CN1795274A - 诱导细胞死亡和/或凋亡的选定的rna基序 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及dsRNA和/或ssRNA在诱导增殖细胞凋亡或细胞死亡中的应用。具体来说，本申请表明低分子量和高分子量的dsRNA和ssRNA均能够诱导增殖细胞的凋亡和/或细胞死亡，能够抑制转化细胞或肿瘤细胞的增殖，并且能够快速诱导细胞因子TNF－α，和/或能够诱导产生IL－12，其中IL－12能够介导Th－1反应。

Description

诱导细胞死亡和/或凋亡的选定的RNA基序
发明的技术领域
本申请广义上来说涉及低分子量和高分子量的双链RNA(“dsRNA”)和单链RNA(“ssRNA”)在诱导细胞死亡和细胞凋亡尤其是转化细胞的死亡和凋亡中的应用。
发明的技术背景
在二十世纪七十年代和八十年代，有几项研究表明高分子量DNA能够与细胞膜结合。已经详细评价了多种多核苷酸链作为生物反应调节剂的应用。其中一个实例是polyI:polyC，其是IFN产生的强诱导剂，还是巨噬细胞激活剂并且是NK活性诱导剂(Talmadge等，“Immunomodulatory effects in mice of polyinosinic-polycytidylic acid complexed with poly-L：lysine andcarboxymethylcellulose”，Cancer Res.45：1058，1985)。然而由细胞因子TNF-α引起的毒副作用防碍了polyI:polyC成为一种有用的治疗试剂。
已经表明短的干扰RNA(siRNA)，如使用具有21和22个核苷酸的RNA，能够诱导同源RNA的序列-特异性转录后基因沉默(Elbashir等，“RNA interference is mediated by 21-22 nucleotide RNAs”。Genes Dev.2001年1月15；15(2)：188-200)，这与上述文献中提到的dsRNA所具有的非-序列特异性活性是完全不同的。
已经报道某些DNA结构还具有激活淋巴细胞的能力。例如，据报道，脾细胞上清液中的核小体蛋白-DNA复合体能够使B细胞增殖和分泌免疫球蛋白(Bell等，“Immunogenic DNA-related factors”。J.Clin.Invest.85：1487，1990)。还报道裸DNA具有免疫作用。例如，据报道260到800bp的poly(dG):(dC)片段能够促进B细胞的有丝分裂(Messina等，“The influence of DNA structure on thein vitro stimulation of murine lymphocytes by natural andsynthetic polynucleotide antigens”.Cell.Immunol.147：148，1993)。Pisetsky等报道纯的哺乳动物DNA检测不到免疫作用，但是某些细菌的DNA能够诱导B细胞激活和分泌免疫球蛋白(Pisetsky等，“Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferationby bacterial DNA”.J.Immunol.147：1759；1991)。另外还有某些含有未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸能够激活淋巴细胞，这已经被体外和体内的试验数据加以了证实。
用负链RNA或某些DNA病毒感染的细胞会产生出非编码RNA基序。特定的dsRNAs能够被先天的免疫细胞识别，并且已知其结合到Toll-like受体3上(Alexopoulou等，“Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor3”，Nature 413：732-738；2001)。另外，已经发现这些dsRNAs能够同时影响先天的免疫反应和适应性免疫反应(Wang等，“NoncodingRNA danger motifs bridge innate and adaptive immunity and arepotent adjuvants for vaccination”，J.Clin.Invest，110：1175-84：2002)。
发明概述
本申请涉及dsRNA和ssRNA在诱导活细胞凋亡和/或细胞死亡中的应用。具体来说，本申请表明低分子量和高分子量的dsRNA和ssRNA能够诱导增殖细胞的凋亡和/或细胞死亡，能够抑制转化细胞或肿瘤细胞的增殖，能够快速诱导促炎细胞因子TNF-α，并且还能够诱导产生IL-12(高分子量的RNA)，其中IL-12是一种谤导IFN-γT细胞和Th1免疫反应的调节剂。
本发明能够应用于抗-肿瘤治疗或抗-白血病治疗，能够分别抑制转化肿瘤细胞或白血病细胞的增殖，并且能够快速谤导细胞因子TNF-α和/或IL-12。本发明还能够应用于抗-微生物治疗。这项技术在治疗实体瘤和白血病过程中，不需要细胞转染试剂以使之适用于体内施用，而且不需要表位或基因特异性，然而当使用反义或siRNAs时则需要细胞转染试剂，另外还需要表位和基因特异性。反义化合物无论是在体外还是在体内应用均需要转染试剂，而且通常反义化合物仅能够到达少量的细胞。相比之下，低分子量的RNAs(单链和双链)能够很容易地穿透细胞膜，而且不需要转染试剂。
某些本发明所公开的dsRNAs诱导天然细胞的促炎(TNF-α)反应或促细胞凋亡反应，或二者兼而有之，这可以增强抗原的交叉呈递，并且增强特异性免疫效应物特异性指向Th-1反应。凋亡细胞是抗原性物质的良好来源，并且其在癌症和传染性疾病中对于效应细胞(Th1或Tc1)的诱导也是很重要的。
现在还不是完全清楚低分子量和高分子量的RNA链是如何诱导细胞凋亡和/或细胞死亡的。有可能是RNA基序被细胞膜上的Toll样受体识别，或者被细胞内化，通过介导基因表达的负调节而起作用，导致非-特异性基因沉默。对于低分子量的RNA(ssRNA和dsRNA)，确信它们是可以直接进入细胞的，而不需利用细胞受体。对于高分子量的RNA链(ssRNA和dsRNA)，确信它们是通过细胞受体进入细胞的，因此其二级结构对于其功能来说是重要的，或者有可能是决定性的。
本发明教导了小的或低分子量的ssRNA或dsRNA能够在快速生长的转化细胞中诱导产生TNF-α，从而快速诱导细胞死亡。另外，本发明教导了在快速生长的转化细胞中，大的或高分子量的ssRNA或dsRNA通过诱导产生IL-12和TNF-α从而诱导细胞凋亡，但诱导的量小于低分子量的ssRNA或dsRNA，其中上述IL-12是一种已知的诱导IFN-γT细胞和Th1免疫反应的调节剂。此外，正如WO 03/078595和PCT/US2003/030188所教导的，高分子量的ssRNA或dsRNA还可以作为一种佐剂，与抗原一起施用以提高T1免疫性，而且其在对抗传染性疾病和癌症的应用中是非常重要的，上述两篇文献在本申请中全文引作参考。相比之下，低分子量的RNAs(单链或双链)仅在一些情况下被用作佐剂。
