JP6621791B2 - 骨盤底の神経性障害を処置するための組成物および方法 - Google Patents

骨盤底の神経性障害を処置するための組成物および方法 Download PDF

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Description

相互参照
本出願は、２０１２年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／６０１，２９８号の利益を主張するものであり、この出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、泌尿器、直腸、および性機能を担う筋肉および器官を神経支配する神経細胞の膜電位を選択的に改変することができる、安定に発現した光応答性オプシンタンパク質の使用による、個体における膀胱機能障害、便失禁、および性機能障害を含む骨盤底の神経障害を処置するための方法に関する。
序文
「光遺伝学」とは、自由に行動する哺乳動物および他の動物内であっても、生体組織の標的化細胞における特定の事象を制御するために使用される、遺伝子的および光学的方法の組み合わせを指し、機能する無傷の生体系に対応するためには時間精度（ミリ秒の時間スケール）が必要である。光遺伝学の特徴は、迅速光応答性イオンチャネルおよび／またはポンプタンパク質を、特定の標的化メカニズムの使用により細胞型分解能を維持しながらニューロン膜電位の時間的に正確な操作を可能にする標的神経細胞の細胞膜に導入することである（例えば、米国特許出願公開第２００７／００５４３１９号、同第２００９／００９３４０３号、および同第２０１０／０１４５４１８号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１３１８３７号および同第ＷＯ２００７／０２４３９１号を参照されたい）。わずか数年で、光遺伝学の分野は、特定の細胞型が、骨格筋と平滑筋との間のその神経支配を担うニューロンによる相互作用を含むｉｎ ｖｉｖｏでの生体組織の機能にいかにして寄与するかの基礎的な科学的理解を進歩させた。
尿失禁は、排尿の随意調節の維持の機能不全であり、世界中の何百万もの男性および女性に影響している状態である。排尿の制御は、神経反射経路（いくつかは中枢神経系制御を有し、いくつかは有さない）、平滑および随意筋、ならびにホルモン効果を含む複雑な生理学的プロセスである。（ＤｅＧｒｏａｔ，１９９７，Ｕｒｏｌｏｇｙ ５０［Ｓｕｐｐ６Ａ］：３６−５２によるレビューを参照されたい。）尿失禁の大部分は、少なくとも部分的に神経原性である。臨床的用語である「過活動膀胱」は、一般に、完全であるか一過性であるかを問わず、尿意または排尿の願望の頻度の増加を特徴とする任意の形態の失禁を指し、随意制御の喪失は、部分的なものから完全なものまで様々である。「切迫性尿失禁」は、突然の強力な排尿の願望に関連した尿の不随意的失禁である。切迫性尿失禁は、多くの場合、膀胱からの尿の排出における主要な力を提供する排尿筋の不随意的（無抑制）収縮の尿流動態所見に関連する。無抑制排尿筋を有する患者の大部分は、ある種の神経学的障害を有し、この場合、臨床的用語は「排尿筋過反射」（ＤＨ）である。排尿筋過反射（ＤＨ）に関連した一般的な神経障害は、パーキンソン病、脳卒中、糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、および末梢神経障害である。さらに、脊髄に外傷を受けた個体は、一般に、ＤＨに関連した症状を経験する。
外尿道括約筋の筋肉もまた、脊髄損傷により影響を受ける可能性があり、「共同運動障害」として知られる状態をもたらす。共同運動障害は、膀胱の排尿に応じた積極的収縮を含む、膀胱が収縮した際の尿道括約筋の弛緩能力不全を含み、尿が尿道を通って流動するのを妨害して、膀胱の不完全な排尿および腎臓への尿の「逆流」を引き起こす。
排尿筋過反射および外尿道括約筋協調不全に対するいくつかの処置は、電気的神経刺激に依存する。この処置法は、刺激される神経／筋肉に隣接して位置付けられる電極の使用に依存する。電気パルスによる電極の活性化は、隣接する神経を興奮させ、その神経により神経支配された筋肉の収縮をもたらす。しかしながら、電極は、非選択的であり、その電場内に含まれる全ての組織および細胞型を刺激する。したがって、この神経刺激法およびデバイスは細胞型特異性により局所的に作用して、排尿筋過反射および外尿道括約筋協調不全に関連する症状の原因となる筋肉および神経を制御することができない。
前方仙骨神経根刺激（ＳＡＲＳ、Ｆｉｎｅｔｅｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は、持続的脊髄損傷を有する患者における膀胱機能を回復するために使用される神経刺激デバイスである。ＳＡＲＳは、ＤＨ／ＤＳＤを防止するために仙骨神経根切断を必要とし、性機能の喪失をもたらす。加えて、仙骨神経根切断は、下部尿路の求心路をさらに損傷し、膀胱反射喪失または膀胱収縮の喪失をもたらす。結果として、排尿筋を活性化させるために術後電気刺激が必要である。しかしながら、括約筋を神経支配する神経は、排尿筋を神経支配する神経よりも大きく、したがって最初に動員されるため、電極はまた同時に、外尿道括約筋も活性化する。括約筋の横紋筋は、排尿筋の平滑筋よりも迅速に弛緩するため、ＳＡＲＳを受けた個体は、短期間、刺激後の排尿を経験する。しかしながら、上述の性機能の喪失に加えて、ＳＡＲＳはしばしば、短期膀胱尿管逆流現象を引き起こす可能性があり、また長期的に腎不全に関連する、非常に高い膀胱圧力をもたらす。
排尿筋過反射および外尿道括約筋協調不全に対する他の現在の処置は、抗ムスカリン様作用薬（例えばオキシブチニンまたはトルテロジン）と組み合わせた永久的または間欠的自己導尿、アルファ遮断薬の使用、外尿道括約筋へのボツリヌス毒素（例えば、Ｂｏｔｏｘ（登録商標）（Ａｌｌｅｒｇａｎ）またはＤｙｓｐｏｒｔ（登録商標）（Ｉｐｓｅｎ））の注射、外尿道括約筋のバルーン拡張、および尿道ステントの使用を含む。しかしながら、これらの処置は全て、頻繁な処置の繰り返しの必要性（間欠的導尿およびボツリヌス毒素注入の場合）、尿路感染の増加（導尿、ステント、バルーン拡張）、敗血症の発生の増加（バルーン拡張）、ならびに扁平上皮癌への感受性の増加（導尿）を含む、著しい欠点が問題となっている。
別の骨盤底疾患である便失禁は、腸の制御の低下により糞便物質が不随意的に排泄される、または漏出する状態である。様々な程度の便失禁は、肛門括約筋の機能障害もしくは損傷、骨盤底の機能障害、または直腸におけるコンプライアンスの低下を含む、任意の数の因子の結果であると考えられる。肛門直腸領域への神経供給は、体性および自律神経性の両方である。浅会陰神経（陰部神経の枝）は、会陰および肛門管粘膜への感覚線維を提供する。外肛門括約筋は、下直腸神経（下部直腸神経としても知られる、陰部神経の枝）から運動供給を受ける。排尿障害に対する処置と同様に、便失禁に対するいくつかの処置は、肛門括約筋の筋肉を制御する神経の電気刺激に依存し、個体の随意調節を回復することを試みている。結腸瘻造設術等の他の外科的処置もまた一般的である。しかしながら、これらの方法は全て、実践上の著しい欠点および複雑性が問題となっている。
性機能障害は、勃起不全、オルガスム障害、早漏および潤滑不足を含む、幅広い弊害を含む。性機能障害は、男性および女性の両方に発生し、生涯性または後天性であり得る。性機能障害には生理学的および精神的の両方の多くの原因があり、多くの患者において、障害は多因子的となり得る。原因は、元来本質的に神経学的ないくつかを含む。例えば、陰茎および陰核を神経支配するために自律神経系により使用される経路への損傷が、中枢神経系により開始される性的興奮を妨害し得る。体性神経経路（すなわち、感覚または動きに関連した神経のいずれか）の障害（例えば、損傷、感染または疾患）は、反射発生的性機能（すなわち、刺激に対する不随意的な本能的生理学的応答）を低下させる可能性があり、また性的興奮を維持するために必要な触感を妨害し得る。さらに、脊髄病変は、病変の位置および重症度に依存して、様々な程度の性機能障害を生成し得る。
現在、これらの欠陥の原因となる神経細胞および関連した筋肉／器官を正確に標的化し、骨盤底の神経性障害に関連した症状を有する個体におけるより生理学的に正常な排尿、腸の制御、および性機能をもたらす可能性を有する、長期作用性の、コスト効率のある、または臨床的に有意義な良好な治療法はない。
本明細書全体を通して、刊行物（例えば科学論文）、特許出願、特許等が参照されるが、それらは全て、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書において、膀胱の筋肉を神経支配するニューロン、外尿道括約筋を神経支配するニューロン、外肛門括約筋を神経支配するニューロン、直腸の収縮を担う筋肉を神経支配するニューロン、および／または生殖器を神経支配するニューロンの過分極または脱分極が可能な、安定に発現した光応答性オプシンタンパク質の使用による、個体における膀胱機能障害、便失禁、および性機能障害の処置のための方法が提供され、ニューロンの過分極または脱分極誘発性シナプス欠乏は、ニューロンにより神経支配される筋肉の弛緩を誘発し、ニューロンの脱分極は、ニューロンにより神経支配された筋肉の収縮を誘発する。いくつかの実施形態において、排尿を可能にするための排尿筋の収縮および外尿道括約筋の弛緩は、ニューロンにおいて発現された光応答性オプシンタンパク質の１つ以上の活性化により誘発され得る。いくつかの実施形態において、尿の貯蔵を可能にするための排尿筋の弛緩および外尿道括約筋の収縮は、ニューロンにおいて発現された光応答性オプシンタンパク質の１つ以上の活性化により誘発され得る。いくつかの実施形態において、便の貯蔵を可能にするための外肛門括約筋の収縮は、ニューロンにおいて発現された光応答性オプシンタンパク質の１つ以上の活性化により誘発され得る。いくつかの実施形態において、排便を可能にするための外肛門括約筋の弛緩は、ニューロンにおいて発現された光応答性オプシンタンパク質の１つ以上の活性化により誘発され得る。さらに、排便は、ニューロンにおいて発現された光応答性オプシンタンパク質の１つ以上の活性化により誘発された、直腸の収縮を担う筋肉の同時の収縮により追加的に促進され得る。いくつかの実施形態において、性機能障害は、生殖器の筋肉および器官の神経支配を担うニューロンの脱分極を増加させることにより処置され得る。
したがって、いくつかの態様において、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発し、それにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、膀胱からの尿の排出を可能にし、ポリヌクレオチドは、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、本明細書で提供される。
いくつかの態様において、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発し、それにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、膀胱からの尿の排出を可能にし、ポリヌクレオチドは、配列番号：２３に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、本明細書で提供される。
いくつかの態様において、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発し、それにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、膀胱からの尿の排出を可能にし、ポリヌクレオチドは、配列番号：４に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、本明細書で提供される。
他の態様において、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏を誘発することができ、それにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏は、膀胱からの尿の排出を可能にし、ポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、本明細書で提供される。
また、いくつかの態様において、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、ニューロンの脱分極を誘発することができ、それにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンの脱分極は、膀胱からの尿の排出を可能にし、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの脱分極は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、ポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、本明細書で提供される。
他の態様において、処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発し、それにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、排便を可能にし、ポリヌクレオチドは、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、本明細書で提供される。
他の態様において、処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発し、それにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、排便を可能にし、ポリヌクレオチドは、配列番号：４に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、本明細書で提供される。
他の態様において、処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発し、それにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、排便を可能にし、ポリヌクレオチドは、配列番号：２３に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、本明細書で提供される。
さらに他の態様において、処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏を誘発することができ、それにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏は、排便を可能にし、ポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、本明細書で提供される。
別の態様において、処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、ニューロンの脱分極を誘発することができ、それにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの脱分極は、直腸内の便の貯蔵を可能にし、ポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法が、本明細書で提供される。
他の態様において、処置を必要とする個体における性機能障害を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、オプシンタンパク質は、個体の生殖器の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの脱分極を誘発し、それにより、生殖器の神経支配を担うニューロンの脱分極は、性機能を回復する方法が、本明細書で提供される。
別の態様において、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するためのキットであって、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキットが、本明細書で提供される。
別の態様において、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するためのキットであって、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：４に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキットが、本明細書で提供される。
別の態様において、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するためのキットであって、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：２３に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキットが、本明細書で提供される。
さらに他の態様において、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するためのキットであって、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される１つ以上の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキットが、本明細書で提供される。
別の態様において、処置を必要とする個体における便失禁を処置するためのキットであって、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキットが、本明細書で提供される。
さらに別の態様において、処置を必要とする個体における便失禁を処置するためのキットであって、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される１つ以上の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキットが、本明細書で提供される。
他の態様において、処置を必要とする個体における性機能障害を処置するためのキットであって、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される１つ以上の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキットが、本明細書で提供される。
背外側核（ＤＬＮ）を含む、脊髄の様々な切片を概略的に示す図である。 ＡＡＶコンストラクトコードオプシンを発現する外尿道括約筋（ＥＵＳ）陰部運動ニューロンの数を示す図である。 ＣｈＲ２を発現する陰部神経の光学的刺激を示す図である。 ＥＵＳの光遺伝学的制御の例示的実施形態を示す図である。
詳細な説明
本発明は、中でも、膀胱の充満および排尿、外肛門括約筋の収縮、ならびに／または生殖器の筋肉および器官の神経支配を決定付ける末梢神経細胞の電気的膜電位を選択的に改変することにより、個体における膀胱機能障害、便失禁、および／または性機能障害を処置するための方法を提供する。本発明者らは、これらの生理学的プロセスを担う筋肉および器官を神経支配する末梢神経細胞において安定に発現する１つ以上の光応答性オプシンタンパク質を使用して、正常な泌尿器、直腸、および性機能を妨げる疾患および状態を処置する方法を開発した。
排尿筋および外尿道括約筋（「外側尿道括約筋」とも呼ばれる）を神経支配する神経の膜分極状態の選択的制御は、膀胱が充満するのを可能とすると同時に、外尿道括約筋を「閉鎖」状態に維持させる。これは、それぞれ光応答性イオンポンプまたはカチオンチャネルの使用による、排尿筋神経支配の選択的過分極または脱分極誘発性シナプス欠乏、および、閉鎖状態に自然に脱分極する外尿道括約筋神経支配を可能とすることにより達成され得る。代替として、外尿道括約筋の神経制御が妨げられた、損傷した、または別様に括約筋を閉じるための十分な筋肉強度を生成することができない場合、光遺伝学的または従来の電気刺激方法を、排尿筋の光遺伝学的制御と組み合わせて使用して、外尿道括約筋を閉じることができる。
個体が、所定のスケジュールに従い排尿の衝動を感じる、または排尿したいと思った際、外尿道括約筋を支配する神経は、選択的に過分極されるか、または脱分極誘発性シナプス欠乏に供されて、括約筋を弛緩させると同時に、排尿筋の選択的過分極または脱分極誘発性シナプス欠乏を停止して、それを自然に脱分極および収縮させ、それにより尿を膀胱から押し出すことができる。しかしながら、排尿筋の神経支配が妨げられた、損傷した、または別様に膀胱を排尿させるための十分な筋肉強度を生成することができない場合、光遺伝学的または電気刺激方法を使用して、これらのニューロンの脱分極を活発化し、それにより、排尿筋を収縮させて、膀胱の内容物を排出させることができる。
したがって、本明細書において開示される方法は、日中および夜間の失禁、尿閉、尿路および膀胱感染、膀胱尿管逆流現象、水尿管腎盂、腎臓結石、腎機能障害、ならびに／または腎不全を含むがこれらに限定されない、膀胱機能障害（例えば、排尿筋過反射および排尿筋外括約筋協調不全）に関連した症状の多くを軽減または予防することができる。
外肛門括約筋を神経支配する神経の膜分極状態の選択的制御は、排便および直腸内の便の貯蔵を可能にする。これは、それぞれ光応答性イオンポンプまたはカチオンチャネルの使用による、外肛門括約筋神経支配の選択的過分極または脱分極誘発性シナプス欠乏により達成され得る。個体が、所定のスケジュールに従い排便の衝動を感じる、または排便したいと思った際、外肛門括約筋を神経支配する神経は、選択的に過分極されるか、または脱分極誘発性シナプス欠乏に供されて、自然に収縮した括約筋を弛緩させることができる。排便が完了したら、外肛門括約筋神経支配の光遺伝学的過分極または脱分極誘発性シナプス欠乏が停止することができ、外肛門括約筋はその自然の閉鎖状態に戻る。代替として、外肛門括約筋の神経制御が妨げられた、損傷した、または別様に括約筋を自然に閉じるための十分な筋肉強度を生成することができない場合、光遺伝学的または従来の電気刺激方法を使用して、外肛門括約筋を閉じることができる。さらに、便意抑制の制御は、直腸の神経支配の同時選択的脱分極によりさらに向上させ、直腸を収縮させ、その内容物を光遺伝学的に弛緩した外肛門括約筋内に、およびそれを通して押し出させることができる。したがって、本明細書において開示される方法は、便失禁を軽減または予防することができる。
男性および女性の両方の外性器を神経支配する神経の膜分極状態の選択的制御は、性機能の回復を可能にする。これは、光応答性カチオンチャネルの使用を介して、性機能、例えば、男性においては勃起、射精、またはオルガスム、および女性においては膣の潤滑またはオルガスムを制御するために、ならびに、性的興奮を維持するために必要な触感を回復するために、１つ以上の仙骨脊髄神経および／または陰部神経幹の構成要素の選択的脱分極により達成され得る。したがって、本明細書において開示される方法は、性機能を回復することができる。
一般的技術
本発明の実践は、別段に指定されない限り、当業者には周知である、排尿の分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、免疫学、生理学、泌尿器学、および病態生理学の従来の技術を使用する。そのような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，２００１）、（本明細書において併せて「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と呼ばれる）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７、２００１年の間の追補を含む）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（本明細書において併せて「Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ」と呼ばれる）、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；ならびにＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）等の文献において十分説明されている。他の有用な参考文献は、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ； Ｊ．Ｉｓｓｅｌｅａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．）、Ｃｏｒｃｏｓ ＆ Ｓｃｈｉｃｋｉｋ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ Ｂｌａｄｄｅｒ：Ａｄｕｌｔｓ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ．（Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，２００４）、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ’ｓ Ｕｒｏｌｏｇｙ，８ｔｈ ｅｄ．，（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００２），Ｆｅｃａｌ Ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，（Ｒａｔｔｏ ＆ Ｄｏｇｌｉｅｔｔｏ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００７）、およびＬｅｃｈｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｘｕａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ，Ｕｒｏｌｏｇｉｃ，ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９４）を含む。
定義
本明細書において使用される場合、「脱分極誘発性シナプス欠乏」は、神経細胞細胞膜の継続的脱分極が、神経伝達物質の末端小胞貯蔵の欠乏により神経細胞が遠心性標的に対する高頻度の作用を維持するのを防ぐ場合に生じる。
「個体」は、ヒトを含む哺乳動物であってもよい。哺乳動物は、家畜、スポーツ用動物、ペット、霊長類、マウスおよびラットを含むが、これらに限定されない。個体はまた、イヌおよびネコを含むがこれらに限定されない、コンパニオンアニマルを含む。一態様において、個体は、ヒトである。別の一態様において、個体は、ヒト以外の動物である。
天然タンパク質配列におけるアミノ酸置換は、「保存的」または「非保存的」であってもよく、そのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされたものであってもよく、またはそうでなくてもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学的に類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸で置き換える）。「非保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸を、芳香族側鎖を有するアミノ酸で置き換える）。標準的な２０個のアミノ酸「アルファベット」は、それらの側鎖の化学的特性に基づいて、化学ファミリーに分けられる。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族基を有する側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
本明細書において使用される場合、薬物、化合物、または薬学的組成物の「効果的な用量」または「効果的な量」は、有益または所望の結果を実現するのに十分な量である。予防的用途において、有益または所望の結果は、疾患、その合併症、および疾患の進行中に現れる中間的病理学的表現型の生化学的、組織学的および／または行動上の症状を含む、疾患のリスクの排除もしくは低減、重症度の低下、またはその発症の遅延等の結果を含む。治療的用途において、有益または所望の結果は、疾患から生じる１つ以上の症状の低減、疾患に罹患した人の生活の質の向上、疾患を処置するために必要な他の医薬品の用量の低減、標的化等による別の医薬品の効果の向上、疾患の進行の遅延、および／または生存期間の延長等の臨床結果を含む。効果的な用量は、単回または複数回の投与で投与され得る。本発明の目的において、薬物、化合物、または薬学的組成物の効果的な用量は、直接的または間接的に予防または治療処置を達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されるように、薬物、化合物、または薬学的組成物の効果的な用量は、別の薬物、化合物、または薬学的組成物と併せて達成されてもよく、または達成されなくてもよい。したがって、「効果的な用量」は、１種以上の治療薬剤の投与に関連して考慮され得、また、１種以上の他の薬剤と併せて、所望の結果が達成され得る、または達成される場合、単一薬剤が効果的な用量で与えられるものと考慮され得る。
本明細書において使用される場合、「処置」または「処置する」は、臨床結果を含む有益または所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的において、有益または所望の臨床結果は、疾患から生じる症状の低減、疾患に罹患した人の生活の質の向上、疾患を処置するために必要な他の医薬品の用量の低減、疾患の進行の遅延、および／または個体の生存期間の延長のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「仙骨脊髄神経」は、脊柱の５つの融合した仙骨の１つ（例えばＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、またはＳ５のいずれか）の近くから生じる、脊髄と身体との間の運動、感覚および自律神経シグナルを伝達する混合脊髄神経のいずれかを指す。
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段に指定されない限り、複数形の呼称を含む。
本明細書全体において示される全ての最大の数値限界は、より低い数値限界が本明細書において明示的に記載されるように、全てのそのようなより低い数値限界を含むことが意図される。本明細書全体において示される全ての最小の数値限界は、より高い数値限界が本明細書において明示的に記載されるように、全てのそのようなより高い数値限界を含むことが意図される。本明細書全体において示される全ての数値範囲は、より狭い数値範囲が全て本明細書において明示的に記載されるように、そのようなより広い数値範囲内に含まれる全てのそのようなより狭い数値範囲を含む。
膀胱生理学
健常個体の下部尿路は、尿が膀胱内に貯蔵される貯蔵段階、および尿が尿道を通して放出される場合に生じる排尿段階の２つの別個の活動段階を有する。この反射システムは、脳からの意識的シグナル、ならびに膀胱および尿道内に含有される感覚線維の発火率の両方により制御される（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ＆ Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒ，２００３，Ｒｅｖ．Ｕｒｏｌ．５（Ｓｕｐｐｌ ８）：Ｓ３−Ｓ１０）。平均的な人の膀胱は、３５０ｍｌから５５０ｍｌの尿を保持することができる。膀胱内の流体の体積が小さい場合、感覚受容器神経発火は低く、外尿道括約筋を神経支配する神経細胞の興奮および脱分極、ならびに膀胱を包囲する排尿筋の弛緩をもたらす（Ｂｌｏｋ ＆ Ｈｏｌｓｔｅｇｅ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，１６６（１）：９３−６）。膀胱がほぼ充満している場合、膀胱壁の内側を覆う伸張受容器が、求心性発火の増加を誘起し、尿意切迫の意識的感覚をもたらす。一般に、膀胱内に約２００ｍｌの尿がある場合、人は排尿の必要性を感じる。個体に排尿の準備が整った場合、彼または彼女は、意識的に排尿を開始し、膀胱の収縮および外尿道括約筋の弛緩が生じる。排尿は、膀胱が完全に空になるまで継続し、その時点で膀胱は弛緩して外尿道括約筋は収縮し、再び貯蔵を開始する。排尿反射を制御する筋肉は、自律神経系および体性神経系の両方により制御される。貯蔵段階中、内尿道括約筋は緊張し続け、排尿筋は交感神経刺激により弛緩する。排尿中、副交感神経刺激が、排尿筋を収縮させ、内尿道括約筋を弛緩させる。外尿道括約筋（ｓｐｈｉｎｃｔｅｒ ｕｒｅｔｈｒａｅとしても知られる）は、体性制御下にあり、排尿中意識的に弛緩される。
膀胱の神経因性機能障害は、最も多くは、中枢神経系または排尿の制御に関わる末梢神経の細胞の疾患または損傷により引き起こされる。排尿筋過反射（ＤＨ）および排尿筋外括約筋協調不全（ＤＳＤ）は、中枢神経系の排尿反射の制御の妨害から生じる２つの状態である。本明細書に記載の方法は、個体における膀胱機能障害の症状を軽減するために使用され得る。
排尿筋過反射
排尿筋肉（排尿筋、膀胱の筋固有層、および筋固有層としても知られる）は、膀胱を包囲し、排尿時に収縮して尿を搾り出す。それ以外では、弛緩し続けて膀胱を充満させる。排尿筋過反射は、排尿筋が異常収縮し、これによって膀胱が完全に空になるのが妨げられる、神経因性状態を指す。ＤＨの症状は、神経傷害の部位および性質に依存して、排尿筋活動低下から過活動まで様々である。例えば、「収縮性障害を伴う排尿筋過反射」（ＤＨＩＣ）は、過活動膀胱症状を指すが、排尿筋は完全な排尿を可能にするための十分な圧力を生成することができない。したがって、排尿筋は、適切な排尿が生じるための適正な収縮を有するには弱すぎる。この状態は、尿閉に類似しているが、刺激性の排尿症状が一般的である。さらに、「排尿筋無反射症」は、下位運動ニューロン障害（例えば、仙髄または末梢神経への）により排尿筋が完全に排尿することができないことを指す。
排尿筋過反射の原因は様々である。脳橋の上の領域内の脳への障害は、排尿主制御中枢を破壊し、排尿制御の完全な喪失をもたらす。しかしながら、下部尿路の原始排尿反射は、まだ無傷である。そのような損傷を保持する個体は、切迫性尿失禁（痙性膀胱とも呼ばれる）を示す。この場合、膀胱は速やかに空になり、多くの場合比較的少量の尿が残る。さらに、膀胱内の尿の貯蔵は困難であり、この問題を有する個体は、典型的には、洗面所に駆け込み、その目的地に到達する前に尿を漏らすこともある。多くの場合、この状態は、夜間に数回睡眠妨害をもたらし、個体は排尿の衝動を解放するために何度も移動することが必要となる。排尿筋過反射の症状をもたらし得る脳障害の典型例は、脳卒中、脳腫瘍、パーキンソン病、水頭症、脳性麻痺、および外傷性脳損傷を含むが、これらに限定されない。
脳橋と脊髄仙骨部との間の脊髄の疾患または損傷もまた、排尿筋過反射をもたらし得る。対麻痺または四肢麻痺をもたらす脊髄損傷を保持する個体は、典型的には下肢痙性を経験する。脊髄外傷後の最初の期間中、個体は、運動麻痺を伴う感覚の喪失を経験し、最初は喪失しているが、約６〜１２週間後、反射が徐々に回復する。神経系のこの緩やかな回復は、多くの場合、膀胱の排尿筋を含む罹患器官の過剰刺激をもたらす。脳障害を有する個体と同様に、脊髄外傷を受けた個体は、多くの場合切迫性尿失禁を経験する。スポーツ傷害または自動車に関連した事故に加えて、多発性硬化症（ＭＳ）もまた脊髄疾患の原因となり得る。さらに、生まれつき脊髄髄膜瘤を有する子供もまた、排尿筋過反射に関連した症状をもたらす神経因性膀胱を示し得る。本明細書において提供される排尿筋過反射を処置するための方法のいくつかの態様において、個体における排尿筋過反射を引き起こす神経系への損傷は、第２、第３、および／または第４仙骨脊髄神経（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４）の下に位置する神経細胞には生じない。
末梢神経障害をもたらす疾患もまた、排尿筋過反射に関連した症状を引き起こし得る。糖尿病およびＡＩＤＳは、膀胱の排尿筋を神経支配する神経を損傷または破壊し得、無症状および無痛の膀胱の膨張をもたらし得る。慢性糖尿病を有する患者は、膀胱が非代償性となる前にまず膀胱充満の感覚を失い得る。罹患した個体は、排尿に困難を有し、またＤＨＩＣを経験し得る。排尿筋過反射を引き起こし得る末梢神経系の疾患の他の限定されない例は、急性灰白髄炎、ギラン−バレー症候群、生殖肛門領域の重度ヘルペス、悪性貧血、および神経梅毒である。
排尿筋過反射は、膀胱機能を評価するために使用される膀胱内圧測定により診断される。圧力流試験は、排尿筋非収縮からＤＨを区別するための、患者の排尿中の排尿筋圧力の測定を含む。さらなる診断情報は、排尿日誌、検尿および培養、血漿電解質およびクレアチニンレベル、または排尿後残留（ＰＶＲ）尿体積の測定を含む腎尿路超音波から得ることができる。
排尿筋−外括約筋協調不全（ＤＳＤ）
この排尿障害は、排尿を試みる際に排尿筋の奇異性収縮と同時に外尿道括約筋が奇異性収縮を有し得ることを除き、排尿筋過反射と同様である。通常、排尿筋および外尿道括約筋は、一方が収縮している（例えば、貯蔵段階中の括約筋または排尿段階中の排尿筋）際に他方が弛緩する（例えば、排尿段階中の括約筋または貯蔵段階中の排尿筋）ように、相乗的に機能する。膀胱および外括約筋の両方が同時に収縮した場合、罹患した個体は、強い排尿の願望を感じるが、実際には少量しか排尿できない。これの医学用語は、膀胱および外括約筋が相乗的に機能していないため、排尿筋外括約筋協調不全である。膀胱は尿を押し出そうと試みても、外括約筋が締め付けて、尿が排出されるのを妨げる。
排尿筋および外尿道括約筋は両方とも、脊髄仙骨部から発生する神経により神経支配される。排尿筋は、仙骨脊髄神経から生じる副交感排尿筋神経支配により神経支配される。一方、外尿道括約筋は、陰部神経の外尿道括約筋神経支配により神経支配される。陰部神経は、仙骨神経叢から発生し、第２、第３および第４仙骨脊髄神経（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４）の腹側枝からその線維を伸ばしている。陰部神経は、梨状筋と尾骨筋との間を通過し、大坐骨孔の下部を通って骨盤から出る。次いでこれは坐骨棘と交差し、小坐骨孔を通って再び骨盤に入る。これは、坐骨直腸窩の側壁に沿って上方および前方に内陰部血管と同伴し、陰部神経管として知られる閉鎖筋膜の鞘内に収容される。陰部神経は、下直腸神経を出し、次いで、会陰神経および陰茎背神経（男性）または陰核背神経（女性）の２つの末梢枝に分岐する。下肛門神経は、大坐骨孔を通過してすぐに分岐する。本明細書において提供される排尿筋外括約筋協調不全を処置するための方法のいくつかの態様において、個体における排尿筋外括約筋協調不全を引き起こす神経系への損傷は、第２、第３、および／または第４仙骨脊髄神経（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４）の下に位置する神経細胞には生じない。
ＤＳＤは、まず、筋肉細胞の脱分極により生成された電位を測定する、尿道括約筋の筋電図検査（ＥＭＧ）トレースから診断される。ＤＳＤを確認し、他の生理学的または解剖学的な不規則性を特定するために、ビデオ尿流動態試験が使用される。
便失禁
便失禁（ＦＩ）は、腸の規則的な制御の喪失である。不随意的排泄および漏出が、罹患者に一般的に生じる。便失禁は、肛門括約筋を制御する神経または直腸内の便を検出する神経への損傷により引き起こされ得る。括約筋を制御する神経への損傷により、筋肉は効果的に機能することができなくなり得る。感覚神経が損傷すると、直腸内の便の検出が不能となり、手遅れになるまで排便の必要性を感じなくなる。神経損傷は、これらに限定されないが、出産、長期便秘、脳卒中、および神経変性を引き起こす疾患、例えば糖尿病および多発性硬化症により引き起こされ得る。脊髄への損傷もまた、便失禁をもたらし得る。さらに、直腸は通常伸長して、随意に放出されるまで便を保持するが、直腸手術、放射線処置、および炎症性腸疾患は、瘢痕を引き起こす可能性があり、これにより直腸壁が固くなり、弾力性がより低くなり得る。直腸壁は、それほど伸長することができず、便をあまり収容することができず、ＦＩへとつながる。炎症性腸疾患もまた、直腸壁を非常に刺激性とし、それにより便を収容することができなくなり得る。
肛門括約筋は、便が直腸内に溜まる際に肛門を閉鎖し続ける。最終的に、直腸壁への圧力が、内肛門括約筋を弛緩させ、一方で外肛門括約筋（ＥＡＳ）に対する意識的運動制御が、体内から肛門を通して便を排出させる。ＥＡＳは、楕円形状の筋肉線維の平坦面であり、肛門の縁を包囲する外皮に密着している。ＥＡＳは、他の筋肉と同様、常に緊張性収縮の状態にあり、拮抗筋を有さず、肛門管および肛門外口を閉鎖し続ける。さらに、ＥＡＳは、よりしっかりと肛門開口部を閉塞するように、意思の影響下でより強い収縮状態とすることができる。ＥＡＳは、第４仙骨脊髄神経（Ｓ４）からの枝により、および陰部神経の直腸（下部直腸としても知られる）枝により神経支配される。
性機能障害
性機能障害は、個体またはカップルが経験する、性欲、興奮またはオルガスムを含む通常の性的行為の任意の段階中の困難を指す。人が性機能障害を経験するようになり得る因子は数多くあり、これは、感情的または肉体的原因から生じ得る。例えば、性的行為は、薬物、アルコール、ニコチン、麻薬、興奮剤、降圧剤、抗ヒスタミン剤、およびいくつかの精神治療薬の使用等の肉体的因子により影響され得る。前立腺肥大の問題、血液供給の問題、および神経損傷（脊髄損傷の場合のように）のように、背中への損傷もまた性的行為に影響し得る。様々な器官系（例えば心臓および肺）の不全、内分泌障害（例えば、視床下部、甲状腺、下垂体、または副腎問題）、ホルモン欠乏（例えば、低テストステロン、エストロゲン、またはアンドロゲン）、ならびにいくつかの出生異常のように、糖尿病性神経障害、多発性硬化症、腫瘍、および稀に第３期梅毒等の疾患もまた、性的行為に影響し得る。
男性の場合、陰茎の皮膚は、陰部神経の最も深い分岐である陰茎背神経により神経支配されるが、これは坐骨枝に沿って内陰部動脈に同伴し、尿生殖隔膜筋膜の上層と下層との間を、恥骨下枝の縁に沿って前方に伸びる。女性の場合、陰核は、陰核背神経として知られる陰部神経の同様の枝により神経支配される。さらに、陰部神経は、球海綿体筋および坐骨海綿体筋、ならびに陰嚢（男性の場合）、会陰、および肛門の周囲の領域の神経支配において役割を担う。性交の間、性的絶頂時において、球海綿体筋および坐骨海綿体筋における痙攣が、男性において射精をもたらし、および両方の性においてオルガスムの経験に関連した外因感覚のほとんどをもたらす。
光応答性オプシンタンパク質
膀胱機能障害（例えばＤＨおよびＤＳＤ）に罹患した個体における排尿筋−括約筋相乗作用を効果的に回復するために、光応答性オプシンタンパク質により、排尿筋および外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンを選択的に過分極または脱分極するための光遺伝学に基づく方法が、本明細書で提供される。また、便失禁に罹患した個体における腸の制御を効果的に回復するために、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンを選択的に過分極または脱分極するための光遺伝学に基づく方法が、本明細書で提供される。さらに、性機能障害に罹患した個体における性機能を効果的に回復するために、光応答性オプシンタンパク質により、生殖器の筋肉および器官の神経支配を担うニューロンを選択的に脱分極するための光遺伝学に基づく方法が、本明細書で提供される。光遺伝学とは、自由に行動する哺乳動物および他の動物内であっても、生体組織の標的化細胞における特定の事象を制御するために使用される、遺伝子的および光学的方法の組み合わせを指し、機能する無傷の生体系に対応するためには時間精度（ミリ秒の時間スケール）が必要である。光遺伝学は、迅速光応答性チャネルまたはポンプタンパク質を、特定の標的化メカニズムの使用により細胞型分解能を維持しながらニューロン膜電位の時間的に正確な操作を可能にする標的神経細胞の細胞膜に導入することを必要とする。光に応答して神経細胞膜過分極または脱分極を促進するために使用され得る任意の微生物オプシンを使用することができる。例えば、光応答性塩化物ポンプのハロロドプシンファミリー（例えば、ＮｐＨＲ、ＮｐＨＲ２．０、ＮｐＨＲ３．０、ＮｐＨＲ３．１）およびＧｔＲ３プロトンポンプを使用して、光に応答して神経細胞膜過分極を促進することができる。別の例として、ｅＡＲＣＨ（プロトンポンプ）を使用して、光に応答して神経細胞膜過分極を促進することができる。さらに、光応答性カチオンチャネルタンパク質のチャネルロドプシンファミリーのメンバー（例えば、ＣｈＲ２、ＳＦＯ、ＳＳＦＯ、Ｃ１Ｖ１）を使用して、光刺激に応答して神経細胞膜脱分極または脱分極誘発性シナプス欠乏を促進することができる。
向上した細胞内輸送アミノ酸モチーフ
本開示は、哺乳動物細胞の細胞膜への輸送を向上させる１つ以上のアミノ酸配列モチーフの追加による、細胞内に発現する光応答性オプシンタンパク質の修飾を提供する。進化的により単純な生物から得られた成分を有する光応答性オプシンタンパク質は、哺乳動物細胞により発現もしくは許容されなくてもよく、または、哺乳動物細胞において高レベルで発現した場合、低下した細胞内局在性を示してもよい。その結果、いくつかの実施形態において、細胞内に発現した光応答性オプシンタンパク質は、シグナルペプチド、小胞体（ＥＲ）移行シグナル、膜輸送シグナル、および／またはＮ末端ゴルジ移行シグナルからなる群から選択される、１つ以上のアミノ酸配列モチーフに融合され得る。哺乳動物細胞の細胞膜への光応答性タンパク質輸送を向上させる１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、光応答性タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に融合され得る。任意に、光応答性タンパク質および１つ以上のアミノ酸配列モチーフは、リンカーにより隔てられてもよい。いくつかの実施形態において、光応答性タンパク質は、細胞膜へのタンパク質の輸送を向上させる輸送シグナル（ｔｓ）の追加により修飾され得る。いくつかの実施形態において、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列から得ることができる。他の実施形態において、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号：１２）を含み得る。
