TWI802584B - 具有經修飾之磷脂酶區域的腺相關病毒(aav) - Google Patents

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Abstract

本發明大體上係關於來自除血清型2以外之血清型的經修飾之腺相關病毒(AAV)，其具有病毒衣殼蛋白，該病毒衣殼蛋白具有相對於對應的野生型序列被修飾之子單元1(VP1)序列。特定言之，本發明之經修飾之AAV包含磷脂酶A2 (PLA2)區域內之胺基酸取代及相對於對應的野生型序列之側接序列，其在於昆蟲細胞中產生時改良AAV之功能性。本發明亦係關於產生經修飾之AAV之方法、其對應試劑、用於產生該等經修飾之AAV之桿狀病毒表現系統以及昆蟲細胞。

Description

具有經修飾之磷脂酶區域的腺相關病毒(AAV)
相關申請案之交叉參考 本申請案主張2017年8月31日申請之美國臨時申請案第62/553,028號之權利，其以全文引用之方式併入本文中。 經由EFS-WEB以電子方式提交之序列表之參考
本申請案包括經由EFS-Web以電子方式提交之序列表(名稱：「4226.006PC01_Sequence_Listing_ST25.txt」；尺寸：100,400個位元組；且創建於：2018年8月22日)，其以全文引用之方式併入本文中。
發明領域 本發明大體上係關於具有病毒衣殼蛋白(viral capsid protein)之腺相關病毒(AAV)，該病毒衣殼蛋白具有經修飾之磷脂酶區域，及在昆蟲細胞中使用桿狀病毒表現系統產生該等腺相關病毒之方法。
發明背景 腺相關病毒(AAV)為一種最具有前景的用於人類基因療法之病毒載體。AAV含有約4.7 kb之ssDNA基因組，其表現二個ORF；一個編碼病毒包衣蛋白質VP1、VP2及VP3以及組裝相關蛋白質(Assembly Associated Protein)或組裝活化蛋白質(Assembly Activated Protein，AAP)，且第二個編碼四種病毒複製酶組分；ORF由二個反向末端重複序列(ITR)側接。ITR由病毒rep蛋白質識別，其中ITR在初生病毒蛋白殼中之新近合成之基因組之基因組複製及負載方面起重要作用。重組型AAV粒子可使用載體製備，其中在二個ITR之間選殖感興趣的基因(Gene of Interest，GOI)且以反式方式提供病毒病毒性cap及rep蛋白質。
重組型AAV粒子保留有效感染分裂以及未分裂之人類細胞之能力。認為病毒粒子進入細胞核，其中基因組以游離基因體形式存留且長期(數月至數年)持續表現重組型載體中之任何轉基因。重要的是，即使AAV感染為常見的，但通常不認為病毒與任何疾病相關聯。此外，存在許多AAV血清型，通常稱為血清型1-12，其在其組織向性方面不同。鑒於此等優點，在許多人類疾病之基因療法臨床試驗中評估重組型腺相關病毒(rAAV)。
存在二種主要類型之重組型AAV產生系統：(1)使用哺乳動物細胞株(例如HEK293細胞、COS細胞、HeLa細胞、KB細胞)之習知產生系統；及(2)最近，使用昆蟲細胞之產生系統。
哺乳動物產生系統通常涉及三重轉染，其中三種質體轉染至哺乳動物細胞株中，此等質體編碼i)AAV rep及包衣蛋白質，ii)來源於腺病毒之輔助細胞功能以及iii)由ITR側接之感興趣的基因。AAV rep及ITR序列通常來源於AAV2血清型以及CAP序列，但來自其他血清型之序列可經取代以產生假模式化病毒粒子，病毒衣殼蛋白之該等反映所需組織向性。
哺乳動物產生系統具有若干缺陷。用於治療用途之最重要的缺點為與黏著性哺乳動物細胞之大規模轉染相關的難點以及隨之而來的AAV產生系統之不良可縮放性。此外，存在哺乳動物細胞培養物中產生之用於臨床用途之載體將受哺乳動物宿主細胞中之不合需要的且可能病原性物質污染之風險。
作為哺乳動物產生系統之替代方案，昆蟲細胞可用於使用桿狀病毒載體產生AAV。桿狀病毒感染昆蟲細胞，桿狀病毒在昆蟲細胞中以游離方式複製且經由使用桿狀病毒衍生之啟動子，可驅動受感染細胞中極高程度之轉基因表現。通常，昆蟲細胞由二種重組型桿狀病毒共同感染，一種表現AAV cap及rep蛋白質且第二種含有由ITR側接之GOI，病毒輔助細胞功能並非必需的。
使用昆蟲細胞產生AAV之主要優勢為可縮放性，因為昆蟲細胞適於在無補充劑(諸如胎牛血清)之情況下在懸浮液培養物中生長。然而,昆蟲細胞產生系統亦具有若干缺陷，包括難以實現三種AAV衣殼蛋白質(VP1、VP2及VP3)之正確化學計量、桿狀病毒表現載體之傳代不穩定性以及最顯著的，與在習知哺乳動物細胞中產生之對應的AAV相比，所得AAV之低功能性。
在昆蟲細胞中產生之AAV之功能性視AAV血清型而變化。舉例而言，Urabe等人. (2006)J. Virol. 80(4):1874-1885報導在昆蟲細胞中之桿狀病毒系統中產生之AAV5粒子與在相同系統中產生之AAV2相比具有弱活性。因為認識到當由昆蟲細胞中之桿狀病毒表現系統產生時，AAV2保持其病毒衣殼蛋白之子單元1(VP1)中的磷脂酶區域(PLA)之活性，藉此使得病毒能夠脫離核內體隔室且到達細胞質。Urabe等人藉由構築嵌合型AAV2/5VP1蛋白質來部分解決此問題，其中AAV5 VP1之具有至少49個胺基酸之N端部分由AAV2 VP1之對應的部分置換，以改良病毒粒子之功能性。然而，鑒於對在人類基因療法中使用AAV之興趣，此項技術中仍需要用於在昆蟲細胞中產生重組型AAV (自除AAV2以外之血清型)之替代性及/或改良方法，其中AAV能夠在細胞內化之後脫離核內體。
應理解，本文中所包括之公開文獻、法規、材料、裝置、物件或其類似物之任何論述係僅用於提供本發明之說明的目的。其不應視為承認由於任何或所有此等事項在本申請案之任何申請專利範圍之優先權日期之前存在而成為本發明相關領域中之公共常識。
發明概要 本發明係基於本發明人意外發現，由昆蟲細胞中之桿狀病毒表現系統產生的來自除血清型2以外的血清型之AAV之核內體脫離活性可藉由在磷脂酶區域及側接區域內進行胺基酸取代來恢復或改良。特定言之，本發明人首次證實有可能藉由用對應的位置處的來自AAV血清型2之胺基酸取代多達六個殘基位置處的胺基酸來恢復或改良二種代表性AAV血清型(血清型8及9)之核內體脫離活性。在此方面，本發明人證實無需用AAV2之區域交換整個PLA區域即可產生嵌合型AAV，亦無需產生表現包含野生型VP1/PLA序列及AAV2之此類序列(例如AAV2/WT VP1)的嵌合體蛋白殼之AAV(迄今為止用於改良在昆蟲細胞中產生之AAV之功能性之策略)。因此，本發明人提供一種新穎方法，其可恢復或改良在昆蟲細胞中產生之重組型非血清型2 AAV之核內體脫離活性，而無需置換各別AAV之野生型病毒衣殼蛋白內的整個區域及/或子單元序列。
因此，本發明提供一種核酸分子，其包含編碼腺相關病毒(AAV)病毒衣殼蛋白之聚核苷酸序列，其中病毒衣殼蛋白包含經修飾之子單元1(VP1)(VP1)序列，該經修飾之子單元1(VP1)序列包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸及位置64處之離胺酸，其中胺基酸位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被定義，其中在位置1、26、40、43、44以及64中之任一或多者處之胺基酸係相對於對應的野生型序列被修飾，且其中除了在位置1、26、40、43、44及64處中之任一或多者的該等胺基酸以外，沒有其他胺基酸係相對於該對應的野生型序列被修飾。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型1。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型3。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型4。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型5。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型6。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型7。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型8。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型9。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型10。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型11。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型12。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型13。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係選自於由下列所構成之群組： (i) 來自AAV1之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:15中所闡述之序列； (ii) 來自AAV3之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:16中所闡述之序列； (iii) 來自AAV4之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:17中所闡述之序列； (iv) 來自AAV5之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:18中所闡述之序列； (v) 來自AAV6之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:19中所闡述之序列； (vi) 來自AAV7之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:20中所闡述之序列； (vii) 來自AAV8之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列； (viii) 來自AAV9之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:22中所闡述之序列； (ix) 來自AAV10之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:23中所闡述之序列； (x) 來自AAV11之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:24中所闡述之序列； (xi) 來自AAV12之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:25中所闡述之序列；以及 (xii) 來自AAV13之病毒衣殼蛋白，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:26中所闡述之序列；
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV1，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:15中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV3，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:16中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV4，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:17中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV5，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:18中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV6，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:19中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV7，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:20中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV8，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV9，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:22中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV10，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:23中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV11，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:24中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV12，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:25中所闡述之序列。
在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV13，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:26中所闡述之序列。
在前述實例中之每一者中，病毒衣殼蛋白可包含來自與經修飾之VP1相同的AAV血清型之子單元2 (VP2)及子單元3 (VP3)。
在一個實例中，編碼AAV病毒衣殼蛋白之核苷酸序列可操作地連接至一用於在昆蟲細胞中表現的啟動子。在一個實例中，啟動子為多角體啟動子(polyhedron promoter)。在另一實例中，啟動子為p10啟動子。
核酸分子亦可包含聚核苷酸序列，其編碼至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAV複製(Rep )蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAVRep 蛋白質。在一個實例中，核酸分子包含編碼Rep78及Rep52之聚核苷酸序列。在一個實例中，核酸分子包含編碼Rep78及Rep40之聚核苷酸序列。在一個實例中，核酸分子包含編碼Rep68及Rep52之聚核苷酸序列。在一個實例中，核酸分子包含編碼Rep68及Rep40之聚核苷酸序列。在一個實例中，核酸分子包含編碼Rep78、Rep68、Rep52及Rep40之聚核苷酸序列。在前述實例中之每一者中，Rep 蛋白質可來自與病毒衣殼蛋白相同的AAV血清型。或者，Rep 蛋白質可來自與病毒衣殼蛋白之血清型不同的AAV血清型，例如Rep蛋白質可來自AAV血清型2。
編碼Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至一用於在昆蟲細胞中表現Rep 蛋白質的啟動子。在一個實例中，編碼Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至多角體啟動子。在一個實例中，編碼Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至p10啟動子。
在前述實例中之每一者中，核酸分子可包含編碼組裝活化蛋白質(AAP)之聚核苷酸。舉例而言，AAP可由與編碼病毒衣殼蛋白之開放閱讀框架不同的開放閱讀框架編碼。
本發明亦提供包含如本文中所描述之核酸分子之桿狀病毒載體。 本發明亦提供複數個桿狀病毒載體，其包含： (i) 第一桿狀病毒載體，其包含如本文所描述之核酸分子，其中核酸分子編碼AAV病毒衣殼蛋白及Rep 蛋白質，如本文中所描述；及 (ii) 第二桿狀病毒載體，其包含編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸。
在一個實例中，AAV ITR序列與病毒衣殼蛋白來自相同血清型。在另一實例中，AAV ITR序列來自除病毒衣殼蛋白之血清型以外的血清型。在一個特定實例中，AAV ITR序列係來自AAV血清型2。
本發明亦提供複數個桿狀病毒載體，其包含： (i) 第一桿狀病毒載體，其包含如本文所描述之核酸分子，其中核酸分子編碼如本文中所描述之AAV病毒衣殼蛋白； (ii) 第二桿狀病毒載體，其包含聚核苷酸序列，該聚核苷酸序列編碼至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAV複製(Rep )蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAV Rep蛋白質；以及 (iii) 第三桿狀病毒載體，其包含編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸。
