JP2006522806A - 細胞死及び／又はアポトーシスを誘導するための、選択されたｒｎａモチーフ - Google Patents

細胞死及び／又はアポトーシスを誘導するための、選択されたｒｎａモチーフ Download PDF

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Abstract

【解決手段】本願は、増殖細胞にアポトーシス或いは細胞死を誘導するためのdsRNA及び／又はssRNAの使用を目的とする。具体的には、低分子量或いは高分子量のdsRNA及びssRNAが、増殖細胞にアポトーシス及び／又は細胞死を誘導すること、形質転換細胞或いは腫瘍細胞の増殖を阻止すること、サイトカインTNF-αの迅速な誘導を惹き起こすこと、及び／又はTh1応答を指向するIL-12産生を誘導することが示される。

Description

本発明は一般に、細胞死或いは細胞アポトーシスを誘導するため、特に形質転換細胞に細胞死或いは細胞アポトーシスを誘導するために用いる低分子量或いは高分子量の二本鎖RNA（「dsRNA」）及び一本鎖RNA（「ssRNA」）に関する。
高分子量DNAが細胞膜に結合することは、１９７０年代、１９８０年代に数人の研究者によって報告されている。以来、種々のポリヌクレオチド鎖が、生体反応修飾物質として広範に評価されてきた。その一例は、ＩＦＮ産生の強力な誘導体であると共にマクロファージアクチベータでありＮＫ活性の誘導体でもあるpolyI:polyCである（Talmadge et al. "Immunomodulatory effects in mice of polyinosinic-polycytidylic acid complexed with poly-L:-lysine and carboxymethylcellulose". Cancer Res. 45:1058, 1985）。また、安定性を改善するため、poly-L-リシン及びカルボキシメチルセルロースと複合化したpolyI:polyCを用いて数種類の臨床試験が行われた（Talmadge, J. et al., "Immunomodulatory Effects In Mice of Polyinosinic-polycytidylic Acid Complexed With Poly-L Lysine and Carboxymethylcellulose", Cancer Res. 45: 1058, 1985）。しかしながら、サイトカインTNF-αによる毒性副作用があるため、polyI:polyCは有用な治療剤とはなり得なかった。
短鎖干渉RNA(SiRNA)が相同RNAの配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導することが、２１〜２２ヌクレオチドのRNAを用いて示されている（Elbashir et al., "RNA interference is meiated by 21-22 nucleotide RNAs". Genes Dev. 2001 Jan 15;15(2):188-200）が、これは本明細書に記載するdsRNAの非配列特異的作用とは全く異なるものである。
また、特定のDNA構造にリンパ球を活性化させる潜在能力があることも報告されている。例えば、脾臓細胞上清中のヌクレオソームタンパク−DNA複合体は、Ｂ細胞増殖とイムノグロブリン分泌を惹き起こすことが報告された（Bell, et al., "Immunogenic DNA-related factors". J. Clin. Invest. 85:1487, 1990）。また、ネーキッドDNAは免疫作用を有することが報告されている。例えば、２６０〜８００ｂｐのpoly(dG);(dC)断片はＢ細胞の分裂を促進させることが報告された（Messina, et al., "The influence of DNA structure on the in vitro stimulation of murine lymphocytes by natural and synthetic polynucleotide antigens". Cell. Immunol. 147:148, 1993）。Pisetsky et al.の報告によると、不純物を含有しない哺乳動物DNAは検出可能な免疫作用を示さないが、特定の細菌から得たDNAはＢ細胞活性化及び免疫グロブリン分泌を誘導する（Pisetsky et al., "Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA", j. Immunol. 147:1759; 1991）。更に、非メチル化シトシン−グアニン（CpG）ジヌクレオチドを含有する或る種のオリゴデオキシヌクレオチドがリンパ球を活性化させることがin vitro及びin vivoのデータで確認されている。
非コードRNAモチーフは、マイナス鎖（negative stranded）RNAウィルス又は或る種のDNAウィルスに感染した細胞から産生される。また、或る種のdsRNAは先天性免疫細胞によって認識され、Toll様受容体３に結合することが知られている（Alexopoulou et al., "Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappAB by Toll-like receptor 3", Nature 413:732-738; 2001）。更に、これらdsRNAは、先天性免疫応答と適応免疫応答の両者に影響することが判明している（Wang et al., "Noncoding RNA danger motifs bridge innate and adaptive immunity and are potent adjuvants for vaccination", J. Clin. Invest. 110:1175-84; 2002）。
本願は、生細胞においてアポトーシス及び／又は細胞死を誘導するためのdsRNA及びssRNAの使用に関する。具体的には、低分子量或いは高分子量のdsRNA及びssRNAが、増殖細胞においてアポトーシス及び／又は細胞死を誘導すること、形質転換細胞或いは腫瘍細胞の増殖を阻止すること、プロ炎症性サイトカインTNF-αを迅速に誘導すること、更にIFN-γＴ細胞の誘導及びTh1免疫応答における調節剤であるIL-12（高分子量RNA）の産生を誘導することが示される。
本発明は、抗腫瘍治療や抗白血病治療において、形質転換された腫瘍細胞や白血病細胞の増殖を阻止するのに、又はサイトカインTNF-α及び／又はIL-12を迅速に誘導するために、実際に用いることができる。また、本発明は抗微生物治療にも実用性がある。この技術を用いると、細胞トランスフェクション試薬を必要としないためin vivoの各種用途に適合性を有し、また、固形癌や白血病の治療において、アンチセンス或いはｓｉRNAで必要とされるエピトープ特異性や遺伝子特異性を要しない。アンチセンス化合物は、in vitro及びin vivoのいずれにおいてもトランスフェクション試薬を必要とする上、一般に、殆どの細胞には到達できない。一方、低分子量RNA（一本鎖及び二本鎖）は細胞膜を容易に通過するため、トランスフェクション試薬は必要ない。
開示されたdsRNAの内の或るものは、生来の細胞（innate cells）においてプロ炎症性（TNF-α）反応又はプロアポトーシス反応、或いはそれら両者を誘導する。これらは、抗原の交差提示(cross presentation)を促進すると共に、特定の免疫エフェクタをTh1応答に特異的に向かうように促進する。アポトーシス性細胞は、抗原性材料を得るための優れた原材料であり、癌や感染性疾患におけるエフェクタ細胞（Th1或いはTc1）の誘導において重要である。
低分子量RNA鎖及び高分子量RNA鎖がどのようにして細胞においてアポトーシス及び／又は細胞死を誘導するかについては完全には解明されていない。RNAモチーフは、細胞膜上のToll様受容体によって認識されているかもしれないし、その後の細胞による細胞取り込みによって認識されているかもしれない。これは、遺伝子発現のネガティブレギュレーションを仲介し、非特異的遺伝子サイレンシングを惹き起こす。低分子量RNA（ssRNA及びdsRNA）については、細胞受容体を利用せずに直接細胞内に入ると考えられている。高分子量RNA鎖（ssRNA及びdsRNA）については、細胞受容体を介して細胞内に入るため、その二次構造がその機能にとって重要な、おそらく決定的な要素であろう。
本発明は、小さな即ち低分子量のssRNA或いはdsRNAが、急速に成長している形質転換細胞にTNF-αを誘導し迅速な細胞死を誘導することを示す。更に本発明は、急速成長下にある形質転換細胞において、大きな即ち高分子量のssRNA或いはdsRNAが、ＩＦＮ−γＴ細胞及びTh1免疫応答の誘導の調節剤として知られているIL-12を誘導すると共に、低分子量ssRNAや低分子量dsRNAの場合よりも程度は少ないがTNF-αも誘導して、アポトーシスを誘導することを示す。更に、高分子量ssRNA或いはdsRNAは、アジュバントとして使用してＴ1免疫を増強させるために抗原と共に投与することができるため、ＷＯ０３／０７８５９５及びＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０１８８に記載のように抗感染性疾患用途や抗癌用途において重要である。ＷＯ０３／０７８５９５及びＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３０１８８の全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。一方、低分子量RNA（一本鎖或いは二本鎖）は、特定の場合においてのみアジュバントとして使用できる。
