CN101522903B - 具有重叠开放阅读框的基因在昆虫细胞中的表达及其方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于在昆虫细胞中表达由包含重叠开放阅读框(ORF)的基因编码的多种多肽的核酸盒。所述核酸盒按照5’至3’顺序包含：a)第一昆虫细胞可操作启动子；b)包含所述基因的第一ORF的基因的5’部分；c)包含第二昆虫细胞可操作启动子的内含子；以及d)包含至少一种另外的ORF的基因的3’部分。本发明还公开了包含所述核酸盒的载体和昆虫细胞，以及使用所述核酸盒在昆虫细胞中制备重组腺病毒相关病毒的方法。

Description

具有重叠开放阅读框的基因在昆虫细胞中的表达及其方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年8月24日提交的美国临时专利申请60/839,761的优先权，其通过引用完整并入本申请。 
背景技术
已知哺乳动物基因组中存在包含重叠开放阅读框(ORF)的基因。在某些情况中，这些基因包含具有支持ORF转录的启动子的内含子(参见，例如，Reisman，D.等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA(《美国科学院院刊》)85：5146-5150，1988；Bennett，V.D.等，J.Biol.Chem.(《生物化学杂志》)265：2223-2230，1990)。然而，编码多种ORF且在内含子中包含启动子的天然存在或人工的昆虫基因尚无报道。 
细小病毒科(Parvoviridae)包括单链DNA动物病毒家族。细小病毒科分为两种亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和感染昆虫的浓核病毒亚科(Densovirinae)。细小病毒亚科(本文中其成员被称为细小病毒)包括依赖病毒属(Dependovirus)，依赖病毒属成员的独特之处在于，对于细胞培养物中的生产性感染，在大多数条件下这些病毒需要与辅助病毒，诸如腺病毒或疱疹病毒共感染。依赖病毒属包括正常情况下感染人类和灵长类动物的腺病毒相关病毒(AAV)(例如，血清型1、2、3、3A、3B、4、5、6、7、8、9、10以及11)和感染其他温血动物的有关病毒(例如，牛、犬、马以及羊的腺病毒相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其他成员描述于Kenneth I.Berns，“Parvoviridae：The Viruses and TheirReplication(细小病毒科：病毒及其复制)，”FIELDS VIROLOGY(《费氏病毒学》)第69章(第3版，1996)，和Choi等，Curr Gene Ther. (《现代基因治疗》)6月；5(3)：299-310(2005)的最新综述文章。 
AAV基因组是线性单链DNA分子，具有少于约5,000个核苷酸(nt)长度。末端反向重复序列(ITR)侧邻非结构复制蛋白(Rep)和结构蛋白(VP)的单一核苷酸编码序列。ITR自我互补并且其构成使得能够形成能量稳定的分子内双链T形发夹。这些发夹结构作为病毒DNA复制的起始点发挥作用。Rep基因编码Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52以及Rep40。Rep78及其剪接变体Rep68从自p5启动子转录的mRNA翻译而来。Rep52及其剪接变体Rep40从自p19启动子转录的mRNA翻译而来。Cap基因编码VP蛋白VP1、VP2以及VP3。这些蛋白形成衣壳，由Cap基因自p40启动子转录产生的两种剪接的mRNA合成。其中一种信使RNA被翻译成VP1，而另一种转录物编码VP2和VP3。VP2的天然存在的起始密码子是劣用的ACG，其导致核糖体扫描至VP3起始密码子(AUG)。VP1转录物的两个剪接受体位点的交替使用和VP2的ACG起始密码子的劣用被认为对AAV2感染的哺乳动物细胞中VP1、VP2以及VP3的化学计量发挥作用，并反映衣壳中的蛋白比例1∶1∶10。Urabe，M.等，Hum.Gene Ther.(《人类基因治疗》)13：1935-1943，2002。 
已知AAV的ITR作为复制起始点，即在复制中具有“顺式(cis)”作用的位点发挥作用，并作为反式作用复制蛋白(例如，Rep78或Rep68)的识别位点发挥作用，所述反式作用复制蛋白识别回文序列和回文序列内部的特定序列。ITR序列的对称性的一个例外是ITR的“D”区。它是单一的(在一种ITR中不具有互补性)。单链DNA的切口产生于A和D区之间的连接处。它是新的DNA合成起始的区域。D区通常位于回文序列的一侧，并提供核酸复制步骤的方向性。哺乳动物细胞中的AAV复制通常具有两种ITR序列。 
在哺乳动物细胞中，AAV的四种Rep蛋白由来自单阅读框的多种转录物编码。图位5和19的启动子调控Rep ORF的转录。Rep78和Rep68从p5启动子表达，且相互间的3’剪接不同。Rep68是Rep78的羧基截短形式，但是由于在剪接受体位点存在移码，导致Rep68 含有7个特有的残基。Rep52和Rep40转录物由p19启动子表达，并与较大的Rep多肽位于框内。较小的Rep多肽相互之间以Rep78和Rep68的相同方式通过剪接事件而不同。Rep的功能结构域是：氨基末端--DNA结合--DNA切割--ATP酶--螺旋酶--核定位信号--修饰的锌指--COOH。DNA结合和DNA切割的功能仅存在于自p5转录的Rep蛋白。 
AAV经作为一种连续分子的双链DNA中间体(两条链通过ITR共价连接)复制。p5Rep蛋白能够识别ITR内的基序，切割双链的一条链，并通过切口5’侧的酪氨酸基胸腺嘧啶核苷磷酸二酯键共价连接。Rep的螺旋酶活性被认为对新产生的5’末端的解旋发挥作用，且细胞聚合酶复合物延伸凹缺的3’末端而产生双链钝末端复制中间体。较小的Rep蛋白保留ATP依赖的DNA螺旋酶活性，并参与单链病毒基因组的衣壳化。Rep52和Rep40与所形成的衣壳相关，并且据推测，解旋双链复制中间体。 
最近几年，AAV由于其有效感染非分裂细胞和分裂细胞、整合入人类基因组的单个染色体位点并对人类具有较低的致病危险的能力，而成为基因治疗的优选病毒载体。鉴于这些优点，重组腺病毒相关病毒(rAAV)目前用于乙型血友病、恶性黑色素瘤、囊性纤维化病以及其他疾病的基因治疗临床试验。 
用于在昆虫细胞中制备AAV的AAV序列可衍生自任何AAV血清型的基因组。通常，AAV血清型具有在氨基酸和核酸水平的显著序列同一性的基因组序列，提供实质上相同的一系列遗传功能，产生物理和功能上基本相同的病毒体，并通过实际上相同的机制复制和装配。对于AAV血清型的基因组序列和基因组相似性的讨论，参见，例如，GenBank登录号U89790；GenBank登录号J01901；GenBank登录号AF043303；GenBank登录号AF085716；Chiorini等，J.Vir.(《病毒学杂志》)71：6823-33(1997)；Srivastava等，《病毒学杂志》45：555-64(1983)；Chiorini等，《病毒学杂志》73：1309-1319(1999)；Rutledge等，《病毒学杂志》72：309-319(1998)；以及Wu等， 《病毒学杂志》74：8635-47(2000)。 
使用当前的哺乳动物细胞制备系统进行大规模rAAV制备如果不是完全不可行，则其所涉及的困难也是显著的。例如，对于某些临床研究来说，可能需要多于1015个颗粒的rAAV。为了在哺乳动物细胞系，诸如人类293细胞中制备该数量的rAAV颗粒，需要转染和培养约1011个细胞，相当于5,000个172cm2的细胞培养瓶。还存在下述可能性：即在哺乳动物细胞培养物中制备的要用于临床用途的载体将受到哺乳动物细胞中存在的不想要的(或许是病原性的)物质的污染。 
Kotin等的美国专利第6,723,551B2号和Urabe等，《病毒学杂志》80：1874-1885，2006公开了在昆虫细胞中制备rAAV载体的方法。在这些公开内容中，构建了杆状病毒载体，所述载体包含以回文序列头至尾排列编码Rep78/68和Rep52/40的核酸，Rep78/68和Rep 52/40基因各自在独立的启动子的调控下(本文图4)。这些载体包含末端反向重复序列(ITR)，转基因编码序列以及AAV衣壳基因。尽管一开始产生高滴度rAAV，但没有证据表明该方法可适用于rAAV的大规模制备。另外，几个研究小组报道使用如美国专利第6,723,551B2号中所述的VP1表达的特定设计制备了与293细胞产生的AAV载体相比较低感染性的其对应物。Merten等，Gene Ther.，(《基因治疗》)12：S51-S61，2005；Kohlbrenner等，Mol.Ther.，(《分子治疗》)12：1217-1225，2005。 
6,723,551B2专利还主张昆虫细胞中的Rep mRNA剪接并不模拟哺乳动物细胞中的过程。具体地，该参考文献教导了修饰Rep68或Rep40编码核苷酸序列以缺乏内含子。通过这些方法在昆虫细胞中翻译的核酸序列仅包含编码序列。因此，在该专利中，转录的任何病毒mRNA的编码序列避免了在翻译之前剪除(去除)内含子。然而，为了在昆虫细胞中表达Rep78和Rep52，专利6,723,551B2 中提出的方法使用了两种独立的Rep序列，和两种表达盒，一种用于Rep78，另一种用于Rep52。 
在哺乳动物细胞产生的AAV中，完全功能性并且可例如靶向细胞核的“全”病毒体(即掺入AAV基因组的病毒颗粒)的最佳产率在所有三种VP蛋白都表达且处于接近1∶1∶10(VP1∶VP2∶VP3)的化学计量时获得。允许该受控的表达水平的调控机制包括通过差异性剪接产生两种mRNA，一种用于VP1，另一种用于VP2和VP3。 