相信本发明所公开的RNA化合物所具有的促细胞凋亡和/或细胞坏死的作用，与原代细胞相比，在很大程度上对于增殖能力高或快速增殖的细胞(如在具有多种癌症和肿瘤细胞的情况下)更加具有特异性。关于在人体中的治疗有效量或剂量，本发明的RNA组合物可以以溶液或乳状液的形式，局部或系统施用到人患者、或者直接注射到肿瘤，施用量在1ng/kg-999mg/kg的范围内。在人体中的治疗有效剂量为1ng/kg-10ng/kg。至10ng/kg-500ng/kg。至500ng/kg-999ng/kg、1μg/kg-10μg/kg。至10μg/kg-100μg/kg。100μg/kg-200μg/kg、200μg/mg-500μg/mg、500μg/kg-999μg/kg、至1mg/kg-10mg/kg、至10mg/kg-100mg/kg、至100mg/kg-200mg/kg和200mg/kg-500mg/kg。基于本申请，最优选的人施用剂量是1-999μg/kg，更加最优选的剂量是1-500μg/kg或1-100μg/kg。如果直接注射到肿瘤团块，则预期剂量应当在1mg/kg-500mg/kg和1mg/kg-100mg/kg的范围内。
本发明的各个具体实施方式包括：
1)一种通过给细胞施用RNA链，从而诱导患者中转化或非转化细胞凋亡或细胞死亡的方法。
2)第1段所述的方法，其中所述RNA链的平均大小为1kDa至50kDa。
3)第1段所述的方法，其中所述RNA链是dsRNA。
4)第1段所述的方法，其中所述RNA链是ssRNA。
5)第3段所述的方法，其中所述dsRNA是pA:pU。
6)第5段所述的方法，其中所述dsRNA的施用剂量选自：1-999μg/kg、1-500μg/kg、1-100μg/kg、1-50μg/kg、1-25μg/kg、1-10μg/kg和1-5μg/kg。
7)第6段所述的方法，其中所述dsRNA是静脉内施用，施用剂量选自：1-999μg/kg、1-500μg/kg、1-100μg/kg、1-50μg/kg、1-25μg/kg、1-10μg/kg和1-5μg/kg。
8)第1段所述的方法，其中患者是人，细胞是转化细胞，dsRNA是pA:pU，并且dsRNA是直接注射到癌细胞。
9)第4段所述的方法，其中ssRNA是pA。
10)第1段所述的方法，其中患者是人，转化细胞选自：T细胞白血病细胞、人单核细胞白血病细胞、人腺癌细胞和人肺成纤维细胞。
11)一种通过给细胞体内施用ssRNA或dsRNA，从而诱导细胞死亡或细胞凋亡的方法，其中所述ssRNA或dsRNA的平均大小小于20kDa。
12)第11段所述的方法，其中ssRNA或dsRNA的平均大小小于10kDa。
13)第12段所述的方法，其中所述细胞是转化细胞。
14)第12段所述的方法，其中所述ssRNA是pA。
15)第11段所述的方法，其中所述dsRNA是pA:pU。
16)第12段所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
17)第1段所述的方法，其中所述RNA链诱导增强的细胞因子TNF-α的产生。
18)第12段所述的方法，其中所述RNA链诱导增强的细胞因子TNF-α的产生。
19)第1段所述的方法，其中使用RNA诱导细胞死亡，诱导增强的对所述细胞的免疫反应。
20)第1段所述的方法，其中所述RNA是体内施用给细胞，施用方式选自：局部施用、系统施用或直接注射。
21)一种通过给细胞施用ssRNA或dsRNA，从而谤导细胞凋亡的方法，其中所述ssRNA或dsRNA的大小小于10kDa。
22)第21段所述的方法，其中所述RNA是ssRNA，并且是pA。
23)第21段所述的方法，其中所述RNA是dsRNA，并且是pA:pU。
24)第21段所述的方法，其中所述细胞是转化细胞。
25)第21段所述的方法，其中所述诱导的凋亡细胞与相似的活细胞相比，诱导增强的IL-12细胞因子产生。
26)第21段所述的方法，其中介导了Th-1反应。
27)第1段所述的方法，其中所述RNA是dsRNA，其分子量大于50kDa，并且诱导增强的IL-12反应。
28)一种用于诱导转化细胞中的细胞死亡或凋亡的组合物，其中所述组合物由平均分子量为1-50kDa的RNA组成。
29)第28段所述的组合物，其中所述dsRNA或ssRNA的平均分子量小于20kDa。
30)第28段所述的组合物，其中所述dsRNA或ssRNA的平均分子量小于10kDa。
31)第28段所述的组合物，其中所述dsRNA是pA:pU。
32)第28段所述的组合物，其中所述dsRNA诱导增强的细胞因子TNF-α的产生，并由此诱导了对转化细胞的T1免疫反应。
33)一种用于诱导患者中转化细胞中的细胞死亡或凋亡的组合物，其中所述组合物由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸由至少两个选自腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤和肌苷的碱基对组成，并且所述寡核苷酸的分子量为1kDa-50kDa。
34)第33段所述的组合物，其中所述寡核苷酸是ssRNA。
35)第33段所述的组合物，其中所述寡核苷酸是dsRNA。
36)第33段所述的组合物，其中所述ssRNA是pA。
37)第35段所述的组合物，其中所述寡核苷酸是pA:pU。
38)第33段所述的组合物，其中所述寡核苷酸的分子量为1kDa-10kDa。
39)第33段所述的组合物，其中所述寡核苷酸的分子量为1kDa-5kDa。
40)组合物在制造用于诱导转化细胞中的细胞死亡或凋亡的药物中的用途，其中所述组合物由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸由至少两个选自腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤和肌苷的碱基对组成，并且所述寡核苷酸的分子量为1kDa-50kDa。
41)第40段所述的用途，其中所述寡核苷酸是ssRNA。
42)第40段所述的用途，其中所述寡核苷酸是dsRNA。
43)第40段所述的用途，其中所述ssRNA是pA。
44)第40段所述的用途，其中所述寡核苷酸是pA:pU。
45)第40段所述的用途，其中所述寡核苷酸的分子量为1kDa-10kDa。
46)第40段所述的用途，其中所述寡核苷酸的分子量为1kDa-5kDa。
47)组合物在制造用于诱导转化细胞中的细胞死亡或凋亡的药物中的用途，其中所述组合物由平均分子量为1-50kDa的RNA组成。
48)第47段所述的用途，其中所述dsRNA或ssRNA的平均分子量小于20kDa。
49)第47段所述的用途，其中所述dsRNA或ssRNA的平均分子量小于10kDa。
50)第47段所述的用途，其中所述dsRNA是pA:pU。
51)第47段所述的用途，其中所述dsRNA诱导增强的细胞因子TNF-α的产生。
52)第51段所述的用途，其中所述增强的TNF-α产生诱导了对转化细胞的T1免疫性。
附图说明
附图1：显示高分子量合成RNAs在诱导抗原呈递细胞(APCs)凋亡过程中的作用；
附图2：显示低分子量和高分子量RNAs在诱导转化的人单核细胞细胞死亡过程中的作用；
附图3：显示基于人抗原呈递细胞的TNF-α和IL-12表达的细胞因子谱；
附图4：图表显示分级分离的低分子量和高分子量RNA的效果差异；
附图5：显示多种浓度的低分子量pA:pU在诱导人T细胞白血病细胞系的大量凋亡和细胞死亡方面，显著优于高分子量的pA:pU、完全pA:pU或对照；