在一個實例中，第二桿狀病毒載體包含編碼Rep78及Rep52之聚核苷酸序列。在一個實例中，第二桿狀病毒載體包含編碼Rep78及Rep40之聚核苷酸序列。在一個實例中，第二桿狀病毒載體包含編碼Rep68及Rep52之聚核苷酸序列。在一個實例中，第二桿狀病毒載體包含編碼Rep68及Rep40之聚核苷酸序列。在一個實例中，第二桿狀病毒載體包含編碼Rep78、Rep68、Rep52及Rep40之聚核苷酸序列。在前述實例中之每一者中，Rep 蛋白質可來自與由第一桿狀病毒載體中之核酸分子編碼之病毒衣殼蛋白相同的AAV血清型。或者，Rep 蛋白質可來自與由第一桿狀病毒載體中之核酸分子編碼的病毒衣殼蛋白之血清型不同的AAV血清型，例如Rep蛋白質可來自AAV血清型2。
在前述實例中之每一者中，編碼第二桿狀病毒載體內之Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至一用於在昆蟲細胞中表現Rep 蛋白質的啟動子。在一個實例中，編碼第二桿狀病毒載體內之Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至多角體啟動子。在一個實例中，編碼第二桿狀病毒載體內之Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至p10啟動子。
在一個實例中，第三桿狀病毒載體包含AAV ITR序列，其與由第一桿狀病毒載體中之核酸分子編碼之病毒衣殼蛋白來自相同血清型。在另一實例中，第三桿狀病毒載體包含AAV ITR序列，其來自除由第一桿狀病毒載體中之核酸分子編碼的病毒衣殼蛋白之血清型以外的血清型。在一個特定實例中，AAV ITR序列係來自AAV血清型2。
桿狀病毒載體中之至少一者包含編碼AAV之組裝活化蛋白質(AAP)之聚核苷酸。在一個實例中，AAP可由第一桿狀病毒載體內所包含之聚核苷酸序列編碼。在一個實例中，AAP可由第二桿狀病毒載體內所包含之聚核苷酸序列編碼。在另一實例中，AAP可由第三桿狀病毒載體內所包含之聚核苷酸序列編碼。
本發明亦提供一種昆蟲細胞，其包含如本文中所描述之核酸。
本發明亦提供一種昆蟲細胞，其包含如本文中所描述之桿狀病毒載體或複數個桿狀病毒載體。
在一個實例中，編碼AAV病毒衣殼蛋白之聚核苷酸序列及/或編碼Rep 蛋白質之聚核苷酸序列係由游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現。
或者或另外，編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸係由游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現。
本發明亦提供一種用於在昆蟲細胞中產生腺相關病毒(AAV)之方法，其包含： (i) 在培養基中，在足以使細胞產生AAV之條件下培養如本文中所描述之昆蟲細胞；及任擇地 (ii) 自培養基及/或細胞回收AAV。
本發明亦提供一種用於在昆蟲細胞中產生腺相關病毒(AAV)之方法，其包含： (i) 用以下共同感染昆蟲細胞：第一桿狀病毒，其具有包含本文中所描述之核酸分子之基因組，該第一桿狀病毒編碼如本文中所描述之AAV病毒衣殼蛋白及Rep 蛋白質；及第二桿狀病毒，其具有包含聚核苷酸之基因組，該聚核苷酸編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之感興趣的蛋白質或RNA，例如來自AAV血清型2之ITR序列； (ii) 在培養基中，在足以使細胞產生AAV之條件下，培養在(i)中用桿狀病毒感染之昆蟲細胞；以及任擇地 (iii) 自培養基及/或細胞回收AAV。
在一個實例中，產生AAV之方法包含自培養基及/或細胞回收AAV。在另一實例中，產生AAV之方法包含自培養基及/或細胞回收AAV且接著純化AAV。在一個實例中，自細胞回收AAV。在一個實例中，自培養基回收AAV。在一個實例中，自細胞及培養基回收AAV。
第一及第二桿狀病毒中之至少一者之基因組將包含編碼AAV之組裝活化蛋白質(AAP)之聚核苷酸。在一個實例中，AAP可由第一桿狀病毒之基因組內所包含之聚核苷酸序列編碼。在一個實例中，AAP可由第二桿狀病毒之基因組內所包含之聚核苷酸序列編碼。
本發明亦提供一種用於在昆蟲細胞中產生腺相關病毒之方法，其包含： (i) 用以下共同感染昆蟲細胞：第一桿狀病毒，其具有包含如本文所描述之核酸分子之基因組，其中核酸分子編碼如本文中所描述之AAV病毒衣殼蛋白；第二桿狀病毒，其具有包含聚核苷酸序列之基因組，該聚核苷酸序列編碼至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAV複製(Rep )蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAV Rep蛋白質；以及第三桿狀病毒，其具有包含聚核苷酸之基因組，該聚核苷酸編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之感興趣的蛋白質或RNA； (ii) 在培養基中，在足以使細胞產生AAV之條件下，培養在(i)中用桿狀病毒感染之昆蟲細胞；以及任擇地 (iii) 自培養基及/或細胞回收AAV。
在一個實例中，用於感染昆蟲細胞之第二桿狀病毒載體包含編碼Rep78及Rep52之聚核苷酸序列。在一個實例中，用於感染昆蟲細胞之第二桿狀病毒載體包含編碼Rep78及Rep40之聚核苷酸序列。在一個實例中，用於感染昆蟲細胞之第二桿狀病毒載體包含編碼Rep68及Rep52之聚核苷酸序列。在一個實例中，用於感染昆蟲細胞之第二桿狀病毒載體包含編碼Rep68及Rep40之聚核苷酸序列。在一個實例中，用於感染昆蟲細胞之第二桿狀病毒載體包含編碼Rep78、Rep68、Rep52及Rep40之聚核苷酸序列。在前述實例中之每一者中，Rep 蛋白質可來自與由第一桿狀病毒載體中之核酸分子編碼之病毒衣殼蛋白相同的AAV血清型。或者，Rep 蛋白質可來自與由第一桿狀病毒載體中之核酸分子編碼的病毒衣殼蛋白之血清型不同的AAV血清型，例如Rep蛋白質可來自AAV血清型2。
在前述實例中之每一者中，編碼第二桿狀病毒載體內之Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至一用於在昆蟲細胞中表現Rep 蛋白質的啟動子。在一個實例中，編碼第二桿狀病毒載體內之Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至多角體啟動子。在一個實例中，編碼第二桿狀病毒載體內之Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至p10啟動子。
在一個實例中，用於感染昆蟲細胞之第三桿狀病毒載體包含AAV ITR序列，其來自與由第一桿狀病毒載體中之核酸分子所編碼之病毒衣殼蛋白相同的血清型。在另一實例中，用於感染昆蟲細胞之第三桿狀病毒載體包含AAV ITR序列，其來自除由第一桿狀病毒載體中之核酸分子編碼的病毒衣殼蛋白之血清型以外的血清型。在一個特定實例中，AAV ITR序列係來自AAV血清型2。
在一個實例中，由第二桿狀病毒載體之基因組編碼之Rep 蛋白質及由第三桿狀病毒載體之基因組編碼之ITR序列係來自AAV血清型2。
第一、第二及第三桿狀病毒中之至少一者之基因組將包含編碼AAV之組裝活化蛋白質(AAP)之聚核苷酸。在一個實例中，AAP可由第一桿狀病毒之基因組內所包含之聚核苷酸序列編碼。在一個實例中，AAP可由第二桿狀病毒之基因組內所包含之聚核苷酸序列編碼。在一個實例中，AAP可由第三桿狀病毒之基因組內所包含之聚核苷酸序列編碼。
在一個實例中，產生AAV之方法包含自培養基及/或細胞回收AAV。在另一實例中，產生AAV之方法包含自培養基及/或細胞回收AAV且接著純化AAV。在一個實例中，自細胞回收AAV。在一個實例中，自培養基回收AAV。在一個實例中，自細胞及培養基回收AAV。
本發明亦提供藉由本文中所描述之方法製造之腺相關病毒(AAV)。
亦提供包含病毒衣殼蛋白之腺相關病毒(AAV)，該病毒衣殼蛋白包含經修飾之子單元1(VP1)(VP1)序列，該經修飾之子單元1(VP1)序列包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸、位置64處之離胺酸，其中胺基酸位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被定義，其中位置1、26、40、43、44及64中之任一或多者處之胺基酸係相對於對應的野生型序列被修飾，且其中除了在位置1、26、40、43、44及64處中之任一或多者的該等胺基酸以外，沒有其他胺基酸係相對於該對應的野生型序列被修飾。
在一個實例中，位置1、26、40、43、44及64中之任二者或更多者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。在一個實例中，位置1、26、40、43、44及64中之任三者或更多者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。在一個實例中，位置1、26、40、43、44及64中之任四者或更多者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。在一個實例中，位置1、26、40、43、44及64中之任五者或更多者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。在一個實例中，位置1、26、40、43、44及64中之每一者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。
本文中已描述包含經修飾之VP1序列之病毒衣殼蛋白，且除非另外具體說明，否則其任何實例應在細節上作必要修改後適用於本發明之AAV。
在一個實例中，AAV係選自於由下列所構成之群組： (i) AAV血清型1，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:15中所闡述之序列； (ii) AAV血清型3，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:16中所闡述之序列； (iii) AAV血清型4，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:17中所闡述之序列； (iv) AAV血清型5，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:18中所闡述之序列； (v) AAV血清型6，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:19中所闡述之序列； (vi) AAV血清型7，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:20中所闡述之序列； (vii) AAV血清型8，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列； (viii) AAV血清型9，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:22中所闡述之序列； (ix) AAV血清型10，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:23中所闡述之序列； (x) AAV血清型11，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:24中所闡述之序列； (xi) AAV血清型12，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:25中所闡述之序列；以及 (xii) AAV血清型13，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:26中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型1，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:15中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型3，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:16中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型4，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:17中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型5，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:18中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型6，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:19中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型7，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:20中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型8，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型9，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:22中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型10，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:23中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型11，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:24中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型12，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:25中所闡述之序列。
在一個實例中，AAV為AAV血清型13，其中經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:26中所闡述之序列。
本發明亦提供改良來自除在昆蟲細胞中產生之血清型2以外的血清型之腺相關病毒(AAV)之官能基，其包含藉由僅取代位置1、26、40、43、44及64處之一或多個胺基酸來相對於對應的野生型序列修飾AAV之病毒衣殼蛋白內之VP1序列，其中殘基位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被測定，使得病毒衣殼蛋白包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸及位置64處之離胺酸，且其中AAV相對於未經修飾且在昆蟲細胞中產生之對應的野生型AAV具有經改良之功能性。AAV之經改良之功能將較佳歸因於經改良之AAV在內化後脫離細胞之核內體隔室之能力，亦即經改良之核內體脫離活性。本文中已描述包含經修飾之VP1序列之AAV病毒衣殼蛋白，且除非另外具體說明，否則其任何實例應在細節上作必要修改後適用於本文中所描述之用於產生其之方法。