当使用原始的AAV Cap编码序列时，昆虫细胞中不能合适地再现需要产生1∶1∶10化学计量的VP1∶VP2∶VP3的剪接事件。从Cap编码序列表达的大多数蛋白是VP1，其起始于Cap编码序列的第一AUG密码子。为了模拟1∶1∶10化学计量的VP1∶VP2∶VP3，美国专利6,723,551B2提出的方法将VP1的AUG密码子突变成ACG以减少VP1的表达水平。 
尽管AAV内含子不能合适地在昆虫细胞中发挥作用，但已经报道苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autograph californica nuclearpolyhedrosis virus)的立即早期IE-1基因包含可在昆虫细胞中被剪接的功能性内含子(Chisholm和Henner，《病毒学杂志》62：3193-3200，1988)。然而，该参考文献没有提示在内含子内掺入启动子用于表达可操作地(operably)连接的开放阅读框。 
多种尝试已经用于增强AAV的VP1的表达，诸如使用嵌合体VP1蛋白或“riboswitch(核开关)”机制。参见，例如，Urabe等，《病毒学杂志》80：1874-1885，2006和Kohlbrenner等，《分子治疗》12：1217-1225，2005，以及美国专利申请2006/0166363。另外，据报道，如美国专利第6,723,551B2号所述的携带Rep78和Rep52的大同源重复序列的重组杆状病毒是不稳定的。Kohlbrenner等，《分子治疗》12：1217-1225，2005。尽管Kolhlbrenner等报道了与6,723,551B2专利的杆状病毒和AAV载体相比更稳定的杆状病毒和更具有感染性的AAV载体，但他们的技术需要Rep78和Rep52的编码序列分开进入两种杆状病毒，并且需要另外的杆状病毒来供应VP1蛋白。 
Cao，L.等(《病毒学杂志》74：11456-11463，2000)描述了一种使用含有内含子的辅助质粒制备高滴度、无野生型的重组腺病毒相关病毒载体的方法。这些方法涉及将人类β珠蛋白内含子插入AAV基因组。然而，这些方法使用人类细胞作为宿主，并且，另外，所导入的内含子不包括可指导昆虫细胞中转录的启动子。 
因此，仍需要在昆虫细胞中表达具有重叠开放阅读框的基因的改进的方法和核酸，以及用于制备感染性细小病毒载体的方法、核酸以及细胞。 
发明内容
鉴于需要在昆虫细胞中表达包含重叠开放阅读框(ORF)的基因的方法，本发明的发明人已经开发了用于表达包含ORF的基因的核酸、细胞培养物以及方法。 
在某些方面，本发明教导内容公开了核酸盒。这些核酸盒可用于在昆虫细胞中表达多种多肽，所述多肽由包含重叠开放阅读框(ORF)的基因编码。这些方面的一种核酸盒按照5’至3’顺序包含：a)第一昆虫细胞可操作(insect cell-operable)启动子；b)所述基因的5’部分，所述5’部分包含所述基因的第一ORF；c)包含第二昆虫细胞可操作启动子的内含子；以及d)所述基因的3’部分，所述3’部分包含所述基因的至少一种另外的ORF，其中，所述第一昆虫可操作启动子与所述第一ORF可操作地连接，所述第一ORF包含第一翻译起始密码子；所述第二昆虫细胞可操作启动子与所述至少一种另外的ORF可操作地连接，所述至少一种另外的ORF包含至少一种另外的翻译起始密码子，并且，其中，a)、b)、c)以及d)中的至少一者与a)、b)、c)以及d)中的至少另一者可以是异源的。在多种结构中，所述核酸盒还可包含：e)位于d)的3’的多聚腺苷酸化信号。在相关方面，a)、b)、c)、d)以及e)的至少一者与a)、b)、c)、d)以及e)的至少另一者可以是异源的。在多种结构中，本发明教 导内容包括包含核酸盒的载体。载体可以是本领域技术人员已知的任何类型的载体，例如，质粒、病毒、病毒核酸或它们的组合。另外，在多种结构中，载体或核酸盒可以是单链或双链DNA，病毒可以是噬菌体或杆状病毒。 
在多种结构中，这些方面的核酸盒可包含昆虫细胞可操作启动子(即，支持昆虫细胞中转录的启动子)。所述核酸盒可包含本领域技术人员已知的任何昆虫细胞可操作启动子。在某些方面，所述核酸盒的第一昆虫细胞可操作启动子可为p10启动子或polh启动子，并且，独立地，所述第二昆虫细胞可操作启动子可为p10启动子或polh启动子。 
在本发明教导内容的多个方面，包含重叠ORF的基因可为病毒诸如感染哺乳动物细胞的病毒的基因。在某些方面，所述病毒可为腺病毒相关病毒(AAV)。在某些结构中，所述核酸盒可包含第一昆虫细胞可操作启动子，AAV的Rep基因的5’部分或AAV的Cap基因的5’部分，和包含第二昆虫细胞可操作启动子的内含子。在某些布置中，包含Rep基因的核酸可包含Rep78/68ORF作为第一RepORF和Rep 52/40ORF作为第二或另外的ORF(如下文所述)。另外，在某些结构中，所述第一启动子可为p10启动子，所述第二启动子可为polh启动子。在其他结构中，所述核酸盒可包含Cap基因，在所述Cap基因中，第一ORF可为VP1ORF，第二或另外的ORF可为VP2/VP3ORF(如下文所述)。在某些结构中，所述核酸盒的第一和第二启动子均可为polh启动子。 
在又一些其他结构中，单核酸可包含两种或多种核酸盒，各核酸盒包括包含多种ORF的不同基因。核酸可包含以串连即以相同极性或以反义方向排列的核酸盒。因此，某些结构中的单核酸可包含第一昆虫可操作启动子，AAV的Rep基因的5’部分，包含第二启动子的第一内含子，Rep基因的3’部分，第三昆虫细胞可操作启动子，Cap基因的5’部分，包含第四昆虫细胞可操作启动子的第二内含子，以及Cap基因的3’部分。另外，在某些方面，多聚腺苷酸化信号可 位于各3’部分的3’。 
本发明教导内容还包括一种昆虫细胞，所述昆虫细胞包含一种或多种核酸盒，所述核酸盒可用于在昆虫细胞中表达由包含多种ORF的基因编码的多种多肽。这些教导内容的昆虫细胞可为体外昆虫细胞，诸如来自培养细胞系的昆虫细胞，如来自粉纹夜蛾(Trichoplusiani)(High-fiveTM，Invitrogen，加利福尼亚州Carlsbad)的BTI-Tn-5B 1-4，衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9或Sf21。在多个方面，体外昆虫细胞可包含AAV的Rep基因和/或AAV的Cap基因。因此，在某些结构中，昆虫细胞可包含第一核酸盒和第二核酸盒，其中，所述第一核酸盒包含Rep 78/68ORF和Rep 52/40ORF，所述第二核酸盒包含VP1ORF和VP2/VP3ORF。如本文所述，这些核酸盒可各自包含第一昆虫可操作启动子和含有第二昆虫可操作启动子的内含子。在某些方面，可通过不同的核酸将核酸盒包含在细胞内。在其他方面，所述核酸盒可以以串连或反义结构包含在相同的核酸中。 
在某些结构中，昆虫细胞还可包含另外的核酸，所述核酸含有待由宿主昆虫细胞表达的感兴趣的转基因。在某些方面，这样的核酸可包含另外的核酸盒，所述另外的核酸盒按照5’至3’顺序包含：AAV的第一末端反向重复序列(ITR)、哺乳动物细胞可操作启动子、转基因、多聚腺苷酸化信号以及AAV的第二ITR。这些结构的转基因可包含编码任何感兴趣的多肽的ORF。在某些结构中，转基因可为报告基因，诸如氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或诸如分泌性碱性磷酸酶的碱性磷酸酶。在其他结构中，转基因可包含编码具有治疗意义的多肽的ORF，诸如但不限于多肽激素、细胞因子或生长因子(例如，胰岛素或促红细胞生成素)、干扰素、血液凝固因子或疫苗。 
在某些结构中，包含感兴趣的转基因的核酸或包含具有多种OFR的基因诸如AAV的Rep基因和/或Cap基因的核酸盒可整合至宿主昆虫细胞的基因组中。在某些结构中，整合可为稳定的整合。宿主细胞中还可瞬时携带本发明教导内容的核酸。 
本发明教导内容的某些方面包括细胞培养物。这些方面的细胞培养物包括多个包含一种核酸盒的昆虫细胞和培养基，所述核酸盒包含第一昆虫细胞可操作启动子、具有重叠开放阅读框并编码多种多肽的基因，以及包含第二昆虫细胞可操作启动子的内含子(如上文所述)。在某些结构中，细胞培养物可包含含有AAV的Rep和Cap基因的核酸盒。在某些结构中，这些培养物可产生AAV，这些培养物的培养基的滴度可至少约1013AAV基因组/L、至少约1014AAV基因组/L或更大。这些结构的昆虫细胞可为本领域技术人员已知的任何昆虫细胞，诸如来自细胞系BTI-Tn-5B 1-4、Sf9或Sf21的细胞。所述培养物的细胞还可包含含有ITR和转基因的核酸(如上文所述)。 
本发明教导内容还包括表达由包含重叠ORF的基因编码的多种多肽的方法。在多种结构中，这些方法可包括使用本文所述的包含含有重叠ORF的基因的核酸盒感染、转化或转染至少一种昆虫细胞，并培养所述至少一种昆虫细胞。这些结构的昆虫细胞可为本领域技术人员已知的任何昆虫细胞，诸如来自细胞系BTI-Tn-5B1-4、Sf9或Sf21的细胞。 
本发明教导内容还包括在昆虫细胞中表达多种基因的方法，其中，各基因包含重叠ORF。这些方法包括提供同时携带第一核酸盒和第二核酸盒的一种或多种昆虫细胞，如上所述，所述第一核酸盒包含第一基因、第一昆虫可操作启动子以及含有第二昆虫可操作启动子的内含子，所述第二核酸盒包含第二基因、第三昆虫可操作启动子以及含有第四昆虫可操作启动子的第二内含子。在多个方面，这些方法的核酸盒可包含在相同或不同的核酸中，所述宿主昆虫细胞可使用其中任一种或两种核酸盒瞬时或稳定转化。 
相似地，本发明教导内容还包括在昆虫细胞中制备腺病毒相关病 毒(AAV)的方法。这些方法可包括提供同时携带第一核酸盒和第二核酸盒的一种或多种昆虫细胞，如本文所述，所述第一核酸盒包含Rep基因、第一昆虫可操作启动子以及含有第二昆虫可操作启动子的内含子，如本文所述，所述第二核酸盒包含Cap基因、第三昆虫可操作启动子和含有第四昆虫可操作启动子的内含子。这些方法还包括在培养基中培养昆虫细胞。在某些结构中，这些方法的昆虫细胞可进一步包含另外的核酸，其中所述另外的核酸包含AAV的第一末端反向重复序列(ITR)、哺乳动物细胞可操作启动子、转基因以及AAV的第二ITR。在多种结构中，所述核酸盒的一种或多种和所述另外的核酸可包含在一种或多种载体中。 