附图6：表明低分子量pA:pU在诱导人T淋巴细胞系中的凋亡和细胞死亡方面效果显著，显著优于高分子量pA:pU和完全pA:pU以及对照；
附图7：表明低分子量pA:pU，尤其是在100μg/ml的较高浓度下，能够在人T细胞淋巴母细胞白血病细胞中，诱导显著水平的细胞死亡和凋亡；
附图8：表明低分子量pA:pU，尤其是在100μg/ml的较高浓度下，在诱导人单核细胞白血病细胞系中的大量细胞凋亡和细胞死亡方面，显著优于对照或高分子量pA:pU；
附图9：表明低分子量pA:pU成功诱导了人宫颈腺癌细胞的凋亡和细胞死亡；
附图10：表明低分子量pA:pU在诱导人肺成纤维细胞中的大量细胞凋亡和细胞死亡方面，显著优于高分子量pA:pU、完全pA:pU或对照；
附图11：显示低分子量或高分子量pA:pU均不能谤导乳腺癌细胞的细胞死亡；
附图12A-12B：显示低分子量或高分子量pA:pU均不能诱导人PBMCs的细胞死亡或细胞凋亡；和
附图13：显示低分子量dsRNA级分和已知寡聚体长度的pA:pU对单核细胞白血病细胞所表现出的细胞死亡诱导效果。
发明详述
定义：
在本申请中所使用的如下术语或短语具有下述含义：
“dsRNA”是指双链RNA片段，其可以由碱基腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤和肌苷组成，其可以是完全互补的、部分互补的或是混合的核苷酸链。
“ssRNA”是指单链RNA片段，其可以由碱基腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和鸟嘌呤组成，可以只由一种核苷酸组成，也可以由混合核苷酸组成。
“低分子量dsRNA或ssRNA”是指分子量大约为10kDa或小于10kDa(＜10k MW)的RNA链。优选的，本发明的低分子量ssRNA和dsRNA具有2-40个碱基对；
“高分子量dsRNA或ssRNA”是指分子量大约为10kDa或大于10kDa并且在10kDa到50kDa之间，但是也可以是大于50kDa(＞50k MW)的RNA链；
“完全dsRNA”是指具有任意或所有分子量或寡聚体长度的dsRNA；
“APC”是指抗原呈递细胞；
“细胞死亡”是指不同于凋亡的细胞的死亡；
“凋亡”是指编程性细胞死亡；
“Th-1反应”是指T-辅助细胞1反应；
“pA:pU”是指这样一种dsRNA，其RNA链或片段是由腺嘌呤和尿嘧啶组成的，其RNA链或片段是互补的，并且包含不均一互补的RNA链或片段；
“聚体”是寡聚体的简称；
“HL-1培养基”是指HL-1培养基(BioWhittaker，WalkersvilleMD，cat#344017)，其含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)；
“＜”是指小于；和
“＞”是指大于。
实施例1：高分子量人工合成RNA能够诱导人抗原呈递细胞(APC)的大量凋亡。
在ATCC建议的下述条件下维持人APCs(THP-1细胞，美国典型培养物保藏中心([ATCC]，Manassas，yA)：(a)培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)和1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)连续培养：在细胞培养瓶(Corning，Corning NY，cat#430641)中培养，每3天更换一次新鲜的培养基直到培养4个月，然后开始新一轮的培养；和(c)温度：37℃，5％CO2。
将THP-1细胞悬浮到上述培养基中，加入0.05μM维生素D3(CalBiochem，San Diego，CA)后开始分化。然后将细胞立即加到灭菌的48孔组织培养板上(BD Falcon，cat#353078)，浓度为每孔0.4×106个细胞(每ml是0.8×106个细胞，因此加入0.5ml即可)，使之成熟3天。这时，取0.2ml新鲜的不含FBS的HL-1培养基替换原有的0.5ml培养基，覆盖微量培养板孔中的贴壁细胞。将已经经过内毒素测试和分级分离的(将单独描述)高分子量(＞50kDa)聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA:pU，Sigma，cat#P1537，lot#022K4068)或聚腺苷酸(pA，Sigma，cat#P9403，lot#022K4022)加入到培养基的细胞中，加入量为50μg/ml。在37℃/5％CO2的无菌条件下，将细胞分别孵育2小时、6小时或24小时。在上述相同时间点，收集上清液，冷冻(-70℃)，用于后面进一步的分析。缓慢加入灭菌的、冷磷酸盐缓冲液(PBS，Sigma，cat#D8537)，将细胞覆盖，然后用Yo-Pro(MolecularProbes，Eugene，OR，cat#Y-3603，终浓度为0.15μM))染色，Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂。温育10分钟之后将细胞冲洗一次，悬浮在含有2％FBS的缓冲液中，冰浴保存。然后与合适的对照细胞相比较，使用合适的过滤器用FACS Calibur流式细胞计数器(BDBioscience，San Jose，CA)分析细胞对Yo-Pro的摄入情况，分析细胞的凋亡情况。
结果表明较高分子量的dsRNA级分pA:pU(＞50kDa)，能够诱导人抗原呈递细胞的大量凋亡。相比之下，对照组在2小时、6小时和24小时时仅观察到极微量的细胞凋亡。而pA(＞50kDa)在2小时、6小时和24小时时所观察到的细胞凋亡水平显著高于对照，同时与pA:pU(＞50kDa)一起孵育的细胞也观察到显著更高的细胞凋亡诱导。
实施例2：低分子量dsRNA对转化人单核细胞表现出诱导细胞凋亡和细胞死亡的作用。
在ATCC建议的下述条件下维持人APCs(THP-1细胞，美国典型培养物保藏中心([ATCC]，Manassas，VA)：培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)和1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；温度：37℃，5％CO2。连续培养：在细胞培养瓶(Corning，Corning NY，cat#430641)中培养，每3天更换一次新鲜的培养基直到培养4个月，然后开始新一轮的培养。