開示されたRNA化合物のプロアポトーシス及び／又は細胞壊死細胞効果は、一次細胞（primary cells）よりも（多くの癌細胞や腫瘍細胞において見られる）増殖能の高い細胞、即ち急速に増殖する細胞に対して特異性が高い、しかもかなりの程度で特異性が高いと考えられる。ヒトにおける治療有効量（用量）については、本発明のRNA化合物は、ヒト患者に対し局所投与又は全身投与することができ、或いは溶液やエマルジョンとして腫瘍に直接注射することもできる。投与量は、１ｎｇ／ｋｇ〜９９９ｍｇ／ｋｇとすることができる。ヒトに対する治療有効量は、１ｎｇ／ｋｇ〜１０ｎｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ〜５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ〜９９９ｎｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｍｇ〜５００μｇ／ｍｇ、５００μｇ／ｋｇ〜９９９μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇである。用途にもよるが、ヒトに対する最も好ましい用量は、１〜９９９μｇ／ｋｇであり、更に好ましくは、１〜５００μｇ／ｋｇ或いは１〜１００μｇ／ｋｇである。腫瘍（tumor mass）に直接注射する場合は、用量は１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ或いは１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇと考えられる。
本発明の各種実施形態を次に示す。
１）患者の形質転換細胞或いは非形質転換細胞にRNA鎖を投与することにより該細胞にアポトーシス或いは細胞死を誘導するための方法。
２）RNA鎖の平均サイズが1 kDa〜50 kDaである、パラグラフ１に記載の方法。
３）RNA鎖がdsRNAである、パラグラフ１に記載の方法。
４）RNA鎖がssRNAである、パラグラフ１に記載の方法。
５）dsRNAがpA:pUである、パラグラフ３に記載の方法。
６）dsRNAを、１〜９９９μｇ／ｋｇ、１〜５００μｇ／ｋｇ、１〜１００μｇ／ｋｇ、１〜５０μｇ／ｋｇ、１〜２５μｇ／ｋｇ、１〜１０μｇ／ｋｇ及び１〜５μｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与する、パラグラフ５に記載の方法。
７）dsRNAを静脈内投与し、１〜９９９μｇ／ｋｇ、１〜５００μｇ／ｋｇ、１〜１００μｇ／ｋｇ、１〜５０μｇ／ｋｇ、１〜２５μｇ／ｋｇ、１〜１０μｇ／ｋｇ及び１〜５μｇ／ｋｇからなる群から選択される用量で投与する、パラグラフ６に記載の方法。
８）患者がヒトであり、細胞が形質転換細胞であり、dsRNAがpA:pUであり、dsRNAを癌細胞に直接注射する、パラグラフ１に記載の方法。
９）ssRNAがpAである、パラグラフ４に記載の方法。
１０）患者がヒトであり、形質転換細胞が、Ｔ細胞白血病細胞、ヒト単球白血病細胞、ヒト腺癌細胞及びヒト肺繊維芽細胞からなる群から選択される、パラグラフ１に記載の方法。
１１）ssRNA或いはdsRNAを細胞にin vivoで投与することにより細胞に細胞死或いはアポトーシスを誘導する方法であって、ssRNA或いはdsRNAの平均サイズが20 kDa未満である方法。
１２）ssRNA或いはdsRNAの平均サイズが10 kDa未満である、パラグラフ１１に記載の方法。
１３）細胞が形質転換細胞である、パラグラフ１２に記載の方法。
１４）ssRNAがpAである、パラグラフ１２に記載の方法。
１５）dsRNAがpA:pUである、パラグラフ１１に記載の方法。
１６）細胞が癌細胞である、パラグラフ１２に記載の方法。
１７）RNA鎖は、増強したTNF-αサイトカイン産生を誘導する、パラグラフ１に記載の方法。
１８）RNA鎖は、増強したTNF-αサイトカイン産生を誘導する、パラグラフ１２に記載の方法。
１９）細胞死を誘導するためのRNAの使用により、増強した免疫応答を細胞に誘導する、パラグラフ１に記載の方法。
２０）RNAは、細胞にin vivoで投与され、投与形態は局所投与、全身投与及び直接注射からなる群から選択される、パラグラフ１に記載の方法。
２１）ssRNA或いはdsRNAを細胞に投与することにより細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、ssRNA或いはdsRNAのサイズが10 kDa未満である方法。
２２）RNAがssRNAであり、pAである、パラグラフ２１に記載の方法。
２３）RNAがdsRNAであり、pA:pUである、パラグラフ２１に記載の方法。
２４）細胞が形質転換細胞である、パラグラフ２１に記載の方法。
２５）誘導されたアポトーシス性細胞が、同様な生細胞に対して向上したIL-12サイトカイン産生を誘導する、パラグラフ２１に記載の方法。
２６）Th1応答が指向される、パラグラフ２１に記載の方法。
２７）RNAは、dsRNAであり、その分子量は50 kDa超であり、向上したIL-12応答を誘導する、パラグラフ１に記載の方法。
２８）形質転換細胞に細胞死或いはアポトーシスを誘導するための組成物であって、平均分子量１〜50 kDaのRNAを含有する組成物。
２９）dsRNA或いはssRNAの平均分子量が20 kDa未満である、パラグラフ２８に記載の組成物。
３０）dsRNA或いはssRNAの平均分子量が10 kDa未満である、パラグラフ２８に記載の組成物。
３１）dsRNAがpA:pUである、パラグラフ２８に記載の組成物。
３２）dsRNAが、増強したTNF-αサイトカイン産生を誘導し、これにより形質転換細胞に対しＴ1免疫応答を誘導する、パラグラフ２８に記載の組成物。
３３）患者の形質転換細胞に細胞死或いはアポトーシスを誘導するための組成物であって、オリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドが、アデニン、ウラシル、シトシン、グアニン及びイノシンからなる群から選択される少なくとも二塩基対から構成され、分子量1 kDa〜50 kDaである、組成物。
３４）オリゴヌクレオチドがssRNAである、パラグラフ３３に記載の組成物。
３５）オリゴヌクレオチドがdsRNAである、パラグラフ３３に記載の組成物。
３６）ssRNAがpAである、パラグラフ３３に記載の組成物。
３７）オリゴヌクレオチドがpA:pUである、パラグラフ３５に記載の組成物。
３８）オリゴヌクレオチドの分子量が1 kDa〜10 kDaである、パラグラフ３３に記載の組成物。
３９）オリゴヌクレオチドの分子量が1 kDa〜5 kDaである、パラグラフ３３に記載の組成物。
４０）形質転換細胞に細胞死或いはアポトーシスを誘導するための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物は、オリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドが、アデニン、ウラシル、シトシン、グアニン及びイノシンからなる群から選択される少なくとも二塩基対から構成され、分子量1 kDa〜50 kDaである、使用。
４１）オリゴヌクレオチドがssRNAである、パラグラフ４０に記載の使用。
４２）オリゴヌクレオチドがdsRNAである、パラグラフ４０に記載の使用。
４３）ssRNAがpAである、パラグラフ４０に記載の使用。
４４）オリゴヌクレオチドがpA:pUである、パラグラフ４０に記載の使用。
４５）オリゴヌクレオチドの分子量が1 kDa〜10 kDaである、パラグラフ４０に記載の使用。
４６）オリゴヌクレオチドの分子量が1 kDa〜5 kDaである、パラグラフ４０に記載の使用。
４７）形質転換細胞に細胞死或いはアポトーシスを誘導するための医薬の製造のための組成物の使用であって、該組成物が平均分子量１〜50 kDaのRNAを含む、使用。
４８）dsRNA或いはssRNAの平均分子量が20 kDa未満である、パラグラフ４７に記載の使用。
４９）dsRNA或いはssRNAの平均分子量が10 kDa未満である、パラグラフ４７に記載の使用。
５０）dsRNAがpA:pUである、パラグラフ４７に記載の使用。
５１）dsRNAが、増強したTNF-αサイトカイン産生を誘導する、パラグラフ４７に記載の使用。
５２）増強したTNF-αサイトカイン産生が、形質転換細胞にＴ1免疫を誘導する、パラグラフ５１に記載の使用。
定義：
本明細書で使用する次の用語及び文言の意味は下の通りとする。
「dsRNA」は、塩基としてアデニン、シトシン、ウラシル、グアニン及びイノシンを含み、全体が相補的であっても部分的に相補的であっても塩基が異なるヌクレオチド鎖が混合していてもよい二本鎖RNAセグメントを意味するものである；
「ssRNA」は、塩基としてアデニン、シトシン、ウラシル及びグアニンを含む一本鎖RNAセグメントを意味し、単一種類のヌクレオチドからなっていても異なるヌクレオチドが混在していてもよい；
「低分子量dsRNA又は低分子量ssRNA」は、約10 kDa以下（＜10 kMW）のRNA鎖を意味する。好ましくは、本発明の低分子量ssRNA鎖及び低分子量dsRNA鎖は２〜４０塩基対である；
「高分子量dsRNA又は高分子量ssRNA」は、約10 kDa以上、10 kDa〜50 kDa、更には50 kDa超（＞50 kMW）のRNA鎖を意味する；
「全dsRNA」は、任意のあらゆる分子量或いはオリゴマー長のdsRNAを意味する；
「APC」は、抗原提示細胞を意味する；
「細胞死」は、アポトーシス以外による細胞の死を意味する；
「アポトーシス」は、プログラムされた細胞死を意味する；
「Th1応答」は、ヘルパーＴ１応答を意味する；
「pA:pU」は、RNA鎖或いはRNAセグメントがアデニンとウラシルからなり、RNA鎖或いはRNAセグメントが相補的であるdsRNAを意味し、部分的に相補的ではないRNA鎖或いはRNAセグメントを包含する；
「-mer」−オリゴマーを意味する略称である；
「HL-1培地」−2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）、ぺニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有し、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）を添加したHL-1培地（バイオウィタッカー社(Bio Whittaker)、メリーランド州ウォーカーズビル、カタログ番号344017）である；
「＜」は「〜未満」を意味する；
「＞」は「〜より大きい」を意味する。
実施例１：高分子量合成RNAはヒト抗原提示細胞（APC）の実質的アポトーシスを誘導できた
