ES2628006T3

ES2628006T3 - Composiciones para el tratamiento de trastornos neurogénicos del suelo pélvico

Info

Publication number: ES2628006T3
Application number: ES13751108.5T
Authority: ES
Inventors: Karl A. DEISSEROTH; Elizabeth R. ADEN; Viviana Gradinaru; Scott L. Delp
Original assignee: Leland Stanford Junior University; Circuit Therapeutics Inc
Current assignee: Leland Stanford Junior University; Circuit Therapeutics Inc
Priority date: 2012-02-21
Filing date: 2013-02-21
Publication date: 2017-08-01
Anticipated expiration: 2033-02-21
Also published as: US20140024701A1; AU2013222443B2; EP2817068B1; EP2817068A1; JP6621791B2; CN104363961B; CN104363961A; JP6537826B2; US11103723B2; WO2013126521A1; EP3205374B1; EP3205374A1; US20160038761A1; EP2817068A4; JP2018052958A; ES2728077T3; AU2013222443A1; CA2865296A1; JP2015509498A

Abstract

Un primer polinucleótido para su uso en un método para el tratamiento de la hiperreflexia del detrusor y/o la disinergia detrusor-esfínter externo en un individuo que lo necesita, en donde dicho primer polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína opsina sensible a la luz que comprende: i) una secuencia al menos un 95 % idéntica a la secuencia mostrada en las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:23; ii) una señal de exportación del RE y iii) una señal de tráfico de membrana, y en donde el método comprende: administrar al individuo una cantidad eficaz de dicho primer polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína opsina sensible a la luz, en donde la proteína opsina se expresa en la membrana plasmática de una población de neuronas responsables de la inervación del músculo detrusor y/o una población de neuronas responsables de la inervación del músculo esfínter urinario externo en el individuo, en donde dicha primera proteína opsina induce la hiperpolarización de las neuronas que expresan la proteína opsina en respuesta a la luz, de modo que la hiperpolarización de las neuronas responsables de la inervación del músculo detrusor permite el almacenamiento de orina en la vejiga y la hiperpolarización de las neuronas responsables de la inervación del músculo esfínter urinario externo permite la evacuación de la orina de la vejiga.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones para el tratamiento de trastornos neurogenicos del suelo pelvico Campo de la invencion

Esta divulgacion se refiere a metodos para el tratamiento de trastornos neurogenicos del suelo pelvico incluyendo disfuncion vesical, incontinencia fecal y disfuncion sexual en un individuo, mediante el uso de protelnas opsina sensibles a la luz expresadas de forma estable capaces de alterar selectivamente el potencial de membrana de las celulas neurales que inervan los musculos y organos responsables de la funcion urinaria, rectal y sexual.

Introduccion

La “optogenetica” se refiere a la combinacion de metodos geneticos y opticos utilizados para controlar eventos especlficos en celulas diana de tejido vivo, incluso en mamlferos que se mueven libremente y otros animales, con la precision temporal (escala de tiempo de milisegundos) necesaria para mantener los sistemas biologicos intactos. La caracterlstica distintiva de la optogenetica es la introduccion de canales de iones y/o protelnas bombas sensibles a la luz de respuesta rapida en las membranas plasmaticas de las celulas neuronales diana que permita una manipulacion temporal precisa del potencial de la membrana neuronal a la vez que se mantiene la resolucion del tipo celular mediante el uso de mecanismos de direccionamiento especlficos (Vease, p. ej., las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos numeros 2007/0054319, 2009/0093403 y 2010/0145418, as! como las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional numeros WO 2009/131837 y WO 2007/024391). En tan solo unos pocos anos, el campo de la optogenetica ha fomentado la comprension cientlfica fundamental de como los tipos especlficos de celulas contribuyen a la funcion de los tejidos biologicos in vivo, incluyendo las interacciones entre los musculos esqueletico y liso con las neuronas responsables de su inervacion.

La incontinencia urinaria, la incapacidad para mantener el control voluntario de la miccion, es una afeccion que afecta a millones de hombres y mujeres en todo el mundo. El control de la miccion es un proceso fisiologico complejo que incluye vlas de reflejos neurales, algunas con y sin control del sistema nervioso central, musculos lisos y voluntarios, as! como efectos hormonales. (Vease la revision de DeGroat, 1997, Urology 50 [Supp6A]:36-52). Un gran subconjunto de los casos de incontinencia urinaria es al menos parcialmente neurogenico. El termino cllnico “vejiga hiperactiva” se utiliza generalmente para designar cualquier forma de incontinencia caracterizada por una mayor frecuencia de miccion o deseo de evacuar, ya sea de forma completa o episodica, y donde la perdida de control voluntario varla de parcial a total. “Incontinencia de urgencia” es la perdida involuntaria de orina asociada con un abrupto y poderoso deseo de evacuar. La incontinencia de urgencia se asocia a menudo con el hallazgo urodinamico de contracciones involuntarias (desinhibidas) del musculo detrusor, el cual proporciona la principal fuerza para expulsar la orina de la vejiga. Un gran subconjunto de pacientes con detrusor desinhibido tiene algun tipo de deterioro neurologico, en cuyo caso el termino cllnico es “hiperreflexia del detrusor” (HD). Los trastornos neurologicos comunes asociados con la hiperreflexia del detrusor (HD) son enfermedad de Parkinson, ictus, diabetes, esclerosis multiple (EM) y neuropatla periferica. Ademas, las personas que sufren una lesion traumatica de la medula espinal comunmente experimentan slntomas asociados con HS.

El musculo esflnter urinario externo tambien puede verse afectado por lesiones de la medula espinal, lo que tiene como resultado una afeccion conocida como “disinergia”. “La disinergia implica una incapacidad de los musculos esflnter urinarios para relajarse cuando la vejiga se contrae, incluida la contraccion activa en respuesta a la evacuacion de la vejiga, evitando que la orina fluya a traves de la uretra y dando como resultado la evacuacion incompleta de la vejiga y el “reflujo” de la orina en los rinones .

Algunos tratamientos para la hiperreflexia del detrusor y la disinergia del esflnter urinario externo dependen de la neuroestimulacion electrica. Esta modalidad de tratamiento depende del uso de electrodos colocados adyacentes al nervio/musculo a estimular. La activacion del electrodo con un impulso electrico excita el nervio adyacente, lo que conduce a la contraccion de los musculos inervados por ese nervio. Sin embargo, el electrodo es no selectivo y estimulara cada tipo de tejido y celula que entra dentro de su campo electrico. Por lo tanto, los metodos y dispositivos neuroestimuladores actuales no pueden actuar localmente con especificidad de tipo celular para regular los musculos y los nervios responsables de los slntomas asociados con la hiperreflexia del detrusor y la disinergia del esflnter urinario externo.

La estimulacion de la ralz anterior sacra (SARS, Finetech Medical Limited) es un dispositivo neuroestimulador utilizado para restaurar la funcion de la vejiga en pacientes que han sufrido lesiones de la medula espinal. El SARS requiere una rizotomla de la ralz sacra para prevenir la HD/DDE (disinergia detrusor-esflnter externo), dando como resultado la perdida de la funcion sexual. Ademas, la rizotomla de la ralz sacra dana aun mas las vlas aferentes del tracto urinario inferior, lo que lleva a la arreflexia de la vejiga o la perdida de la contraccion de la vejiga. Como resultado, la estimulacion electrica posquirurgica es necesaria para activar el musculo detrusor. Sin embargo, al mismo tiempo, el electrodo tambien activa el musculo esflnter urinario externo porque los nervios que inervan el esflnter son mas grandes que los del detrusor y, por lo tanto, son reclutados primero. Debido a que el musculo estriado esflnter se relaja mas rapidamente que el musculo liso del detrusor, un individuo que ha sufrido el SARS

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experimenta evacuacion post-estlmuio durante un breve perlodo de tiempo. Sin embargo, ademas de la ya mencionada perdida de la funcion sexual, el SARS a menudo produce una presion vesical muy aita que puede causar reflujo vesicoureteral a corto plazo y se ha asociado, a largo plazo, con insuficiencia renal.

Otros tratamientos actuales para la hiperreflexia del detrusor y la disinergia del esflnter urinario externo son el autocateterismo permanente o intermitente combinado con agentes anti-muscarlnicos (como oxibutinina o tolterodina), el uso de alfa-bloqueantes, la inyeccion del esflnter urinario externo con toxina botullnica, Botox® (Allergan) o Dysport® (Ipsen)), dilatacion con balon del esflnter urinario externo y uso de stents uretrales. Sin embargo, todos estos tratamientos sufren inconvenientes considerables, incluyendo la necesidad de tratamientos repetidos frecuentes (en el caso de la cateterizacion intermitente y la administration de toxina botullnica), el aumento de las infecciones del tracto urinario (cateterismo, stents, dilatacion con balon), aumento de la incidencia de septicemia (dilatacion con balon) y aumento de la susceptibilidad al carcinoma de celulas escamosas (cateterismo).

Otro trastorno del piso pelvico, la incontinencia fecal, es una condition por la cual el material fecal es involuntariamente excretado o filtrado debido a la disminucion del control intestinal. La incontinencia fecal de diversos grados se cree que es el resultado de cualquier numero de factores, incluyendo disfuncion o dano a los esflnteres anales, disfuncion del piso pelvico o disminucion de la adherencia en el recto. La inervacion neural a la region anorrectal es tanto somatica como autonoma. El nervio perineal superficial (rama del nervio pudendo) proporciona fibras sensoriales al perineo as! como a la mucosa del canal anal. El esflnter anal externo recibe su inervacion motora del nervio rectal inferior (tambien conocido como nervio hemorroidal inferior, una rama del nervio pudendo). Al igual que los tratamientos para la disfuncion urinaria, algunos tratamientos para la incontinencia fecal dependen de la estimulacion electrica de los nervios que controlan los musculos esflnter anal e intentan restaurar la continencia de un individuo. Otros tratamientos quirurgicos, como la colostomla, tambien son comunes. Sin embargo, todos estos metodos sufren considerables inconvenientes practicos y complicaciones.

La disfuncion sexual comprende una amplia gama de enfermedades, incluyendo disfuncion erectil, disfuncion orgasmica, eyaculacion precoz y falta de lubrication. Las disfunciones sexuales afectan tanto a las mujeres como a los hombres, y pueden ser de por vida o adquiridas. La disfuncion sexual tiene una serie de causas, tanto fisiologicas como psicologicas, y en muchos pacientes el trastorno puede ser multifactorial. Las causas incluyen varias que son esencialmente de origen neurologico. Por ejemplo, el dano a las vlas utilizadas por el sistema nervioso autonomo para inervar el pene y el clitoris puede interrumpir la excitation sexual iniciada por el sistema nervioso central. Lesiones (p.ej., dano, infection o enfermedad) de las vlas nerviosas somaticas (es decir, cualquiera de los nervios asociados con la sensation o el movimiento) puede afectar a la funcion sexual reflexogenica (es decir, respuesta fisiologica instintiva involuntaria a un estlmulo) y puede interrumpir la sensacion tactil necesaria para mantener la excitacion sexual. Ademas, las lesiones de la medula espinal pueden producir diversos grados de disfuncion sexual dependiendo de la localization y la gravedad de las lesiones.

Actualmente, no existe una buena terapia de larga duration, rentable o cllnicamente significativa que se dirija precisamente a las celulas neurales y a los musculos y organos asociados responsables de estos defectos con el potencial de producir una miccion mas fisiologicamente normal, el control del intestino y la funcion sexual en individuos con slntomas asociados a trastornos neurogenicos del suelo pelvico.

Se conocen del documento US2009/0326603 medios para tratar la disfuncion de la vejiga mediante la estimulacion electrica del nervio pudendo, lo que conduce a contracciones de la vejiga.

Sumario

La invention a la que pertenece esta memoria descriptiva se expone en las reivindicaciones adjuntas a esta memoria descriptiva.

En la presente memoria se proporcionan metodos para el tratamiento de la disfuncion vesical, la incontinencia fecal y la disfuncion sexual en un individuo mediante el uso de protelnas opsina sensibles a la luz expresadas de forma estable capaces de hiperpolarizar o despolarizar las neuronas que inervan los musculos de la vejiga, las neuronas que inervan el esflnter anal externo, las neuronas que inervan los musculos responsables de la contraction del recto y/o las neuronas que inervan los organos genitales, en los que la hiperpolarizacion o depletion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas induce la relajacion del musculo inervado por las neuronas y la despolarizacion de las neuronas induce la contraccion del musculo inervado por las neuronas. En algunas realizaciones, la contraccion del musculo detrusor y la relajacion del esflnter urinario externo para permitir la miccion pueden ser inducidas por la activation de una o mas de las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las neuronas. En algunas realizaciones, la relajacion del musculo detrusor y la contraccion del esflnter urinario externo para permitir el almacenamiento de orina puede ser inducida por la activacion de una o mas de las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las neuronas. En algunas realizaciones, la contraccion del esflnter anal externo para permitir el almacenamiento de las heces puede ser inducida por la activacion de una o mas protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las neuronas. En algunas realizaciones, la relajacion del esflnter anal externo para permitir la defecation puede ser inducida por la activacion de una o mas de las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las neuronas. Ademas, la defecacion puede facilitarse adicionalmente mediante la contraccion

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simultanea de los musculos responsables de la contraccion del recto inducida por la activacion de una o mas de las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las neuronas. En algunas realizaciones, la disfuncion sexual puede tratarse aumentando la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion de los musculos y organos de los genitales.

Por consiguiente, en algunos aspectos, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo: administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo en el individuo, en el que la protelna opsina induce la hiperpolarizacion de las neuronas que expresan la protelna opsina en respuesta a la luz, de modo que la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite el almacenamiento de orina en la vejiga y la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo permite la evacuacion de la orina de la vejiga, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana.

En algunos aspectos, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo: administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo en el individuo, en el que la protelna opsina induce la hiperpolarizacion de las neuronas que expresan la protelna opsina en respuesta a la luz, de modo que la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite el almacenamiento de orina en la vejiga y la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo permite la evacuacion de la orina de la vejiga, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina

sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID

NO:23, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana.

NO:4, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana.

En algunos aspectos, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo: administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo en el individuo, en el que la protelna opsina es capaz de inducir la depletion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan la protelna opsina en respuesta a la luz, de modo que la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite el almacenamiento de orina en la vejiga y la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo permite la evacuacion de la orina de la vejiga, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.

En algunos aspectos, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo: administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo en el individuo, en el que la protelna opsina es capaz de inducir la despolarizacion de las neuronas, de modo que la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite la evacuacion de

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la orina de la vejiga y la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo permite el almacenamiento de la orina de la vejiga, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.

En otros aspectos, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo: administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo en el individuo, en el que la protelna opsina induce la hiperpolarizacion de las neuronas que expresan la protelna opsina en respuesta a la luz, de modo que la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo permite la defecacion, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana.

En otros aspectos, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo: administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo en el individuo, en el que la protelna opsina induce la hiperpolarizacion de las neuronas que expresan la protelna opsina en respuesta a la luz, de modo que la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo permite la defecacion, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana.

En otros aspectos, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo: administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo en el individuo, en el que la protelna opsina induce la hiperpolarizacion de las neuronas que expresan la protelna opsina en respuesta a la luz, de modo que la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo permite la defecacion, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:23, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana.

En otros aspectos mas, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo: administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo en el individuo, en el que la protelna opsina es capaz de inducir la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan la protelna opsina en respuesta a la luz, de modo que la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo permite la defecacion, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo: administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo en el individuo, en el que la protelna opsina es capaz de inducir la despolarizacion de las neuronas, de modo que la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo permite el almacenamiento de las heces en el recto, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.

En otros aspectos, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar la disfuncion sexual en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo: administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en donde la protelna opsina Se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion de los

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genitales del individuo, en donde la protelna opsina induce la despolarizacion de las neuronas que expresan la protelna opsina en respuesta a la luz, por lo que la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion De los genitales restaura la funcion sexual.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un kit para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, que comprende: a) un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la protelna opsina que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la protelna opsina.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un kit para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, que comprende: a) un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la protelna opsina que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la protelna opsina.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un kit para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, que comprende: a) un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la protelna opsina que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:23, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la protelna opsina.

En otros aspectos mas, en la presente memoria se proporciona un kit para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, que comprende: a) un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la protelna opsina.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un kit para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesite, que comprende: a) un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la protelna opsina que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la protelna opsina.

En otro aspecto mas, en la presente memoria se proporciona un kit para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesite, que comprende: a) un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11; y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la protelna opsina.

En otros aspectos, en la presente memoria se proporciona un kit para tratar la disfuncion sexual en un individuo que lo necesite, que comprende: a) un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la protelna opsina.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 representa esquematicamente las diversas secciones de la medula espinal, incluyendo el nucleo

dorsolateral (dLn).

La Figura 2 representa numeros de neuronas motoras pudendas del esflnter urinario externo (EUE) que

expresan opsinas codificadas por la construccion AAV.

La Figura 3 representa la estimulacion optica del nervio pudendo que expresa ChR2.

La Figura 4 representa un ejemplo de realizacion del control optogenetico del EUE.

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Descripcion detallada

Esta divulgacion proporciona, entre otros, metodos para tratar la disfuncion de la vejiga, la incontinencia fecal y/o la disfuncion sexual en un individuo alterando selectivamente el potencial de membrana electrico de las celulas neuronales perifericas que gobiernan el llenado y la evacuacion de la vejiga urinaria, la contraccion del esflnter anal externo y/o la inervacion de los musculos y organos de los genitales. Los inventores han desarrollado metodos para tratar enfermedades y afecciones que alteran la funcion urinaria, rectal y sexual normales utilizando una o mas protelnas opsinas sensibles a la luz que se expresan de forma estable en las celulas neurales perifericas que inervan los musculos y organos responsables de estos procesos fisiologicos.

El control selectivo del estado de polarizacion de la membrana de los nervios que inervan el detrusor y el esflnter urinario externo (tambien denominado “esflnter uretral externo”) permite que la vejiga se llene mientras que simultaneamente se permite que el esflnter urinario externo permanezca en un estado “cerrado”. Esto puede lograrse mediante la hiperpolarizacion selectiva o la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las innervaciones del detrusor mediante el uso de bombas de iones sensibles a la luz o canales cationicos, respectivamente, y permitiendo que las inervaciones externas del esflnter urinario se despolaricen naturalmente en un estado cerrado. Como alternativa, si el control neuronal del esflnter urinario externo se altera, dana o si no es capaz de generar suficiente fuerza muscular para cerrar el esflnter, se pueden usar metodos optogeneticos o electroestimuladores tradicionales en combinacion con el control optogenetico del detrusor para cerrar el esflnter urinario externo.

Cuando el individuo siente el deseo de miccionar o si desea miccionar acuerdo con una pauta predeterminada, los nervios que inervan el esflnter urinario externo pueden ser hiperpolarizados selectivamente o sometidos a una deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion, haciendo que el esflnter se relaje, provocando simultaneamente el cese de la hiperpolarizacion o deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion del detrusor, lo que le permite despolarizarse y contraerse naturalmente, forzando as! a la orina fuera de la vejiga. Sin embargo, si las inervaciones del musculo detrusor se alteran, danan o si no pueden generar fuerza muscular suficiente para evacuar la vejiga urinaria, pueden usarse metodos optogeneticos o electrostimuladores para impulsar la despolarizacion de estas neuronas, forzando as! al detrusor a contraerse y evacuar el contenido de la vejiga.

Por lo tanto, los metodos divulgados en la presente memoria pueden aliviar o prevenir muchos de los slntomas asociados con disfunciones de la vejiga (por ejemplo, hiperreflexia del detrusor y disinergia del esflnter externo del detrusor) incluyendo, pero no limitandose a, perdidas diurnas y nocturnas, retencion urinaria, infecciones del tracto urinario y la vejiga, reflujo vesicoureteral, hidroureteronefrosis, calculos renales, insuficiencia renal y/o fallo renal.

El control selectivo del estado de polarizacion de la membrana de los nervios que inervan el esflnter anal externo permite controlar la defecacion y el almacenamiento de las heces en el recto. Esto puede lograrse mediante la hiperpolarizacion selectiva o la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las innervaciones del esflnter anal externo mediante el uso de bombas de iones sensibles a la luz o canales cationicos, respectivamente. Cuando el individuo siente el deseo de defecar o desea defecar de acuerdo con una pauta predeterminada, los nervios que inervan el esflnter anal externo pueden ser hiperpolarizados selectivamente o sometidos a deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion, provocando la relajacion del musculo esflnter contraldo naturalmente. Cuando se completa la defecacion, la hiperpolarizacion optogenetica o la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las inervaciones del esflnter anal externo pueden cesar, dando lugar a que el esflnter anal externo vuelva a su estado natural cerrado. De forma alternativa, si el control neural del esflnter anal externo se altera, se dana o si no es capaz de generar suficiente fuerza muscular para cerrar naturalmente el esflnter, se pueden usar metodos optogeneticos o electrostimuladores tradicionales para cerrar el esflnter anal externo. Ademas, el control de la continencia fecal se puede mejorar aun mas mediante la despolarizacion selectiva simultanea de las innervaciones del recto, obligando al recto a contraerse y forzar su contenido hacia y a traves del esflnter anal externo relajado optogeneticamente. Por lo tanto, los metodos divulgados en la presente memoria pueden aliviar o prevenir la incontinencia fecal.

