は、上部電極に供給される正の電圧が最も小さくなった状態を示す。 実施例１で作製したマイクロプレートと上部電極の設計図である。図５（Ａ）は、マイクロプレートの微小容量容器の断面の設計図を示し、図５（Ｂ）は、上部電極の断面の設計図を示し、図５（Ｃ）は、上部電極の平面の設計図を示す。 実施例２の実験結果を示すグラフである。図６（Ａ）は、マイクロプレートを上部電極によって押さえ付けることで、マイクロプレートの形状歪みを抑制した状態でＥＬＩＳＡを行った場合の結果を示し、図６（Ｂ）は、マイクロプレートを上部電極によって押さえ付けない場合の結果を示す。
１．　反応デバイス
１－１．　電界撹拌用電極の構造
　本発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートと、複数の微小容量容器内の溶液に変動電界を印加するために用いる電界撹拌用電極とを含む反応デバイスに関するものである。
　本発明の反応デバイスの電界撹拌用電極は、上部電極と下部電極とを有しており、これらの電極が対電極となっている。電源装置を用いて上部電極と下部電極の間に変動電界を発生させることで、微小容量容器内の溶液に変動電界を印加して、溶液の液滴を高速に振動させることで撹拌を行うことが可能である。
　本発明の反応デバイスは、下部電極の上部にマイクロプレートを載置し、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有している。
　このような構造を有することにより、本発明の反応デバイスは、マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の微小容量容器内の溶液に対して、それぞれ同一条件の電界撹拌を行うことができる。
　下部電極の形状は、上部にマイクロプレートを載置することができるものであれば、どのような形状であってもよいが、マイクロプレートを安定に載置するためには、マイクロプレートの形状に対応した形状とすることが好ましい。マイクロプレートは、通常、底面が同一平面上にあるため、下部電極の形状は、平面形状の平板電極とすることが好ましい。
　マイクロプレートの微小容量容器内に強い電界を印加するためには、下部電極の表面に直接マイクロプレートを載置することが好ましいが、感電や電極への溶液の付着を防止するために、下部電極とマイクロプレートとの間に絶縁性のシートや板を設けてもよい。
　本発明の反応デバイスにおいては、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けるために、下部電極と上部電極とを相対的に移動可能な構造とすることが好ましい。例えば、これらに限定されるわけではないが、上部電極のみを上下に移動することができる構造とすることができ、下部電極のみを上下に移動することができる構造とすることができ、あるいは、上部電極と下部電極とがそれぞれ上下に移動することができる構造とすることができる。また、上部電極を上下左右に自在に移動できる構造とすることもできる。
　マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付ける際には、マイクロプレートの微小容量容器内に強い電界を印加できるように、上部電極を直接マイクロプレートに接触させて押さえ付けることが好ましい。しかしながら、上部電極に溶液が付着することを防止するため、マイクロプレートをカバー部材（マイクロプレート蓋）で覆った上で、カバー部材を介してマイクロプレートを上部電極により押さえ付けてもよい。
　上部電極及び／又は下部電極の形状は、微小容量容器の位置に対応する複数の凸部を有する形状とすることが好ましい。電極の凸部においては、電気力線が集中して、溶液に対して強い電界を印加することができる。
　一方の電極に変動電圧を供給し、他方の電極をアース電位とする場合には、変動電圧を印加する電極のみに凸部を設け、他方の電極は平面形状の平板電極とすることが好ましい。尚、一方の電極に変動電圧を供給する場合においても、上部電極及び下部電極の両方の電極に変動電圧を供給する場合においても、両方の電極に凸部を設ける形態は有り得る。
　上部電極に複数の凸部を設ける場合には、この凸部を微小容量容器の側壁に挿入することができる形状とすることが好ましい。これにより、上部電極の凸部を微小容量容器内の溶液に近づけて、さらに強い電界を溶液に印加することが可能となり、また、微小容量容器に対する凸部の位置を正確に合わせることができ、溶液に対して上下方向の変動電界を印加して、好適に撹拌することが可能となる。
　以下、本発明の反応デバイスの一つの実施形態を図１に模式的に示す。
