CN1189076C - 一种筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，是将人肝细胞移植入小鼠体内，建立小鼠丙型肝炎自然感染模型，并通过以下四个步骤来筛选抗丙型肝炎病毒药物：(1)建立免疫耐受小鼠模型；(2)建立人鼠嵌合型肝脏模型；(3)建立小鼠暴发性肝损伤模型；(4)建立丙型肝炎病毒自然感染小鼠模型。本发明的方法克服了以往在动物实验时动物均处于免疫抑制状态的缺点，从而影响药物筛选的可信性，由于本发明方法可反映正常免疫系统，因此，可以在模拟人HCV自然感染过程、研究其发病机制、病理损害等研究中应用，并可最终评价抗丙型肝炎药物的疗效。
Description
技术领域
本发明属于利用动物进行抗丙型肝炎病毒药物筛选的方法，具体涉及利用丙型肝炎病毒筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法。
背景技术
丙型肝炎在全世界广泛流行，80％以上的患者被丙型肝炎病毒(HCV)感染后可导致慢性化，且与肝癌的发生密切相关，如何有效地预防和治疗丙型肝炎是亟待解决的问题。
但是直到今天丙型肝炎的研究也还没有取得突破性进展，关键因素是缺乏理想的动物模型。除了人类之外，只有黑猩猩对丙型肝炎病毒易感。由于实验费用极其昂贵，全世界只有极少数几个实验室能进行研究。国内外学者致力于丙型肝炎小动物模型建立的研究。
丙型肝炎小动物模型研究最多、最详细的应属转基因小鼠。许多实验室先后建立了多种整合有HCV不同基因片段的转基因小鼠，包括了HCV C区、E区、NS区等各个区段的基因序列以及各区段不同组合方式，甚至HCV cDNA全长序列的转基因小鼠模型。转丙型肝炎病毒基因小鼠为免疫耐受机制的研究提供了极好的模型，但是对于研究丙型肝炎发病机制、感染了丙型肝炎后宿主肝脏等组织脏器的病理改变如何，以及治疗药物疗效的评估等方面，转基因小鼠却无能为力。首先由于小鼠不是HCV的合适宿主，HCV转入小鼠后，小鼠体内可以检测到HCV RNA复制，但没有肝脏病理损害，与人类感染HCV后的变化不同，其次，在小鼠受精卵中注入HCV基因，出生后的小鼠处于免疫耐受状态，与自然感染过程不同，因此转HCV基因动物不能反映丙型肝炎的发病机制，也不能用于筛选并评价抗HCV药物的疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，是通过将人肝细胞移植入小鼠体内，建立小鼠丙型肝炎病毒自然感染模型，克服了以往在动物实验时动物均处于免疫抑制状态的缺点，具有正常免疫系统，模型含有大量人肝细胞，可以模拟人HCV自然感染过程，研究其发病机制、病理损害，并可最终评价抗丙型肝炎药物疗效，具体通过以下四个步骤来筛选抗丙型肝炎病毒药物：
(1)建立免疫耐受小鼠模型；
(2)建立人鼠嵌合型肝脏模型；
(3)建立小鼠暴发性肝损伤模型；
(4)建立丙型肝炎病毒自然感染小鼠模型。
本发明的目的涉及到的丙型肝炎病毒自然感染小鼠模型的制备通过以下方案实现：(1)用人肝细胞免疫出生24小时内的纯系小鼠，建立仅仅对人肝细胞免疫耐受而整个免疫系统正常的小鼠-免疫耐受小鼠模型。(2)将人肝细胞经肝细胞移植法输入免疫耐受小鼠，建立人肝细胞与鼠肝细胞嵌合体小鼠-人鼠嵌合型肝脏模型；(3)注射D-半乳糖胺，建立小鼠暴发性肝损伤模型；(4)将人肝细胞经肝细胞移植法输入重建肝组织，获得含人肝细胞较多的小鼠，输血感染HCV，制备HCV自然感染的小鼠模型。