ヒトAPC（THP-1細胞、アメリカ基準株保存機関（ATCC）、バージニア州マナサス）を、ATCC推奨の条件下で維持した：（ａ）培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；（ｂ）連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、３日毎に新鮮培地と交換し、４ヶ月経過したところで新たに培養を開始；（ｃ）温度：３７℃（５％ＣＯ2）。
上述の培地にTHP-1細胞を懸濁させ、０.０５μＭ ビタミンＤ３（カルビオケム社(CalBiochem)、カリフォルニア州サンディエゴ）を添加し分化させた。滅菌した４８ウェル組織培養プレート（ＢＤファルコン社(BD Falcon)、カタログ番号353078）に細胞濃度が０.４×１０6個／ウェル（即ち０.８×１０6個／ｍＬを０.５ｍＬ）となるよう、直ちに細胞を添加し、３日間成熟させた。このとき、マイクロタイタープレートの各ウェルに接着している細胞を覆っている培地（各０.５ｍＬ）を、新鮮なFBS不含HL-1培地（各０.２ｍＬ）と交換した。エンドトキシン試験をパスし且つ分画操作（後述）を経た高分子量（＞50 kDa）ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（pA:pU、シグマ社(Sigma)、カタログ番号P1537、ロット番号022Ｋ4068）又はポリアデニル酸（pA、シグマ社(Sigma)、カタログ番号P9403、ロット番号022Ｋ4022）を培地の細胞に添加した（５０μｇ／ｍＬ）。細胞を無菌状態で２、６、２４時間の各時間インキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。これらの各時点において上清を回収し、後で分析に使用するまで冷凍した（−７０℃）。滅菌した冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）を細胞にゆっくり加えた後、アポトーシスのインジケーターであるYo-Proで染色した（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）。１０分間インキュベートした後、細胞を一回洗浄し、２％FBS含有緩衝液に懸濁させ氷冷下で保存した。次いで、細胞のYo-Pro取込み量を適切な対照細胞と比較し分析するための適切なフィルターをFACS Caliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社(BD Bioscience)、カリフォルニア州サンノゼ）に用いて細胞のアポトーシスを分析した。
得られた結果から、高分子量dsRNA画分pA:pU（＞50 kDa）がヒト抗原提示細胞の実質的アポトーシスを誘導できたことが分かる。対照では、２、６、２４時間の各時間において、アポトーシスはほとんど見られなかった。しかしながら、pA（＞50 kDa）の場合には、２、６、２４時間の各時間で顕著に高レベルのアポトーシスが見られ、またpA:pU（＞50 kDa）と共にインキュベートした細胞においては劇的に高いアポトーシスの誘導が見られた。
実施例２：低分子量dsRNA画分は、形質転換されたヒト単球性細胞に対しアポトーシス及び細胞死を誘導する効果を示す
ヒトAPC（THP-1細胞、アメリカ基準株保存機関（ATCC）、バージニア州マナサス）をATCC推奨の条件下で維持した：培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；温度：３７℃（５％ＣＯ2）；連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、３日毎に新鮮培地と交換し、４ヶ月経過したところで新たに培養を開始。
上述の培地にTHP-1細胞を懸濁させ、０.０５μＭ ビタミンＤ３（カルビオケム社(CalBiochem)、カリフォルニア州サンディエゴ）を添加し分化させた。滅菌した４８ウェル組織培養プレート（ＢＤファルコン社(BD Falcon)、カタログ番号353078）に細胞濃度が０.４×１０6個／ウェルとなるよう、直ちに細胞を添加し、３日間成熟させた。このとき、マイクロタイタープレートの各ウェルに接着している細胞を覆っている培地（各０.５ｍＬ）を、新鮮なFBS不含HL-1培地（各０.２ｍＬ）と交換した。エンドトキシン試験をパスし且つ分画操作を経た（後述）高分子量（＞50 kDa）ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（pA:pU、シグマ社(Sigma)、カタログ番号P1537、ロット番号022Ｋ4068）又はポリアデニル酸（pA、シグマ社(Sigma)、カタログ番号P9403、ロット番号022Ｋ4022）を培地の細胞に添加した（５０ｍｇ／ｍＬ）。細胞を無菌状態で２、６、２４時間の各時間インキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。これらの各時点において上清を回収し、後の分析において使用するまで冷凍した（−７０℃）。滅菌した冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）を細胞にゆっくり加えた後、細胞死のインジケーターであるエチジウムブロミド（シグマ社(Sigma)、カタログ番号46067、最終濃度１.５μｇ／ｍＬ）及び／又はアポトーシスのインジケーターであるYo-Pro（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）で染色した。１０分間インキュベートした後、生細胞からアポトーシス細胞及び死細胞を識別するための適切なフィルターを用いた蛍光顕微鏡法と、適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を用いて得た画像（図２に示す）と、Image Proソフトウェア（メディアサイバネティックス社(Media Cybernetics)、カリフォルニア州カールスバード）に基づく画像解析システムとを利用して細胞を分析した。
得られた結果から、低分子量RNA鎖（pA及びpA:pU、＜10 kDa）が高分子量RNA鎖（pA及びpA:pU、＞50 kDa）よりも著しく効果的に細胞死を誘導し、いずれも対照（含有無し）より効果的に細胞死を誘導したことが分かる。また結果から、低分子量ssRNA及びdsRNA（＜10 kDa）は高分子量ssRNA及びdsRNA（＞50 kDa）より細胞にアポトーシスを誘導するという点で優れており、対照と比較するとアポトーシスの誘導においてかなり優れていることが分かる。
高分子量RNA（＞50 kDa）は細胞の受容体に結合することにより細胞内に入るのに対し、低分子量RNA（＜10 kDa）は細胞内に入るのに受容体を必要としないことが理論上考えられる。更にまた、細胞の受容体による高分子量RNAの取込み量は、RNA鎖の２次構造に依存すると理論上考えられる。
実施例３：RNAモチーフの各画分に曝露した後のヒトAPCのサイトカインプロフィール
ヒトAPC（THP-1細胞、アメリカ基準株保存機関（ATCC）、バージニア州マナサス）をATCC推奨の条件下で維持した：培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；温度：３７℃（５％ＣＯ2）；連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、３日毎に新鮮培地と交換し、４ヶ月経過したところで新たに培養を開始。
上述の培地にTHP-1細胞を懸濁し、０.０５μＭ ビタミンＤ３（カルビオケム社(CalBiochem)、カリフォルニア州サンディエゴ）を添加し分化させた。滅菌した４８ウェル組織培養プレート（ＢＤファルコン社(BD FALCON)、カタログ番号353078）に細胞濃度が０.４×１０6個／ウェルとなるよう、直ちに細胞を添加し、３日間成熟させた。このとき、マイクロタイタープレートの各ウェルに接着している細胞を覆っている培地（各０.５ｍＬ）を、新鮮なFBS不含HL-1培地（各０.２ｍＬ）と交換した。エンドトキシン試験をパスし且つ分画操作を経た（後述）高分子量（＞50 kDa）ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（pA:pU、シグマ社(Sigma)、カタログ番号P1537、ロット番号022Ｋ4068）又はポリアデニル酸（pA、シグマ社(Sigma)、カタログ番号P9403、ロット番号022Ｋ4022）と、エンドトキシン試験済み全ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（pA:pU、シグマ社(Sigma)、カタログ番号P1537、ロット番号022Ｋ4068）又はポリアデニル酸（pA、シグマ社(Sigma)、カタログ番号P9403、ロット番号022Ｋ4022）とを培地の細胞に添加した（５０ｍｇ／ｍＬ）。細胞を無菌状態で２、６、２４時間の各時間インキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。これらの各時点において上清を回収し、サイトカインの分析を行うまで冷凍した（−７０℃）。ヒトIL-12用ELISAアッセイ（バイオソースインターナショナル社(Biosourse International)、カリフォルニア州カマリロ、カタログ番号KHC0121）とヒトTNF-α用ELISAアッセイ（バイオソースインターナショナル社(Biosourse International)、カタログ番号KHC0311）を細胞上清中のサイトカイン濃度の測定に使用した（図３）。ELISAアッセイは製品取扱説明書に従って行った。
得られた結果から、低分子量ssRNAモチーフと低分子量dsRNA（＜10 kDa、pA:pUとpA）モチーフはプロ炎症性サイトカインTNF-αを誘導できることが分かる（図３参照）。低分子量RNAモチーフのうち、dsRNA（＜10 kDa pA:pU）はTNF-αの誘導においてssRNA（＜10 kDa pA）よりやや優れていた。高分子量RNAモチーフ（＞50 kDa pA:pUと＞50 kDa pA）もまた、顕著にTNF-αを誘導でき対照と比較するとかなり優れていた。よって、低分子量RNAと高分子量RNAは細胞死とアポトーシスを誘導するだけでなく、プロ炎症性サイトカインTNF-αを誘導することができ、これにより細胞における免疫応答が促進される。これにより、細胞に細胞毒性作用を生じさせた後、より高い免疫応答に向かわせる。低分子量一本鎖RNA或いは二本鎖RNAで処理した後のプロ炎症性サイトカインTNF-αの産生とは対照的に、得られた結果から、高分子量（＞50 kDa pA:pU）ではその他の処理や対照（含有無し）と比較して、IL-12産生を顕著に誘導できたことが分かる。これは、Th1応答が調節されたことを示している。