使用に好適な輸送配列は、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１（例えばＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号：１２））の輸送配列等のアミノ酸配列との、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
輸送配列は、約１０アミノ酸から約５０アミノ酸、例えば約１０アミノ酸から約２０アミノ酸、約２０アミノ酸から約３０アミノ酸、約３０アミノ酸から約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸から約５０アミノ酸の長さを有し得る。
使用に好適なシグナル配列は、以下のうちの１つ等のアミノ酸配列との、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
１）ｈＣｈＲ２のシグナルペプチド（例えば、ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰＶＶＶＮＧＳ（配列番号：１３））
２）ニューロンニコチン性アセチルコリン受容体のβ２サブユニットシグナルペプチド（例えば、ＭＡＧＨＳＮＳＭＡＬＦＳＦＳＬＬＷＬＣＳＧＶＬＧＴＥＦ（配列番号：１４））；
３）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列（例えば、ＭＧＬＲＡＬＭＬＷＬＬＡＡＡＧＬＶＲＥＳＬＱＧ（配列番号：１５））；および
４）ニコチン性アセチルコリン受容体シグナル配列（例えば、ＭＲＧＴＰＬＬＬＶＶＳＬＦＳＬＬＱＤ（配列番号：１６））。
シグナル配列は、約１０アミノ酸から約５０アミノ酸、例えば約１０アミノ酸から約２０アミノ酸、約２０アミノ酸から約３０アミノ酸、約３０アミノ酸から約４０アミノ酸、または約４０アミノ酸から約５０アミノ酸の長さを有し得る。
本開示の修飾オプシンにおける使用に好適な小胞体（ＥＲ）移行配列は、例えば、ＶＸＸＳＬ（Ｘは、任意のアミノ酸である）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号：１７）；ＶＬＧＳＬ（配列番号：１８）等）；ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号：１９）；ＦＸＹＥＮＥ（配列番号：２０）（Ｘは、任意のアミノ酸である）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：２１）等を含む。ＥＲ移行配列は、約５アミノ酸から約２５アミノ酸、例えば約５アミノ酸から約１０アミノ酸、約１０アミノ酸から約１５アミノ酸、約１５アミノ酸から約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸から約２５アミノ酸の長さを有し得る。
細胞の細胞膜への光応答性タンパク質輸送を向上させ得る追加的なタンパク質モチーフは、米国特許出願第１２／０４１，６２８号に開示されており、これは、参照により全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、タンパク質におけるシグナルペプチド配列は、欠失していてもよく、または異なるタンパク質からのシグナルペプチド配列と置換されてもよい。
光応答性塩化物ポンプ
本明細書で提供される方法のいくつかの態様において、光応答性塩化物ポンプのハロロドプシンファミリーの１つ以上のメンバーが、排尿筋および外尿道括約筋の神経支配を含む神経細胞の細胞膜上に発現する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上の光応答性塩化物ポンプは、１つ以上の仙骨脊髄神経を含む神経の細胞膜上に発現する。他の実施形態において、前記１つ以上の光応答性塩化物ポンプは、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配を含む神経の細胞膜上に発現する。別の実施形態において、前記１つ以上の光応答性塩化物ポンプは、陰部神経の細胞膜上に発現する。他の実施形態において、前記１つ以上の光応答性塩化物ポンプは、陰部神経の外尿道括約筋神経支配を含む神経の細胞膜上に発現する。
いくつかの態様において、上述の神経細胞の細胞膜上に発現した前記１つ以上の光応答性塩化物ポンプタンパク質は、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ ｐｈａｒａｏｎｉｓから得ることができる。いくつかの実施形態において、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、アンバー光および赤色光に応答することができ、光応答性塩化物ポンプタンパク質がアンバーまたは赤色光を照射された場合、神経細胞における過分極電流を媒介し得る。光応答性塩化物ポンプを活性化し得る光の波長は、約５８０ｎｍから６３０ｎｍの間であってもよい。いくつかの実施形態において、光は、約５８９ｎｍの波長であってもよく、または、光は、約６３０ｎｍを超える（例えば約７４０ｎｍ未満）の波長を有してもよい。別の実施形態において、光は、約６３０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態において、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、光の連続パルスに暴露された場合、神経細胞膜を少なくとも約９０分間過分極し得る。いくつかの実施形態において、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、配列番号：１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。さらに、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、光への感受性を増加もしくは減少させるため、特定波長の光への感受性を増加もしくは減少させるため、および／または細胞の細胞膜の分極状態を制御する、光応答性タンパク質の能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含み得る。いくつかの実施形態において、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含有する。いくつかの実施形態において、光応答性タンパク質は、１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有する。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失および／または挿入を含む光応答性タンパク質は、光に応答して神経細胞の細胞膜を過分極する能力を安定に維持する。
さらに、他の態様において、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、配列番号：１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）移行シグナルとを含み得る。このＥＲ移行シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されてもよく、または、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、リンカーによりコアアミノ酸配列に連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含み得る。リンカーは、さらに、蛍光タンパク質、例えば、これらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥ（配列番号：２０）（Ｘは、任意のアミノ酸であってもよい）を含み得る。別の実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬ（Ｘは、任意のアミノ酸であってもよい）を含み得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：２１）を含み得る。
本開示の修飾オプシンにおける使用に好適な小胞体（ＥＲ）移行配列は、例えば、ＶＸＸＳＬ（Ｘは、任意のアミノ酸である）（例えばＶＫＥＳＬ（配列番号：１７）；ＶＬＧＳＬ（配列番号：１８）等）；ＮＡＮＳＦＣＹＥＮＥＶＡＬＴＳＫ（配列番号：１９）；ＦＸＹＥＮＥ（Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号：２０）、例えばＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：２１）等を含む。ＥＲ移行配列は、約５アミノ酸から約２５アミノ酸、例えば約５アミノ酸から約１０アミノ酸、約１０アミノ酸から約１５アミノ酸、約１５アミノ酸から約２０アミノ酸、または約２０アミノ酸から約２５アミノ酸の長さを有し得る。
他の態様において、本明細書で提供される光応答性塩化物ポンプタンパク質は、細胞膜上に発現した光応答性タンパク質を含んでもよく、タンパク質は、配列番号：１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、輸送シグナル（例えば、細胞膜への光応答性塩化物ポンプタンパク質の輸送を向上させ得る）とを含む。輸送シグナルは、コアアミノ酸配列のＣ末端に融合されてもよく、または、コアアミノ酸配列のＮ末端に融合されてもよい。いくつかの実施形態において、輸送シグナルは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含み得るリンカーにより、コアアミノ酸配列に連結されてもよい。リンカーは、さらに、蛍光タンパク質、例えば、これらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列から得ることができる。他の実施形態において、輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号：１２）を含み得る。
いくつかの態様において、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、配列番号：１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナル、シグナルペプチド、および膜輸送シグナルからなる群から選択される、哺乳動物細胞の細胞膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ、またはそれ以上）のアミノ酸配列モチーフとを含み得る。いくつかの実施形態において、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ移行シグナル、およびＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結されてもよい。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含み得る。リンカーはまた、さらに、蛍光タンパク質、例えば、これらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、輸送シグナルよりもＣ末端側に位置し得る。他の実施形態において、輸送シグナルは、ＥＲ移行シグナルよりもＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列ＭＴＥＴＬＰＰＶＴＥＳＡＶＡＬＱＡＥ（配列番号：２２）を含む。別の実施形態において、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、配列番号：２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
さらに、他の態様において、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、配列番号：１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含んでもよく、配列番号：１のＮ末端シグナルペプチドは、欠失または置換されている。いくつかの実施形態において、他のシグナルペプチド（例えば他のオプシンからのシグナルペプチド）が使用され得る。光応答性タンパク質は、さらに、本明細書に記載のＥＲ輸送シグナルおよび／または膜輸送シグナルを含んでもよい。いくつかの実施形態において、光応答性塩化物ポンプタンパク質は、配列番号：３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、光応答性オプシンタンパク質は、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＮｐＨＲオプシンタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、さらに、小胞体（ＥＲ）移行シグナルおよび／または膜輸送シグナルを含む。例えば、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、小胞体（ＥＲ）移行シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列は、リンカーを介してＥＲ移行シグナルに連結している。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥ（配列番号：２０）（Ｘは、任意のアミノ酸であってもよい）を含む。別の実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＶＸＸＳＬ（Ｘは、任意のアミノ酸であってもよい）を含む。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：２１）を含む。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む。他の実施形態において、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む。他の実施形態において、ＮｐＨＲオプシンタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列と、膜輸送シグナルと、ＥＲ移行シグナルとを含む。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、ヒト内向き整流カリウムチャネルＫｉｒ２．１のアミノ酸配列から得られる。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号：１２）を含む。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、リンカーにより、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に連結される。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルは、リンカーを介してＥＲ移行シグナルに連結される。リンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含み得る。リンカーは、さらに、蛍光タンパク質、例えば、これらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、光応答性オプシンタンパク質は、さらに、Ｎ末端シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、光応答性オプシンタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光応答性オプシンタンパク質は、配列番号：３のアミノ酸配列を含む。
また、配列番号：１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む光応答性タンパク質等の、本明細書に記載の光応答性塩化物イオンポンプタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドが、本明細書で提供される。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号：２および配列番号：３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸をコードする配列を含む。ポリヌクレオチドは、発現ベクター（例えば、これらに限定されないが、本明細書に記載のウイルスベクター）内にあってもよい。ポリヌクレオチドは、光応答性塩化物イオンポンプタンパク質の発現に使用され得る。
光応答性塩化物ポンプタンパク質に関するさらなる開示は、米国特許出願公開第２００９／００９３４０３号および同第２０１０／０１４５４１８号、ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号に見出すことができ、それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
光応答性プロトンポンプ
本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、１つ以上の光応答性プロトンポンプが、排尿筋および外尿道括約筋の神経支配を含む神経細胞の細胞膜上に発現する。いくつかの実施形態において、１つ以上の光応答性プロトンポンプは、１つ以上の仙骨脊髄神経を含む神経の細胞膜上に発現する。他の実施形態において、１つ以上の光応答性プロトンポンプは、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配を含む神経の細胞膜上に発現する。別の実施形態において、１つ以上の光応答性プロトンポンプは、陰部神経の細胞膜上に発現する。他の実施形態において、１つ以上の光応答性プロトンポンプは、陰部神経の外尿道括約筋神経支配を含む神経の細胞膜上に発現する。
いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、青色光に応答することができ、Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａ ｔｈｅｔａから得ることができ、プロトンポンプタンパク質は、細胞が青色光を照射された場合、細胞における過分極電流を媒介することができてもよい。光は、約４５０ｎｍから約４９５ｎｍの間の波長を有してもよく、または、約４９０ｎｍの波長を有してもよい。別の実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、配列番号：４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。光応答性プロトンポンプタンパク質は、さらに、光への感受性を増加もしくは減少させるため、特定波長の光への感受性を増加もしくは減少させるため、および／または細胞の細胞膜の分極状態を制御する、光応答性プロトンポンプタンパク質の能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含み得る。さらに、光応答性プロトンポンプタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換および／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有し得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答して神経細胞の細胞膜を過分極する能力を安定に維持する。
本明細書において開示される方法の他の態様において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、配列番号：４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ移行シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択される、哺乳動物細胞の細胞膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ、またはそれ以上）のアミノ酸配列モチーフとを含み得る。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ＥＲ移行シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ移行シグナル、およびＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含み得る。リンカーは、さらに、蛍光タンパク質、例えば、これらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、輸送シグナルよりもＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルは、ＥＲ移行シグナルよりもＣ末端側に位置する。
また、配列番号：４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質等の、本明細書に記載の光応答性プロトンポンプタンパク質のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドが、本明細書で提供される。また、配列番号：４に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質等の、本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例えば本明細書に記載のウイルスベクター）が、本明細書で提供される。ポリヌクレオチドは、神経細胞（例えば、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配および陰部神経の外尿道括約筋神経支配を含む神経細胞）における光応答性タンパク質の発現に使用され得る。
光応答性プロトンポンプタンパク質に関するさらなる開示は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２８８９３号に見出すことができ、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、緑色または黄色光に応答することができ、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ ｓｏｄｏｍｅｎｓｅから得ることができ、プロトンポンプタンパク質は、細胞が緑色または黄色光を照射された場合、細胞における過分極電流を媒介することができてもよい。光は、約５６０ｎｍから約５７０ｎｍの間の波長を有してもよく、または、約５６６ｎｍの波長を有してもよい。別の実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、配列番号：２３に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。光応答性プロトンポンプタンパク質は、さらに、光への感受性を増加もしくは減少させるため、特定波長の光への感受性を増加もしくは減少させるため、および／または細胞の細胞膜の分極状態を制御する、光応答性プロトンポンプタンパク質の能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含み得る。さらに、光応答性プロトンポンプタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換および／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有し得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答して神経細胞の細胞膜を過分極する能力を安定に維持する。
本明細書において開示される方法の他の態様において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、配列番号：２３に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列と、シグナルペプチド、ＥＲ移行シグナル、および膜輸送シグナルからなる群から選択される、哺乳動物細胞の細胞膜への輸送を向上させる少なくとも１つ（例えば１つ、２つ、３つ、またはそれ以上）のアミノ酸配列モチーフとを含み得る。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ＥＲ移行シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチド、Ｃ末端ＥＲ移行シグナル、およびＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、光応答性プロトンポンプタンパク質は、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端輸送シグナルを含む。いくつかの実施形態において、Ｃ末端ＥＲ移行シグナルおよびＣ末端輸送シグナルは、リンカーにより連結される。リンカーは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、または５００アミノ酸の長さのいずれかを含み得る。リンカーは、さらに、蛍光タンパク質、例えば、これらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、またはシアン蛍光タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナルは、輸送シグナルよりもＣ末端側に位置する。いくつかの実施形態において、輸送シグナルは、ＥＲ移行シグナルよりもＣ末端側に位置する。
また、配列番号：２３に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質等の、本明細書に記載の光応答性プロトンポンプタンパク質のいずれかをコードする単離ポリヌクレオチドが、本明細書で提供される。また、配列番号：２３に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるコアアミノ酸配列を含む光応答性プロトンポンプタンパク質等の、本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例えば本明細書に記載のウイルスベクター）が、本明細書で提供される。ポリヌクレオチドは、神経細胞（例えば、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配および陰部神経の外尿道括約筋神経支配を含む神経細胞）における光応答性タンパク質の発現に使用され得る。
光応答性カチオンチャネルタンパク質
本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、１つ以上の光応答性カチオンチャネルが、排尿筋および外尿道括約筋の神経支配を含む神経細胞の細胞膜上に発現し得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の光応答性カチオンチャネルが、１つ以上の仙骨脊髄神経（例えばＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、および／またはＳ５のいずれか）の細胞膜上に発現し得る。他の実施形態において、１つ以上の光応答性カチオンチャネルが、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配を含む神経の細胞膜上に発現し得る。別の実施形態において、１つ以上の光応答性カチオンチャネルは、陰部神経の細胞膜上に発現し得る。他の実施形態において、１つ以上の光応答性カチオンチャネルは、陰部神経の外尿道括約筋神経支配を含む神経の細胞膜上に発現し得る。
いくつかの態様において、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉから得ることができ、カチオンチャネルタンパク質は、細胞が光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介することができてもよい。別の実施形態において、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、配列番号：５に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉから得られた光応答性カチオンチャネルタンパク質を活性化させるために使用される光は、約４６０ｎｍから約４９５ｎｍの間の波長を有してもよく、または、約４８０ｎｍの波長を有してもよい。さらに、光は、少なくとも約１００Ｈｚの強度を有してもよい。いくつかの実施形態において、１００Ｈｚの強度を有する光によるＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉから得られた光応答性カチオンチャネルの活性化は、光応答性カチオンチャネルを発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらし得る。光応答性カチオンチャネルタンパク質は、さらに、光への感受性を増加もしくは減少させるため、特定波長の光への感受性を増加もしくは減少させるため、および／または細胞の細胞膜の分極状態を制御する、光応答性カチオンチャネルタンパク質の能力を増加もしくは減少させるために、天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含み得る。さらに、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、１つ以上の保存的アミノ酸置換および／または１つ以上の非保存的アミノ酸置換を含有し得る。天然アミノ酸配列に導入された置換、欠失、および／または挿入を含む光応答性プロトンポンプタンパク質は、光に応答して神経細胞の細胞膜を脱分極する能力を安定に維持する。
いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャネルは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャネルは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャネルは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャネルは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャネルは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換およびＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャネルは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換およびＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャネルは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換、およびＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャネルは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＴ１５９Ｃ置換、Ｌ１３２Ｃ置換、およびＥ１２３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャネルは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換およびＥ１２３Ｔ置換を含む。いくつかの実施形態において、光応答性カチオンチャネルは、配列番号：５に記載のアミノ酸配列のＬ１３２Ｃ置換およびＥ１２３Ａ置換を含む。
光応答性カチオンチャネルタンパク質に関するさらなる開示は、米国特許出願公開第２００７／００５４３１９号ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１３１８３７号および同第ＷＯ２００７／０２４３９１号に見出すことができ、それぞれの開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
階段関数オプシンおよび安定化階段関数オプシン
他の実施形態において、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、タンパク質のレチナール結合ポケット全体の主要位置における特定アミノ酸置換を有し得る、階段関数オプシン（ＳＦＯ）タンパク質または安定化階段関数オプシン（ＳＳＦＯ）タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号：５のアミノ酸残基Ｃ１２８に突然変異を有してもよい。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号：５におけるＣ１２８Ａ突然変異を有する。他の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号：５におけるＣ１２８Ｓ突然変異を有する。別の実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号：５におけるＣ１２８Ｔ突然変異を有する。いくつかの実施形態において、ＳＦＯタンパク質は、配列番号：６に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号：５のアミノ酸残基Ｄ１５６に突然変異を有し得る。他の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号：５のアミノ酸残基Ｃ１２８およびＤ１５６の両方に突然変異を有し得る。一実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号：５におけるＣ１２８ＳおよびＤ１５６Ａ突然変異を有する。別の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号：７に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。別の実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号：５におけるＣ１２８Ｔ突然変異を含み得る。いくつかの実施形態において、ＳＳＦＯタンパク質は、配列番号：５におけるＣ１２８ＴおよびＤ１５６Ａ突然変異を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質は、細胞が青色光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介することができてもよい。他の実施形態において、光は、約４４５ｎｍの波長を有してもよい。さらに、光は、約１００Ｈｚの強度を有してもよい。いくつかの実施形態において、１００Ｈｚの強度を有する光によるＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質の活性化は、ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらし得る。いくつかの実施形態において、開示される階段関数オプシンおよび安定化階段関数オプシンタンパク質は、光に応答した神経細胞の膜の脱分極における使用のための特定の特性および特徴を有し得る。
ＳＦＯまたはＳＳＦＯタンパク質に関するさらなる開示は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０５６９７０号および米国仮特許出願第６１／４１０，７０４?号および同第６１／５１１，９０５号に見出すことができ、それぞれの開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
Ｃ１Ｖ１キメラカチオンチャネル
他の実施形態において、光応答性カチオンチャネルタンパク質は、Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉのＶＣｈＲ１タンパク質およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉからのＣｈＲ１タンパク質から得られたＣ１Ｖ１キメラタンパク質であってもよく、タンパク質は、ＣｈＲ１の第１および第２膜貫通へリックスにより置き換えられた少なくとも第１および第２膜貫通へリックスを有する、ＶＣｈＲ１のアミノ酸配列を含み、光応答性であり、細胞が光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、さらに、キメラ光応答性タンパク質の第２および第３膜貫通へリックスの間に位置する細胞内ループドメイン内に置き換えを含んでもよく、細胞内ループドメインの少なくとも一部は、ＣｈＲ１からの対応する部分により置き換えられている。別の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの一部は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ａ１４５に延在するＣｈＲ１からの対応する部分と置き換えられてもよい。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、さらに、キメラ光応答性タンパク質の第３の膜貫通ヘリックス内に置き換えを含んでもよく、第３の膜貫通へリックスの少なくとも一部は、ＣｈＲ１の対応する配列により置き換えられている。さらに別の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質の細胞内ループドメインの一部は、ＣｈＲ１のアミノ酸残基Ｗ１６３に延在するＣｈＲ１からの対応する部分と置き換えられてもよい。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、配列番号：８に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、細胞が緑色光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介することができる。他の実施形態において、光は、約５４０ｎｍから約５６０ｎｍの間の波長を有してもよい。いくつかの実施形態において、光は、約５４２ｎｍの波長を有してもよい。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、細胞が紫色光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介することができない。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介することができない。さらに、光は、約１００Ｈｚの強度を有してもよい。いくつかの実施形態において、１００Ｈｚの強度を有する光によるＣ１Ｖ１キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらし得る。いくつかの実施形態において、開示されるＣ１Ｖ１キメラタンパク質は、光に応答した神経細胞の膜の脱分極における使用のための特定の特性および特徴を有し得る。
Ｃ１Ｖ１キメラ突然変異体
いくつかの態様において、本開示は、置換または突然変異アミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、突然変異ポリペプチドは、前駆体Ｃ１Ｖ１キメラポリペプチドの特徴的な光活性化の本質を維持するが、いくつかの特定の態様において改変された特性も有し得る。例えば、本明細書に記載の突然変異光応答性Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、動物細胞内または動物細胞膜上の両方での増加した発現レベル、異なる波長の光、特に赤色光に暴露された際の改変された応答性、ならびに／または、キメラＣ１Ｖ１ポリペプチドが低脱感作、迅速不活性化、他の光応答性カチオンチャネルとの最小限の交差活性のための低紫色光活性化、および／もしくは動物細胞における強い発現の特性を有する形質の組み合わせを示すことができる。
したがって、キメラポリペプチドのＶＣｈＲ１部分のレチナール結合ポケット全体の主要位置における特定アミノ酸置換を有し得る、Ｃ１Ｖ１キメラ光応答性オプシンタンパク質が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号：７のアミノ酸残基Ｅ１２２に突然変異を有し得る。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号：７のアミノ酸残基Ｅ１６２に突然変異を有し得る。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号：７のアミノ酸残基アミノ酸残基Ｅ１６２およびＥ１２２の両方に突然変異を有し得る。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は、配列番号：９、配列番号：１０、または配列番号：１１に示される配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、開示される突然変異Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質は、光に応答した動物細胞の膜の脱分極における使用のための特定の特性および特徴を有し得る。
いくつかの態様において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２突然変異キメラタンパク質は、細胞が光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、光は、緑色光であってもよい。他の実施形態において、光は、約５４０ｎｍから約５６０ｎｍの間の波長を有してもよい。いくつかの実施形態において、光は、約５４６ｎｍの波長を有してもよい。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２突然変異キメラタンパク質は、細胞が赤色光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、赤色光は、約６３０ｎｍの波長を有してもよい。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２突然変異キメラタンパク質は、細胞が紫色光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介しない。さらに、光は、約１００Ｈｚの強度を有してもよい。いくつかの実施形態において、１００Ｈｚの強度を有する光によるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２突然変異キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２突然変異キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらし得る。いくつかの実施形態において、開示されるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２突然変異キメラタンパク質は、光に応答した神経細胞の膜の脱分極における使用のための特定の特性および特徴を有し得る。
他の態様において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質は、細胞が光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、光は、緑色光であってもよい。他の実施形態において、光は、約５３５ｎｍから約５４０ｎｍの間の波長を有してもよい。いくつかの実施形態において、光は、約５４２ｎｍの波長を有してもよい。他の実施形態において、光は、約５３０ｎｍの波長を有してもよい。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質は、細胞が紫色光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介しない。さらに、光は、約１００Ｈｚの強度を有してもよい。いくつかの実施形態において、１００Ｈｚの強度を有する光によるＣ１Ｖ１−Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらし得る。いくつかの実施形態において、開示されるＣ１Ｖ１−Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質は、光に応答した神経細胞の膜の脱分極における使用のための特定の特性および特徴を有し得る。
さらに他の態様において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質は、細胞が光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介することができる。いくつかの実施形態において、光は、緑色光であってもよい。他の実施形態において、光は、約５４０ｎｍから約５６０ｎｍの間の波長を有してもよい。いくつかの実施形態において、光は、約５４６ｎｍの波長を有してもよい。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質は、細胞が紫色光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、細胞が約４０５ｎｍの波長を有する光を照射された場合、細胞における脱分極電流を媒介しない。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質は、紫色光に暴露された場合、Ｅ１２２／Ｅ１６２における突然変異を有さないＣ１Ｖ１キメラタンパク質、または他の光応答性カチオンチャネルタンパク質に比べて少ない活性化を示し得る。さらに、光は、約１００Ｈｚの強度を有してもよい。いくつかの実施形態において、１００Ｈｚの強度を有する光によるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質の活性化は、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらし得る。いくつかの実施形態において、開示されるＣ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２突然変異キメラタンパク質は、光に応答した神経細胞の膜の脱分極における使用のための特定の特性および特徴を有し得る。