在某些方面，本发明教导内容还包括在昆虫细胞中体外制备AAV衣壳的方法。这些方法包括：提供包含核酸盒的一种或多种昆虫细胞，所述核酸盒按照5’至3’顺序包含第一启动子、AAV的Cap基因的5’部分、含有第二启动子的内含子以及Cap基因的3’部分；在培养基中培养所述一种或多种昆虫细胞。在多种结构中，所述核酸可包含在载体中。在某些结构中，提供昆虫细胞可包括使用包含核酸盒的核酸或载体转化、转染或感染一种或多种昆虫细胞。另外，在某些方面，这些方法可进一步包括使用另外的核酸转化、转染或感染所述细胞，所述另外的核酸包含AAV的第一末端反向重复序列(ITR)、哺乳动物细胞可操作启动子、转基因以及AAV的第二ITR。 
附图说明
图1描述了表达单表达盒内的Rep78或Rep68和Rep52或Rep40两者的、典型的重组杆状病毒基因图和转录图。当人工内含子通过剪接去除时形成成熟的Rep78或Rep68mRNA。Rep52或40mRNA 自位于人工内含子内的启动子转录。 
图2描述了表达单表达盒内的VP1、VP2以及VP3的典型的重组杆状病毒基因图和转录图。当人工内含子通过剪接去除时形成成熟的VP1mRNA。编码VP2和VP3的RNA自位于人工内含子内的启动子转录。 
图3描述了用于在昆虫细胞中制备细小病毒的一种三载体系统的基因图。 
图4描述了用于在昆虫细胞中制备细小病毒载体的一种双载体系统的基因图。 
图5描述了用于在昆虫细胞中制备AAV载体的单载体系统和稳定的昆虫细胞系的两个实例。 
图6描述了用于细小病毒基因组制备的方法的一个实例。 
图7描述了用于细小病毒空颗粒制备的方法的一个实例。 
图8描述了包含AAV2Rep编码序列的重组载体的基因图，所述AAV2Rep编码序列包含含有多角体蛋白(polh)启动子的人工内含子。该载体可用于在昆虫细胞中制备AAV载体。 
图9描述了Rep和Cap蛋白的蛋白质印迹的典型结果。(A)使用Bac-inRep感染的Sf9细胞表达的AAV2Rep78和Rep52；(B)使用Bac-inCap感染的Sf9细胞表达的AAV2Cap蛋白；(C)使用Bac-inCap8感染的Sf9细胞表达的AAV8Cap蛋白；(D)使用Bac-inCap6感染的Sf9细胞表达的AAV6Cap蛋白；以及(E)使用Bac-inCap1感染的Sf9细胞表达的AAV1Cap蛋白。 
图10描述了一种重组载体的基因图，所述重组载体包含AAV2Cap编码序列和含有多角体蛋白(polh)启动子的人工内含子。该载体可用于在昆虫细胞中制备AAV2载体。 
图11描述了一种重组载体的基因图，所述重组载体包含AAV8Cap编码序列和含有多角体蛋白(polh)启动子的人工内含子。该载体可用于在昆虫细胞中制备AAV8假型载体。 
图12描述了一种重组载体的基因图，所述重组载体包含AAV6Cap编码序列和含有多角体蛋白(polh)启动子的人工内含子。该载体可用于在昆虫细胞中制备AAV6假型载体。 
图13描述了一种重组载体的基因图，所述重组载体包含AAV1Cap编码序列和含有多角体蛋白(polh)启动子的人工内含子。该载体可用于在昆虫细胞中制备AAV1假型载体。 
图14描述了表达单表达盒内的所有三种SV40VP蛋白的重组杆状病毒基因图和转录图。当第一和第二内含子通过剪接去除时形成成熟的VP2mRNA，当第二内含子通过剪接去除时形成成熟的VP3mRNA。VP1mRNA自位于第二内含子内的启动子转录。 
具体实施方式
本文所述的方法和组合物利用了本领域技术人员公知的实验室技术，可见于实验室手册，诸如，Sambrook，J.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第3版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，2001；Methods In Molecular Biology(《分子生物学方法》)，Richard编辑，Humana出版社，新泽西，1995；Spector，D.L.等，Cells：A Laboratory Manual(《细胞：实验室手册》)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1998；以及Harlow，E.，UsingAntibodies：A Laboratory Manual(《使用抗体：实验室手册》)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1999。描述昆虫细胞中异源多肽表达方法、将载体和核酸导入昆虫细胞的方法以及维持昆虫细胞培养物的方法的其他参考文献包括：例如，O′Reilly等，BaculovirusExpression Vectors，A Laboratory Manual(《杆状病毒表达载体：实验室手册》)，牛津大学出版社，1994；Samulski等，《病毒学杂志》63：3822-3288，1989；Kajigaya等，《美国科学院院刊》88：4646-4650，1991； Ruffing等，《病毒学杂志》66：6922-6930，1992；Kimbauer等，《病毒学》219：37-44，1996；Zhao等，《病毒学》272：382-393，2000；以及Samulski等，美国专利第6,204,059号。 
除非上下文另有指明，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式意于还包括复数形式。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用完整并入本申请。 
本发明的发明人已经开发了一种用于在昆虫细胞中表达具有重叠阅读框的基因的方法。发明人发现向单基因中掺入包含昆虫细胞可操作启动子的人工内含子可提供重叠开放阅读框在昆虫细胞中的表达。本文所使用的“重叠阅读框”是指可自多转录起始位点转录成多种mRNA分子的基因的编码序列，在多个方面，这些mRNA分子可翻译成多种多肽。重叠阅读框包括下述编码序列：即可从一种具有移码阅读框或非移码阅读框的基因转录成具有不同翻译起始位点(起始密码子)的mRNA分子的编码序列。 
在某些方面，本发明教导内容的核酸盒可包含Rep基因、p10启动子和含有polh启动子的内含子。在多个方面，当通过包含所述核酸盒的杆状病毒感染昆虫细胞时，Rep78或Rep68前mRNA可自p10启动子转录，成熟mRNA可通过剪接人工内含子而形成。另外，Rep52或Rep40mRNA可自位于人工内含子内的polh启动子转录。因此，昆虫细胞可从相同的Rep编码序列表达Rep78(或Rep68)和Rep52(或Rep40)两者，而避免了单独使用Rep78和Rep52序列。在其他方面，任何昆虫细胞可操作启动子可代替p10或polh启动子使用。 
在某些实施方案中，本发明教导内容涉及通过将Rep和Cap基因分别掺入包含昆虫细胞可操作启动子的人工内含子中而在昆虫细胞中表达腺病毒相关病毒的重叠Rep和Cap基因。在某些方面，rAAV可通过应用Rep和Cap编码序列而在昆虫细胞中制备。通过将人工内含子插入Rep编码序列，Rep78(或Rep68)和Rep52(或Rep40)两者可自单Rep编码序列表达，而不需要使用两种单独的Rep编码 序列(图1)。同样，通过将人工内含子序列掺入Cap编码序列，所有三种Cap蛋白VP1、VP2以及VP3可自单Cap编码序列表达(图2)。在某些结构中，包含人工内含子的Cap基因消除了如美国专利6,723,551B2所述的将VP1起始密码子AUG突变为ACG的需要。 
在某些方面，本发明教导内容提供了一种在昆虫细胞中制备AAV的方法。这些方法包括通过转录编码Rep蛋白和Cap蛋白的mRNA表达Rep蛋白和Cap蛋白。在这些方法中，将至少一种载体导入昆虫细胞中。这些方面的载体包含含有核酸盒的一种或多种核酸分子，各核酸盒按照5’至3’顺序包含：第一昆虫细胞可操作启动子，基因的5’部分，所述5’部分包含含有多种ORF的基因的第一ORF，包含第二昆虫细胞可操作启动子的内含子，以及包含至少一种另外的ORF的基因的3’部分。在多种结构中，昆虫细胞相容性载体可包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含Rep编码序列和至少一种含有昆虫细胞可操作启动子的人工内含子，所述第二核苷酸序列包含Cap编码序列和至少一种人工内含子。然后，可在使得产生AAV的条件下维持这些载体所导入的昆虫细胞。在某些结构中，所述昆虫细胞可进一步包含含有至少一种AAVITR的核酸。该核苷酸还可包含转基因，诸如编码报告多肽或具有治疗意义的多肽的基因。在多个结构中，该核酸可通过载体导入细胞中。该载体可不同于包含Rep和/或Cap基因的载体，或者，在某些结构中，单载体可包含含有至少一种AAV ITR、Rep基因和Cap基因的核酸。 
发明人已经确定AAV Rep和ITR序列也有效地与昆虫细胞中的其他AAV Rep和ITR序列交叉互补。通常，在不同AAV血清型中，决定AAV颗粒的细胞营养机能(tropicity)的Cap蛋白和相关的Cap蛋白编码序列的保守性显著低于Rep蛋白和基因。鉴于Rep和ITR序列与其他血清型的相应序列交叉互补的能力，可容易地生成包含一种血清型(例如，AAV6)的衣壳蛋白和另一种AAV血清型(例 如，AAV2)的Rep和/或ITR序列的假型AAV颗粒。如本文所使用，“假型”是指腺病毒相关病毒中Cap蛋白的来源。参见，例如，Halbert，C.L.等，《病毒学杂志》74：1524-1532，2000；Halbert，C.L.等，《病毒学杂志》75：6615-6624，2001。例如，发明人已经在Sf9细胞中制备了高滴度的rAAV2/6和rAAV2/8(即，包含AAV2的ITR和Rep序列和分别衍生自AAV6和AAV8的VP序列的假型AAV)(参见实施例4)。鉴于AAV血清型中Rep和ITR序列的保守性，在包装细胞系统中包含特定AAV血清型的Cap基因的假型载体的制备表明该血清型的非假型载体也可在该系统中成功制备。例如，Sf9细胞中rAAV2/6和rAAV2/8的有效制备表明rAAV6和rAAV8也可在这些细胞中有效制备。 