実施例４：本例は、合成RNAの使用に先立ち、該RNAの分画、精製、濃度測定をどのように行うかを示す
バルク合成RNA材料は標準的な有機合成法によって得るが、市販のものを用いることもできる。例えば、RNAモチーフポリアデニル酸−ポリウリジル酸（pA:pU、シグマ社(Sigma)、カタログ番号P1537、ロット番号22Ｋ4068）やポリアデニル酸（pA、シグマ社(Sigma)、カタログ番号P9403、ロット番号22Ｋ4022）はシグマ社(Sigma)から入手できる。実施例の多くで使用される画分は、２０ｂｐ〜約１００ｂｐのサイズの合成RNAを含む。しかしながら、いかなるサイズのRNAをも使用でき、そのような使用は本発明の範囲内である。
合成RNA材料を一連の遠心分離にかけ、有孔率が規定されたフィルターを通して分画する。製品取扱説明書に従い、約２０ｍｇのpA:pUを遠心濾過用セントリプレップ(Centriprep) YM-50、50K MWCO（アミコン社(Amicon)、カタログ番号4323）に加え、１５００×ｇで１５分間遠心した。濾液（50 kMW未満）を回収し、YM-50を更に２回同様に回転させ、濾液（＜50 kMW）と残分（＞50 kMW）の両者を取得した。次いで、濾液（＜50 kMW）をセントリプレップ(Centriprep) YM-10、10K MWCO（アミコン社(Amicon)、カタログ番号4304）に加え、３０００×ｇで２０分間（２回）遠心し、濾液（＜10 kMW）と残分（＞10 kMW）の両者を取得した。
バルク合成RNA材料の分画操作後、材料を滅菌エンドトキシンフリー生理食塩水（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、滅菌済み、エンドトキシン試験済み（シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）等）に溶解させ、AffinitiPak Detoxi-Gelエンドトキシン除去ゲルカラム（ピアースケミカル社(Pierce Chemical)、カタログ番号20344）等のエンドトキシン除去カラムに別々に通し、流出物(effluent)を回収した。この流出物を、エンドトキシンレベル（リポ多糖(LPS)の濃度として測定）が１０ＥＵ／ｍｇより低くなるまでエンドトキシン除去カラムに通した。LPSの測定は、リムルス(Limulus)アッセイ（カブトガニの血球抽出物(Limulus Amebocyte Lysate ("LAL")を用いた発色アッセイ(chromogenic assay)（バイオウィタッカー社(Bio Whitakker)、Kinetic-QCL、カタログ番号50-650Ｕ）等）により行う。
エンドトキシン除去後、このモチーフをPBSで１：１００に希釈し、モチーフの濃度がわかっているPBS（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）溶液を基準として、260 nmにおける吸光度をベックマンDU-640分光光度計を用いて測定した。この結果、次の吸光係数（「ec」）が得られた：
ａ）pA:pU、（シグマ社(Sigma)、ロット番号22Ｋ4068）：ec＝0.0601；
ｂ）pA、（シグマ社(Sigma)、ロット番号22Ｋ4022）：ec＝0.0575
次いで、このモチーフの生物活性について各実施例に示す測定を行った。
Ａ．白血病細胞系
実施例５：低分子量dsRNA画分は、Ｔ細胞白血病細胞系に対しアポトーシス及び細胞死を誘導する効果を示す
ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞系（Jurkat）をアメリカ基準株保存機関（ATCC、バージニア州マナサス）から入手し、ATCC推奨の条件下で維持した：（ａ）培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mM ピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；（ｂ）連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、３日毎に新鮮培地と交換し、４ヶ月経過したところで新たに培養を開始；（ｃ）温度：３７℃（５％ＣＯ2）。Jurkat細胞は、in vivoにおいてヒトＴ細胞白血病を模倣(mimic)する、トランスフェクションされていないヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞系である。これとその他の白血病細胞系とを選択的に殺傷できることは臨床上有用と考えられる。
次に、Ｔ細胞白血病系を４８ウェルプレートのFBS含有培地に細胞濃度が０.４×１０6個／ウェル（即ち約８０％コンフルーエンス）となるように加え、３〜４日間成熟させた。翌日、培地を新鮮なFBS不含HL-1培地（各０．２ｍＬ）と交換した。次いで、エンドトキシン試験をパスし且つ分画操作を経たdsRNA（pA:pU）（実施例４に記載済み）を、細胞に１０、３０、１００μｇ／ｍＬの濃度で６時間パルシングした後、培地を新鮮なHL-1培地と交換し、無菌状態で一晩インキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。次いで、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）を細胞にゆっくり加え再懸濁させ、アポトーシスのインジケーターであるYo-Pro（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）と細胞死のインジケーターであるエチジウムブロミド（シグマ社(Sigma)、カタログ番号46067、最終濃度１.５μｇ／ｍＬ）で染色した。１０分間インキュベートした後、細胞を一回洗浄し、２％FBS含有緩衝液に懸濁させ氷冷下で保存した。次いで、細胞のYo-Proとエチジウムブロミド取込み量を適切な対照細胞と比較し分析するための適切なフィルターをFACS Caliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社(BD Bioscience)、カリフォルニア州サンノゼ）に用いて細胞のアポトーシスと細胞死を分析した。
図５に示す結果から、低分子量pA:pU（即ち、１０ｋＤ或いは約４０塩基対以下のpA:pUの混合物）は、ヒトＴ細胞白血病細胞系に対する実質的なアポトーシスと細胞死の誘導という点で、高分子量pA:pU、塩基対長が広範囲に亘るオリゴヌクレオチド（数塩基〜数千塩基）を含有する全pA:pU及び各種対照より顕著に優れていたことが分かる。特に、高濃度のLMW（３０μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬ）は細胞死とアポトーシスの誘導という点において、低濃度のLMW pA:pU（１０μｇ／ｍＬ）より優れていた。
実施例６：低分子量dsRNA画分は、ヒトＴリンパ球に対しアポトーシスと細胞死とを誘導する効果を示す
ヒトＴリンパ球細胞系（ATL-2）をアメリカ基準株保存機関（ATCC、バージニア州マナサス）から入手し、ATCC推奨の条件下で維持した：（ａ）培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；（ｂ）連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、３日毎に新鮮培地と交換し、４ヶ月経過したところで新たに培養を開始；（ｃ）温度：３７℃（５％ＣＯ2）。ATL-2細胞は、トランスフェクションされていないヒトＴ細胞白血病細胞系であり、in vivoにおいてヒトＴ細胞白血病を模倣する。これとその他の白血病細胞系とを選択的に殺傷できることは臨床上有用と考えられる。次に、Ｔリンパ球細胞系を４８ウェルプレートのFBS含有培地に細胞濃度が約０.４×１０6個／ウェル、即ち８０％コンフルーエンスとなるように加え、３〜４日間成熟させた。翌日、上に概要を述べたように培地をFCS不含HL-1培地（約０．２ｍＬ／ウェル）と交換した（但し、FBSは含まず）。
次いで、エンドトキシン試験をパスし且つ分画操作を経たdsRNA（pA:pU）（実施例４参照）を、細胞に１０、３０、１００μｇ／ｍＬの各濃度で６時間パルシングした後、培地を新鮮なHL-1培地と交換し、無菌状態で一晩インキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。次いで、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）を細胞にゆっくり加え再懸濁させ、アポトーシスのインジケーターであるYo-Pro（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）と細胞死のインジケーターであるエチジウムブロミド（シグマ社(Sigma)、カタログ番号46067、最終濃度１.５μｇ／ｍＬ）で染色した。１０分間インキュベートした後、細胞を一回洗浄し、２％FBS含有緩衝液に再懸濁させ氷冷下で保存した。次いで、細胞のYo-Proとエチジウムブロミド取込み量を適切な対照細胞と比較し分析するための適切なフィルターをFACS Caliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社(BD Bioscience)、カリフォルニア州サンノゼ）に用いて細胞のアポトーシスを分析した。
図６に示す結果から、低分子量pA:pU（即ち、１０ｋＤ以下のpA:pUの混合物）はヒトＴリンパ球細胞系に対して高分子量pA:pU、全pA:pU及び各種対照のいずれよりもアポトーシスと細胞死とを顕著に誘導できたことが分かる。LMWpA:pUのうち高濃度の１００μｇ／ｍＬでは、Ｔリンパ球細胞系の細胞死とアポトーシスの誘導において、低濃度のpA:pUより顕著に優れていた。