　図１（Ａ）は、下部電極の上部にマイクロプレートを載置した状態を示す断面図であり、図１（Ｂ）は、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けた状態を示す断面図である。
　図１（Ａ）に示されるように、マイクロプレート１は、複数の微小容量容器２ａ，２ｂ，２ｃを有している。それぞれの微小容量容器は、底面３ａ，３ｂ，３ｃと、側壁４ａ，４ｂ，４ｃと、囲み枠５ａ，５ｂ，５ｃとを有している。底面はそれぞれ円形であり、側壁はそれぞれ円筒形状であり、囲み枠はそれぞれリング形状となっている。底面３ａ，３ｂ，３ｃと囲み枠５ａ，５ｂ，５ｃとが形成する容器内に、溶液の液滴６ａ，６ｂ，６ｃを形成することができる。
　マイクロプレート１は、プラスチック製のため、形状歪みは成形時に加わる応力によって少なからず存在するものであるため、平板状の下部電極７の上部にマイクロプレート１を載置した場合でも、歪みが生じてしまう。図１（Ａ）の例では、微小容量容器２ｂにおいて、底面３ｂは下部電極７から僅かに浮いた状態となっており、微小容量容器２ａ，２ｃにおいて、底面３ａ，３ｃは、僅かに傾いた状態となっている。このような歪みが生じた状態で、微小容量容器内の溶液６ａ，６ｂ，６ｃに対して変動電界を印加すると、それぞれ傾きの異なる液滴に対して変動電界を印加することとなり均一な撹拌性が維持できなくなる。液滴の僅かな傾きによっても、微小液滴のため、振動挙動が大きく異なり、同一条件の電界撹拌を行うことが難しくなる。歪みが生じた状態で電界撹拌を行った場合に、反応結果にバラツキが生じてしまうことは、後記実施例２の比較例の実験からも明らかである。
　そこで、図１（Ｂ）に示すように、マイクロプレート１を上部電極８によって上部から押さえ付けることにより、マイクロプレート１の形状歪みを抑制することができる。
　上部電極８は、上下に駆動することができ、上部電極８を下方向に移動させることによって、マイクロプレート１を上部から押さえ付けることができる。
　上部電極８は、微小容量容器２ａ，２ｂ，２ｃに対応する位置に、凸部９ａ，９ｂ，９ｃを有している。上部電極の凸部には電気力線が集中するため、凸部９ａ，９ｂ，９ｃと下部電極７とに挟まれた領域に、強い電界が発生することとなり、溶液６ａ，６ｂ，６ｃに強い電界を印加することができる。
　上部電極の凸部９ａ，９ｂ，９ｃは、円柱形状であり、円筒形状である側壁４ａ，４ｂ，４ｃの内周側に挿入できる形状となっている。
　これにより、凸部９ａ，９ｂ，９ｃを溶液６ａ，６ｂ，６ｃに近づけることができ、さらに強い電界を溶液に印加することができる。
　また、上部電極の凸部を側壁の内周側に挿入することにより、凸部９ａ，９ｂ，９ｃと溶液６ａ，６ｂ，６ｃとの正確な位置合わせが可能となる。これにより、溶液に対して上下方向の変動電界を印加し、溶液の液滴を上下方向に振動させて、電界撹拌を好適に行うことが可能となる。凸部と溶液の位置合わせが正確でないと、溶液に対して斜め方向の変動電界が印加されてしまい、電界撹拌を効率的に行うことが難しくなる。
　凸部９ａ，９ｂ，９ｃの直径は、側壁４ａ，４ｂ，４ｃの内径よりも小さくし、両者の間に僅かな隙間を設けることが好ましい。これにより、凸部によって側壁に強い力が加わることを防ぎ、マイクロプレートの歪みや破損を防止することができる。
１－２．　マイクロプレートの構造
　本発明において、マイクロプレートとは、複数の微小容量容器を有しており、その容器内で溶液の反応、混合、撹拌等を行うものであれば、どのようなものであってもよい。
　マイクロプレートの微小容量容器の容量は、通常、１個あたり０．１～２０００μｌである。マイクロプレートは、通常、微小容量容器を２～１００００個有することができる。微小容量容器（ウェル）の数を、用途に応じて、６、１２、２４、４８、９６、３８４、１５３６等とし、これらを縦横に整列したマイクロプレートが市販されている。
　本発明で使用するマイクロプレートの微小容量容器は、市販のマイクロプレートのように、底面と、その外周に位置する側壁とを有する微小容量容器とすることができる。
　しかしながら、本発明においては、微小容量容器の側壁よりも内周側の底面上に、囲み枠を有したマイクロプレートを用いることが好ましい。
　このような囲み枠を設けることにより、溶液の分子が側壁に引きつけられてメニスカスを形成してしまうことを防ぎ、溶液を囲み枠の高さを若干越えるまで注ぎ入れることにより、中央が盛り上がった形状の液滴を形成することが可能となる。このような液滴は、変動電界を印加することにより、上下に振動させて効率良く撹拌を行うことが可能である。