El control selectivo del estado de polarizacion de la membrana de los nervios que inervan los genitales externos de hombres y mujeres permite la restauracion de la funcion sexual. Esto puede lograrse mediante la despolarizacion selectiva de uno o mas nervios raquldeos sacros y/o componentes del tronco del nervio pudendo para controlar la funcion sexual, como en la ereccion, eyaculacion u orgasmo masculinos y en la lubricacion vaginal u orgasmo femeninos, as! como para restaurar las sensaciones tactiles necesarias para mantener la excitacion sexual mediante el uso de canales cationicos sensibles a la luz. Por lo tanto, los metodos divulgados en la presente memoria pueden restaurar la funcion sexual.

Tecnicas generates

La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologla molecular, microbiologla, biologla celular, bioqulmica, qulmica de acidos nucleicos, inmunologla, fisiologla, urologla y fisiopatologla de la miccion que son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Tales tecnicas se explican completamente en la literatura, tales como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion

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(Sambrook et al., 1989) and Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edicion (Sambrook and Russel, 2001), (conjuntamente referidas como “Sambrook”); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, incluidos los suplementos hasta 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (conjuntamente referidas en la presente memoria como “Harlow and Lane”), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000), Handbook of Experimental Immunology, 4a edicion (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987) y Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987). Otras referencias utiles incluyen Harrison's Principles of Internal Medicine (McGraw Hill; J. Isseleacher et al., eds.), Corcos & Schickik, Textbook of the Neurogenic Bladder: Adults and Children. (Informa Health Care, 2004), Walsh et al., Campbell's Urology, 8a ed., (Saunders, 2002), Fecal Incontinence: Diagnosis and Treatment, (Ratto & Doglietto, eds., Springer, 2007) y Lechtenberg et al., Sexual Dysfunction: Neurologic, Urologic, and Gynecologic Aspects (Lippincott Williams & Wilkins, 1994).

Definiciones

Tal como se usa en la presente memoria, la “deplecion sinaptica inducida por despolarizacion” ocurre cuando la despolarizacion continua de una membrana plasmatica de celulas neuronales evita que la celula neural mantenga una accion de alta frecuencia sobre dianas eferentes debido a la deplecion de las reservas vesiculares terminales de neurotransmisores.

Un “individuo” puede ser un mamlfero, incluyendo un ser humano. Los mamlferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales de deporte, mascotas, primates, ratones y ratas. Los individuos tambien incluyen animales de companla incluyendo, pero sin limitarse a, perros y gatos. En un aspecto, un individuo es un ser humano. En otro aspecto, un individuo es un animal no humano.

Las sustituciones de aminoacidos en una secuencia de protelna nativa pueden ser “conservadoras” o “no conservadoras” y dichos restos de aminoacidos sustituidos pueden o no ser codificados por el codigo genetico. Una “sustitucion de aminoacidos conservadora” es aquella en la que el resto de aminoacido se sustituye por un resto de aminoacido que tiene una cadena lateral qulmicamente similar (es decir, reemplazando un aminoacido que posee una cadena lateral basica con otro aminoacido con una cadena lateral basica). Una “sustitucion de aminoacidos no conservadora” es aquella en la que el resto de aminoacido se sustituye por un resto de aminoacido que tiene una cadena lateral qulmicamente diferente (es decir, reemplazando un aminoacido que tiene una cadena lateral basica con un aminoacido que tiene una cadena lateral aromatica). El “alfabeto” estandar de veinte aminoacidos se divide en familias qulmicas basadas en las propiedades qulmicas de sus cadenas laterales. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (p.ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (p.ej., acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (p.ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistelna), cadenas laterales no polares (p.ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (p.ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales que tienen grupos aromaticos (p.ej., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

Como se usa en la presente memoria, una “dosificacion eficaz” o “cantidad eficaz” de farmaco, compuesto o composicion farmaceutica es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. Para el uso profilactico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados tales como eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar la aparicion de la enfermedad, incluyendo slntomas bioqulmicos, histologicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patologicos intermedios que presentes durante el desarrollo de la enfermedad. Para el uso terapeutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados cllnicos tales como la disminucion de uno o mas slntomas resultantes de la enfermedad, el aumento de la calidad de vida de los pacientes de la enfermedad, la disminucion de la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, la intensificacion del efecto de otra medicacion tal como mediante el direccionamiento, retrasando la progresion de la enfermedad y/o prolongando la supervivencia. Una dosificacion eficaz puede administrarse en una o mas administraciones. Para los fines de esta invencion, una dosificacion eficaz del farmaco, compuesto o composicion farmaceutica es una cantidad suficiente para realizar un tratamiento profilactico o terapeutico, ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto cllnico, una dosificacion eficaz de un farmaco, compuesto o composicion farmaceutica puede o no conseguirse junto con otro farmaco, compuesto o composicion farmaceutica. Por lo tanto, puede considerarse una “dosificacion eficaz” en el contexto de la administracion de uno o mas agentes terapeuticos y se puede considerar que un solo agente se administre en una cantidad eficaz si, junto con uno o mas de otros agentes, se consigue un resultado deseable.

Tal como se utiliza en la presente memoria, “tratamiento” o “tratar” es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados que incluyen resultados cllnicos. Para los propositos de esta invencion, los resultados cllnicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o mas de los siguientes: disminucion de los slntomas resultantes de la enfermedad, aumento de la calidad de vida de los pacientes que sufren la enfermedad, disminucion de la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, retraso de la progresion de la enfermedad y/o prolongacion de la supervivencia de los individuos.

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Como se usa en la presente memoria, la expresion “nervio raquldeo sacro” se refiere a cualquiera de los nervios raquldeos mixtos que llevan senales motoras, sensoriales y autonomas entre la medula espinal y el cuerpo que se origina cerca de uno de los cinco huesos sacros fusionados de la columna vertebral S1, S2, S3, S4 o S5).

Como se usa en la presente memoria, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referencias plurales a menos que se indique lo contrario.

Se pretende que cada maxima limitacion numerica dada a lo largo de esta memoria descriptiva incluya cualquier limitacion numerica inferior, como si dichas limitaciones numericas inferiores estuvieran expresamente escritas en la presente memoria. Cada limitacion numerica minima dada a lo largo de esta memoria descriptiva incluira todas las limitaciones numericas mas altas, como si dichas limitaciones numericas mas altas estuvieran expresamente escritas en la presente memoria. Cada intervalo numerico dado a lo largo de esta memoria descriptiva incluira cada rango numerico mas estrecho que entra dentro de dicho intervalo numerico mas amplio, como si tales intervalos numericos mas estrechos estuvieran todos expresamente escritos en la presente memoria.

Fisiologia de la vejiga urinaria

El tracto urinario inferior de individuos sanos tiene dos fases discretas de actividad: la fase de almacenamiento, en la que la orina se almacena en la vejiga y la fase de evacuacion, que ocurre cuando la orina es liberada a traves de la uretra. Este sistema reflejo es controlado tanto por una senal consciente del cerebro como por la velocidad de activacion de las fibras sensoriales contenidas en la vejiga y la uretra (Yoshimura & Chancellor, 2003, Rev. Urol. 5 (Supl. 8): S3-S10). La vejiga de una persona promedio puede contener de 350 ml a 550 ml de orina. Cuando el volumen de llquido en la vejiga es bajo, la activacion nerviosa del receptor sensorial es baja, dando como resultado la excitacion y despolarizacion de las celulas neurales que inervan el esflnter urinario externo y la relajacion del musculo detrusor que rodea la vejiga urinaria (Blok & Holstege, Neurosci. Lett., 1994, 166(1):93-6). Cuando la vejiga esta casi llena, los receptores de estiramiento que recubren la pared de la vejiga desencadenan un aumento de la actividad aferente, dando como resultado la sensacion consciente de urgencia urinaria. Generalmente, una persona siente la necesidad de orinar cuando hay aproximadamente 200 ml de orina en la vejiga. Cuando el individuo esta listo para orinar, inconscientemente inicia la evacuacion, lo que da como resultado la contraccion de la vejiga y la relajacion del esflnter urinario externo. La evacuacion continua hasta que la vejiga se vacla por completo, momento en el que la vejiga se relaja y el esflnter urinario externo se contrae para reiniciar el almacenamiento. Los musculos que controlan el reflejo de la miccion son controlados tanto por los sistemas nerviosos autonomos como somaticos. Durante la fase de almacenamiento, el esflnter uretral interno permanece tenso y el musculo detrusor relajado por estimulacion simpatica. Durante la miccion, la estimulacion parasimpatica hace que el musculo detrusor se contraiga y el esflnter uretral interno se relaje. El esflnter urinario externo (tambien conocido como esflnter de la uretra) esta bajo control somatico y esta conscientemente relajado durante la miccion.

La disfuncion neurogenica de la vejiga urinaria esta causada mas a menudo por enfermedades o lesiones de las celulas del sistema nervioso central o de los nervios perifericos implicados en el control de la miccion. La hiperreflexia del detrusor (HD) y la disinergia del detrusor-esfinter externo (DDE) son dos afecciones debidas a la alteracion de la regulacion del sistema nervioso central del reflejo de la miccion. Los metodos descritos en la presente memoria pueden usarse para aliviar los sintomas de disfuncion de la vejiga en individuos.

Hiperreflexia del detrusor

El musculo urinario detrusor, (tambien conocido como musculo detrusor, muscularis propria de la vejiga urinaria y and muscularis propria) rodea la vejiga urinaria y se contrae al orinar para exprimir la orina. De lo contrario, permanece relajado para permitir que la vejiga se llene. La hiperreflexia del detrusor se refiere a una afeccion neurogenica por la cual el musculo detrusor se contrae anormalmente y evita que la vejiga se vacie completamente. Los sintomas de la HD van desde la subactividad del detrusor hasta la hiperactividad, dependiendo del sitio y la naturaleza de la lesion neurologica. Por ejemplo, la “hiperreflexia del detrusor con contractilidad deteriorada" (DHIC) se refiere a los sintomas de la vejiga hiperactiva, pero el musculo detrusor es incapaz de producir suficiente presion para permitir la evacuacion total. Por lo tanto, el detrusor es demasiado debil para afrontar una contraccion adecuada para que se produzca la evacuacion adecuada. La afeccion es similar a la retencion urinaria, pero son frecuentes los sintomas irritantes de la evacuacion. Adicionalmente, “arreflexia del detrusor” se refiere a la incapacidad completa del detrusor para vaciarse debido a una lesion de la neurona motora inferior (p.ej., al cordon sacro o nervios perifericos).

Las causas de la hiperreflexia del detrusor son variadas. Las lesiones en el cerebro en la region por encima de la protuberancia destruyen el centro de control maestro de la miccion, lo que tiene como resultado una perdida completa de control de la miccion. Sin embargo, los reflejos primitivos de evacuacion del tracto urinario inferior estan todavia intactos. Los individuos que sufren una lesion de este tipo presentan incontinencia de urgencia (tambien conocida como vejiga espastica). En este caso, la vejiga se vacla rapidamente y a menudo, con volumenes relativamente bajos de orina. Ademas, el almacenamiento de orina en la vejiga es diflcil y las personas con este problema por lo general se apresuran a ir al bano e incluso presentan perdidas de orina antes de llegar a su destino. A menudo, la afeccion tiene como resultado la interrupcion del sueno varias veces durante la noche, lo que requiere

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que el individuo tenga que ir en varia ocasiones al bano para aliviar el impulso de evacuar. Ejemplos tlpicos de lesiones cerebrales que pueden dar como resultado los slntomas de hiperreflexia del detrusor incluyen, sin limitacion, ictus, tumor cerebral, enfermedad de Parkinson, hidrocefalia, paralisis cerebral y lesion cerebral traumatica.

Las enfermedades o lesiones de la medula espinal entre la protuberancia y la medula espinal sacra tambien pueden provocar hiperreflexia del detrusor. Los individuos que sufren lesiones medulares que resultan en paraplejia o tetraplejia suelen experimentar espasticidad en las extremidades inferiores. En el perlodo inicialmente posterior al traumatismo de la medula espinal, el individuo experimenta una perdida de sensacion acompanada de paralisis motora con perdida inicial pero recuperacion gradual de los reflejos despues de aproximadamente 6-12 semanas. Esta recuperacion gradual del sistema nervioso a menudo conduce a la hiperestimulacion de los organos afectados, incluyendo el musculo detrusor de la vejiga. De forma similar a lo que sucede en los individuos con lesiones cerebrales, los individuos que sufren trauma de la medula espinal a menudo experimentan incontinencia de urgencia. Ademas de los accidentes asociados con lesiones deportivas o vehlculos de motor, la esclerosis multiple (EM) tambien puede causar enfermedad de la medula espinal. Ademas, los ninos nacidos con mielomeningocele tambien pueden exhibir vejigas neurogenicas que conducen a slntomas asociados con hiperreflexia del detrusor. En algunos aspectos de los metodos para tratar la hiperreflexia del detrusor proporcionados en la presente memoria, una lesion en el sistema nervioso que cause hiperreflexia del detrusor en un individuo no se produce en las celulas nerviosas situadas por debajo del segundo, tercer y/o cuarto nervios raquldeos sacros (S2, S3, S4).

Las enfermedades que tienen como resultado neuropatla periferica tambien pueden causar slntomas asociados con la hiperreflexia del detrusor. La diabetes mellitus y el SIDA pueden danar o destruir los nervios que inervan el musculo detrusor de la vejiga y pueden conducir a distension silenciosa e indolora de la vejiga. Los pacientes con diabetes cronica pueden perder primero la sensacion de llenado de la vejiga, antes de que la vejiga se descompense. Las personas afectadas tienen dificultad para orinar y tambien pueden experimentar DHIC. Otros ejemplos no limitativos de enfermedades del sistema nervioso periferico que pueden causar hiperreflexia del detrusor son la poliomielitis, el slndrome de Guillain-Barre, el herpes grave en el area genitoanal, la anemia perniciosa y la neuroslfilis.

La hiperreflexia del detrusor se diagnostica mediante cistometrla, que se utiliza para evaluar la funcion de la vejiga. Los estudios de flujo de presion implican la medicion de las presiones del detrusor mientras que el paciente esta evacuando para distinguir la HD de la contractilidad del detrusor. Se puede obtener informacion diagnostica adicional de: un diario de evacuacion, analisis de orina y cultivo, niveles de electrolitos plasmaticos y creatinina o una ecografla de las vlas renales que incluye la medicion del volumen de orina residual post-evacuacion (PVR).

Disinergia del esfinter externo del detrusor (DDE)

Este trastorno de la evacuacion es similar a la hiperreflexia del detrusor, excepto que el esfinter urinario externo puede tener contracciones paradojicas simultaneamente con las del musculo detrusor cuando intenta la evacuacion. Normalmente, el musculo detrusor y el esfinter urinario externo funcionan en sinergia, de modo que cuando uno se contrae (p.ej., el esfinter durante la fase de almacenamiento o el detrusor durante la fase de evacuacion) el otro esta relajado (p.ej., el esfinter durante la fase de evacuacion o el detrusor durante la fase de almacenamiento). Si tanto la vejiga como el esfinter externo se contraen al mismo tiempo, el individuo afectado percibira un intenso deseo de orinar, pero en realidad solo podra evacuar una pequena cantidad. El termino medico para esto es disinergia del detrusor-esfinter externo porque la vejiga y el esfinter externo no estan operando en sinergia. A pesar de que la vejiga esta tratando de expulsar la orina, el esfinter externo se esta contrayendo para evitar que la orina salga.

Tanto el musculo detrusor como el esfinter urinario externo se inervan a traves de los nervios que se originan en la medula espinal sacra. El musculo detrusor es inervado por las inervaciones del detrusor parasimpatico que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros. El esfinter urinario externo, por otra parte, es inervado por las inervaciones externas del esfinter urinario del nervio pudendo. El nervio pudendo se origina en el plexo sacro y deriva sus fibras de las ramas ventrales del segundo, tercer y cuarto nervios raquldeos sacros (S2, S3, S4). Pasa entre los musculos piriforme y coccigeo y sale de la pelvis a traves de la parte inferior del foramen ciatico mayor. A continuation cruza la espina dorsal isquiatica y entra de nuevo en la pelvis a traves del foramen ciatico menor. Acompana a los vasos pudendos internos hacia arriba y hacia adelante a lo largo de la pared lateral de la fosa isquiorrectal y esta contenido en una vaina de la fascia obturadora conocida como el canal pudendo. El nervio pudendo abandona los nervios rectales inferiores y luego se divide en dos ramas terminales: el nervio perineal y el nervio dorsal del pene (hombres) o el nervio dorsal del clitoris (en las mujeres). Los nervios anales inferiores se ramifican poco despues de pasar a traves del foramen ciatico mas grande. En algunos aspectos de los metodos para tratar la disinergia del detrusor- esfinter externo proporcionados en la presente memoria, en un individuo no se produce una lesion en el sistema nervioso que provoque disinergia del esfinter externo del detrusor en las celulas nerviosas situadas por debajo del segundo, tercer y/o cuarto nervios raquldeos sacros (S2, S3, S4).

La DDE se diagnostica inicialmente a partir de un trazado electromiografico (EMG) del esfinter uretral que mide los potenciales electricos generados por la despolarizacion de las celulas musculares. Los estudios videourodinamicos se utilizan para confirmar la DDE e identificar otras irregularidades fisiologicas o anatomicas.

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Incontinencia fecal

La incontinencia fecal (IF) es la perdida de control regular del intestino. La excrecion involuntaria y el escape son episodios comunes para los afectados. La incontinencia fecal puede ser causada por dano en los nervios que controlan los esflnteres anales o en los nervios que detectan heces en el recto. El dano en los nervios que controlan los musculos del esflnter puede hacer que los musculos no puedan trabajar eficazmente. Si los nervios sensoriales estan danados, la deteccion de heces en el recto esta deshabilitada y uno no sentira la necesidad de defecar hasta que sea demasiado tarde. El dano nervioso puede ser causado por, sin limitation, por el parto, estrenimiento cronico, ictus, enfermedades que causan degeneration nerviosa, como diabetes y esclerosis multiple. El dano en la medula espinal tambien puede tener como resultado en incontinencia fecal. Ademas, mientras que el recto normalmente se estira para sostener las heces hasta que se libera voluntariamente, la cirugla rectal, la radioterapia y la enfermedad inflamatoria del intestino pueden causar cicatrices, lo que puede hacer que las paredes del recto se vuelvan rlgidas y menos elasticas. Las paredes rectales son incapaces de estirar tanto y son incapaces de acomodar tantas heces, lo que conduce a la IF. La enfermedad inflamatoria intestinal tambien puede hacer que las paredes rectales esten muy irritadas y, por lo tanto, sean incapaces de contener las heces.

Los esflnteres anales mantienen el ano cerrado mientras que las heces se acumulan en el recto. Eventualmente, la presion en la pared rectal hace que el esflnter anal interno se relaje mientras que el control motor consciente sobre el esflnter anal externo (EAE) permite que las heces salgan del cuerpo a traves del ano. El EAE es un plano aplanado de fibras musculares, de forma ellptica e Intimamente adherente al integumento que rodea el margen del ano. El EEA esta, al igual que otros musculos, siempre en estado de contraction tonica y no tiene musculo antagonista que mantenga el canal y el orificio anal cerrados. Ademas, se puede contraer aun mas la influencia de la voluntad para ocluir mas firmemente la apertura anal. Es inervado por una rama del cuarto nervio raquldeo sacro (S4) y por la rama rectal (tambien conocida como hemorroidal inferior) del nervio pudendo.

Disfuncion sexual

La disfuncion sexual se refiere a una dificultad experimentada por un individuo o una pareja durante cualquier etapa de una actividad sexual normal, incluyendo el deseo, la excitation o el orgasmo. Hay muchos factores que pueden provocar en una persona una disfuncion sexual, cual puede ser debida a causas emocionales o flsicas. Por ejemplo, la actividad sexual puede verse afectada por factores flsicos como el uso de drogas, alcohol, nicotina, narcoticos, estimulantes, antihipertensivos, antihistamlnicos y algunos farmacos psicoterapeuticos. Las lesiones en la espalda tambien pueden afectar a la actividad sexual, al igual que los problemas con una prostata agrandada, problemas con la irrigation sangulnea y dano a los nervios (como en las lesiones de la medula espinal). La enfermedad, como la neuropatla diabetica, la esclerosis multiple, los tumores y, en raras ocasiones, la slfilis terciaria, tambien pueden afectar a la actividad sexual, al igual que la insuficiencia de diversos sistemas organicos (como el corazon y los pulmones), trastornos endocrinos (por ejemplo, hipotalamo, la glandula tiroidea, hipofisaria o suprarrenal), deficiencias hormonales (por ejemplo, niveles bajos de testosterona, estrogenos o androgenos) y algunos defectos congenitos.

En el caso de los hombres, la piel del pene esta inervada por el nervio dorsal del pene, que es la division mas profunda del nervio pudendo; acompana a la arteria pudenda interna a lo largo de la rama isquiatica, que transcurre hacia adelante a lo largo del margen de la rama inferior del pubis, entre las capas superior e inferior de la fascia del diafragma urogenital. En las mujeres, el clitoris es inervado por una rama similar del nervio pudendo conocido como el nervio dorsal del clitoris. Ademas, el nervio pudendo desempena un papel en la inervacion de los musculos bulboesponjoso e isquiocavernoso y areas alrededor del escroto (en hombres), perineo y ano. Durante el acto sexual, en el climax sexual, los espasmos del bulboesponjoso e isquiocavernoso tienen como resultado la eyaculacion en el varon y la mayorla de las sensaciones externas asociadas con la experiencia del orgasmo en ambos sexos.