実施例７：低分子量dsRNA画分は、ヒトＴ細胞リンパ芽球に対しアポトーシスと細胞死とを誘導する効果を示す
ヒトＴ細胞リンパ芽球白血病細胞（CEM）をアメリカ基準株保存機関（ATCC、バージニア州マナサス）から入手し、ATCC推奨の条件下で維持した：（ａ）培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；（ｂ）連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、３日毎に新鮮培地と交換し、４ヶ月経過したところで新たに培養を開始；（ｃ）温度：３７℃（５％ＣＯ2）。CEM細胞は、in vivoにおいてヒトＴ細胞白血病を模倣するトランスフェクションされていないヒトＴ細胞リンパ芽球白血病細胞系である。これとその他の白血病とを選択的に殺傷できることは臨床上有用と考えられる。
次に、ヒトＴ細胞リンパ芽球白血病細胞を４８ウェルプレートのFBS含有培地に細胞濃度が０.４×１０6個／ウェル（即ち約８０％コンフルーエンス）となるように加え、３〜４日間成熟させた。翌日、培地をFCS不含HL-1培地（０．２ｍＬ／ウェル）と交換した。次いで、エンドトキシン試験をパスし且つ分画操作を経たdsRNA（pA:pU）（実施例４参照）を、細胞に１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬの濃度で６時間パルシングした後、培地を新鮮なHL-1培地と交換し、無菌状態で一晩インキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。次いで、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）を細胞にゆっくり加え再懸濁させ、アポトーシスのインジケーターであるYo-Pro（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）と細胞死のインジケーターであるエチジウムブロミド（シグマ社(Sigma)、カタログ番号46067、最終濃度１.５μｇ／ｍＬ）で染色した。１０分間インキュベートした後、細胞を一回洗浄し、２％FBS含有緩衝液に再懸濁させ氷冷下で保存した。次いで、細胞のYo-Proとエチジウムブロミド取込み量を適切な対照細胞と比較し分析するための適切なフィルターをFACS Caliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社(BD BIOSCIENCE)、カリフォルニア州サンノゼ）に用いて細胞のアポトーシスと細胞死を分析した。
図７に示す結果から、低分子量pA:pUは、特に高濃度の１００μｇ／ｍＬにおいて、各種対照或いは高分子量pA:pU、全pA:pUよりも、ヒトＴ細胞リンパ芽球白血病細胞系に対して顕著なレベルの細胞死とアポトーシスを誘導できたことが分かる。
実施例８：低分子量dsRNA画分は、ヒト単球性白血病細胞に対しアポトーシスと細胞死とを誘導する効果を示す
ヒト単球性白血病細胞（THP-1）をアメリカ基準株保存機関（ATCC、バージニア州マナサス）から入手し、ATCC推奨の条件下で維持した：（ａ）培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；（ｂ）連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、３日毎に新鮮培地と交換し、４ヶ月経過したところで新たに培養を開始；（ｃ）温度：３７℃（５％ＣＯ2）。THP-1細胞は、in vivoにおいてヒト単球性白血病を模倣するトランスフェクションされていないヒト単球性白血病細胞系である。これとその他の白血病細胞系とを選択的に殺傷できることは臨床上有用と考えられる。
次に、ヒト単球性白血病細胞を４８ウェルプレートのFBS含有培地に細胞濃度が０.４×１０6個／ウェル（即ち約８０％コンフルーエンス）となるように加え、３〜４日間成熟させた。翌日、培地をFBS不含HL-1培地（０．２ｍＬ／ウェル）と交換した。
次いで、エンドトキシン試験をパスし且つ分画操作を経たdsRNA（pA:pU）（実施例４参照）を、細胞に１０、３０、１００μｇ／ｍＬの濃度で６時間パルシングした後、培地を新鮮なHL-1培地と交換し、無菌状態で一晩インキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。次いで、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）を細胞にゆっくり加え再懸濁させ、アポトーシスのインジケーターであるYo-Pro（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）と細胞死のインジケーターであるエチジウムブロミド（シグマ社(Sigma)、カタログ番号46067、最終濃度１.５μｇ／ｍＬ）で染色した。１０分間インキュベートした後、細胞を一回洗浄し、２％FBS含有緩衝液に再懸濁させ氷冷下で保存した。次いで、細胞のYo-Proとエチジウムブロミド取込み量を適切な対照細胞と比較し分析するための適切なフィルターをFACS Caliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社(BD BIOSCIENCE)、カリフォルニア州サンノゼ）に用いて細胞のアポトーシスと細胞死を分析した。
図８に示す結果から、低分子量pA:pUは、特に１００μｇ／ｍＬの濃度において、ヒト単球性白血病細胞系に対し実質的なアポトーシスと細胞死とを誘導するという点で、各種対照或いは高分子量pA:pU、全pA:pUのいずれよりも顕著に優れていたことが分かる。
Ｂ．非白血病細胞系
実施例９：低分子量dsRNA画分及び高分子量dsRNA画分は、対照よりも高い率でヒト腺癌細胞株に細胞死或いはアポトーシスを誘導することができなかった
ヒト子宮頸部腺癌細胞系（ＨｅＬａ）をアメリカ基準株保存機関（ATCC、バージニア州マナサス）から入手し、ATCC推奨の条件下で維持した：（ａ）培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；（ｂ）連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、３日毎に新鮮培地と交換し、４ヶ月経過したところで新たに培養を開始；（ｃ）温度：３７℃（５％ＣＯ2）。ＨｅＬａ細胞は、in vivoにおいて腺癌を模倣するトランスフェクションされていないヒト子宮頸部腺癌細胞系である。これとその他の腺癌細胞系とを選択的に殺傷できることは臨床上有用と考えられる。
次に、ヒト子宮頸部腺癌細胞系を４８ウェルプレートのFBS含有培地に細胞濃度が０.４×１０6個／ウェル（即ち約８０％コンフルーエンス）となるように加え、３〜４日間成熟させた。翌日、培地をFBS不含HL-1培地（０．２ｍＬ／ウェル）と交換した。次いで、エンドトキシン試験をパスし且つ分画操作を経たdsRNA（pA:pU）（実施例４参照）を、細胞に１０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で６時間パルシングした後、培地を新鮮なHL-1培地と交換し、無菌状態で一晩インキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。次いで、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）を細胞にゆっくり加え再懸濁させ、アポトーシスのインジケーターであるYo-Pro（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）と細胞死のインジケーターであるエチジウムブロミド（シグマ社(Sigma)、カタログ番号46067、最終濃度１.５μｇ／ｍＬ）で染色した。１０分間インキュベートした後、細胞を一回洗浄し、２％FBS含有緩衝液に再懸濁させ氷冷下で保存した。次いで、細胞のYo-Proとエチジウムブロミド取込み量を適切な対照細胞と比較し分析するための適切なフィルターをFACS Caliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社(BD BIOSCIENCE)、カリフォルニア州サンノゼ）に用いて細胞のアポトーシスと細胞死を分析した。
図９に示す結果から、ヒト子宮頸部腺癌細胞に対しアポトーシスと細胞死を誘導するという点において、高分子量pA:pUと各種対照と同様、低分子量pA:pUは有利でなかったことが分かる。
実施例１０：低分子量pA:pU（１００μｇ／ｍＬ）はヒト肺繊維芽細胞に対し実質的なアポトーシスと細胞死とを誘導するという点で、高分子量pA:pU、全pA:pU、各種対照より顕著に優れていた
ヒト肺繊維芽細胞（「ＷＩ３８」）をアメリカ基準株保存機関（ATCC、バージニア州マナサス）から入手し、ATCC推奨の条件下で維持した：（ａ）培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；（ｂ）連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、２〜３日毎に新鮮培地と交換し、５０日間経過したところで新たに培養を開始；（ｃ）温度：３７℃（５％ＣＯ2）。ＷＩ−３８は、肺癌腫を模倣するヒト肺繊維芽細胞系である。