Ｃ１Ｖ１キメラカチオンチャネルおよびその突然変異体に関するさらなる開示は、米国仮特許出願第６１／４１０，７３６号、同第６１／４１０，７４４号および同第６１／５１１，９１２号に見出すことができ、それぞれの開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
ポリヌクレオチド
本開示はまた、本明細書に記載の光応答性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現カセットを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、上述の核酸を含むベクターである。いくつかの実施形態において、本開示の光応答性タンパク質をコードする核酸は、プロモーターに作用可能に連結する。プロモーターは、当該技術分野において周知である。宿主細胞内で機能する任意のプロモーターが、本開示の光応答性オプシンタンパク質および／またはその任意の変異体の発現に使用され得る。一実施形態において、光応答性オプシンタンパク質の発現を活発化するために使用されるプロモーターは、運動ニューロンに特異的なプロモーターであってもよい。他の実施形態において、プロモーターは、交感神経および／または副交感神経系の両方のニューロンにおいて光応答性オプシンタンパク質の発現を活発化することができる。特定の動物細胞における光応答性オプシンタンパク質またはその変異体の発現の活発化に有用である開始制御領域またはプロモーターは、数多くあり、当業者によく知られている。これらの核酸を活発化することができる事実上いかなるプロモーターも、使用することができる。運動ニューロン特異的遺伝子の例は、例えば、Ｋｕｄｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０，１９（１６）：３２３３−３２５３に見出すことができ、その内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、光応答性タンパク質の発現を活発化するために使用されるプロモーターは、中枢および末梢神経系の両方のニューロンにおける導入遺伝子の確実な発現を活発化することができるＴｈｙ１プロモーターであってもよい。（例えば、Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６（１０）：１１６１−１１６６を参照されたい）。他の実施形態において、光応答性タンパク質の発現を活発化するために使用されるプロモーターは、ＥＦ１αプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシン−Ｉプロモーター（例えば、ヒトシナプシン−Ｉプロモーター）、ヒトシヌクレイン１プロモーター、ヒトＴｈｙ１プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩアルファ（ＣＡＭＫＩＩα）プロモーター、または、哺乳動物の末梢ニューロンにおける光応答性オプシンタンパク質の発現を活発化することができる任意の他のプロモーターであってもよい。
また、本明細書に記載の光応答性タンパク質またはその任意の変異体をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが、本明細書で提供される。本発明に従い投与され得るベクターはまた、ベクターのポリヌクレオチドから転写された場合に標的動物細胞の細胞膜上での光応答性オプシンタンパク質の蓄積をもたらすＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む。使用され得るベクターは、これらに限定されないが、レンチウイルス、ＨＳＶ、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。レンチウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＡＶを含むが、これらに限定されない。レンチウイルスは、ＶＳＶ、狂犬病、Ｍｏ−ＭＬＶ、バキュロウイルスおよびエボラを含むがこれらに限定されない他のウイルスのエンベロープタンパク質を有する偽型であってもよい。そのようなベクターは、当該技術分野における標準的方法を使用して調製され得る。
いくつかの実施形態において、ベクターは、組み換えＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、感染する細胞のゲノム内に安定的および部位特異的に組み込まれ得る、比較的小さいサイズのＤＮＡウイルスである。ＡＡＶベクターは、細胞増殖、形態または分化にいかなる影響も誘発することなく広範なスペクトルの細胞に感染することができ、また人体病理学に関与しないようである。ＡＡＶゲノムは、クローニング、配列決定および特性決定されている。ＡＡＶゲノムは、約４７００の塩基を包含し、各末端に、ウイルスの複製起源として機能する約１４５塩基の逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域を含有する。ゲノムの残りは、カプシド形成機能を保持する２つの必須領域：ウイルス複製およびウイルス遺伝子の発現に関与するｒｅｐ遺伝子を含有するゲノムの左側部分、ならびにウイルスのカプシドタンパク質をコードするｃａｐ遺伝子を含有するゲノムの右側部分に分けられる。
ＡＡＶベクターは、当該技術分野における標準的方法を使用して調製され得る。任意の血清型のアデノ関連ウイルスが好適である（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，ｐｐ．１６５−１７４ ｏｆ “Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ” Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．（１９８８）；Ｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１，１９７４；Ｐ．Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌ “Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ” Ｉｎ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＪＲ Ｋｅｒｒ，ＳＦ Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ５−１４，Ｈｕｄｄｅｒ Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）；およびＤＥ Ｂｏｗｌｅｓ，ＪＥ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，ＲＪ Ｓａｍｕｌｓｋｉ “Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ”（ＪＲ Ｋｅｒｒ，ＳＦ Ｃｏｔｍｏｒｅ．ＭＥ Ｂｌｏｏｍ，ＲＭ Ｌｉｎｄｅｎ，ＣＲ Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｅｄｓ．）ｐ１５−２３，Ｈｕｄｄｅｒ Ａｒｎｏｌｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ（２００６）を参照されたく、それぞれの開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。ベクターを精製するための方法は、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号、同第６，９８９，２６４号、および同第６，９９５，００６号、ならびに第ＷＯ／１９９９／０１１７６４号、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ」に見出すことができ、それらの開示は、参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。バキュロウイルス系におけるＡＡＶベクターの調製方法は、例えば、第ＷＯ２００８／０２４９９８号に記載されている。ＡＡＶベクターは、自己相補的または一本鎖であってもよい。ハイブリッドベクターの調製は、例えば、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２７０９１号に記載されており、その開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。遺伝子をインビトロおよびインビボで導入するためのＡＡＶから得られたベクターの使用が説明されている（例えば、国際特許出願公開第９１／１８０８８号および同第ＷＯ９３／０９２３９号、米国特許第４，７９７，３６８号、同第６，５９６，５３５号、および同第５，１３９，９４１号、ならびに欧州特許第０４８８５２８号を参照されたく、これらは全て、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。これらの刊行物は、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子が欠失し、対象遺伝子により置き換えられている様々なＡＡＶ由来コンストラクト、および対象遺伝子をインビトロで（培養細胞中に）、またはインビボで（直接生物内に）導入するためのこれらのコンストラクトの使用を説明している。本開示による複製欠陥組み換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域が隣接した対象核酸配列を含有するプラスミド、およびＡＡＶカプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を保持するプラスミドを、ヒトへルパーウイルス（例えばアデノウイルス）に感染した細胞株に同時トランスフェクトすることにより調製され得る。生成されたＡＡＶ組み換え体は、次いで標準的技術により精製される。
いくつかの実施形態において、本開示の方法における使用のためのベクター（複数を含む）は、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、およびＡＡＶ１６を含むがこれらに限定されないＡＡＶウイルス粒子）にカプシド形成される。したがって、本開示は、本明細書に記載のベクターのいずれかを含む組み換えウイルス粒子（組み換えポリヌクレオチドを含有するため、組み換え体）を含む。そのような粒子を生成する方法は、当該技術分野において知られており、米国特許第６，５９６，５３５号に記載されており、その開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
光応答性オプシンタンパク質の送達
いくつかの態様において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、当該技術分野において知られている神経外科技術を使用して、例えば定位的注入（例えば、Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７３：３４２４３４２９，１９９９；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７：３４２８−３４３２，２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９−２２３，１９９３；およびＡｌｉｓｋｙ ＆ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：２３１５−２３２９，２０００を参照されたく、それぞれの内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）または蛍光透視法により、針、カテーテル、または関連デバイスを用いて、排尿筋の神経支配を担うニューロンおよび／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンに直接送達され得る。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、１つ以上の仙骨脊髄神経（例えば、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、および／またはＳ５のいずれか）の体性運動ニューロン細胞体へのポリヌクレオチドの注入により、排尿筋の神経支配を担うニューロンに送達され得る。他の実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、陰部神経へのポリヌクレオチドの注入により、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンに送達され得る。別の実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、オヌフ核へのポリヌクレオチドの注入により、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンに送達され得る。
いくつかの態様において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、当該技術分野において知られている神経外科的技術を使用して、例えば定位的注入または蛍光透視法により、針、カテーテル、または関連デバイスを用いて、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンに直接送達され得る。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、仙骨脊髄神経（例えば、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、および／またはＳ５のいずれか）の体性運動ニューロン細胞体へのポリヌクレオチドの注入により、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンに送達され得る。他の実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、陰部神経へのポリヌクレオチドの注入により、またはオヌフ核へのポリヌクレオチドの注入により、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンに送達され得る。他の実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、仙骨脊髄神経（例えば、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、および／またはＳ５のいずれか）の体性運動ニューロン細胞体へのポリヌクレオチドの注入により、または下下腹神経叢へ注入により、直腸の神経支配を担うニューロンに送達され得る。
いくつかの態様において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、当該技術分野において知られている神経外科的技術を使用して、例えば定位的注入または蛍光透視法により、針、カテーテル、または関連デバイスを用いて、男性および女性の生殖器の筋肉および器官の神経支配を担うニューロンに直接送達され得る。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、仙骨脊髄神経（例えば、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、および／またはＳ５のいずれか）の体性運動ニューロン細胞体へのポリヌクレオチドの注入により、男性および女性の生殖器の筋肉および器官の神経支配を担うニューロンに送達され得る。他の実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、陰部神経へのポリヌクレオチドの注入により、またはオヌフ核へのポリヌクレオチドの注入により、男性および女性の生殖器の筋肉および器官の神経支配を担うニューロンに送達され得る。
また、これらに限定されないが、イオン性脂質もしくはポリマーによるトランスフェクション、電気穿孔、光学的トランスフェクション、インペールフェクション、または遺伝子銃等の、対象神経に光応答性オプシンタンパク質を送達するための他の方法が使用されてもよい。
別の態様において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、膀胱の排尿筋および／または外尿道括約筋の収縮を担う筋肉に直接送達され得る。特定の筋肉を神経支配する特定細胞体へのウイルスベクターの直接的注入に内在する制限のため、研究者は、ウイルスベクターを筋肉内に直接注入することによる末梢ニューロンへの導入遺伝子の送達を試みてきた。これらの実験は、アデノウイルス、ＡＡＶ２、および狂犬病糖タンパク質−偽型レンチウイルス等のいくつかのウイルス血清型が、筋肉細胞により取り込まれ、神経筋シナプスを介して運動ニューロンに逆行的に輸送され得ることを示した（例えば、Ａｚｚｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．，１１（７）：１５２３−３４；Ｋａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０１（５６３４）：８３９−８４２；Ｍａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，７（４）：３２９−３３４を参照されたく、それぞれの開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、外尿道括約筋の収縮を担う筋肉へのポリヌクレオチド発現ベクターの直接的注入により、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンに送達され得る。別の実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、排尿筋へのポリヌクレオチド発現ベクターの直接的注入により、排尿筋の神経支配を担うニューロンに送達され得る。他の実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、外肛門括約筋の収縮を担う筋肉へのポリヌクレオチド発現ベクターの直接的注入により、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンに送達され得る。他の実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、直腸の収縮を担う筋肉へのポリヌクレオチド発現ベクターの直接的注入により、直腸の神経支配を担うニューロンに送達され得る。さらに別の実施形態において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＡＶベクター）は、陰茎の球海綿体筋および坐骨海綿体筋、陰茎の皮膚、永続的筋肉（ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ）、または陰核を含むがこれらに限定されない、正常性機能を担う筋肉および器官へのポリヌクレオチド発現ベクターの直接的注入により、男性および女性の生殖器の神経支配を担うニューロンに送達され得る。
光源および電源
本開示のいくつかの態様において、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質は、光応答性オプシンタンパク質を発現する神経線維、あるいは膀胱、外尿道括約筋、外肛門括約筋、直腸、および／または男性もしくは女性の生殖器の筋肉を制御する神経の周囲または近くに設置される、移植型光源（例えばライトカフ）または移植型電極により活性化され得る。神経の電気刺激における使用のためにそれらの神経の周囲または近くに外科的に設置される電極カフおよび電極は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，６０２，６２４号、同第７，１４２，９２５号および同第６，６００，９５６号、ならびに米国特許出願公開第２００８／０１７２１１６号および同第２０１０／００９４３７２号を参照されたく、それぞれの開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の光源（例えばライトカフ）または電極は、当該技術分野において知られているように、任意の有用な組成物または組成物の混合物、例えば白金またはステンレススチールを含んでもよく、本明細書において開示される光応答性オプシンタンパク質、あるいは、膀胱、外尿道括約筋、外肛門括約筋、および／または男性もしくは女性の生殖器の筋肉および器官を制御する神経を刺激するための任意の有用な構成のものであってもよい。
電極または移植型光源（例えばライトカフ）は、神経、例えば、これらに限定されないが、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配、陰部神経の外尿道括約筋神経支配、仙骨脊髄神経から生じる外肛門括約筋神経支配および／または陰部神経から生じる下直腸神経（下部直腸神経としても知られる）、仙骨脊髄神経から生じる直腸の神経支配、および／また下下腹神経叢、陰部神経から生じる陰茎背神経、および／または陰部神経から生じる陰核背神経の周囲または近くに設置され得る。上述の筋肉および／または器官の神経支配を担う神経線維は、当該技術分野における既知の技術を使用して電極または移植型光源を神経の周囲または近くに設置する前に、臨床医学者により特定され得る。例えば、電極または移植型光源の正確な設置を確実とするために、神経線維が短い電気パルスにより刺激されて、前記電気刺激により引き起こされた筋肉収縮の位置が観察されてもよい。電極または移植型光源は、特に、仙骨神経根（そこから陰部神経が発生する）から離れた陰部神経幹またはその求心性もしくは遠心性枝上で、下部尿路、腸、会陰および生殖器の筋肉および器官を神経支配する陰部神経と共に使用されるのに十分適している。陰部神経幹およびその枝は、仙骨神経根および脊柱から離間している。結果として、それらは、身体の正面から外科的に到達可能であり、脊柱上、脊柱内、もしくは脊柱付近における複雑な外科手術、または付随する背部神経根切断を必要としない。別の実施形態において、光源は、所望の神経標的の前根の近くに設置されてもよい。別の実施形態において、光源は、外科的に露出した所望の神経標的の近くに設置された光ファイバーケーブルを含む。
いくつかの実施形態において、移植型光源（例えばライトカフ）は、神経を完全には包囲しないが、Ｕ字形状を有し得る。別の実施形態において、移植型光源は、移植型光源（例えばライトカフ）を神経線維（例えば、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配および／または陰部神経の外尿道括約筋神経支配）にガイドするために使用され得る取付アームを有し得る。取付アームは、光源の移植後に取り外してもよく、または、光源の位置を対象神経線維に近接して固定するために留置してもよい。
移植型光源（例えばライトカフ）は、内部本体を備えてもよく、内部本体は、電源に組み付けられた少なくとも１つの光生成手段を有する。いくつかの実施形態において、電源は、光生成手段に電力供給するための内蔵電池であってもよい。別の実施形態において、移植型光源は、光生成手段への電力供給のための外部源から無線伝送された電磁エネルギーを受信するための外部アンテナを備えてもよい。無線伝送された電磁エネルギーは、ラジオ波、マイクロ波、または移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段に電力供給するために外部源から伝送され得る他の任意の電磁エネルギー源であってもよい。一実施形態において、光生成手段は、半導体または当該技術分野において知られた他のプロセスを使用して製造された集積回路により制御される。
いくつかの態様において、光手段は、発光ダイオード（ＬＥＤ）であってもよい。いくつかの実施形態において、ＬＥＤは、青色および／または緑色光を生成してもよい。他の実施形態において、ＬＥＤは、アンバーおよび／または黄色光を生成してもよい。いくつかの実施形態において、いくつかのマイクロＬＥＤが、移植型光源（例えばライトカフ）の内部本体内に埋め込まれる。他の実施形態において、光生成手段は、固体レーザダイオードまたは光を生成し得る他の任意の手段である。光生成手段は、光源（例えばライトカフ）に近接した神経の細胞膜上の光応答性オプシンタンパク質を活性化するのに十分な強度を有する光を生成し得る。いくつかの実施形態において、光生成手段は、端点を含む約０．０５ｍＷ／ｍｍ２、０．１ｍＷ／ｍｍ２、０．２ｍＷ／ｍｍ２、０．３ｍＷ／ｍｍ２、０．４ｍＷ／ｍｍ２、０．５ｍＷ／ｍｍ２、約０．６ｍＷ／ｍｍ２、約０．７ｍＷ／ｍｍ２、約０．８ｍＷ／ｍｍ２、約０．９ｍＷ／ｍｍ２、約１．０ｍＷ／ｍｍ２、約１．１ｍＷ／ｍｍ２、約１．２ｍＷ／ｍｍ２、約１．３ｍＷ／ｍｍ２、約１．４ｍＷ／ｍｍ２、約１．５ｍＷ／ｍｍ２、約１．６ｍＷ／ｍｍ２、約１．７ｍＷ／ｍｍ２、約１．８ｍＷ／ｍｍ２、約１．９ｍＷ／ｍｍ２、約２．０ｍＷ／ｍｍ２、約２．１ｍＷ／ｍｍ２、約２．２ｍＷ／ｍｍ２、約２．３ｍＷ／ｍｍ２、約２．４ｍＷ／ｍｍ２、約２．５ｍＷ／ｍｍ２、約３ｍＷ／ｍｍ２、約３．５ｍＷ／ｍｍ２、約４ｍＷ／ｍｍ２、約４．５ｍＷ／ｍｍ２、約５ｍＷ／ｍｍ２、約５．５ｍＷ／ｍｍ２、約６ｍＷ／ｍｍ２、約７ｍＷ／ｍｍ２、約８ｍＷ／ｍｍ２、約９ｍＷ／ｍｍ２、または約１０ｍＷ／ｍｍ２（これらの数の間の値を含む）のいずれかの強度を有する光を生成する。他の実施形態において、光生成手段は、少なくとも約１００Ｈｚの強度を有する光を生成する。
いくつかの態様において、光生成手段は、外部制御器により外部から有効化され得る。外部制御器は、伝送コイルに装着され得る発電機を備えてもよい。外部制御器のいくつかの実施形態において、電池に電力を提供するために、発電機に電池が接続されてもよい。発電機にスイッチを接続して、個体が手動で発電機を有効化または無効化することができてもよい。いくつかの実施形態において、スイッチが有効化された後、発電機は、外部制御器上の伝送コイルと、移植型光源（例えばライトカフ）の外部アンテナとの間の電磁結合を介して、光源上の光生成手段に電力を提供することができる。伝送コイルは、光形成手段に電力を供給するため、および１つ以上の制御シグナルを移植型光源に伝送するために、移植型光源の外部アンテナに近接した際にそれと電磁結合を確立することができる。いくつかの実施形態において、外部制御器の伝送コイルと移植型光源（例えばライトカフ）の外部アンテナとの間の電磁結合は、高周波磁気インダクタンス結合であってもよい。高周波磁気インダクタンス結合が使用される場合、電波の作動周波数は、端点を含む約１から２０ＭＨｚの間（これらの数の間の任意の値（例えば、約１ＭＨｚ、約２ＭＨｚ、約３ＭＨｚ、約４ＭＨｚ、約５ＭＨｚ、約６ＭＨｚ、約７ＭＨｚ、約８ＭＨｚ、約９ＭＨｚ、約１０ＭＨｚ、約１１ＭＨｚ、約１２ＭＨｚ、約１３ＭＨｚ、約１４ＭＨｚ、約１５ＭＨｚ、約１６ＭＨｚ、約１７ＭＨｚ、約１８ＭＨｚ、約１９ＭＨｚ、または約２０ＭＨｚ）を含む）であってもよい。しかしながら、光受信機、赤外線、または生物医学テレメトリシステム等の他の結合技術が使用されてもよい（例えば、Ｋｉｏｕｒｔｉ，“Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｌｅｍｅｔｒｙ：Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｉｍｐｌａｎｔｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｗｏｒｌｄ，Ｏｐｔｉｃｏｎ１８２６，（８）：Ｓｐｒｉｎｇ，２０１０を参照されたい）。
本開示のいくつかの態様において、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配、陰部神経の外尿道括約筋神経支配、陰部神経または仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配は、光で活性化された場合、神経過分極を促進する光応答性ポンプを発現し得る。いくつかの実施形態において、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源の光生成手段は、膀胱が尿を貯蔵する際に光を連続的に生成し、同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）は光を生成しない。別の態様において、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段は、膀胱が排尿している際に光を生成せず、同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）は、光を連続的に生成し得る。いくつかの実施形態において、外部制御器により生成された第１の制御シグナルは、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を有効化すると同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）を無効化することができる。別の実施形態において、外部制御器により生成された第２の制御シグナルは、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を無効化すると同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）を有効化することができる。別の実施形態において、外部制御器により生成された制御シグナルは、陰部神経または仙骨脊髄神経から生じる外肛門括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を有効化することができる。
本開示のいくつかの態様において、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配、陰部神経の外尿道括約筋神経支配、および／または陰部神経もしくは仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配は、光で活性化された場合、神経脱分極誘発性シナプス欠乏を促進する光応答性カチオンチャネルを発現し得る。いくつかの実施形態において、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源の光生成手段は、膀胱が尿を貯蔵する際に光を生成せず、同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）は、少なくとも１００Ｈｚの強度を有する光を連続的に生成し得る。別の態様において、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段は、膀胱が排尿している際に少なくとも１００Ｈｚの強度を有する光を生成し、同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）は、光を生成しない。別の態様において、陰部神経または仙骨脊髄神経から生じる外肛門括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段は、外肛門括約筋が弛緩している際に少なくとも１００Ｈｚの強度を有する光を生成する。いくつかの実施形態において、外部制御器により生成された第１の制御シグナルは、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を有効化すると同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）を無効化することができる。別の実施形態において、外部制御器により生成された第２の制御シグナルは、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに配置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を無効化すると同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）を有効化することができる。別の実施形態において、外部制御器により生成された制御シグナルは、陰部神経または仙骨脊髄神経から生じる外肛門括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を無効化することができる。
本開示のいくつかの態様において、陰部神経または１つ以上の仙骨脊髄神経から生じる男性または女性の生殖器の筋肉または器官の神経支配は、光で活性化された場合、神経脱分極を促進する光応答性カチオンチャネルタンパク質を発現し得る。いくつかの実施形態において、陰部神経または仙骨脊髄神経から生じる男性または女性の生殖器の神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源の光生成手段は、個体が、これらに限定されないが、勃起、オルガスム、射精、および／または膣の潤滑等の性的行為を行いたい場合、光を連続的に生成する。いくつかの実施形態において、陰部神経または仙骨脊髄神経から生じる男性または女性の生殖器の神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源の光生成手段は、個体が、性的興奮を維持するために必要な生殖器部の触感を回復したい場合、光を連続的に生成する。いくつかの実施形態において、外部制御器により生成された第１の制御シグナルは、陰部神経または仙骨脊髄神経から生じる男性または女性の生殖器の筋肉または器官の神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を有効化することができる。別の実施形態において、外部制御器により生成された第２の制御シグナルは、陰部神経または仙骨脊髄神経から生じる男性または女性の生殖器の筋肉または器官の神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を無効化することができる。
本開示の他の態様において、光応答性オプシンタンパク質による神経刺激および電気の組み合わせを使用して、排尿および／または便意の抑制を回復することができる。いくつかの実施形態において、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配は、本明細書に記載の光応答性オプシンタンパク質のいずれかを発現することができ、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置され得る。いくつかの実施形態において、仙骨脊髄神経および／または陰部神経から生じる外肛門括約筋神経支配は、陰部神経および／または仙骨脊髄神経から生じる外肛門括約筋神経支配の周囲または近くに設置された電極を有してもよい。他の実施形態において、電極は、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置され得、一方で、陰部神経の外尿道括約筋神経支配は、本明細書に記載の光応答性オプシンタンパク質のいずれかを発現し得る。いくつかの実施形態において、外部制御器により生成された第１の制御シグナルは、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を有効化すると同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された電極を有効化することができる。別の実施形態において、外部制御器により生成された第２の制御シグナルは、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を無効化すると同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された電極を無効化することができる。別の実施形態において、外部制御器により生成された第１の制御シグナルは、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された電極を無効化すると同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を活性化することができる。さらに別の実施形態において、外部制御器により生成された第２の制御シグナルは、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された電極を有効化すると同時に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）の光生成手段を無効化することができる。
光源（例えばライトカフ）を含む光刺激デバイスの例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／５０６２８号および同第ＰＣＴ／ＵＳ０９／４９９３６号、ならびにＬｌｅｗｅｌｌｙｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６（１０）：１６１−１６５に見出すことができ、それぞれの開示は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
方法
本発明は、膀胱機能障害、便失禁（ＦＩ）、および／または性機能障害に関連した症状（機能障害、障害）を阻害するための方法に関する。特に、本明細書で提供される方法は、排尿筋過反射（ＤＨ）および／または排尿筋外括約筋協調不全（ＤＳＤ）に関連した症状の処置および／または軽減を目的としている。したがって、生理学的損傷または状態の全ての影響が完全に逆転される必要はないが、ここで開示される方法の効果は、患者の大きな治療上の利益に及ぶことができる。したがって、治療上の利益は、ＤＨ、ＤＳＤ、ＦＩ、および／または性機能障害の完全な治癒であるとは限らず、これらの状態から生じる症状もしくは生理学的損傷を低減または予防すること、そのような症状もしくは損傷の発生を（定量的もしくは定性的に）低減もしくは予防すること、そのような症状もしくは生理学的影響の重症度を低減すること、ならびに／またはＤＨ、ＤＳＤ、ＦＩ、および／もしくは性機能障害（例えば、これらに限定されないが、脊髄損傷および多発性硬化症）の原因を経験した後に患者の回復を向上させることを包含し得る。
具体的には、本発明の方法は、長期ＤＨ、ＤＳＤ、ＦＩ、および／もしくは性機能障害に関連した損傷を予防し得る、ならびに／またはこれらの状態に関連した（これらの状態から生じる）状態の症状を低減もしくは軽減し得る。したがって、個体をＤＨ、ＤＳＤ、ＦＩ、および／または性機能障害から生じる生理学的影響または症状から保護することは、症状の発生および／またはその影響の重症度を予防または低減すること、ならびに症状がすでに生じている、または生じ始めている患者を処置することの両方を含む。有益な効果は、当業者および／または患者を処置している熟練した臨床医学者によって容易に評価され得る。例えば、ＤＨおよび／またはＤＳＤの診断のための上述の方法の多くは、本発明の方法を使用した処置前および処置後に患者を評価するために使用して、処置の成功を評価することができる。いくつかの実施形態において、本発明の方法で処置されていない患者と比較して、処置されたそのような患者を評価するために使用される少なくとも１つの臨床的もしくは生物学的スコア、値、または基準の重症度または発生におけるプラスのまたは有益な差がある。
膀胱機能障害および／または便失禁を処置するための、光応答性オプシンタンパク質による過分極または脱分極誘発性シナプス欠乏
膀胱機能障害
したがって、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、光応答性オプシンタンパク質は、個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、光応答性オプシンタンパク質は、光に応答して光応答性オプシンタンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発することができ、それにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、膀胱からの尿の排出を可能にする方法が、本明細書で提供される。過分極を誘発し得る光応答性オプシンタンパク質をコードする本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドが、投与され得る。いくつかの実施形態において、膀胱機能障害は、ＤＨおよび／またはＤＳＤである。他の実施形態において、排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団は、アンバー光への暴露により過分極される。主題の方法の例示的実施形態を、図４に概略的に示す。
仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）により照射された場合、排尿筋神経支配の細胞膜上に発現した光応答性オプシンタンパク質は、過分極神経膜電位を維持して、排尿筋の収縮を防止し、膀胱を充満させる。仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配上に発現した光応答性オプシンタンパク質が、移植型光源により照射されない場合、排尿筋は、正常な神経膜電位の回復により収縮することができ、生成された圧力が排尿を促進する。同様に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源により照射された場合、外尿道括約筋神経支配の細胞膜上に発現した光応答性オプシンタンパク質は、過分極神経膜電位を維持して、外尿道括約筋の収縮を防止し、個体が排尿するのを可能にする。陰部神経の外尿道括約筋神経支配上に発現した光応答性オプシンタンパク質が、移植型光源により照射されない場合、外尿道括約筋は収縮して、膀胱を充満させる。
また、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、光応答性オプシンタンパク質は、個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、光応答性オプシンタンパク質は、光に応答して光応答性オプシンタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらすことができ、それにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏は、膀胱からの尿の排出を可能にする方法が、本明細書で提供される。脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらし得る光応答性オプションタンパク質をコードする本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドが、投与され得る。いくつかの実施形態において、膀胱機能障害は、ＤＨおよび／またはＤＳＤである。他の実施形態において、排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団は、青色、緑色、黄色、橙色、または赤色光への暴露によって、シナプス欠乏の点まで脱分極され得る。いくつかの実施形態において、光は、少なくとも約１００Ｈｚの強度を有する。
仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）により照射された場合、排尿筋神経支配の細胞膜上に発現した光応答性オプシンタンパク質は、神経細胞の脱分極誘発性シナプス欠乏を誘起して、それにより排尿筋の収縮を防止し、膀胱を充満させる。仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配上に発現した光応答性オプシンタンパク質が、移植型光源により照射されない場合、排尿筋は、経シナプスベシクルの回復により収縮することができ、生成された圧力が排尿を促進する。同様に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源により照射された場合、外尿道括約筋神経支配の細胞膜上に発現した光応答性オプシンタンパク質は、それらのニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらして、外尿道括約筋の収縮を防止し、個体が排尿するのを可能にする。陰部神経の外尿道括約筋神経支配上に発現した光応答性オプシンタンパク質が、移植型光源により照射されない場合、外尿道括約筋は収縮して、膀胱を充満させる。
いくつかの態様において、個体は、仙骨脊髄神経（例えばＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、もしくはＳ５のいずれか）および／または陰部神経の１つを包囲する、またはその近くに位置する１つ以上の光源（例えばライトカフ）から光手段を有効化することにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンおよび／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの分極状態を外部的に制御する。別の実施形態において、個体が排尿の必要性および／もしくは衝動を経験する、または所定のスケジュールに従って排尿したいと思った場合、個体は、陰部神経を包囲する、またはその近くに位置する光源を有効化すると同時に、仙骨脊髄神経を包囲する、またはその近くに位置する光源を不活性化することにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンおよび／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの膜分極状態を選択的に変化させる。別の実施形態において、個体は、ヒトである。
