KR20220130174A - 페닐케톤뇨증에 대한 아데노 연관 바이러스 기반 유전자 치료법 - Google Patents

페닐케톤뇨증에 대한 아데노 연관 바이러스 기반 유전자 치료법 Download PDF

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다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 개시는 특히 AAV8 캡시드 및 인간 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 효소를 암호화하는 코돈 최적화 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 제공한다. 본 개시는 또한 치료를 필요로 하는 대상체에 AAV8 캡시드, 및 PAH를 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 결합된 프로모터를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 페닐케톤뇨증(PKU)을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 투여는 대상체에서 페닐알라닌 수준의 감소를 초래한다.

Description

페닐케톤뇨증에 대한 아데노 연관 바이러스 기반 유전자 치료법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 1월 16일에 출원된 미국 특허 일련 번호 62/962,011의 우선권 및 그 이익을 주장하며, 그 내용이 본원에 포함된다.
페닐케톤뇨증(PKU)은 간 효소 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)에 대한 유전자의 돌연변이를 특징으로 하는, 이를 비기능적으로 만드는, 상염색체 열성 대사 유전 장애이다. PAH는 아미노산 페닐알라닌(Phe)을 아미노산 티로신으로 대사하는 데 필요하다. PAH 활성이 감소되면, 페닐알라닌이 축적되어 페닐피루베이트(페닐케톤으로도 알려짐)로 전환된다. PKU를 치료하지 않고 방치하면 정신 지체, 발작 및 기타 심각한 의학적 문제를 초래할 수 있다. 현재 이 질환에 대한 근치법은 없으며, 관리 표준은 단백질 함량이 높은 음식을 최소화하는 식단 관리를 통하는 것이다.
생체내 치료 단백질을 생산하는 벡터의 사용은 질환의 치료에 바람직하지만 생체내 요망되는 치료 단백질의 낮은 생산을 포함하는 다양한 요인에 의해 제한된다.
요약
본 발명은 특히 유전자 치료법을 사용하는 PKU의 효과적 치료 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명은 부분적으로, 코돈-최적화 인간 PAH를 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 사용하는 질환의 동물 모델에서의 PKU의 성공적인 치료의 놀라운 발견에 기반한다. 예를 들어, 하기의 실시예 섹션에서 더 자세히 설명된 바와 같이, PAH를 암호화하는 rAAV 벡터의 투여는 효율적인 단백질 발현을 초래했다. 또한, AAV8 캡시드 및 코돈-최적화된 인간 PAH를 암호화하는 rAAV 벡터는 PKU 마우스의 혈장 및 뇌 모두에서 페닐알라닌 수준을 감소시키고 티로신 및 트립토판 수준을 증가시키는 데 특히 효과적이었다. 따라서, 본 발명자들은 본원에 기재된 유전자 치료법 접근이 PKU를 치료하는 데 매우 효과적일 수 있음을 실증하였다.
한 양태에서, 본 발명은 인간 PAH를 암호화하는 코돈-최적화 서열을 포함하는 rAAV를 제공하고, 코돈-최적화 서열은 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 70% 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 코돈-최적화 서열은 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 75% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 코돈-최적화 서열은 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 80% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 코돈-최적화 서열은 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 85% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 코돈-최적화 서열은 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 코돈-최적화 서열은 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 95% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 코돈-최적화 서열은 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 99% 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 코돈-최적화 서열은 서열 번호 11-27 중 하나와 동일하다.
일부 구현예에서, rAAV는 AAV8 캡시드를 암호화한다.
일부 구현예에서, rAAV8 캡시드는 야생형 AAV8 캡시드와 비교하여 개선된 간 친화성을 갖는 변형된 AAV8 캡시드이다.
일부 구현예에서, AAV8 캡시드는 야생형 AAV 캡시드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, rAAV는 우드척 전사-후 조절 요소(WPRE) 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, WPRE 서열은 자연 발생 WPRE 서열이다.
일부 구현예에서, WPRE 서열은 변형된 WPRE 서열이다. 일부 구현예에서, WPRE 서열은 야생형 WPRE, WPRE3, 또는 WPREmut6delATG로부터 선택된다.
일부 구현예에서, rAAV는 간-특이적 프로모터를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 간-특이적 프로모터는 트랜스티레틴 프로모터(TTR)이다.
일부 구현예에서, rAAV는 시스 작용 조절 모듈(CRM)을 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 CRM 반복부를 포함한다.
일부 구현예에서, CRM은 CRM8이다.
일부 구현예에서, rAAV는 PAH 서열의 상류에 인트론을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 인트론은 마우스 미세 바이러스(MVM) 인트론이다.