Proteinas opsina sensibles a la luz

En la presente memoria se proporcionan metodos optogeneticos para hiperpolarizar o despolarizar selectivamente las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y el esflnter urinario externo con proteinas opsina sensibles a la luz para restablecer eficazmente la sinergia detrusor-esflnter en individuos afectados con disfuncion de la vejiga (tal como HD y DDE). Tambien se proporcionan en la presente memoria metodos optogeneticos para hiperpolarizar o despolarizar selectivamente las neuronas responsables de la inervacion del esflnter anal externo para restablecer eficazmente el control intestinal en individuos afectados por incontinencia fecal. Adicionalmente, se proporcionan metodos optogeneticos para la despolarizacion selectiva de las neuronas responsables de la inervacion de los musculos y organos de los genitales con proteinas opsina sensibles a la luz para restablecer eficazmente la funcion sexual en individuos con disfuncion sexual. La optogenetica se refiere a la combination de metodos geneticos y opticos utilizados para controlar eventos especlficos en celulas diana de tejido vivo, incluso en mamlferos que se mueven libremente y otros animales, con la precision temporal (escala de tiempo de milisegundos) necesaria para mantener el ritmo de funcionamiento de sistemas biologicos intactos. La optogenetica requiere la introduction de canales o proteinas bomba sensibles a la luz de respuesta rapida en las membranas plasmaticas de las celulas neuronales diana que permiten una manipulation temporal precisa del potencial de la

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membrana neuronal mientras se mantiene la resolucion del tipo celular mediante el uso de mecanismos especlficos de direccionamiento. Puede usarse cualquier opsina microbiana para promover la hiperpolarizacion o despolarizacion de la membrana de las celulas neurales en respuesta a la luz. Por ejemplo, puede usarse la familia halorodopsina de bombas de cloruro sensibles a la luz (p. ej., NpHR, NpHR2.0, NpHR3.0, NpHR3.1) y la bomba de protones GtR3 para promover la hiperpolarizacion de la membrana de las celulas neurales en respuesta a la luz. Como otro ejemplo, se puede usar eARCH (una bomba de protones) para promover la hiperpolarizacion de la membrana celular neural en respuesta a la luz. Ademas, los miembros de la familia canalrrodopsina de protelnas de canal cationico sensibles a la luz (p.ej., ChR2, SFOs, SSFOs, C1V1s) se pueden utilizar para promover la despolarizacion de la membrana celular neuronal o la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion en respuesta a un estlmulo de luz.

Intensification del transporte celular por motivos de aminoacidos

La presente divulgacion proporciona la modificacion de protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en una celula mediante la adicion de uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos que intensifican el transporte a las membranas plasmaticas de las celulas de mamlfero. Las protelnas opsina sensibles a la luz que tienen componentes derivados de organismos evolutivamente mas simples pueden no ser expresadas o toleradas por celulas de mamlfero o pueden presentar una localization subcelular alterada cuando se expresan a niveles altos en celulas de mamlfero. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en una celula pueden fusionarse con uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en un peptido senal, una senal de exportation del retlculo endoplasmico (RE), una senal de trafico de membrana y/o una senal de exportacion del aparato de Golgi N-terminal. Los uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos que intensifican el transporte de protelna opsina sensible a la luz a las membranas plasmaticas de las celulas de mamlfero pueden fusionarse con el extremo N terminal, el extremo C terminal o con los extremos N y C terminales de la protelna opsina sensible a la luz. Opcionalmente, la protelna opsina sensible a la luz y el uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos pueden estar separados por un enlazador. En algunas realizaciones, la protelna opsina sensible a la luz puede modificarse mediante la adicion de una senal de trafico (ts) que intensifica el transporte de la protelna a la membrana plasmatica de la celula. En algunas realizaciones, la senal de trafico puede derivarse de la secuencia de aminoacidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En otras realizaciones, la senal de trafico puede comprender la secuencia de aminoacidos, KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO:12)).

Las secuencias de trafico que son adecuadas para su uso pueden comprender una secuencia de aminoacidos que tiene 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoacidos, tal como una secuencia de trafico de canal de potasio rectificador interno humano Kr2.1 (por ej., KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO:12)).

Una secuencia de trafico puede tener una longitud de aproximadamente 10 aminoacidos a aproximadamente 50 aminoacidos, por ejemplo, de aproximadamente 10 aminoacidos a aproximadamente 20 aminoacidos, de aproximadamente 20 aminoacidos a aproximadamente 30 aminoacidos, de aproximadamente 30 aminoacidos a aproximadamente 40 aminoacidos, o de aproximadamente 40 aminoacidos a aproximadamente 50 aminoacidos.

Las secuencias de senal que son adecuadas para el uso pueden comprender una secuencia de aminoacidos que tiene un secuencia de aminoacidos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a una secuencia de aminoacidos tal como una de las siguientes:

1) El peptido senal de hChR2 (por ejemplo, MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGS (SEQ ID NO:13))

2) El peptido senal de la subunidad p2 del receptor nicotlnico neuronal de acetilcolina (por ejemplo,

MAGHSNSMALFSFSLLWLCSGVLGTEF (SEQ ID NO:14));

3) Una secuencia de senal del receptor nicotlnico de acetilcolina (por ejemplo,

MGLRALMLWLLAAAGLVRESLQG (SEQ ID NO:15)); y

4) Una secuencia de senal del receptor nicotlnico de acetilcolina (por ejemplo, MRGTPLLLVVSLFSLLQD (SEQ

ID NO:16)).

Una secuencia senal puede tener una longitud de aproximadamente 10 aminoacidos a aproximadamente 50 aminoacidos, por ejemplo, de aproximadamente 10 aminoacidos a aproximadamente 20 aminoacidos, de aproximadamente 20 aminoacidos a aproximadamente 30 aminoacidos, de aproximadamente 30 aminoacidos a aproximadamente 40 aminoacidos, o de aproximadamente 40 aminoacidos a aproximadamente 50 aminoacidos.

Las secuencias de exportacion del retlculo endoplasmico (ER) que son adecuadas para su uso en una opsina modificada de la presente divulgacion incluyen, por ej., VXXSL (donde X es cualquier aminoacido) (por ej., VKESL (SEQ ID NO:17), VLGSL:18), etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO:19); FXYENE (SEQ ID NO:20) (donde X es cualquier aminoacido), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO:21) y similares. Una secuencia de exportacion del RE puede tener una longitud de aproximadamente 5 aminoacidos a aproximadamente 25 aminoacidos, por ejemplo, de aproximadamente 5 aminoacidos a aproximadamente 10 aminoacidos, de aproximadamente 10 aminoacidos a aproximadamente 15 aminoacidos, de aproximadamente 15 aminoacidos a aproximadamente 20 aminoacidos, o de

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aproximadamente 20 aminoacidos a aproximadamente 25 aminoacidos.

Otros motivos de proteina adicionales que pueden intensificar el transporte de proteina opsina sensible a la luz a la membrana plasmatica de una celula se describen en la Solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 12/041.628, la cual se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad. En algunas realizaciones, la secuencia del peptido senal en la proteina puede suprimirse o sustituirse con una secuencia de peptido senal de una proteina diferente.

Bombas de cloruro sensibles a la luz

En algunos aspectos de los metodos proporcionados en la presente memoria, uno o mas miembros de la familia halorodopsina de bombas de cloruro sensibles a la luz se expresan en las membranas plasmaticas de las celulas neurales que comprenden las inervaciones del musculo detrusor y el esfinter urinario externo. En algunas realizaciones, dichas una o mas bombas de cloruro sensibles a la luz se expresan en la membrana plasmatica de los nervios que comprenden uno o mas nervios raquideos sacros. En otras realizaciones, dichas una o mas bombas de cloruro sensibles a la luz se expresan en la membrana plasmatica de nervios que comprenden las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquideos sacros. En otra realizacion, dichas una o mas bombas de cloruro sensibles a la luz se expresan en la membrana plasmatica del nervio pudendo. En otras realizaciones, dichas una o mas bombas de cloruro sensibles a la luz se expresan en la membrana plasmatica de los nervios que comprenden las inervaciones del esfinter urinario externo del nervio pudendo.

En algunos aspectos, dichas una o mas proteinas bomba de cloruro sensibles a la luz, expresadas en las membranas plasmaticas de las celulas nerviosas descritas anteriormente, pueden derivarse de Natronomonas pharaonis. En algunas realizaciones, las proteinas bomba de cloruro sensibles a la luz pueden ser sensibles a la luz ambar asi como a la luz roja y pueden mediar una corriente hiperpolarizante en la celula nerviosa cuando las proteinas bomba de cloruro sensibles a la luz se iluminan con luz ambar o roja. La longitud de onda de la luz que puede activar las bombas de cloruro sensibles a la luz puede estar entre aproximadamente 580 y 630 nm. En algunas realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 589 nm o la luz puede tener una longitud de onda superior a aproximadamente 630 nm (p.ej. menos de aproximadamente 740 nm). En otra realizacion, la luz tiene una longitud de onda de aproximadamente 630 nm. En algunas realizaciones, la proteina bomba de cloruro sensible a la luz puede hiperpolarizar una membrana neural durante al menos aproximadamente 90 minutos cuando se expone a un pulso continuo de luz. En algunas realizaciones, la proteina bomba de cloruro sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1. Ademas, la proteina bomba de cloruro sensible a la luz puede comprender sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en una secuencia de aminoacidos nativa para aumentar o disminuir la sensibilidad a la luz, aumentar o disminuir la sensibilidad a determinadas longitudes de onda de la luz y/o aumentar o disminuir la capacidad de la proteina sensible a la luz para regular el estado de polarizacion de la membrana plasmatica de la celula. En algunas realizaciones, la proteina bomba de cloruro sensible a la luz contiene una o mas sustituciones de aminoacidos conservadoras. En algunas realizaciones, la proteina sensible a la luz contiene una o mas sustituciones de aminoacidos que no conservadoras. La proteina sensible a la luz que comprende sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en la secuencia de aminoacidos nativa retiene adecuadamente la capacidad de hiperpolarizar la membrana plasmatica de una celula neuronal en respuesta a la luz .

Ademas, en otros aspectos, la proteina bomba de cloruro sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 y una senal de exportacion del reticulo endoplasmico (RE). Esta senal de exportacion del RE puede fusionarse con el extremo C terminal de la secuencia de aminoacidos basica o puede fusionarse con el extremo N terminal de la secuencia de aminoacidos basica. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE esta unida a la secuencia de aminoacidos basica por un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoacidos de longitud. El enlazador puede comprender ademas una proteina fluorescente, por ejemplo, pero sin limitarse a, una proteina fluorescente amarilla, una proteina fluorescente roja, una proteina fluorescente verde o una proteina fluorescente cian. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE puede comprender la secuencia de aminoacidos FXYENE (SEQ ID NO:20), donde X puede ser cualquier aminoacido. En otra realizacion, la senal de exportacion del RE puede comprender la secuencia de aminoacidos VXXSL, donde X puede ser cualquier aminoacido. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE puede comprender la secuencia de aminoacidos FCYENEV (SEQ ID NO:21).

Las secuencias de exportacion del reticulo endoplasmico (ER) que son adecuadas para su uso en una opsina modificada de la presente divulgacion incluyen, por ej., VXXSL (donde X es cualquier aminoacido) (por ej., VKESL (SEQ ID NO:17), VLGSL (SEQ ID NO:18), etc.); NANSFCYENEVALTSK (SEQ ID NO:19); FXYENE (donde X es cualquier aminoacido) (SEQ ID NO:20), por ejemplo, FCYENEV (SEQ ID NO:21) y similares. Una secuencia de exportacion del RE puede tener una longitud de aproximadamente 5 aminoacidos a aproximadamente 25 aminoacidos, por ejemplo, de aproximadamente 5 aminoacidos a aproximadamente 10 aminoacidos, de aproximadamente 10 aminoacidos a aproximadamente 15 aminoacidos, de aproximadamente 15 aminoacidos a

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aproximadamente 20 aminoacidos o de aproximadamente 20 aminoacidos a aproximadamente 25 aminoacidos.

En otros aspectos, las proteinas bomba de cloruro sensible a la luz proporcionadas en la presente memoria pueden comprender una proteina sensible a la luz expresada en la membrana celular, en la que la proteina comprende una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 % 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 y una senal de trafico (p.ej., que puede intensificar el transporte de la proteina bomba de cloruro sensible a la luz a la membrana plasmatica). La senal de trafico puede fusionarse con el extremo C terminal de la secuencia de aminoacidos basica o puede fusionarse con el extremo N terminal de la secuencia de aminoacidos basica. En algunas realizaciones, la senal de trafico puede estar unida a la secuencia de aminoacidos basica mediante un enlazador que puede comprender cualquiera de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, o 500 aminoacidos de longitud. El enlazador puede comprender ademas una proteina fluorescente, por ejemplo, pero sin limitarse a, una proteina fluorescente amarilla, una proteina fluorescente roja, una proteina fluorescente verde o una proteina fluorescente cian. En algunas realizaciones, la senal de trafico puede derivarse de la secuencia de aminoacidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En otras realizaciones, la senal de trafico puede comprender la secuencia de aminoacidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO:12).

En algunos aspectos, la proteina bomba de cloruro sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 y al menos uno (dos, tres, o mas) motivos de la secuencia de aminoacidos que intensifican el transporte a las membranas plasmaticas de las celulas de mamifero seleccionadas del grupo que consiste en una senal de exportacion del RE, un peptido senal y una senal de trafico de membrana. En algunas realizaciones, la proteina bomba de cloruro sensible a la luz comprende un peptido senal N- terminal, una senal de exportacion del RE C-terminal y una senal de trafico C-terminal. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE C-terminal y la senal de trafico C-terminal pueden unirse mediante un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoacidos de longitud. El enlazador puede comprender ademas una proteina fluorescente, por ejemplo, pero sin limitarse a, una proteina fluorescente amarilla, una proteina fluorescente roja, una proteina fluorescente verde o una proteina fluorescente cian. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE puede estar localizada mas proxima al C-terminal que la senal de trafico. En otras realizaciones, la senal de trafico esta localizada mas proxima al C-terminal que la senal de exportacion del RE. En algunas realizaciones, el peptido senal comprende la secuencia de aminoacidos MTETLPPVTESAVALQAE (SEQ ID NO:22). En otra realizacion, la proteina bomba de cloruro sensible a la luz comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 95 % identica a la SEQ ID NO:2.

Ademas, en otros aspectos, las proteinas bomba de cloruro sensibles a la luz pueden comprender una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, en la que el peptido senal N-terminal de la SEQ ID NO:1 se elimina o se sustituye. En algunas realizaciones, pueden usarse otros peptidos senal (tales como peptidos senal de otras opsinas). La proteina sensible a la luz puede comprender ademas una senal de transporte del RE y/o una senal de trafico de membrana descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, la proteina bomba de cloruro sensible a la luz comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 95 % identica a la SEQ ID NO:3.

En algunas realizaciones, la proteina opsina sensible a la luz es una proteina opsina NpHR que comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, la proteina opsina NpHR comprende ademas una senal de exportacion del reticulo endoplasmico (RE) y/o una senal de trafico de membrana. Por ejemplo, la proteina opsina NpHR comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 y una senal de exportacion del reticulo endoplasmico (RE). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 esta unida a la senal de exportacion del RE a traves de un enlazador. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE comprende la secuencia de aminoacidos FXYENE (SEQ ID NO:20), donde X puede ser cualquier aminoacido. En otra realizacion, la senal de exportacion del RE comprende la secuencia de aminoacidos VXXSL, donde X puede ser cualquier aminoacido. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE comprende la secuencia de aminoacidos FCYENEV (SEQ ID NO:21). En algunas realizaciones, la proteina opsina NpHR comprende una secuencia de aminoacidos al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana. En otras realizaciones, la proteina opsina NpHR comprende, desde el extremo N terminal hasta el extremo C terminal, la secuencia de aminoacidos al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, la senal de exportacion del RE y la senal de trafico de membrana. En otras realizaciones, la proteina opsina NpHR comprende, desde el extremo N terminal hasta el extremo C terminal, la secuencia de aminoacidos al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, la senal de trafico de membrana y la senal de exportacion del RE. En algunas realizaciones, la senal de trafico de membrana se deriva de la secuencia de aminoacidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En algunas realizaciones, la senal de trafico de membrana comprende la secuencia de aminoacidos KSRITSEGEYIPEDQIDINV (SEQ ID NO:12). En algunas realizaciones, la senal de trafico de membrana esta unida a la senal de exportacion del RE a traves de un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de 5, 10, 20,

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En la presente memoria tambien se proporcionan polinucleotidos que codifican cualquiera de las protelnas bomba de ion cloruro sensible a la luz descritas en la presente memoria, tales como una protelna sensible a la luz que comprende una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana. En otra realization, los polinucleotidos comprenden una secuencia que codifica una secuencia de aminoacidos al menos un 95 % identica a la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:3. Los polinucleotidos pueden estar en un vector de expresion (tal como, pero sin limitarse a, un vector viral descrito en la presente memoria). Los polinucleotidos pueden usarse para la expresion de las protelnas bomba de ion cloruro sensibles a la luz.

Se puede encontrar information adicional relacionada con protelnas bomba de cloruro sensible a la luz en las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos numeros 2009/0093403 y 2010/0145418, as! como en la Solicitud de Patente Internacional N.°: PCT/US2011/028893, cuyas divulgaciones se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad.

Bombas de protones sensibles a la luz

En algunos aspectos de los metodos proporcionados en la presente memoria, una o mas bombas de protones sensibles a la luz se expresan en las membranas plasmaticas de las celulas neurales que comprenden las inervaciones del musculo detrusor y el esflnter urinario externo. En algunas realizaciones, una o mas bombas de protones sensibles a la luz se expresan en la membrana plasmatica de los nervios que comprenden uno o mas nervios raquldeos sacros. En otras realizaciones, la o las bombas de protones sensibles a la luz se expresan en la membrana plasmatica de nervios que comprenden las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros. En otra realizacion, una o mas bombas de protones sensibles a la luz se expresan en la membrana plasmatica del nervio pudendo. En otras realizaciones, la una o mas bombas de protones sensibles a la luz se expresan en la membrana plasmatica de nervios que comprende las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo.

En algunas realizaciones, la protelna bomba de protones sensible a la luz puede ser sensible a la luz azul y puede derivarse de Guillardia theta, en la que la protelna bomba de protones puede ser capaz de mediar una corriente hiperpolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz azul. La luz puede tener una longitud de onda entre aproximadamente 450 y aproximadamente 495 nm o puede tener una longitud de onda de aproximadamente 490 nm. En otra realizacion, la protelna bomba de protones sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4. La protelna bomba de protones sensible a la luz puede comprender adicionalmente sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en una secuencia de aminoacidos nativa para aumentar o disminuir la sensibilidad a la luz, aumentar o disminuir la sensibilidad a determinadas longitudes de onda de la luz y/o aumentar o disminuir la capacidad de la protelna de la bomba de protones sensible a la luz para regular el estado de polarization de la membrana plasmatica de la celula. Ademas, la protelna bomba de protones sensible a la luz puede contener una o mas sustituciones de aminoacidos conservadoras y/o una o mas sustituciones de aminoacidos no conservadoras. La protelna bomba de protones sensible a la luz que comprende sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en la secuencia de aminoacidos nativa retiene adecuadamente la capacidad de hiperpolarizar la membrana plasmatica de una celula neuronal en respuesta a la luz.

En otros aspectos de los metodos divulgados en la presente memoria, la protelna bomba de protones sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4 y al menos uno (como uno, dos, tres o mas) motivos de secuencia de aminoacidos que intensifican el transporte a las membranas plasmaticas de las celulas de mamlfero seleccionados del grupo que consiste en un peptido senal, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana. En algunas realizaciones, la protelna bomba de protones sensible a la luz comprende un peptido senal N-terminal y una senal de exportacion del RE C-terminal. En algunas realizaciones, la protelna bomba de protones sensible a la luz comprende un peptido senal N-terminal y una senal de trafico C-terminal. En algunas realizaciones, la protelna bomba de protones sensible a la luz comprende un peptido senal N-terminal, una senal de exportacion del RE C-terminal y una senal de trafico C-terminal. En algunas realizaciones, la protelna bomba de protones sensible a la luz comprende una senal de exportacion del RE C- terminal y una senal de trafico C-terminal. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE C-terminal y la senal de trafico C-terminal estan unidas por un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de

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aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoacidos de longitud. El enlazador puede comprender ademas una proteina fluorescente, por ejemplo, pero sin limitarse a, una proteina fluorescente amarilla, una proteina fluorescente roja, una proteina fluorescente verde o una proteina fluorescente cian. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE esta situada mas proxima al C-terminal que la senal de trafico. En algunas realizaciones, la senal de trafico esta situada mas proxima al C-terminal que la senal de exportacion del RE.