いくつかの態様において、排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の両方が、上述のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターでトランスフェクトされてもよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば上述のウイルス発現ベクターのいずれかであってもよい。いくつかの態様において、排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団は、仙骨脊髄神経（例えばＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、および／またはＳ５のいずれか）の体性運動ニューロン細胞体への発現ベクターの注入によりトランスフェクトされてもよい。他の態様において、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団は、オヌフ核への発現ベクターの注入によりトランスフェクトされる。いくつかの態様において、上述のもの等の外部シグナルに応答して光を生成し得る１つ以上の光源（例えばライトカフ）は、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近く、および陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲に外科的に設置される。
便失禁
また、処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、光応答性オプシンタンパク質は、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、光応答性オプシンタンパク質は、光に応答して光応答性タンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発することができ、それにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、括約筋の弛緩を可能にする方法が、本明細書で提供される。過分極を誘発し得る光応答性オプシンタンパク質をコードする本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドが、投与され得る。他の実施形態において、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団は、アンバー色光への暴露により過分極される。
陰部神経ならびに／または１つ以上の仙骨脊髄神経（例えばＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、および／もしくはＳ５のいずれか）の外肛門括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）により照射された場合、外肛門括約筋神経支配の細胞膜上に発現した光応答性オプシンタンパク質は、過分極神経膜電位を維持して、外肛門括約筋の収縮を防止し、個体が排便するのを可能にする。陰部神経および／または仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配上に発現した光応答性オプシンタンパク質が、移植型光源により照射されない場合、外肛門括約筋は自然に収縮し、腸内の便の貯蔵を可能にする。
また、処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、光応答性オプシンタンパク質は、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、光応答性オプシンタンパク質は、光に応答して光応答性タンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらすことができ、それにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏は、括約筋の弛緩を可能にする方法が、本明細書で提供される。ニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏を誘発し得る光応答性オプシンタンパク質をコードする本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドが、投与され得る。他の実施形態において、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団は、青色、緑色、黄色、橙色、または赤色光への暴露によって、シナプス欠乏の点まで脱分極され得る。いくつかの実施形態において、光は、少なくとも約１００Ｈｚの強度を有してもよい。
陰部神経および／または仙骨脊髄神経から生じる外肛門括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源により照射された場合、外肛門括約筋神経支配の細胞膜上に発現した光応答性オプシンタンパク質は、それらのニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらして、外肛門括約筋の収縮を防止し、個体が排便するのを可能にする。陰部神経および／または仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配上に発現した光応答性オプシンタンパク質が、移植型光源により照射されない場合、外肛門括約筋は自然に収縮し、直腸が便を貯蔵するのを可能にする。
いくつかの態様において、個体は、仙骨脊髄神経および／または陰部神経を包囲する、またはその近くに位置する１つ以上の光源（例えばライトカフ）から光手段を有効化することにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極状態を外部から制御する。別の実施形態において、個体が排便の必要性および／もしくは衝動を経験する、または所定のスケジュールに従って排便したいと思った場合、個体は、陰部神経および／または仙骨脊髄神経を包囲する、またはその近くに位置する光源を有効化することにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの膜分極状態を選択的に変化させる。別の実施形態において、個体は、ヒトである。いくつかの態様において、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団は、上述のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターでトランスフェクトされてもよい。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば上述のウイルス発現ベクターのいずれかであってもよい。いくつかの態様において、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団は、仙骨脊髄神経（例えばＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、および／またはＳ５のいずれか）への発現ベクターの注入によりトランスフェクトされる。他の態様において、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団は、陰部神経への発現ベクターの注入により、またはオヌフ核への発現ベクターの注入によりトランスフェクトされる。いくつかの態様において、上述のもの等の外部シグナルに応答して光を生成し得る１つ以上の光源（例えばライトカフ）は、陰部神経および／または仙骨脊髄神経から生じる外肛門括約筋神経支配の周囲または近くに外科的に設置される。
筋肉収縮を活発化するための光応答性オプシンタンパク質または電気刺激による脱分極
膀胱機能障害
括約筋は、ほとんどの骨格筋と異なり、括約筋収縮に拮抗する他の筋肉が存在しないため（例えば、二頭筋は三頭筋に拮抗する）、自然に収縮した（緊張した）状態で存在する。しかしながら、いくつかの状況において、括約筋神経支配の部位の上流側に位置する細胞またはニューロンが損傷される、機能不全となる、または尿を膀胱から押し出すのに十分強い筋肉収縮を生成して、外尿道括約筋を閉鎖する、または外肛門括約筋を閉鎖することができない可能性がある。これらの状況において、光応答性オプシンタンパク質または従来の電気刺激の使用によるこれらの末梢神経の脱分極を使用して、排尿の機能および／または便意の抑制を回復し、排尿筋、尿道括約筋、および／または肛門括約筋それぞれの「オン／オフ」制御を達成することができる。
したがって、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、第１の光応答性オプシンタンパク質および第２の光応答性オプシンタンパク質をコードする効果的な量のポリヌクレオチド配列（例えば上で開示されたポリヌクレオチド配列のいずれか）を、個体に投与することを含み、第１の光応答性オプシンタンパク質および第２の光応答性オプシンタンパク質は、個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、第１の光応答性オプシンタンパク質は、第１の波長の光に応答して第１の光応答性タンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発することができ、それにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、膀胱からの尿の排出を可能にし、第２の光応答性オプシンタンパク質は、第２の波長の光に応答して第２の光応答性タンパク質を発現するニューロンの脱分極を誘発することができ、それにより、排尿筋の神経支配を担うニューロンの脱分極は、膀胱からの尿の排出を可能にし、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの脱分極は、括約筋の閉鎖を可能にして尿の貯蔵を可能にする方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、膀胱機能障害は、ＤＨおよび／またはＤＳＤである。
仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）により提供される第１の波長を有する光を照射された場合、排尿筋神経支配の細胞膜上に発現した第１の光応答性オプシンタンパク質は、神経支配を過分極し、それにより、排尿筋の収縮を防止して、膀胱を充満させる。仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配上に発現した第２の光応答性オプシンタンパク質が、移植型光源により提供される第２の波長を有する光を照射された場合、排尿筋は、排尿筋神経支配の脱分極により収縮することができる。同様に、陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）により提供される第１の波長を有する光を照射された場合、外尿道括約筋神経支配の細胞膜上に発現した第１の光応答性オプシンタンパク質は、それらのニューロンを過分極して、外尿道括約筋の収縮を防止し、個体が排尿するのを可能にする。陰部神経の外尿道括約筋神経支配上に発現した第２の光応答性オプシンタンパク質が、移植型光源により提供される第２の波長を有する光を照射された場合、外尿道括約筋は、神経支配の脱分極により収縮し、膀胱内の尿の貯蔵を可能にする。
便失禁
さらに、処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、第１の光応答性オプシンタンパク質および第２の光応答性オプシンタンパク質をコードする効果的な量のポリヌクレオチド配列（例えば上で開示されたポリヌクレオチド配列のいずれか）を、個体に投与することを含み、第１の光応答性オプシンタンパク質および第２の光応答性オプシンタンパク質は、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、第１の光応答性オプシンタンパク質は、第１の波長の光に応答して第１の光応答性タンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発することができ、それにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの過分極は、括約筋の弛緩を可能にして排便を可能にし、第２の光応答性オプシンは、第２の波長の光に応答して第２の光応答性タンパク質を発現するニューロンの脱分極を誘発することができ、それにより、外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの脱分極は、括約筋の閉鎖を可能にして腸内の便の貯蔵を可能にする方法が、本明細書で提供される。
陰部神経および／または仙骨脊髄神経から生じる外肛門括約筋の神経支配の周囲または近くに設置された移植型光源（例えばライトカフ）により提供される第１の波長を有する光を照射された場合、外肛門括約筋神経支配の細胞膜上に発現した第１の光応答性オプシンタンパク質は、神経支配を過分極し、それにより、括約筋の収縮を防止して、括約筋を弛緩させる。仙骨脊髄神経および／または陰部神経から生じる外肛門括約筋神経支配の細胞膜上に発現した第２の光応答性オプシンタンパク質が、移植型光源により提供される第２の波長を有する光を照射された場合、括約筋は、括約筋神経支配の脱分極により収縮することができ、それにより、直腸内の便の貯蔵を可能にする。
別の態様において、便失禁を処置するための方法は、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、効果的な量のポリヌクレオチド（例えば上で開示されたポリヌクレオチド配列のいずれか）を、個体に投与することを含み、光応答性オプシンタンパク質は、個体における直腸の収縮を担う筋肉の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、光応答性オプシンタンパク質は、光に応答して光応答性タンパク質を発現するニューロンの脱分極を誘発することができ、それにより、直腸の収縮を担う筋肉の神経支配を担うニューロンの脱分極は、排便を促進する。いくつかの態様において、個体は、仙骨脊髄神経および／または下下腹神経叢から生じる神経線維を包囲する、またはその近くに位置する１つ以上の光源（例えばライトカフまたは本明細書に記載の光源のいずれか）から光手段を有効化することにより、直腸の収縮を担う筋肉の神経支配を担うニューロンの脱分極状態を外部から制御する。別の実施形態において、個体が排便の必要性および／もしくは衝動を経験する、または所定のスケジュールに従って排便したいと思った場合、個体は、仙骨脊髄神経および／または下下腹神経叢から生じる神経線維を包囲する、またはその近くに位置する光源を有効化することにより、直腸の収縮を担う筋肉の神経支配を担うニューロンの膜分極状態を選択的に変化させる。
他の態様において、方法はまた、排尿筋の神経支配および／または外尿道括約筋の陰部神経支配、ならびに外肛門括約筋の神経支配を脱分極するために使用され得る電気刺激を含んでもよい。いくつかの実施形態において、外部制御型電極が、排尿筋の神経支配を担うニューロン、外尿道括約筋の神経支配を担うニューロン、および／または外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの周囲または近くに設置される。他の実施形態において、電気刺激は、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配を脱分極し、排尿筋の収縮をもたらして膀胱を排尿させるために使用されてもよく、一方光応答性オプシンタンパク質は、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配を過分極する、またはその脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらし、排尿筋の弛緩をもたらし、それにより膀胱を充満させるために使用されてもよい。別の実施形態において、電気刺激は、陰部神経の外尿道括約筋神経支配を脱分極し、それにより、外尿道括約筋を閉鎖して膀胱を充満させるために使用されてもよく、一方光応答性オプシンタンパク質は、陰部神経の外尿道括約筋神経支配を脱分極する、またはその脱分極誘発性シナプス欠乏をもたらして、外尿道括約筋の弛緩をもたらし、それにより膀胱を排尿させるために使用されてもよい。
性機能障害を処置するための光応答性オプシンタンパク質による脱分極
処置を必要とする個体における性機能障害を処置するための方法であって、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、個体に投与することを含み、光応答性オプシンタンパク質は、個体における性機能を担う生殖器の筋肉および器官の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、光応答性オプシンタンパク質は、光に応答して光応答性タンパク質を発現するニューロンの脱分極をもたらすことができ、それにより、生殖器の神経支配を担うニューロンの脱分極は、性交および／または個体における性機能を可能にする方法もまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、性機能は、勃起、オルガスム、射精、および膣の潤滑からなる群から選択される１つ以上の機能である。他の実施形態において、性機能は、性的興奮を維持するために必要な生殖器への触感の回復である。ニューロンの脱分極を誘発し得る光応答性オプシンタンパク質をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれも投与され得る。他の実施形態において、ニューロンの集団は、青色、緑色、黄色、橙色、または赤色光への暴露によって、シナプス欠乏の点まで脱分極され得る。
陰茎／陰核背神経（陰部神経の枝）または仙骨脊髄神経の周囲または近くに設置された移植型光源により照射された場合、陰茎／陰核背神経の細胞膜上に発現した光応答性オプシンタンパク質は、それらのニューロンの脱分極をもたらし、それらの筋肉の収縮、ならびに正常な性交に関連した感覚および／または機能をもたらす。これらは、勃起、オルガスム、射精、および膣の潤滑を含むが、これらに限定されない。さらに、陰茎／陰核背神経（陰部神経の枝）または仙骨脊髄神経の周囲または近くに設置された移植型光源により照射された場合、陰茎／陰核背神経の細胞膜上に発現した光応答性オプシンタンパク質は、それらのニューロンの脱分極をもたらし、性的興奮を維持するために必要な生殖器への触感の回復をもたらす。
いくつかの態様において、個体は、陰部神経（例えば陰部神経の陰茎／陰核背神経枝）または仙骨脊髄神経を包囲する、またはその近くに位置する１つ以上の光源から光手段を有効化することにより、生殖器の神経支配を担うニューロンの脱分極を外部から制御する。別の実施形態において、個体が性交を行いたいと思った場合、または個体が所定のスケジュールに従って性交を行うことを選択した場合、個体は、陰部神経および／または仙骨脊髄神経を包囲する、またはその近くに位置する１つ以上の光源（例えばライトカフ）から光手段を有効化することにより、生殖器の筋肉の神経支配を担うニューロンの分極状態を外部から変化させる。別の実施形態において、個体は、ヒトであってもよい。
いくつかの態様において、生殖器の筋肉および器官の神経支配を担うニューロンの集団は、仙骨脊髄神経（例えばＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、および／またはＳ５のいずれか）の体性運動ニューロン細胞体へのポリヌクレオチド発現ベクター（例えば上述のポリヌクレオチド発現ベクターのいずれか）の注入によりトランスフェクトされてもよい。他の態様において、生殖器の筋肉の神経支配を担うニューロンの集団は、陰部神経への発現ベクターの注入によりトランスフェクトされてもよい。いくつかの態様において、上述のもの等の外部シグナルに応答して光を生成し得る１つ以上の光源（例えばライトカフ）は、陰部神経（例えば陰部神経の陰茎／陰核背神経枝）または仙骨脊髄神経の周囲または近くに外科的に設置されてもよい。
キット
いくつかの態様において、本発明は、処置を必要とする個体における膀胱機能障害、便失禁、および／または性機能障害を処置するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、光応答性イオンポンプタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、外部シグナルに応答して光を生成することができるカフであって、光は、光応答性イオンポンプタンパク質を活性することができるカフとを備える。
いくつかの態様において、本発明は、処置を必要とする個体における膀胱機能障害、便失禁、および／または性機能障害を処置するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、光応答性イオンポンプタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、配列番号：４に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、外部シグナルに応答して光を生成することができるカフであって、光は、光応答性イオンポンプタンパク質を活性することができるカフとを備える。
いくつかの態様において、本発明は、処置を必要とする個体における膀胱機能障害、便失禁、および／または性機能障害を処置するためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、光応答性イオンポンプタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、配列番号：２３に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ＥＲ移行シグナルと、膜輸送シグナルとを含む、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、外部シグナルに応答して光を生成することができるカフであって、光は、光応答性イオンポンプタンパク質を活性することができるカフとを備える。
他の態様において、キットは、さらに、効果的な量のポリヌクレオチドを個体に投与するための１組の説明であって、光応答性イオンポンプタンパク質は、排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団、個体における外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団、および／または個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現する説明、ならびに／あるいは、カフを仙骨脊髄神経の排尿筋神経支配の周囲、および／または陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲、および／または陰部神経もしくは仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配の周囲に設置するための説明を備えてもよい。キットはまた、上述の方法のいずれかに従って上述の光応答性イオンポンプタンパク質のいずれかを使用するための説明を提供し得る。同様に、キットに提供されるライトカフは、上述のライトカフのいずれかであってもよい。
いくつかの態様において、本発明は、処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するためのキットを提供し、キットは、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される１つ以上の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備える。
主題のキットは、さらに、効果的な量のポリヌクレオチドを個体に投与するための説明であって、ポリヌクレオチドによりコードされた光応答性オプシンタンパク質は、個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団、および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現する、説明と、光源を仙骨脊髄神経の排尿筋神経支配の周囲、および／または陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲に設置するための説明とを含んでもよい。いくつかの場合において、膀胱機能障害は、排尿筋過反射および／または排尿筋外括約筋協調不全である。
いくつかの態様において、本発明は、処置を必要とする個体における便失禁を処置するためのキットを提供し、キットは、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ｉ）配列番号：１、配列番号：４、または配列番号：２３に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ｉｉ）ＥＲ移行シグナルと、ｉｉｉ）膜輸送シグナルとを含む、オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備える。
主題のキットは、さらに、効果的な量のポリヌクレオチドを個体に投与するための説明であって、ポリヌクレオチドによりコードされた光応答性オプシンタンパク質は、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現する、説明と、光源を仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配および／または陰部神経の下直腸枝の周囲に設置するための説明とを含んでもよい。
いくつかの態様において、本発明は、処置を必要とする個体における便失禁を処置するためのキットを提供し、キットは、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される１つ以上の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備える。
キットは、さらに、効果的な量のポリヌクレオチドを個体に投与するための説明であって、ポリヌクレオチドによりコードされた光応答性オプシンタンパク質は、個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現する、説明と、光源を仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配および／または陰部神経の下直腸枝の周囲に設置するための説明とを含んでもよい。
いくつかの態様において、本発明は、処置を必要とする個体における性機能障害を処置するためのキットを提供し、キットは、ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される１つ以上の配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、光は、オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備える。
キットは、さらに、効果的な量のポリヌクレオチドを個体に投与するための説明であって、ポリヌクレオチドによりコードされた光応答性オプシンタンパク質は、個体における生殖器の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現する、説明と、光源を、１つ以上の仙骨脊髄神経、陰部神経の陰茎背神経枝、および／または陰部神経の陰核背神経から生じる生殖器神経支配の周囲に設置するための説明とを含んでもよい。
実施例１：排尿筋外括約筋協調不全（ＤＳＤ）および排尿筋過反射（ＤＨ）の動物モデルにおける、光遺伝学に基づく神経刺激の使用
この実施例は、本明細書に記載の光遺伝学的方法による処置のためのＤＳＤおよびＤＨの動物モデルを検証する。脊髄損傷を有するネコモデルが、ＤＳＤおよびＤＨのヒトの状態を再現するために使用され、ＰＥＴを使用して検証されている（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌ．，１９０：１７１）。また、脊髄損傷（ＳＣＩ）ラット（Ｓｈａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌ Ｕｒｏｄｙｎ．，２２（７）：６９３−８）、およびＥＡＥマウスにおける過反射の動物モデルがあり、これはまた、多発性硬化症のモデルでもある（Ｖｉｇｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ．５７８（Ｐｔ ２）：４３９−５０）。この実施例において、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ ｐｈａｒａｏｎｉｓ（ＮｐＨＲ）からの膜標的光活性化アニオンポンプハロロドプシンが、膀胱の排尿筋および外尿道括約筋の神経支配を担う神経を過分極するために使用される。
材料および方法
ヒトＤＳＤおよびＤＨの症状を再現するための実験的に誘発された脊髄損傷を有するネコを、既知の方法（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌ．１９０：１７１）に従って生成した。ＡＡＶ１ウイルスベクター中およびネコＴｈｙ１プロモーターの制御下の黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）標識化ハロロドプシン（ＹＦＰ−ＮｐＨｒ３．０、および／またはＹＦＰ−ＮｐＨＲ３．１； ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｄｏｔ）ｏｒｇを参照されたい）を、排尿筋神経支配を担う仙骨脊髄神経の体性運動ニューロン細胞体中に直接注入する。さらに、ネコＴｈｙ１プロモーターの制御下でのＡＡＶ１ウイルスベクター中のＹＦＰ−ハロロドプシンを、陰部神経の起点であるオヌフ核内に注入する。
ライトカフ設計および外科的移植
ライトカフ設計は、内径０．５ｍｍのホウケイ酸ガラスピペットを使用する。研磨チップを有する歯科用ドリルを使用して、ガラスピペットを慎重に４ｍｍまで研磨し、カフの長さに沿って縦に約０．５ｍｍ幅のチャネルを削る。紫外線硬化エポキシ（Ｎｏｒｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｒａｎｂｕｒｙ、ＮＪ、ＮＯＡ ８１）を、カフの外側に塗布し、ＵＶ硬化ランプで硬化させる。１６個の小型（１．０×０．６×０．２ｍｍ）アンバーＬＥＤ（Ｒｏｈｍ、京都、日本、ＳＭＬＰ１２ＢＣ７Ｔ、５８９ｎｍ）を、ガラスカフの外部に付け、ＵＶ硬化光学エポキシで所定位置に固定する。ＬＥＤを、中央の末梢神経に面する同心円外周上に配置し、４０ゲージ銅磁石ワイヤを使用して、手で微細はんだ付けする。単一ＬＥＤの強度およびオン／オフ時間を、デジタル光強度測定器および高速光検出器（ＴｈｏｒＬａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ、Ｓ１３０ＡおよびＤＥＴ１０Ａ）を用いて測定する。強度測定値は、後述の光伝搬モデルの入力として使用され、実験光の推定のための入力電流対光強度プロットの構築に役立つ。
発光ダイオード（ＬＥＤ）を有する外部からの有効化が可能なライトカフを、各神経を取り囲むように外科的に設置する（１つ以上の仙骨脊髄神経および／または陰部神経；例えば、Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６（１０）：１６１−１６５を参照されたい）。
光伝搬モデル
光伝搬モデルを使用して、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配および陰部神経の外尿道括約筋神経支配（または陰部神経自体）の全ての領域が、ＮｐＨｒ３．０および／またはＮｐＨＲ３．１塩化物ポンプを活性化するために必要な最低光強度を超える光強度に暴露されることを検証する（３．５ｍＷ／ｍｍ−２ ；Ｇｒａｄｉｎａｒｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｅｌｌ，１４１：１−１２）。光伝搬は、散漫散乱組織に対してＡｒａｖａｎｉｓら（２００７，Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｅｎｇ ４，Ｓ１４３−５６）により概説されるように、Ｋｕｂｅｌｋａ−Ｍｕｎｋモデルを使用してモデル化される。簡潔に述べると、光強度は、以下の式により距離と共に変動する。
式中、
であり、Ｓは、組織の散乱長であり、ｚは、光源からの距離であり、ｒは、ＬＥＤチップの直径であり、ｎは、光が移動する材料の屈折率であり、ＮＡは、
からのＬＥＤの開口数であり、１／２は、ＬＥＤからの発散半角であった。このモデルは、散乱および幾何学的損失による光強度への効果を考慮している。散乱長に使用される値は、４００ｎｍから９００ｎｍの間の波長においてマウス脳スライスから実験的に決定され、末梢組織の場合と同様であると仮定される。このモデルはまた、吸収による光強度の損失がないと仮定し、また、多数の散乱光子を考慮していない。１／２およびｒの値は、ＬＥＤ製造会社の製品シートから採用され、一方Ｉ（ｚ＝０）は、電力計を用いて単一ＬＥＤに対して測定された（ＴｈｏｒＬａｂｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＮＪ、Ｓ１３０Ａ）。
陰部神経直径をこのモデルにおける参照として使用して、相対光強度変動を、神経末梢および神経中枢に対して決定することができる。したがって、神経にわたる強度のいかなる降下も、ＮｐＨｒ３．０および／またはＮｐＨＲ３．１塩化物ポンプの光活性化のための最小強度（３．５ｍＷ／ｍｍ−２）を超える必要がある神経の最小表面と共に決定され得る。ライトカフは、神経の表面において２５ｍＷ ｍｍ−２を超えることができる。
陰部神経および仙骨脊髄神経の運動性軸索画像化
上述のように準備した成体脊髄損傷ネコを、ケタミンおよびキシラジンの注射により麻酔する。皮膚切開により排尿筋および／または外尿道括約筋を露出させ、続いて、４μｌの５％逆行性標識染料（Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）を筋肉内注射する。組織接着剤（ＶｅｔＢｏｎｄ、３Ｍ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）により皮膚切開を閉じ、ネコを回復させる。１週間後、動物を麻酔し、致死させる。陰部神経および仙骨脊髄神経切片を切除し、４％パラホルムアルデヒド中、２５℃で３０分間固定する。次いで、試料を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ｍＭ、２．７ＫＣｌ、１．７６ＫＨ２ＰＯ４、１３７ＮａＣｌ、１０ＮａＨＰＯ４、ｐＨ７．４）中、それぞれ２５℃で５分間２回洗浄し、５０℃の低融点アガロース中に包埋し、ビブラトームで５０μｍの切片にスライスした。
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）ｘ）および３％正常ロバ血清中での３０分間の透過化の後、切片をマウスモノクローナル抗ラミン１：５００（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）およびウサギポリクローナル抗タウ１：１０００（ＤＡＫＯ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）と共に一晩インキュベートする。次いで、切片を洗浄し、蛍光Ｃｙ３−またはＣｙ５−複合２次抗体１：１０００（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と共に、２５℃で３時間インキュベートする。２０×／０．７０ＮＡまたは４０×／１．２５ＮＡ油浸対物レンズを有するＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５走査レーザ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、共焦点蛍光画像が得られる。同等の設定を使用して、いくつかの対象の複数連続積層画像が得られる。
画像分析
運動性軸索（３μｍおよびＧ−比０．５）の数、サイズおよび蛍光強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を使用して手分析により決定する。ラミン標識化髄鞘およびタウ標識化軸索鞘の外周を手作業で輪郭化し、対象領域を形成する。次いで、対象領域に対し、Ｆｅｒｅｔ径および平均ピクセル強度をＩｍａｇｅＪ内で自動的に決定した。各軸索の中心と神経の外側との間の最短距離を求めることにより、陰部神経および仙骨脊髄神経内の軸索深度を決定する。Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）において、Ｌｉｌｌｉｅｆｏｒｓ検定（α＝０．０５）を使用した正常性の第１の試験後に、対応のある両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定（α＝０．０５）を使用して、統計的に有意な相関に関して運動性軸索直径対黄色蛍光タンパク質のピクセル強度を試験する。
Ｔｈｙ１：：ＮｐＨＲネコの運動性軸索内のＹＦＰタグ化光応答性塩化物ポンプの分布を、両方とも平行で、軸索の長軸に対し垂直である陰部神経および仙骨脊髄神経の断面を検査することにより定量化する。
ライトカフにより提供された刺激は、排尿筋および外尿道括約筋の電気的および収縮反応を誘起する。
外部シグナルを使用して、ＬＥＤを有効化する。仙骨脊髄ＬＥＤおよび陰部ＬＥＤは、一方がオンである場合、他方がオフであるように有効化される。仙骨脊髄ＬＥＤがオンである場合、膀胱は弛緩し、外尿道括約筋は活性で、尿の貯蔵を可能にする。仙骨脊髄ＬＥＤがオフである場合、外尿道括約筋がオンで、外尿道括約筋を弛緩させ、尿を収縮膀胱から通過させる。排尿が完了すると、仙骨脊髄ＬＥＤがオンに戻り、外尿道括約筋ＬＥＤはオフになる、
実施例２：排尿筋外括約筋協調不全（ＤＳＤ）および排尿筋過反射（ＤＨ）の動物モデルにおいて脱分極誘発性シナプス欠乏を誘起するための、光応答性カチオンチャネルの使用
この実施例は、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配および陰部神経の外尿道括約筋神経支配の選択的脱分極誘発性シナプス欠乏により尿機能が回復される、上述の光遺伝学的方法による処置のためのＤＳＤおよびＤＨの動物モデルを検証する。ネコまたはげっ歯類動物モデルは、実施例１において使用されたものと同一である。
ＡＡＶ１ウイルスベクター中、およびネコＴｈｙ１プロモーターの制御下の黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）標識化ＳＳＦＯ（ｐＡＡＶ−Ｔｈｙ１−ｈＣｈＲ２（Ｅ１２３Ｔ／Ｔ１５９Ｃ）−ＥＹＦＰ；ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｄｏｔ）ｏｒｇを参照されたい）を、仙骨脊髄神経（排尿筋神経支配を担う）の体性運動ニューロン細胞体およびオヌフ核（外尿道括約筋神経支配を担う）に直接注入する。
ライトカフは、実施例１のように製造される。発光ダイオード（ＬＥＤ）を有する外部からの有効化が可能なライトカフを、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配および陰部神経の外尿道括約筋神経支配を取り囲むように外科的に設置する。少なくとも１００Ｈｚの強度を有する光による光応答性カチオンチャネルタンパク質の活性化によりもたらされた脱分極誘発性シナプス欠乏は、排尿筋の弛緩を誘起し、それにより膀胱を充満させる。さらに、少なくとも１００Ｈｚの強度を有する光による光応答性カチオンチャネルタンパク質の活性化によりもたらされた脱分極誘発性シナプス欠乏は、外尿道括約筋の弛緩をもたらし、それにより尿の排出を可能にする。
外部シグナルを使用して、ＬＥＤを有効化する。仙骨脊髄ＬＥＤおよび陰部ＬＥＤは、一方がオンである場合、他方がオフであるように有効化される。仙骨脊髄ＬＥＤがオンである場合、膀胱は弛緩し、外尿道括約筋は活性で、尿の貯蔵を可能にする。仙骨脊髄ＬＥＤがオフである場合、外尿道括約筋がオンで、外尿道括約筋を弛緩させ、尿を収縮膀胱から通過させる。排尿が完了すると、仙骨脊髄ＬＥＤがオンに戻り、外尿道括約筋ＬＥＤはオフになる、
実施例３：ＡＡＶベクターコンストラクト
以下のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）コンストラクトを生成した：１）ＡＡＶ１：ｈｓｙｎ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ（ヒトシナプシン１プロモーターに作用可能に連結したＣｈＲ２−ｅＹＦＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶ１）；２）ＡＡＶ６−ｈｓｙｎ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ（ヒトシナプシン１プロモーターに作用可能に連結したＣｈＲ２−ｅＹＦＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶ６）；３）ＡＡＶ１−ｈｓｙｎ−ＮｐＨＲ−ＥＹＦＰ（ヒトシナプシン１プロモーターに作用可能に連結したＮｐＨＲ ３．０−ＥＹＦＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶ１）；４）ＡＡＶ６−ｈｓｙｎ−ＮｐＨＲ−ＥＹＦＰ（ヒトシナプシン１プロモーターに作用可能に連結したＮｐＨＲ ３．０−ＥＹＦＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶ６）；５）ＡＡＶ１−ｈｓｙｎ−ｅＡＲＣＨ−ＥＹＦＰ（ヒトシナプシン１プロモーターに作用可能に連結したｅＡＲＣＨ ３．０−ＥＹＦＰ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶ１）。
一本鎖ＤＮＡ ＡＡＶウイルスを、バキュロウイルス系で生成した（Ｖｉｒｏｖｅｋ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ；ＷＯ２００８／０２４９９８に記載の通り）。
実施例４：ラットにおける、オプシンをコードするＡＡＶの筋肉内注射
実施例３に記載の約１２μＬのコンストラクト中約１×１０１２ウイルスゲノム（ｖｇ）の全用量を、それぞれ１３０〜１７０ｇの雌Ｆ３４４／Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットのＥＵＳ筋肉内に注射した。注射後様々な日数で、動物を致死させ、背外側核（ＤＬＮ）および脊髄の他の領域におけるコンストラクトによりコードされたオプシンの発現を評価した。図１は、ＤＬＮを含む脊髄の様々な切片を概略的に示す。全てのコンストラクトは、オプシン−ＥＹＦＰ融合タンパク質（例えば、ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ；ＮｐＨＲ−ＥＹＦＰ；ｅＡＲＣＨ−ＥＹＦＰ）をコードしていた。
ラット脊髄の４０ｎｍ切片を調製した。切片をＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡で検査した。共焦点顕微鏡を使用して、ＹＦＰ標識を可視化することにより、全ての切片上のＤＬＮ運動ニューロンをカウントした。運動ニューロンは、４０×対物レンズを使用して可視化し、ＤＡＰＩ（核を示す）およびＹＦＰ（細胞体の領域を示す）チャネルからの画像をマージすることにより、切片の顕微鏡写真を撮影した。ＤＬＮ内でＹＦＰにより囲まれた目に見える核を有する切片を、連続切片にわたりカウントし、各動物に対し全運動ニューロンカウントを決定した。各切片において、細胞がＹＦＰ発現および核染色のためのＤＡＰＩの両方を示した場合、その細胞を陽性としてカウントした。データを図２に示す。
図２の左パネルに示されるように、全陰部運動ニューロンのほぼ半数が、様々な注射されたＡＡＶコンストラクトによりコードされたタンパク質を発現した。逆行性標識により測定された陰部運動ニューロンの総数の文献値は、ＤＬ右およびＤＬ左に対して約６０、合計１２０である。（Ｋａｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．２６６：２１−２９）。
実施例５：ラットにおけるＥＵＳ筋肉の収縮および膀胱圧力の測定
ＥＵＳへのＡＡＶ１−ｈｓｙｎ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ筋肉内注射から９０日後、膀胱および外尿道括約筋の膀胱内圧測定および括約筋−ＥＭＧ記録を行った。膀胱内圧測定は、圧力センサに留められるげっ歯類膀胱内のカテーテルの設置を含んでいた。電極をＥＵＳ内に設置し、記録増幅器に留めて、括約筋収縮（ＥＭＧ）活動を測定した。データを図３に示す。
図３は、ＡＡＶ１−ｈｓｙｎ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰを（ＥＵＳ内に）筋肉内注射されたラットの陰部神経における青色光光刺激後の異なる周波数／期間におけるＥＵＳ筋肉収縮を示す。観察される光誘発収縮は、陰部神経に対する５〜５０Ｈｚの光パルスの周波数に従う。
本発明の純粋な例示であることが意図され、したがって本発明をいかなる様式でも限定するように見なされるべきではない実施例はまた、上述の本発明の態様および実施形態を説明し、詳述する。上述の実施例および詳細な説明は、例示を目的として提供され、限定を目的として説明されない。本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、および特許は、各個別の刊行物、特許出願、または特許が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書において引用される全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得る組成物および方法を説明および開示することを目的として、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。上述の発明は、明確な理解を目的として、例示および実施例を用いてある程度詳細に説明されたが、当業者には、本発明の教示に照らして、添付の請求項の精神または範囲から逸脱せずに、本発明にある特定の変更および修正を行うことができることが容易に明らかとなるだろう。
配列
シグナルペプチドを有さないＮｐＨＲのアミノ酸配列：
ＶＴＱＲＥＬＦＥＦＶＬＮＤＰＬＬＡＳＳＬＹＩＮＩＡＬＡＧＬＳＩＬＬＦＶＦＭＴＲＧＬＤＤＰＲＡＫＬＩＡＶＳＴＩＬＶＰＶＶＳＩＡＳＹＴＧＬＡＳＧＬＴＩＳＶＬＥＭＰＡＧＨＦＡＥＧＳＳＶＭＬＧＧＥＥＶＤＧＶＶＴＭＷＧＲＹＬＴＷＡＬＳＴＰＭＩＬＬＡＬＧＬＬＡＧＳＮＡＴＫＬＦＴＡＩＴＦＤＩＡＭＣＶＴＧＬＡＡＡＬＴＴＳＳＨＬＭＲＷＦＷＹＡＩＳＣＡＣＦＬＶＶＬＹＩＬＬＶＥＷＡＱＤＡＫＡＡＧＴＡＤＭＦＮＴＬＫＬＬＴＶＶＭＷＬＧＹＰＩＶＷＡＬＧＶＥＧＩＡＶＬＰＶＧＶＴＳＷＧＹＳＦＬＤＩＶＡＫＹＩＦＡＦＬＬＬＮＹＬＴＳＮＥＳＶＶＳＧＳＩＬＤＶＰＳＡＳＧＴＰＡＤＤ（配列番号：１）。