鉴于上述情况，应理解来自多于一种的AAV血清型的序列可以组合用于在昆虫细胞中制备AAV。例如，包含至少一种AAV ITR核苷酸序列的核酸可衍生自一种血清型，诸如AAV2，而其他核酸可包含衍生自一种或多种其他血清型诸如血清型3的开放阅读框或编码序列。在多种结构中，在本发明方法中，AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及11中任何血清型的核酸可提供Rep基因、Cap基因和/或AAV ITR。 
在这些方法的某些方面，AAV ITR可为AAV1、AAV2或AAV6ITR，包含Rep ORF的核酸可包含AAV1、AAV2或AAV6Rep基因，包含Cap ORF的核酸可包含AAV1、AAV2或AAV6Cap基因。 
在某些方面，修饰的AAV序列也可用于在昆虫细胞中制备rAAV。例如，与AAV1、AAV2、AAV3和/或AAV4ITR、Rep或Cap具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％序列同一性的核苷酸序列可代替野生型AAV ITR、Rep或Cap序列使用，前提是在感染的细胞中制备rAAV颗粒。相似地，与AAV1、AAV2、AAV3和/或AAV4多肽序列具有至少约70％、 至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％序列同一性的氨基酸序列可代替野生型AAV ITR、Rep或Cap序列使用，前提是在感染的细胞中制备rAAV颗粒。 
在多个方面，本领域技术人员已知的可在培养物中维持的任何昆虫细胞都可用于本发明的方法。细胞系的非限制性实例包括来自草地贪夜蛾的Sf9细胞、来自草地贪夜蛾的Sf21细胞、果蝇细胞系或蚊细胞系，例如衍生自白纹伊蚊的细胞系。在某些方面，细胞系可为草地贪夜蛾Sf9细胞系。 
本领域技术人员已知的任何载体可用于本发明教导内容，前提是它具有昆虫细胞相容性。昆虫细胞中载体的存在不需要持久。所述载体可通过任何已知的方法导入，例如通过化学处理细胞、电穿孔或感染。在某些方面，所述载体可为杆状病毒、病毒载体或质粒。 
如果使用三种载体，第一载体可包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列含有第一昆虫细胞可操作启动子、Rep编码序列以及含有第二昆虫细胞可操作启动子的人工内含子，第二载体可包含第二核苷酸序列和第三核苷酸序列，所述第二核苷酸序列含有第三昆虫细胞可操作启动子、Cap编码序列以及含有第四昆虫细胞可操作启动子的人工内含子，所述第三核苷酸序列含有至少一种AAV ITR核苷酸序列。在图3中，pA是多聚腺苷酸化信号，polh和p10是用于在昆虫细胞中表达的转录启动子，CMV是用于在哺乳动物细胞中表达基因的哺乳动物转录启动子。ITR是AAV的末端反向重复序列。 
在某些方面，可根据所公开的方法使用两种载体制备AAV。在这些方面，第一载体可包含一种核苷酸序列，所述核苷酸序列含有：与Rep编码序列的5’部分可操作地连接的第一昆虫细胞可操作启动子，含有与Rep编码序列的3’部分可操作地连接的第二昆虫细胞可操作启动子的人工内含子，与Cap编码序列的5’部分可操作地连接 的第三昆虫细胞可操作启动子，以及含有与Cap编码序列的3’部分可操作地连接的第四昆虫细胞可操作启动子的人工内含子。这些方面的第二载体可包含含有至少一种AAV ITR核苷酸序列的核苷酸序列。图4是典型的双载体系统的基因图。在图4中，pA是多聚腺苷酸化信号，polh和p10是用于在昆虫细胞中表达的转录启动子，CMV是用于在哺乳动物细胞中表达基因的哺乳动物转录启动子。ITR是AAV的末端反向重复序列。 
在多种结构中，各载体包含的序列相互之间可以是任何顺序。例如，在某些排列中，载体可包含ITR和Cap编码序列，Cap编码序列可位于载体中，使得当ITR序列之间的DNA复制时，Cap编码序列可复制，而在其他排列中，Cap编码序列不复制。在其他结构中，Rep编码序列和Cap编码序列可以以任何顺序位于载体中。 
和用于筛选和鉴定携带导入的核酸的细胞的方法一样，核酸序列导入昆虫基因组中的方法是本领域技术人员公知的。可通过例如使用包含与昆虫宿主细胞的基因组的一个或多个区域具有广泛序列相似性的核苷酸序列的载体来帮助掺入基因组中。基因元件诸如转座子的使用提供了一种用于将核苷酸序列导入基因组中的方法。在本发明方法的某些方面，可借助于由添加至细胞的核酸序列编码的标志基因来筛选或鉴定转化的细胞。在某些方面，核酸序列掺入宿主细胞基因组则可通过本领域技术人员公知的标准方法确定，诸如DNA印迹(Southern bot)或聚合酶链反应(PCR)分析。 
在某些方面，可以将ITR设计成使得复制多肽的结合位点位于A区和D区的两条链上，并对称地定位，每一条位于回文序列的每一侧。在双链环状DNA模板(例如质粒)上，Rep78或Rep68辅助的核酸复制则可在两个方向进行，并且单链ITR满足环状载体的AAV复制。因此，一条ITR核苷酸序列可用于本发明教导内容的上下文。然而，可使用两条或其它偶数条规则的ITR。在某些方面，使用两条 ITR序列。 
在多个方面，包含至少一条AAV ITR的核酸还可包含用于在哺乳动物细胞中表达的、编码至少一条“感兴趣的基因产物”或“转基因”的核酸序列，其定位使得可以掺入在昆虫细胞中复制的AAV基因组中。任何核酸可掺入用于之后在使用根据本发明教导内容制备的AAV转染的哺乳动物细胞中的表达。例如，所述核酸可编码蛋白、表达反义RNA或小干扰RNA(SiRNA)。所述蛋白可为分泌性蛋白，或主要影响使用昆虫细胞制备的AAV感染的细胞的蛋白。在某些方面，感兴趣的产物可为Rep78或Rep68。因此，在这些方面，核苷酸序列可包含两种核酸序列，每一序列编码一种用于在哺乳动物细胞中表达的感兴趣的基因产物。编码感兴趣的产物的两种核酸序列中的每一种可被布置成使得其可掺入在昆虫细胞中复制的rAAV基因组中。 
在多种结构中，感兴趣的产物可为作为多肽或RNA分子的基因产物。感兴趣的多肽的非限制性实例包括蛋白，诸如酶、凝固因子、肽激素或融合蛋白。感兴趣的产物的其他实例包括弥补遗传缺陷的基因产物、RNA分子或转录因子。例如，感兴趣的基因产物可包含提供调控功能的核苷酸序列(例如，转座子)。感兴趣的基因产物的实例包括但不限于：激素受体(例如，盐皮质类固醇受体、糖皮质激素受体以及甲状腺激素受体)；膜内蛋白(例如，TM-1和TM-7)；胞内受体(例如，孤儿蛋白、类视黄醇、维生素D3和维生素A受体)；信号传导分子(例如，激酶、转录因子以及信号转导因子和细胞因子超家族的转录受体的激活因子(例如，促红细胞生成素、生长激素、干扰素、白细胞介素以及集落刺激因子))；G蛋白偶联受体，例如，激素、降钙素、肾上腺素、胃泌素，以及旁分泌或自分泌介质，诸如促生长素抑制素或前列腺素；神经递质受体(去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺或乙酰胆碱)；病原性抗原，其可为 病毒、细菌、变应原或癌性来源；以及酪氨酸激酶受体的配体(诸如，胰岛素生长因子和神经生长因子)。 
在多个方面，感兴趣的基因产物可为治疗性基因产物。治疗性基因产物可为多肽、RNA分子或其他基因产物，当它们在靶细胞中表达时，提供治疗作用，诸如，消除感染的细胞(例如，如Goldsmith等，在WO 90/07936中所述)，表达具有治疗性生物活性的多肽，和/或表达用于反义治疗的RNA分子(例如，调控内源或异源基因在靶细胞基因组中的表达)。例如，在要接受异源移植物或植入物的患者中，可以进行编码靶向植入物的T细胞的毒素的多核苷酸的给药。 
AAV蛋白可为感兴趣的基因产物。例如，Rep蛋白诸如Rep78或Rep68的序列或其功能性片段可为在哺乳动物细胞中表达的感兴趣的基因产物。编码Rep78和/或Rep68的核酸序列，如果存在于本发明教导内容的rAAV基因组中且在根据本发明教导内容制备的rAAV转导的哺乳动物细胞中表达时，允许rAAV整合至被转导的哺乳动物细胞的基因组中。Rep78和/或Rep68在rAAVA转导或感染的哺乳动物细胞中表达可赋予在昆虫细胞中制备的rAAV的某些用途的优点，诸如允许rAAV导入的细胞中感兴趣的任何其他基因产物的长期或持久表达。 
选择性标志物是一类感兴趣的基因产物。由选择性标志物编码的蛋白的表达允许使用一种表达载体转染宿主细胞，所述表达载体包括有待与不具有编码选择性标志物的表达载体的宿主细胞区分的选择性标志物。其一个实例是可使用选择性标志物而在会杀伤宿主细胞的选择过程，诸如使用抗生素处理中存活的宿主细胞。这样的选择性标志物可为一种或多种抗生素抗性因子，诸如新霉素抗性(例如，neo)、潮霉素抗性以及嘌呤霉素抗性。选择性标志物还可为细胞表面标志物，诸如神经生长因子受体或其截短形式。表达细胞表面标志物的细胞则可使用靶向细胞表面标志物的抗体选择。靶向细胞表面标志物的抗体可直接标记(例如，使用荧光素底物)或可使用第二标记抗体或结合靶向细胞表面标志物的抗体的底物检测。可 选地，细胞可使用酶阴性选择，例如，将前毒素(更昔洛韦(gancyclovir))转化为毒素的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSVTK)，或将前毒素5’-氟胞嘧啶(5’-FC)转化为毒素5’-氟尿嘧啶(5’-FU)的细菌胞嘧啶脱氨酶(CD)。可选地，只要多肽容易被抗体识别，任何编码所述多肽的核酸序列都可用作选择性标志物。 