　また、本発明においては、微小容量容器内の囲み枠の内周側に存在する底面が、平面形状であることが好ましい。
　囲み枠とその内周側の底面とにより溶液が収容される容器が形成されることから、その底面を平面形状とすることによって、位置による溶液の深さのバラツキを小さくすることができる。位置による溶液の深さのバラツキを小さくすることによって、吸光光度計を用いて溶液の深さ方向に測定光を透過させて溶液の濃度や発色の程度を測定する際に、測定光を透過させる位置の違いによる光が溶液を透過する距離のバラツキを小さくすることができるため、精度良く吸光度の測定を行うことができる。
　変動電界により効率良く撹拌できる液滴を形成するためには、囲み枠の高さと、囲み枠の内周側に存在する底面の径との比が、１：２～１：２０となるように、マイクロプレートを製造することが好ましい。
　ここで、吸光光度計による測定を行う場合には、溶液を透過する透過光の経路長を十分に確保するために、微小容量容器の底面と囲み枠で形成される容器の容量を１０μｌ以上とすることが好ましい。また、試薬を節約し、より多くの被検試料を同時に測定することを可能とするためには、容器の容量を３００μｌ以下とすることが好ましい。
　マイクロプレートは、通常、プラスチック成形にて製造することができる。液滴を形成することが難しい場合には、囲み枠の部分を撥水性の材料で成形することにより、液滴を形成し易くすることができる。ここで、撥水性の材料としては、これらに限定されるわけではないが、例えば、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂、オルガノポリシロキサン等のシリコン系樹脂、ポリプロピレン等のポリオレフィン等を用いることができる。
　本発明で使用するマイクロプレートの微小容量容器の構造について、２つの実施形態を図２に模式的に示す。
　図２（Ａ）は、底面と、側壁と、囲み枠とを有し、底面を平面形状とした微小容量容器の構造を示す断面図である。図２（Ｂ）は、特許文献２の図１（Ａ）に記載された底面が湾曲形状の微小容量容器の断面図である。
　図２（Ａ）に示される微小容量容器２は、底面３と、底面３の外周に設けられた側壁４とを有している。底面３は円形であり、側壁４は円筒形状となっている。
　微小容量容器２の側壁４よりも内周側の底面上には、囲み枠５が設けられている。囲み枠５は、円形のリング状であり、囲み枠５と底面３とにより容器が形成されている。この容器内に溶液６を注入すると、溶液６は側壁４に接触しないため、メニスカスを形成せず、囲み枠５の高さまで溶液を注ぎ入れると、表面張力により中央が少し盛り上がった形状の液滴となる。
　図２（Ａ）に示されるとおり、囲み枠５の内周側に存在する底面は、平面形状となっている。これにより、溶液６の深さが、位置によって異なることにより生ずるバラツキを小さくすることができる。溶液６の深さのバラツキを小さくすることにより、吸光光度計を用いて溶液の深さ方向に測定光を透過させて溶液の濃度や発色の程度を測定する際に、測定光１０を透過させる位置の違いによる、光が溶液を透過する距離のバラツキを小さくすることができるため、精度良く吸光度の測定を行うことができる。
　図２（Ａ）に示されるとおり、囲み枠５の高さＡと、囲み枠５の内周側に存在する底面の径Ｂの比は、１：２～１：２０の範囲内にある。このような範囲内の比とすることにより、変動電界の印加により効率よく撹拌できる形状の液滴を形成することができる。
　また、囲み枠５は溶液を注入し過ぎた場合には、囲み枠を越えて溶液があふれ出すことができ、側壁４と囲み枠５との間には空間が設けられているため、囲み枠５からあふれた溶液を収容できるようになっている。
　図２（Ｂ）は、特許文献２（特許第５８３９５２６号公報）の図１（Ａ）に記載された底面が湾曲形状の微小容量容器の断面図であるが、本発明においては、このような形状の微小容量容器を有するマイクロプレートを使用することもできる。
　図２（Ｂ）に示されるように、微小容量容器２は、底面３とその外周に位置する側壁４とを有している。底面３は円形であり、側壁４は円筒形状となっている。
　そして、側壁４の内周側に隣接して撥水性の囲み枠（台座）５が設けられている。囲み枠（台座）５は、円形のリング状であり、囲み枠５と底面３とにより容器が形成されている。この容器内に溶液６を注入すると、溶液６は側壁４に接触しないため、メニスカスを形成しない。囲み枠（台座）は撥水性であるため、囲み枠５の高さを大きく越えて溶液を注ぎ入れることができ、表面張力により中央が大きく盛り上がったドーム形状の液滴となる。