在一個實例中，該方法包含相對於如本文中所描述之對應的野生型序列修飾位置1、26、40、43、44及64處之任二個或更多個胺基酸。在一個實例中，該方法包含相對於如本文中所描述之對應的野生型序列修飾位置1、26、40、43、44及64處之任三個或更多個胺基酸。在一個實例中，該方法包含相對於如本文中所描述之對應的野生型序列修飾位置1、26、40、43、44及64處之任四個或更多個胺基酸。在一個實例中，該方法包含相對於如本文中所描述之對應的野生型序列修飾位置1、26、40、43、44及64處之任五個或更多個胺基酸。在一個實例中，該方法包含相對於如本文中所描述之對應的野生型序列修飾位置1、26、40、43、44及64處之胺基酸。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得： (i) 當AAV係血清型1時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:15中所闡述之序列； (ii) 當AAV係血清型3時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:16中所闡述之序列； (iii) 當AAV係血清型4時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:17中所闡述之序列； (iv) 當AAV係血清型5時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:18中所闡述之序列； (v) 當AAV係血清型6時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:19中所闡述之序列； (vi) 當AAV係血清型7時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:20中所闡述之序列； (vii) 當AAV係血清型8時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列； (viii) 當AAV係血清型9時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:22中所闡述之序列； (ix) 當AAV係血清型10時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:23中所闡述之序列； (x) 當AAV係血清型11時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:24中所闡述之序列； (xi) 當AAV係血清型12時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:25中所闡述之序列；以及 (xii) 當AAV係血清型13時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:26中所闡述之序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV1之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:15中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV3之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:16中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV4之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:17中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV5之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:18中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV6之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:19中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV7之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:20中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV8之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV9之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:22中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV10之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:23中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV11之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:24中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV12之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:25中所闡述之序列之VP1序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV13之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:26中所闡述之序列之VP1序列。
序列表之重要說明
SEQ ID NO:1：AAV血清型之經修飾之共同VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:2：AAV血清型1之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:3：AAV血清型2之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:4：AAV血清型3之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:5：AAV血清型4之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:6：AAV血清型5之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:7：AAV血清型6之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:8：AAV血清型7之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:9：AAV血清型8之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:10：AAV血清型9之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:11：AAV血清型10之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:12：AAV血清型11之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:13：AAV血清型12之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:14：AAV血清型13之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:15：AAV血清型1之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:16：AAV血清型3之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:17：AAV血清型4之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:18：AAV血清型5之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:19：AAV血清型6之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:20：AAV血清型7之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:21：AAV血清型8之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:22：AAV血清型9之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:23：AAV血清型10之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:24：AAV血清型11之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:25：AAV血清型12之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:26：AAV血清型13之經修飾之VP1子序列，其包含PLA2區域及側接序列。
SEQ ID NO:27：AAV血清型1之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:28：AAV血清型2之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:29：AAV血清型3之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:30：AAV血清型4之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:31：AAV血清型5之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:32：AAV血清型6之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:33：AAV血清型7之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:34：AAV血清型8之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:35：AAV血清型9之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:36：AAV血清型10之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:37：AAV血清型11之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:38：AAV血清型12之VP1胺基酸序列。
SEQ ID NO:39：AAV血清型13之VP1胺基酸序列。
較佳實施例之詳細說明 一般說明 遍及本說明書，除非另外具體說明或上下文需要，否則對單一步驟、特徵、物質之組成、步驟組或特徵組或物質之組合物的參考應視為涵蓋一種及複數種(亦即一或多種)此等步驟、特徵、物質組成、步驟組或特徵組或物質之組合物。
熟習此項技術者將瞭解，本發明易於進行除特定描述以外之變化及修改。應理解，本發明包括所有此類變化及修改。本發明亦包括在本說明書中單獨或共同地參考或指示之所有步驟、特徵、組合物及化合物，及該等步驟或特徵之任何及所有組合或任二者或更多者。
本發明不限於本文中所描述之特定實例的範疇，該等特定實例僅欲用於範例之目的。功能上等效之產物、組合物及方法明確屬於本發明之範疇內。
除非另外具體說明，否則本文中本發明之任何實例應在細節上作必要修改後適用於本發明之任何其他實例。
除非另外具體定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語將視為具有與一般熟習此項技術者通常理解之含義相同的含義(例如在細胞培養、分子遺傳、免疫學、免疫組織化學、蛋白質化學及生物化學中)。
除非另有指示，否則本發明中所用之重組型DNA、重組型蛋白質、細胞培養物及免疫技術為熟習此項技術者所熟知之標準程序。此類技術描述及說明於諸如以下之來源的文獻通篇中：J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T.A. Brown (編者), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, 第1及2卷, IRL Press (1991)、D.M. Glover及B.D. Hames (編者), DNA Cloning: A Practical Approach, 第1-4卷, IRL Press (1995及1996)以及F.M. Ausubel等人(編者), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 包括至今所有更新)、Ed Harlow及David Lane (編者) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)以及J.E. Coligan等人(編者) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (包括至今所有更新)。
遍及本說明書，除非本文另有規定，否則字組「包含(comprise)」或諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」之變型應理解為暗示包涵所陳述之一個步驟或要素或整數或者一組步驟或要素或整數，但不排除任何其他步驟或要素或整數或者其他組要素或整數。
術語「及/或(and/or)」，例如「X及/或Y(X and/or Y)」應理解為意謂「X及Y」或「X或Y」且應用於為二種含義或任一含義提供明確支持。 所選擇之定義
如本文中所使用，術語「腺相關病毒」或「AAV」係關於細小病毒科(Parvoviridae family)內之病毒組，其含有短(約4.7 kb)單股DNA基因組且其取決於輔助病毒之存在，諸如用於其複製之腺病毒。本發明亦涵蓋來源於AAV之載體，亦即基因轉移工具。
如本文中所使用，術語「血清型」，如在AAV之上下文中所用，為一種區別，其用於指AAV具有在血清學上與其他AAV血清型不同之衣殼。血清型差異係基於與另一種AAV相比，抗體與一種AAV之間缺乏交叉反應性來測定。此類交叉反應性差異通常歸因於衣殼蛋白質序列/抗原決定子之差異(例如歸因於AAV血清型之VP1、VP2及/或VP3序列差異)。
如本文中所使用，在AAV之情形下，術語「病毒衣殼蛋白」、「衣殼蛋白質」、「衣殼多肽」或類似術語係指具有自行組裝以產生AAV粒子之蛋白質殼之活性的AAV之多肽，亦稱為鞘蛋白或VP蛋白質。其包含三個子單元，VP1、VP2及VP3，其通常由單個核酸分子表現，且其共同相互作用以形成具有二十面體對稱性之衣殼。AAV之衣殼結構描述於BERNARD N. FIELDS等人, VIROLOGY, 第2卷, 第69及70章 (第4版, Lippincott-Raven Publishers)中。
如本文所使用，術語「可操作地連接」或「可操作連接」(或類似術語)係指聚核苷酸元件在功能性關係方面的連接。當核酸或聚核苷酸序列置於與另一核酸序列之功能關係中時，其為「可操作地連接」。舉例而言，若轉錄調節序列(例如啟動子、強化子或此項技術中公認的其他表現控制元件)影響編碼序列之轉錄，則該轉錄調節序列可操作地連接至該編碼序列。
如本文所使用，術語「啟動子」通常指一種DNA序列，其涉及DNA依賴性RNA聚合酶及其他蛋白質(反式作用轉錄因子)之識別及結合以起始及控制一或多種編碼序列之轉錄，且通常係相對於轉錄方向位於編碼序列之上游。
如本文所使用，複數或單數形式之術語「反向末端重複」或「ITR」係指位於載體之一個末端之序列，其在與位於載體之相對末端之互補序列組合使用時可形成髮夾結構。反向末端重複序列對涉及AAV DNA之救援、複製以及宿主基因組中之封裝。ITR亦為AAV DNA之有效衣殼化以及完整組裝之AAV粒子之產生所需的。
如在包含經修飾之衣殼蛋白質或VP1序列之本發明之AAV之上下文中所用，術語「經改良之功能性」應理解為意謂與未經修飾且在昆蟲細胞中產生之具有相同血清型之野生型AAV相比，包含經修飾之衣殼蛋白質或VP1序列之AAV具有經改良之核內體脫離活性。如本文所使用，術語「核內體脫離活性」、「核內體脫離活性」或類似術語應理解為意謂AAV在細胞內化後脫離核內體隔室之能力。在AAV功能性之情形下，應瞭解，在細胞內化後不能脫離核內體之AAV不具有功能性，尤其在基因療法之情形下。 用於產生經修飾之AAV之DNA構築體
本發明大體上係關於AAV，其具有經修飾之病毒衣殼蛋白，尤其包含經修飾之VP1序列及相關磷脂酶A2 (PLA2)區域，當在昆蟲細胞中產生時，該AAV具有經改良或恢復之功能性(相對於對應的野生型AAV)。本發明亦係關於此類經修飾之AAV之生產及其作為用於在哺乳動物細胞中引入及/或表現外源性核酸的載體之用途，諸如在基因療法之情況下。
AAV通常感染人類(例如血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)或靈長類動物(例如血清型1及4)。所有已知AAV血清型之基因組組織極類似。AAV之基因組為線形、單股DNA分子，其長度通常小於約5,000個核苷酸(nt)。反向末端重複序列(ITR)側接用於非結構複製(Rep )蛋白質及結構(VP )蛋白之獨特編碼核苷酸序列。VP蛋白質(VPl、VP2及VP3)形成衣殼。AAV衣殼組裝需要組裝活化蛋白質(AAP)的表現，該組裝活化蛋白質由位於VP2 及VP3 ORF之編碼序列內的衣殼基因之框內開放閱讀框架編碼(Sonntag等人, (2010)PNAS , 107(22):10220-10225)。末端145 nt為自互補的且經組織使得可形成能量穩定的分子內雙螺旋(亦即，反向末端重複(ITR))，其形成T形髮夾。此等髮夾結構充當病毒DNA複製來源，充當細胞DNA聚合酶複合之引子。在哺乳動物細胞中之野生型AAV (wtAAV)之感染後，Rep基因(亦即Rep78及Rep52)分別由P5啟動子及P19啟動子表現。Rep78蛋白質具有複製病毒基因組之功能，而Rep52蛋白質使初生基因組移動至病毒粒子中。Rep ORF中的剪接事件引起四種Rep 蛋白質(亦即Rep78、Rep68、Rep52及Rep40)的表現。然而，已證實哺乳動物細胞中之未經剪接之mRNA，編碼Rep78及Rep52蛋白質，足以用於AAV載體產生。又在昆蟲細胞中，Rep78及Rep52蛋白質足以用於AAV載體產生。三種衣殼蛋白質VP1、VP2及VP3由來自p40啟動子之單個VP閱讀框架表現。