编码选择性标志物的核酸可编码例如，β-内酰胺酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶或其他其术语为本领域已知的报告基因，包括细胞表面标志物，诸如CD4或截短的神经生长因子(NGFR)(对于GFP，参见WO 96/23810；Heim等，Current Biology(《现代生物学》)2：178-182(1996)；Heim等，《美国科学院院刊》(1995)；或Heim等，Science(《科学》)373：663-664(1995)；对于β-内酰胺酶，参见WO 96/30540)。在某些方面，选择性标志物可为β-内酰胺酶。编码选择性标志物的核酸可编码例如荧光素蛋白。荧光素蛋白可通过测定任何定量的荧光素性质的量而检测，例如，在特定波长的荧光的量，或在发射光谱的荧光的积分。测量荧光的技术为本领域技术人员所公知。 
在多个方面，用于在哺乳动物细胞中表达的核酸如果位于两个规则的ITR之间或位于使用两个D区设计的ITR的任一侧，可掺入在昆虫细胞中制备的AAV基因组中。 
在多个方面，编码用于在哺乳动物细胞中表达的感兴趣的基因产物的核苷酸序列可以与至少一种哺乳动物细胞相容性表达调控序列例如启动子可操作地连接。许多这样的启动子为本领域已知。本领域技术人员应理解这些方面的启动子包括可诱导的、具有组织特异性和/或细胞周期特异性的那些。例如，E2F启动子可介导肿瘤选择性表达，特别地，通过在神经学细胞体内脱阻抑而介导神经学细胞体内肿瘤选择性表达。Parr等，Nat.Med.(自然——医学)3：1145-1149(1997)。另外，在某些结构中，多于一种的表达调控序列可以与给定的核苷酸序列可操作地连接。例如，启动子序列、翻译起始序列以及终止密码子可以与核苷酸序列可操作地连接。 
剪接位点是位于mRNA转录(形成)之后促进mRNA序列的部分去除的mRNA上的序列。通常，在mRNA运输至细胞的细胞质中之前在细胞核中发生剪接。 
在某些方面，表达调控序列可与已知的表达调控序列具有序列同一性。两条核酸序列的序列同一性程度的测定是对来自四种已知的天然核苷酸中的核苷酸准确匹配第二条核苷酸序列上的对应物，即，T匹配T，A匹配A，G匹配G，C匹配C的次数的百分数的确定。至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的序列同一性可被认为与表达调控序列具有显著的序列相似性。在某些方面，可在序列之间计算序列同一性，而不在所比较的一条或两条序列中引入间隙。 
本领域技术人员应理解为了优化两条核苷酸序列的序列相似性，可在两条序列的任一条或两条中引入间隙。在某些方面，如果引入间隙，仅与第二核苷酸序列中核苷酸配对的第一序列的核苷酸(不管是否匹配)用于计算同源性百分数。计算出同源性百分数的计算规则的算法是已知的。这样的程序的实例包括SIM、GAP、NAP、LAP2、GAP2、ALIGN、BLAST以及PIPMAKER。 
例如，ALIGN程序使用Myers和Miller，CABIOS(《生物科学的计算机应用》)4，11-17(1988)所述的动态程序算法的变化形式产生两条所选择的蛋白或核酸序列的最佳比对。优选地，如果可行，与加权末端间隙(end-gaps)一起使用ALIGN程序。如果间隙开口和间隙延伸罚分可以利用，对于氨基酸序列对比，优选将它们分别设置在约-5至-15之间和0至-3之间，更优选分别在约-12和-0.5至-2之间，对于核酸序列比对，优选将它们分别设置在-10至-20之间和-3至-5之间，更优选分别在约-16和-4之间。ALIGN程序及其原理进一步描述于，例如，Pearson等，《美国科学院院刊》85：2444-48(1988)，和Pearson等，Methods Enzymol.(《酶学方法》)183：63-98(1990)。 
BLAST程序提供了至少两条氨基酸或核苷酸序列的分析，其通过将所选择的序列与数据库(例如，GenSeq)中的多个序列进行比对，或使用BL2SEQ在两条所选择的序列之间进行比对。BLAST程 序优选由低复杂性过滤程序诸如DUST或SEG程序修饰，它们优选整合至BLAST程序操作中(参见，例如，Wooton等，Compu.Chem.(《计算机化学》)17：149-63(1993)；Altschul等，Nat.Genet.(《自然：遗传学》)6：119-29(1994)；Hancock等，《生物科学的计算机应用》10：67-70(1994)；以及Wootton等，《酶学方法》266：554-71(1996))。如果使用λ比值，该比值的优选设定值在0.75和0.95之间，更优选0.8和0.9之间。如果使用间隙存在值(或间隙分)，将间隙存在值优选设定在约-5和-15之间，更优选约-10，将每残基间隙值优选设定在约0和-5之间，更优选0和-3之间(例如，-0.5)。相似的间隙参数可用于其他合适的程序。BLAST程序及其原理进一步描述于，例如，Altschul等，J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)215：403-10(1990)，Karlin和Altschul，《美国科学院院刊》87：2264-68(1990)(如Karlin和Altschul，《美国科学院院刊》90：5873-77(1993)所修改的)，以及Altschul等，Nucl.Acids Res.(《核酸研究》)25：3389-3402(1997)。 
在本文所公开的方法的某些方面，有可能使用少于四种的Rep酶，诸如Rep78/Rep68酶的仅一种和Rep52/Rep40酶的仅一种，其中这两种酶均自包含人工内含子的相同单Rep编码序列表达。由于AAV p5和p19启动子在昆虫细胞中作用不佳，昆虫细胞可操作启动子，例如p10或polh启动子代替p5和p19启动子，用于Rep78/68和Rep52/40。因为p19启动子位于Rep编码区，使用任何其他启动子取代p19启动子改变了Rep ORF的密码子并因此改变Rep78/68蛋白的功能。 
本发明教导内容的方法利用了在昆虫细胞中发挥作用的人工内含子，并提供了一种将昆虫细胞可操作启动子插入p19启动子区域而不改变Rep78/68编码序列及其功能的方法，使得从单表达盒表达Rep78和Rep52或Rep68和Rep40成为可能。 
在某些方面，Rep编码序列可包含含有polh启动子的人工内含子(图1)。在某些结构中，包含polh启动子的人工内含子序列可为：GTAAGTACTCCCTATCAGTGATAGAGATCTATCATGGAGATAATT AAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGAAGGGGGAGACCTGTAGTCAGAGCCCCCGGGCAGCACACACTGACATCCACTCCCTTCCTATTGTTTCAG(SEQ ID NO：1)。该人工内含子内的polh启动子是ATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCG(SEQID NO：20)。在某些方面，人工内含子可在核苷酸850和851之间插入AAV基因组(NCBI登录号：AF043303)的Rep编码序列中，使得Rep52或Rep40蛋白可自polh启动子表达，而Rep78或Rep68蛋白可自位于Rep编码序列上游的p10启动子合成。在多个其他方面，人工内含子可插入除核苷酸850和851以外的位置。 
在某些方面，本发明教导内容公开了使用人工内含子从单Cap编码核苷酸表达所有三种Cap蛋白(VP1、VP2和VP3)，而不突变VP1蛋白的AUG翻译起始密码子。在某些结构中，将人工内含子插入AAV基因组(AF043303)的核苷酸2227和2228之间，使得可自人工内含子内的polh启动子合成VP2和VP3蛋白，而VP1蛋白可自位于Cap编码序列的上游的polh启动子表达(图2)。当通过携带包含人工内含子的Cap编码序列的杆状病毒感染昆虫细胞时，可自Cap编码区上游的启动子转录VP1前mRNA并通过剪接人工内含子形成成熟mRNA。然后，可使用其原始AUG代替ACG起始密码子将成熟mRNA翻译成VP1蛋白，使得原始VP1氨基酸组成没有如美国专利6,723,551B2所述而改变。另外，VP2和VP3mRNA可从位于人工内含子内的polh启动子转录。根据优选的实施方案，位于Cap编码序列上游的启动子和人工内含子内的启动子均为polh启动子。 
在本发明教导内容的多个方面，人工内含子序列的变化形式可用于所公开的方法。在某些结构中，可使用与人工内含子核苷酸序列 具有显著序列相似性的序列。例如，可将与SEQ ID NO：1的人工内含子核苷酸序列具有至少60％、70％或90％序列同一性的序列导入核酸盒，使得可表达Rep78(或Rep68)和Rep52(或Rep40)，或所有三种Cap蛋白(VP1、VP2以及VP3)。 
在本发明教导内容的多个方面，提供了包含本发明教导内容的至少一种核苷酸序列的昆虫细胞相容性载体。在某些结构中，载体可包含AAV Rep编码核苷酸序列，且还包含含有昆虫细胞可操作启动子的人工内含子。根据另一种结构，昆虫细胞相容性载体可包含AAVCap编码核苷酸序列，且还包含SEQ ID NO：1核苷酸序列的人工内含子，或与SEQ ID NO：1所列的序列具有显著序列同一性的核苷酸序列。在某些结构中，AAV衣壳蛋白VP1、VP2以及VP3可来自AAV2。图5提供了用于制备AAV的单载体和稳定细胞系的两个实例。 
在本发明教导内容的多个方面，公开了一种昆虫细胞，所述昆虫细胞包含第一核苷酸序列、第二核苷酸序列以及第三核苷酸序列中至少一种。在这些方面，所述第一核苷酸序列可包含第一昆虫细胞可操作启动子、Rep编码核苷酸序列的5’部分、含有第二昆虫细胞可操作启动子的人工内含子，以及Rep编码核苷酸序列的3’部分，其中，所述第一昆虫细胞可操作启动子与所述Rep编码核苷酸序列的5’部分可操作地连接，所述第二昆虫细胞可操作启动子与所述Rep编码核苷酸序列的3’部分可操作地连接。另外，在这些方面，第二核苷酸序列可包含第三昆虫细胞可操作启动子，Cap编码核苷酸序列的5’部分，包含第四昆虫细胞可操作启动子的人工内含子，以及Cap编码核苷酸序列的3’部分，其中，所述第三启动子与Cap编码核苷酸序列的5’部分可操作地连接，所述第四启动子与Cap编码核苷酸序列的3’部分可操作地连接。另外，这些教导内容的昆虫细胞可包含含有至少一种AAV ITR核苷酸序列的第一核苷酸序列。 