한 양태에서, 본 발명은 인간 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)를 암호화하는 코돈-최적화 서열을 포함하는 rAAV를 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, PKU를 치료하는 방법을 제공하며, 코돈-최적화 서열은 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 70% 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, PAH를 암호화하는 코돈-최적화 서열은 40% 및 80%의 GC 함량을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, PAH를 암호화하는 코돈-최적화 서열은 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%의 GC 함량을 포함한다. 일부 구현예에서, PAH를 암호화하는 코돈-최적화 서열은 10개 이하의 CpG 섬 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, PAH를 암호화하는 코돈-최적화 서열은 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개의 CpG 섬 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, PAH를 암호화하는 코돈 최적화 서열은 6개 미만의 CpG 섬 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV의 투여는 대조군과 비교하여 대상체에서 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준의 감소를 초래한다.
일부 구현예에서, rAAV의 투여는 대조군과 비교하여 대상체에서 혈장 티로신 수준의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, rAAV의 투여는 대조군과 비교하여 대상체에서 혈장 트립토판 수준의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, 대조군은 대상체에서 혈장 Phe, 혈장 티로신 및/또는 혈장 트립토판의 치료-전 수준이다.
일부 구현예에서, 대조군은 과거 데이터에 기반한 혈장 Phe, 혈장 티로신 및/또는 혈장 트립토판의 참조 수준이다. 예를 들어, 과거 데이터(예를 들어, 조직 샘플 측정, 단백질 또는 mRNA 측정)는 다른 환자, 동일한 환자(예를 들어, 치료-전) 또는 건강한 개체로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV는 약 1x1010 vg/kg, 약 1x1011 vg/kg, 약 1x1012 vg/kg, 약 1x1013 vg/kg, 약 1x1014 vg/kg, 또는 약 1x1015 vg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 전신 투여된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 정맥내 투여된다.
도 1a~1d는 야생형(wt) 및 코돈-최적화된(co) 인간 PAH(hPAH) 발현 서열을 포함하는 예시적인 발현 작제물의 일련의 개략도이다. 발현 작제물에 나타낸 상응하는 co hPAH 서열은 표 2에서 확인된다. ITR: 역 말단 반복부; hTTR: 인간 트랜스티레틴 프로모터; CRM: 시스-작용 조절 모듈; MVM 인트론: 마우스 미세 바이러스 인트론; BGH pA: 소 성장 호르몬 종결인자 + 폴리A; WPRE: 우드척 전사-후 조절 요소.
도 2는 wt 또는 co hPAH를 암호화하는 rAAV8 벡터로 감염된 HepG2 세포에서 hPAH 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. hPAH 단백질을 표시하는 단백질 밴드는 ~50 kD에 있다.
도 3a는 rAAV 투여 1주, 2주, 3주, 4주 및 5주 후 기준선에서 Phe, Tyr 및 Trp의 혈장 수준을 나타내는 예시적인 그래프이다. 도 3b는 co hPAH 또는 wt hPAH중 하나를 포함하는 rAAV8의 생체내 형질도입 효율(hPAH DNA) 및 전사 효율(hPAH RNA)을 나타내는 일련의 막대 그래프를 도시한다.
도 4는 코돈-최적화 hPAH를 암호화하는 rAAV8을 사용한 유전자 치료법에 의한 치료 3주 후 PKU 마우스에서의 외피 색상 보정의 예시적인 표시를 나타낸다.
도 5는 치료 0주, 1주, 2주, 3주, 4주 및 5주 후 PAH-KO 마우스의 Phe, Tyr 및 Trp의 혈장 수준 정상화 및 외피 색상 보정에 있어서 코돈-최적화 hPAH를 암호화하는 rAAV8 벡터의 용량-의존적 효능을 나타낸다.
도 6은 PAH-KO 마우스의 뇌에서 대형 신경 아미노산(LNAA)(페닐알라닌, 티로신 및 트립토판) 및 신경전달물질(도파민, 세로토닌 및 노르아드레날린)의 수준이 이상조절됨을 나타내는 예시적인 그래프이다.
도 7a는 co hPAH를 암호화하는 rAAV8 벡터로의 처리 5주 후 또는 미처리 PAH-KO 마우스에서 PAH-KO 마우스의 뇌 조직에서 Phe, Tyr 및 Trp의 수준을 나타내는 예시적인 그래프이다. 도 7b는 코돈-최적화 hPAH를 암호화하는 rAAV8 벡터로의 처리 5주 후 또는 미처리 PAH-KO 마우스에서 PAH-KO 마우스의 뇌 조직에서 세로토닌, 노르아드레날린 및 도파민 신경전달물질의 수준을 나타내는 예시적인 그래프이다.
도 8은 PAH-KO 마우스에서 다양한 용량으로 코돈-최적화 hPAH를 암호화하는 rAAV 벡터의 기준선, 투여 7일, 14일, 35일, 56일, 98일, 140 및 182일 후 Phe의 혈장 수준을 나타내는 예시적인 그래프이다. 코돈-최적화 hPAH로 처리된 마우스의 Phe 수준을 C22 처리된 PAH-KO 마우스 및 C22 처리된 wt 마우스의 수준과 비교했다.