En la presente memoria tambien se proporcionan polinucleotidos aislados que codifican cualquiera de las proteinas bomba de protones sensibles a la luz descritas en la presente memoria, tales como una proteina bomba de protones sensible a la luz que comprende una secuencia de aminoacidos de nucleo al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4. Tambien se proporcionan en la presente memoria vectores de expresion (tales como un vector viral descrito en la presente memoria) que comprenden un polinucleotido que codifica las proteinas descritas en la presente memoria, tal como una proteina bomba de protones sensible a la luz que comprende una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 % , 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4. Los polinucleotidos pueden usarse para la expresion de la proteina opsina sensible a la luz en celulas neurales (p.ej. las celulas neurales que comprenden las inervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquideos sacros y las inervaciones del esfinter urinario externo del nervio pudendo.

Se puede encontrar informacion adicional relacionada con proteinas bomba de protones sensibles a la luz en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/US2011/028893, cuya divulgacion se incorpora por referencia en su totalidad.

En algunas realizaciones, la proteina de bomba de protones sensible a la luz puede responder a la luz verde o amarilla y puede derivarse de Hadorubrum sodomense, en la que la proteina de bomba de protones puede ser capaz de mediar una corriente hiperpolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz verde o amarilla. La luz puede tener una longitud de onda entre aproximadamente 560 y aproximadamente 570 nm o puede tener una longitud de onda de aproximadamente 566 nm. En otra realizacion, la proteina de bomba de protones sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:23. La proteina de bomba de protones sensible a la luz puede comprender adicionalmente sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en una secuencia de aminoacidos nativa para aumentar o disminuir la sensibilidad a la luz, aumentar o disminuir la sensibilidad a determinadas longitudes de onda de luz y/o aumentar o disminuir la capacidad la proteina de la bomba de protones sensible a la luz para regular el estado de polarizacion de la membrana plasmatica de la celula. Ademas, la proteina de bomba de protones sensible a la luz puede contener una o mas sustituciones de aminoacidos conservadoras y/o una o mas sustituciones de aminoacidos no conservadoras. La proteina de bomba de protones sensible a la luz que comprende sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en la secuencia de aminoacidos nativa retiene adecuadamente la capacidad de hiperpolarizar la membrana plasmatica de una celula neuronal en respuesta a la luz.

En otros aspectos de los metodos divulgados en la presente memoria, la proteina de bomba de protones sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:23 y al menos uno (tal como uno, dos, tres o mas) motivos de secuencia de aminoacidos que intensifican el transporte a las membranas plasmaticas de celulas de mamifero seleccionados del grupo que consiste en un peptido senal, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana. En algunas realizaciones, la proteina de bomba de protones sensible a la luz comprende un peptido senal N-terminal y una senal de exportacion del RE C-terminal. En algunas realizaciones, la proteina bomba de protones sensible a la luz comprende un peptido senal N-terminal y una senal de trafico C-terminal. En algunas realizaciones, la proteina bomba de protones sensible a la luz comprende un peptido senal N-terminal, una senal de exportacion del Re C-terminal y una senal de trafico C-terminal. En algunas realizaciones, la proteina bomba de protones sensible a la luz comprende una senal de exportacion del RE C- terminal y una senal de trafico C-terminal. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE C-terminal y la senal de trafico C-terminal estan unidas por un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoacidos de longitud. El enlazador puede comprender ademas una proteina fluorescente, por ejemplo, pero sin limitarse a, una proteina fluorescente amarilla, una proteina fluorescente roja, una proteina fluorescente verde o una proteina fluorescente cian. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE esta situada mas en C-terminal que la senal de trafico. En algunas realizaciones, la senal de trafico se encuentra mas proxima al C-terminal que la senal de exportacion del RE.

Tambien se proporcionan en la presente memoria polinucleotidos aislados que codifican cualquiera de las proteinas bomba de protones sensibles a la luz descritas en la presente memoria, tales como una proteina bomba de protones sensible a la luz que comprende una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:23. Tambien se proporcionan en la presente memoria vectores de expresion (tales como un vector viral descrito en la presente memoria) que comprenden un polinucleotido que codifica las proteinas descritas en la presente memoria,

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tal como una protelna bomba de protones sensible a la luz que comprende una secuencia de aminoacidos basica de al menos aproximadamente 90 %, 91 % , 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:23. Los polinucleotidos pueden usarse para la expresion de la protelna sensible a la luz en celulas neurales (p.ej. las celulas neurales que comprenden las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros y las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo).

Proteinas canal cationico sensibles a la luz

En algunos aspectos de los metodos proporcionados en la presente memoria, uno o mas canales cationicos sensibles a la luz pueden expresarse en las membranas plasmaticas de las celulas neurales que comprenden las inervaciones del musculo detrusor y el esflnter urinario externo. En algunas realizaciones, uno o mas canales cationicos sensibles a la luz se pueden expresar en la membrana plasmatica de uno o mas nervios raquldeos sacros (tales como cualquiera de S1, S2, S3, S4 y/o S5). En otras realizaciones, el uno o mas canales cationicos sensibles a la luz pueden expresarse en la membrana plasmatica de nervios que comprenden las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros. En otra realizacion, uno o mas canales cationicos sensibles a la luz pueden expresarse en la membrana plasmatica del nervio pudendo. En otras realizaciones, el uno o mas canales cationicos sensibles a la luz pueden expresarse en la membrana plasmatica de nervios que comprenden las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo.

En algunos aspectos, la protelna canal cationico sensible a la luz puede derivarse de Chlamydomonas reinhardtii, en la que la protelna canal cationico puede ser capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz. En otra realizacion, la protelna canal cationico sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:5. La luz utilizada para activar la protelna canal cationico sensible a la luz derivada de Chlamydomonas reinhardtii puede tener una longitud de onda entre aproximadamente 460 y aproximadamente 495 nm o puede tener una longitud de onda de aproximadamente 480 nm. Adicionalmente, la luz puede tener una intensidad de al menos aproximadamente 100 Hz. En algunas realizaciones, la activacion del canal cationico sensible a la luz derivado de Chlamydomonas reinhardtii con luz que tiene una intensidad de 100 Hz puede causar la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan el canal cationico sensible a la luz. La protelna canal cationico sensible a la luz puede comprender adicionalmente sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en una secuencia de aminoacidos nativa para aumentar o disminuir la sensibilidad a la luz, aumentar o disminuir la sensibilidad a determinadas longitudes de onda de la luz y/o aumentar o disminuir la capacidad de la protelna canal cationico sensible a la luz para regular el estado de polarizacion de la membrana plasmatica de la celula. Adicionalmente, la protelna canal cationico sensible a la luz puede contener una o mas sustituciones de aminoacidos conservadoras y/o una o mas sustituciones de aminoacidos no conservadoras. La protelna canal cationico sensible a la luz que comprende sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en la secuencia de aminoacidos nativa retiene adecuadamente la capacidad de despolarizar la membrana plasmatica de una celula neuronal en respuesta a la luz.

En algunas realizaciones, el canal cationico sensible a la luz comprende una sustitucion de T159C de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el canal cationico sensible a la luz comprende una sustitucion L132C de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el canal cationico sensible a la luz comprende una sustitucion E123T de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el canal cationico sensible a la luz comprende una sustitucion E123A de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el canal cationico sensible a la luz comprende una sustitucion T159C y una sustitucion E123T de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el canal cationico sensible a la luz comprende una sustitucion T159C y una sustitucion E123A de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el canal cationico sensible a la luz comprende una sustitucion T159C, una sustitucion L132C y una sustitucion E123T de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el canal cationico sensible a la luz comprende una sustitucion T159C, una sustitucion L132C y una sustitucion E123A de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el canal cationico sensible a la luz comprende una sustitucion L132C y una sustitucion E123T de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, el canal cationico sensible a la luz comprende una sustitucion L132C y una sustitucion E123A de la secuencia de aminoacidos expuesta en la SEQ ID NO:5.

Se puede encontrar informacion adicional relacionada con proteinas e canal cationico sensibles a la luz en la Publication de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos N.° 2007/0054319 y las Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional numeros WO 2009/131837 y WO 2007/024391, cuyas divulgaciones se incorporan aqul por referencia en su totalidad.

Qpsinas de funcion de paso y opsinas de funcion de paso estabilizadas

En otras realizaciones, la protelna canal cationico sensible a la luz puede ser una protelna opsina de funcion de paso (SFO) o una protelna opsina de funcion de paso estabilizada (SSFO) que puede tener sustituciones de aminoacidos especlficas en posiciones clave a lo largo del sitio de union a la retina de la protelna. En algunas

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realizaciones, la protelna SFO puede tener una mutacion en el resto de aminoacido C128 de la SEQ ID NO:5. En otras realizaciones, la protelna SFO tiene una mutacion C128A en la SEQ ID NO:5. En otras realizaciones, la protelna SFO tiene una mutacion C128S en la SEQ ID NO:5. En otra realizacion, la protelna SFO tiene una mutacion C128T en la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, la protelna SFO puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:6.

En algunas realizaciones, la protelna SSFO puede tener una mutacion en el resto de aminoacido D156 de la SEQ ID NO:5. En otras realizaciones, la protelna SSFO puede tener una mutacion en ambos restos de aminoacidos C128 y D156 de la SEQ ID NO:5. En una realizacion, la protelna SSFO tiene una mutacion C128S y una mutacion D156A en la SEQ ID NO:5. En otra realizacion, la protelna SSFO puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica la secuencia mostrada en las SEQ ID NO:7. En otra realizacion, la protelna SSFO puede comprender una mutacion C128T en la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, la protelna SSFO comprende mutaciones C128T y D156A en la SEQ ID NO:5.

En algunas realizaciones, las protelnas SFO o SSFO proporcionadas en la presente memoria pueden ser capaces de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz azul. En otras realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 445 nm. Adicionalmente, la luz puede tener una intensidad de aproximadamente 100 Hz. En algunas realizaciones, la activacion de la protelna SFO o SSFO con luz que tiene una intensidad de 100 Hz puede causar una deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan la protelna SFO o SSFO. En algunas realizaciones, cada una de las protelnas opsina de funcion de paso y opsina de funcion de paso estabilizada divulgadas puede tener propiedades y caracterlsticas especlficas para su uso en la despolarizacion de la membrana de una celula neuronal en respuesta a la luz.

Se puede encontrar information adicional relacionada con protelnas SFO o SSFO en la Publication de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2010/056970 y Solicitudes de Patente Provisional de los Estados Unidos numeros 61/410.704 y 61/511,905, cuyas divulgaciones se incorporan aqul por referencia en su totalidad.

Canales cationicos quimericos C1V1

En otras realizaciones, la protelna canal cationico sensible a la luz puede ser una protelna quimerica C1V1 derivada de la protelna VChR1 de Volvox carteri y la protelna ChR1 de Chlamydomonas reinhardti, en la que la protelna comprende la secuencia de aminoacidos de VChR1 que tiene al menos la primera y segunda helices transmembrana sustituidas por la primera y segunda helices transmembrana de ChR1, es sensible a la luz y es capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz. En algunas realizaciones, la protelna C1V1 puede comprender ademas una sustitucion dentro del dominio de bucle intracelular situado entre la segunda y tercera helices transmembrana de la protelna quimerica sensible a la luz, en la que al menos una portion del dominio de bucle intracelular se reemplaza por la portion correspondiente de ChR1. En otra realizacion, la porcion del dominio de bucle intracelular de la protelna quimerica C1V1 puede reemplazarse con la porcion correspondiente de ChR1 que se extiende hasta el resto de aminoacido A145 de ChR1. En otras realizaciones, la protelna quimerica C1V1 puede comprender ademas una sustitucion dentro de la tercera helice transmembrana de la protelna quimerica sensible a la luz, en la que al menos una porcion de la tercera helice transmembrana se reemplaza por la secuencia correspondiente de ChR1. En otra realizacion mas, la porcion del dominio de bucle intracelular de la protelna quimerica C1V1 puede reemplazarse con la porcion correspondiente de ChR1 que se extiende hasta el resto de aminoacido W163 del ChR1. En otras realizaciones, la protelna quimerica C1V1 puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % Identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:8.

En algunas realizaciones, la protelna C1V1 puede mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz verde. En otras realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de entre aproximadamente 540 nm a aproximadamente 560 nm. En algunas realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 542 nm. En algunas realizaciones, la protelna quimerica C1V1 no es capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz violeta. En algunas realizaciones, la protelna quimerica no es capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 405 nm. Adicionalmente, la luz puede tener una intensidad de aproximadamente 100 Hz. En algunas realizaciones, la activacion de la protelna quimerica C1V1 con luz que tiene una intensidad de 100 Hz puede causar la deplecion sinaptica inducida por despolarizacion de las neuronas que expresan la protelna quimerica C1V1. En algunas realizaciones, la protelna quimerica C1V1 divulgada puede tener propiedades y caracterlsticas especlficas para su uso en la despolarizacion de la membrana de una celula neuronal en respuesta a la luz.

Variantes mutantes quimericos C1V1

En algunos aspectos, la presente divulgation proporciona polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos sustituidas o mutadas, en las que el polipeptido mutante retiene la naturaleza activable por luz caracterlstica del

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polipeptido quimerico C1V1 precursor, pero tambien puede poseer propiedades alteradas en algunos aspectos especificos. Por ejemplo, las protelnas quimericas C1V1 sensibles a la luz mutantes descritas en la presente memoria pueden presentar un nivel aumentado de expresion tanto dentro de una celula animal como en la membrana plasmatica de la celula animal; una respuesta alterada cuando se expone a diferentes longitudes de onda de luz, particularmente luz roja y/o una combination de rasgos en los que el polipeptido quimerico C1V1 posee las propiedades de baja desensibilizacion, desactivacion rapida, baja activation de la luz violeta para una activation cruzada minima con otros canales cationicos sensibles a la luz y/o fuerte expresion en celulas animales.

Por consiguiente, se proporcionan en la presente invention protelnas opsina sensibles a la luz quimerica C1V1 que pueden tener sustituciones de aminoacidos especlficas en posiciones clave a lo largo del sitio de union a la retina de la portion VChR1 del polipeptido quimerico. En algunas realizaciones, la protelna C1V1 puede tener una mutation en el resto de aminoacido E122 de la SEQ ID NO:7. En algunas realizaciones, la protelna C1V1 puede tener una mutacion en el resto de aminoacido E162 de la SEQ ID NO:7. En otras realizaciones, la proteina C1V1 puede tener una mutacion en ambos restos de aminoacidos E162 y E122 de la SEQ ID NO:7. En otras realizaciones, la proteina C1V1 puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11. En algunas realizaciones, cada una de las proteinas quimericas C1V1 mutantes divulgadas puede tener propiedades y caracteristicas especificas para su uso en la despolarizacion de la membrana de una celula animal en respuesta a la luz.

En algunos aspectos, la proteina quimerica mutante C1V1-E122 es capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz. En algunas realizaciones la luz puede ser luz verde. En otras realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de entre aproximadamente 540 nm a aproximadamente 560 nm. En algunas realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 546 nm. En otras realizaciones, la protelna quimerica mutante C1V1-E122 puede mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz roja. En algunas realizaciones, la luz roja puede tener una longitud de onda de aproximadamente 630 nm. En algunas realizaciones, la protelna quimerica mutante C1V1-E122 no media una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz violeta. En algunas realizaciones, la proteina quimerica no media una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 405 nm. Adicionalmente, la luz puede tener una intensidad de aproximadamente 100 Hz. En algunas realizaciones, la activacion de la proteina quimerica mutante C1V1-E122 con luz que tiene una intensidad de 100 Hz puede provocar una depletion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan la protelna quimerica mutante C1V1-E122. En algunas realizaciones, la protelna quimerica mutante C1V1-E122 divulgada puede tener propiedades y caracteristicas especificas para su uso en la despolarizacion de la membrana de una celula neuronal en respuesta a la luz.

En otros aspectos, la protelna quimerica mutante C1V1-E162 es capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz. En algunas realizaciones la luz puede ser luz verde. En otras realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de entre aproximadamente 535 nm a aproximadamente 540 nm. En algunas realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 542 nm. En otras realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 530 nm. En algunas realizaciones, la protelna quimerica mutante C1V1-E162 no media una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz violeta. En algunas realizaciones, la proteina quimerica no media una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 405 nm. Adicionalmente, la luz puede tener una intensidad de aproximadamente 100 Hz. En algunas realizaciones, la activacion de la proteina quimerica mutante C1V1-E162 con luz que tiene una intensidad de 100 Hz puede provocar una deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan la protelna quimerica mutante C1V1-E162. En algunas realizaciones, la protelna quimerica mutada C1V1-E162 divulgada puede tener propiedades y caracteristicas especificas para su uso en la despolarizacion de la membrana de una celula neuronal en respuesta a la luz.

En otros aspectos mas, la protelna quimerica mutante C1V1-E122/E162 es capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz. En algunas realizaciones la luz puede ser luz verde. En otras realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de entre aproximadamente 540 nm a aproximadamente 560 nm. En algunas realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 546 nm. En algunas realizaciones, la protelna quimerica mutante C1V1-E122/E162 no media una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz violeta. En algunas realizaciones, la proteina quimerica no media una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz que tiene una longitud de onda de aproximadamente 405 nm. En algunas realizaciones, la proteina quimerica mutante C1V1- E122/E162 puede mostrar menos activacion cuando se expone a luz violeta con respecto a protelnas quimericas C1V1 que carecen de mutaciones en E122/E162 o con respecto a otras protelnas canal cationico sensibles a la luz. Adicionalmente, la luz puede tener una intensidad de aproximadamente 100 Hz. En algunas realizaciones, la activacion de la proteina quimerica mutante C1V1-E122/E162 con luz que tiene una intensidad de 100 Hz puede provocar la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan la proteina quimerica mutante C1V1-E122/E162. En algunas realizaciones, la protelna quimerica mutada C1V1-E122/E162 divulgada puede tener propiedades y caracteristicas especificas para su uso en la despolarizacion de la membrana de una

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celula neuronal en respuesta a la luz.

Se puede encontrar informacion adicional relacionada con canales cationicos quimericos C1V1, as! como variantes mutantes de los mismos en la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos numeros 61/410.736, 61/410.744 y 61/511.912, cuyas divulgaciones se incorporan aqul por referencia en su totalidad.

Polinucleotidos

La divulgacion tambien proporciona polinucleotidos que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, el polinucleotido comprende un casete de expresion. En algunas realizaciones, el polinucleotido es un vector que comprende el acido nucleico anteriormente descrito. En algunas realizaciones, el acido nucleico que codifica una protelna opsina sensible a la luz de la divulgacion esta unido operativamente a un promotor. Los promotores son bien conocidos en la tecnica. Se puede usar cualquier promotor que funcione en la celula hospedadora para la expresion de las protelnas opsina sensibles a la luz y/o cualquier variante de las mismas de la presente divulgacion. En una realizacion, el promotor utilizado para dirigir la expresion de las protelnas opsina sensibles a la luz puede ser un promotor que es especlfico de las neuronas motoras. En otras realizaciones, el promotor es capaz de dirigir la expresion de las protelnas opsina sensibles a la luz en las neuronas de los sistemas nervioso simpatico y/o parasimpatico. Las regiones de control de la iniciacion o promotores, que son utiles para dirigir la expresion de las protelnas opsina sensibles a la luz o sus variantes en una celula animal especlfica son numerosos y familiares para los expertos en la materia. Puede usarse practicamente cualquier promotor capaz de dirigir estos acidos nucleicos. Ejemplos de genes especlficos de neuronas motoras se pueden encontrar, por ejemplo, en Kudo et al., Human Mol. Genetica, 2010, 19(16):3233-3253, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia en su totalidad. En algunas realizaciones, el promotor usado para impulsar la expresion de la protelna sensible a la luz puede ser el promotor Thyl, que es capaz de dirigir la expresion robusta de transgenes en neuronas tanto del sistema nervioso central como periferico (Vease, por ejemplo, Llewellyn, et al., 2010, Nat. Med., 16(10):1161-1166). En otras realizaciones, el promotor utilizado para dirigir la expresion de la protelna sensible a la luz puede ser el promotor EF1a, un promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor CAG, un promotor de la sinapsina-I (por ejemplo, un promotor de la sinapsina-I humana), un promotor de la sinuclelna 1 humana, un promotor Thy1 humano, un promotor de la alfa quinasa II dependiente de calcio/calmodulina (CAMKIla), o cualquier otro promotor capaz de dirigir la expresion de las protelnas opsina sensibles a la luz en las neuronas perifericas de los mamlferos.

En la presente memoria tambien se proporcionan vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz o cualquier variante de la misma descrita en la presente memoria. Los vectores que se pueden administrar de acuerdo con la presente invencion tambien incluyen vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN (p. ej., un ARNm) que cuando se transcribe a parti r de los polinucleotidos del vector tendra como resultado la acumulacion de protelnas opsina sensibles a la luz en las membranas plasmaticas de las celulas animales diana. Los vectores que pueden usarse incluyen, sin limitacion, vectores lentivirales, VHS, adenovirales y virales adeno-asociados (AAV). Los lentivirus incluyen, pero no se limitan a VIH-1, VIH-2, VIS, VIF y VAIE. Los lentivirus pueden ser pseudotipados con las protelnas de la envoltura de otros virus, incluyendo pero sin limitarse a los virus VSV, rabia, Mo-MLV, baculovirus y Ebola. Tales vectores pueden prepararse usando metodos convencionales en la tecnica.