ｅＹＦＰ−ＮｐＨＲ３．０のアミノ酸配列：
ＭＴＥＴＬＰＰＶＴＥＳＡＶＡＬＱＡＥＶＴＱＲＥＬＦＥＦＶＬＮＤＰＬＬＡＳＳＬＹＩＮＩＡＬＡＧＬＳＩＬＬＦＶＦＭＴＲＧＬＤＤＰＲＡＫＬＩＡＶＳＴＩＬＶＰＶＶＳＩＡＳＹＴＧＬＡＳＧＬＴＩＳＶＬＥＭＰＡＧＨＦＡＥＧＳＳＶＭＬＧＧＥＥＶＤＧＶＶＴＭＷＧＲＹＬＴＷＡＬＳＴＰＭＩＬＬＡＬＧＬＬＡＧＳＮＡＴＫＬＦＴＡＩＴＦＤＩＡＭＣＶＴＧＬＡＡＡＬＴＴＳＳＨＬＭＲＷＦＷＹＡＩＳＣＡＣＦＬＶＶＬＹＩＬＬＶＥＷＡＱＤＡＫＡＡＧＴＡＤＭＦＮＴＬＫＬＬＴＶＶＭＷＬＧＹＰＩＶＷＡＬＧＶＥＧＩＡＶＬＰＶＧＶＴＳＷＧＹＳＦＬＤＩＶＡＫＹＩＦＡＦＬＬＬＮＹＬＴＳＮＥＳＶＶＳＧＳＩＬＤＶＰＳＡＳＧＴＰＡＤＤＡＡＡＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＦＧＹＧＬＱＣＦＡＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＹＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：２）。