정의
아데노-연관 바이러스(AAV): 본원에 사용된 용어 "아데노-연관 바이러스" 또는 "AAV" 또는 재조합 AAV("rAAV")는 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3(유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 및 양 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Fields 등, Virology, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers); Gao 등, J. Virology 78:6381-6388 (2004); Mori 등, Virology 330:375-383 (2004) 참조). 전형적으로 AAV는 분열 세포와 비분열 세포를 모두 감염시킬 수 있으며 숙주 세포의 게놈 내로 통합되지 않고 염색체외 상태로 존재할 수 있다. AAV 벡터는 유전자 치료법에서 일반적으로 사용된다. AAV는 코돈 최적화 AAV를 또한 포함한다.
투여: 본원에 사용된 용어 "투여", "전달" 또는 "도입"은 rAAV 벡터의 효율적인 전달을 초래하는 방법 또는 경로에 의해 PAH를 암호화하는 rAAV 벡터를 대상체 내로 전달하는 맥락에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어 정맥내, 피하 또는 경피를 포함하는 rAAV 벡터를 투여하기 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. rAAV 벡터의 경피 투여는 "유전자 총" 또는 바이올리스틱 입자 전달 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 비-바이러스성 지질 나노입자를 통해 투여된다.
동물: 본원에서 사용된 용어 "동물"은 동물계의 임의의 구성원을 나타낸다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발생 단계에 있는 인간을 나타낸다. 일부 구현예에서, "동물"은 임의의 발생 단계에 있는 비인간 동물을 나타낸다. 특정 구현예에서, 비-인간 동물은 포유류(예를 들어, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충 및/또는 벌레를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 동물은 트랜스제닉 동물, 유전자 조작 동물, 및/또는 클론일 수 있다.
대략 또는 약: 하나 이상의 관심 값에 적용되는 본원에 사용된 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 참조 값과 유사한 값을 나타낸다. 특정 구현예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 언급되거나 맥락 상 달리 명백하지 않은 한(이러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외) 언급된 참조 값의 어느 방향으로든(더 크든 더 작든) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 내에 속하는 값의 범위를 나타낸다.
활성: 본원에 사용된 문구 "활성"은 생물학적 시스템, 특히 유기체에서 활성을 갖는 임의의 제제의 특성을 나타낸다. 예를 들어, 유기체에 투여될 때 그 유기체에 생물학적 영향을 미치는 제제는 활성 또는 생물학적 활성으로 간주된다. 특정 구현예에서, 펩티드가 활성이거나 생물학적으로 활성인 경우, 펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 공유하는 펩티드의 일부는 전형적으로 "활성" 부분으로 나타낸다.
기능적 등가물 또는 유도체: 본원에 사용된 용어 "기능적 등가물" 또는 "기능적 유도체"는 아미노산 서열의 기능적 유도체의 맥락에서 원래 서열와 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능적 또는 구조적)을 유지하는 분자를 표시한다. 기능적 유도체 또는 등가물은 천연 유도체일 수 있거나 합성으로 제조된다. 예시적인 기능적 유도체는 단백질의 생물학적 활성이 보존된다면, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 치환 아미노산은 바람직하게는 치환된 아미노산의 것과 유사한 화학적-물리적 특성을 갖는다. 바람직한 유사한 화학-물리적 특성은 전하, 부피, 소수성, 친수성 등의 유사성을 포함한다.
시험관내: 본원에 사용된 용어 "시험관내"는 다세포 유기체에서가 아니라 인공 환경, 예를 들어 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등에서 발생하는 사건을 나타낸다.
생체내: 본원에 사용된 용어 "생체내"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체에서 발생하는 사건을 나타낸다. 세포 기반 시스템의 맥락에서, 본 용어는 살아있는 세포에서 발생하는(예를 들어, 시험관내 시스템과 반대인) 사건을 나타내는 데 사용될 수 있다.
IRES: 본원에 사용된 용어 "IRES"는 임의의 적합한 내부 리보솜 진입 부위 서열을 나타낸다.
단리된: 본원에 사용된 용어 "단리된"은 (1) 처음 생산될 때(자연에서건 및/또는 실험 설정에서건) 연관된 성분의 적어도 일부로부터 분리되고 및/또는 (2) 인공적으로 생산, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 독립체를 나타낸다. 단리된 물질 및/또는 독립체는 처음에 연관되었던 다른 성분의 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 약 99%, 실질적으로 100%, 또는 100%로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 98%, 약 99% 초과, 실질적으로 100% 또는 100% 순수하다. 본원에 사용된 바와 같이, 물질에 실질적으로 다른 성분이 없는 경우 이는 "순수한" 것이다. 본원에 사용된 용어 "단리된 세포"는 다세포 유기체에 함유되지 않은 세포를 나타낸다.