對AAV (特定言之，在昆蟲細胞中產生之AAV)之功能性尤其重要的係VP1子單元，其含有守恆的磷脂酶A2 (PLA2)主結構，已證實其活性為核內體脫離所必需的，在核內體脫離後，病毒基因組轉移至宿主細胞之細胞核中。雖然已表明當在昆蟲細胞中表現時，血清型2之AAV保留PLA2活性且藉此保留其功能性；僅管整個細小病毒科一般守恆此區域，其他血清型之AAV具有缺陷的PLA2活性。此缺陷的PLA2活性限制在昆蟲細胞中產生功能性AAV之能力(除血清型2以外)。已使用多種方法解決此問題以改變作用，包括嵌合型AAV2/5 VP1蛋白質之構築，其中用AAV2 VP1之對應的序列置換AAV VP1序列或其含有PLA2主結構之N端部分(區域調換)。亦報導產生基於AAV2 VP1之嵌合體，產生表現野生型及血清型2 VP1序列之AAV。雖然已報導當在昆蟲細胞中表現時，此等方法可不同程度地改良功能性，但供臨床環境中使用之用於在昆蟲細胞中產生AAV載體之桿狀病毒系統仍具有侷限性。在本發明中，描述涉及對AAV VP1序列之位點特異性修飾之新穎方法，已證實當在昆蟲細胞中由桿狀病毒系統表現時，其可改良除AAV2以外的來自血清型之AAV之後續功能性。經改良之功能性係由病毒粒子脫離核內體隔室之能力賦予。
因此，本發明提供包含聚核苷酸序列之核酸分子，該聚核苷酸序列編碼腺相關病毒(AAV)病毒衣殼蛋白，其中病毒衣殼蛋白包含經修飾之子單元1(VP1)(VP1)序列，該經修飾之子單元1(VP1)序列包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸以及位置64處之離胺酸，其中胺基酸位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被定義，其中位置1、26、40、43、44及64中之任一或多者處之胺基酸係相對於對應的野生型序列被修飾，且其中除了在位置1、26、40、43、44及64處中之任一或多者的該等胺基酸以外，沒有其他胺基酸係相對於該對應的野生型序列被修飾。
在一個實例中，在SEQ ID NO:1中所闡述之序列之位置1、26、40、43、44及64中之任何二者、三者、四者、五者或六者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。
編碼AAV衣殼蛋白質之聚核苷酸序列可來自除血清型2以外的通常感染人類之AAV中之任一者(例如血清型1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型1。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型3。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型4。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型5。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型6。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型7。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型8。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型9。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型10。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型11。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型12。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV血清型13。
編碼AAV衣殼蛋白質之聚核苷酸序列可編碼經修飾之VP1，其包含SEQ ID NO:15-26中之任一者中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV1且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:15中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV3且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:16中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV4且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:17中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV5且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:18中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV6且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:19中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV7且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:20中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV8且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV9且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:22中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV10且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:23中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV11且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:24中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV12且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:25中所闡述之序列。在一個實例中，病毒衣殼蛋白係來自AAV13且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:26中所闡述之序列。
在前述實例中之每一者中，病毒衣殼蛋白可包含來自與經修飾之VP1相同的AAV血清型之子單元2 (VP2)及子單元3 (VP3)。較佳地，VP1、VP2及VP3由相同ORF表現。
編碼如本文中所描述之AAV病毒衣殼蛋白之核苷酸序列可操作地連接至啟動子，其適用於在昆蟲細胞中表現衣殼蛋白質。適用於在昆蟲細胞中表現的啟動子為此項技術中已知的且預期用於本文中。在此方面，用於在分子工程改造及昆蟲細胞中表現多肽之方法先前已描述於例如Summers及Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. 第7555號, College Station, Tex. (1986)；Luckow., In Prokop等人, Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152 (1991)；King, L. A及R. D. Possee, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom (1992)；O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A Luckow, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York (1992)；W. H. Freeman及Richardson, C. D., Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39 (1992)；美國專利案第4,745,051號；US2003148506；WO2003/074714；Kotin RM (2011)Hum. Mol. Genet., 20(R1):R2-R6；Aucoin等人, (2006)Biotechnol. Bioeng. 95(6):1081-1092；及van Oers等人, (2015)J. Gen. Virol. 96:6-23。涵蓋此項技術中已知的啟動子及其他此類調節元件以用於本發明之核酸中。在一個特定實例中，啟動子為多角體啟動子或p10啟動子。
如本文所描述，AAV衣殼組裝需要非結構蛋白質，即組裝活化蛋白質(AAP)的表現。因此，在前述實例中之每一者中，如本文中所描述之核酸分子可包含編碼AAP之聚核苷酸。
如本文所描述，AAV基因組包含Rep基因(亦即Rep78及Rep52)，由其編碼之蛋白質在病毒基因組之複製中起作用。Rep ORF中之剪接事件引起四種Rep 蛋白質(亦即Rep78、Rep68、Rep52及Rep40)的表現。然而，已證實昆蟲細胞中之未經剪接之mRNA，編碼Rep78及Rep52蛋白質，足以用於AAV載體產生。因此，在一個實例中，本發明之核酸分子亦包含聚核苷酸序列，其編碼至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAV複製Rep 蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAVRep 蛋白質。在一個實例中，本文中所描述之核酸分子包含編碼Rep78及Rep52之聚核苷酸序列。在一個實例中，本文中所描述之核酸分子包含編碼Rep78及Rep40之聚核苷酸序列。在一個實例中，本文中所描述之核酸分子包含編碼來自與病毒衣殼蛋白相同的AAV血清型之Rep68及Rep52之聚核苷酸序列。在一個實例中，本文中所描述之核酸分子包含編碼Rep68及Rep40之聚核苷酸序列。在一個實例中，本文中所描述之核酸分子包含編碼Rep78、Rep68、Rep52及Rep40之聚核苷酸序列。在前述實例中之每一者中，各別小型及大型Rep 蛋白質可來自與病毒衣殼蛋白相同的AAV血清型。或者，各別小型及大型Rep 蛋白質可來自除病毒衣殼蛋白之AAV血清型以外的AAV血清型，例如Rep 蛋白質可來自AAV血清型2。
編碼Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至啟動子，其適用於在昆蟲細胞中表現Rep 蛋白質。適用於在昆蟲細胞中表現的啟動子為此項技術中已知的且預期用於本文中。在一個特定實例中，啟動子可為多角體啟動子或p10啟動子。編碼各別Rep 蛋白質之核苷酸序列可操作地連接至相同啟動子。或者，各編碼Rep 蛋白質之序列可操作地連接至其自身啟動子。
編碼經修飾之VP1序列之核酸可以電子雜交方式經設計，例如基於野生型AAV序列或來源於野生型AAV序列之天然存在之變異型AAV序列，且包含核酸序列之DNA構築體可使用此項技術中已知之方法合成。或者或另外，如本文中所描述之相對於該對應的野生型VP1序列(或來源於此等野生型AAV序列之天然存在之變異型AAV序列)的對VP1序列之修飾，可藉由應用熟知遺傳工程改造技術來實現，諸如例如Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York中所描述。VP編碼序列之各種其他修飾為熟習此項技術者已知的，其可增加VP及病毒粒子之產率或具有其他所需作用，諸如改變向性或降低病毒粒子之抗原性。此等修飾屬於本發明之範疇內。
可用於本發明中之AAV序列，例如用於在如本文所描述之昆蟲細胞中產生具有經修飾之VP1序列之AAV，可來源於任何AAV血清型之基因組。通常，AAV血清型具有基因組序列，其在胺基酸及核酸程度上具有顯著同源性，提供一致的遺傳功能集合，產生在實體及功能性上類似的病毒粒子，且藉由幾乎一致的機制複製及組裝(具有本文中所描述之PLA2區域之活性之特異性免除)。用於設計及產生本發明之經修飾之AAV之適合的AAV之核酸及蛋白質序列可公開獲得。已知可感染人類之野生型AAV之VP1序列(且其涵蓋於本文中)描述於Chen等人, (2013) J. Vir. 87(11):6391-6405中。人類或猴腺相關病毒(AAV)血清型為用於本發明之情形之較佳的AAV核苷酸序列之來源且更佳地，通常感染人類之AAV血清型(例如血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12及13)。AAV血清型1-13之衣殼多肽序列為此項技術中已知的，例如AAV1 (Genbank寄存編號：AAD27757.1, GI:4689097)、AAV2 (Genbank寄存編號：AAC03780.1，GP.2906023)、AAV3 (Genbank寄存編號：AAC55049.1，GI：1408469)、AAV4 (Genbank寄存編號：AAC58045.1，GL2337940)、AAV5 (Genbank寄存編號：AAD13756.1，GI-4249658)、AAV10 (Genbank寄存編號：AAT46337.1，GL48728343)、AAV11 (Genbank寄存編號：AAT46339.1，GI:48728346)、AAV12 (Genbank寄存編號：ABI16639.1，GI: 112379656)或AAV13 (Genbank寄存編號：ABZ10812.1, GI: 167047087)。血清型1-13之AAV衣殼蛋白質之多肽序列亦闡述於本文中之SEQ ID NO:27-39中。此外，來自血清型1-13之AAV之完全基因組為此項技術中已知的，例如AAV1 (NCBI參考序列NC_002077.1)、AAV2 (GenBank寄存編號：J01901.1)、AAV3 (Genbank寄存編號：AF028705.1)、AAV4 (NCBI參考序列：NC_001829.1)、AAV5 (NCBI參考序列：NC_006152.1)、AAV6 (GenBank：AF028704.1)、AAV7 (NCBI參考序列：NC_006260.1)、AAV8 (NCBI參考序列：NC_006261.1)、AAV9 (GenBank寄存編號：AY530579.1)、AAV10 (Genbank寄存編號：AY631965.1)、AAV11 (Genbank寄存編號：AY631966.1)或AAV12 (Genbank寄存編號：DQ813647.1)，或AAV13 (Genbank寄存編號：EU285562.1)。
本發明亦提供AAV衣殼蛋白質，其包含由本發明之核酸編碼之經修飾之VP1序列。 用於產生經修飾之AAV之桿狀病毒載體
本發明亦提供在昆蟲細胞相容載體(亦即桿狀病毒載體)中之本發明之核酸分子。特定言之，本發明提供桿狀病毒載體，其包含編碼AAV病毒衣殼蛋白之核酸分子，該AAV病毒衣殼蛋白具有如本文中所描述之經修飾之VP1序列。
本發明亦提供複數個桿狀病毒載體，其包含： (i) 第一桿狀病毒載體，其包含編碼AAV病毒衣殼蛋白之核酸分子，該AAV病毒衣殼蛋白具有如本文中所描述之經修飾之VP1序列；及 (ii) 第二桿狀病毒載體，其包含編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸。 在一個實例中，AAV ITR序列來自與由第一桿狀病毒載體內之核酸分子編碼的病毒衣殼蛋白相同的血清型。在另一實例中，AAV ITR序列來自另一種AAV血清型，例如AAV2。 典型地，編碼感興趣的蛋白質或RNA (包括側接ITR)之聚核苷酸之長度為5,000個核苷酸(nt)或更少。然而，亦預期編碼過大的DNA 之聚核苷酸，亦即長度超過5,000 nt。在本文中，過大的DNA理解為超過5 kbp之最大AAV封裝限制之DNA。因此，產生能夠產生通常由大於5.0 kb之較大基因組編碼的重組型蛋白質或RNA之AAV載體亦為可行的。 該編碼用於在哺乳動物細胞中表現該感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸將位於桿狀病毒載體內，使得其將複製且併入在昆蟲細胞中複製之AAV基因組中。任何核苷酸序列可被併入以用於隨後表現於一用根據本揭露內容所產生之AAV轉染的哺乳動物細胞中，只要構築體保持在AAV病毒粒子之封裝能力內即可。聚核苷酸序列可例如編碼感興趣的蛋白質或其可表現RNAi試劑，亦即能夠進行RNA干擾之RNA分子，諸如shRNA (短髮夾RNA)或短髮夾微型RNA (shmiR)。在一個實例中，編碼感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸編碼複數個感興趣的蛋白質、複數個RNAi試劑或一或多種感興趣的蛋白質及一或多種RNAi試劑。用於在哺乳動物細胞中表現感興趣的蛋白質可為治療性基因產物。治療性基因產物可為多肽，或RNA分子 (諸如本文中所描述之shRNA或shmiR)，或其他基因產物，其在於目標細胞中表現時提供所需治療作用，諸如去除不合需要的活性，例如去除受感染的細胞，或遺傳缺陷之補充，例如引起酶促活性不足。或者或另外，由聚核苷酸編碼之感興趣的蛋白質可充當標記蛋白質以評估細胞轉型及表現。用於此目的之適合的標記蛋白質為例如螢光蛋白質GFP或螢火蟲螢光素酶。用於獲得此等標記基因之來源及其使用方法提供於Sambrook及Russel (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York中。 根據其中第一桿狀病毒載體不編碼AAVRep 蛋白質之實例，複數個桿狀病毒載體進一步包含： (iii) 第三桿狀病毒載體，其包含聚核苷酸序列，該聚核苷酸序列編碼至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAVRep 蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAV Rep蛋白質。