En algunas realizaciones, el vector es un vector AAV recombinante. Los vectores AAV son virus de ADN de tamano relativamente pequeno que pueden integrarse, de una manera estable y especlfica del sitio, en el genoma de las celulas que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de celulas sin inducir ningun efecto sobre el crecimiento, la morfologla o la diferenciacion celular y no parecen estar implicados en patologlas humanas. El genoma del AAV ha sido clonado, secuenciado y caracterizado. Abarca aproximadamente 47.00 bases y contiene una region de repeticion terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que sirve como un origen de replication para el virus. El resto del genoma se divide en dos regiones esenciales que llevan las funciones de encapsidacion: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicacion viral y la expresion de los genes virales y la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las protelnas de la capside del virus.

Los vectores AAV pueden prepararse usando metodos estandar en la tecnica. Los virus adeno-asociados de cualquier serotipo son adecuados (vease, p.ej., Blacklow, pags. 165-174 de “Parvoviruses and Human Disease” J. R. Pattison, ed. (1988); Rose, Comprehensive Virology 3:1, 1974; P. Tattersall “The Evolution of Parvovirus Taxonomy” en Parvoviruses (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, Eds.) p5-14, Hudder Arnold, Londres, Reino Unido (2006) y DE Bowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski “The Genus Dependovirus” (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, Eds.) p15-23, Hudder Arnold, Londres, Reino Unido (2006), cuyas divulgaciones se incorporan aqul por referencia en su totalidad). Se pueden encontrar metodos para purificar vectores en, por ejemplo, las patentes US-6.566.118, US-6.989.264 y US-6.995.006 y en el documento WO/1999/011764 Titulado “Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors”, cuyas divulgaciones se incorporan aqul por referencia en su totalidad. Los metodos para preparar vectores AAV en un sistema de baculovirus se describen por ejemplo en el documento WO 2008/024998. Los vectores AAV pueden ser autocomplementarios o de hebra sencilla.

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La preparacion de vectores hlbridos se describe, por ejemplo, en la Solicitud PCT N.1° PCT/US2005/027091. El uso de vectores derivados de los AAV para la transferencia de genes in vitro e in vivo ha sido descrito (Vease, por ejemplo, Publicacion de Solicitud de Patente Internacional N.°: 91/18088 y WO 93/09239; Patentes US-4.797.368, US-6.596.535 y US-5.139.941 y la Patente Europea N.°: 048 8528, cuyas divulgaciones se incorporan aqul por referencia en su totalidad). Estas publicaciones describen diversas construcciones derivadas de AAV en las que los genes rep y/o cap se eliminan y se sustituyen por un gen de interes y el uso de estas construcciones para transferir el gen de interes in vitro (en celulas cultivadas) o in vivo (directamente en un organismo). Los AAV recombinantes defectuosos para la replicacion de acuerdo con la presente divulgacion pueden prepararse co-transfectando un plasmido que contiene la secuencia de acido nucleico de interes flanqueada por dos regiones de repeticion terminal invertida (ITR) del AAV y un plasmido que lleva los genes de encapsidacion del AAV (genes rep y cap), en una llnea celular que esta infectada con un virus colaborador humano (por ejemplo un adenovirus). Los recombinantes del AAV que se producen se purifican despues mediante tecnicas estandar.

En algunas realizaciones, el vector(es) para su uso en los metodos de la presente divulgacion se encapsidan en una partlcula de virus (por ejemplo, partlcula de virus AAV, incluyendo, pero sin limitarse a AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 y AAV16). De acuerdo con ello, la presente divulgacion incluye una partlcula de virus recombinante (recombinante porque contiene un polinucleotido recombinante) que comprende cualquiera de los vectores descritos en la presente memoria. Los metodos para producir tales partlculas son conocidos en la tecnica y se describen en la Patente US-6.596.535, cuya divulgacion se incorpora aqul como referencia en su totalidad.

Administration de proteinas opsina sensibles a la luz

En algunos aspectos, los polinucleotidos que codifican las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) se pueden administrar directamente a las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o las neuronas responsables de la innervacion del esflnter urinario externo con una aguja, cateter o dispositivo relacionado, usando tecnicas neuroquirurgicas conocidas en la tecnica, tal como por inyeccion estereotactica (Ver, p.ej., Stein et al., J. Virol, 73: 3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS, 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; y Alisky y Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000, cuyos contenidos se incorporan aqul por referencia en su totalidad) o fluoroscopia. En algunas realizaciones, el polinucleotido que codifica las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV1) puede administrarse a las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor mediante la inyeccion del polinucleotido en el cuerpo celular neuronal motor somatico de uno o mas nervios raquldeos sacros (tal como cualquiera de S1, S2, S3, S4 y/o S5). En otras realizaciones, el polinucleotido que codifica las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) se puede administrar a las neuronas responsables de la inervacion del esflnter urinario externo por inyeccion del polinucleotido en el nervio pudendo. En otra realization, el polinucleotido que codifica las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) puede administrarse a las neuronas responsables de la inervacion del esflnter urinario externo por inyeccion del polinucleotido en el nucleo de Onuf.

En algunos aspectos, los polinucleotidos que codifican las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector de AAV) se pueden administrar directamente a las neuronas responsables de la inervacion del esflnter anal externo con una aguja, cateter o dispositivo relacionado usando tecnicas neuroquirurgicas conocidas en la tecnica, tales como por inyeccion estereotactica o fluoroscopia. En algunas realizaciones, el polinucleotido que codifica las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) puede administrarse a las neuronas responsables de la inervacion del esflnter anal externo por inyeccion del polinucleotido en un cuerpo celular neuronal motor somatico de un nervio raquldeo sacro (por ejemplo, cualquiera de S1, S2, S3, S4 y/o S5). En otras realizaciones, el polinucleotido que codifica las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) se puede administrar a las neuronas responsables de la inervacion del esflnter anal externo por inyeccion del polinucleotido en el nervio pudendo o por inyeccion del polinucleotido en el nucleo de Onuf. En otras realizaciones, el polinucleotido que codifica las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) puede administrarse a las neuronas responsables de la inervacion del recto por inyeccion del polinucleotido en un cuerpo celular de una neurona motora somatica de un nervio raquldeo sacro (por ejemplo, cualquiera de S1, S2, S3, S4 y/o S5) o por inyeccion en el plexo hipogastrico inferior.

En algunos aspectos, los polinucleotidos que codifican las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector aAv) se pueden administrar directamente a las neuronas responsables de la inervacion de los musculos y organos de los genitales masculinos y femeninos con una aguja, cateter o dispositivo relacionado, usando tecnicas neuroquirurgicas conocidas en la tecnica, tales como por inyeccion estereotactica o fluoroscopia. En algunas realizaciones, el polinucleotido que codifica las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) se puede suministrar a las neuronas responsables de la inervacion de los musculos y organos de los genitales masculino y femenino por inyeccion del polinucleotido en un cuerpo celular de una neurona motora somatica de un nervio raquldeo sacro (por ejemplo, cualquiera de S1, S2, S3, S4 y/o S5). En otras realizaciones, el polinucleotido que codifica las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector aAv) puede administrarse a las neuronas responsables

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de la inervacion de los musculos y organos de los genitales masculino y femenino por inyeccion del polinucleotido en el nervio pudendo o por inyeccion del polinucleotido en el nucleo de Onuf.

Tambien pueden usarse otros metodos para administrar las protelnas opsina sensibles a la luz a los nervios de interes, tales como, pero sin limitarse a, transfeccion con llpidos o pollmeros ionicos, electroporacion, transfeccion optica, impelencia o mediante pistola genica.

En otro aspecto, el polinucleotido que codifica las protelnas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) se puede suministrar directamente al musculo detrusor de la vejiga y/o los musculos responsables de la contraccion del esflnter urinario externo. Debido a las limitaciones inherentes a la inyeccion de vectores virales directamente en los cuerpos celulares especlficos que inervan determinados musculos, los investigadores han intentado administrar transgenes a las neuronas perifericas mediante la inyeccion de vectores virales directamente en el musculo. Estos experimentos han demostrado que algunos serotipos virales tales como adenovirus, AAV2 y lentivirus pseudotipado con la glicoprotelna del virus de la rabia pueden ser absorbidos por celulas musculares y retrogradablemente transportados a neuronas motoras a traves de la sinapsis neuromuscular (Vease, por ejemplo, Azzouz et al., 2009, Antioxid Redox Signal., 11(7):1523-34; Kaspar et al., 2003, Science, 301 (5634):839-842; Manabe et al., 2002. Apoptosis, 7(4):329-334, cuyas divulgaciones se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad).

Por consiguiente, en algunas realizaciones, los polinucleotidos que codifican las protelnas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector de AAV) se pueden administrar a las neuronas responsables de la inervacion del esflnter urinario externo por inyeccion del vector de expresion de polinucleotido directamente en los musculos responsables de la contraccion del esflnter urinario externo. En otra realizacion, los polinucleotidos que codifican las protelnas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) se pueden administrar a las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor por inyeccion del vector de expresion polinucleotldico directamente en el musculo detrusor. En otras realizaciones, los polinucleotidos que codifican las protelnas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) se pueden administrar a las neuronas responsables de la inervacion del esflnter anal externo mediante la inyeccion del vector de expresion polinucleotldico directamente en los musculos responsables de la contraccion del esflnter anal externo. En otras realizaciones, los polinucleotidos que codifican las protelnas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) se pueden administrar a las neuronas responsables de la inervacion del recto mediante la inyeccion del vector de expresion polinucleotldico directamente en los musculos responsables de la contraccion del recto. En otra realizacion mas, los polinucleotidos que codifican las protelnas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector AAV) pueden administrarse a las neuronas responsables de la inervacion de los genitales masculino y femenino por inyeccion del vector de expresion polinucleotldico directamente en los musculos y organos responsables de la funcion sexual normal incluyendo, pero sin limitarse a, los musculos bulboesponjoso e isquiocavernoso del pene, la piel del pene, los musculos perineales o el clitoris.

Fuentes luminicas y electricas

En algunos aspectos de la presente divulgacion, las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria pueden activarse mediante una fuente de luz implantable (tal como un manguito luminico) o un electrodo implantable situado alrededor o cerca de fibras nerviosas que expresan las proteinas opsina sensibles a la luz o de los nervios que controlan los musculos de la vejiga, el esflnter urinario externo, el esflnter anal externo, el recto y/o los genitales masculinos o femeninos. Los manguitos del electrodo y los electrodos colocados quirurgicamente alrededor o cerca de los nervios para su uso en la estimulacion electrica de esos nervios son bien conocidos en la tecnica (Vease, por ejemplo, las patentes US-4.602.624, US-7.142.925 y US-6.600.956, asi como las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos numeros 2008/0172116 y 2010/0094372, cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en su totalidad). Las fuentes de luz (tal como un manguito luminico) o electrodos de la presente invencion pueden estar constituidas por cualquier composition util o mezcla de composiciones, tal como platino o acero inoxidable, como son conocidas en la tecnica, y pueden ser de cualquier configuration util para estimular las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria o los nervios que controlan los musculos y organos de la vejiga, el esflnter urinario externo, el esflnter anal externo y/o los genitales masculinos o femeninos.

Los electrodos o la fuente de luz implantable (tal como un manguito luminico) pueden colocarse alrededor o cerca de un nervio, tales como, pero sin limitarse a, las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquideos sacros, las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo, las innervaciones del esflnter anal externo que tienen su origen en los nervios raquideos sacros y/o el nervio rectal inferior (tambien conocido como nervio hemorroidal inferior) que tienen su origen en el nervio pudendo, las innervaciones del recto que tienen su origen en los nervios raquideos sacros y/o el plexo hipogastrico inferior, el nervio dorsal del pene que tiene su origen en el nervio pudendo y/o el nervio dorsal del clitoris que tiene su origen en el nervio pudendo. Las fibras nerviosas responsables de la inervacion de los musculos y/o organos antes mencionados pueden ser identificadas por los medicos antes de colocar el electrodo o la fuente de luz implantable alrededor o cerca de las fibras nerviosas usando tecnicas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, las fibras nerviosas pueden ser estimuladas con breves impulsos de electricidad y observar la localization de las contracciones musculares causadas por dicha estimulacion

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electrica para asegurar la colocacion correcta del electrodo o de la fuente de luz implantable. Los electrodos o la fuente de luz implantable son perfectamente adecuados para ser utilizados junto con el nervio pudendo en particular, ya sea en el tronco del nervio pudendo o en sus ramas aferentes o eferentes fuera de la ralz sacra (de donde proviene el nervio pudendo), que inervan los musculos y organos del tracto urinario inferior, el intestino, el perineo y los genitales. El tronco del nervio pudendo y sus ramas se separan de la ralz sacra y de la columna vertebral. En consecuencia, son accesibles quirurgicamente desde la parte delantera del cuerpo y no requieren procedimientos quirurgicos complejos sobre, en o cerca de la columna vertebral o que impliquen rizotomla dorsal. En otra realizacion, se puede colocar una fuente de luz cerca de las ralces ventrales de las dianas nerviosas deseadas. En otra realizacion, una fuente de luz comprende un cable de fibra optica colocado cerca de un objetivo nervioso deseado que esta expuesto quirurgicamente.

En algunas realizaciones, la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) no rodea completamente al nervio, sino, mas bien, puede tener una forma de U. En otra realizacion, la fuente de luz implantable puede tener un brazo de fijacion que puede usarse para guiar la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) a las fibras nerviosas (p.ej., las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros y/o las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo). El brazo de union se puede retirar despues de la implantacion de la fuente de luz o puede dejarse en su sitio para fijar la posicion de la fuente de luz en la proximidad de las fibras nerviosas de interes.

La fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) puede comprender un cuerpo interior, teniendo el cuerpo interior al menos un medio para generar luz que esta configurado para una fuente de energla. En algunas realizaciones, la fuente de energla puede ser una baterla interna para alimentar los medios generadores de luz. En otra realizacion, la fuente de luz implantable puede comprender una antena externa para recibir energla electromagnetica transmitida inalambricamente desde una fuente externa para alimentar los medios generadores de luz. La energla electromagnetica transmitida inalambricamente puede ser una onda de radio, una microonda o cualquier otra fuente de energla electromagnetica que pueda ser transmitida desde una fuente externa para alimentar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico). En una realizacion, el medio generador de luz es controlado por un circuito integrado producido usando un semiconductor u otros procesos conocidos en la tecnica.

En algunos aspectos, los medios lumlnicos pueden ser un diodo emisor de luz (LED). En algunas realizaciones, el LED puede generar luz azul y/o verde. En otras realizaciones, el LED puede generar luz ambar y/o amarilla. En algunas realizaciones, varios microLED estan incrustados en el cuerpo interno de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico). En otras realizaciones, el medio generador de luz es un diodo laser de estado solido o cualquier otro medio capaz de generar luz. Los medios generadores de luz pueden generar luz que tiene una intensidad suficiente para activar las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en la membrana plasmatica de los nervios en proximidad a la fuente de luz (tal como un manguito lumlnico). En algunas realizaciones, los medios generadores de luz producen luz que tiene una intensidad de cualquiera de aproximadamente 0,05 mW/mm2, 0.1 mW/mm2, 0.2 mW/mm2, 0.3 mW/mm2, 0.4 mW/mm2, 0.5 mW/mm2, aproximadamente 0.6 mW/mm2, aproximadamente 0.7 mW/mm2, aproximadamente 0.8 mW/mm2, aproximadamente 0.9 mW/mm2, aproximadamente 1.0 mW/mm2, aproximadamente 1.1 mW/mm2, aproximadamente 1.2 mW/mm2, aproximadamente 1.3 mW/mm2, aproximadamente 1.4 mW/mm2, aproximadamente 1.5 mW/mm2, aproximadamente 1.6 mW/mm2, aproximadamente 1.7 mW/mm2, aproximadamente 1.8 mW/mm2, aproximadamente 1.9 mW/mm2, aproximadamente 2.0 mW/mm2, aproximadamente 2.1 mW/mm2, aproximadamente 2.2 mW/mm2, aproximadamente 2.3 mW/mm2, aproximadamente 2.4 mW/mm2, aproximadamente 2.5 mW/mm2, aproximadamente 3 mW/mm2, aproximadamente 3.5 mW/mm2, aproximadamente 4 mW/mm2, aproximadamente 4.5 mW/mm2, aproximadamente 5 mW/mm2, aproximadamente 5.5 mW/mm2, aproximadamente 6 mW/mm2, aproximadamente 7 mW/mm2, aproximadamente 8 mW/mm2, aproximadamente 9 mW/mm2, o aproximadamente 10 mW/mm2, inclusive, incluyendo valores entre estos numeros. En otras realizaciones, los medios generadores de luz producen luz que tiene una intensidad de al menos aproximadamente 100 Hz.

En algunos aspectos, los medios generadores de luz pueden ser activados externamente por un controlador externo. El controlador externo puede comprender un generador de energla que puede montarse en una bobina transmisora. En algunas realizaciones del controlador externo, se puede conectar una baterla al generador de energla, para proporcionar energla al mismo. Se puede conectar un interruptor al generador de energla, lo que permite a un individuo activar o desactivar manualmente el generador de energla. En algunas realizaciones, tras la activacion del interruptor, el generador de energla puede proporcionar energla a los medios generadores de luz en la fuente de luz mediante el acoplamiento electromagnetico entre la bobina de transmision en el controlador externo y la antena externa de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico). La bobina de transmision puede establecer un acoplamiento electromagnetico con la antena externa de la fuente de luz implantable cuando esta en proximidad de la misma, para suministrar energla a los medios generadores de luz y para transmitir una o mas senales de control a la fuente de luz implantable. En algunas realizaciones, el acoplamiento electromagnetico entre la bobina de transmision del controlador externo y la antena externa de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) puede ser un acoplamiento de inductancia magnetica de radiofrecuencia. Cuando se utiliza acoplamiento de inductancia magnetica de radiofrecuencia, la frecuencia de funcionamiento de la onda de radio puede estar entre aproximadamente 1 y 20 MHz, inclusive, incluyendo cualquier valor entre estos numeros (por ejemplo,

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aproximadamente: 5 MHz, aproximadamente 6 MHz, aproximadamente 7 MHz, aproximadamente 8 MHz

aproximadamente: 9 MHz, aproximadamente 10 MHz, aproximadamente 11 MHz, aproximadamente 12 MHz

aproximadamente: 13 MHz, aproximadamente 14 MHz, aproximadamente 15 MHz, aproximadamente 16 MHz

aproximadamente 17 MHz, aproximadamente 18 MHz, aproximadamente 19 MHz, o aproximadamente 20 MHz). Sin embargo, se pueden utilizar otras tecnicas de acoplamiento, tales como un receptor optico, infrarrojo o un sistema de telemedida biomedica (Vease, por ejemplo, Kiourti, “Biomedical Telemetry: Communication between Implanted Devices and the External World, Opticon1826, (8):Spring, 2010).

En algunos aspectos de la presente divulgacion, mas de una de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros, las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo, las inervaciones del esflnter anal externo de los nervios raquldeos pudendos o sacros pueden expresar bombas sensibles a la luz que promueven la hiperpolarizacion nerviosa cuando se activan con luz. En algunas realizaciones, los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable colocados alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros, generan luz continuamente cuando la vejiga almacena la orina mientras que, al mismo tiempo, la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocado alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo no genera luz. En otro aspecto, los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocados alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros no generan luz cuando la vejiga esta vaciando mientras que al mismo tiempo, la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo puede generar luz continuamente. En algunas realizaciones, una primera senal de control generada por el controlador externo puede activar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros mientras que simultaneamente desactivan la luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocado alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo. En otra realizacion, una segunda senal de control generada por el controlador externo puede desactivar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros mientras que simultaneamente activan la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo. En otra realizacion, una senal de control generada por el controlador externo puede activar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones del esflnter anal externo que tienen su origen en los nervios raquldeos pudendos o sacros.

En algunos aspectos de la presente divulgacion, las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros, las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo y/o las inervaciones del esflnter anal externo de los nervios raquldeos pudendos o sacros pueden expresar canales cationicos sensibles a la luz que promueven la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion nerviosa cuando se activan con luz. En algunas realizaciones, los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable colocada alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros no generan luz cuando la vejiga almacena la orina mientras que al mismo tiempo, la fuente de luz implantable (como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo puede generar continuamente luz que tiene una intensidad de al menos 100 Hz. En otro aspecto, el medio generador de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocado alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros genera luz que tiene una intensidad de al menos 100 Hz cuando la vejiga esta vaciando mientras que al mismo tiempo, la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo no genera luz. En otro aspecto, los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones del esflnter anal externo que tienen su origen en los nervios raquldeos pudendos o sacros, generan luz que tiene una intensidad de al menos 100 Hz cuando el esflnter anal externo se relaja. En algunas realizaciones, una primera senal de control generada por el controlador externo puede activar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocados alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros mientras que simultaneamente se desactiva la luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocado alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo. En otra realizacion, una segunda senal de control generada por el controlador externo puede desactivar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros mientras que simultaneamente se activa la luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo. En otra realizacion, una senal de control generada por el controlador externo puede desactivar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones del esflnter anal externo que tienen su origen en los nervios raquldeos pudendos o sacros.