将THP-1细胞悬浮到上述培养基中，加入0.05μM维生素D3(CalBiochem，San Diego，CA)后开始分化。然后将细胞立即加到灭菌的48孔组织培养板上(BD Falcon，cat#353078)，浓度为每孔0.4×106个细胞，使之成熟3天。这时，取0.2ml新鲜的不含FBS的HL-1培养基替换原有的0.5ml培养基，覆盖微量培养板孔中的贴壁细胞。将已经经过内毒素测试和分级分离的(将单独描述)高分子量(＞50kDa)聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA:pU，Sigma，cat#P1537，lot#022K4068)或聚腺苷酸(pA，Sigma，cat#P9403，lot#022K4022)加入到培养基的细胞中，加入量为50mg/ml。在37℃/5％CO2的无菌条件下，将细胞分别孵育2小时、6小时或24小时。在上述相同时间点，收集上清液，冷冻(-70℃)，用于后面进一步的分析。缓慢加入灭菌的、冷磷酸盐缓冲液(PBS，Sigma，cat#D8537)，将细胞覆盖，然后用溴化乙锭(Sigma，cat#46067，终浓度为1.5μg/ml))染色，溴化乙锭是细胞死亡指示剂，和/或用Yo-Pro染色(MolecularProbes，Eugene，OR，cat#y-3603，终浓度为0.15μm)，Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂。温育10分钟之后使用合适过滤器通过荧光显微镜将凋亡细胞和死亡细胞与活细胞区分开来，并用带有合适过滤器和使用Image Pro软件(Media Cybernetics，Carlsbad，CA)的图像分析系统的荧光显微镜照像(附图2所示)分析细胞。
结果表明低分子量RNA链(pA和pA:pU＜10kDa)能够显著诱导细胞死亡，比较高分子量RNA链(pA和pA:pU＞50kDa)更加有效，同时上述两种RNA比对照(nil)诱导了更多的细胞死亡。结果还显示出低分子量的ssRNA和dsRNA(＜10kDa)比高分子量的ssRNA和dsRNA(＞50kDa)在诱导细胞凋亡方面更有效，另外与对照相比在诱导细胞凋亡方面更有效。
据推论，低分子量RNAs(＜10kDa)可以在不需要受体的情况下进入细胞，而高分子量RNAs(＞50kDa)是通过占据细胞受体而进入细胞。还推论，细胞受体对高分子量RNAs的摄入依赖于RNA链的二级结构。
实施例3：人APC在暴露于RNA基序之后的细胞因子谱。
在ATCC建议的下述条件下维持人APCs(THP-1细胞，美国典型培养物保藏中心([ATCC]，Manassas，VA)：培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)和1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)。温度：37℃，5％CO2。连续培养：在细胞培养瓶(Corning，Corning NY，cat#430641)中培养，每3天更换一次新鲜的培养基直到培养4个月，然后开始新一轮的培养。
将THP-1细胞悬浮到上述培养基中，加入0.05μM维生素D3(CalBiochem，San Diego，CA)后开始分化。然后将细胞立即加到灭菌的48孔组织培养板上(BD Falcon，cat#353078)，浓度为每孔0.4×106个细胞，使之成熟3天。这时，取0.2ml新鲜的不含FBS的HL-1培养基替换原有的0.5ml培养基，覆盖微量培养板孔中的贴壁细胞。将已经经过内毒素测试的完全和分级分离的(将单独描述)高分子量(＞50kDa)聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA:pU，Sigma，cat#P1537，lot#022K4068)或聚腺苷酸(pA，Sigma，cat#P9403，lot#022K4022)加入到培养基的细胞中，加入量为50mg/ml。在37℃/5％CO2的无菌条件下，将细胞分别孵育2小时、6小时或24小时。在上述相同时间点，收集上清液，并在分析细胞因子之前冷冻(-70℃)上清液。使用人IL-12(Biosourse International，Camarillo，CA，cat#KHC0121)或人TNF-α(Biosourse International，cat#KHC3011)的ELISA分析法，检测细胞上清液中细胞因子的浓度(附图3)。ELISA分析步骤按照生产商所提供的说明进行。
结果表明(参见附图3)，低分子量ssRNA和dsRNA(＜10kDa的pA和pA:pU)基序能够诱导促炎细胞因子TNF-α。在低分子量RNA基序中，dsRNA(＜10kDa的pA:pU)在诱导TNF-α方面比ssRNAs(＜10kDa，pA)稍微有效一些。较高分子量RNA基序(＞50kDa的pA:pU和＞50kDa的pA)在诱导TNF-α方面也显著优于对照。因此低分子量和高分子量RNAs不仅能够诱导细胞死亡和细胞凋亡，还能够诱导促炎细胞因子TNF-α，并由此促进对细胞的免疫反应，同时也由此导致对细胞产生细胞毒性，之后引发对细胞的后续免疫反应或增强对细胞的免疫反应。用低分子量单链或双链RNA进行处理后产生了促炎细胞因子TNF-α，相比之下，结果表明较高分子量(＞50kDa的pA:pU)能够诱导产生显著水平的IL-12，这是与所有其它处理或对照(nil)相比较后得出的，其中IL-12是Th1反应调节的指示性特征。
实施例4：阐述合成RNA是如何进行分级、纯化的，以及在使用前如何确定浓度。
大量的合成RNA材料可以通过标准的有机合成来获得，也可以通过购买获得。例如，RNA基序聚腺苷酸-聚尿苷酸(pA:pU，Sigma，cat#P1537，lot#22K4068)或聚腺苷酸(pA，Sigma，cat#P9403，lot#22K4022)可以从Sigma公司购买。本发明大部分实施例所使用的合成RNA的长度小于20bp到大约100bp。但是，本发明还可以使用所有大小的RNA，这也包括在本发明范围内。
可以通过一系列的离心步骤将合成的RNA进行分级分离，离心时使用具有确定孔径的过滤器。按照生产商的说明，将大约20mgs的pA:pU置于Centriprep YM-50，50K MWCO(Amicon，cat#4323)中进行离心过滤，在1500Xg离心15分钟。收集小于50K MW的滤进物，再将YM-50旋转两次，如上所述，收集两次的滤过物(＜50K MW)，并保留滞留物(＞50K MW)。然后将滤过物(＜50K MW)置于CentriprepYM-10，10K MWCO(Amicon，cat#4304)中，在3000Xg离心两次，每次20分钟，收集两次的滤过物(＜10K MW)，并保留滞留物(＞10K MW)。
在将大量的合成RNA材料进行分级后，将RNA材料溶解在灭菌的无内毒素的盐溶液中(如Dulbecco′s磷酸盐缓冲液[PBS]，灭菌，进行了内毒素测试，[Sigma，cat#D8537])，分别通过用于去除内毒素的柱子，如AffinitiPak Detoxi-Gel内毒素去除凝胶柱(PierceChemical，cat#20344)，收集洗脱液。然后将洗脱液通过用于去除内毒素的柱子，直到用脂多糖(LPS)浓度测量时内毒素水平低于10EU/mg。使用鲎分析方法来测量LPS(如鲎阿米巴细胞裂解物[″LAL″]显色试验[BioWhitakker，Kinetic-QCL，cat#50-650U])。
在去除内毒素之后，将基序以1∶100的比例稀释到PBS溶液中，并用Beckman DU-640分光光度计在260nm下测定已知基序浓度的PBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲液，Sigma，cat#D8537)溶液的吸光度。消光系数(“ec”)如下：
a)pA:pU，(Sigma，Lot#22K4086)：ec＝0.0601；
b)pA，(Sigma，Lot#22K4022)：ec＝0.0575＞
然后按照实施例测定上述基序的生物活性。
A.白血病细胞系