舉例而言，第三桿狀病毒載體可包含編碼Rep78及Rep52之聚核苷酸序列。舉例而言，第三桿狀病毒載體可包含編碼Rep78及Rep40之聚核苷酸序列。舉例而言，第三桿狀病毒載體可包含編碼Rep68及Rep52之聚核苷酸序列。舉例而言，第三桿狀病毒載體可包含編碼Rep68及Rep40之聚核苷酸序列。舉例而言，第三桿狀病毒載體可包含編碼Rep78、Rep68、Rep52及Rep40之聚核苷酸序列。在描述第三桿狀病毒載體之前述實例中之每一者中，各別小型及大型Rep 蛋白質可來自與由第一桿狀病毒載體編碼之病毒衣殼蛋白相同的AAV血清型。或者，各別小型及大型Rep 蛋白質可來自除由第一桿狀病毒載體編碼之病毒衣殼蛋白之AAV血清型以外的AAV血清型，例如Rep蛋白質可來自AAV血清型2。在此方面，在大部分血清型中Rep序列被特別守恆保，且Rep序列在昆蟲細胞中有效地交叉互補一事已被記述。
在描述複數個桿狀病毒載體之前述實例中之每一者中，編碼第三桿狀病毒載體內之Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至用於昆蟲細胞中之Rep 蛋白質的表現之啟動子。除非另外具體說明，否則已描述適用於在昆蟲細胞中表現蛋白質的啟動子且應在細節上作必要修改後適用於本發明之描述桿狀病毒載體之實例。
如AAV衣殼組裝所需要，複數個桿狀病毒載體中之至少一種桿狀病毒載體將包含編碼組裝活化蛋白質(AAP)之聚核苷酸。在一個實例中，編碼衣殼蛋白質之桿狀病毒載體包含編碼AAP之聚核苷酸。在替代性實例中，編碼Rep蛋白質之桿狀病毒及/或編碼感興趣的蛋白質或RNA之桿狀病毒包含編碼AAP之聚核苷酸。
桿狀病毒載體以及其產生及使用方法為此項技術中已知的且描述於上文引用之關於昆蟲細胞之分子工程改造之參考文獻中。 昆蟲細胞
本文中亦提供一種昆蟲細胞，其包含編碼AAV病毒衣殼蛋白之本發明之核酸分子，該AAV病毒衣殼蛋白具有如本文中所描述之經修飾之VP1序列。
昆蟲細胞亦將較佳包含(i)聚核苷酸序列，其編碼至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAVRep 蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAV Rep蛋白質，及(ii)聚核苷酸，其編碼由AAV ITR序列側接之感興趣的蛋白質或RNA。大型及小型Rep 蛋白質之特定組合以及適合的ITR已描述於本文中，例如在本發明之桿狀病毒載體之情形下，且除非另外具體說明，否則應在細節上作必要修改後適用於本發明之描述昆蟲細胞之實例。類似地，用於併入由昆蟲細胞產生之AAV之基因組中的編碼感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸已描述於本文中，例如在本發明之桿狀病毒載體之情形下，且除非另外具體說明，否則應在細節上作必要修改後適用於本發明之描述昆蟲細胞之實例。
較佳地，將以下中之每一者引入桿狀病毒載體中且用於感染昆蟲細胞：(i)本發明之核酸分子，其編碼具有如本文所描述之經修飾之VP1序列之AAV病毒衣殼蛋白，(ii)編碼Rep 蛋白質之聚核苷酸，及(iii)編碼由AAV ITR序列側接之感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸。較佳地，(i)至(iii)中之至少一者亦將包含編碼組裝活化蛋白質(AAP)AAV衣殼組裝物之聚核苷酸。因此，本文中所描述之昆蟲細胞應包含能夠表現及組裝感染性及穩定的AAV病毒粒子所必需的組分。在一個實例中，昆蟲細胞可包含游離複製型重組型桿狀病毒。
本發明亦提供一種昆蟲細胞，其包含如本文中所描述之桿狀病毒載體或多個桿狀病毒載體，該桿狀病毒載體能夠產生感染性及穩定的AAV病毒粒子。在一個實例中，昆蟲細胞已用如本文中所描述之桿狀病毒載體或多個桿狀病毒載體轉型或轉染。根據其中昆蟲細胞已用本發明之桿狀病毒載體或多個桿狀病毒載體轉型或轉染之實例，以下中之每一者將由游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現：(i)本發明之核酸分子，其編碼具有如本文所描述之經修飾之VP1序列之AAV病毒衣殼蛋白，(ii)編碼Rep蛋白質之聚核苷酸，及(iii)編碼由AAV ITR序列側接之感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸。
可根據本發明使用允許桿狀病毒之複製且可維持於培養物中之任何昆蟲細胞。舉例而言，所使用之細胞株可來自草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )、果蠅(Drosophila)細胞株或蚊蟲(mosquito)細胞株，例如白紋伊蚊(Aedes albopictus )衍生之細胞株。較佳昆蟲細胞或細胞株為來自對桿狀病毒感染敏感之昆蟲物種之細胞，包括例如expresSF+®、Drosophila Schneider 2 (S2)細胞、Se301、SeIZD2109、SeUCRl、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5Bl-4、MG-I、5 Tn368、HzAml、Ha2302及Hz2E5。 產生經修飾之AAV之方法
本發明亦提供產生包含衣殼蛋白質之AAV之方法，該衣殼蛋白質具有經修飾之VP1序列，其中編碼如本文中所描述之經修飾之VP1序列之核酸表現於昆蟲細胞內且在其中組裝AAV。在一個實例中，本發明提供一種用於在昆蟲細胞中產生AAV之方法，其包含： (i) 在培養基中，在足以使細胞產生AAV之條件下培養如本文中所描述之昆蟲細胞；及任擇地 (ii) 自該等培養基及/或細胞回收AAV。
在另一實例中，本發明提供一種用於在昆蟲細胞中產生AAV之方法，其包含： (i) 用以下共同感染昆蟲細胞：第一桿狀病毒載體，其具有包含本發明之核酸分子之基因組，該核酸分子編碼具有如本文中所描述之經修飾之VP1序列之AAV病毒衣殼蛋白，且包含編碼至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAV複製(Rep )蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAV Rep蛋白質之聚核苷酸序列；及第二桿狀病毒載體，其具有包含聚核苷酸序列之基因組，該聚核苷酸序列編碼如本文中所描述之由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之感興趣的蛋白質或RNA； (ii) 在培養基中，在足以使細胞產生AAV之條件下，培養在(i)中用桿狀病毒載體感染之昆蟲細胞；以及任擇地 (iii) 自該等培養基及/或細胞回收AAV。
在另一實例中，本發明提供一種用於在昆蟲細胞中產生AAV之方法，其包含： (i) 用以下共同感染昆蟲細胞：第一桿狀病毒載體，其具有包含本發明之核酸分子之基因組，該核酸分子編碼具有如本文中所描述之經修飾之VP1序列之AAV病毒衣殼蛋白；第二桿狀病毒載體，其具有包含聚核苷酸序列之基因組，該聚核苷酸序列編碼至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAV複製(Rep )蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAV Rep蛋白質；及第三桿狀病毒載體，其具有基因組，該基因組包含編碼由AAV ITR序列側接之感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸； (ii) 在培養基中，在足以使細胞產生AAV之條件下，培養在(i)中用桿狀病毒載體感染之昆蟲細胞；以及任擇地 (iii) 自該等培養基及/或細胞回收AAV。
在前述實例中之每一者中，Rep 蛋白質可來自與病毒衣殼蛋白相同的AAV血清型。或者，Rep蛋白質可來自與病毒衣殼蛋白之血清型不同的AAV血清型，例如Rep蛋白質可來自AAV血清型2。
類似地，在前述實例中之每一者中，ITR序列可來自與病毒衣殼蛋白相同的AAV血清型。或者，ITR序列可來自與病毒衣殼蛋白之AAV血清型不同的AAV血清型，例如ITR序列可來自AAV血清型2。
複數個桿狀病毒載體中之至少一種桿狀病毒載體亦將包含編碼用於AAV衣殼組裝之組裝活化蛋白質(AAP)之聚核苷酸。在一個實例中，編碼衣殼蛋白質之桿狀病毒載體包含編碼AAP之聚核苷酸。在替代性實例中，編碼Rep蛋白質之桿狀病毒及/或編碼感興趣的蛋白質或RNA之桿狀病毒包含編碼AAP之聚核苷酸。
根據其中該方法包含用本文中所描述之桿狀病毒載體感染昆蟲細胞之實例，可使用此項技術中已知的任何習知方法。適用於在昆蟲細胞中產生病毒(諸如AAV)之培養基及條件為此項技術中已知的且涵蓋於本文中。舉例而言，用於在分子工程改造及昆蟲細胞中表現AAV及多肽之方法描述於例如Summers及Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. 第7555號, College Station, Tex. (1986)；Luckow., In Prokop等人, Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152 (1991)；King, L. A及R. D. Possee, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom (1992)；O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A Luckow, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York (1992)；W. H. Freeman及Richardson, C. D., Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, 第39卷 (1992)；美國專利案第4,745,051號；US2003148506；WO2003/074714；Kotin RM (2011)Hum. Mol. Genet., 20(R1):R2-R6；Aucoin等人, (2006)Biotechnol. Bioeng. 95(6):1081-1092；及van Oers等人, (2015)J. Gen. Virol. 96:6-23。
適合的大型及小型Rep蛋白質、ITR序列以及感興趣的蛋白質或RNA已描述於本文中，例如在本發明之桿狀病毒載體之情形下，且除非另外具體說明，否則應在細節上作必要修改後適用於本發明之描述產生AAV之方法之實例。在一個實例中，本文中所描述之方法包含用本發明之複數個桿狀病毒載體共同轉染昆蟲細胞。
在描述產生AAV之方法之前述實例中之每一者中，編碼桿狀病毒載體內之Rep 蛋白質之聚核苷酸序列可操作地連接至用於在昆蟲細胞中表現Rep 蛋白質的啟動子(及視情況選用之其他調節元件)。類似地，編碼由AAV ITR序列側接之感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸序列可操作地連接至用於在昆蟲細胞中表現的啟動子(及視情況選用之其他調節元件)。適用於在昆蟲細胞中表現的啟動子為此項技術中已知的且已描述於本文中，且除非另外具體說明，否則應在細節上作必要修改後適用於本發明之描述產生AAV之方法之實例。在一個實例中，啟動子為多角體啟動子或p10啟動子。
在一個實例中，產生AAV之方法包含自培養基及/或細胞回收AAV之步驟。在另一實例中，產生AAV之方法包含自培養基及/或細胞回收AAV且接著純化AAV之步驟。在一個實例中，自細胞回收AAV。在一個實例中，自培養基回收AAV。在一個實例中，自細胞及培養基回收AAV。適用於自培養基及/或細胞回收及純化AAV之方法為此項技術中已知的且預期用於本文中。舉例而言，該方法可包含基於碘克沙醇(iodixanol)之密度梯度純化，接著進行氯化銫(CsCl)梯度離心。舉例而言，該方法可包含使用抗AAV抗體，較佳固定抗體進行之AAV之親和力純化。抗AAV抗體可為單株抗體。尤其適合的抗體為單鏈駱駝抗體或其片段，如例如可自駱駝或駱馬獲得(參見例如Muyldermans等人, (2001)Biotechnol . 74: 277-302)。用於AAV之親和力純化之抗體較佳為特異性結合AAV衣殼蛋白質上之抗原決定基(諸如存在於超過一種AAV血清型之衣殼蛋白質上之抗原決定基)之抗體(以實現來自不同血清型之AAV之純化)。
先前已描述重組型AAV之構築及純化。參見例如美國專利案第5,173,414號、第5,139,941號、第5,863,541號及第5,869,305號、第6,057,152號、第6,376,237號；Rabinowitz等人, (2002)J. Virol. 76:791-801；及Bowles等人, (2003)J. Virol. 77:423-432。如所描述之此類方法預期用於本文中。
本發明亦提供一種藉由本文中所描述之方法產生之AAV，其包含具有經修飾之VP1序列之病毒衣殼蛋白。
本發明亦提供改良在昆蟲細胞中產生之來自除血清型2以外的血清型之AAV之功能性之方法，該方法包含藉由取代位置1、26、40、43、44及64處之一或多個胺基酸來相對於對應的野生型序列修飾AAV病毒衣殼蛋白之VP1序列，該修飾使得病毒衣殼蛋白包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸及/或位置64處之離胺酸中之一或多者，其中殘基位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被測定，其中除了在位置1、26、40、43、44及/或64處的該等胺基酸以外，沒有其他胺基酸係相對於該對應的野生型序列被修飾，且其中該AAV當在昆蟲細胞中產生時與未經修飾之對應的野生型AAV當在昆蟲細胞中產生時相比具有經改良之功能性。AAV之經改良之功能性將歸因於AAV在細胞內化後脫離核內體隔室之能力。本文中已描述包含經修飾之VP1序列之AAV病毒衣殼蛋白，且除非另外具體說明，否則其任何實例應在細節上作必要修改後適用於如本文中所描述之改良AAV之功能性之方法。
在一個實例中，改良AAV之功能性之方法包含相對於如本文所描述之對應的野生型序列修飾VP1序列之位置1、26、40、43、44及64處之胺基酸中之任二者或更多者，使得病毒衣殼蛋白包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸及/或位置64處之離胺酸中之二者或更多者，其中殘基位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被測定。在一個實例中，改良AAV之功能性之方法包含相對於如本文所描述之對應的野生型序列修飾VP1序列之位置1、26、40、43、44及64處之胺基酸中之任三者或更多者，使得病毒衣殼蛋白包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸及/或位置64處之離胺酸中之三者或更多者，其中殘基位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被測定。在一個實例中，改良AAV之功能性之方法包含相對於如本文所描述之對應的野生型序列修飾VP1序列之位置1、26、40、43、44及64處之胺基酸中之任四者或更多者，使得病毒衣殼蛋白包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸及/或位置64處之離胺酸中之四者或更多者，其中殘基位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被測定。在一個實例中，改良AAV之功能性之方法包含相對於如本文所描述之對應的野生型序列修飾VP1序列之位置1、26、40、43、44及64處之胺基酸中之任五者或更多者，使得病毒衣殼蛋白包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸及/或位置64處之離胺酸中之五者或更多者，其中殘基位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被測定。在一個實例中，改良AAV之功能性之方法包含相對於如本文所描述之對應的野生型序列修飾VP1序列之位置1、26、40、43、44及64處之胺基酸中之每一者，使得病毒衣殼蛋白包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸及位置64處之離胺酸，其中殘基位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被測定。