　図２（Ｂ）に示される微小容量容器では、中央が大きく盛り上がったドーム形状の液滴を形成できる上に、底面３が、平面形状ではなく、湾曲形状となっているため、溶液６が中央部ほど深くなる度合いが顕著である。このため、吸光光度計を用いて溶液の濃度や発色の程度を測定する際に、測定光１０を透過させる位置の違いにより、光が溶液を透過する距離のバラツキが大きくなり、吸光度の測定の精度が図２（Ａ）の場合と比較して低くなる。
　図２（Ａ）に示される微小容量容器を縦横に複数有するマイクロプレートを図３に模式的に示す。
　図３（Ａ）は、マイクロプレートの断面図を示し、図３（Ｂ）は、マイクロプレートの平面図を示す。
　図３（Ａ）の断面図に示されるように、マイクロプレート１は、横方向に５個の微小容量容器２を有している。それぞれの微小容量容器２は、底面３と、底面の外周に位置する側壁４を有しており、側壁４よりも内周側の底面上に囲み枠５を有している。底面３は円形であり、側壁４は円筒形状である。底面３と囲み枠５とで形成される容器内に溶液６が収容されている。
　図３（Ｂ）の平面図に示されるように、マイクロプレート１は、縦方向にも３個の微小容量容器２を有している。したがって、マイクロプレートは、５×３＝１５個の微小容量容器を有している。囲み枠５は、円形のリング形状であり、溶液６は円形となっている。
２．　電界撹拌装置
　本発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートに変動電界を印加する電界撹拌装置を提供する。
　本発明の電界撹拌装置は、
ｉ）上部電極及び下部電極と、
ii）上部電極及び／又は下部電極に変動電圧を供給する電源装置と、
iii）微小容量容器内の溶液の吸光度を測定する吸光光度計と
を有している。
　本発明の電界撹拌装置における上部電極と下部電極は、下部電極の上部にマイクロプレートを載置し、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有する。
　このような上部電極と下部電極の構造は、前記１－１．において詳述したとおりである。
　本発明の電界撹拌装置は、下部電極の上部に載置したマイクロプレートを、上部電極によって上部から押さえ付けることにより、マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことができるため、反応のバラツキを少なくして、複数の被検試料の検査を精度良く行うことができる。
　本発明の電界撹拌装置で使用する電源装置は、上部電極と下部電極の両方、又は上部電極と下部電極のどちらか一方に、変動電圧を供給する装置である。
　上部電極と下部電極のどちらか一方に変動電圧を供給する場合には、他方の電極はアース電位とすることができる。
　上部電極に変動電圧を供給する場合には、例えば、これらに限定されるわけではないが、電源装置として、高圧アンプとファンクションジェネレータを用い、ファクションジェネレータから周期的に変化する波形の信号を高圧アンプに供給して、高圧アンプから上部電極に対して周期的に変化する電圧を供給することができる。また、高電圧発生装置として、これらのそれぞれの機能を一台にまとめて装置化し、周期的に変化する電圧を供給することもできる。
　上下の電極と電源装置により発生させる電界は、溶液の液滴を振動させるものであればどのような電圧、周期、波形の条件であってもよい。変動電界の大きさは、液滴の大きさにより異なるが、十分に撹拌効果を生じさせるためには、３５０～３５００Ｖ／ｍｍとするのが好ましく、より好ましくは、７００～２５００Ｖ／ｍｍとするのがよい。このような電界強度となるように、電極間距離に応じて計算した電圧を、上下の電極間に印加する。また、印加する変動電界を発生させるための信号は、０．１～８００Ｈｚとするのが好ましい。印加する変動電界を発生させるための信号は、方形波、正弦波、三角波、ノコギリ波などを使用することができるが、撹拌効果を高めるためには、瞬間的な変化の大きい方形波を用いることが好ましい。変動電界を発生させるための信号は、プラスに偏った波形を用いることもできるが、プラスとマイナスの間を反転する波形又はマイナスに偏った波形を用いることもできる。
　図４は、変動電界の印加により溶液の液滴が振動する様子を示す模式図である。
　図４（Ａ）は、上部電極に供給される正の電圧が最も大きくなった状態を示し、図４（Ｂ）は、上部電極に供給される正の電圧が最も小さくなった状態を示す。
　図４（Ａ）に示されるように、上部電極８には高圧アンプ１１から正の電圧が供給される。ここで、高圧アンプ１１には、ファンクションジェネレータ１２からプラス側に偏って周期的に変化する波形の信号が供給されることにより、高圧アンプ１１から上部電極８に対して、電圧が周期的に変化する正の電圧が供給される。