实施例5：低分子量dsRNA级分对T细胞白血病细胞系显示出细胞凋亡和细胞死亡诱导作用。
人急性T细胞白血病细胞系(Jurkat)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并在ATCC建议的下述条件下维持上述细胞系：(a)培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)连续培养：在细胞培养瓶(Corning，Corning NY，cat#430641)中培养，每3天更换一次新鲜的培养基直到培养4个月，然后开始新一轮的培养；和(c)温度：37℃，5％CO2。Jurkat细胞是一种未转化的人急性T细胞白血病细胞系，能够在体内模拟人T细胞白血病。选择性杀死上述细胞和其它白血病细胞在临床上将是非常具有价值的。
将上述T细胞白血病细胞系置于48孔板上，浓度为每孔0.4×106个细胞，大约为80％铺满，在含有FBS的培养基中使之成熟3-4天。第二天，将培养基更换为0.2mls新鲜的不含FBS的HL-1培养基。然后将已经经过内毒素测试和分级分离的dsRNA(pA:pU)(如实施例4所述)对细胞进行脉冲试验，浓度分别为10、30到100μg/ml，6小时后将培养基更换为新鲜的HL-1培养基，在37℃/5％CO2无菌条件温育过夜。然后将细胞重悬浮在冷的磷酸盐缓冲液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸盐缓冲液要缓慢加入到细胞中，然后用Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#Y-3603，终浓度为0.15μM))和溴化乙锭(Sigma，cat#46067，终浓度为1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂，溴化乙锭是一种细胞死亡指示剂。温育10分钟之后将细胞冲洗一次，悬浮在含有2％FBS的缓冲液中，冰浴保存。然后与合适的对照细胞相比较，使用合适的过滤器用FACSCalibur流式细胞计数器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析细胞对Yo-Pro和溴化乙锭的摄入情况，分析得出细胞凋亡和细胞死亡的情况。
结果显示在附图5中，该结果表明低分子量pA:pU，也就是分子量小于10kDa或大约为40个bp或小于40bp的pA:pU的混合物，在诱导人T细胞白血病细胞系中的大量细胞凋亡和细胞死亡方面显著优于高分子量的pA:pU、包含大范围碱基长度的寡核苷酸的完全pA:pU(其碱基长度从几个到几千个)和对照。尤其是较高浓度的低分子量pA:pU，如30μg/ml和100μg/ml，在诱导细胞死亡和细胞凋亡方面比较低浓度的低分子量pA:pU(10μg/ml)更加有效。
实施例6：低分子量dsRNA级分对人T淋巴细胞显示出诱导细胞凋亡和细胞死亡的作用。
人T淋巴细胞系(ATL-2)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并在ATCC建议的下述条件下维持上述细胞系：(a)培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)连续培养：在细胞培养瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培养，每3天更换一次新鲜的培养基直到培养4个月，然后开始新一轮的培养；和(c)温度：37℃，5％CO2。ATL-2细胞是一种未转化的人T细胞白血病细胞系，能够在体内模拟人T细胞白血病。选择性杀死上述细胞和其它白血病细胞在临床上将是非常具有价值的。将上述T淋巴细胞系置于48孔板上，浓度为约每孔0.4×106个细胞，大约为80％铺满，在含有FBS的培养基中使之成熟3-4天。之后，将培养基更换为不含FCS的HL-1培养基，每孔大约0.2ml，其过程如上所述，不同之处在于不含FBS。
然后用纯化和分级分离的dsRNA(pA:pU)(参见实施例4)对细胞进行脉冲试验，浓度分别为10、30到100μg/ml，6小时后将培养基更换为新鲜的HL-1培养基，在37℃/5％CO2无菌条件温育过夜。然后将细胞重悬浮在冷的磷酸盐缓冲液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸盐缓冲液要缓慢加入到细胞中，然后用Yo-Pro(MolecularProbes，Eugene，OR，cat#Y-3603，终浓度为0.15μM))和溴化乙锭(Sigma，cat#46067，终浓度为1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂，溴化乙锭是一种细胞死亡指示剂。温育10分钟之后将细胞冲洗一次，悬浮在含有2％FBS的缓冲液中，冰浴保存。然后与合适的对照细胞相比较，使用合适的过滤器用FACS Calibur流式细胞计数器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析细胞对Yo-Pro和溴化乙锭的摄入情况，分析得出细胞凋亡的情况。
结果显示在附图6中，该结果表明低分子量pA:pU，也就是分子量为10kDa或小于10kDa的pA:pU的混合物，在诱导人T淋巴细胞系的细胞凋亡和细胞死亡方面显著优于高分子量的pA:pU、完全pA:pU和对照。较高浓度的低分子量pA:pU，如100μg/ml，在诱导T淋巴细胞系细胞死亡和细胞凋亡方面显著优于较低浓度的低分子量pA:pU。
实施例7：低分子量dsRNA级分对人T淋巴母细胞显示出诱导细胞凋亡和细胞死亡的作用。
人T淋巴母细胞白血病细胞系(CEM)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并在ATCC建议的下述条件下维持上述细胞系：(a)培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)连续培养：在细胞培养瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培养，每3天更换一次新鲜的培养基直到培养4个月，然后开始新一轮的培养；和(c)温度：37℃，5％CO2。CEM细胞是一种未转化的人T淋巴母细胞白血病细胞系，能够在体内模拟人T细胞白血病。选择性杀死上述细胞和其它白血病细胞在临床上将是非常具有价值的。
将上述人T淋巴母细胞白血病细胞置于48孔板上，浓度为每孔0.4×106个细胞，大约为80％铺满，在含有FBS的培养基中使之成熟3-4天。之后，将培养基更换为不含FCS的HL-1培养基，每孔0.2ml。然后用已经经过内毒素测试和分级分离的dsRNA(pA:pU)(参见实施例4)对细胞进行脉冲试验，浓度分别为10μg/ml、30μg/ml和100μg/ml，6小时后将培养基更换为新鲜的HL-1培养基，在37℃/5％CO2无菌条件温育过夜。然后将细胞重悬浮在冷的磷酸盐缓冲液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸盐缓冲液要缓慢加入到细胞中，然后用Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#Y-3603，终浓度为0.15μM))和溴化乙锭(Sigma，cat#46067，终浓度为1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂，溴化乙锭是一种细胞死亡指示剂。温育10分钟之后将细胞冲洗一次，悬浮在含有2％FBS的缓冲液中，冰浴保存。然后与合适的对照细胞相比较，使用合适的过滤器用FACS Calibur流式细胞计数器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析细胞对Yo-Pro和溴化乙锭的摄入情况，分析得出细胞凋亡和细胞死亡的情况。