在本发明教导内容的某些方面，昆虫细胞包含的核苷酸序列可包含两种AAV ITR核苷酸序列，和至少一种编码感兴趣的基因产物的 核苷酸序列或在哺乳动物细胞中于两条AAV ITR核苷酸序列之间表达的转基因。在多个结构中，所述第一、第二和第三核苷酸序列的至少一种可稳定地整合在昆虫细胞中。 
另一方面，本发明教导内容提供了一种在昆虫细胞中制备细小病毒基因组的方法。在该方法中，如图6所述，可将一种或两种昆虫细胞相容性载体导入昆虫细胞中。这些载体可共同包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。这些方面的第一核苷酸序列可包含第一昆虫细胞可操作启动子、Rep编码序列的5’部分、包含第二昆虫细胞可操作启动子的人工内含子，以及Rep编码序列的3’部分，其中，所述第一启动子与Rep编码序列的5’部分可操作地连接，所述第二启动子与Rep编码序列的3’部分可操作地连接。这些方面的第二核苷酸序列可包含含有至少一种细小病毒ITR的第二核苷酸序列。在这些方法的多种结构中，在将一种或多种载体导入昆虫细胞之后，可在使得产生细小病毒基因组的条件下维持昆虫细胞。细小病毒基因组可为下述的任何核酸：(1)包含来自AAV 5’和3’ITR的5’和3’ITR或分别与AAV 5’和3’ITR具有显著序列同一性(例如，至少约70％同一性、至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性或更大)的5’和3’ITR；以及(2)当导入一种或多种载体时可在昆虫细胞中复制的核酸。在某些结构中，细小病毒基因组可进一步包含Rep序列或其具有显著同一性的序列。这些方面的细小病毒可为细小病毒亚科的任何成员。具体地，细小病毒可为感染哺乳动物的细小病毒。在某些方面，细小病毒可为依赖病毒属，诸如AAV，例如人类或猿AAV。根据本发明教导内容在昆虫细胞中制备的细小病毒可包括野生型和/或修饰的ITR、Rep序列和VP序列，以及一种或多种另外的核苷酸序列(例如，一种或多种转基因)。 
在又一方面，本发明教导内容公开了在昆虫细胞中制备空细小病毒颗粒的方法。在图7中所述的这些方法中，可将昆虫细胞相容性载体导入昆虫细胞，并在使得产生空细小病毒颗粒的条件下维持所述昆虫细胞。空细小病毒颗粒可为任何细小病毒衣壳。细小病毒 可为细小病毒亚科的任何合适的成员，诸如感染哺乳动物的细小病毒。在某些方面，细小病毒可为依赖病毒属，诸如人类或猿AAV。在多种结构中，在昆虫细胞中制备的空细小病毒颗粒可包括野生型和/或修饰的Cap序列。 
实施例
本发明教导内容的多个方面可通过下述非限制性实施例描述。下述实施例是说明性的，且非意于限制权利要求的范围。除了以过去式呈现的结果以外，实施例中组合物或方法的描述并非暗示所述产品或组合物是否已经制备，或所述方法是否已经实施。 
实施例1
该实施例表明包含AAV2Rep编码序列和包含polh启动子的人工内含子的单核酸可表达Rep78和Rep52蛋白。 
在这些实验中，如Chisholm和Henner在《病毒学杂志》62(9)：3193-3200(1988)中所报道，使用相似的剪接供体和受体序列设计包含polh启动子的人工内含子。将人工内含子(SEQ ID NO：1)插入Rep78序列，使得Rep52mRNA自位于人工内含子内的polh启动子转录，而Rep78前mRNA自位于Rep78起始密码子上游的p10启动子转录。当宿主细胞中通过剪接而去除人工内含子时，形成成熟的Rep78mRNA(图1)。在这些实验中，将人工内含子插入根据标准编号的AAV基因组核苷酸850和851之间(可于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nuccore&id＝2906016的互联网获得，登录号：AF043303；还可参见，Srivastava，A.等，《病毒学杂志》45：555-564，1983)，其中，核苷酸841-860的序列是agtatttaag cgcctgtttg(SEQ ID NO：25)。首先，使用HindIII和SacI消化质粒pAAV-RC(Stratagene，加利福尼亚州La Jolla)，以分离骨架片段(6259bp)。然后，使用DrdI和HindIII消化pAAV-RC以分离977bp片段。最后，合成包含含有polh启动子的人工内含子的12 寡核苷酸，并进行退火。连接6259bp骨架片段、977bp片段以及退火的寡核苷酸，以产生质粒pAAV-inRC。使用PCR引物5’-GTGTGTATACCCGCCATGCCGGGGTTTTACGAGAT-3’(SEQ IDNO：14)和5’-GCGCGCATGCTCCTTCAGAGAGAGTGTCCTCGAGC-3’(SEQID NO：15)通过聚合酶链反应(PCR)扩增含有人工内含子的Rep编码序列，并使用限制性核酸内切酶BstZ17I和SphI消化，并将其克隆至pFastBacDual(Invitrogen，加利福尼亚州Carlsbad)的SmaI和SphI位点，以产生pFBD-inRep(图8)。用于形成人工内含子的12寡核苷酸如下： 
5’-CAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGGTAAGTACTCCCTATCAGTGATAG-3’(SEQ ID NO：2) 
5’-AGATCTATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACT-3’(SEQ ID NO：3) 
5’-GTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTC-3’(SEQ ID NO：4) 
5’-CCACCATCGGGCGCGAAGGGGGAGACCTGTAGTCAGAGCCCCCGGGCAGCACACACTGAC-3’(SEQ ID NO：5) 
5’-ATCCACTCCCTTCCTATTGTTTCAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGG-3’(SEQ ID NO：6) 
5’-TGGCGCAGCATCTGACGCAC-3’(SEQ ID NO：7) 
5’-GCGTCAGATGCTGCGCCACCAACCGTTTACGCTCCGTGAGATTCAAACAG-3’(SEQ ID NO：8) 
5’-GCGCTGAAACAATAGGAAGGGAGTGGATGTCAGTGTGTGCTGCCCGGGGGCTCTGACTAC-3’(SEQ ID NO：9) 
5’-AGGTCTCCCCCTTCGCGCCCGATGGTGGGACGGTATGAATAATCCGGAATATTTATAGGT-3’(SEQ ID NO：10) 
5’-TTTTTTATTACAAAACTGTTACGAAAACAGTAAAATACTTATTTATTTGCGAGATGGTTA-3’(SEQ ID NO：11) 
5’-TCATTTTAATTATCTCCATGATAGATCTCTATCACTGATAGGGAGTACTTACCTTAAATA-3’(SEQ ID NO：12) 
5’-CTGTTCCATATTAGTCCACGCCCACTGGAGCT-3’(SEQ IDNO：13)。 
根据制造商的操作方案(Invitrogen，加利福尼亚州Carlsbad)，将质粒pFBD-inRep用于转化DH10Bac感受态细胞，分离含有Rep编码序列的重组Bacmid DNA，并将其用于在Sf9细胞中生成重组杆状病毒Bac-inRep。在28℃下，将Sf9细胞维持于含有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen，加利福尼亚州Carlsbad)的SF900II SFM中。 
为了表达Rep蛋白，于28℃以1个感染复数(m.o.i.)感染Sf9细胞3天，并通过在2,000rpm离心15分钟收获Sf9细胞。于NuPAGE 
Figure G2007800370312D00281
LDS样品缓冲液(InVitrogen，加利福尼亚州Carlsbad)中裂解细胞沉淀物，煮沸5分钟，超声处理10秒钟，将裂解物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将蛋白转移至PVDF膜上，并通过单克隆抗体303.9克隆(American Research Products；加利福尼亚州San Jose)检测Rep78和Rep52。图9A中呈现的结果显示Rep78和Rep52均有表达，表明人工内含子得以成功剪除而产生被翻译成Rep78蛋白的全长mRNA。这些结果还表明位于内含子内中的polh启动子具有功能性，且编码Rep52的全长mRNA被转录并翻译成Rep52蛋白。 
实施例2
该实施例表明包含含有polh启动子的人工内含子的单AAV2Cap编码序列可表达VP1、VP2以及VP3蛋白。 
位于野生型AAV基因组右侧的ORF编码三种重叠衣壳蛋白VP1、VP2以及VP3。在哺乳动物细胞中，这些衣壳蛋白自产生于p40启动子的两种剪接的mRNA合成。一种信使mRNA被翻译成VP1，而另一种转录物编码VP2和VP3。VP2的天然存在的起始密 码子是劣用的ACG，其导致核糖体扫描至VP3起始密码子(AUG)。两个剪接受体位点的交替使用和VP2的ACG起始密码子的劣用对AAV2感染的哺乳动物细胞中VP1、VP2以及VP3的化学计量发挥作用，并反映衣壳中的蛋白比例1∶1∶10。AAV Cap内含子在昆虫细胞中不剪接。 