　図４（Ａ）は、上部電極８に供給される正の電圧が最も大きくなった状態を示しており、上部電極８に蓄積するプラス電荷１３の量は、この時点で最大となる。そして、上部電極８に蓄積したプラス電荷１３により、溶液の液滴６の表面のマイナス電荷１４が強く引きつけられて、液滴６は中央が盛り上がった形状となる。
　図４（Ｂ）は、上部電極８に供給される正の電圧が最も小さくなった状態を示しており、上部電極８に蓄積したプラス電荷１３の量は、この時点で最小となる。そして、上部電極８に蓄積したプラス電荷１３の量が少ないため、液滴６を引きつける上向きの力が極めて弱くなり、液滴６は自重により下方向に落ちて平たい形状となる。
　上部電極８に供給される正の電圧は周期的に変化して、図４（Ａ）の状態と図４（Ｂ）の状態の間を周期的に往復する。図４（Ｂ）に示されるように、液滴６は、自重により下方向に落ちるが、底面３での反作用によりバウンドして、電界の変化にあわせて図４（Ａ）の状態にすみやかに戻ることができる。このため、液滴６は、変動電界の周期に従って振動することとなり、液滴内部が撹拌される。液滴の振幅は小さいが、液滴の振動速度（周波数）は大きいため、液滴を効率良く撹拌することができる。
　本発明の電界撹拌装置で使用する吸光光度計は、試料溶液の中を特定の波長の測定光を透過させて、溶液を通過した光の量を測定することで、溶液により吸収された光の量を計測する機器である。
　本発明の電界撹拌装置では、被検試料と試薬を反応させた後、反応の程度に応じて増大する発色の程度や濃度を、吸光光度計で測定することができ、これにより、被検試料中の特定の物質の検出すること（測定を含む）や、目的の機能を有する物質のスクリーニングを行うこと等が可能となる。
　本発明の電界撹拌装置においては、微小容量容器内への被検試料又は試薬の分注、微小容量容器内への変動電界の印加、微小容量容器内の洗浄、及び微小容量容器内の溶液の吸光度の測定を自動で行う機構を有することが好ましい。
　このような機構を有することにより、多数の被検試料についての試験を人手によらずに迅速に行うことができ、また、ＥＬＩＳＡのような多段階の反応を必要とする試験であっても、試薬の分注と洗浄を繰り返すことにより、人手によらずに迅速に行うことが可能となる。本発明の電界撹拌装置は、電界撹拌により反応や洗浄の時間を短縮することが可能であるため、自動化との相乗効果により、極めて迅速に多数の被検試料について試験を行うことが可能であり、吸光度の測定によって、検出結果まで自動で得ることが可能である。
３．　検出方法
　本発明は、複数の微小容量容器を有するマイクロプレートの各微小容量容器内に、被検試料と試薬を分注し、変動電界を印加することにより被検試料と試薬との反応を促進し、被検試料内の目的物質を検出する検出方法を提供する。
　本発明の検出方法においては、変動電界を印加するための電極として、上部電極と下部電極を使用する。そして、下部電極の上部にマイクロプレートを載置し、マイクロプレートを上部電極によって上部から押さえ付けることにより、マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことができるため、反応のバラツキを少なくして、複数の被検試料の検査を精度良く行うことができる。
　本発明の検出方法においては、マイクロプレートとして、次の構造を有するマイクロプレートを使用することが好ましい。
ｉ）　微小容量容器内に、底面と、底面の外周に位置する側壁とを有している。
ii）　側壁よりも内周側の底面上に、囲み枠を有している。
iii）　囲み枠の内周側に存在する底面が、平面形状である。
　このような構造を有するマイクロプレートの一例は、図２（Ａ）に示されるとおりであり、前記１－２．で詳述したように、前記ｉ）及びii）の構造により、中央が盛り上がった形状の液滴を形成できることから、変動電界を印加することにより、上下に振動させて効率良く撹拌を行うことが可能である。また、前記iii）の構造により、位置による溶液の深さのバラツキを小さくすることができる。位置による溶液の深さのバラツキを小さくすることによって、吸光光度計を用いて溶液の深さ方向に測定光を透過させて溶液の濃度や発色の程度を測定する際に、測定光を透過させる位置の違いによる、光が溶液を透過する距離のバラツキを小さくすることができるため、精度良く吸光度の測定を行うことができる。