En algunos aspectos de la presente divulgacion, las inervaciones de los musculos u organos de los genitales masculinos o femeninos que tienen su origen en el nervio pudendo o uno o mas nervios raquldeos sacros pueden expresar protelnas canal cationico sensibles a la luz que promueven la despolarizacion nerviosa cuando se activan

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con luz. En algunas realizaciones, los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable colocada alrededor o cerca de las inervaciones de los genitales masculinos o femeninos que tienen su origen en los nervios raquldeos pudendos o sacros, generan luz continuamente cuando el individuo desea participar en una actividad sexual tal como, pero sin limitarse a, ereccion, orgasmo, eyaculacion y/o lubricacion vaginal. En algunas realizaciones, los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable colocada alrededor o cerca de las inervaciones de los genitales masculinos o femeninos que tienen su origen en los nervios raquldeos pudendos o sacros, generan luz continuamente cuando el individuo desea restablecer sensaciones tactiles en el area genital requerida para mantener la excitacion sexual. En algunas realizaciones, una primera senal de control generada por el controlador externo puede activar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las inervaciones de los musculos u organos de los genitales masculinos o femeninos que tienen su origen en los nervios raquldeos pudendos o sacros. En otra realizacion, una segunda senal de control generada por el controlador externo puede desactivar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones de los musculos u organos de los genitales masculinos o femeninos que tienen su origen en los nervios raquldeos pudendos o sacros.

En otros aspectos de la presente divulgacion, puede usarse una combination de estimulacion nerviosa con protelnas opsina sensibles a la luz y electricidad para restaurar la continencia urinaria y/o fecal. En algunas realizaciones, las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros pueden expresar cualquiera de las protelnas opsina sensibles a la luz descritas en la presente memoria y puede colocarse un electrodo alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo. En algunas realizaciones, las inervaciones del esflnter anal externo que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros y/o pudendos pueden tener un electrodo colocado alrededor o cerca de las innervaciones del esflnter anal externo que tienen su origen en el nervio pudendo y/o los nervios raquldeos sacros. En otras realizaciones, un electrodo puede colocarse alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros, mientras que las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo pueden expresar cualquiera de las protelnas opsina sensibles a la luz descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones, una primera senal de control generada por el controlador externo puede activar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros a la vez que se activa simultaneamente un electrodo colocado alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo. En otra realizacion, una segunda senal de control generada por el controlador externo puede desactivar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros a la vez que simultaneamente se desactiva un electrodo colocado alrededor o cerca de las innervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo. En otra realizacion, una primera senal de control generada por el controlador externo puede desactivar un electrodo colocado alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros a la vez que simultaneamente se activa un medio generador de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo. En otra realizacion mas, una segunda senal de control generada por el controlador externo puede activar un electrodo colocado alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros a la vez que simultaneamente se desactiva un medio generador de luz de la fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocado alrededor o cerca de las innervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo.

Ejemplos de dispositivos de estimulacion de luz, incluyendo la fuente de luz (tal como un manguito lumlnico), se pueden encontrar en las Solicitudes de Patente Internacional numeros PCT/US08/50628 y PCT/US09/49936 y en Llewellyn et al., 2010, Nat. Med., 16(10): 161-165, cuyas divulgaciones se incorporan en la presente memoria en su totalidad.

Metodos

La presente divulgacion se refiere a metodos para inhibir los slntomas (discapacidades, afectaciones) asociados con la disfuncion de la vejiga, la incontinencia fecal (IF) y/o la disfuncion sexual. En particular, los metodos proporcionados en la presente memoria se refieren al tratamiento y/o alivio de los slntomas asociados con la hiperreflexia del detrusor (HD) y/o a la disinergia detrusor-esflnter externo (DDE). Como tal, no se requiere que el dano fisiologico o todos los efectos de la afeccion se inviertan por completo, aunque los efectos de los metodos actualmente divulgados probablemente se extiendan a un beneficio terapeutico significativo para el paciente. Como tal, un beneficio terapeutico no es necesariamente una cura completa para la HD, la DDE, la IF y/o la disfuncion sexual, sino que puede abarcar un resultado que incluye reducir o prevenir los slntomas o el dano fisiologico resultante de estas afecciones, reducir o prevenir la aparicion de tales slntomas o danos (ya sea cuantitativa o cualitativamente), reducir la gravedad de tales slntomas o efectos fisiologicos y/o mejorar la recuperation del paciente despues de experimentar una causa de HD, DDE, IF y/o disfuncion sexual (por ejemplo, pero sin limitarse a, lesion de la medula espinal y esclerosis multiple).

Especlficamente, los metodos de la presente divulgacion pueden prevenir el dano asociado con HD, DDE, IF y/o disfuncion sexual prolongada, y/o reducir o aliviar los slntomas o afecciones asociadas con (que resultan de) estas afecciones. Como tal, proteger a un individuo de los efectos o slntomas fisiologicos resultantes de HD, DDE, IF y/o

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disfuncion sexual incluye tanto prevenir como reducir la aparicion y/o gravedad de los efectos de los slntomas y tratar a un paciente en el cual los slntomas Ya estan ocurriendo o empiezan a ocurrir. Un efecto beneficioso puede ser facilmente evaluado por un experto en la materia y/o un medico cllnico capacitado que este tratando al paciente. Por ejemplo, muchos de los metodos descritos anteriormente para el diagnostico de la HD y/o la DDE pueden usarse para evaluar al paciente antes y despues del tratamiento usando un metodo de la presente invencion para evaluar el exito del tratamiento. En algunas realizaciones, existe una diferencia positiva o beneficiosa en la gravedad o aparicion de al menos una puntuacion, valor o medida cllnica o biologica utilizada para evaluar tales pacientes en aquellos que han sido tratados con los metodos de la presente invencion en comparacion con aquellos que no lo han hecho.

Hiperpolarizacion o depletion sinaptica inducida por la despolarizacion con proteinas opsina sensibles a la luz para el tratamiento de la disfuncion vesical y/o la incontinencia fecal

Disfuncion vesical

En consecuencia, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo en el individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz es capaz de inducir la hiperpolarizacion de las neuronas que expresan la protelna opsina sensible a la luz en respuesta a la luz, de modo que la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite el almacenamiento de orina en la vejiga y la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion de musculo esflnter urinario externo permite la evacuacion de la orina de la vejiga. Se pueden administrar cualesquiera polinucleotidos descritos en la presente memoria que codifiquen una protelna opsina sensible a la luz capaz de inducir hiperpolarizacion. En algunas realizaciones, la disfuncion de la vejiga es hD y/o DDE. En otras realizaciones, la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo se hiperpolarizan por exposicion a la luz ambar. Un ejemplo de realizacion de un metodo en cuestion se representa esquematicamente en la Figura 4.

Cuando se iluminan con una fuente de luz implantable (como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros, las proteinas opsina sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas de las innervaciones del detrusor mantienen un potencial de la membrana neural hiperpolarizado evitando la contraccion del musculo detrusor y permitiendo que la vejiga se llene. Cuando las proteinas opsina sensibles a la luz expresadas en las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquideos sacros no son iluminadas por la fuente de luz implantable, el musculo detrusor es capaz de contraerse debido a la recuperacion del potencial normal de membrana neural y la presion generada facilita la evacuacion. De forma similar, cuando se iluminan mediante una fuente de luz implantable colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo, las proteinas opsina sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas de las inervaciones del esflnter urinario externo mantienen un potencial de membrana neural hiperpolarizado, evitando la contraccion del esflnter urinario externo y permitiendo al individuo miccionar. Cuando las proteinas opsina sensibles a la luz expresadas en las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo no son iluminadas por la fuente de luz implantable, el esflnter urinario externo se contrae y permite que la vejiga se llene.

Tambien en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina opsina sensible a la luz al individuo, en el que la proteina opsina sensible a la luz se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo en el individuo, en el que la proteina opsina sensible a la luz es capaz de causar la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan la proteina sensible a la luz en respuesta a la luz, de modo que la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite el almacenamiento de orina en la vejiga y la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esfinter urinario externo permite evacuar la orina de la vejiga. Se pueden administrar cualesquiera polinucleotidos descritos en la presente memoria que codifiquen una proteina opsina sensible a la luz capaz de causar la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion. En algunas realizaciones, la disfuncion de la vejiga es HD y/o DDE. En otras realizaciones, la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo puede despolarizarse hasta el punto de la deplecion sinaptica por exposicion a la luz azul, verde, amarilla, naranja o roja. En algunas realizaciones, la luz tiene una intensidad de al menos aproximadamente 100 Hz.

Cuando son iluminadas por una fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocado alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquideos sacros, las proteinas opsina

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sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas de las innervaciones del detrusor provocan una deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las celulas neurales, evitando as! la contraccion del musculo detrusor y permitiendo que la vejiga se llene. Cuando las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros no son iluminadas por la fuente de luz implantable, el musculo detrusor es capaz de contraerse debido a la recuperacion de las veslculas transinapticas y la presion generada facilita la evacuacion. De forma similar, cuando se iluminan mediante una fuente de luz implantable colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo, las protelnas opsinas sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas de las inervaciones del esflnter urinario externo provocan una deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de esas neuronas, evitando la contraccion del esflnter urinario externo y permitiendo que el individuo evacue. Cuando las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo no son iluminadas por la fuente de luz implantable, el esflnter urinario externo se contrae y permite que la vejiga se llene.

En algunos aspectos, el individuo controla externamente el estado de polarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o de las neuronas responsables de la inervacion del esflnter urinario externo activando los medios luminosos a partir de una o mas fuentes de luz (tal como un manguito lumlnico) que rodea o esta situado cerca de uno de los nervios raquldeos sacros (como cualquiera de S1, S2, S3, S4, o S5) y/o el nervio pudendo. En otra realizacion, el individuo cambia selectivamente el estado de polarizacion de la membrana de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o neuronas responsables de la inervacion del esflnter urinario externo activando la fuente de luz que rodea o se encuentra cerca del nervio pudendo a la vez que simultaneamente se desactiva la fuente de luz que rodea o se encuentra cerca de los nervios raquldeos sacros cuando el individuo experimenta la necesidad y/o impulso de evacuar o desea evacuar de acuerdo con una pauta predeterminada. En otra realizacion, el individuo es un ser humano.

En algunos aspectos, tanto la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor como la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo en el individuo pueden transfectarse con un vector de expresion que comprende cualquiera de los polinucleotidos descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el vector de expresion puede ser un vector viral tal como cualquiera de los vectores de expresion vlricos descritos anteriormente. En algunos aspectos, la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor puede ser transfectada por inyeccion del vector de expresion en el cuerpo de la celula neuronal motora somatica de un nervio raquldeo sacro (tal como cualquiera de S1, S2, S3, S4, y/o S5). En otros aspectos, la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo se transfecta mediante la inyeccion del vector de expresion en el nucleo de Onuf. En algunos aspectos, una o mas fuentes de luz (tales como un manguito lumlnico) capaces de generar luz en respuesta a una senal externa, tales como las descritas anteriormente, son colocadas quirurgicamente alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros y alrededor de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo.

Incontinencia fecal

Tambien en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar una incontinencia fecal en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo en el individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz es capaz de inducir hiperpolarizacion de las neuronas que expresan la protelna sensible a la luz en respuesta a la luz, de modo que la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo permite la relajacion del esflnter. Se puede administrar cualesquiera polinucleotidos descritos en la presente memoria que codifiquen una protelna opsina sensible a la luz capaz de inducir hiperpolarizacion. En otras realizaciones, la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo esta hiperpolarizada por exposicion a la luz ambar.

Cuando se iluminan con una fuente de luz implantable (como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter anal externo del nervio pudendo y/o uno o mas nervios raquldeos sacros (como cualquiera de S1, S2, S3, S4 y/o S5), las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas de las inervaciones del esflnter anal externo mantienen un potencial de membrana neural hiperpolarizada, evitando la contraccion del esflnter anal externo y permitiendo al individuo defecar. Cuando las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las inervaciones del esflnter anal externo del nervio pudendo y/o los nervios raquldeos sacros no son iluminadas por la fuente de luz implantable, el esflnter anal externo se contrae naturalmente y permite el almacenamiento de heces en el intestino.

Tambien en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz es expresada en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsable de la inervacion del musculo esflnter anal externo en el individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz es capaz

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de causar la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan la protelna sensible a la luz en respuesta a la luz, de modo que la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo permite la relajacion del esflnter. Se pueden administrar cualesquiera polinucleotidos descritos en la presente memoria que codifiquen una protelna opsina sensible a la luz capaz de inducir una deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas. En otras realizaciones, la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo puede despolarizarse hasta el punto de la deplecion sinaptica por exposicion a luz azul, verde, amarilla, naranja o roja. En algunas realizaciones, la luz puede tener una intensidad de al menos aproximadamente 100 Hz.

Cuando se iluminan con una fuente de luz implantable colocada alrededor o cerca de las innervaciones del esflnter anal externo que tienen su origen en los nervios raquldeos pudendos y/o sacra, las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas de las inervaciones del esflnter anal externo causan deplecion sinaptica inducida por despolarizacion De esas neuronas, evitando la contraccion del esflnter anal externo y permitiendo al individuo defecar. Cuando las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las inervaciones del esflnter anal externo del nervio pudendo y/o los nervios raquldeos sacros no son iluminadas por la fuente de luz implantable, el esflnter anal externo se contrae naturalmente y permite que el recto almacene las heces.

En algunos aspectos, el individuo controla externamente el estado de hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del esflnter anal externo activando los medios lumlnicos de una o mas fuentes de luz (como un manguito lumlnico) que rodean o estan situados cerca de los nervios raquldeos sacros y/o el nervio pudendo. En otra realizacion, el individuo cambia selectivamente el estado de polarizacion de la membrana de las neuronas responsables de la inervacion del esflnter anal externo activando la fuente de luz que rodea o esta situada cerca del nervio pudendo y/o los nervios raquldeos sacros cuando el individuo experimenta la necesidad y/o la urgencia de defecar o desea defecar de acuerdo con una pauta predeterminada. En otra realizacion, el individuo es un ser humano. En algunos aspectos, la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo en el individuo puede transfectarse con un vector de expresion que comprende cualquiera de los polinucleotidos descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el vector de expresion puede ser un vector viral tal como cualquiera de los vectores de expresion vlricos descritos anteriormente. En algunos aspectos, la poblacion de neuronas responsable de la inervacion del musculo esflnter anal externo es transfectada por inyeccion del vector de expresion en un nervio raquldeo sacro (tal como cualquiera de S1, S2, S3, S4 y/o S5). En otros aspectos, la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo se transfecta mediante inyeccion del vector de expresion en el nervio pudendo o por inyeccion del vector de expresion en el nucleo de Onuf. En algunos aspectos, una o mas fuentes de luz (tales como un manguito lumlnico) capaces de generar luz en respuesta a una senal externa, tales como las descritas anteriormente, se colocan quirurgicamente alrededor o cerca de las innervaciones del esflnter anal externo que tienen su origen en el nervio pudendo y/o en los nervios raquldeos sacros.

Despolarizacion con protelnas opsina sensibles a la luz o electroestimulacion para impulsar la contraccion muscular Disfuncion vesical

Los musculos del esflnter existen en un estado naturalmente contraldo (tonico) debido al hecho de que, a diferencia de la mayorla de los musculos esqueleticos, no hay otro musculo que se oponga a la contraccion del esflnter (por ejemplo, el musculo biceps esta en oposicion al musculo triceps). Sin embargo, en algunas situaciones, las celulas o neuronas ubicadas mas arriba de los sitios de inervacion del musculo esflnter pueden estar danadas, ser no funcionales o incapaces de generar una contraccion muscular lo suficientemente fuerte como para expulsar la orina de la vejiga, cerrar el esflnter urinario externo o cerrar el esflnter anal externo. En estas circunstancias, la despolarizacion de estos nervios perifericos mediante el uso de proteinas opsina sensibles a la luz o la electroestimulacion tradicional puede utilizarse para restaurar la funcion urinaria y/o continencia fecal y lograr un control “on/off” del musculo detrusor, esflnter urinario y/o esflnter anal, respectivamente.

En consecuencia, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar cantidades efectivas de secuencias polinucleotidicas (tales como cualquiera de las secuencias polinucleotidicas divulgadas anteriormente) que codifican una primera proteina opsina sensible a la luz y una segunda proteina opsina sensible a la luz, en el que la segunda proteina opsina sensible a la luz se expresan en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo en el individuo, en el que la primera proteina opsina sensible a la luz es capaz de inducir hiperpolarizacion de las neuronas que expresan la primera proteina sensible a la luz en respuesta a una primera longitud de onda de luz, de modo que la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite el almacenamiento de orina en la vejiga y la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario externo permite la evacuacion de la orina de la vejiga, en el que la segunda proteina opsina sensible a la luz es capaz de inducir la despolarizacion de las neuronas que expresan la segunda proteina opsina sensible a la luz en respuesta a una segunda longitud de onda de luz, de modo que la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite la evacuacion de la orina de la vejiga y la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter urinario

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externo permite el cierre del esflnter permitiendo el almacenamiento de orina. En algunas realizaciones, la disfuncion de la vejiga es DH y/o DDE.

Cuando se ilumina por luz que tiene una primera longitud de onda proporcionada por una fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros, las primeras protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas de las inervaciones del detrusor hiperpolarizan las innervaciones, evitando as! la contraccion del musculo detrusor y permitiendo que la vejiga se llene. Cuando las segundas protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros son iluminadas por luz que tiene una segunda longitud de onda proporcionada por la fuente de luz implantable, el musculo detrusor es capaz de contraerse debido a la despolarizacion de las innervaciones del detrusor. De manera similar, cuando se ilumina con luz que tiene una primera longitud de onda proporcionada por una fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter externo del nervio pudendo, las primeras protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas de las inervaciones del esflnter urinario externo hiperpolarizan esas neuronas, evitando la contraccion del esflnter urinario externo y permitiendo que el individuo evacue. Cuando las segundas protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo se iluminan por luz que tiene una segunda longitud de onda proporcionada por la fuente de luz implantable, el esflnter urinario externo se contrae debido a la despolarizacion de las innervaciones, permitiendo el almacenamiento de orina en la vejiga.

Incontinencia fecal

Ademas, en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar cantidades efectivas de secuencias polinucleotldicas (tales como cualquiera de las secuencias polinucleotldicas divulgadas anteriormente) que codifican una primera protelna opsina sensible a la luz y una segunda protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la primera protelna opsina sensible a la luz y la segunda protelna opsina sensible a la luz se expresan en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo en el individuo, en el que la primera protelna opsina sensible a la luz es capaz de inducir hiperpolarizacion de las neuronas que expresan la primera protelna sensible a la luz en respuesta a una primera longitud de onda de luz, de modo que la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo permite la relajacion del esflnter permitiendo la defecacion, en el que la segunda opsina sensible a la luz es capaz de inducir la despolarizacion de las neuronas que expresan la segunda protelna sensible a la luz en respuesta a una segunda longitud de onda de luz, de modo que la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo permite el cierre del esflnter permitiendo el almacenamiento de las heces en el intestino.

Cuando se iluminan por una luz que tiene una primera longitud de onda proporcionada por una fuente de luz implantable (tal como un manguito lumlnico) colocada alrededor o cerca de las inervaciones del esflnter anal externo que tienen su origen en el nervio pudendo y/o los nervios raquldeos sacros, las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas de las inervaciones del esflnter anal externo hiperpolarizan las innervaciones, evitando as! la contraccion del musculo esflnter y permitiendo que el esflnter se relaje. Cuando las segundas protelnas opsinas sensibles a la luz, expresadas en las membranas plasmaticas de las inervaciones del esflnter anal externo que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros y/o del nervio pudendo, son iluminadas por luz que tiene una segunda longitud de onda proporcionada por la fuente luminosa implantable, el musculo esflnter es capaz de contraerse debido a la despolarizacion de las innervaciones del esflnter, permitiendo as! el almacenamiento de heces en el recto.

En otro aspecto, el metodo para tratar la incontinencia fecal comprende ademas administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido (tal como cualquiera de las secuencias polinucleotldicas divulgadas anteriormente) que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion de los musculos responsables de la contraccion del recto en el individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz es capaz de inducir la despolarizacion de las neuronas que expresan la protelna sensible a la luz en respuesta a la luz, de modo que la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion de los musculos responsables de la contraccion del recto facilita la defecacion. En algunos aspectos, el individuo controla externamente el estado de despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion de los musculos responsables de la contraccion del recto activando los medios lumlnicos de una o mas fuentes de luz (tal como un manguito lumlnico o cualquiera de las fuentes de luz descritas en la presente memoria) que rodea o esta situada cerca de los nervios raquldeos sacros y/o las fibras nerviosas que tienen su origen en el plexo hipogastrico inferior. En otra realizacion, el individuo cambia selectivamente el estado de polarizacion de la membrana de las neuronas responsables de la inervacion de los musculos responsables de la contraccion del recto activando la fuente de luz que rodea o esta situada cerca de los nervios raquldeos sacros y/o las fibras nerviosas que tienen su origen en el plexo hipogastrico inferior cuando el individuo experimenta la necesidad y/o la urgencia de defecar o desea defecar de acuerdo con una pauta predeterminada.