为了自单编码序列表达所有三种衣壳蛋白，并保留VP1蛋白的天然AUG起始密码子，使用如上文实施例1所述的相同人工内含子。在AAV基因组(AF043303)的核苷酸2227和2228之间将它插入Cap编码序列，其中，核苷酸2221-2230序列是cttccagatt(SEQ ID NO：26)。首先，使用BamHI和EcoNI消化质粒，以分离4969bp骨架片段。然后，使用引物5’-GCGCGGATCCTGTTAAGATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGGTAAGTACTCCCTATCAGTGATAGAG-3’(SEQ ID NO：16)和5’-ATATCGTCTCGCTGAAACAATAGGAAGGGAGTGGAT-3’(SEQ ID NO：17)从pAAV-inRep扩增人工内含子。引物SEQ ID NO：16含有BamHI位点和VP1编码序列的前25个核苷酸(ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAG，SEQ ID NO：27)，并且引物SEQ ID NO：17含有BsmBI位点。然后使用BamHI和BsmBI消化PCR产物。使用引物5’-AATTCGTCTCGTCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGA-3’(SEQ ID NO：18)和5’-TCCCGGAGCCGTCTTAACAG-3’(SEQ IDNO：19)从pAAV-RC扩增第二PCR片段，并使用限制性酶BsmBI和EcoNI消化。将骨架片段与两条PCR片段连接以产生pAAV-inCap。然后使用BamHI和SnaBI消化包含人工内含子的完整的Cap编码序列，并将其与pFastBacDual质粒的BamHI和HindIII位点(通过Klenow使其变钝)连接，以产生pFBD-inCap质粒(图10)。然后，根据实施例1所述的方法将该质粒用于生成重组杆状病毒Bac-inCap。用Bac-inCap在28C感染Sf9细胞3天，并在NuPAGE 
Figure G2007800370312D00291
LDS样品缓冲液中收获和裂解。然后，通过SDS-PAGE分离蛋白并将其转移至PVDF膜，使用针对AAV衣壳蛋白的单克隆抗体探测(克隆B1，American Research Products；加利福尼亚州San Jose)。图9B中显示的结果表明表达了VP1、VP2以及VP3蛋白，表明成功剪接了人工内含子而形成被翻译成VP1蛋白的全长VP1 mRNA。结果进一步表明位于人工内含子内的polh启动子合适地发挥作用而驱动VP2和VP3蛋白表达。
实施例3
该实施例表明通过使用相同设计的人工内含子，可从AAV8、AAV6以及AAV1血清型表达VP1、VP2以及VP3蛋白。 
将上文实施例中使用的相同人工内含子插入AAV血清型8的Cap编码序列的核苷酸2145和2146之间(登录号NC 006261)，其中，核苷酸2141-2150是tccagattgg(SEQ ID NO：28)；AAV血清型6的核苷酸2232和2233之间(登录号NC 001862)，其中核苷酸序列2231-2240是agattggctc(SEQ ID NO：32)；以及AAV血清型1的2247和2248之间(登录号NC 002077)，其中核苷酸序列2241-2250是cttccagatt(SEQ ID NO：29，见实施例2)。为了构建pFBD-inCap8和pFBD-inCap6，使用引物5’-ATGCCCTCAGAGAGGTTGTCCTCGAGCCAATCTGAAACAAT-3’(SEQ ID NO：21)和5’-CCCGGTACCGCATGCTATGC-3’(SEQID NO：22)通过PCR从pFBD-inCap扩增人工内含子。使用EcoNI和SphI消化扩增产物，并将消化产物分别与pFBD-Cap8和pFBD-Cap6的EcoNI和SphI位点连接，产生pFBD-inCap8(图11)和pFBD-inCap6(图12)。为了将人工内含子克隆至AAV1的Cap编码序列中，使用EcoNI和XbaI消化pFBD-inCap8以去除AAV8的Cap编码序列。使用引物5’-GATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTG-3’(SEQ IDNO：23)和5’-GGATCCTCTAGAGTCGACCGCTTACAGGGGACGGGTAAGGT-3’(SEQ ID NO：24)从AAV1质粒PCR扩增AAV1的Cap编码序列。 将EcoNI和XbaI消化的PCR片段与EcoNI和XbaI消化的pFBD-inCap8连接，产生pFBD-inCap1(图13)。根据实施例1所述的制造商的操作方案生成重组杆状病毒Bac-inCap8、Bac-inCap6以及Bac-inCap1。在28℃分别用Bac-inCap8、Bac-inCap6以及Bac-inCap1感染Sf9细胞3天，在NuPAGE LDS样品缓冲液中收获并裂解。通过SDS-PAGE分离蛋白，并将其转移至PVDF膜上。通过单克隆抗体B1克隆(American Research Products；加利福尼亚州San Jose)检测VP1、VP2以及VP3蛋白。图9中显示的结果表明VP1、VP2以及VP3蛋白自检测的所有血清型成功表达，表明人工内含子得以成功剪接，而形成被翻译成VP1蛋白的全长VP1mRNA。这些结果还表明人工内含子内的polh启动子在检测的所有血清型中合适地发挥作用，以驱动VP2和VP3蛋白表达。 
实施例4
该实施例表明通过使用各自含有人工内含子的AAV Rep和Cap编码序列，可在昆虫细胞中制备rAAV。 
在这些实验中，在含有100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的SF900II SFM培养基中于28℃培养Sf9细胞至约107个细胞/ml，并在感染之前将其稀释至约5×106个细胞/ml。将三重感染用于制备rAAV。将各自1个感染复数的Bac-inRep、Bac-GFP(或Bac-RFP)以及Bac-inCap用于在28℃感染Sf9细胞3天以产生AAV血清型2载体。对于AAV1、6以及8型载体的制备，在三重感染中分别用Bac-inCap 1、Bac-inCap6以及Bac-inCap8简单取代Bac-inCap。在感染3天之后，通过于台式离心机中在2,000rpm离心15分钟收集细胞沉淀物。如Urabe等，《人类基因治疗》1；13(16)：1935-43(2002)所述于裂解缓冲液中裂解细胞沉淀物，并通过benzonase(Sigma，密苏里州St.Louis)消化细胞核酸(DNA和RNA)。通过于Avanti J-25离心机(Backman，加利福尼亚州Fullerton)中在8,000rpm离心30分钟清除细胞裂解物，然后将其装入含有5ml 1.55g/cc和10ml 1.32g/cc CsCl溶液的SW28离心管中。在15℃于28,000rpm离心约16小时之后，通过使用注射针穿刺离心管而收集含有rAAV的部分，并将其进行第二轮CsCl超离心。再次使用注射针通过穿刺离心管收集含有rAAV的部分，并于PBS缓冲液中透析以去除盐和去污剂。根据制造商的操作方案(Applied Biosystems，加利福尼亚州FosterCity)通过实时定量PCR分析测定载体滴度。表1中呈现的结果显示使用分别携带包含人工内含子的Rep和Cap编码序列的重组杆状病毒可于Sf9细胞中制备高滴度的rAAV载体。 
表1 
Figure G2007800370312D00321
实施例5
该实施例表明使用双载体系统在昆虫细胞中制备rAAV。 
使用标准克隆技术将各自含有人工内含子的Rep和Cap编码序列一起克隆至图4所示的单杆状病毒中。于28℃将Sf9细胞培养至107个细胞/ml，并恰好在感染之前将其稀释至5×106个细胞/ml。在28℃将各自为1个感染复数的Bac-inRep-inCap和Bac-GFP用于感 染细胞3天。如实施例4所述收获细胞并纯化rAAV载体。表2呈现的结果表明使用双载体系统成功制备了AAV2载体。 
表2 
Figure G2007800370312D00331
实施例6
该实施例表明通过使用包含人工内含子的AAV Cap编码序列合适地在病毒体中包装了VP1、VP2以及VP3蛋白。 
在这些实验中，于NuPAGE 
Figure G2007800370312D00332
LDS样品缓冲液中煮沸各自为1010载体基因组的纯化的AAV2、AAV6以及AAV8持续5分钟。通过SDS-PAGE解析蛋白，并将其转移至PVDF膜。如实施例2所述，通过单克隆抗体B 1克隆检测VP1、VP2以及VP3蛋白。结果表明通过使用包含人工内含子的Cap编码序列，所有三种衣壳蛋白可合适地包装至病毒体中。 
实施例7
该实施例表明使用包含人工内含子的Rep和Cap编码序列在昆虫细胞中制备的AAV载体具有感染性并可将基因递送至靶细胞。 
在这些实验中，将AAV2-GFP和AAV6-GFP用于转导HepG2肝细胞癌细胞(美国典型培养物保藏中心，弗吉尼亚州Manassas)，以显示在昆虫细胞中制备的载体的感染性。于37℃在补充10％胎牛血清(Hyclone，犹他州Logan)和100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen，加利福尼亚州Carlsbad)的MEM培养基(ATCC) 中培养HepG2细胞。将1.5×105个细胞/孔的HepG2细胞接种于24孔培养板，并在CO2培养箱中于37℃过夜培养。将AAV载体在无血清但含有20μM依托泊苷(etoposide，A.G.Scientific，Inc.，加利福尼亚州San Diego)的培养基中稀释至1.2×109vg/ml、1.2×108vg/ml、1.2×107vg/ml以及1.2×106vg/ml。从细胞去除旧培养基，并将500μl稀释的AAV载体添加至每孔。转导2天后，对GFP表达细胞进行评分，并照相。结果显示HepG2细胞被AAV2-GFP和AAV6-GFP载体有效转导。 