　本発明の検出方法においては、これらに限定されるわけではないが、例えば、抗原となるタンパク質と抗体を反応させるＥＬＩＳＡ等の抗原抗体反応や、核酸とそれに相補的な核酸プローブを反応させるハイブリダイゼーションや、特定の多糖類又は脂質とそれに親和性のある色素や毒素を結合させる反応等を行うことにより、被検試料内の目的となるタンパク質、核酸、多糖類、脂質等の物質を検出することができる。これらの反応において電界撹拌を行うことにより、反応を促進することができきるため、反応時間を短縮することができ、また、反応に使用する抗体等の試薬の濃度を低くしても、十分な検出感度を得ることができる。
　本発明において、「検出」とは、目的となる物質が存在するか否かを判別することのみならず、目的となる物質の量を測定することも含む。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（電極及びマイクロプレートの作製）
　図２（Ａ）と同一の構造の微小容量容器を８個有するマイクロプレートを作製した。微小容量容器は、底面と側壁とにより、内寸直径７．５ｍｍ、内寸高４．０ｍｍの空間を有するものである。そして、底面上に、内寸直径４．０ｍｍ、高さ０．８ｍｍの囲み枠を設けた。微小容量容器の断面の設計図を図５（Ａ）に示す。
　また、上記の微小容量容器の側壁の内周側に挿入出来る凸部を８個有する上部電極を製造した。各凸部は、直径６．０ｍｍ、高さ０．５ｍｍである。上部電極の断面の設計図を図５（Ｂ）に、平面の設計図を図５（Ｃ）に示す。
　作製したマイクロプレートは、平面上に載置しても歪みが生じるものであったが、作製した上部電極で上部から押さえ付けることにより、形状歪みを抑制することが出来た。
（ＥＬＩＳＡ実験）
　実施例１で作製したマイクロプレートと上部電極、そして、平板状の下部電極を用い、抗原抗体反応と発色反応において電界撹拌を行うことにより、ＥＬＩＳＡを行った。下部電極の上にマイクロプレートを載置し、その上部から上部電極によって押さえ付けることで、マイクロプレートの形状歪みを抑制した状態でＥＬＩＳＡを行った。
　ＥＬＩＳＡは、セルスペクトル株式会社製のトラスツズマブＥＬＩＳＡキット（商品名：クオンテスト）を使用し、次のプロトコールに従って行った。
１）既知濃度のトラスツズマブを含有する被検試料（１２μｌ）をマイクロプレートに注入して、被検試料中のトラスツズマブを、微小容量容器内の底面に固相化された１次抗体へ反応させた。
２）被検試料を取り除き、洗浄液で微小容量容器内を洗浄した。
３）トラスツズマブに結合する２次抗体（標識酵素結合）の溶液（１２μｌ）を微小容量容器内に注入して、２次抗体反応を行った。
４）２次抗体溶液を取り除き、洗浄液で微小容量容器内を洗浄した。
５）標識酵素の発色基質の溶液（１０μｌ）を微小容量容器内に注入して、発色反応を行った。
６）反応停止剤の溶液（５μｌ）を微小容量容器内に注入して、発色反応を停止し、波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定を行った。
　上記のプロトコールに従い、電界撹拌を行わないＥＬＩＳＡ（従来法）と、１次抗体反応、２次抗体反応、及び発色反応で電界撹拌を行うＥＬＩＳＡ（電界撹拌法）を行った。電界撹拌は、４ｋＶ、４０Ｈｚの変動電圧を上下の電極間に印加することにより行った。
　トラスツズマブＥＬＩＳＡキットの通常のプロトコールでは、１次抗体反応と２次抗体反応の時間は、どちらも１時間であり、発色反応の時間は３０分であるが、今回の実験では、１次抗体反応と２次抗体反応の時間をどちらも１０分間とし、発色反応の時間を１０分間とする、短時間での反応とした。
　従来法と電界撹拌法において、被検試料中のトラスツズマブの濃度が０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌである被検試料を用いて、それぞれ試験を行った。その結果を図６（Ａ）のグラフに示す。図６（Ａ）において、横軸は、被検試料中のトラスツズマブの濃度を示し、縦軸は、吸光度を測定した結果を示す。
　図６（Ａ）のグラフに示されるとおり、従来法では、トラスツズマブＥＬＩＳＡキットの通常のプロトコールよりも短い時間で反応を行っているため、十分な発色ができず、吸光度の値は低いものであった。一方、電界撹拌法では、１次抗体反応、２次抗体反応、及び発色反応を電界撹拌により促進したため、反応時間が短いにもかかわらず、十分な発色が得られた。測定された吸光度の値は、トラスツズマブの濃度に比例したものであり、検量線を引くことができた。
（比較例）
　次に、比較例として、マイクロプレートを上部電極によって押さえ付けず、マイクロプレートとの間に僅かな隙間を設けて上部電極を設置し、それ以外の条件は、前記と同じ条件としてＥＬＩＳＡを行った。その結果を、図６（Ｂ）のグラフに示す。図６（Ｂ）において、横軸は、被検試料中のトラスツズマブの濃度を示し、縦軸は、吸光度を測定した結果を示す。