结果显示在附图7中，该结果表明低分子量pA:pU，尤其是在较高浓度下，如100μg/ml，在诱导人T淋巴母细胞白血病细胞系的细胞死亡和细胞凋亡方面显著优于对照或高分子量的pA:pU和完全pA:pU。
实施例8：低分子量dsRNA级分对人单核细胞白血病细胞显示出诱导细胞凋亡和细胞死亡的作用。
人单核细胞白血病细胞(THP-1)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并在ATCC建议的下述条件下维持上述细胞系：(a)培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)连续培养：在细胞培养瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培养，每3天更换一次新鲜的培养基直到培养4个月，然后开始新一轮的培养；和(c)温度：37℃，5％CO2。THP-1细胞是一种未转化的人单核细胞白血病细胞系，能够在体内模拟人单核细胞白血病。选择性杀死上述细胞和其它白血病细胞在临床上将是非常具有价值的。
将上述人单核细胞白血病细胞置于48孔板上，浓度为每孔0.4×106个细胞，大约为80％铺满，在含有FBS的培养基中使之成熟3-4天。之后，将培养基更换为不含FBS的HL-1培养基，每孔0.2ml。
然后用已经经过内毒素测试和分级分离的dsRNA(pA:pU)(参见实施例4)对细胞进行脉冲试验，浓度分别为10、30和100μg/ml，6小时后将培养基更换为新鲜的HL-1培养基，在37℃/5％CO2无菌条件温育过夜。然后将细胞重悬浮在冷的磷酸盐缓冲液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸盐缓冲液要缓慢加入到细胞中，然后用Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#Y-3603，终浓度为0.15μM))和溴化乙锭(Sigma，cat#46067，终浓度为1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂，溴化乙锭是一种细胞死亡指示剂。温育10分钟之后将细胞冲洗一次，悬浮在含有2％FBS的缓冲液中，冰浴保存。然后与合适的对照细胞相比较，使用合适的过滤器用FACS Calibur流式细胞计数器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析细胞对Yo-Pro和溴化乙锭的摄入情况，分析得出细胞凋亡和细胞死亡的情况。
结果显示在附图8中，该结果表明低分子量pA:pU，尤其是在100μg/ml的浓度下，在透导人单核细胞白血病细胞系中的大量细胞凋亡和细胞死亡方面显著优于对照或高分子量的pA:pU和完全pA:pU。
B：非-白血病细胞系
实施例9：低分子量和高分子量dsRNA级分成功诱导了人腺癌细胞系的细胞死亡或细胞凋亡，其速度高于对照。
人宫颈腺癌细胞系(HeLa)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并在ATCC建议的下述条件下维持上述细胞系：(a)培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)、调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)连续培养：在细胞培养瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培养，每3天更换一次新鲜的培养基直到培养4个月，然后开始新一轮的培养；和(c)温度：37℃，5％CO2。HeLa细胞是一种未转化的宫颈腺癌人细胞系，能够在体内模拟腺癌。选择性杀死腺癌和其它癌症在临床上将是非常具有价值的。
将上述人宫颈腺癌细胞系置于48孔板上，浓度为每孔0.4×106个细胞，大约为80％铺满，在含有FBS的培养基中使之成熟3-4天。之后，将培养基更换为不含FBS的HL-1培养基，每孔0.2ml。然后用已经经过内毒素测试和分级分离的dsRNA(pA:pU)(参见实施例4)对细胞进行脉冲试验，浓度为10-100μg/ml，6小时后将培养基更换为新鲜的HL-1培养基，在37℃/5％CO2无菌条件温育过夜。然后将细胞重悬浮在冷的磷酸盐缓冲液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸盐缓冲液要缓慢加入到细胞中，然后用Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#Y-3603，终浓度为0.15μM))和溴化乙锭(Sigma，cat#46067，终浓度为1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂，溴化乙锭是一种细胞死亡指示剂。温育10分钟之后将细胞冲洗一次，悬浮在含有2％FBS的缓冲液中，冰浴保存。然后与合适的对照细胞相比较，使用合适的过滤器用FACS Calibur流式细胞计数器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析细胞对Yo-Pro和溴化乙锭的摄入情况，分析得出细胞凋亡和细胞死亡的情况。
结果显示在附图9中，该结果表明低分子量pA:pU在诱导人宫颈腺癌细胞的细胞凋亡和细胞死亡方面不再优于高分子量的pA:pU或对照。
实施例10：当低分子量pA:pU的浓度为100μg/ml时，其在诱导人肺成纤维细胞中的大量细胞凋亡和细胞死亡方面显著优于高分子量pA:pU和完全pA:pU和对照。
人肺成纤维细胞(″WI38″)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并在ATCC建议的下述条件下维持上述细胞系：(a)培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)连续培养：在细胞培养瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培养，每2-3天更换一次新鲜的培养基直到培养50天，然后开始新一轮的培养；和(c)温度：37℃，5％CO2。WI38细胞是一种人肺成纤维细胞系，能够在体内模拟肺癌。选择性杀死腺癌和其它癌症在临床上将是非常具有价值的。