ｅＹＦＰ−ＮｐＨＲ３．１のアミノ酸配列：
ＭＶＴＱＲＥＬＦＥＦＶＬＮＤＰＬＬＡＳＳＬＹＩＮＩＡＬＡＧＬＳＩＬＬＦＶＦＭＴＲＧＬＤＤＰＲＡＫＬＩＡＶＳＴＩＬＶＰＶＶＳＩＡＳＹＴＧＬＡＳＧＬＴＩＳＶＬＥＭＰＡＧＨＦＡＥＧＳＳＶＭＬＧＧＥＥＶＤＧＶＶＴＭＷＧＲＹＬＴＷＡＬＳＴＰＭＩＬＬＡＬＧＬＬＡＧＳＮＡＴＫＬＦＴＡＩＴＦＤＩＡＭＣＶＴＧＬＡＡＡＬＴＴＳＳＨＬＭＲＷＦＷＹＡＩＳＣＡＣＦＬＶＶＬＹＩＬＬＶＥＷＡＱＤＡＫＡＡＧＴＡＤＭＦＮＴＬＫＬＬＴＶＶＭＷＬＧＹＰＩＶＷＡＬＧＶＥＧＩＡＶＬＰＶＧＶＴＳＷＧＹＳＦＬＤＩＶＡＫＹＩＦＡＦＬＬＬＮＹＬＴＳＮＥＳＶＶＳＧＳＩＬＤＶＰＳＡＳＧＴＰＡＤＤＡＡＡＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＦＧＹＧＬＱＣＦＡＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＹＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：３）。