　図６（Ｂ）のグラフに示されるように、電界撹拌法では、十分な発色が得られたものの、測定された吸光度の値は、トラスツズマブの濃度に比例したものではなく、検量線を引くことができなかった。これは、マイクロプレートの歪みにより、各微小容量容器における電界撹拌の条件が同一とはならず、反応にバラツキが生じたためであると考えられた。
１　　　　マイクロプレート
２　　　　微小容量容器
３　　　　底面
４　　　　側壁
５　　　　囲み枠
６　　　　溶液、液滴
７　　　　下部電極
８　　　　上部電極
９　　　　凸部
１０　　　測定光
１１　　　高圧アンプ
１２　　　ファンクションジェネレータ
１３　　　プラス電荷
１４　　　マイナス電荷
Ａ　　　　囲み枠の高さ
Ｂ　　　　囲み枠の内周側に存在する底面の径

Claims (9)

  1. 　複数の微小容量容器を有するマイクロプレートと、前記微小容量容器内の溶液に変動電界を印加するために用いる電界撹拌用電極とを含む反応デバイスにおいて、
    　前記電界撹拌用電極は上部電極と下部電極とを有しており、前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有することにより、
    　前記マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の前記溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことを特徴とする反応デバイス。
  2. 　前記微小容量容器は、底面と、前記底面の外周に位置する側壁とを有しており、
    　前記側壁よりも内周側の前記底面上に、囲み枠を有しており、
    　前記囲み枠の内周側に存在する前記底面は、平面形状であることを特徴とする、請求項１に記載の反応デバイス。
  3. 　前記囲み枠の高さと、前記囲み枠の内周側に存在する底面の径との比が、１：２～１：２０であり、
    　前記底面と前記囲み枠とで形成される容器の容量が、１０～３００μｌであることを特徴とする、請求項２に記載の反応デバイス。
  4. 　前記上部電極は、前記マイクロプレートの各微小容量容器の位置に対応する、複数の凸部を有しており、
    　前記複数の凸部が、前記側壁の内周側に挿入できる形状であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の反応デバイス。
  5. 　前記凸部が円柱形状であり、前記側壁の内周側が円筒形状であることを特徴とする、請求項４に記載の反応デバイス。
  6. 　複数の微小容量容器を有するマイクロプレートに変動電界を印加する電界撹拌装置であって、
    　上部電極及び下部電極と、
    　前記上部電極及び／又は下部電極に変動電圧を供給する電源装置と、
    　前記微小容量容器内の溶液の吸光度を測定する吸光光度計と
    を有し、
    　前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることができる構造を有することにより、
    　前記マイクロプレートの形状歪みを抑制することで、前記微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行い、
    　前記微小容量容器内の溶液の吸光度を測定することにより、
    複数の被検試料について同時に検査を行うことができる電界撹拌装置。
  7. 　前記微小容量容器内への被検試料又は試薬の分注、前記微小容量容器内の溶液への変動電界の印加、前記微小容量容器内の洗浄、及び前記微小容量容器内の溶液の吸光度の測定を自動で行う機構を有する、請求項６に記載の電界撹拌装置。
  8. 　複数の微小容量容器を有するマイクロプレートの各微小容量容器内に、被検試料と試薬を分注し、変動電界を印加することにより前記被検試料と前記試薬との反応を促進し、前記被検試料内の目的物質を検出する検出方法において、
    　変動電界を印加するための電極として、上部電極と下部電極を使用し、
    　前記下部電極の上部に前記マイクロプレートを載置し、前記マイクロプレートを前記上部電極によって上部から押さえ付けることにより、
    　前記マイクロプレートの形状歪みを抑制し、複数の前記微小容量容器内の溶液に対して同一条件の電界撹拌を行うことを特徴とする、検出方法。
  9. 　前記マイクロプレートとして、
    　前記微小容量容器内に、底面と、前記底面の外周に位置する側壁とを有しており、