次に、ヒト肺繊維芽細胞を４８ウェルプレートのFBS含有培地に細胞濃度が０.４×１０6個／ウェル（即ち約８０％コンフルーエンス）となるように加え、３〜４日間成熟させた。翌日、培地をFCS不含HL-1培地（０．２ｍＬ／ウェル）と交換した。次いで、エンドトキシン試験をパスし且つ分画操作を経たdsRNA（pA:pU）（実施例４参照）を、細胞に１０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で６時間パルシングした後、培地を新鮮なHL-1培地と交換し、無菌状態で一晩インキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。次いで、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）を細胞にゆっくり加え再懸濁させ、アポトーシスのインジケーターであるYo-Pro（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）と細胞死のインジケーターであるエチジウムブロミド（シグマ社(Sigma)、カタログ番号46067、最終濃度１.５μｇ／ｍＬ）で染色した。１０分間インキュベートした後、細胞を一回洗浄し、２％FBS含有緩衝液に再懸濁させ氷冷下で保存した。次いで、細胞のYo-Proとエチジウムブロミド取込み量を適切な対照細胞と比較し分析するための適切なフィルターをFACS Caliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社(BD BIOSCIENCE)、カリフォルニア州サンノゼ）に用いて細胞のアポトーシスと細胞死を分析した。
図１０に示す結果から、低分子量pA:pUは、１００μｇ／ｍＬの濃度でヒト肺繊維芽細胞に対しアポトーシスと細胞死とを誘導するという点において、高分子量pA:pU、全pA:pU、各種対照より顕著に優れていたことが分かる。
実施例１１：高分子量、低分子量のdsRNA、ssRNAはいずれも、ヒト乳癌細胞に細胞死或いはアポトーシスを誘導するという点において、対照より優れていなかった
ヒト乳癌細胞系（SKBR-3）をアメリカ基準株保存機関（ATCC、バージニア州マナサス）から入手し、ATCC推奨の条件下で維持した：（ａ）培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；（ｂ）連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、３日毎に新鮮培地と交換し、４ヶ月経過したところで新たに培養を開始；（ｃ）温度：３７℃（５％ＣＯ2）。
次に、ヒト乳癌細胞系を４８ウェルプレートのFBS含有培地に細胞濃度が０.４×１０6個／ウェル（即ち約８０％コンフルーエンス）となるように加え、３〜４日間成熟させた。翌日、培地をFCS不含HL-1培地（０．２ｍＬ／ウェル）と交換した。次いで、エンドトキシン試験をパスし且つ分画操作を経たdsRNA（pA:pU）（実施例４参照）を、細胞に１０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で６時間パルシングした後、培地を新鮮なHL-1培地と交換し、無菌状態で一晩インキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。次いで、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）を細胞にゆっくり加え再懸濁させ、アポトーシスのインジケーターであるYo-Pro（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）と細胞死のインジケーターであるエチジウムブロミド（シグマ社(Sigma)、カタログ番号46067、最終濃度１.５μｇ／ｍＬ）で染色した。１０分間インキュベートした後、細胞を一回洗浄し、２％FBS含有緩衝液に再懸濁させ氷冷下で保存した。次いで、細胞のYo-Proとエチジウムブロミド取込み量を適切な対照細胞と比較し分析するための適切なフィルターをFACS Caliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社(BD BIOSCIENCE)、カリフォルニア州サンノゼ）に用いて細胞のアポトーシスと細胞死を分析した。
図１１に示す結果から、各種対照と同様、低分子量pA:pU、高分子量pA:pU、全pA:pUはいずれも、乳癌細胞に細胞死を誘導できなかったことが分かる。
実施例１２：高分子量dsRNAや対照と同様、低分子量dsRNA、高分子量dsRNAはいずれもヒトPBMCにおける細胞死或いはアポトーシスを誘導できなかった
Histopaque密度勾配培地(Histopaque density gradient medium)（シグマ社(Sigma)、カタログ番号1077-1）を室温にし、数回転倒混和して完全に混合させた。Histopaque（３ｍＬ）を１５ｍＬ遠沈管に加えた。ヒトのドナー（ドナー１、２）から採取したヒト血液サンプル５〜６ｍＬをHistopaqueに慎重に積層させ、次いで４００×ｇで２０℃で３０分間遠心した。滅菌ピペットを用いて、Histopaqueと血漿ができるだけ混ざらないように白色のリンパ球層を取った。
次いで、このリンパ球層を新しい１５ｍＬ遠沈管に移し、３倍量のPBSをリンパ球に加えた。リンパ球を再懸濁させ、遠沈管を1500 RPMで２０℃で１０分間遠心した。次いで、上清をデカントしリンパ球をピペットで穏やかに再懸濁した。遠沈管は、再度1200 RPMで２０℃で１０分間遠心した。次いで、上清をデカントしリンパ球をHL-1培地に穏やかに再懸濁させた。もう一度、遠沈管を1000 RPMで２０℃で１０分間遠心し、HL-1培地に再懸濁させた。
次いで、リンパ球数をカウントし４８ウェルプレートのHL-1培地に細胞濃度が４×１０5個／ウェルとなるよう加えた。分画・精製したRNAモチーフ（pA:pU）（実施例４参照）を最終濃度１０、３０、１００μｇ／ｍＬで、またLPS（E.coli 055：B5）を１００ｎｇ／ｍＬで細胞に添加し、一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ2）。
次いで細胞を再懸濁し、次のようにエチジウムブロミド及び／又はYo-Proで染色した：滅菌した冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）（１００μＬ）を細胞に加えた後、細胞死のインジケーターであるエチジウムブロミド（シグマ社(Sigma)、カタログ番号46067、最終濃度１.５μｇ／ｍＬ）及び／又はアポトーシスのインジケーターであるYo-Pro（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）で染色した。細胞を氷冷下で１０分間インキュベート後、２％FBS含有PBSに再懸濁させ、続いて細胞のYo-Proとエチジウムブロミド取込み量を適切な対照（LPS（１００ｎｇ／ｍＬ）、含有無し（HL-1培地のみ））と比較し分析するための適切なフィルターをFACS Caliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社(BD BIOSCIENCE)、カリフォルニア州サンノゼ）に用いて細胞のアポトーシス及び／又は細胞死を分析した。更に、アポトーシス細胞と死細胞とを区別するための適切なフィルターを用いた蛍光顕微鏡法と、Image Proソフトウェア（メディアサイバネティックス社(media Cybernetics、カリフォルニア州カールスバード）を用いた画像解析システムによって得た画像とによって細胞を分析した。
図１２Ａ〜１２Ｂの結果から、低分子量dsRNA、高分子量dsRNAはいずれも高分子量dsRNA或いは対照と同様に、ヒトPBMCに細胞死或いはアポトーシスを誘導することができなかったことが分かる。
実施例１３：低分子量dsRNA画分とオリゴマー長が既知のdsRNAは、単球性白血病細胞に対し細胞死を誘導する効果を示す
ヒト単球性白血病細胞（THP-1）をアメリカ基準系保存機関（ATCC、バージニア州マナサス）から入手し、ATCC推奨の条件下で維持した：（ａ）培地：2 mM Ｌ−グルタミン（インビトロジェン社(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバード、カタログ番号11875-085）を含有するRPMI 1640培地に10 mM HEPES（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15630-080）、ペニシリン−ストレプトマイシン（５０ユニット／ｍＬ）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号15070-063）、1.0 mMピルビン酸ナトリウム（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号11360-070）を含有させ、0.05 mM ２−メルカプトエタノール（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号21985-023）、ウシ胎児血清（FBS、１０％）（インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号26170-019）を添加した培地；（ｂ）連続培養：細胞培養フラスコ（コーニング社(Corning)、ニューヨーク州コーニング、カタログ番号430641）を用い、３日毎に新鮮培地と交換し、４ヶ月経過したところで新たに培養を開始；（ｃ）温度：３７℃（５％ＣＯ2）。THP-1細胞は、in vivoにおいてヒト単球性白血病を模倣するトランスフェクションされていないヒト単球性白血病細胞系である。これとその他の白血病細胞系とを選択的に殺傷できることは臨床上有用と考えられる。
次に、ヒト単球性白血病細胞を４８ウェルプレートのFBS含有培地に細胞濃度が０.４×１０6個／ウェル（即ち約８０％コンフルーエンス）となるように加え、３〜４日間成熟させた。翌日、培地をFBS不含HL-1培地（０．２ｍＬ／ウェル）と交換した。