本發明之方法可提供具有病毒衣殼蛋白之AAV，該病毒衣殼蛋白具有包含SEQ ID NO:15-26中之任一者中所闡述之序列之VP1序列。AAV可來自任何通常感染人類之血清型(例如血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得： (i) 當該AAV係血清型1時，該病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:15中所闡述之序列； (ii) 當該AAV係血清型3時，該病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:16中所闡述之序列； (iii) 當AAV係血清型4時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:17中所闡述之序列； (iv) 當AAV係血清型5時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:18中所闡述之序列； (v) 當AAV係血清型6時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:19中所闡述之序列； (vi) 當AAV係血清型7時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:20中所闡述之序列； (vii) 當AAV係血清型8時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列； (viii) 當AAV係血清型9時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:22中所闡述之序列； (ix) 當AAV係血清型10時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:23中所闡述之序列； (x) 當AAV係血清型11時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:24中所闡述之序列； (xi) 當AAV係血清型12時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:25中所闡述之序列；以及 (xii) 當AAV係血清型13時，病毒衣殼蛋白包括VP1序列，其包含SEQ ID NO:26中所闡述之序列。
在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV1之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:15中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV3之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:16中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV4之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:17中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV5之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:18中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV6之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:19中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV7之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:20中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV8之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV9之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:22中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV10之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:23中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV11之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:24中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV12之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:25中所闡述之序列之VP1序列。在一個實例中，該方法包含相對於對應的野生型序列修飾AAV13之病毒衣殼蛋白之VP1序列，使得病毒衣殼蛋白包括包含SEQ ID NO:26中所闡述之序列之VP1序列。
如本文中所描述之改良AAV之功能性之方法可進一步包含相對於對應的野生型AAV分析經修飾之AAV之功能性之步驟。亦即，該方法可進一步包含用如本文中所描述及/或藉由本文中所描述之方法產生之經修飾的或野生型AAV感染哺乳動物細胞及測定功能性水準。舉例而言，AAV之功能性可藉由測定在以AAV感染後的哺乳動物細胞中之感興趣的蛋白質或RNA的表現位準來測定。用於測定病毒粒子之功能性的功能性分析法為此項技術中已知的且預期用於本文中，例如Girod等人, (2002)J . Gen . Virol . , 83:973-978；Lock等人, (2010) Hum. Gene Ther. 21(10):1273-1285中所描述。用於分析病毒感染性及/或功能性之適合的分析法包括(但不限於)：(1)藉由A20酶聯結免疫吸附分析法獲得之衣殼效價；(2)藉由定量聚合酶鏈反應(qPCR)獲得之載體基因組效價；及(3)用qPCR讀數藉由中值組織培養感染性劑量(TCID50 )獲得之感染性效價以及(4)藉由用報導基因(例如綠色螢光蛋白[GFP])進行之分析轉導。
如本文中所描述之改良AAV之功能性之方法可包含提供如本文中所描述之編碼經修飾之AAV VP1序列之核酸或如本文中所描述之包含該核酸之桿狀病毒載體。或者或另外，如本文中所描述之改良AAV之功能性之方法可包含產生包含衣殼蛋白質之AAV，該衣殼蛋白質具有如本文中所描述之經修飾之VP1序列。 具有經修飾之VP1之AAV
本發明亦提供包含病毒衣殼蛋白之AAV，該病毒衣殼蛋白具有經修飾之VP1序列，該經修飾之VP1序列包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸及位置64處之離胺酸，其中胺基酸位置係相對於SEQ ID NO:1中所闡述之序列被定義，其中位置1、26、40、43、44及64中之任一或多者處之胺基酸係相對於對應的野生型序列被修飾，且其中除了在位置1、26、40、43、44及64處中之任一或多者的該等胺基酸以外，沒有其他胺基酸係相對於該對應的野生型序列被修飾。
在一個實例中，本文中所描述之AAV包含具有經修飾之VP1序列之病毒衣殼蛋白，其中在SEQ ID NO:1中所闡述之序列之位置1、26、40、43、44及64中之任何二者、三者、四者、五者或六者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。
在一個實例中，本文中所描述之AAV包含具有經修飾之VP1序列之病毒衣殼蛋白，其中在SEQ ID NO:1中所闡述之序列之位置1、26、40、43、44及64中之任二者或更多者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。
在一個實例中，本文中所描述之AAV包含具有經修飾之VP1序列之病毒衣殼蛋白，其中在SEQ ID NO:1中所闡述之序列之位置1、26、40、43、44及64中之任三者或更多者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。
在一個實例中，本文中所描述之AAV包含具有經修飾之VP1序列之病毒衣殼蛋白，其中在SEQ ID NO:1中所闡述之序列之位置1、26、40、43、44及64中之任四者或更多者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。
在一個實例中，本文中所描述之AAV包含具有經修飾之VP1序列之病毒衣殼蛋白，其中在SEQ ID NO:1中所闡述之序列之位置1、26、40、43、44及64中之任五者或更多者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。
在一個實例中，本文中所描述之AAV包含具有經修飾之VP1序列之病毒衣殼蛋白，其中在SEQ ID NO:1中所闡述之序列之位置1、26、40、43、44及64中之每一者處之胺基酸係相對於如本文中所描述之對應的野生型序列被修飾。
本文中已描述包含經修飾之VP1序列之病毒衣殼蛋白，且除非另外具體說明，否則其任何實例應在細節上作必要修改後適用於本發明之包含該經修飾之VP1序列之AAV。
本文中所描述之AAV可為除血清型2以外的通常感染人類之AAV中任之一者(例如血清型1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13)。在一個實例中，AAV係血清型1。在一個實例中，AAV係血清型3。在一個實例中，AAV係血清型4。在一個實例中，AAV係血清型5。在一個實例中，AAV係血清型6。在一個實例中，AAV係血清型7。在一個實例中，AAV係血清型8。在一個實例中，AAV係血清型9。在一個實例中，AAV係血清型10。在一個實例中，AAV係血清型11。在一個實例中，AAV係血清型12。在一個實例中，AAV係血清型13。
本文中所描述之AAV可包含具有經修飾之VP1之衣殼蛋白質，該經修飾之VP1包含SEQ ID NO:15-26中之任一者中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型1且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:15中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型3且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:16中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型4且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:17中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型5且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:18中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型6且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:19中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型7且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:20中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型8且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型9且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:22中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型10且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:23中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型11且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:24中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型12且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:25中所闡述之序列。在一個實例中，AAV係血清型13且經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO:26中所闡述之序列。
在前述實例中之每一者中，本文中所描述之AAV包含病毒衣殼蛋白，其包含來自與經修飾之VP1相同的AAV血清型之子單元2 (VP2)及子單元3 (VP3)序列。較佳地，VP1、VP1及VP3由相同ORF表現。
如本文所描述，AAV基因組包含複製(Rep )基因，其為由在病毒基因組之複製中起作用之病毒編碼之蛋白質。因此，在一個實例中，本文中所描述之AAV包含至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAVRep 蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAVRep 蛋白質。在一個實例中，本文中所描述之AAV包含Rep78及Rep52。在一個實例中，本文中所描述之AAV包含Rep78及Rep40。在一個實例中，本文中所描述之AAV包含Rep68及Rep52。在一個實例中，本文中所描述之AAV包含Rep68及Rep40。在一個實例中，本文中所描述之AAV包含Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。在前述實例中之每一者中，各別小型及大型Rep 蛋白質可來自與病毒衣殼蛋白相同的AAV血清型。或者，各別小型及大型Rep 蛋白質可來自除病毒衣殼蛋白之AAV血清型以外的AAV血清型，例如Rep 蛋白質可來自AAV2。
本發明之AAV亦可包含聚核苷酸，其編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之感興趣的蛋白質或RNA。
在一個實例中，AAV ITR序列來自與病毒衣殼蛋白相同的血清型。在另一實例中，AAV ITR序列來自除病毒衣殼蛋白之血清型以外的血清型。在一個特定實例中，ITR序列來自AAV血清型2。
如上文所描述，編碼感興趣的蛋白質或RNA (包括側接ITR)之聚核苷酸之長度通常為5,000個核苷酸(nt)或更少。然而，亦預期編碼過大的DNA 之聚核苷酸，亦即長度超過5,000 nt。在本文中，過大的DNA理解為超過5 kbp之最大AAV封裝限制之DNA。因此，本發明之AAV可能夠表現大於5.0 kb之來自基因組之蛋白質或RNA。
本發明之AAV將較佳包含一編碼用於在哺乳動物細胞中表現感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸，該聚核苷酸併入哺乳動物細胞之基因組中。任何核苷酸序列可被併入以用於隨後表現於一用根據本揭露內容所產生之AAV轉染的哺乳動物細胞中，只要構築體保持在AAV病毒粒子之封裝能力內即可。編碼感興趣的蛋白質或RNA之適合的聚核苷酸已描述於本文中且除非另外具體說明，否則應在細節上作必要修改後適用於本發明之AAV。在一個實例中，AAV基因組包含編碼如本文中所描述之感興趣的治療性蛋白質之聚核苷酸序列。在一個實例中，AAV基因組包含編碼如本文中所描述之RNAi試劑之聚核苷酸序列。在一個實例中，AAV基因組包含編碼標記蛋白質之聚核苷酸序列，例如以評估細胞轉型及表現，如本文中所描述。在一個實例中，AAV基因組包含複數個聚核苷酸序列，該複數個聚核苷酸序列編碼感興趣的蛋白質、RNAi試劑及/或標記蛋白質中之二者或更多者，如本文中所描述。
當在昆蟲細胞中產生時，本文中所描述之包含經修飾之VP1序列之AAV與包含對應的野生型VP1序列之AAV相比將具有經改良之功能性。
在一個實例中，使用本發明之方法產生包含衣殼蛋白質之AAV，該衣殼蛋白質具有經修飾之VP1序列。 套組
本發明亦提供呈套組形式之本發明之核酸分子、桿狀病毒載體、多個桿狀病毒載體及/或昆蟲細胞。套組可包含容器，其包含本發明之核酸分子。在一個實例中，核酸包含於桿狀病毒載體內。在一個實例中，套組包含有包含本發明之核酸分子之第一容器及包含用於產生AAV之一或多種其他試劑之第二容器。在一個實例中，核酸包含於桿狀病毒載體內。在一個實例中，套組包含本發明之複數個桿狀病毒載體，其各自包含於單獨的容器內。套組可視情況進一步包含例如適用於產生根據本發明之AAV之昆蟲細胞。套組亦可進一步包含用於使用如本文中所描述之方法產生AAV之本發明之核酸分子、桿狀病毒載體、多個桿狀病毒載體及/或昆蟲細胞之使用說明書。 例示性實例 實例1 - 經修飾之AAV VP1序列之設計、產生及測試
在此實例中，本發明人設計及製備具有病毒衣殼蛋白子單元1(VP1)之AAV，其中特異性序列修飾(亦即胺基酸取代)引入磷脂酶A2 (PLA2)區域及側接序列中以在昆蟲細胞中產生時恢復AAV之磷脂酶活性及病毒功能性。此外，基於所進行之包含各種代表性AAV血清型之PLA2區域及側接序列之VP1子序列之多重序列比對，製備包含PLA2區域及側接序列之共同VP1子序列，其包括經設計以恢復磷脂酶活性之序列修飾。此共同VP1子序列闡述於SEQ ID NO:1中。 1.1 經修飾之AAV8 VP1及AAV9 VP1序列之設計