폴리펩티드: 본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 함께 결합된 아미노산의 순차적 사슬을 나타낸다. 본 용어는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 나타내기 위해 사용되지만, 당업자는 이 용어가 긴 사슬로 제한되지 않고 펩티드 결합을 통해 함께 결합된 2개의 아미노산을 포함하는 최소 사슬을 나타낼 수 있음을 이해할 것이다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 폴리펩티드는 가공되고/되거나 변형될 수 있다.
단백질: 본원에 사용된 용어 "단백질"은 별개의 단위로서 기능하는 하나 이상의 폴리펩티드를 나타낸다. 단일 폴리펩티드가 별개의 기능적 단위이고 별개의 기능적 단위를 형성하기 위해 다른 폴리펩티드와 영구적인 또는 일시적인 물리적 연합을 필요로 하지 않는 경우, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 별개의 기능적 단위가 물리적으로 서로 연합하는 하나 초과의 폴리펩티드로 이루어지는 경우, 용어 "단백질"은 물리적으로 커플링되고 별개의 단위로서 함께 기능하는 여러 폴리펩티드를 나타낸다.
조절 요소: 본원에 사용된 용어 "조절 요소"는 유전자의 전사를 조절 및/또는 제어할 수 있는 전사 제어 요소, 특히 비-코딩 시스-작용 전사 제어 요소를 나타낸다. 조절 요소는 적어도 하나의 전사 인자 결합 부위, 예를 들어 조직 특이적 전사 인자에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다. 본원에 기재된 구현예에서, 조절 요소는 간-특이적 전사 인자에 대한 적어도 하나의 결합 부위를 갖는다. 전형적으로, 조절 요소는 조절 요소 없이 프로모터 단독으로부터의 유전자 전사와 비교할 때 프로모터-구동 유전자 발현을 증가시키거나 증강시킨다. 따라서, 조절 요소는 특히 인핸서 서열을 포함하지만, 전사를 증강시키는 조절 요소는 전형적인 원위 상류 인핸서 서열에 제한되지 않고 이들이 조절하는 유전자의 임의의 거리에서 발생할 수 있음이 이해되어야 하다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, 전사를 조절하는 서열은 생체내에서 조절되는 유전자의 상류(예를 들어, 프로모터 영역) 또는 하류(예를 들어, 3'UTR)에 위치할 수 있으며, 유전자의 바로 근처 또는 더 멀리에 위치할 수 있다. 조절 요소는 자연 발생 서열, 이러한 조절 요소(일부)의 조합 또는 조절 요소의 몇몇 카피, 예를 들어 비-자연 발생 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 조절 요소는 요망되는 발현 수준을 달성하기 위해 자연 발생 및 최적화되거나 조작된 조절 요소를 포함한다.
대상체: 본원에 사용된 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 나타낸다. 인간은 출생 전 및 출생 후 형태를 포함한다. 많은 구현예에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 보이는 인간을 나타내는 환자일 수 있다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애에 걸리거나 이에 취약할 수 있지만 질환 또는 장애의 증상을 나타낼 수도 있고 나타내지 않을 수도 있다.
실질적으로: 본원에 사용된 용어 "실질적으로"는 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 상태를 나타낸다. 생물학 분야의 당업자는 생물학적 및 화학적 현상이 일어나더라도, 완료되고 및/또는 완전하게 진행되거나 절대적 결과를 달성하거나 배제하는 경우가 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 완전성의 잠재적인 결여를 포착하기 위해 본원에서 사용된다.
실질적인 상동성: 문구 "실질적인 상동성"은 본원에서 아미노산 또는 핵산 서열 간 비교를 나타내는 데 사용된다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 2개의 서열이 상응하는 위치에서 상동성 잔기를 함유하는 경우 이들은 일반적으로 "실질적으로 상동성"인 것으로 간주된다. 상동성 잔기는 동일한 잔기일 수 있다. 대안적으로, 상동성 잔기는 구조적 및/또는 기능적 특징이 적절하게 유사할 동일하지 않은 잔기일 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 특정 아미노산은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 갖는 것으로 분류된다. 동일한 유형의 또 다른 아미노산에 대한 한 아미노산의 치환은 종종 "상동성" 치환으로 간주될 수 있다.
당업계에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTN 및 아미노산 서열에 대해 BLASTP, 갭(gapped) BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상용 컴퓨터 프로그램에서 이용 가능한 알고리즘을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있다. 이러한 프로그램의 예는 문헌(Altschul, 등, basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, 등, Methods in Enzymology; Altschul, 등, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, 등, Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener, 등, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999)에 기재되어 있다. 상동성 서열을 확인하는 것 외에도, 위에서 언급된 프로그램은 전형적으로 상동성 정도의 표시를 제공한다. 일부 구현예에서, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 상응하는 잔기가 잔기의 관련 신장에 걸쳐 상동성인 경우 두 서열은 실질적으로 상동성인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 신장은 전체 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 신장은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 이상의 잔기이다.