次いで、エンドトキシン試験済み全dsRNAとエンドトキシン試験をパスし且つ分画操作を経た低分子量（＜10 kMW）dsRNA（pA:pU）（実施例４参照）（１００μｇ／ｍＬ）で細胞をパルシングした。パルシングにはアデニル酸（シグマ社(Sigma)、カタログ番号Ａ−１７５２）或いはウリジル酸（シグマ社(Sigma)、カタログ番号Ｕ−１７５２）の滅菌PBS溶液（５０、１００、２００、４００μｇ／ｍＬ）或いはアニーリングにより５-mer、１０-mer、２０-merのヌクレオチド（オリゴマー）長としたPolyA:polyU（アンビオン社(Ambion)、テキサス州オースティン）の滅菌PBS溶液（５０、１００、２００、４００μｇ／ｍＬを用いた。更に、LPS（２００ｎｇ／ｍＬ）のみとHL-1培地のみを対照に用いた。サンプルを一晩無菌状態でインキュベートした（３７℃／５％ＣＯ2）。次いで、冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS、シグマ社(Sigma)、カタログ番号D8537）を細胞にゆっくり加え再懸濁させ、アポトーシスのインジケーターであるYo-Pro（モレキュラープローブ社(Molecular Probes)、オレゴン州ユージーン、カタログ番号Y-3603、最終濃度０.１５μＭ）と細胞死のインジケーターであるエチジウムブロミド（シグマ社(Sigma)、カタログ番号46067、最終濃度１.５μｇ／ｍＬ）で染色した。１０分間インキュベートした後、細胞を一回洗浄し、２％FBS含有緩衝液に再懸濁させ氷冷下で保存した。次いで、細胞のYo-Proとエチジウムブロミド取込み量を適切な対照細胞と比較し分析するための適切なフィルターをFACS Caliburフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社(BD BIOSCIENCE)、カリフォルニア州サンノゼ）に用いて細胞のアポトーシスを分析した。
図１３に示す結果から、低分子量（＜１０ｋ）pA:pU（１００μｇ／ｍＬ）は既に示したように、実質的壊死性細胞死を誘導できたことが分かる。また、１０-mer或いは２０-merのpA:pU、アデニル酸、ウリジル酸及び各種対照に比べて、５-merのpA:pUのうち２００μｇの濃度では、わずかではあるが壊死性細胞死を誘導する量が多く、４００μｇの濃度では明らかな違いを示した。このことから更に、モノアデニル酸とモノウリジル酸が示す壊死作用は単なるバックグラウンドであり、最初のpA:pUオリゴマーのフォーマットが重要であることが分かる。更に、低分子量（＜10 kMW）pA:pU画分が壊死作用を示すのは、壊死作用を有する１０-mer長未満のオリゴマーを有するためであろう。
図１は、高分子量合成RNAの、抗原提示細胞（APC）にアポトーシスを誘導する効果を示す。 図２は、低分子量RNAと高分子量RNAの、形質転換されたヒト単球性細胞に細胞死を誘導する効果を示す。 図３は、ヒト抗原提示細胞におけるサイトカインTNF-αとIL-12の発現プロフィールを示す。 図４は、分画操作を経た低分子量RNAと高分子量RNAの効果の差異を示す表である。 図５は、各濃度の低分子量pA:pUがヒトＴ細胞白血病細胞系に対して実質的にアポトーシス及び細胞死を誘導するという点で、高分子量pA:pU、全pA:pU、各種対照より顕著に優れていたこと示す。 図６は、低分子量pA:pUがヒトＴリンパ球細胞系に対して高分子量pA:pU、全pA:pU及び各種対照のいずれよりもアポトーシスと細胞死とを顕著に誘導できたことを示す。 図７は、低分子量pA:pUが、特に高濃度の１００μｇ／ｍＬにおいて、ヒトＴ細胞リンパ芽球白血病細胞に対し顕著なレベルの細胞死とアポトーシスを誘導できたことを示す。 図８は、低分子量pA:pUが、特に１００μｇ／ｍＬの濃度において、ヒト単球性白血病細胞系に対し実質的なアポトーシスと細胞死とを誘導するという点で、各種対照或いは高分子量pA:pUのいずれよりも顕著に優れていたことを示す。 図９は、低分子量pA:pUがヒト子宮頸部腺癌細胞に対しアポトーシス及び細胞死を誘導することができたことを示す。 図１０は、低分子量pA:pUがヒト肺繊維芽細胞に対し実質的なアポトーシスと細胞死とを誘導するという点において、高分子量pA:pU、全pA:pU、各種対照より顕著に優れていたことを示す。 図１１は、低分子量pA:pUと高分子量pA:pUのいずれも乳癌細胞に細胞死を誘導できなかったことを示す。 図１２Ａは、低分子量dsRNAと高分子量dsRNAのいずれもヒトPBMCに細胞死もアポトーシスも誘導できなかったことを示す。 図１２Ｂは、低分子量dsRNAと高分子量dsRNAのいずれもヒトPBMCに細胞死もアポトーシスも誘導できなかったことを示す。 図１３は、単球性白血病細胞に対し細胞死誘導効果を示す低分子量dsRNA画分とオリゴマー長が既知のpA:pUについて示す。

Claims (37)

  1. 患者の形質転換細胞或いは非形質転換細胞にRNA鎖を投与することにより該細胞にアポトーシス或いは細胞死を誘導する方法。
  2. RNA鎖の平均サイズが1 kDa〜50 kDaである、請求項１に記載の方法。
  3. RNA鎖がdsRNAである、請求項１に記載の方法。
  4. RNA鎖がssRNAである、請求項１に記載の方法。
  5. dsRNAがpA:pUである、請求項３に記載の方法。
  6. dsRNAを、１〜９９９μｇ／ｋｇの用量で静脈内投与する、請求項５に記載の方法。
  7. 患者に投与するdsRNAの濃度が１〜５００μｇ／ｋｇである、請求項３に記載の方法。
  8. 患者がヒトであり、細胞が癌細胞であり、dsRNAがpA:pUであり、dsRNAを癌細胞に直接注射する、請求項１に記載の方法。
  9. ssRNAがpAである、請求項４に記載の方法。
  10. 形質転換細胞が、Ｔ細胞白血病細胞、ヒト単球白血病細胞、ヒト腺癌細胞、及びヒト肺繊維芽細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  11. ssRNA或いはdsRNAを細胞に投与することにより細胞に細胞死或いはアポトーシスを誘導する方法であって、ssRNA或いはdsRNAの平均サイズが20 kDa未満である方法。
  12. ssRNA或いはdsRNAの平均サイズが10 kDa未満である、請求項１１に記載の方法。
  13. 細胞が形質転換細胞である、請求項１２に記載の方法。
  14. ssRNAがpAである、請求項１２に記載の方法。
  15. dsRNAがpA:pUである、請求項１１に記載の方法。
  16. 細胞が癌細胞である、請求項１２に記載の方法。
  17. RNA鎖が、増強したTNF-αサイトカイン産生を誘導し、これにより前記細胞にＴ1免疫応答を導く、請求項１に記載の方法。
  18. RNA鎖が、増強したTNF-αサイトカイン産生を誘導し、これにより前記細胞にＴ1免疫応答を導く、請求項１２に記載の方法。
  19. 細胞死を誘導するためのRNAの使用により、増強した免疫応答を細胞に誘導する、請求項１に記載の方法。
  20. 局所投与、全身投与、及び直接注射からなる群から選択される投与形態により、RNAを細胞にin vivoで投与する、請求項１に記載の方法。
  21. ssRNA或いはdsRNAを細胞に投与することにより細胞にアポトーシスを誘導する方法であって、ssRNA或いはdsRNAのサイズが10 kDa未満である方法。
  22. RNAがssRNAであり、pAである、請求項２１に記載の方法。
  23. RNAがdsRNAであり、pA:pUである、請求項２１に記載の方法。
  24. 細胞が形質転換細胞である、請求項２１に記載の方法。
  25. 誘導されたアポトーシス性細胞が、増強したIL-12サイトカイン産生を誘導する、請求項２１に記載の方法。
  26. Th1応答が誘導される、請求項２１に記載の方法。
  27. RNAがdsRNAであり、その分子量が50 kDaより大であり、増強したIL-12応答を誘導する、請求項１に記載の方法。
  28. 患者の形質転換細胞に細胞死或いはアポトーシスを誘導するための組成物であって、平均分子量1〜50 kDaのdsRNAを含有する組成物。
  29. dsRNAの平均分子量が20 kDa未満である、請求項２８に記載の組成物。
  30. dsRNAの平均分子量が10 kDa未満である、請求項２８に記載の組成物。
  31. dsRNAがpA:pUである、請求項２８に記載の組成物。
  32. dsRNAが、増強したTNF-αサイトカイン産生を誘導する、請求項２８に記載の組成物。
  33. 形質転換細胞に細胞死或いはアポトーシスを誘導するための組成物であって、オリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドが、アデニン、ウラシル、シトシン、グアニン、及びイノシンからなる群から選択される少なくとも二塩基対から構成され、分子量が1 kDa〜50 kDaである、組成物。
  34. オリゴヌクレオチドがssRNAである、請求項３３に記載の組成物。
  35. オリゴヌクレオチドがdsRNAである、請求項３３に記載の組成物。
  36. ssRNAがpAである、請求項３３に記載の組成物。
  37. オリゴヌクレオチドがpA:pUである、請求項３５に記載の組成物。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2258712A3 (en) 2002-03-15 2011-05-04 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs
WO2004087877A2 (en) * 2003-03-26 2004-10-14 Astral Inc. Selected rna motifs to include cell death and/or apoptosis
WO2006092607A1 (en) * 2005-03-02 2006-09-08 The Secretary Of State For Defence Pharmaceutical composition
WO2009130616A2 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Innate Pharma Improved tlr3 agonist compositions
CA2789847A1 (en) 2010-02-15 2011-08-18 Synovo Gmbh Kinase modulators for the treatment of cancer
WO2014165296A1 (en) * 2013-03-12 2014-10-09 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Methods and formulations to achieve tumor targeted double stranded rna mediated cell death

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3906092A (en) * 1971-11-26 1975-09-16 Merck & Co Inc Stimulation of antibody response