将上述人肺成纤维细胞置于48孔板上，浓度为每孔0.4×106个细胞，大约为80％汇合，在含有FBS的培养基中使之成熟3-4天。之后，将培养基更换为不含FCS的HL-1培养基，每孔0.2ml。然后用已经经过内毒素测试和分级分离的dsRNA(pA:pU)(参见实施例4)对细胞进行脉冲试验，浓度为10-100μg/ml，6小时后将培养基更换为新鲜的HL-1培养基，在37℃/5％CO2无菌条件温育过夜。然后将细胞重悬浮在冷的磷酸盐缓冲液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸盐缓冲液要缓慢加入到细胞中，然后用Yo-Pro(MolecularProbes，Eugene，OR，cat#y-3603，终浓度为0.15μM))和溴化乙锭(Sigma，cat#46067，终浓度为1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂，溴化乙锭是一种细胞死亡指示剂。温育10分钟之后将细胞冲洗一次，悬浮在含有2％FBS的缓冲液中，冰浴保存。然后与合适的对照细胞相比较，使用合适的过滤器用FACS Calibur流式细胞计数器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析细胞对Yo-Pro和溴化乙锭的摄入情况，分析得出细胞凋亡和细胞死亡的情况。
结果显示在附图10中，该结果表明当低分子量pA:pU的浓度为100μg/ml时，其在诱导人肺成纤维细胞中的大量细胞凋亡和细胞死亡方面显著优于高分子量pA:pU和完全pA:pU和对照。
实施例11：高分子量和低分子量的dsRNA或ssRNA均不能成功诱导人乳腺癌细胞的细胞死亡或凋亡。
人乳腺癌细胞系(SKBR-3)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并在ATCC建议的下述条件下维持上述细胞系：(a)培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)，调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)连续培养：在细胞培养瓶(Corning，CorningNY，cat#430641)中培养，每3天更换一次新鲜的培养基直到培养4个月，然后开始新一轮的培养；和(c)温度：37℃，5％CO2。
将上述人乳腺癌细胞系置于48孔板上，浓度为每孔0.4×106个细胞，大约为80％铺满，在含有FBS的培养基中使之成熟3-4天。之后，将培养基更换为不含FCS的HL-1培养基，每孔0.2ml。然后用已经经过内毒素测试和分级分离的dsRNA(pA:pU)(参见实施例4)对细胞进行脉冲试验，浓度为10-100μg/ml，6小时后将培养基更换为新鲜的HL-1培养基，在37℃/5％CO2无菌条件温育过夜。然后将细胞重悬浮在冷的磷酸盐缓冲液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸盐缓冲液要缓慢加入到细胞中，然后用Yo-Pro(MolecularProbes，Eugene，OR，cat#Y-3603，终浓度为0.15μM)和溴化乙锭(Sigma，cat#46067，终浓度为1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂，溴化乙锭是一种细胞死亡指示剂。温育10分钟之后将细胞冲洗一次，悬浮在含有2％FBS的缓冲液中，冰浴保存。然后与合适的对照细胞相比较，使用合适的过滤器用FACS Calibur流式细胞计数器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析细胞对Yo-Pro和溴化乙锭的摄入情况，分析得出细胞凋亡和细胞死亡的情况。
结果显示在附图11中，该结果低分子量pA:pU和高分子量的pA:pU，以及完全的pA:pU，与对照相比均不能成功诱导人腺癌细胞的细胞死亡。
实施例12：低分子量或高分子量的dsRNA不能以高于高分子量的ds RNA或对照的水平诱导人PBMCs的细胞死亡或细胞凋亡。
将Histopaque密度梯度培养基(Sigma，cat#1077-1)在室温下放置，并翻转几次使之混合均匀。取3mL的Histopaque加入到15ml的离心管中。取5-6mL来自人供体(供体1和2)的人血样品，轻轻铺于Histopaque培养基，然后在20℃、400xg下离心30分钟。使用灭菌的吸管，吸取白色的淋巴细胞层，尽可能不要吸取Histopaque介质和血浆污染。
然后将淋巴细胞层转移到另外一个15mL的离心管中，向淋巴细胞中加入3倍体积的PBS缓冲液。将淋巴细胞重悬浮在PBS缓冲液中，将离心管在20℃、1500RPM下离心10分钟。轻轻倾倒出上清液，然后用吸管轻轻地将淋巴细胞重悬浮。然后将离心管在20℃、1200RPM下再次离心10分钟。轻轻倾倒出上清液，然后将淋巴细胞轻轻地重悬浮在HL-1培养基中。将离心管再次在20℃、1000RPM下离心10分钟，然后重悬浮在HL-1培养基中。
然后将淋巴细胞计数，并平铺到带有HL-1培养基的48孔板上，每孔4×105个细胞。向细胞中加入分级分离的并纯化了的RNA基序(pA:pU)(参见实施例4)，终浓度分别为10、30和100μg/ml，或者LPS(大肠杆菌055：B5)，浓度为100ng/ml，然后在37℃、5％CO2条件下温育过夜。
然后将细胞重悬浮，并用溴化乙锭和/或Yo-Pro染色，过程如下：向细胞中加入100μl灭菌的冷磷酸盐缓冲液(PBS，Sigma，cat#D8537)，然后用溴化乙锭(Sigma，cat#46067，终浓度为1.5μg/ml)和/或Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#y-3603，终浓度为0.15μM)染色，其中溴化乙锭是一种细胞死亡指示剂，Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂。将细胞在冰浴中温育10分钟，然后重悬浮在含有2％FBS的PBS缓冲液中，随后与合适的对照(LPS，100ng/ml或Nil，或单纯的HL-1介质)相比较，使用合适的过滤器用FACS Calibur流式细胞计数器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析细胞对Yo-Pro和溴化乙锭的摄入情况，分析得出细胞凋亡/细胞死亡的情况。通过荧光显微镜使用合适过滤器将凋亡细胞和死亡细胞与活细胞区分开来以分析细胞，并用使用Image Pro软件(MediaCybernetics，Carlsbad，CA)的图像分析系统拍摄照片。
附图12A-12B的结果显示低分子量或高分子量dsRNA与高分子量dsRNA或对照相比，不能更有效诱导人PBMCs的细胞死亡或凋亡。
实施例13：低分子量的dsRNA级分和已知寡聚体长度的dsRNA显示出诱导单核细胞白血病细胞的细胞死亡作用。