실질적인 동일성: "실질적인 동일성"이라는 문구는 본원에서 아미노산 또는 핵산 서열 간 비교를 나타내는 데 사용된다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 두 서열이 상응하는 위치에서 동일한 잔기를 함유하는 경우 이들은 일반적으로 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열은 뉴클레오티드 서열에 대해 BLASTN 및 아미노산 서열에 대해 BLASTP, 갭 BLAST 및 PSI-BLAST와 같은 상용 컴퓨터 프로그램에서 이용 가능한 알고리즘을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 사용하여 비교할 수 있다. 이러한 프로그램의 예는 문헌(Altschul, 등, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, 등, Methods in Enzymology; Altschul 등, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis 등, Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; 및 Misener, 등, (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999)에 기재되어 있다. 동일한 서열을 확인하는 것 외에도, 위에서 언급된 프로그램은 전형적으로 동일성 정도의 표시를 제공한다. 일부 구현예에서, 두 서열은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 상응하는 잔기가 잔기의 관련 신장에 걸쳐 동일하면 실질적으로 동일한 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 관련 신장은 전체 서열이다. 일부 구현예에서, 관련 신장은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 이상의 잔기이다.
앓는: 질환, 장애 및/또는 병태를 "앓는" 개체는 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상으로 진단되었거나 이를 나타낸다.
치료 유효량: 본원에 사용된 용어, 치료제의 "치료 유효량"은 질환, 장애 및/또는 병태를 앓거나 이에 취약한 대상체에게 투여될 때 질환, 장애 및/또는 병태의 증상(들)을 치료, 진단, 예방 및/또는 발병을 지연하기에 충분한 양을 의미한다. 치료 유효량이 적어도 하나의 단위 용량을 포함하는 투약 요법을 통해 전형적으로 투여된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
치료: 본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 부분적 또는 전체적 개선, 완화, 경감, 억제, 예방, 발병 지연, 중증도 감소 및/또는 발생률 감소에 사용되는 임의의 방법을 나타낸다. 질환과 연관된 병태의 발생 위험을 감소시킬 목적으로 질환의 징후를 나타내지 않고/않거나 질환의 초기 징후만 나타내는 대상체에 치료가 투여될 수 있다.
본원에서 종말점에 의한 수치 범위의 열거는 그 범위 내에 포함된 모든 숫자 및 분수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.9, 4 및 5를 포함함). 또한 이의 모든 숫자 및 분수는 "약"에 의해 수식된 것으로 추정됨이 이해되어야 하다.
본 발명의 다양한 양태는 하기 섹션에서 상세히 설명된다. 섹션의 사용은 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 각 섹션은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 본 출원에서 "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에 사용된 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 맥락 상 명확히 달리 지시하지 않는 한 단수 및 복수 지시대상을 모두 포함한다.
상세한 설명
본 발명은 특히 야생형 또는 코돈-최적화 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)를 암호화하는 rAAV 벡터를 사용하여 PKU를 치료하는 방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명은 PKU의 적어도 하나의 증상 또는 특징이 강도, 중증도, 또는 빈도에 있어서 감소되도록 하는 유효 용량으로 인간 PAH를 암호화하는 야생형 또는 코돈 최적화 서열을 포함하는 rAAV를 투여함으로써 PKU를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 유전자 치료법의 방법은 페닐알라닌 수준을 정상화하는 데 특히 효과적이었다.
페닐케톤뇨증(PKU)
본 발명은 PKU를 앓고 있거나 이에 취약한 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. PKU는 간 효소 PAH에 대한 유전자의 돌연변이를 특징으로 하는, 이를 비기능적으로 만드는 상염색체 열성 대사 유전 장애이다. PAH는 아미노산 페닐알라닌(Phe)을 아미노산 티로신으로 대사하는 데 필요하다. PAH 활성이 감소되면 페닐알라닌이 축적되어 소변에서 검출될 수 있는 페닐피루베이트(페닐케톤으로도 알려짐)로 전환된다.
페닐알라닌은 대형 중성 아미노산(LNAA)이다. LNAA는 대형 중성 아미노산 수송체(LNAAT)를 통해 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로지르는 수송을 위해 경쟁한다. 혈중 과도한 Phe는 수송체를 포화시키고 뇌의 다른 LNAA 수준을 감소시키는 경향이 있다. 이러한 다른 아미노산 중 몇 가지는 단백질과 신경전달물질 합성에 필요하기 때문에, Phe 축적은 뇌 발달을 방해하고 정신 지체를 유도할 수 있다.