使用BLASTp比對工具進行以下之成對序列比對：來自AAV8 (SEQ ID NO:34)及AAV2 (SEQ ID NO:28)之病毒衣殼蛋白1(VP1)蛋白質之N端180個胺基酸，及來自AAV9 (SEQ ID NO:35)及AAV2 (SEQ ID NO:26)之VP1蛋白質之N端180個胺基酸。基於此等比對，證實來自AAV8及AAV9之PLA2區域及側接序列針對AAV2中之對應的序列具有高共同。
基於此等序列比對，藉由用SEQ ID NO:28中闡述之AAV2 VP1序列中之對應的位置處的胺基酸取代SEQ ID NO:34中所闡述之序列之位置42、67、81、84、85及105處之胺基酸(亦即SEQ ID NO:34之序列內之G42S、A67E、Q81R、Q84D、A85S及Q105K)，以電子雜交方式設計經修飾之AAV8 VP1序列。經修飾之AAV8 VP1序列中之二個經取代之殘基位置位於側接PLA2區域之區域中(但認為可能涉及PLA2區域之摺疊及/或活性)，且四個經修飾之殘基位置本身滯留於PLA2區域內。
類似地，藉由用SEQ ID NO:28中闡述之AAV2 VP1序列中之對應的位置處的胺基酸取代SEQ ID NO:35中所闡述之序列之位置42、67、81、84及85處之胺基酸(亦即SEQ ID NO:35之序列內之A42S、A67E、Q81R、K84D及A85S)，以電子雜交方式設計經修飾之AAV9 VP1序列。經修飾之AAV9 VP1序列中之一個經取代之殘基位置位於側接PLA2區域之區域中(但認為可能涉及PLA2區域之摺疊及/或活性)，且四個經修飾之殘基位置本身滯留於PLA2區域內。 1.2 包括經修飾之殘基之共同AAV VP1子序列之設計
基於所進行之AAV2、AAV8及AAV9之完整VP1序列之序列比對，進行包含AAV血清型1-13之PLA2區域及側接序列之VP1子序列(SEQ ID NO:15-26)之多重序列比對。除由以上成對比對鑑別之此等差異以外，在子序列內鑑別許多其他不一致殘基。然而，決定不使此等位置關於對應的AAV2之一致性而突變，因為該差異被認為是守恆的差異及/或因為殘基位置位於PLA2區域外部且認為不太可能影響磷脂酶活性。基於多重序列比對，以電子雜交方式製備包含PLA2區域及側接序列之共同VP1子序列(SEQ ID NO:1)，該區域及側接序列具有上文所描述之胺基酸取代。 1.3 產生表現結構及非結構AAV8蛋白質之桿狀病毒載體
製備一種桿狀病毒載體，其編碼包含子單元VP1、VP2及VP3之經修飾之AAV8衣殼蛋白質以及AAV8非結構蛋白質Rep78及Rep52 (BacAAV8-Rep-VPmod，圖1)。
簡言之，在GenScript中合成編碼AAV8衣殼蛋白質(VP1、VP2及Vp3)且具有側接Not I及Apa I限制位點之DNA構築體，該衣殼蛋白質具有包含SEQ ID NO:21中所闡述之序列之經修飾之VP1子單元(AAV8-VPmod，圖2)。使用編碼非結構蛋白質Rep78、Rep68、Rep52及Rep40之wtAAV8-Rep/Cap質體(Virovek, Hayward, CA)以及衣殼蛋白質VP1、VP2及VP3及組裝活化蛋白質(AAP)作為主鏈以收納AAV8-VPmod DNA構築體。用Not I及Apa I消化AAV8-VPmod DNA構築體及wtAAV8-Rep/Cap質體，隨後使AAV8-VPmod DNA構築體代替wt衣殼蛋白質編碼序列接合至wtAAV8-Rep/Cap質體主鏈(圖3)，得到AAV8-Rep-VPmod (圖4)。
接著，將AAV8-Rep-VPmod中間物選殖至pOET1桿狀病毒轉移載體(Oxford Expression Technologies)中。為了有助於此操作，使用Quickchange技術將EcoR V位點插入AAV8-Rep-VPmod中間物中，得到AAV8-Rep-VPmod-EcoRV中間物。接著用Not I及EcoR V消化AAV8-Rep-VPmod-EcoRV中間物及pOET1，且接著使插入物接合至pOET1主鏈(Oxford Expression Technologies)，產生最終AAV8-Rep-VPmod純系(BacAAV8-Rep-VPmod，圖1)。 1.4 產生表現結構及非結構AAV9蛋白質之桿狀病毒載體
製備一種桿狀病毒載體，其編碼包含子單元VP1、VP2及VP3之AAV9衣殼蛋白質及AAV9非結構蛋白質Rep78、Rep68、Rep52及Rep40(BacAAV9-Rep-VPmod，圖5)。
簡言之，在GenScript中合成DNA構築體，其編碼具有由SEQ ID NO:22中所闡述之序列編碼之經修飾之AAV9 VP1子單元之AAV9衣殼蛋白質，且具有側接Not I及Apa I限制位點(AAV9-VPmod，圖6)。使用編碼非結構蛋白質Rep78、Rep68、Rep52及Rep40之野生型AAV9-Rep質體(Virovek, Hayward, CA)以及衣殼蛋白質VP1、VP2及VP3及組裝活化蛋白質(AAP)作為主鏈以收納AAV9-VPmod DNA構築體。用Not I及Apa I消化AAV9-VPmod DNA構築體及wtAAV9-Rep質體，隨後使AAV9-VPmod DNA構築體代替野生型衣殼蛋白質編碼序列接合至wtAAV9-Rep質體主鏈(圖3)，得到AAV9-Rep-VPmod (圖7)。
接著，將AAV9-Rep-VPmod中間物選殖至pOET1桿狀病毒轉移載體(Oxford Expression Technologies)中。為了有助於此操作，使用Quickchange技術將EcoR V位點插入AAV9-Rep-VPmod中間物中，得到AAV9-Rep-VPmod-EcoRV中間物。接著用Not I及EcoR V消化AAV9-Rep-VPmod-EcoRV中間物及pOET1 (Oxford Expression Technologies)且接著使插入物接合至pOET1主鏈，產生最終AAV9-Rep-VPmod純系(BacAAV9-Rep-CapPL，圖5)。 1.5 產生表現感興趣的基因(GOI)之桿狀病毒載體
製備編碼由AAV2反向末端重複序列(ITR)側接之感興趣的基因(GOI)之桿狀病毒載體。簡言之，在一個實例中，藉由用Not I消化AAV2-GOI構築體(圖8)及pOET1 (Oxford Expression Technologies)，及使AAV2-GOI接合至pOET1主鏈以產生最終純系(BacAAV2-GOI，圖9)來將編碼二個靶向由AAV2 ITR側接之人類PABPN1之轉錄物的shmiR之DNA構築體選殖至pOET1桿狀病毒轉移載體(Oxford Expression Technologies)中。亦與上文所描述一致的方式製備第二GOI，但編碼三個靶向HBV聚合酶基因轉錄物之各種區域之shmiR。 1.6 產生P0桿狀病毒原料
使用Oxford Expression Technologies baculoCOMPLETE系統產生桿狀病毒P0原料(根據製造商說明書)。簡言之，在轉染之前1小時將1百萬個Sf9細胞接種於6孔盤中且使其黏附至盤。在1 ml TC100培養基中，將500 ng Bac-AAV2-GOI質體、BacAAV8-Rep-CapPL或BacAAV9-Rep-CapPL與500 ng急驟BAC DNA及baculoFECTIN轉染劑混合(根據製造商方案)。在室溫下培育30分鐘之後，將轉染混合物添加至經接種之Sf9細胞中。在28℃下培育6孔盤。在轉染後24小時，向細胞中添加1 ml Sf9培養基。在轉染後第5天，收集含有P0桿狀病毒原料之培養基且在4℃下儲存。因此，產生用於BacAAV8-Rep-CapPL、BacAAV9-Rep-CapPL及Bac-AAV2-GOI之P0桿狀病毒。 1.7 產生P1桿狀病毒原料
在2×10e6個細胞/毫升之濃度下，使用500 μl P0桿狀病毒原料感染100 ml Sf9細胞培養物。在140 rpm下振盪情況下，在28℃下培育桿狀病毒培養物5天。在感染後第5天，收集含有P1之培養基且在4℃下儲存。 1.8 產生P2桿狀病毒原料
在2×10e6個細胞/毫升之濃度下，使用500 μl P1桿狀病毒原料感染100 ml Sf9細胞培養物。在140 rpm下振盪情況下，在28℃下培育桿狀病毒培養物5天。在感染後第5天，收集含有P2之培養基且在4℃下儲存。 1.9 滴定P2桿狀病毒原料
使用Oxford Expression Technologies baculoQUANT套組測定桿狀病毒P2原料之效價。根據製造商指令，用所提供之溶解緩衝液連續稀釋及溶解桿狀病毒原料。使用用於桿狀病毒包膜融合蛋白質gp64之qPCR擴增DNA。使用標準曲線定量P2原料且外推以測定病毒pfu/ml。 1.10 用於產生AAV之共同感染
在2x10e6個細胞/毫升之細胞密度下，用BacAAV8-Rep-CapPL及BacAAV2-GOI (編碼3個靶向HBV聚合酶基因轉錄物之shmiR)在0.1之MOI下或BacAAV9-Rep-CapPL及BacAAV2-GOI (編碼2個靶向人類PABPN1基因轉錄物之shmiR)在0.1之MOI下共同感染600 ml Sf9細胞。接著，在115 rpm下振盪情況下，在28℃下培育細胞培養物6天。 1.11 AAV之純化
在感染後第六天，自受感染之培養物收集澄清培養基。相繼使用0.2微米過濾及0.1微米過濾自AAV濾除桿狀病毒。接著，將PEG添加至不含桿狀病毒之培養基中以使AAV沈澱。在PEG添加後24小時，培養基在2500 g下旋轉45分鐘以使AAV集結。丟棄上清液且使粒化病毒懸浮於溶解緩衝液中。藉由碘克沙醇梯度進行AAV該等初始純化，由其收集40-60%溶離份之間的5 ml層。對此含有病毒之層進行緩衝液更換以移除殘餘碘克沙醇且使更換緩衝液之病毒在銫梯度上分層。接著對銫梯度進行隔夜離心。用針筒收集來自銫梯度之含有AAV之色帶且更換緩衝液以自經純化之AAV病毒原料移除氯化銫。 1.12 滴定AAV
藉由qPCR定量所有AAV製劑之最終AAV效價。簡言之，在室溫下，用DNAse處理(DNAseI，擴增級，1 U/μl，Invitrogen)十微升經純化之AAV病毒15分鐘。接著，藉由在65℃下培育10分鐘使DNAse酶去活化。如下稀釋病毒：1:10；1:30；1:100；1:1,000；1:3,000；1:10,000。藉由qPCR分析各稀釋物以測定每毫升病毒基因組之總數。 1.13 在哺乳動物細胞中製備之AAV
比較在哺乳動物細胞中製備之AAV與如上文所描述在昆蟲細胞中製備之AAV之功能性。為了比較在哺乳動物及昆蟲細胞中製備之重組型AAV之生物活性(功能性)，用各種效價之病毒活體外感染哺乳動物細胞且使用qRT PCR分析法定量經處理之shmiR的表現。
對於此等實驗，由商業供應商(Vector Biolabs；https://www.vectorbiolabs.com)在哺乳動物細胞中製備重組型AAV8粒子，其表現3個靶向HBV聚合酶基因轉錄物之shmiR。此外，藉由第二供應商在哺乳動物細胞中製備表現2個靶向人類PABPN1之shmiR之重組型AAV9粒子，亦即Nationwide Children之醫院載體核心(https://www.nationwidechildrens.org/research/ resources-infrastructure/core-facilities/viral-vector-core-clinical-manufacturing-facility)。
評估以下之生物活性：(i)在哺乳動物細胞中產生之具有未經修飾之VP1之AAV8 (Vector Biolabs)，(ii)在昆蟲細胞中藉由桿狀病毒產生之具有經修飾之VP1之AAV8 (如本文中所描述，使用BacAAV8-Rep-VPmod)，及(iii)使用wtAAV8-Rep/Cap在昆蟲細胞中藉由桿狀病毒產生之具有未經修飾之野生型VP1之AAV8 (Ben10，Virovek, Hayward, CA)，各自編碼3個靶向HBV聚合酶基因之shmiR (shmiR1、shmiR2及shmiR3)。簡言之，在4×10e9、8×10e9及1.6×10e10之MOI下，用上文所描述之經修飾或未經修飾之重組型病毒製劑感染JHU67細胞，且在感染之後定量三個shmiR中之每一者之shmiR表現72小時。為了定量shmiR之表現，使用Qiagen RNA微型套組(Qiagen)自受感染之細胞提取RNA。使用Qiagen miScript套組(Qiagen)反轉錄RNA。接著，在qPCR反應中使用cDNA，其中特異性引子經設計以擴增shmiR目標，以測定樣品中之複本之總數。
如圖10A-10C中所示，用在哺乳動物細胞中製備之具有未經修飾之野生型VP1之AAV8感染的細胞產生可易於偵測之shmiR位準，而在昆蟲細胞中藉由桿狀病毒產生之具有未經修飾之野生型VP1之AAV8產生極少(若存在)shmiR。相比之下，在昆蟲細胞中藉由桿狀病毒產生之具有經修飾之VP1之AAV8產生相對高位準的shmiR，指示此等AAV之功能性增加，如與在昆蟲細胞中藉由桿狀病毒產生之具有未經修飾之野生型VP1之AAV8相比。
亦評估以下之生物活性(i)在哺乳動物細胞中產生之具有未經修飾之衣殼蛋白質之AAV9 (Nationwide)，及(ii)使用BACAAV9-Rep-VPmod (如本文中所描述)在昆蟲細胞中藉由桿狀病毒產生之具有經修飾之衣殼蛋白質之AAV9，各自編碼2個靶向人類PABPN1之轉錄物之shmiR (稱為sh13及sh17)。簡言之，用4×10e9、8×10e9及1.6×10e10載體基因組感染表現AAV內化受體之C2C12細胞。在72小時培育之後，收集細胞，提取RNA且根據上文所描述之qPCR方法定量二個shmiR之shmiR表現。
如圖11中所示，二種製劑展示極類似的shmiR表現位準，指示極類似的病毒功能性。
雖然在AAV之情形下由血清型8及9說明，但預期當由昆蟲細胞中之桿狀病毒表現系統產生時，根據本文中所描述之方法修飾其他AAV血清型(除血清型2以外)之VP1子單元序列將恢復AAV之功能性。
熟習此項技術者應瞭解，可在不偏離本發明之廣泛一般範疇的情況下進行上述實施例之大量變化及/或修改。因此，將本發明之實施例在所有方面視為說明性且非限制性的。
圖1為名為BacAAV8-Rep-VPmod之DNA構築體之向量圖。此DNA構築體經設計以在昆蟲細胞中表現AAVRep 蛋白質及經修飾之AAV8衣殼。載體主鏈為桿狀病毒載體pOET1主鏈(Oxford Expression Technologies)且用於在昆蟲細胞中產生含有經修飾之AAV8衣殼蛋白質之AAV。
圖2為名為AAV8-VPmod之DNA構築體之向量圖。此DNA構築體含有AAV8衣殼基因之經修飾之版本，其用於產生AAV8-Rep-VPmod (圖4)及BacAAV8-Rep-VPmod (圖1)。
圖3為名為wtAAV8-Rep/Cap之DNA構築體之向量圖。DNA構築體經設計以在昆蟲細胞中表現AAVRep 蛋白質及wt AAV8衣殼且用於產生含有wtAAV8衣殼蛋白質之AAV。
圖4為名為AAV8-Rep-VPmod之DNA構築體之向量圖。此DNA構築體經設計以在昆蟲細胞中表現AAVRep 蛋白質及經修飾之AAV8衣殼且用於產生BacAAV8-Rep-VPmod (圖1)。
圖5為名為BacAAV9-Rep-VPmod之DNA構築體之向量圖。此DNA構築體經設計以在昆蟲細胞中表現AAVRep 蛋白質及經修飾之AAV9衣殼。載體主鏈為桿狀病毒載體pOET1主鏈(Oxford Expression Technologies)且用於產生含有經修飾之AAV9衣殼蛋白質之AAV。
圖6為名為AAV9-VPmod之DNA構築體之向量圖。此DNA構築體含有AAV9衣殼基因之經修飾之版本，其用於產生BacAAV9-Rep-VPmod (圖5)。
圖7為名為AAV9-Rep-VPmod之DNA構築體之向量圖。此DNA構築體經設計以在昆蟲細胞中表現AAVRep 蛋白質及經修飾之AAV9衣殼。
圖8為名為AAV2-GOI之DNA構築體之向量圖。此DNA構築體經設計以表現由AAV ITR側接之二個shmiR且用於產生BacAAV2-GOI (圖9)。
圖9為名為BacAAV2-GOI之DNA構築體之向量圖。此DNA構築體經設計以在桿狀病毒載體pOET1主鏈(Oxford Expression Technologies)中表現由AAV ITR (AAV2-GOI)側接之二個shmiR。此構築體用於產生含有經修飾之AAV9衣殼蛋白質之AAV，該衣殼蛋白質表現編碼二個shmiR之GOI。
圖10A-10C展示來自用以下之4×10e9、8×10e9及1.6×10e10個AAV載體基因組感染之JHU67細胞的每個細胞表現之shmiR複本之總數：(i)具有哺乳動物細胞中產生之未經修飾之VP1之AAV8 (VecBio),(ii)具有由昆蟲細胞中之桿狀病毒產生之經修飾之VP1之AAV8(BacVPmod)及(iii)具有由昆蟲細胞中之桿狀病毒產生之未經修飾之VP1之AAV8 (Ben10)。與具有在昆蟲細胞中產生之野生型衣殼之AAV相比(其中表現幾乎不可偵測)，具有在哺乳動物細胞中產生之野生型衣殼之AAV表現高位準的shmiR。與使用未經修飾之野生型衣殼在昆蟲中產生之AAV相比，具有含有在昆蟲細胞中產生之經修飾之VP1的衣殼之AAV展示顯著增加的表現，且因此展示顯著增加的功能性。
圖11展示由表現AAV內化受體(AAV-R)且用以下之4x10e9、8x10e9及1.6x10e10個AAV載體基因組感染之C2C12細胞表現的shmiR複本之總數：(i)具有在哺乳動物細胞中產生之未經修飾之VP1之AAV9，及(ii)具有由昆蟲細胞中之桿狀病毒產生之經修飾之VP1之AAV9。二種重組型病毒產生相同位準的shmiR，表明等效功能性。
<110> 美商貝尼科技智產控股股份有限公司(BENITEC IP HOLDINGS INC.)