实施例8
该实施例表明本发明教导内容的含有Rep或Cap编码序列和人工内含子的核酸序列在杆状病毒中是稳定的。 
为了证明分别包含Rep和Cap编码序列的杆状病毒的稳定性，对杆状病毒进行噬斑纯化，接着传代5次，并分析Rep和Cap蛋白表达。如下所述进行噬斑纯化：将1×106个细胞/孔的Sf9细胞接种于6孔培养板中，并于28℃温育30分钟。将杆状病毒稀释至100pfu/100μl、50pfu/100μl以及25pfu/100μl。从细胞去除旧培养基，并添加稀释的杆状病毒，在28℃感染细胞20分钟。熔化于DPBS中的1％琼脂糖，冷却至37℃，并在37℃与1个体积量的SF900II SFM混合，将1.5ml的琼脂糖-SF900II SFM覆盖层添加至各孔。当琼脂糖固化时，将1.5ml SF900II SFM添加至各孔，并于28℃温育培养板6天，使得形成噬斑。在温育结束时，挑选Bac-inCap的6个噬斑，和Bac-inRep的12个噬斑，并将其转移至含有500μl SF900II SFM培养基的微离心管。使用100μl的各噬斑感染6孔培养板中的Sf9细胞4天。收集细胞用于蛋白质印迹分析，并收集上清液，将3μl的上清液用于感染6孔培养板中的Sf9细胞。重复该程序4次，直至第5代。结果显示，如所预期的，经过5代挑选的噬斑表达Rep78和Rep52或VP1、VP2以及VP3蛋白，无明显的蛋白表达丧失。 
实施例9
该实施例表明在昆虫细胞中从包含多个内含子的单表达盒表达了多种SV40VP蛋白。 
猿猴病毒40(SV40)是具有5.2kb共价闭合的环状基因组的双链DNA病毒，并且已经完整测序(Fiers，W.等，Nature(《自然》)273：113-120，1978)。其序列可在互联网 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nuccore&id＝9628421登录号NC_001669上获得。在哺乳动物细胞中，其三种衣壳蛋白VP1、VP2以及VP3均转录自相同的SV40启动子，并且这些VP蛋白的表达受到内含子剪接机制的调控。VP3蛋白是VP2蛋白的截短形式，编码VP1蛋白的序列的5’部分与VP2和VP3的3’部分重叠，但不具有相同的ORF。 
人工内含子可用于在昆虫细胞中表达SV40衣壳蛋白。为了驱动VP3表达，将包含polh启动子的人工内含子插入至SV40基因组的核苷酸913和914之间，其中核苷酸911-920序列是caggaatggc(SEQID NO：30)。为了驱动VP1表达，将包含相同polh启动子的人工内含子插入核苷酸1462和1463之间，其中核苷酸1461-1470的序列是aggcctgtac(SEQ ID NO：31)。VP2蛋白自与VP2基因可操作地连接的polh启动子表达(图14)。 
该说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本申请，如同各出版物或专利申请特别和单独被指明通过引用并入本申请。尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实例的方式较详细地描述了上文的教导内容，但根据所述教导内容对本领域技术人员显而易见的是，在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以进行某些改变和变化。 
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Claims (31)

1.一种用于在昆虫细胞中表达由包含重叠开放阅读框（ORF）的基因编码的多种多肽的核酸盒，所述核酸盒按照5’至3’顺序包含： 
a）第一昆虫细胞可操作启动子； 
b）包含所述基因的第一ORF的基因的5’部分； 
c）包含第二昆虫细胞可操作启动子的内含子；以及 
d）与至少一种另外的ORF重叠的基因的3’部分， 
其中，所述第一昆虫可操作启动子与所述第一ORF可操作地连接；所述第一ORF包含第一翻译起始密码子；所述第二昆虫细胞可操作启动子与所述至少一种另外的ORF可操作地连接，所述至少一种另外的ORF包含至少一种另外的翻译起始密码子，并且其中，a）、b）、c）以及d）中的至少一者与a）、b）、c）以及d）中的至少另一者是异源的。 
2.根据权利要求1所述的核酸盒，其还包含：e)位于d）的3’的多聚腺苷酸化信号。 
3.根据权利要求1所述的核酸盒，其中，所述第一昆虫细胞可操作启动子和所述第二昆虫细胞可操作启动子中的每一个独立地选自由p10启动子和polh启动子组成的组。 
4.根据权利要求1所述的核酸盒，其中，所述包含重叠ORF的基因选自由腺病毒相关病毒（AAV）的Rep基因和AAV的Cap基因组成的组。 
5.根据权利要求4所述的核酸盒，其中，所述第一ORF是Rep78/68ORF，所述至少一种另外的ORF是Rep 52/40 ORF。 
6.根据权利要求5所述的核酸盒，其中，所述第一启动子是p10启动子，所述第二启动子是polh启动子。 
7.根据权利要求4所述的核酸盒，其中，所述第一ORF是VP1 ORF，所述至少一种另外的ORF是VP2/VP3 ORF。 
8.根据权利要求7所述的核酸盒，其中，所述第一启动子是第一polh启动子，所述第二启动子是第二polh启动子。 
9.一种包含权利要求1所述的核酸盒的载体。 
10.根据权利要求9所述的载体，其中，所述载体选自由质粒、病毒及其组合组成的组。 
11.一种包含权利要求1所述的核酸盒的体外昆虫细胞。 
12.根据权利要求11所述的体外昆虫细胞，其包含第一核酸盒和第二核酸盒，其中，所述第一核酸盒包含含有Rep 78/68 ORF和Rep 52/40 ORF的Rep基因，所述第二核酸盒包含含有VP1 ORF和VP2/VP3 ORF的Cap基因。 
13.根据权利要求12所述的昆虫细胞，其还包含另外的核酸盒，所述另外的核酸盒按照5’至3’顺序包含： 
腺病毒相关病毒的第一末端反向重复序列（ITR）； 
哺乳动物细胞可操作启动子； 
转基因； 
多聚腺苷酸化信号；以及 
AAV的第二ITR。 
14.根据权利要求13所述的昆虫细胞，其中，所述转基因为编码多肽的报告基因，所述多肽选自由氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶、绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）以及碱性磷酸酶组成的组。 
15.根据权利要求13所述的昆虫细胞，其中，所述转基因包含编码多肽的ORF，所述多肽选自由多肽激素、干扰素、血液凝固因子、疫苗以及促红细胞生成素组成的组。 
16.根据权利要求11所述的昆虫细胞，其中，所述核酸盒被整合至所述昆虫细胞的基因组中。 
17.根据权利要求13所述的昆虫细胞，其中，所述核酸盒和所述另外的核酸盒的至少一者被整合至所述昆虫细胞的基因组中。 
18.根据权利要求11所述的昆虫细胞，其中，所述细胞选由自粉纹夜蛾的BTI-Tn-5B1-4细胞、草地贪夜蛾Sf9细胞以及草地贪夜蛾Sf21细胞组成的组。 
19.一种细胞培养物，其包含： 
多种根据权利要求11所述的昆虫细胞；以及 
培养基。 
20.一种细胞培养物，其包含： 
多种根据权利要求13所述的昆虫细胞；以及 
包含至少1013AAV基因组/L的培养基。 
21.根据权利要求20所述的细胞培养物，其中，所述包含至少1013AAV基因组/L的培养基是包含至少1014AAV基因组/L的培养基。 
22.一种表达由包含重叠ORF的基因编码的多种多肽的方法，所述方法包括： 
a)使用根据权利要求1所述的核酸盒感染或转染至少一种昆虫细胞；以及 
b)培养所述至少一种昆虫细胞。 
23.根据权利要求22所述的表达由包含重叠ORF的基因编码的多种多肽的方法，其中，所述至少一种昆虫细胞选自由粉纹夜蛾的BTI-Tn-5B1-4细胞、草地贪夜蛾Sf9细胞以及草地贪夜蛾Sf21细胞组成的组。 
24.一种在昆虫细胞中制备腺病毒相关病毒（AAV）的方法，所述方法包括： 
a)提供根据权利要求13所述的一种或多种昆虫细胞；以及 
b)在培养基中培养所述一种或多种昆虫细胞。 
25.一种体外制备AAV衣壳的方法，所述方法包括： 
a)提供包含根据权利要求4所述的核酸盒的一种或多种昆虫细胞，其中，所述包含重叠ORF的基因是AAV的Cap基因；以及 
b)在培养基中培养所述一种或多种昆虫细胞。 
26.根据权利要求25所述的一种体外制备AAV衣壳的方法，其中，所述提供包含根据权利要求4所述的核酸盒的一种或多种昆虫细胞的步骤包括使用包含所述核酸盒的核酸或载体转化、转染或感染一种或多种昆虫细胞。 
27.一种体外制备AAV基因组的方法，所述方法包括： 
a)提供包含根据权利要求5所述的核酸盒和另外的核酸盒的一种或多种昆虫细胞，所述另外的核酸盒按照5’至3’顺序包含： 
腺病毒相关病毒的第一末端反向重复序列（ITR）； 
哺乳动物细胞可操作启动子； 
转基因； 
多聚腺苷酸化信号；以及 
AAV的第二ITR，以及 
b)在培养基中培养所述一种或多种昆虫细胞。 
28.一种包含权利要求2所述的核酸盒的核酸，其还包含第二核酸盒，所述第二核酸盒按照5’至3’顺序包含： 
第二多聚腺苷酸化信号； 
包含重叠ORF的第二基因的3’部分； 
包含第三昆虫可操作启动子的第二内含子； 
所述第二基因的5’部分；以及 
第四昆虫可操作启动子。 
29.根据权利要求28所述的核酸，其中，所述第二核酸盒相对于所述第一核酸盒为反义方向。 
30.根据权利要求28所述的核酸，其中，所述第二核酸盒相对于所述第一核酸盒为正义方向。 
31.根据权利要求28所述的核酸，其中，所述第一核酸盒包含含有Rep 78/68 ORF和Rep 52/40 ORF的AAV Rep基因，所述第二核酸盒包含含有VP1 ORF和VP2/VP3 ORF的AAV Cap基因。 
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