뇌 발달 장애 외에도 이 질환은 생성되는 케톤 중 하나인 페닐아세테이트로 인해 발작, 백색증, 과잉 행동, 성장 부진, 피부 발진(습진), 소두증 및/또는 영향을 받은 아기의 땀과 소변에서 "곰팡이" 냄새를 포함하는 다양한 증상을 임상적으로 제시할 수 있다. 치료를 받지 않은 어린이는 전형적으로 태어날 때는 정상이지만 정신 및 사회적 기술이 지연되고 머리 크기가 정상보다 훨씬 작으며 종종 진행성 뇌 기능 손상을 실증한다. 아동이 성장하고 발달함에 따라 과잉 행동, 팔이나 다리의 경련 움직임, EEG 이상, 피부 발진, 떨림, 발작 및 심각한 학습 장애를 포함한 추가 증상이 발생하는 경향이 있다. PKU는 전형적으로 출생 2-7일 후 수행되는 대부분의 국가의 정례적인 신생아 스크리닝 패널에 포함된다.
PKU가 충분히 조기에 진단되면 영향을 받은 신생아는 식이 또는 식이와 약물의 조합을 통해 Phe 수준을 관리하고 제어해야만 비교적 정상적인 뇌 발달을 가지며 자랄 수 있다. 모든 PKU 환자는 최적의 뇌 발달을 위해 Phe가 낮은 특별 식이를 준수해야 하다. 식이는 육류, 닭고기, 생선, 계란, 견과류, 치즈, 콩류, 우유 및 기타 유제품과 같은 Phe가 높은 식품을 엄격하게 제한하거나 제거해야 하다. 감자, 빵, 파스타, 및 옥수수와 같은 전분 식품은 모니터링해야 한다. 유아는 모유의 모든 이점을 얻기 위해 여전히 모유 수유를 할 수 있지만 양을 또한 모니터링해야 하며 누락된 영양소에 대한 보충이 필요할 것이다. 아스파탐은 페닐알라닌을 함유하므로, 많은 다이어트 식품 및 청량 음료에 존재하는 감미료 아스파탐도 피해야 한다.
일생 동안 환자는 저페닐알라닌 식이에서 달리 결핍될 아미노산 및 기타 필수 영양소를 얻기 위해 보충 포뮬라, 알약 또는 특별히 제형화된 식품을 사용할 수 있다. 일부 Phe이 많은 단백질 합성에 필요하고 적절한 성장에 필요하지만 PKU 환자에서는 Phe 수준을 엄격하게 제어해야 하다. 또한 PKU 환자는 일반적으로 페닐알라닌으로부터 유도되는 티로신 보충제를 섭취해야 한다. 다른 보충제는 표준 Phe-비함유 식이에서 누락된 장쇄 지방산을 대체하고 신경 발달을 개선하기 위한 어유, 철분 또는 카르니틴을 포함할 수 있다.
PKU에 대한 또 다른 잠재적인 치료법은 특정 환자에서 Phe의 혈중 농도를 낮출 수 있는 Phe 산화의 보조인자인 테트라하이드로바이오프테린(BH4)이다. BH4 치료법에 반응하는 환자는 또한 이들이 먹을 수 있는 천연 단백질의 양을 늘릴 수 있다. 그러나 BH4 치료법은 PAH 결핍의 근본적인 문제를 치료하지 못하고 PKU 환자의 10%에 대해서만 적합하다. 따라서, 면역 억제를 유발하지 않는 개선된 안전성 및 용량 감소를 갖는 PKU의 효과적인 치료가 현재 부족하다.
rAAV PAH 벡터 설계
일부 양태에서, 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 단백질을 암호화하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터가 본원에 제공된다. 본 개시내용의 예시적인 rAAV 벡터를 예시하는 개략도가 도 1b에 예시된다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 rAAV 벡터는 간 특이적 프로모터, 5' 및 3' 역 말단 반복부(ITR), 시스 작용 조절 모듈(CRM), 및 인트론을 포함한다.
벡터의 PAH 서열은 야생형 또는 코돈-최적화 변이체일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 야생형 PAH 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 코돈-최적화 PAH 서열을 포함한다.