本发明的另一个目的是利用上述方法建立的动物模型进行抗丙型肝炎病毒药物的筛选。
本发明的两个显著特点是：1、用小动物模型研究HCV自然感染，小动物的正常免疫功能是必须的。本发明关键是建立仅对人肝细胞免疫耐受而整个免疫系统正常的小鼠模型，可以模拟人HCV感染的自然过程。2、在人肝细胞与鼠肝细胞嵌合体小鼠中获得尽可能多的人肝细胞，可以模拟人肝脏的病理改变，从而使该模型适用于HCV的研究，尤其是用在抗丙型肝炎病毒药物的筛选。
具体实施方式
实施例1 本发明方法：
(1)建立免疫耐受小鼠模型：新出生Balb/c小鼠出生后24小时内腹腔注射正常人肝细胞(100μl，105)，以注射生理盐水为对照(100μl)，1周后观察肝脏和血清中人白蛋白含量，脾脏重量，以及混合淋巴细胞反应，以检验免疫耐受模型是否建立。
(2)建立人鼠嵌合型肝脏模型：第4周经脾注射正常人肝细胞10μl，105，第5周观察肝脏和血清中人白蛋白含量，脾脏重量，以及混合淋巴细胞反应，以检验人鼠嵌合型肝脏模型是否建立。并于第6周切除肝外侧叶，第10周周后处死，观察新生肝叶病理切片人白蛋白免疫组化，检验移植的人肝细胞有无再生功能。
(3)建立小鼠暴发性肝损伤模型：第6周制备暴发性肝损伤模型，注射D-半乳糖胺，以肝脏病理切片和血清ALT水平，检验小鼠暴发性肝损伤模型是否建立。
(4)建立HCV自然感染小鼠模型，第7周经脾脏注射10μl，107人肝细胞，观察肝脏和血清中人白蛋白含量检验小鼠人鼠嵌合型肝脏中人肝细胞的含量。第10周尾静脉注射HCV阳性血清，感染后l周，2周，3周，4周，5周，6周，7周，8周连续观察肝脏和血清中HCV RNA和HCV抗体(IgM，IgG)水平，检验HCV自然感染小鼠模型是否建立。
实施例2 本发明方法的应用
利用实施例1的方法，可以模拟人HCV感染的自然过程，可用于丙型肝炎病毒发病机理的研究、丙型肝炎病理变化研究、丙型肝炎病程进展观察、观察丙型肝炎预后、筛选抗丙型肝炎药物、药物疗效考核等研究。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
Claims (3)
1.一种筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法，其特征是：将人肝细胞移植入小鼠体内，建立小鼠丙型肝炎自然感染模型，通过以下四个步骤来筛选抗丙型肝炎病毒药物：
(1)建立免疫耐受小鼠模型，
(2)建立人鼠嵌合型肝脏模型，
(3)建立小鼠暴发性肝损伤模型，
(4)建立HCV自然感染小鼠模型；
其中所述步骤(1)是用人肝细胞免疫出生24小时内的纯系小鼠，建立仅仅对人肝细胞免疫耐受而整个免疫系统正常的小鼠；所述步骤(2)是将人肝细胞经肝细胞移植法输入免疫耐受小鼠，建立人肝细胞与鼠肝细胞嵌合体小鼠；所述步骤(3)是注射D-半乳糖胺，建立小鼠暴发性肝损伤模型；所述步骤(4)是将人肝细胞经肝细胞移植法输入重建肝组织，获得含人肝细胞较多的小鼠，输血感染丙型肝炎病毒，观察肝脏和血清中丙型肝炎病毒RNA和丙型肝炎病毒抗体IgM和IgG水平，制备丙型肝炎病毒自然感染的小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的方法，可以通过模拟人丙型肝炎病毒感染的自然过程，在用于研究丙型肝炎的自然感染过程中的应用。
3.根据权利要求1所述的方法，在筛选抗丙型肝炎药物中的应用。
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