ＧｔＲ３のアミノ酸配列：
ＡＳＳＦＧＫＡＬＬＥＦＶＦＩＶＦＡＣＩＴＬＬＬＧＩＮＡＡＫＳＫＡＡＳＲＶＬＦＰＡＴＦＶＴＧＩＡＳＩＡＹＦＳＭＡＳＧＧＧＷＶＩＡＰＤＣＲＱＬＦＶＡＲＹＬＤＷＬＩＴＴＰＬＬＬＩＤＬＧＬＶＡＧＶＳＲＷＤＩＭＡＬＣＬＳＤＶＬＭＩＡＴＧＡＦＧＳＬＴＶＧＮＶＫＷＶＷＷＦＦＧＭＣＷＦＬＨＩＩＦＡＬＧＫＳＷＡＥＡＡＫＡＫＧＧＤＳＡＳＶＹＳＫＩＡＧＩＴＶＩＴＷＦＣＹＰＶＶＷＶＦＡＥＧＦＧＮＦＳＶＴＦＥＶＬＩＹＧＶＬＤＶＩＳＫＡＶＦＧＬＩＬＭＳＧＡＡＴＧＹＥＳＩ（配列番号：４）。

ＣｈＲ２のアミノ酸配列：
ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰＶＶＶＮＧＳＶＬＶＰＥＤＱＣＹＣＡＧＷＩＥＳＲＧＴＮＧＡＱＴＡＳＮＶＬＱＷＬＡＡＧＦＳＩＬＬＬＭＦＹＡＹＱＴＷＫＳＴＣＧＷＥＥＩＹＶＣＡＩＥＭＶＫＶＩＬＥＦＦＦＥＦＫＮＰＳＭＬＹＬＡＴＧＨＲＶＱＷＬＲＹＡＥＷＬＬＴＣＰＶＩＬＩＨＬＳＮＬＴＧＬＳＮＤＹＳＲＲＴＭＧＬＬＶＳＤＩＧＴＩＶＷＧＡＴＳＡＭＡＴＧＹＶＫＶＩＦＦＣＬＧＬＣＹＧＡＮＴＦＦＨＡＡＫＡＹＩＥＧＹＨＴＶＰＫＧＲＣＲＱＶＶＴＧＭＡＷＬＦＦＶＳＷＧＭＦＰＩＬＦＩＬＧＰＥＧＦＧＶＬＳＶＹＧＳＴＶＧＨＴＩＩＤＬＭＳＫＮＣＷＧＬＬＧＨＹＬＲＶＬＩＨＥＨＩＬＩＨＧＤＩＲＫＴＴＫＬＮＩＧＧＴＥＩＥＶＥＴＬＶＥＤＥＡＥＡＧＡＶＰ（配列番号：５）。

ＳＦＯのアミノ酸配列：
ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰＶＶＶＮＧＳＶＬＶＰＥＤＱＣＹＣＡＧＷＩＥＳＲＧＴＮＧＡＱＴＡＳＮＶＬＱＷＬＡＡＧＦＳＩＬＬＬＭＦＹＡＹＱＴＷＫＳＴＣＧＷＥＥＩＹＶＣＡＩＥＭＶＫＶＩＬＥＦＦＦＥＦＫＮＰＳＭＬＹＬＡＴＧＨＲＶＱＷＬＲＹＡＥＷＬＬＴＳＰＶＩＬＩＨＬＳＮＬＴＧＬＳＮＤＹＳＲＲＴＭＧＬＬＶＳＤＩＧＴＩＶＷＧＡＴＳＡＭＡＴＧＹＶＫＶＩＦＦＣＬＧＬＣＹＧＡＮＴＦＦＨＡＡＫＡＹＩＥＧＹＨＴＶＰＫＧＲＣＲＱＶＶＴＧＭＡＷＬＦＦＶＳＷＧＭＦＰＩＬＦＩＬＧＰＥＧＦＧＶＬＳＶＹＧＳＴＶＧＨＴＩＩＤＬＭＳＫＮＣＷＧＬＬＧＨＹＬＲＶＬＩＨＥＨＩＬＩＨＧＤＩＲＫＴＴＫＬＮＩＧＧＴＥＩＥＶＥＴＬＶＥＤＥＡＥＡＧＡＶＰ（配列番号：６）。

ＳＳＦＯのアミノ酸配列：
ＭＤＹＧＧＡＬＳＡＶＧＲＥＬＬＦＶＴＮＰＶＶＶＮＧＳＶＬＶＰＥＤＱＣＹＣＡＧＷＩＥＳＲＧＴＮＧＡＱＴＡＳＮＶＬＱＷＬＡＡＧＦＳＩＬＬＬＭＦＹＡＹＱＴＷＫＳＴＣＧＷＥＥＩＹＶＣＡＩＥＭＶＫＶＩＬＥＦＦＦＥＦＫＮＰＳＭＬＹＬＡＴＧＨＲＶＱＷＬＲＹＡＥＷＬＬＴＳＰＶＩＬＩＨＬＳＮＬＴＧＬＳＮＤＹＳＲＲＴＭＧＬＬＶＳＡＩＧＴＩＶＷＧＡＴＳＡＭＡＴＧＹＶＫＶＩＦＦＣＬＧＬＣＹＧＡＮＴＦＦＨＡＡＫＡＹＩＥＧＹＨＴＶＰＫＧＲＣＲＱＶＶＴＧＭＡＷＬＦＦＶＳＷＧＭＦＰＩＬＦＩＬＧＰＥＧＦＧＶＬＳＶＹＧＳＴＶＧＨＴＩＩＤＬＭＳＫＮＣＷＧＬＬＧＨＹＬＲＶＬＩＨＥＨＩＬＩＨＧＤＩＲＫＴＴＫＬＮＩＧＧＴＥＩＥＶＥＴＬＶＥＤＥＡＥＡＧＡＶＰ（配列番号：７）。

Ｃ１Ｖ１のアミノ酸配列：
ＭＳＲＲＰＷＬＬＡＬＡＬＡＶＡＬＡＡＧＳＡＧＡＳＴＧＳＤＡＴＶＰＶＡＴＱＤＧＰＤＹＶＦＨＲＡＨＥＲＭＬＦＱＴＳＹＴＬＥＮＮＧＳＶＩＣＩＰＮＮＧＱＣＦＣＬＡＷＬＫＳＮＧＴＮＡＥＫＬＡＡＮＩＬＱＷＩＴＦＡＬＳＡＬＣＬＭＦＹＧＹＱＴＷＫＳＴＣＧＷＥＥＩＹＶＡＴＩＥＭＩＫＦＩＩＥＹＦＨＥＦＤＥＰＡＶＩＹＳＳＮＧＮＫＴＶＷＬＲＹＡＥＷＬＬＴＣＰＶＬＬＩＨＬＳＮＬＴＧＬＫＤＤＹＳＫＲＴＭＧＬＬＶＳＤＶＧＣＩＶＷＧＡＴＳＡＭＣＴＧＷＴＫＩＬＦＦＬＩＳＬＳＹＧＭＹＴＹＦＨＡＡＫＶＹＩＥＡＦＨＴＶＰＫＧＩＣＲＥＬＶＲＶＭＡＷＴＦＦＶＡＷＧＭＦＰＶＬＦＬＬＧＴＥＧＦＧＨＩＳＰＹＧＳＡＩＧＨＳＩＬＤＬＩＡＫＮＭＷＧＶＬＧＮＹＬＲＶＫＩＨＥＨＩＬＬＹＧＤＩＲＫＫＱＫＩＴＩＡＧＱＥＭＥＶＥＴＬＶＡＥＥＥＤ（配列番号：８）。

Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ）のアミノ酸配列：
ＭＳＲＲＰＷＬＬＡＬＡＬＡＶＡＬＡＡＧＳＡＧＡＳＴＧＳＤＡＴＶＰＶＡＴＱＤＧＰＤＹＶＦＨＲＡＨＥＲＭＬＦＱＴＳＹＴＬＥＮＮＧＳＶＩＣＩＰＮＮＧＱＣＦＣＬＡＷＬＫＳＮＧＴＮＡＥＫＬＡＡＮＩＬＱＷＩＴＦＡＬＳＡＬＣＬＭＦＹＧＹＱＴＷＫＳＴＣＧＷＥＴＩＹＶＡＴＩＥＭＩＫＦＩＩＥＹＦＨＥＦＤＥＰＡＶＩＹＳＳＮＧＮＫＴＶＷＬＲＹＡＥＷＬＬＴＣＰＶＬＬＩＨＬＳＮＬＴＧＬＫＤＤＹＳＫＲＴＭＧＬＬＶＳＤＶＧＣＩＶＷＧＡＴＳＡＭＣＴＧＷＴＫＩＬＦＦＬＩＳＬＳＹＧＭＹＴＹＦＨＡＡＫＶＹＩＥＡＦＨＴＶＰＫＧＩＣＲＥＬＶＲＶＭＡＷＴＦＦＶＡＷＧＭＦＰＶＬＦＬＬＧＴＥＧＦＧＨＩＳＰＹＧＳＡＩＧＨＳＩＬＤＬＩＡＫＮＭＷＧＶＬＧＮＹＬＲＶＫＩＨＥＨＩＬＬＹＧＤＩＲＫＫＱＫＩＴＩＡＧＱＥＭＥＶＥＴＬＶＡＥＥＥＤ（配列番号：９）。

Ｃ１Ｖ１（Ｅ１６２Ｔ）のアミノ酸配列：
ＭＳＲＲＰＷＬＬＡＬＡＬＡＶＡＬＡＡＧＳＡＧＡＳＴＧＳＤＡＴＶＰＶＡＴＱＤＧＰＤＹＶＦＨＲＡＨＥＲＭＬＦＱＴＳＹＴＬＥＮＮＧＳＶＩＣＩＰＮＮＧＱＣＦＣＬＡＷＬＫＳＮＧＴＮＡＥＫＬＡＡＮＩＬＱＷＩＴＦＡＬＳＡＬＣＬＭＦＹＧＹＱＴＷＫＳＴＣＧＷＥＥＩＹＶＡＴＩＥＭＩＫＦＩＩＥＹＦＨＥＦＤＥＰＡＶＩＹＳＳＮＧＮＫＴＶＷＬＲＹＡＴＷＬＬＴＣＰＶＬＬＩＨＬＳＮＬＴＧＬＫＤＤＹＳＫＲＴＭＧＬＬＶＳＤＶＧＣＩＶＷＧＡＴＳＡＭＣＴＧＷＴＫＩＬＦＦＬＩＳＬＳＹＧＭＹＴＹＦＨＡＡＫＶＹＩＥＡＦＨＴＶＰＫＧＩＣＲＥＬＶＲＶＭＡＷＴＦＦＶＡＷＧＭＦＰＶＬＦＬＬＧＴＥＧＦＧＨＩＳＰＹＧＳＡＩＧＨＳＩＬＤＬＩＡＫＮＭＷＧＶＬＧＮＹＬＲＶＫＩＨＥＨＩＬＬＹＧＤＩＲＫＫＱＫＩＴＩＡＧＱＥＭＥＶＥＴＬＶＡＥＥＥＤ（配列番号：１０）。

Ｃ１Ｖ１（Ｅ１２２Ｔ／Ｅ１６２Ｔ）のアミノ酸配列：
ＭＳＲＲＰＷＬＬＡＬＡＬＡＶＡＬＡＡＧＳＡＧＡＳＴＧＳＤＡＴＶＰＶＡＴＱＤＧＰＤＹＶＦＨＲＡＨＥＲＭＬＦＱＴＳＹＴＬＥＮＮＧＳＶＩＣＩＰＮＮＧＱＣＦＣＬＡＷＬＫＳＮＧＴＮＡＥＫＬＡＡＮＩＬＱＷＩＴＦＡＬＳＡＬＣＬＭＦＹＧＹＱＴＷＫＳＴＣＧＷＥＴＩＹＶＡＴＩＥＭＩＫＦＩＩＥＹＦＨＥＦＤＥＰＡＶＩＹＳＳＮＧＮＫＴＶＷＬＲＹＡＴＷＬＬＴＣＰＶＬＬＩＨＬＳＮＬＴＧＬＫＤＤＹＳＫＲＴＭＧＬＬＶＳＤＶＧＣＩＶＷＧＡＴＳＡＭＣＴＧＷＴＫＩＬＦＦＬＩＳＬＳＹＧＭＹＴＹＦＨＡＡＫＶＹＩＥＡＦＨＴＶＰＫＧＩＣＲＥＬＶＲＶＭＡＷＴＦＦＶＡＷＧＭＦＰＶＬＦＬＬＧＴＥＧＦＧＨＩＳＰＹＧＳＡＩＧＨＳＩＬＤＬＩＡＫＮＭＷＧＶＬＧＮＹＬＲＶＫＩＨＥＨＩＬＬＹＧＤＩＲＫＫＱＫＩＴＩＡＧＱＥＭＥＶＥＴＬＶＡＥＥＥＤ（配列番号：１１）。