본 발명에 적합한 PAH는 자연 발생 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 단백질의 적어도 일부 활성을 대체하거나 PAH-결핍과 연관된 하나 이상의 표현형 또는 증상을 구제할 수 있는 임의의 단백질 또는 단백질의 일부이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 PAH 뉴클레오티드 서열은 wt hPAH 단백질을 암호화하는 PAH 서열을 포함한다(GenBank U49897, 그 내용은 본원에 참조로 포함됨). 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 PAH 뉴클레오티드 서열은 야생형 인간 PAH 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 자연 발생 인간 PAH 아미노산 서열을 표 1에 나타낸다:
Figure pct00001
다양한 종류의 프로모터가 본원에 기재된 rAAV 벡터에서 사용될 수 있다. 이들은 예를 들어 편재(ubiquitous), 조직 특이적 및 조절 가능한(예를 들어, 유도성 또는 억제성) 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 간-특이적 프로모터이다. 간 특이적 프로모터의 예는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 인간 트랜스티레틴 프로모터(hTTR), α-항트립신 프로모터, 인간 인자 IX 프로/간 전사 인자 반응성 올리고머, LSP 및 기본 알부민 프로모터를 포함한다. 간 특이적 프로모터는 예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌(Zhijian Wu 등, Molecular Therapy vol 16, no 2, 2008년 2월)에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 편재 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 닭 베타 액틴 프로모터이다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 mRNA의 전사 및/또는 번역을 촉진하기 위한 추가의 인핸서 또는 조절 요소(예를 들어, 인핸서 서열, Kozak 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열, IRES 등)를 함유한다. 일부 구현예에서, 벡터는 5' 및 3' 역 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 인핸서 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 폴리(A) 꼬리를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 인트론과 같은 하나 이상의 작은 요소를 포함한다. 다양한 인트론이 당업계에 알려져 있다. 본원에 기재된 rAAV 벡터에 적합한 인트론은 예를 들어 MVM 인트론, 절단된 F.IX 인트론, 키메라 β 글로빈 SD/면역글로불린 중쇄 SA 인트론, SV40 및/또는 알파 글로빈 1차 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 MVM 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 SV40 인트론을 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)를 포함한다. WPRE의 다양한 최적화 또는 변이체 형태가 당업계에 알려져 있으며, 특히 WPRE3, WPREmut6delATG를 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 시스-액틴 조절 모듈(CRM)을 포함한다. 다양한 종류의 CRM이 본원에 기재된 벡터에서 사용하기 적합하고, 예를 들어 간-특이적 CRM, 뉴런-특이적 CRM 및/또는 CRM8을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 초과의 CRM을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 벡터는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CRM을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 3개의 CRM, 예를 들어 3개의 CRM8을 포함한다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 전사 안정성을 증가시키기 위해, 보다 효율적인 번역을 위해 및/또는 면역원성을 감소시키기 위해 서열 최적화된다. 일부 구현예에서, PAH는 서열 최적화된다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 AAV11 벡터이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV1이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV2이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV3이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV4이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV5이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV6이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV7이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV8이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV9이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV10이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 AAV11이다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 서열 최적화된다. 일부 구현예에서, rAAV 캡시드가 변형된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, rAAV8 캡시드가 변형된다.
예시적인 요소 서열을 아래의 표 2에 나타낸다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 표 2에 나타낸 벡터 요소 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 rAAV 벡터 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 표 2에 나타낸 벡터 요소 뉴클레오티드 서열과 동일한 벡터 요소 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
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일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터는 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 코돈-최적화 PAH 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터는 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 70% 동일성을 갖는 코돈-최적화 PAH 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터는 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 75%의 동일성을 갖는 코돈-최적화 PAH 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터는 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 코돈-최적화 PAH 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터는 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 85%의 동일성을 갖는 코돈-최적화 PAH 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터는 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 코돈-최적화 PAH 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터는 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 코돈-최적화 PAH 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터는 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 99%의 동일성을 갖는 코돈-최적화 PAH 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터는 서열 번호 11-27 중 하나와 동일한 코돈-최적화 PAH 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
질환 치료를 위한 PAH를 암호화하는 rAAV 벡터의 용도
PAH 효소 결핍과 연관된 질환을 치료하는 방법이 본원에 기재된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 rAAV 벡터는 페닐케톤뇨증(PKU)과 같은 PAH 결핍을 갖는 대상체를 치료하는 데 적합하다. 치료 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에 본원에 기재된 바와 같은 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 투여하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 rAAV 벡터는 PAH 결핍 또는 장애와 연관된 임의의 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, rAAV 벡터는 치료를 필요로 하는 대상체에 투여 후 에피좀으로 유지된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 치료를 필요로 하는 대상체에 투여 후 에피좀으로 유지되지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 대상체의 게놈 내로 통합된다. 이러한 통합은 예를 들어 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성제제-유사 효과인자 뉴클레아제(TALENS), ARCUS 게놈 편집 및/또는 CRISPR-Cas 시스템과 같은 다양한 유전자 편집 기술을 사용하여 달성할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 rAAV 벡터를 함유하는 약학 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용된다. 본 발명의 rAAV 벡터를 함유하는 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 함유한다. 적합한 약학 담체의 예는 당업계에 잘 알려져 있으며, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 유형의 수화제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체는 통상적인 방법에 의해 제형화될 수 있고 치료 유효량으로 대상체에 투여된다.
rAAV 벡터는 적절한 경로를 통해 치료를 필요로 하는 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 정맥내, 복강내, 피하 또는 피내 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 피내 투여는 "유전자 총" 또는 생물학적 입자 전달 시스템의 사용에 의한 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 비-바이러스성 지질 나노입자를 통해 투여된다. 예를 들어, rAAV 벡터를 포함하는 조성물은 하나 이상의 희석제, 완충제, 리포좀, 지질, 지질 복합체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터는 지질 나노입자와 같은 나노입자 또는 미소구체 내에 포함된다.