WO2002055692A2 (de) * 2001-01-09 2002-07-18 Ribopharma Ag Verfahren zur hemmung der expression eines zielgens und medikament zur therapie einer tumorerkrankung

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US508386A (en) * 1893-11-07 hayworth
US5906980A (en) * 1987-07-17 1999-05-25 Hem Research Inc. Treatment of hepatitis with mismatched dsRNA
US5683986A (en) * 1987-08-12 1997-11-04 Hemispherx Biopharma Inc. Elaboration of host defense mediators into biological fluids by systemic dsRNA treatment
US5593973A (en) * 1987-09-04 1997-01-14 Hemispherx Biopharma Inc. Treatment of viral hepatitis with mismatched dsRNA
US5000000A (en) * 1988-08-31 1991-03-19 University Of Florida Ethanol production by Escherichia coli strains co-expressing Zymomonas PDC and ADH genes
JP3355351B2 (ja) * 1989-02-24 2002-12-09 ユーロジェン・ホールディング・ソシエテ・アノニム 遺伝的に工作されたイムノグロブリン
US5612035A (en) * 1989-03-21 1997-03-18 The Immune Response Corporation Vaccination against diseases resulting from pathogenic responses by specific T cell populations
ZA908037B (en) * 1989-10-11 1991-09-25 Hem Res Inc Protection from shock subsequent to injury by double-standed rnas
US5969109A (en) * 1990-02-28 1999-10-19 Bona; Constantin Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes
US5998366A (en) * 1990-09-21 1999-12-07 The Regents Of The University Of California Method for ameliorating glutamic acid decarboxylase associated autoimmune disorders
US5474771A (en) * 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
US7252829B1 (en) * 1998-06-17 2007-08-07 Idm Pharma, Inc. HLA binding peptides and their uses
US5958457A (en) * 1993-04-22 1999-09-28 Emisphere Technologies, Inc. Compositions for the delivery of antigens
US6479055B1 (en) * 1993-06-07 2002-11-12 Trimeris, Inc. Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission
WO1995026204A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
EP0770628B9 (en) * 1994-07-13 2007-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
EP0772619B2 (en) * 1994-07-15 2010-12-08 The University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5698679A (en) * 1994-09-19 1997-12-16 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for targeting an immune response
US5736524A (en) * 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
GB9501079D0 (en) * 1995-01-19 1995-03-08 Bioinvent Int Ab Activation of T-cells
US5976800A (en) * 1996-06-28 1999-11-02 The Regents Of The University Of California Enhancement of cancer cell death
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
AU7690898A (en) * 1997-05-20 1998-12-11 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US6777546B2 (en) * 1997-10-07 2004-08-17 Loma Linda University Methods and substances for preventing and treating autoimmune disease
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
KR20000034847A (ko) * 1998-11-17 2000-06-26 성재갑 인간 4-1비비 분자에 대한 인간화 항체 및 이를 포함하는 약학조성물
US6514948B1 (en) * 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
EP1286226B1 (en) * 2000-05-25 2008-02-27 Fuji Xerox Co., Ltd. Toner and image forming method
AU2001280934A1 (en) * 2000-07-28 2002-02-13 Alliance Pharmaceutical Corp. Methods and compositions to upregulate, redirect or limit immune responses to bioactive compounds
US6811785B2 (en) * 2001-05-07 2004-11-02 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Multivalent MHC class II—peptide chimeras
CN1582167A (zh) * 2001-11-02 2005-02-16 积水化学工业株式会社 细胞因子诱导材料和细胞因子诱导装置
WO2003078595A2 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Astral, Inc. Immunostimulatory double stranded rna and methods of inducing, enhancing or modulating the immune response
US20040223949A1 (en) * 2002-10-22 2004-11-11 Sunnybrook And Women's College Health Sciences Center Aventis Pasteur, Ltd. Vaccines using high-dose cytokines
WO2004087877A2 (en) * 2003-03-26 2004-10-14 Astral Inc. Selected rna motifs to include cell death and/or apoptosis
ATE511859T1 (de) * 2004-07-20 2011-06-15 Schering Corp Apoptoseinduktion in toll-artige rezeptoren exprimierenden tumorzellen
WO2006054129A1 (en) * 2004-11-19 2006-05-26 Institut Gustave Roussy Improved treatment of cancer by double-stranded rna

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3906092A (en) * 1971-11-26 1975-09-16 Merck & Co Inc Stimulation of antibody response
WO2002055692A2 (de) * 2001-01-09 2002-07-18 Ribopharma Ag Verfahren zur hemmung der expression eines zielgens und medikament zur therapie einer tumorerkrankung

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