    　前記側壁よりも内周側の前記底面上に、囲み枠を有しており、
    　前記囲み枠の内周側に存在する前記底面が、平面形状である
    マイクロプレートを使用することにより、
    　前記底面と前記囲み枠とにより形成される容器の中の溶液について、位置による深さのバラツキを小さくし、
    　前記溶液の深さ方向に測定光を透過させて、前記溶液の吸光度を測定することを特徴とする、請求項８に記載の検出方法。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0225754A (ja) * 1988-07-15 1990-01-29 Corona Denki Kk 自動分析装置
JP2002537767A (ja) * 1999-02-15 2002-11-12 フラウンホファー ゲセルシャフトツール フェールデルンク ダー アンゲヴァンテン フォルシュンク エー．ファオ． 物質をｉｎｓｉｔｕで分割し濃縮するための方法およびプローブ担体系
JP2005345203A (ja) * 2004-06-01 2005-12-15 Nippon Sheet Glass Co Ltd 凹部アレイ基板用蓋材およびその製造方法、並びに蓋付き凹部アレイ基板
JP2006090749A (ja) * 2004-09-21 2006-04-06 Olympus Corp 温度調整装置
JP2016144780A (ja) * 2015-02-06 2016-08-12 秋田県 微小液滴を形成する反応デバイス及びこれを用いた電界撹拌方法
JP2016144422A (ja) * 2015-02-06 2016-08-12 秋田県 液滴形成用シャーレ及びそれを用いた電界撹拌方法
JP2016205850A (ja) * 2015-04-16 2016-12-08 大日本印刷株式会社 試薬入りマイクロプレートおよびその製造方法
WO2017203637A1 (ja) * 2016-05-25 2017-11-30 エイブル株式会社 反応容器体用蓋及び該反応容器体用蓋を備える反応容器体蓋セット

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5754520B2 (ja) * 2013-01-22 2015-07-29 秋田県 電界洗浄方法、電界免疫組織染色方法、電界洗浄装置及び、電界免疫組織染色装置
JP5696300B1 (ja) * 2014-02-20 2015-04-08 秋田県 自動電界免疫組織染色装置
JP2016109636A (ja) * 2014-12-10 2016-06-20 秋田エプソン株式会社 電界撹拌装置、抗原抗体反応装置、抗原抗体反応方法
JP5825618B1 (ja) * 2015-02-06 2015-12-02 秋田県 電界撹拌用電極及びこれを用いた電界撹拌方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0225754A (ja) * 1988-07-15 1990-01-29 Corona Denki Kk 自動分析装置
JP2002537767A (ja) * 1999-02-15 2002-11-12 フラウンホファー ゲセルシャフトツール フェールデルンク ダー アンゲヴァンテン フォルシュンク エー．ファオ． 物質をｉｎｓｉｔｕで分割し濃縮するための方法およびプローブ担体系
JP2005345203A (ja) * 2004-06-01 2005-12-15 Nippon Sheet Glass Co Ltd 凹部アレイ基板用蓋材およびその製造方法、並びに蓋付き凹部アレイ基板
JP2006090749A (ja) * 2004-09-21 2006-04-06 Olympus Corp 温度調整装置
JP2016144780A (ja) * 2015-02-06 2016-08-12 秋田県 微小液滴を形成する反応デバイス及びこれを用いた電界撹拌方法
JP2016144422A (ja) * 2015-02-06 2016-08-12 秋田県 液滴形成用シャーレ及びそれを用いた電界撹拌方法
JP2016205850A (ja) * 2015-04-16 2016-12-08 大日本印刷株式会社 試薬入りマイクロプレートおよびその製造方法
WO2017203637A1 (ja) * 2016-05-25 2017-11-30 エイブル株式会社 反応容器体用蓋及び該反応容器体用蓋を備える反応容器体蓋セット

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