人单核细胞白血病细胞(THP-1)来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，并在ATCC建议的下述条件下维持上述细胞系：(a)培养基：RPMI 1640培养基，含有2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen，Carlsbad，CA，cat#11875-085)、调节为含有10mM的HEPES(Invitrogen，cat#15630-080)、50单位/ml的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat#15070-063)、1.0mM的丙酮酸钠(Invitrogen，cat#11360-070)，并补加了0.05mM的2-巯基乙醇(Invitrogen，cat#21985-023)、10％的胎牛血清(FBS)(Invitrogen，cat#26170-019)；(b)连续培养：在细胞培养瓶(Corning，Corning NY，cat#430641)中培养，每3天更换一次新鲜的培养基直到培养4个月，然后开始新一轮的培养；和(c)温度：37℃，5％CO2。THP-1细胞是一种未转化的人单核细胞白血病细胞系，能够在体内模拟人单核细胞白血病。选择性杀死上述细胞和其它白血病细胞在临床上将是非常具有价值的。
将上述人单核细胞白血病细胞置于48孔板上，浓度为每孔0.4×106个细胞，大约为80％铺满，在含有FBS的培养基中使之成熟3-4天。之后，将培养基更换为不含FBS的HL-1培养基，每孔0.2ml。
然后用已经经过内毒素测试的完全和分级分离的低分子量(＜10kMW)ds RNA(pA:pU)(参见实施例4)，浓度为100μg/ml，以及腺苷酸(Sigma，cat#A-1752)或尿苷酸(Sigma，cat#U-1752)的50、100、200和400μg/ml的灭菌PBS溶液，或者是5聚体、10聚体或20聚体退火核苷酸(寡聚体)长度的polyA:polyU(Ambion，Austin TX)的50、100、200和400μg/ml的灭菌PBS溶液，对细胞进行脉冲试验。另外分别以LPS(200ng/ml)或HL-1培养基作为对照。将样品在37℃/5％CO2无菌条件温育过夜。然后将细胞重悬浮在冷的磷酸盐缓冲液中(PBS，Sigma，cat#D8537)，其中磷酸盐缓冲液要缓慢加入到细胞中，然后用Yo-Pro(Molecular Probes，Eugene，OR，cat#Y-3603，终浓度为0.15μM))和溴化乙锭(Sigma，cat#46067，终浓度为1.5μg/ml)染色，其中Yo-Pro是一种细胞凋亡指示剂，溴化乙锭是一种细胞死亡指示剂。温育10分钟之后将细胞冲洗一次，悬浮在含有2％FBS的缓冲液中，冰浴保存。然后与合适的对照细胞相比较，使用合适的过滤器用FACS Calibur流式细胞计数器(BD Bioscience，San Jose，CA)分析细胞对Yo-Pro和溴化乙锭的摄入情况，分析得出细胞凋亡的情况。
结果显示在附图13中，该结果表明当低分子量pA:pU的浓度为100μg/ml时，正如前面所显示的，能够诱导细胞的大量坏死性细胞死亡，当5聚体pA:pU的浓度为200μg或400μg时，所诱导的坏死性细胞死亡的量较高，并且显著高于10聚体或20聚体pA:pU、腺苷酸或尿苷酸或对照所诱导的细胞死亡。上述结果还表明，腺苷酸单体或尿苷酸单体仅显示出背景水平的细胞坏死活性，因此起始的pA:pU寡聚体形式是重要的。另外，低分子量(＜10k MW)pA:pU寡聚体的长度应当小于10聚体，只有这样才预期具有细胞坏死活性。

Claims (37)

1.一种通过给细胞施用RNA链，从而诱导患者中转化或非转化细胞凋亡或细胞死亡的方法。
2.权利要求1所述的方法，其中所述RNA链的平均大小为1kDa至50kDa。
3.权利要求1所述的方法，其中所述RNA链是dsRNA。
4.权利要求1所述的方法，其中所述RNA链是ssRNA。
5.权利要求3所述的方法，其中所述dsRNA是pA∶pU。
6.权利要求5所述的方法，其中所述dsRNA是静脉内施用，施用剂量是1-999μg/kg。
7.权利要求3所述的方法，其中所述dsRNA施用给患者的浓度范围是1-500μg/kg。
8.权利要求1所述的方法，其中所述患者是人，细胞是癌细胞，dsRNA是pA∶pU，并且dsRNA是直接注射到癌细胞。
9.权利要求4所述的方法，其中ssRNA是pA。
10.权利要求1所述的方法，其中转化细胞选自：T细胞白血病细胞、人单核细胞白血病细胞、人腺癌细胞和人肺成纤维细胞。
11.一种通过给细胞施用ssRNA或dsRNA，从而诱导细胞死亡或凋亡的方法，其中所述ssRNA或dsRNA的平均大小小于20kDa。
12.权利要求11所述的方法，其中ssRNA或dsRNA的平均大小小于10kDa。
13.权利要求12所述的方法，其中所述细胞是转化细胞。
14.权利要求12所述的方法，其中所述ssRNA是pA。
15.权利要求11所述的方法，其中所述dsRNA是pA∶pU。
16.权利要求12所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
17.权利要求1所述的方法，其中所述RNA链诱导增强的细胞因子TNF-α的产生，并由此介导了对所述细胞的T1免疫反应。
18.权利要求12所述的方法，其中所述RNA链诱导增强的细胞因子TNF-α的产生，并由此介导了对所述细胞的T1免疫反应。
19.权利要求1所述的方法，其中使用RNA诱导细胞死亡，诱导增强的对所述细胞的免疫反应。
20.权利要求1所述的方法，其中所述RNA是体内施用给细胞，施用方式选自：局部施用、系统施用或直接注射。
21.一种通过给细胞施用ssRNA或dsRNA，从而诱导细胞凋亡的方法，其中所述ssRNA或dsRNA的大小小于10kDa。
22.权利要求21所述的方法，其中所述RNA是ssRNA，并且是pA。
23.权利要求21所述的方法，其中所述RNA是dsRNA，并且是pA∶pU。
24.权利要求21所述的方法，其中所述细胞是转化细胞。
25.权利要求21所述的方法，其中所述诱导的凋亡细胞诱导增强的IL-12细胞因子的产生。
26.权利要求21所述的方法，其中诱导了Th-1反应。
27.权利要求1所述的方法，其中所述RNA是dsRNA，其分子量大于50kDa，并且诱导增强的IL-12反应。
28.一种用于诱导患者中转化细胞中的细胞死亡或凋亡的组合物，其中所述组合物由平均分子量为1-50kDa的dsRNA组成。
29.权利要求28所述的组合物，其中所述dsRNA的平均分子量小于20kDa。
30.权利要求28所述的组合物，其中所述dsRNA的平均分子量小于10kDa。
31-权利要求28所述的组合物，其中所述ds RNA是pA∶pU。
32.权利要求28所述的组合物，其中所述dsRNA诱导增强的细胞因子TNF-α的产生。
33.一种用于诱导转化细胞中的细胞死亡或凋亡的组合物，其中所述组合物由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸由至少两个选自腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤和肌苷的碱基对组成，并且所述寡核苷酸的分子量为1kDa-50kDa。
34.权利要求33所述的组合物，其中所述寡核苷酸是ssRNA。
35.权利要求33所述的组合物，其中所述寡核苷酸是dsRNA。
36.权利要求33所述的组合物，其中所述ssRNA是pA。
37.权利要求35所述的组合物，其中所述寡核苷酸是pA∶pU。
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