<120> 具有經修飾之磷脂酶區域的腺相關病毒(AAV)
<130> PI-68014-AM
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<141> 2018-08-30
<150> US 65/553,028
<151> 2017-08-31
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型之經修飾的共同VP1子序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Asn或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa為Gly或Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (20)..(20)
<223> Xaa為Arg或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa為Glu或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa為Val或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa為Arg或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(36)
<223> Xaa為Ile或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> Xaa為Ser或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> Xaa為Asn或Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> Xaa為Lys或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (61)..(61)
<223> Xaa為Glu或Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (62)..(62)
<223> Xaa為Lys或Arg
<400> 1
Figure 107130363-A0305-02-0080-1
Figure 107130363-A0305-02-0081-2
<210> 2
<211> 64
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 2
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<210> 3
<211> 64
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 3
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<210> 4
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<213> 腺相關病毒
<400> 4
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<210> 5
<211> 64
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 5
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<210> 6
<211> 64
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 6
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<210> 7
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<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 7
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<210> 8
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<212> PRT
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<400> 8
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<210> 9
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<400> 9
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<210> 10
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<212> PRT
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<400> 10
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<210> 11
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<212> PRT
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<400> 11
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<210> 12
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<212> PRT
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<213> 腺相關病毒
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<210> 14
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<400> 14
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Figure 107130363-A0305-02-0087-18
<210> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型1之經修飾之VP1子序列
<400> 15
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<210> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> AAV血清型3之經修飾之VP1子序列
<400> 16
Figure 107130363-A0305-02-0087-20
Figure 107130363-A0305-02-0088-21
<210> 17
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型4之經修飾之VP1子序列
<400> 17
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<210> 18
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型5之經修飾之VP1子序列
<400> 18
Figure 107130363-A0305-02-0088-23
Figure 107130363-A0305-02-0089-24
<210> 19
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型6之經修飾之VP1子序列
<400> 19
Figure 107130363-A0305-02-0089-25
<210> 20
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型7之經修飾之VP1子序列
<400> 20
Figure 107130363-A0305-02-0089-26
Figure 107130363-A0305-02-0090-27
<210> 21
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型8之經修飾之VP1子序列
<400> 21
Figure 107130363-A0305-02-0090-28
<210> 22
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型9之經修飾之VP1子序列
<400> 22
Figure 107130363-A0305-02-0090-29
Figure 107130363-A0305-02-0091-30
<210> 23
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型10之經修飾之VP1子序列
<400> 23
Figure 107130363-A0305-02-0091-31
<210> 24
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型11之經修飾之VP1子序列
<400> 24
Figure 107130363-A0305-02-0091-32
Figure 107130363-A0305-02-0092-33
<210> 25
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型12之經修飾之VP1子序列
<400> 25
Figure 107130363-A0305-02-0092-34
<210> 26
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAV血清型13之經修飾之VP1子序列
<400> 26
Figure 107130363-A0305-02-0093-35
<210> 27
<211> 726
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 27
Figure 107130363-A0305-02-0093-36
Figure 107130363-A0305-02-0094-37
Figure 107130363-A0305-02-0095-38
Figure 107130363-A0305-02-0096-39
Figure 107130363-A0305-02-0097-40
<210> 28
<211> 735
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 28
Figure 107130363-A0305-02-0097-41
Figure 107130363-A0305-02-0098-42
Figure 107130363-A0305-02-0099-43
Figure 107130363-A0305-02-0100-44
<210> 29
<211> 736
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 29
Figure 107130363-A0305-02-0101-45
Figure 107130363-A0305-02-0102-46
Figure 107130363-A0305-02-0103-47
Figure 107130363-A0305-02-0104-48
<210> 30
<211> 734
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 30
Figure 107130363-A0305-02-0104-49
Figure 107130363-A0305-02-0105-50
Figure 107130363-A0305-02-0106-51
Figure 107130363-A0305-02-0107-52
Figure 107130363-A0305-02-0108-53
<210> 31
<211> 724
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 31
Figure 107130363-A0305-02-0108-54
Figure 107130363-A0305-02-0109-55
Figure 107130363-A0305-02-0110-56
Figure 107130363-A0305-02-0111-57
Figure 107130363-A0305-02-0112-58
<210> 32
<211> 736
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 32
Figure 107130363-A0305-02-0112-59
Figure 107130363-A0305-02-0113-60
Figure 107130363-A0305-02-0114-61
Figure 107130363-A0305-02-0115-62
Figure 107130363-A0305-02-0116-63
<210> 33
<211> 746
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 33
Figure 107130363-A0305-02-0116-64
Figure 107130363-A0305-02-0117-65
Figure 107130363-A0305-02-0118-66
Figure 107130363-A0305-02-0119-67
Figure 107130363-A0305-02-0120-68
<210> 34
<211> 738
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 34
Figure 107130363-A0305-02-0120-69
Figure 107130363-A0305-02-0121-70
Figure 107130363-A0305-02-0122-71
Figure 107130363-A0305-02-0123-72
<210> 35
<211> 736
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 35
Figure 107130363-A0305-02-0124-73
Figure 107130363-A0305-02-0125-74
Figure 107130363-A0305-02-0126-75
Figure 107130363-A0305-02-0127-76
<210> 36
<211> 738
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 36
Figure 107130363-A0305-02-0128-77
Figure 107130363-A0305-02-0129-78
Figure 107130363-A0305-02-0130-79
Figure 107130363-A0305-02-0131-80
<210> 37
<211> 733
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 37
Figure 107130363-A0305-02-0131-81
Figure 107130363-A0305-02-0132-82
Figure 107130363-A0305-02-0133-83
Figure 107130363-A0305-02-0134-84
Figure 107130363-A0305-02-0135-85
<210> 38
<211> 742
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 38
Figure 107130363-A0305-02-0135-86
Figure 107130363-A0305-02-0136-87
Figure 107130363-A0305-02-0137-88
Figure 107130363-A0305-02-0138-89
Figure 107130363-A0305-02-0139-90
<210> 39
<211> 733
<212> PRT
<213> 腺相關病毒
<400> 39
Figure 107130363-A0305-02-0139-91
Figure 107130363-A0305-02-0140-92
Figure 107130363-A0305-02-0141-93
Figure 107130363-A0305-02-0142-94
Figure 107130363-A0305-02-0143-95

Claims (32)

  1. 一種核酸分子，其包含一編碼來自除腺相關病毒(AAV)血清型2以外之血清型的AAV的一病毒衣殼蛋白(viral capsid protein)與磷脂酶區域之聚核苷酸序列，其中該病毒衣殼蛋白包含一經修飾之子單元1(VP1)序列，該經修飾之子單元1(VP1)序列包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸以及位置64處之離胺酸，其中該等胺基酸位置係相對於SEQ ID NO：1中所闡述之序列被定義。
  2. 如請求項1之核酸分子，其中該病毒衣殼蛋白係選自於由下列所構成之群組：(i)一來自AAV1之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：15中所闡述之序列；(ii)一來自AAV3之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：16中所闡述之序列；(iii)一來自AAV4之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：17中所闡述之序列；(iv)一來自AAV5之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：18中所闡述之序列；(v)一來自AAV6之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：19中所闡述之序列；(vi)一來自AAV7之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：20中所闡述之序列； (vii)一來自AAV8之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：21中所闡述之序列；(viii)一來自AAV9之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：22中所闡述之序列；(ix)一來自AAV10之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：23中所闡述之序列；(x)一來自AAV11之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：24中所闡述之序列；(xi)一來自AAV12之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：25中所闡述之序列；以及(xii)一來自AAV13之病毒衣殼蛋白，其中該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：26中所闡述之序列。
  3. 如請求項1之核酸分子，其中該病毒衣殼蛋白來自AAV8且該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：21中所闡述之序列。
  4. 如請求項1之核酸分子，其中該病毒衣殼蛋白來自AAV9且該經修飾之VP1序列包含SEQ ID NO：22中所闡述之序列。
  5. 如請求項1之核酸分子，其中：(i)該病毒衣殼蛋白包含來自與該經修飾之VP1相同的AAV血清型之子單元2(VP2)以及子單元3(VP3)序列；(ii)編碼該AAV病毒衣殼蛋白之該核苷酸序列係可操作地連接至一用於在昆蟲細胞中表現的啟動子；(iii)該核苷酸序列包含一聚核苷酸序列，其編碼至少一種 選自Rep78及Rep68之大型AAV複製(Rep)蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAV Rep蛋白質；或(iv)(i)至(iii)之任何組合。
  6. 如請求項5之核酸分子，其中該用於在昆蟲細胞中表現的啟動子為一多角體啟動子(polyhedron promoter)或一p10啟動子。
  7. 如請求項5之核酸分子，其包含一編碼Rep78及Rep52之聚核苷酸序列。
  8. 如請求項5之核酸分子，其中該編碼Rep蛋白質之聚核苷酸序列係可操作地連接至一用於在昆蟲細胞中表現該等Rep蛋白質的啟動子。
  9. 如請求項8之核酸分子，其中該用於在昆蟲細胞中表現的啟動子為一多角體啟動子或一p10啟動子。
  10. 一種桿狀病毒載體，其包含如請求項1至9中任一項之核酸分子。
  11. 一種複數個桿狀病毒載體，其包含：(i)一第一桿狀病毒載體，其包含如請求項1至9中任一項之核酸分子；以及(ii)一第二桿狀病毒載體，其包含一編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之一感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸。
  12. 一種複數個桿狀病毒載體，其包含：(i)一第一桿狀病毒載體，其包含如請求項1至6中 任一項之核酸分子；(ii)一第二桿狀病毒載體，其包含一聚核苷酸序列，該聚核苷酸序列編碼至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAV複製(Rep)蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAV Rep蛋白質；以及(iii)一第三桿狀病毒載體，其包含一編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之一感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸。
  13. 如請求項12之複數個桿狀病毒載體，其中：(i)該第二桿狀病毒載體包含一編碼Rep78及Rep52之聚核苷酸序列；及/或(ii)該編碼Rep蛋白質之聚核苷酸序列係可操作地連接至一用於在昆蟲細胞中表現該等Rep蛋白質的啟動子。
  14. 一種昆蟲細胞，其包含如請求項1至9中任一項之核酸分子。
  15. 如請求項14之昆蟲細胞，其中：(i)該編碼AAV病毒衣殼蛋白之聚核苷酸序列及該編碼Rep蛋白質之聚核苷酸序列係由該昆蟲細胞內之游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現；及/或；(ii)一編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之一感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸係由該昆蟲細胞內之游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現。
  16. 一種昆蟲細胞，其包含如請求項10之桿 狀病毒載體。
  17. 如請求項16之昆蟲細胞，其中：(i)該編碼AAV病毒衣殼蛋白之聚核苷酸序列及該編碼Rep蛋白質之聚核苷酸序列係由該昆蟲細胞內之游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現；及/或(ii)一編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之一感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸係由該昆蟲細胞內之游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現。
  18. 一種昆蟲細胞，其包含如請求項12之複數個桿狀病毒載體。
  19. 如請求項18之昆蟲細胞，其中：(i)該編碼AAV病毒衣殼蛋白之聚核苷酸序列及該編碼Rep蛋白質之聚核苷酸序列係由該昆蟲細胞內之游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現；及/或(ii)一編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之一感興趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸係由該昆蟲細胞內之游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現。
  20. 一種昆蟲細胞，其包含如請求項13之複數個桿狀病毒載體。
  21. 如請求項20之昆蟲細胞，其中：(i)該編碼AAV病毒衣殼蛋白之聚核苷酸序列及該編碼Rep蛋白質之聚核苷酸序列係由該昆蟲細胞內之游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現；及/或(ii)一編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之一感興 趣的蛋白質或RNA之聚核苷酸係由該昆蟲細胞內之游離複製型重組型桿狀病毒基因組表現。
  22. 一種用於在昆蟲細胞中產生腺相關病毒(AAV)之方法，其包含：在一培養基中，在足以使該等細胞產生AAV之條件下，培養昆蟲細胞；以及任擇地自該等培養基及/或細胞回收AAV；以及任擇地自該等培養基及/或細胞純化該AAV；其中：(i)該昆蟲細胞包含如請求項1至9中任一項之核酸分子；(ii)該昆蟲細胞包含如請求項10之桿狀病毒載體；(iii)該昆蟲細胞包含如請求項12之複數個桿狀病毒載體；及/或(iv)該昆蟲細胞包含如請求項13之複數個桿狀病毒載體。
  23. 一種用於在昆蟲細胞中產生腺相關病毒(AAV)之方法，其包含：(i)用以下共同感染一昆蟲細胞：一第一桿狀病毒，其具有一包含如請求項7至9中任一項之核酸分子之基因組；以及一第二桿狀病毒，其具有一包含一聚核苷酸之基因組，該聚核苷酸編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之一感興趣的蛋白質或RNA；(ii)在一培養基中，在足以使該等細胞產生AAV之 條件下，培養該等在(i)中用該等桿狀病毒感染之昆蟲細胞；以及任擇地(iii)自該等培養基及/或細胞回收該AAV；以及任擇地(iv)自該等培養基及/或細胞純化該AAV。
  24. 一種用於在昆蟲細胞中產生腺相關病毒(AAV)之方法，其包含：(i)用以下共同感染一昆蟲細胞：一第一桿狀病毒，其具有一包含如請求項1至6中任一項之核酸分子之基因組；一第二桿狀病毒，其具有一包含一聚核苷酸序列之基因組，該聚核苷酸序列編碼至少一種選自Rep78及Rep68之大型AAV複製(Rep)蛋白質及至少一種選自Rep52及Rep40之小型AAV Rep蛋白質；以及一第三桿狀病毒，其具有一包含一聚核苷酸之基因組，該聚核苷酸編碼由AAV反向末端重複(ITR)序列側接之一感興趣的蛋白質或RNA；(ii)在一培養基中，在足以使該等細胞產生AAV之條件下，培養該等在(i)中用該等桿狀病毒感染之昆蟲細胞；以及任擇地(iii)自該等培養基及/或細胞回收該AAV；以及任擇地(iv)自該等培養基及/或細胞回收該AAV。
  25. 一種腺相關病毒(AAV)，其係藉由如請求項22之方法製造。
  26. 一種腺相關病毒(AAV)，其係藉由如請求項23之方法製造。
  27. 一種腺相關病毒(AAV)，其係藉由如請求項24之方法製造。
  28. 一種腺相關病毒(AAV)，其包含一由如請求項1至9中任一項之核酸分子所編碼之病毒衣殼蛋白。
  29. 一種改良來自在昆蟲細胞中所產生之血清型2以外之其它血清型的腺相關病毒(AAV)之核內體脫離活性的方法，其包含藉由僅取代位置1、26、40、43、44及64處之一或多個胺基酸來相對於對應的野生型序列修飾該AAV之一病毒衣殼蛋白，使得該病毒衣殼蛋白包含位置1處之絲胺酸、位置26處之麩胺酸、位置40處之精胺酸、位置43處之天冬胺酸、位置44處之絲胺酸以及位置64處之離胺酸，其中該等殘基位置係相對於SEQ ID NO：1中所闡述之序列被測定，且其中該AAV相對於未經修飾且在昆蟲細胞中產生之對應的野生型AAV具有經改良之核內體脫離活性。
  30. 如請求項29之方法，其包含相對於該對應的野生型序列修飾該AAV之病毒衣殼蛋白，使得(i)當該AAV係血清型1時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：15中所闡述之序列；(ii)當該AAV係血清型3時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：16中所闡述之序列；(iii)當該AAV係血清型4時，該病毒衣殼蛋白包括 一VP1序列，其包含SEQ ID NO：17中所闡述之序列；(iv)當該AAV係血清型5時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：18中所闡述之序列；(v)當該AAV係血清型6時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：19中所闡述之序列；(vi)當該AAV係血清型7時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：20中所闡述之序列；(vii)當該AAV係血清型8時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：21中所闡述之序列；(viii)當該AAV係血清型9時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：22中所闡述之序列；(ix)當該AAV係血清型10時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：23中所闡述之序列；(x)當該AAV係血清型11時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：24中所闡述之序列；(xi)當該AAV係血清型12時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：25中所闡述之序列；以及(xii)當該AAV係血清型13時，該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，其包含SEQ ID NO：26中所闡述之序列。
  31. 如請求項29之方法，其包含相對於該對應的野生型序列修飾一血清型8之AAV之病毒衣殼蛋白，使得該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，該VP1序列包含SEQ ID NO：21中所闡述之序列。
  32. 如請求項29之方法，其包含相對於該對應的野生型序列修飾一血清型9之AAV之病毒衣殼蛋白，使得該病毒衣殼蛋白包括一VP1序列，該VP1序列包含SEQ ID NO：22中所闡述之序列。
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