En otros aspectos, el metodo puede comprender tambien la estimulacion electrica que puede usarse para

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despolarizar las innervaciones del musculo detrusor y/o las inervaciones pudendas del esflnter urinario externo, as! como las inervaciones del esflnter anal externo. En algunas realizaciones, se coloca un electrodo controlable externamente alrededor o cerca de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor, las neuronas responsables de la inervacion del esflnter urinario externo y/o de las neuronas responsables de la inervacion del esflnter anal externo. En otras realizaciones, la estimulacion electrica puede usarse para despolarizar las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros, dando como resultado la contraccion del musculo detrusor y la evacuacion de la vejiga urinaria, a la vez que las protelnas opsina sensibles a la luz pueden usarse para hiperpolarizar o causar deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros, lo que tiene como resultado la relajacion del musculo detrusor, permitiendo as! que la vejiga urinaria se llene. En otra realizacion, la estimulacion electrica puede utilizarse para despolarizar las inervaciones externas del esflnter urinario del nervio pudendo, cerrando as! el esflnter urinario externo y permitiendo que la vejiga se llene mientras que las protelnas opsina sensibles a la luz pueden usarse para hiperpolarizar o provocar la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo, dando como resultado la relajacion del esflnter urinario externo, permitiendo as! que la vejiga urinaria se vacle.

Despolarizacion con protelnas opsina sensibles a la luz para el tratamiento de la disfuncion sexual

Tambien en la presente memoria se proporciona un metodo para tratar la disfuncion sexual en un individuo que lo necesite, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz es expresada en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion de los musculos y organos de los genitales responsables de la funcion sexual en el individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz es capaz de causar la despolarizacion de las neuronas que expresan la protelna sensible a la luz en respuesta a la luz, de modo que la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion de los genitales permite relaciones sexuales y/o la funcionalidad sexual en el individuo. En algunas realizaciones, la funcionalidad sexual es una o mas funciones seleccionadas del grupo que consiste en ereccion, orgasmo, eyaculacion y lubricacion vaginal. En otras realizaciones, la funcionalidad sexual es la restauracion de sensaciones tactiles a los genitales necesarias para mantener la excitacion sexual. Se puede administrar cualquiera de los polinucleotidos descritos en la presente memoria que codifiquen una protelna opsina sensible a la luz capaz de inducir despolarizacion de neuronas. En otras realizaciones, la poblacion de neuronas puede despolarizarse hasta el punto de la deplecion sinaptica por exposicion a luz azul, verde, amarilla, naranja o roja.

Cuando se iluminan por una fuente de luz implantable colocada alrededor o cerca del nervio dorsal del pene/clltoris (una rama del nervio pudendo) o los nervios raquldeos sacros, las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas del nervio dorsal del pene/clltoris provocan la despolarizacion de esas neuronas, conduciendo a la contraccion de esos musculos y sensaciones y/o funciones asociadas con relaciones sexuales normales. Estas incluyen, pero no se limitan a, ereccion, orgasmo, eyaculacion y lubricacion vaginal. Ademas, cuando se iluminan con una fuente de luz implantable colocada alrededor o cerca del nervio dorsal del pene/clltoris (una rama del nervio pudendo) o los nervios raquldeos sacros, las protelnas opsinas sensibles a la luz expresadas en las membranas plasmaticas del nervio dorsal del pene/clltoris causan la despolarizacion de esas neuronas, llevando a la restauracion de sensaciones tactiles a los genitales requeridas para mantener la excitacion sexual.

En algunos aspectos, el individuo controla externamente la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion de los genitales activando los medios lumlnicos de una o mas fuentes de luz que rodean o se encuentran cerca del nervio pudendo (tal como el nervio dorsal del pene/clltoris del nervio pudendo) o los nervios raquldeos sacros. En otra realizacion, el individuo cambia externamente el estado de polarizacion de las neuronas responsables de la inervacion de los musculos de los genitales activando los medios lumlnicos de una o mas fuentes de luz (como un manguito lumlnico) que rodea o se encuentra cerca del nervio pudendo y/o los nervios raquldeos sacros cuando el individuo experimenta el deseo de tener relaciones sexuales o cuando el individuo elige tener relaciones sexuales de acuerdo con una pauta predeterminada. En otra realizacion, el individuo puede ser un ser humano.

En algunos aspectos, la poblacion de neuronas responsables de la inervacion de los musculos y organos de los genitales puede ser transfectada por inyeccion de un vector de expresion polinucleotldico (tal como cualquiera de los vector de expresion polinucleotldicos descritos anteriormente) en el cuerpo de las celulas neuronales motoras somaticas de un nervio raquldeo sacro (tal como cualquiera de S1, S2, S3, S4 y/o S5). En otros aspectos, la poblacion de neuronas responsables de la inervacion de los musculos de los genitales puede ser transfectada por inyeccion del vector de expresion en el nervio pudendo. En algunos aspectos, una o mas fuentes de luz (tales como un manguito lumlnico) capaces de generar luz en respuesta a una senal externa, tales como las descritas anteriormente, pueden colocarse quirurgicamente alrededor o cerca del nervio pudendo (tal como el nervio dorsal de la rama del pene/clltoris del nervio pudendo) o los nervios raquldeos sacros.

Kits

En algunos aspectos, la presente divulgacion proporciona kits para tratar una disfuncion de la vejiga, incontinencia

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fecal y/o disfuncion sexual en un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones, el kit comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina bomba ionica sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO : 1, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana y un manguito capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la proteina bomba ionica sensible a la luz.

En algunos aspectos, la presente divulgacion proporciona kits para tratar una disfuncion de la vejiga, incontinencia fecal y/o disfuncion sexual en un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones, el kit comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina bomba ionica sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana y un manguito capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la proteina bomba ionica sensible a la luz.

En algunos aspectos, la presente divulgacion proporciona kits para tratar una disfuncion de la vejiga, incontinencia fecal y/o disfuncion sexual en un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones, el kit comprende un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina bomba ionica sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:23, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana y un manguito capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la proteina bomba ionica sensible a la luz.

En otros aspectos, el kit puede proporcionar adicionalmente un conjunto de instrucciones para administrar una cantidad eficaz del polinucleotido al individuo, en el que la proteina bomba ionica sensible a la luz se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsable de la inervacion del musculo detrusor, una poblacion de neuronas responsable de la inervacion del musculo esfinter urinario externo en el individuo y/o una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esfinter anal externo en el individuo y/o instrucciones para colocar el manguito alrededor de la inervacion del detrusor de los nervios raquideos sacros y/o alrededor de la inervacion del esfinter urinario externo del nervio pudendo y/o alrededor de las inervaciones del esfinter anal externo del nervio pudendo o los nervios raquideos sacros. El kit tambien puede proporcionar instrucciones para usar cualquiera de las proteinas bomba ionica sensibles a la luz descritas anteriormente de acuerdo con cualquiera de los metodos descritos anteriormente. De manera similar, los manguitos luminicos proporcionados en el kit pueden ser cualquiera de los manguitos luminicos descritos anteriormente.

En algunos aspectos, la presente divulgacion proporciona un kit para tratar una disfuncion de la vejiga en un individuo que lo necesita, donde el kit comprende: a) un polinucleotido que codifica una proteina opsina sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la proteina opsina.

Un kit en cuestion puede incluir ademas instrucciones para administrar una cantidad eficaz del polinucleotido al individuo, donde la proteina opsina sensible a la luz codificada por el polinucleotido se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o una poblacion de neuronas responsable de la inervacion del musculo esfinter urinario externo en el individuo e instrucciones para colocar la fuente de luz alrededor de la inervacion del detrusor del nervio raquideo sacro y/o alrededor de la inervacion del esfinter urinario externo del nervio pudendo. En algunos casos, la disfuncion de la vejiga es la hiperreflexia del detrusor y/o la disinergia del detrusor-esfinter externo.

En algunos aspectos, la presente divulgacion proporciona un kit para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesita, donde el kit comprende: a) un polinucleotido que codifica una proteina opsina sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la proteina opsina que comprende: i) una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en las SEQ ID NO:1, sEq ID No:4 o SEQ ID NO:23; ii) una senal de exportacion del RE; iii) y una senal de trafico de membrana; y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la proteina opsina.

Un kit en cuestion puede incluir ademas instrucciones para administrar una cantidad eficaz del polinucleotido al individuo, donde la proteina opsina sensible a la luz codificada por el polinucleotido se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsable de la inervacion del musculo esfinter anal externo en el individuo e instrucciones para colocar la fuente de luz alrededor de las inervaciones del esfinter anal externo de un nervio raquideo sacro y/o la rama hemorroidal inferior del nervio pudendo.

En algunos aspectos, la presente divulgacion proporciona un kit para tratar la incontinencia fecal en un individuo que lo necesita, donde el kit comprende: a) un polinucleotido que codifica una proteina opsina sensible a la luz, donde el

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polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, en el que la luz es capaz de activar la protelna opsina.

El kit puede incluir ademas instrucciones para administrar una cantidad eficaz del polinucleotido al individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz codificada por el polinucleotido se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esflnter anal externo en el individuo e instrucciones para colocar la fuente de luz alrededor de las inervaciones del esflnter anal externo de un nervio raquldeo sacro y/o la rama hemorroidal inferior del nervio pudendo.

En algunos aspectos, la presente divulgacion proporciona un kit para tratar la disfuncion sexual en un individuo que lo necesite, donde el kit comprende: a) un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz, en el que el polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a una o mas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 y b) una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa, donde la luz es capaz de activar la protelna opsina.

El kit puede incluir ademas instrucciones para administrar una cantidad eficaz del polinucleotido al individuo, donde la protelna opsina sensible a la luz codificada por el polinucleotido se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsable de la inervacion de los genitales en el individuo y las instrucciones para colocar la fuente de luz alrededor de las innervaciones genitales que tienen su origen en uno o mas nervios raquldeos sacros, el nervio dorsal de la rama del pene del nervio pudendo y/o el nervio dorsal de la rama del clitoris del nervio pudendo.

Ejemplos

Ejemplo 1: Uso de la estimulacion nerviosa basada en la optogenetica en un modelo animal de disinergia del detrusor-esffnter externo (DDE) e hiperreflexia del detrusor (HD)

Este Ejemplo valida un modelo animal de DDE e HD para el tratamiento con los metodos optogeneticos descritos en la presente memoria. Se han utilizado modelos de gato con lesiones de la medula espinal para recrear las condiciones humanas de la DDE y la HD, habiendose validado usando PET (Tai et al., 2004, Experimental Neurol., 190:171). Tambien existen modelos animales de hiperreflexia en las ratas con lesiones de la medula espinal (SCI) (Shaker et al., 2003, Neurourol Urodyn., 22(7):693-8), asi como en el raton EAE, que es tambien un modelo para la esclerosis multiple (Vignes et al., 2007, J. Physio. 578(Pt2):439-50). En este Ejemplo, la bomba anionica fotoactivable dirigida a la membrana halorodopsina de Natronomonas pharaonis (NpHR) se utiliza para hiperpolarizar los nervios responsables de la inervacion del musculo detrusor de la vejiga y el esflnter urinario externo.

Materiales y metodos

Los gatos con lesiones de la medula espinal inducidas experimentalmente para replicar los sintomas de la DDE y la HD humanas se producen segun metodos conocidos (Tai et al., 2004, Experimental Neurol. 190:171). Se inyecta halorodopsina marcada con proteina fluorescente amarilla (YFP) (YFP - NpHr3.0 y/o YFP - NpHR3.1; vease
www.optogenetics.org) en un vector viral AAV1 y bajo el control del promotor Thy1 felino directamente en el cuerpo de la celula neuronal motora somatica de los nervios raquideos sacros responsables de las innervaciones del detrusor. Ademas, la YFP-halorodopsina en un vector viral AAV1 bajo el control del promotor Thy1 felino se inyecta en el nucleo de Onuf, el origen del nervio pudendo.

Construccion del manguito luminico e implante guirurgico

La construccion del manguito luminico utiliza una pipeta de vidrio de borosilicato de 0,5 mm de diametro interior. Las pipetas de vidrio se introducen cuidadosamente a 4 mm y en un canal de aproximadamente 0,5 mm de ancho longitudinalmente a lo largo de la longitud del manguito usando un taladro dental con una punta abrasiva. Una resina epoxi curada por radiacion ultravioleta (Norland Products, Cranbury, NJ, NOA 81) se aplica al exterior del manguito y se cura con una lampara de curado UV. Se aplican 16 LED ambar pequenos (1,0 x 0,6 x 0,2 mm) (Rohm, Kyoto, Japon, SMLP12BC7T, 589 nm) al exterior del manguito de vidrio y se fijan en su sitio con la resina epoxi optica curada con luz UV. Los LED estan dispuestos en un perimetro concentrico dirigido hacia el nervio periferico en el centro y micro-soldados manualmente con alambre magnetico de cobre calibre 40. La intensidad y los tiempos de encendido/apagado de los LED individuales se miden con un medidor digital de potencia optica y un fotodetector de alta velocidad (ThorLabs, Newton, NJ, S130A y DET10A). Las mediciones de intensidad se usan como entradas para un modelo de propagacion de la luz, descrito a continuacion y sirven para construir una grafica de corriente electrica de entrada frente a intensidad de la luz para la estimacion de la luz experimental.

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El manguito de luz activable externamente con diodo emisor de luz (LED) se coloca quirurgicamente para rodear cada nervio (uno o mas nervios raquldeos sacros y/o el nervio pudendo; vease, por ejemplo, Llewellyn et al., 2010, Nat. Med., 16 (10):161-165).

Modelo de propagacion de la luz

Se utiliza un modelo de propagacion de la luz para verificar que todas las regiones de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros, as! como las inervaciones del esflnter externo del nervio pudendo (o el propio nervio pudendo) estan expuestas a intensidades de luz que exceden esa intensidad minima de la luz requerida para activar las bombas de cloruro NpHr3.0 y/o NpHR3.1 (3,5 mW/mm-2; Gradinaru et al., 2010, Cell, 141:1-12). La propagacion de la luz se modela utilizando el modelo de Kubelka-Munk como se describe Aravanis et al. para el tejido de dispersion difusa (2007, J Neural Eng 4, S143-56). Brevemente, la intensidad de la luz varla con la distancia mediante la ecuacion

*(«) P2

1) (z + P)

donde

imagen1

y S era la longitud de dispersion del tejido, z era la distancia desde la fuente de luz, r era el diametro del chip LED, n era el Indice de refraccion del material que la luz atravesaba, NA era la apertura numerica del LED desde

NA = nsen

y 1/2 era el medio angulo de divergencia del LED. Este modelo tiene en cuenta el efecto sobre la intensidad de la luz debido a la dispersion y a las perdidas geometricas. El valor utilizado para la longitud de dispersion se determina empiricamente a partir de cortes de cerebro de raton para longitudes de onda entre 400 y 900 nm y se supone que son similares en el tejido periferico. Este modelo tambien asume que no existe ninguna perdida en la intensidad de la luz debido a la absorcion, ni tiene en cuenta los fotones de dispersion multiple. Los valores para 1/2 y r se toman de la hoja de producto del fabricante del LED, mientras que I(z=0) se midio con un medidor de potencia (ThorLabs, Newton, NJ, S130A) para un solo LED.

Utilizando un diametro del nervio pudendo como referencia en este modelo, se puede determinar la variacion relativa de intensidad optica en la periferia del nervio y en el centro nervioso. Por lo tanto, se puede determinar cualquier caida de intensidad a traves del nervio, asi como la superficie minima del nervio necesaria para exceder la intensidad minima para la activacion de la luz de las bombas de cloruro NpHr3.0 y/o NpHR3.1 (3,5 mW/mm-2). El manguito lumlnico puede superar los 25 mW mm-2 en la superficie del nervio.

Imagen del axon motor del nervio pudendo y de los nervios raquldeos sacros

Los gatos adultos con lesiones en la medula espinal, preparados como se ha descrito anteriormente, se anestesian mediante inyeccion de ketamina y xilazina. El musculo detrusor y/o los musculos del esflnter urinario externo se exponen por incision en la piel seguido por inyeccion intramuscular de 4 gl de tincion de marcado retrogrado de 5 % (Fast Blue, Polysciences, Warrington, PA). La incision de la piel se cierra con un adhesivo tisular (VetBond, 3M, St. Paul, MN) y se deja que los gatos se recuperen. Despues de una semana, los animales son anestesiados y sacrificados. Los cortes del nervio raquldeo pudendo y sacro se diseccionan y se fijan en paraformaldehldo al 4 % durante 30 minutos a 25 °C. Las muestras son lavadas despues dos veces en solucion salina tamponada con fosfato 1X (en mM, 2,7 KCl, 1,76 KH2PO4, 137 NaCl, 10 NaHPO4, pH 7,4) durante 5 minutos cada una a 25 °C, embebidas en agarosa con punto de fusion de baja temperatura a 50 °C y se cortan con vibratomo en cortes de 50 gm.

Despues de una permeabilizacion de 30 min en Triton X-100 al 0,1 % (octilfenolpolil (etilenglicoleter)x) y suero de burro normal al 3 %, los cortes se incuban durante la noche con anticuerpo monoclonal anti-lamina de raton 1:500 (Abcam, Cambridge, MA) y anticuerpo policlonal anti-tau de conejo 1:1000 (DAKO, Cambridgeshire, Reino Unido). Los cortes se lavan a continuacion y se incuban durante 3 horas a 25 °C con anticuerpos secundarios conjugados con Cy3 o Cy5 fluorescente 1:1000 (Jackson Laboratories, West Grove, PA). Las imagenes de fluorescencia confocal se obtienen utilizando un microscopio de laser de barrido Leica TCS SP5 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania) con un objetivo de inmersion de aceite 20X/0,70NA o 40X/1,25NA. Se adquieren multiples imagenes en pila en serie de varios sujetos utilizando ajustes equivalentes.

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Analisis de la imagen

El numero, el tamano y la intensidad de la fluorescencia de los axones motores (3 |jm y G-ratio 0,5) se determinan mediante analisis manual utilizando el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD). El perlmetro de la vaina de mielina marcada con lamina y el axolemma marcado con tau se delinean a mano para formar una region de interes. El diametro de Feret y la intensidad media de los plxeles se determinaron automaticamente en ImageJ para la region de interes. La profundidad del axon dentro de los nervios raquldeos pudendos y sacros se determina buscando la distancia mas corta entre el centro de cada axon y el exterior del nervio. El diametro del axon motor frente a la intensidad de plxeles de la protelna fluorescente amarilla se evaluan para determinar la correlation estadlsticamente significativa utilizando una prueba t de Student de dos colas pareada (a= 0,05) despues de la primera prueba de normalidad usando el ensayo de Lilliefors (a=0,05) en Matlab (Mathworks, Natick, MA).

La distribucion de las bombas de cloruro sensibles a la luz marcadas con YFP dentro de axones motores de un gato Thy1::NpHR se cuantifican examinando los cortes transversales de los nervios raquldeos pudendos y sacros paralelos y perpendiculares al eje largo de los axones.

Los estlmulos proporcionados a traves de los manguitos lumlnicos evocan respuestas electricas y contractiles del musculo detrusor y el esflnter urinario externo.

Se utiliza una senal externa para activar los LED. La activation de los LED raquldeos sacros y los LED pudendos son tales que cuando uno esta encendido, el otro esta apagado. Cuando los LED raquldeos sacros estan encendidos, la vejiga esta relajada y el esflnter urinario externo esta activo, permitiendo el almacenamiento de la orina. Cuando los LED raquldeos sacros estan apagados, el esflnter urinario externo esta encendido permitiendo que el esflnter urinario externo se relaje y permita que la orina pase de la vejiga en contraction. Cuando se completa la evacuation, los LED raquldeos sacros se vuelven a encender y los LED del esflnter urinario externo se apagan.

Ejemplo 2: Uso de canales cationicos sensibles a la luz para provocar la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion en un modelo animal de disinergia del detrusor-esfmter externo (DDE) e hiperreflexia del detrusor (HD)

Este Ejemplo valida un modelo animal de DDE e HD para el tratamiento con los metodos optogeneticos descritos anteriormente por el cual la funcion urinaria se restablece mediante la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion selectiva de las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros y las inervaciones del esflnter urinario externo del nervio pudendo. Los modelos animales felinos o de roedores son identicos a los utilizados en el Ejemplo 1.

Se inyecta SSFO marcada con protelna fluorescente amarilla (YFP) (pAAV-Thy1-hChR2 (E123T/T159C)-EYFP; vease
www.optogenetics.org) en un vector viral AAV1 y bajo control del promotor Thy1 felino directamente en el cuerpo celular de la neurona motora somatica de los nervios raquldeos sacros (responsables de las innervaciones del detrusor) y en el nucleo de Onuf (responsable de las inervaciones del esflnter urinario externo).

Los manguitos lumlnicos se fabrican como en el Ejemplo 1. Los manguitos lumlnicos activables externamente con diodo emisor de luz (LED) se colocan quirurgicamente para rodear las innervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquldeos sacros y las inervaciones del esflnter urinario del nervio pudendo. La deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion causada por la activacion de las protelnas canal cationico sensibles a la luz con luz que tiene una intensidad de al menos 100 Hz provoca la relajacion del musculo detrusor, permitiendo as! que la vejiga se llene. Ademas, la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion causada por la activacion de las protelnas canal cationico sensibles a la luz con luz que tiene una intensidad de por lo menos 100 Hz provoca la relajacion del esflnter urinario externo, permitiendo as! la evacuacion de la orina.

Se utiliza una senal externa para activar los LED. La activacion de los LED raquldeos sacros y los LED pudendos es tal que cuando unos estan encendidos, los otros estan apagados. Cuando los LED raquldeos sacros estan encendidos, la vejiga esta relajada y el esflnter urinario externo esta activo, permitiendo el almacenamiento de la orina. Cuando los LED raquldeos sacros estan apagados, los del esflnter urinario externo estan encendidos, permitiendo que el esflnter urinario externo se relaje y permita que la orina pase de la vejiga en contraccion. Cuando se completa la evacuacion, los LED raquldeos sacros se vuelven a encender y los LED del esflnter urinario externo se apagan.