ｅＡｒｃｈのアミノ酸配列：
ＭＤＰＩＡＬＱＡＧＹＤＬＬＧＤＧＲＰＥＴＬＷＬＧＩＧＴＬＬＭＬＩＧＴＦＹＦＬＶＲＧＷＧＶＴＤＫＤＡＲＥＹＹＡＶＴＩＬＶＰＧＩＡＳＡＡＹＬＳＭＦＦＧＩＧＬＴＥＶＴＶＧＧＥＭＬＤＩＹＹＡＲＹＡＤＷＬＦＴＴＰＬＬＬＬＤＬＡＬＬＡＫＶＤＲＶＴＩＧＴＬＶＧＶＤＡＬＭＩＶＴＧＬＩＧＡＬＳＨＴＡＩＡＲＹＳＷＷＬＦＳＴＩＣＭＩＶＶＬＹＦＬＡＴＳＬＲＳＡＡＫＥＲＧＰＥＶＡＳＴＦＮＴＬＴＡＬＶＬＶＬＷＴＡＹＰＩＬＷＩＩＧＴＥＧＡＧＶＶＧＬＧＩＥＴＬＬＦＭＶＬＤＶＴＡＫＶＧＦＧＦＩＬＬＲＳＲＡＩＬＧＤＴＥＡＰＥＰＳＡＧＡＤＶＳＡＡＤ（配列番号：２３）。

ｅＡｒｃｈ３．０−ＥＹＦＰのアミノ酸配列：
ＭＤＰＩＡＬＱＡＧＹＤＬＬＧＤＧＲＰＥＴＬＷＬＧＩＧＴＬＬＭＬＩＧＴＦＹＦＬＶＲＧＷＧＶＴＤＫＤＡＲＥＹＹＡＶＴＩＬＶＰＧＩＡＳＡＡＹＬＳＭＦＦＧＩＧＬＴＥＶＴＶＧＧＥＭＬＤＩＹＹＡＲＹＡＤＷＬＦＴＴＰＬＬＬＬＤＬＡＬＬＡＫＶＤＲＶＴＩＧＴＬＶＧＶＤＡＬＭＩＶＴＧＬＩＧＡＬＳＨＴＡＩＡＲＹＳＷＷＬＦＳＴＩＣＭＩＶＶＬＹＦＬＡＴＳＬＲＳＡＡＫＥＲＧＰＥＶＡＳＴＦＮＴＬＴＡＬＶＬＶＬＷＴＡＹＰＩＬＷＩＩＧＴＥＧＡＧＶＶＧＬＧＩＥＴＬＬＦＭＶＬＤＶＴＡＫＶＧＦＧＦＩＬＬＲＳＲＡＩＬＧＤＴＥＡＰＥＰＳＡＧＡＤＶＳＡＡＤＲＰＶＶＡＶＳＫＡＡＡＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＦＧＹＧＬＱＣＦＡＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＮＳＨＮＶＹＩＭＡＤＫＱＫＮＧＩＫＶＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＹＱＳＡＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：２４）。
例示的な実施形態
１． 処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、
光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、前記個体に投与することを含み、前記オプシンタンパク質は、前記個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、
前記オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発し、それにより、前記排尿筋の神経支配を担うニューロンの前記過分極は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、前記外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの前記過分極は、膀胱からの尿の排出を可能にし、
前記ポリヌクレオチドは、ｉ）配列番号：１、配列番号：４、または配列番号：２３に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ｉｉ）ＥＲ移行シグナルと、ｉｉｉ）膜輸送シグナルとを含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、方法。
２． 光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、前記個体に投与することをさらに含み、前記オプシンタンパク質は、前記個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、
前記オプシンタンパク質は、前記ニューロンの脱分極を誘発し、それにより、前記排尿筋の神経支配を担うニューロンの前記脱分極は、膀胱からの尿の排出を可能にし、前記外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの前記脱分極は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、
前記ポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態１に記載の方法。
３． 処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、
光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、前記個体に投与することを含み、前記オプシンタンパク質は、前記個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、
前記オプシンタンパク質は、光に応答して前記オプシンタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏を誘発することができ、それにより、前記排尿筋の神経支配を担うニューロンの前記脱分極誘発性シナプス欠乏は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、前記外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの前記脱分極誘発性シナプス欠乏は、膀胱からの尿の排出を可能にし、
前記ポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と数なくとも９５％同一である配列を含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法。
４． 処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するための方法であって、
光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、前記個体に投与することを含み、前記オプシンタンパク質は、前記個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、
前記オプシンタンパク質は、前記ニューロンの脱分極を誘発することができ、それにより、前記排尿筋の神経支配を担うニューロンの前記脱分極は、膀胱からの尿の排出を可能にし、前記外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの前記脱分極は、膀胱内の尿の貯蔵を可能にし、
前記ポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法。
５． 前記膀胱機能障害は、排尿筋過反射および／または排尿筋外括約筋協調不全である、実施形態１から４のいずれか一項に記載の方法。
６． 前記膀胱機能障害は、脊髄損傷または多発性硬化症に関連する、実施形態１から４のいずれか一項に記載の方法。
７． 前記排尿筋の神経支配を担うニューロンの前記集団が、前記個体における１つ以上の仙骨脊髄神経から生じるニューロンである、実施形態１から４のいずれか一項に記載の方法。
８． 前記外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの前記集団は、前記個体における陰部神経のニューロンを含む、実施形態１から４のいずれか一項に記載の方法。
９． 外部シグナルに応答して光を生成することができる光源が、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋神経支配の周囲、および／または陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲に設置され、前記光は、前記ニューロンの細胞膜上に発現した前記光応答性オプシンタンパク質を活性化することができる、実施形態１から８のいずれか一項に記載の方法。
１０． 前記光源は、赤色、アンバー色、青色、または緑色光を生成することができる、実施形態９に記載の方法。
１１． 前記個体は、仙骨脊髄神経および／または陰部神経を包囲する前記光源を活性化することにより、前記排尿筋の神経支配を担うニューロンおよび／または前記外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの分極状態を外部的に制御する、実施形態９に記載の方法。
１２． 前記ポリヌクレオチドは、仙骨脊髄神経の体性運動ニューロン細胞体への前記ポリヌクレオチドの注入により投与される、実施形態１から４のいずれか一項に記載の方法。
１３． 前記ポリヌクレオチドは、陰部神経への前記ポリヌクレオチドの注入により投与される、実施形態１から４のいずれか一項に記載の方法。
１４． 前記ポリヌクレオチドは、オヌフ核への前記ポリヌクレオチドの注入により投与される、実施形態１から４のいずれか一項に記載の方法。
１５． 処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、
光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、前記個体に投与することを含み、前記オプシンタンパク質は、前記個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、
前記オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの過分極を誘発し、それにより、前記外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの前記過分極は、排便を可能にし、
前記ポリヌクレオチドは、ｉ）配列番号：１、配列番号：４、または配列番号：２３に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ｉｉ）ＥＲ移行シグナルと、ｉｉｉ）膜輸送シグナルとを含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、方法。
１６． 光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、前記個体に投与することをさらに含み、前記オプシンタンパク質は、前記個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、
前記オプシンタンパク質は、前記ニューロンの脱分極を誘発し、それにより、前記外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの前記脱分極は、直腸内の便の貯蔵を可能にし、
前記ポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、実施形態１５に記載の方法。
１７． 処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、
光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、前記個体に投与することを含み、前記オプシンタンパク質は、前記個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、
前記オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの脱分極誘発性シナプス欠乏を誘発することができ、それにより、前記外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの前記脱分極誘発性シナプス欠乏は、排便を可能にし、
前記ポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と数なくとも９５％同一である配列を含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法。
１８． 処置を必要とする個体における便失禁を処置するための方法であって、
光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、前記個体に投与することを含み、前記オプシンタンパク質は、前記個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、
前記オプシンタンパク質は、前記ニューロンの脱分極を誘発することができ、それにより、前記外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの前記脱分極は、直腸内の便の貯蔵を可能にし、
前記ポリヌクレオチドは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む方法。
１９． 光応答性カチオンチャネルタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、効果的な量のポリヌクレオチドを、前記個体に投与することをさらに含み、前記光応答性カチオンチャネルタンパク質は、前記個体における直腸の収縮を担う筋肉の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、前記光応答性カチオンチャネルタンパク質は、光に応答して光応答性タンパク質を発現するニューロンの脱分極を誘発することができ、それにより、前記直腸の収縮を担う筋肉の神経支配を担うニューロンの前記脱分極は、排便を促進する、実施形態１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
２０． 前記便失禁は、出産、長期便秘、脳卒中、糖尿病、多発性硬化症、または脊髄損傷に関連する、実施形態１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
２１． 前記外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの前記集団は、前記個体における１つ以上の仙骨脊髄神経から生じるニューロンである、実施形態１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
２２． 前記外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの前記集団は、前記個体における陰部神経の下直腸枝のニューロンを含む、実施形態１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
２３． 外部シグナルに応答して光を生成することができる光源が、仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配の周囲、および／または陰部神経の下直腸枝の周囲に設置され、前記光は、前記ニューロンの細胞膜上に発現した前記光応答性オプシンタンパク質を活性化することができる、実施形態１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
２４． 前記光源は、赤色、アンバー色、青色、および／または緑色光を生成することができる、実施形態２３に記載の方法。
２５． 前記個体は、仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配および／または陰部神経の下直腸枝の周囲を包囲する前記光源を活性化することにより、前記外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの分極状態を外部的に制御する、実施形態２３に記載の方法。
２６． 前記ポリヌクレオチドは、仙骨脊髄神経の体性運動ニューロン細胞体への前記ポリヌクレオチドの注入により投与される、実施形態１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
２７． 前記ポリヌクレオチドは、陰部神経への前記ポリヌクレオチドの注入により投与される、実施形態１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
２８． 前記ポリヌクレオチドは、オヌフ核への前記ポリヌクレオチドの注入により投与される、実施形態１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
２９． 処置を必要とする個体における性機能障害を処置するための方法であって、
光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む効果的な量のポリヌクレオチドを、前記個体に投与することを含み、前記オプシンタンパク質は、前記個体の生殖器の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、
前記オプシンタンパク質は、光に応答してオプシンタンパク質を発現するニューロンの脱分極を誘発し、それにより、前記生殖器の神経支配を担うニューロンの前記脱分極は、性機能を回復させる方法。
３０． 回復した性機能は、勃起、オルガスム、射精、膣の潤滑、および性的興奮を維持するために必要な生殖器への触感からなる群から選択される１つ以上の機能である、実施形態２９に記載の方法。
３１． 前記性機能障害は、糖尿病性神経障害、多発性硬化症、腫瘍、第３期梅毒、内分泌障害、ホルモン欠乏、または脊髄損傷に関連する、実施形態２９に記載の方法。
３２． 前記生殖器の神経支配を担うニューロンの前記集団は、前記個体における１つ以上の仙骨脊髄神経から生じるニューロンを含む、実施形態２９に記載の方法。
３３． 前記生殖器の神経支配を担うニューロンの前記集団は、男性個体における陰部神経の陰茎背神経枝のニューロンを含む、実施形態２９に記載の方法。
３４． 前記生殖器の神経支配を担うニューロンの前記集団は、女性個体における陰部神経の陰核背神経のニューロンを含む、実施形態２９に記載の方法。
３５． 外部シグナルに応答して光を生成することができる光源が、仙骨脊髄神経の周囲および／または陰部神経の神経支配の周囲に設置され、前記光は、前記ニューロンの細胞膜上に発現した前記光応答性オプシンタンパク質を活性化することができる、実施形態２９に記載の方法。
３６． 前記光源は、赤色、アンバー色、青色、または緑色光を生成することができる、実施形態２９に記載の方法。
３７． 前記個体は、仙骨脊髄神経（複数を含む）および／または陰部神経を包囲する前記光源を活性化することにより、前記生殖器の神経支配を担うニューロンの分極状態を外部的に制御する、実施形態２９に記載の方法。
３８． 前記ポリヌクレオチドは、１つ以上の仙骨脊髄神経の体性運動ニューロン細胞体への前記ポリヌクレオチドの注入により投与される、実施形態２９に記載の方法。
３９． 前記ポリヌクレオチドは、陰部神経への前記ポリヌクレオチドの注入により投与される、実施形態２９に記載の方法。
４０． 前記ポリヌクレオチドは、オヌフ核への前記ポリヌクレオチドの注入により投与される、実施形態２９に記載の方法。
４１． 前記ポリヌクレオチドは、ベクターである、実施形態１から４０のいずれか一項に記載の方法。
４２． 前記ベクターは、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＨＳＶベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、実施形態４１に記載の方法。
４３． 前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９である、実施形態４２に記載の方法。
４４． 前記光応答性オプシンタンパク質は、シグナルペプチドを含む、実施形態１または１５に記載の方法。
４５． 前記ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：２１）を含む、実施形態１または１５に記載の方法。
４６． 前記膜輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号：１２）を含む、実施形態１または１５に記載の方法。
４７． 前記光応答性オプシンタンパク質の発現は、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンプロモーター、Ｔｈｙ１プロモーター、およびＣＡＭＫＩＩプロモーターからなる群から選択されるプロモーターにより制御される、実施形態１から４６のいずれか一項に記載の方法。
４８． 処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するためのキットであって、
ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ｉ）配列番号：１、配列番号：４、または配列番号：２３に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列と、ｉｉ）ＥＲ移行シグナルと、ｉｉｉ）膜輸送シグナルとを含むオプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、前記光は、前記オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキット。
４９． 効果的な量の前記ポリヌクレオチドを前記個体に投与するための説明であって、前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記光応答性オプシンタンパク質は、前記個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団、および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現する、説明と、前記光源を仙骨脊髄神経の排尿筋神経支配の周囲、および／または陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲に設置するための説明とをさらに備える、実施形態４８に記載のキット。
５０． 処置を必要とする個体における膀胱機能障害を処置するためのキットであって、
ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される１つ以上の配列と少なくとも９５％同一である配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、
ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、前記光は、前記オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキット。
５１． 効果的な量の前記ポリヌクレオチドを前記個体に投与するための説明であって、前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記光応答性オプシンタンパク質は、前記個体における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団、および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現する、説明と、前記光源を仙骨脊髄神経の排尿筋神経支配の周囲、および／または陰部神経の外尿道括約筋神経支配の周囲に設置するための説明とをさらに備える、実施形態５０に記載のキット。
５２． 前記膀胱機能障害は、排尿筋過反射および／または排尿筋外括約筋協調不全である、実施形態４８または５０に記載のキット。
５３． 処置を必要とする個体における便失禁を処置するためのキットであって、
ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ｉ）配列番号：１、配列番号：４、または配列番号：２３に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ｉｉ）ＥＲ移行シグナルと、ｉｉｉ）膜輸送シグナルとを含むオプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、前記光は、前記オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキット。
５４． 効果的な量の前記ポリヌクレオチドを前記個体に投与するための説明であって、前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記光応答性オプシンタンパク質は、前記個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現する、説明と、前記光源を仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配および／または陰部神経の下直腸枝の周囲に設置するための説明とをさらに備える、実施形態５３に記載のキット。
５５． 処置を必要とする個体における便失禁を処置するためのキットであって、
ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される１つ以上の配列と少なくとも９５％同一である配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、
ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、前記光は、前記オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキット。
５６． 効果的な量の前記ポリヌクレオチドを前記個体に投与するための説明であって、前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記光応答性オプシンタンパク質は、前記個体における外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現する、説明と、前記光源を仙骨脊髄神経の外肛門括約筋神経支配および／または陰部神経の下直腸枝の周囲に設置するための説明とをさらに備える、実施形態５５に記載のキット。
５７． 処置を必要とする個体における性機能障害を処置するためのキットであって、
ａ）光応答性オプシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される１つ以上の配列と少なくとも９５％同一である配列を含むアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドと、
ｂ）外部シグナルに応答して光を生成することができる光源であって、前記光は、前記オプシンタンパク質を活性化することができる光源とを備えるキット。
５８． 効果的な量の前記ポリヌクレオチドを前記個体に投与するための説明であって、前記ポリヌクレオチドによりコードされた前記光応答性オプシンタンパク質は、前記個体における生殖器の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現する、説明と、前記光源を、１つ以上の仙骨脊髄神経、陰部神経の陰茎背神経枝、および／または陰部神経の陰核背神経から生じる生殖器神経支配の周囲に設置するための説明とをさらに備える、実施形態５７に記載のキット。
５９． 前記アミノ酸配列は、シグナルペプチドをさらに含む、実施形態４８、４９、５３、５５、または５７に記載のキット。
６０． 前記ＥＲ移行シグナルは、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含む、実施形態４８または５３に記載のキット。
６１． 前記膜輸送シグナルは、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号：１２）を含む、実施形態４８または５３に記載のキット。
６２． 前記ポリヌクレオチドが、ベクターである、実施形態４８から６１のいずれか一項に記載のキット。
６３． 前記ベクターは、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＨＳＶベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択されるウイルスベクターである、実施形態６２に記載のキット。
６４． 前記光源は、アンバー色、赤色、青色、または緑色光を生成することができる、実施形態４８、４９、５３、５５、または５７に記載のキット。
６５． 前記外部シグナルは、無線シグナルである、実施形態４８、４９、５３、５５、または５７に記載のキット。
６６． 前記外部シグナルは、マイクロ波シグナルである、実施形態４８、４９、５３、５５、または５７に記載のキット。

Claims (16)

  1. 非ヒト哺乳動物において膀胱機能障害を治療する方法であって、
    ｉ）仙骨脊髄神経の体性運動ニューロン細胞体、陰部神経またはオヌフ核へ、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターの効果的な量を直接的に投与する工程であって、前記光応答性オプシンタンパク質が、非ヒト哺乳動物の排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団に発現され、前記ヌクレオチド配列が運動ニューロン特異的プロモーターに作用可能に連結しており、前記光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ｉ）配列番号：１に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ｉｉ）ＥＲ移行シグナルと、ｉｉｉ）膜輸送シグナルとを含むものである、投与する工程、
    ｉｉ）排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の近くに光源を移植する工程、および、
    ｉｉｉ）光源からの光により前記光応答性オプシンタンパク質を活性化する工程であって、前記光応答性オプシンタンパク質が光に応答してニューロンの過分極を誘導するものである、活性化する工程、
    を含む方法。
  2. 前記排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団が、前記動物の一つ以上の仙骨脊髄神経から生じる神経である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団が、前記動物の陰部神経のニューロンを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記光源が、仙骨脊髄神経から生じる排尿筋の神経支配の周囲、および／または、陰部神経の外尿道括約筋の神経支配の周囲にある、請求項１に記載の方法。
  5. 光源の光生成手段を外部から有効化および無効化することによって、前記動物の排尿筋の神経支配を担うニューロンおよび／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの分極状態を外部的に制御することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記組換え発現ベクターが、仙骨脊髄神経の体性運動ニューロン細胞体への組換え発現ベクターの注入により投与される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記組換え発現ベクターが、陰部神経への組換え発現ベクターの注入により投与される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記組換え発現ベクターが、オヌフ核への組換え発現ベクターの注入により投与される、請求項１に記載の方法。
  9. 前記光応答性オプシンタンパク質がシグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記ＥＲ移行シグナルが、アミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶ（配列番号：２１）を含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記膜輸送シグナルが、アミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶ（配列番号：１２）を含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記運動ニューロン特異的プロモーターが、シナプシンプロモーター、Ｔｈｙ１プロモーター、およびＣＡＭＫＩＩプロモーターからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  13. 前記組換え発現ベクターが、組換えウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
  14. 前記組換えウイルスベクターが、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純疱疹ウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  15. さらに、第二の光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第二の組換え発現ベクターの効果的な量を前記動物に投与することを含み、
    前記第二のオプシンタンパク質が、前記動物における排尿筋の神経支配を担うニューロンの集団および／または外尿道括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の細胞膜上に発現し、
    前記第二のオプシンタンパク質が、前記ニューロンの脱分極を誘発し、
    前記光応答性オプシンタンパク質が、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、および配列番号：１１からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、
    前記ヌクレオチド配列が、運動ニューロン特異的プロモーターに作用可能に連結している、請求項１に記載の方法。
  16. 非ヒト哺乳動物において便失禁を治療する方法であって、
    ｉ）外肛門括約筋の収縮を担う筋肉へ、光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターの効果的な量を直接的に投与する工程であって、前記光応答性オプシンタンパク質が、前記動物の外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団に発現され、前記ヌクレオチド配列が運動ニューロン特異的プロモーターに作用可能に連結しており、前記光応答性オプシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、ｉ）配列番号：１、配列番号：４または配列番号：２３に示される配列と少なくとも９５％同一である配列と、ｉｉ）ＥＲ移行シグナルと、ｉｉｉ）膜輸送シグナルとを含むものである、投与する工程、
    ｉｉ）外肛門括約筋の神経支配を担うニューロンの集団の近くに光源を移植する工程、および、
    ｉｉｉ）光源からの光により前記光応答性オプシンタンパク質を活性化する工程であって、前記光応答性オプシンタンパク質が光に応答して、前記オプシンタンパク質を発現するニューロンの過分極を誘導するものである、活性化する工程、
    を含む方法。
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