Ejemplo 3: Construcciones de vectores AAV

Se generaron las siguientes construcciones de virus adenoasociados (AAV): 1) AAV1:hsyn-ChR2-EYFP (AAV1 que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna de fusion de ChR2-eYFP operativamente unida a un promotor de sinapsina 1 humana); 2) AAV6- hsyn-ChR2-EYFP (AAV6 que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna de fusion ChR2-eYFP operativamente unida a un promotor de sinapsina 1 humana); 3) AAV1-hsyn-NpHR-EYFP (AAV1 que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna de fusion NpHR3.0-EYFP, unida operativamente a un promotor de sinapsina 1 humana); 4) AAV6-hsyn-

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NpHR-EYFP (AAV6 que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna de fusion NpHR 3.0- EYFP, unida operativamente a un promotor de sinapsina 1 humana); 5) AAV1-hsyn-eARCH-EYFP (AAV1 que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna de fusion eARCH 3.0-EYFP, unida operativamente a un promotor de sinapsina 1 humana).

Los virus AAV de ADN monocatenario se produjeron en un sistema de baculovirus (Virovek, Hayward, CA, tal como se describe en el documento WO 2008/024998

Ejemplo 4: Inyecciones intramusculares de AAV que codifican opsinas en ratas

Se inyecto una dosis total de aproximadamente 1 x 1012 genomas virales (gv) en aproximadamente 12 pl de construcciones descritas en el Ejemplo 3 en el musculo EUE (esflnter urinario externo) de ratas F344/Sprague Dawley hembra, 130-170 g cada una. En diversos dlas despues de la inyeccion, se sacrificaron los animales y se evaluo la expresion de las opsinas codificadas por las construcciones en el nucleo dorsolateral (NDL) y en otras regiones de la medula espinal. La figura 1 representa esquematicamente las diversas secciones de la medula espinal, incluyendo el NDL. Todas las construcciones codificaron protelnas de fusion opsina-EYFP (por ejemplo, ChR2-EYFP, NpHR-EYFP, eARCH-EYFP).

Se prepararon cortes de 40 nm de la medula espinal de la rata. Los cortes se tineron con DAPI y se examinaron con un microscopio de fluorescencia. La microscopla confocal se utilizo para contar neuronas motoras del NDL en todos los cortes mediante la visualizacion del marcaje con YFP. Las neuronas motoras se visualizaron utilizando un objetivo de 40x y se tomaron fotomicrograflas de los cortes mediante la fusion de imagenes de los canales DAPI (que representa el nucleo) e YFP (que indica las regiones del cuerpo celular). Los cortes con un nucleo visible rodeado por YFP dentro del NDL se contaron sobre cortes seriados para determinar el numero total de neuronas motoras para cada animal. En cada corte, se contaron las celulas como positivas si mostraban tanto la expresion de YFP como DAPI para la tincion nuclear. Los datos se representan en la Figura 2.

Como se muestra en la Figura 2, panel izquierdo, aproximadamente la mitad de todas las neuronas motoras pudendas expresaban la protelna codificada por las diversas construcciones de AAV inyectadas. Los valores de la literatura para el numero total de neuronas motoras pudendas, medido mediante marcado retrogrado, es de aproximadamente 60 para DL derecha y DL izquierda y 120 total. (Kane et al. (2002) Anat. Rec. 266:21-29).

Ejemplo 5: Medicion de la contraccion del musculo EUE y de la presion en la vejiga en rata

Noventa dlas despues de la inyeccion intramuscular de AAV1-hsyn-ChR2-EYFP en el EUE, se realizo una cistometrla y se tomaron registros EMG del esflnter de la vejiga y del esflnter urinario externo. La cistometrla implico la colocacion de un cateter en la vejiga del roedor que se engancha a un sensor de presion. Se colocaron electrodos en el EUE y se conectaron a un amplificador registrador para medir la actividad (EMG) de la contraccion del musculo esflnter. Los datos se presentan en la Figura 3.

La Figura 3 muestra las contracciones del musculo EUE a diferentes frecuencias/duraciones de tiempo despues de la estimulacion optica con luz azul en el nervio pudendo de ratas por via intramuscular (en el EUE) inyectadas con AAV1-hsyn-ChR2-EYFP. Las contracciones opticamente inducidas observadas siguen la frecuencia de pulsos de luz de 5-50 Hz para el nervio pudendo.

Los ejemplos, que estan destinados a ser puramente ilustrativos de la invencion y por lo tanto no deben ser considerados como limitativos de la invencion de ninguna manera, tambien describen y detallan aspectos y realizaciones de la invencion discutidos anteriormente. Los ejemplos anteriores y la descripcion detallada se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo de limitation.

Aunque la invencion anterior se ha descrito con algun detalle a modo de ilustracion y ejemplo con fines de claridad de entendimiento, sera facilmente evidente para los expertos en la materia a la luz de las ensenanzas de esta invencion que se pueden hacer ciertos cambios y modificaciones sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

SECUENCIAS

La secuencia de aminoacidos de NpHR sin el peptido senal:

VTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPRAKLIAVSTILVPVVSIASYT GLASGLTISVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTWALSTPMILLALGLLAG SN ATKLFTA1 lTOIAMCV'l GEAAAE11 SSI IEMRWFWYA1SCACFEVVEY1LEVEWAQDAKA AGTADMFNTLKLLTVVMWLGYPIVWALGVEGIAVLPVGVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLLLN YLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADD (SEQ ID NO:l).

La secuencia de aminoacidos de eYFP-NpHR3.0:

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MTETLPPVTESAVALQAEVTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPR

AKLIAVSTILVPVVSIASYTGLASGLTISVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYL

TWALSTPMILLALGLLAGSNATKLFTAITFDIAMGVTGLAAALTTSSHLMRWFWYAISCAGF

LVVLYILLVBWAQDAKAAGTADMFNTLKLLTVVMWLGYPIVWALGVEG1AVLPVGVTSW

GYSFLDIVAKYIFAFLLLNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADDAAAKSRITSEGEYIPLDQID

INVVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPT

LVTTFGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQER'nFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTL

VNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADH

YQQNTPIGDGPVLFPDNHYFSYQSALSKDPNEKRDFIMVEFFrVTAAGrrFGMDEEYKFCYE NEV (SEQ ID NO:2).

La secuencia de aminoacidos de eYFP-NpHR3.1:

MVTQRBLFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVEMTRGLDDPRAKLIAVSTILVPVVSIAS

YTGLASGLTISVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTWALSTPMILLALGLL

AGSNATKLFT AITFDIAMC VT GLA AALTTSSHLMRWFWY AISC ACFLV VL YILL VEWAQDA

KAAGTADMFNTLKLLTVVMWLGYPIVWALGVEGIAVLPVGVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLL

LNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADDAAAKSRITSEGEYIPLDQIDINVVSKGEELFTGVVP1

LVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGLQCFARYP

DHMKQHDFEKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNI

EGHKEEYNYNSHNVYTMADKQKNGTKVNEKIRFINTEDGSVQEADHYQQNTPIGDGPVEEPD

NHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKFGYENEV (SEQ ID N():3).

La secuencia de aminoacidos de GtR3:

ASSFGKALLEFVFIVFACITLLLGINAAKSKAASRVLFPATFVTGIASIAYFSMASGGGWVIAP DCRQLFVARYLDWLITTPLLLIDLGLVAGVSRWDIMALCLSDVLMIATGAFGSLTVGNVKW VWWEPGMCWP'EHIIFAEGKSWAEAAKAKGCtDSASVYSKIAGITVITWFCYPVVWVFAEGF GNFSVTFEVLIYGVLDVISKAVFGLILMSGAATGYESI (SEQ ID NO:4).

La secuencia de aminoacidos de ChR2:

MDYGGALSAVGRELLEVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLA AGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLR YAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGL CYGANI II;HAAKAYIIXIYH'I VPKGRCRQVVIGMAWIA 11 VSWGMI I'll.I;IEC.PIXII;GVI.SVY GSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEVETLVEDEAEAG A VP (SEQ ID NO:5).

La secuencia de aminoacidos de SFO:

MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLA AGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLR YAEWEETSPVIEIHESNETGESNDYSRRTMGI.EVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVII FCEGE CYGAN'l FFIIAAKAYIFIGYirrVPKGRCRQVV rGMAWI.FFVSWGMFPILEIIXIPEGFGVI.SVY GS'I VGH I IlDEMSKNCWGEEGHYERVEIHEHIEIHGDIRKTI KENIGCr l Ell :VE LEVI IDFIAEAG AVP (SEQ ID NO:6).

La secuencia de aminoacidos de SSFO:

MDYGGALSAVGRELLEVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLA AGFSILLLMFYAYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLR Y AF.WI .ETSPVIEIIIESNI .TGESND YSRRTMGI .1 .VS AIGTTV WGATSAM ATGY VKVIFFCEGE CYGANTFFIIAAKAYIEGYIITVPKGRCRQVVTGMAWEFFVSWGMFPIEFILGPFX1FGVESVY GS'I VGI I I IIDI.MSKNCWGI.EGI IYI.RVI.il IHIIIEII IGDIRK'l TKENIGCt I HIHVE'n.VHDHAHAG AVP (SEQ ID NO:7).

La secuencia de aminoacidos de C1V1:

5

10

15

20

25

30

MSRRPWI .1AT AI AV AT A AGS AG ASTGSD ATVPV ATQDGPD Y VFHR AHERMI .FQTSYTLF NNGSV1CIPNNGQGFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCG WFFTYV ATIFMIKFTIFYFHFFDFPA VIYSSNGNKTVWI R Y AFWIJ .TCPVEIJHT SNET GI TC DDYSKRTMGI.E VSD VGCIVWG ATS AMCTGWTKII 11 1 ISI SYGMYTYNIAAKVYIFAFIIT

VPKGTCRFLVRVMAWTFFVAWGMFPVFFI.FGTFGFGHISPYCiSATGHSIFDI JAKNMWGV LGNYLRVKIHEH1LLYGD1RKKQK1T1AGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO:8).

La secuencia de aminoacidos de C1V1 (E122T):

MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLEN NGSVICIPNNGQCFGFAWFKSNGTNAFKI AANIFQWITFAFSAFCFMFYGYQTWKSTCGWF TIYVATIEMIKFIIRYFIIFFDEPAVIYSSNGNKTVWFRYAEWFFTCPVFFITIFSNFTGFKDDYS KRTMGFFVSD VGCIVWGATSAMCTGWTKTFFFFISFSYGMYTYFIIAAKV YIFAFI TTVPKGI CRFFVRVMAWTFFVAWGMFPVFFLFGTFGFGI 1ISPYGSAIGIIS1FDEIAKNMWGVFGNYER VKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO:9).

La secuencia de aminoacidos de C1V1 (E162T):

MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLE

NNGSVICIPNNGQGFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCG

WEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTGPVLLIHLSNLTGLK

DDYSKRIMGFEVSDVGCIVWGAl’SAlVICTGWl’KIFF'I'EISESYGMY'l'YFHAAKVYIlAI'Hr

VPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHLSPYGSAIGHSILDLIAKNMWGV

LGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO: 10).

La secuencia de aminoacidos de C1V1 (E122T/E162T):

MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLE NNGSVICIPNNGQGFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCG WETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTGPVLLIHLSNLTGLK DDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFIIAAKVYIEAFI IT VPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGV LGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO:ll).

La secuencia de aminoacidos de eArch:

MDPIALQAGYDLLGDGRPETLWLGIGTLLMLIGTFYFLVRGWGVTDKDAREYYAVTILVP (HAS A AYLSMFFC II( 1LTEVTVCIGEMLDIY YARYADWLFTTPLLLLDL ALLAKVDRVTIGTL VGVDALMIVTGLIGALSIITAIARYSWWLFSTICMIVVLYFLATSLRSAAKERGPEVASTFN IL'l ALVLVLW'I AYPILWIIGIEGAGVVGLGIEILLFMVLDVI AKVGFGFILLRSRAILGD'rE APEPS AG AD VS A AD (SEQ ID NO:23).

La secuencia de aminoacidos de eArch3.0-EYFP:

MDPIALQAGYDLLGDGRPETLWLGIGTLLMLIGTFYFLVRGWGVTDKDAREYYAVTILVP GIASAAYLSMFFGIGLTEVTVGGEMLDIYYARYADWLFTTPLLLLDLALLAKVDRVTIGTL VGVDALMIVTGLIGALSHTAIARYSWWLFSTICMIVVLYFLATSLRSAAKERGPEVASTFN TLT ALVLVL WT A YPILWIIGTEG AGV V GLGIETLLFM VLD VT AKV GF GFILLRS RAILGDTE APEPS AG ADVSAADRPVVAVSKAAAKSRn’SEGEYIPLDQIDINVVSKGEELlT’GVVPILVE LDGDVNCIHKFS VSGEGEGDATYCIKLTLKFK ’TTCIKLPVPWPTLVTTFGY GLQ( ’FARYPDIT MKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNIL GHKI .F.YNYNSHNVYIMADKQKNGTKVNFKTRHNTFDGSVQI ADHYQQNTPTGDGPVFFPD NHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKFCYENEV (SEQ ID NO:24).

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Deisseroth, Karl A.

Aden, Elizabeth R.

Gradinaru, Viviana Delp, Scott L.

<120> Composiciones y metodos para el tratamiento de trastornos neurogenicos del suelo pelvico

<130> STAN-937WO

<150> US 61/601.298 5 <151>

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

10

<210> 1 <211 > 273 <212> PRT

<213> Secuencia artificial 15

<220>

<223> Secuencia de aminoacidos sintetica

20

<400> 1

imagen2

Gly Leu: Ala Ala Ala Leu Thr Thr Ser Ser His Leu Met Arg Trp Phe

145: 150 155 160

Trp: Tyr Ala lie Ser Cys Ala Cys Phe Leu val Val Leu Tyr He Leu




: 165 170 175

Leu: val Glu Trp Ala Gin Asp Ala Lys Ala Ala Gly Thr Ala Asp Met



: 180 185 190

Phe: Asn Thr Leu Lys Leu Leu Thr Val Val Met Trp Leu Gly Tyr Pro


: 195 200 205

lie: Val Trp Ala Leu Gly val Glu Gly He Ala val Leu Pro Val Gly

: 210 215 220

val: Thr Ser Trp Gly Tyr Ser Phe Leu Asp He val Ala Lys Tyr He

225: 230 235 240

Phe: Ala Phe Leu Leu Leu Asn Tyr Leu Thr Ser Asn Glu Ser Val Val




: 245 250 255

Ser: Gly Ser He Leu Asp Val Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Ala Asp



: 260 265 270

Asp

<210>2 <211>559 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de aminoacidos sintetica

10

<400>2

Met Thr Glu Thr Leu Pro Pro Val Thr Glu Ser Ala Val Ala Leu Gin 15 10 15

Ala Glu Val Thr Gin Arg Glu Leu Phe Glu Phe Val Leu Asn Asp Pro 20 25 30

Leu Leu Ala Ser Ser Leu Tyr lie Asn lie Ala Leu Ala Gly Leu Ser

35 40 45

lie Leu Leu Phe Val Phe Met Thr Arg Gly Leu Asp Asp Pro Arg Ala 50 55 60

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1. Un primer polinucleotido para su uso en un metodo para el tratamiento de la hiperreflexia del detrusor y/o la disinergia detrusor-esfinter externo en un individuo que lo necesita,

en donde dicho primer polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina opsina sensible a la luz que comprende: i) una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia mostrada en las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:23; ii) una senal de exportacion del RE y iii) una senal de trafico de membrana, y en donde el metodo comprende:

administrar al individuo una cantidad eficaz de dicho primer polinucleotido que comprende una secuencia de

nucleotidos que codifica una primera proteina opsina sensible a la luz, en donde la proteina opsina se expresa en

la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esfinter urinario externo en el individuo, en donde dicha primera proteina opsina induce la hiperpolarizacion de las neuronas que expresan la proteina opsina en respuesta a la luz, de modo que la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite el almacenamiento de orina en la vejiga y la hiperpolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esfinter urinario externo permite la evacuacion de la orina de la vejiga.
2. El polinucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el metodo comprende ademas:

administrar al individuo una cantidad eficaz de un segundo polinucleotido que comprende una secuencia de

nucleotidos que codifica una segunda proteina opsina sensible a la luz, en donde la proteina opsina se expresa

en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esfinter urinario externo en el individuo,

en donde dicha segunda proteina opsina induce la despolarizacion de las neuronas, de modo que la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite la evacuacion de la orina de la vejiga y la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esfinter urinario externo permite el almacenamiento de la orina de la vejiga,

en donde dicho segundo polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina opsina sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11.
3. Un polinucleotido para su uso en un metodo para el tratamiento de la hiperreflexia del detrusor y/o la disinergia del detrusor-esfinter externo en un individuo que lo necesita,

en donde dicho polinucleotido comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina opsina sensible a la luz que comprende una secuencia al menos un 95 % identica a la secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 y SEQ ID NO:11 y en donde el metodo comprende:

administrar al individuo una cantidad eficaz de dicho polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina opsina sensible a la luz, en donde la proteina opsina se expresa en la membrana plasmatica de una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o una poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esfinter urinario externo en el individuo, en donde dicha proteina opsina es capaz de inducir la despolarizacion o la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan la proteina opsina en respuesta a la luz, de modo que la despolarizacion o la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor permite la evacuacion de la orina de la vejiga o el almacenamiento de orina en la vejiga respectivamente y la despolarizacion o la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo esfinter urinario externo permite el almacenamiento de la orina en la vejiga o la evacuacion de la orina de la vejiga respectivamente.
4. El polinucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la poblacion de neuronas responsables de la inervacion del musculo esfinter urinario externo comprende neuronas del nervio pudendo en el individuo.
5. El polinucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde una fuente de luz capaz de generar luz en respuesta a una senal externa esta colocada alrededor de las inervaciones del detrusor que tienen su origen en los nervios raquideos sacros y/o alrededor de las inervaciones del esfinter urinario externo del nervio pudendo, en donde la luz es capaz de activar la proteina opsina sensible a la luz expresada en la membrana plasmatica de las neuronas.
6. El polinucleotido para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el individuo controla externamente el estado de polarizacion de las neuronas responsables de la inervacion del musculo detrusor y/o las neuronas responsables de la inervacion del esfinter urinario externo activando la fuente de luz que rodea el nervio raquideo

sacro y/o el nervio pudendo.
7. El polinucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el polinucleotido se administra mediante inyeccion del polinucleotido en el cuerpo celular de una neurona motora

5 somatica de uno o mas nervios raquldeos sacros, en el nervio pudendo o en el nucleo de Onuf.
8. El polinucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el polinucleotido es un vector, opcionalmente en donde dicho vector es un vector viral seleccionado del grupo que consiste en un vector AAV, tal como un vector AAV1, AAV2, AAV6 o AAV9, un vector retroviral, un vector adenoviral,

10 un vector HSV y un vector lentiviral.
9. El polinucleotido para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la expresion de la protelna opsina sensible a la luz es controlada por un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor EF1a, un promotor CMV, un promotor CAG, un promotor de sinapsina, un promotor Thy1 y un promotor

15 CAMKII.

imagen1

Neuronas motoras del DLN

Figura 2

Numeros de neuronas motoras pudendasdel EUE: medido frente a descrito

Comparacion de serotipos con un titulo de 1e12particulas

TABLA 1. Recuerto de neuronas motoras

pudendaspor marcado retrogrado

imagen2

Localization

Media t DE Rango N

Dorsolateral*

"If if TOO l«

| DL izquierdo

to && 33,™ 19

DL derecho

m nj m-iiri

Dorsomedia^

" Sir "85 TO/ 9

DM izquierdo

3L3 ftl Wim 9

DM derecho

32.1 8,8 14,444,6 9

Otro*

5.8 12,1 mil 9

Otro izquierdo

1,8 2,9 8.7 9

Otro derecho

2,9 24,7 0,0 -75,5 9

Breedlove V Arnold, 1980“

DM

m 11,1 5

McKenna y Nadelhaft,

r -tm*...............

LDL

m -6,6 .5

DM

"355" ir — f!

.....................1

L DL

62,7 -6,7 52>-7U. B

DM

ii inra 6

“ “ “

-----------------------,

1 dl

5614 231 .7

*La media se ajusto con el factor de correccion de Abercrombie.

Kane etal, 2002

Figura 3 Estimulacion optica del nervio pudendo que expresa ChR2

imagen3

imagen4

wwmws

} AAV1 que codifica } una proteina | opticamente } activable (opsina)

Musculo

|Con disineraia detrusor-esfinter \ (DDE), los pacientes tienen jpermanentemente contraido el j EUE y no pueden evacuar normalmente

Permitirel transporte retrogrado desde el EUE hasta la medula espinal y expresion de la opsina

Inyectaren el esfinter uretral externo (EUE)

VtNTOWvXYlW';

Manguito luminico alrededor del nervio pudendo : que expresa una opsina

Relaiacion mediada porla luz del EUE

Opsinas activates por luz expresadas en la membrana plasmatica axonal

Inhibicion mediada por la luz de la activacion neuronal

Evacuation de la vejiga permitida

Figura 4

EI Problema:

Paciente con antecedentes de traumatismo o enfermedad

neurodegenerativa que tiene vejiga parahzada