일부 구현예에서, 기능적 PAH는 대상체에서 검출된다. PAH를 검출하는 다양한 방식이 사용될 수 있으며, 예를 들어 조직 샘플링(생검 포함) 및 PAH의 존재에 대한 스크리닝을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 약 2 내지 6주 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 약 2주 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 약 3주 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 약 4주 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 약 5주 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 약 6주 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 약 2 내지 6주 후 대상체의 간세포에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 7주 초과 후 대상체의 간세포에서 검출 가능하다.
일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 3개월, 6개월, 12개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년 또는 10년 후 대상체에서 검출 가능하다. 따라서, 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 3개월 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 6개월 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 12개월 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 2년 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 3년 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 4년 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 5년 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 6년 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 7년 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 8년 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 9년 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 적어도 10년 후 대상체에서 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 기능적 PAH는 rAAV 벡터의 투여 후 대상체의 남은 생애 동안 대상체에서 검출 가능하다.
일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 치료 유효량으로 활성 PAH의 생성을 초래한다.
일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 페닐알라닌(Phe)의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, Phe의 감소는 대상체의 혈장에서 검출된다. 일부 구현예에서, Phe의 감소는 중추신경계(CNS)에서 검출된다. 일부 구현예에서, Phe의 감소는 대상체의 뇌 조직에서 검출된다. 일부 구현예에서, Phe의 감소는 대상체의 간 조직에서 검출된다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 PAH를 포함하는 rAAV를 투여하기 전 대상체의 기준선 Phe 수준과 비교하여 대상체에서 Phe을 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 또는 약 10% 감소시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 95% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 90% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 85% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 80% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 75% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 70% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 65% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 60% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 55% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 50% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 45% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 40% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 35% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 30% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 25% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 20% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 15% 감소시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Phe을 약 10% 감소시킨다.
일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 비-Phe 대형 중성 아미노산(LNAA)의 증가를 초래한다. 이론에 얽매이지 않고, 다양한 작용 방식은 예를 들어, LNAA의 생산 증가, LNAA의 수송 또는 트래픽(trafficking) 증가, 및/또는 LNAA의 안정성 증가를 포함하는 대상체에서의 LNAA의 증가를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA의 증가는 대상체의 혈장에서 검출된다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA의 증가는 중추 신경계(CNS)에서 검출된다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA의 증가는 대상체의 뇌 조직에서 검출된다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA의 증가는 대상체의 간 조직에서 검출된다. 일부 구현예에서 비-Phe LNAA는 티로신이다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA는 트립토판이다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA는 발린이다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA는 이소류신이다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA는 메티오닌이다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA는 트레오닌이다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA는 류신이다. 일부 구현예에서, 비-Phe LNAA는 히스티딘이다.
일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 티로신(Tyr)의 증가를 초래한다. 이론에 얽매이지 않고, 다양한 작용 방식은 예를 들어 Tyr의 생산 증가, Tyr의 수송 또는 트래픽 증가, 및/또는 Tyr의 안정성 증가를 포함하여 대상체에서의 Tyr의 증가를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, Tyr의 증가는 대상체의 혈장에서 검출된다. 일부 구현예에서, Tyr의 증가는 대상체의 뇌 조직에서 검출된다. 일부 구현예에서, Tyr의 증가는 대상체의 간 조직에서 검출된다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 PAH를 포함하는 rAAV를 투여하기 전 대상체의 기준선 Tyr 수준과 비교하여 대상체에서 Tyr을 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 또는 약 10% 증가시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 95% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 90% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 85% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 80% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 75% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 70% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 65% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 60% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 55% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 50% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 45% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 40% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 35% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 30% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 25% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 20% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 15% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Tyr을 약 10% 증가시킨다.
일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 트립토판(Trp)의 증가를 초래한다. 이론에 얽매이지 않고, 다양한 작용 방식은 예를 들어 Trp의 생산 증가, Trp의 수송 또는 트래픽 증가, 및/또는 Trp의 안정성 증가를 포함하여 대상체에서의 Trp 증가를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, Trp의 증가는 대상체의 혈장에서 검출된다. 일부 구현예에서, Trp의 증가는 대상체의 뇌 조직에서 검출된다. 일부 구현예에서, Trp의 증가는 대상체의 간 조직에서 검출된다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 PAH를 포함하는 rAAV를 투여하기 전 대상체의 기준선 Trp 수준과 비교하여 대상체에서 Trp을 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 또는 약 10% 증가시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 95% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 90% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 85% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 80% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 75% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 70% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 65% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 60% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 55% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 50% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 45% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 40% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 35% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 30% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 25% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 20% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 15% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 Trp을 약 10% 증가시킨다.
일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 신경전달물질의 증가를 초래한다. 이론에 얽매이지 않고, 다양한 작용 방식은 예를 들어 신경전달물질의 생산 증가, 신경전달물질의 수송 또는 트래픽 증가, 및/또는 신경전달물질의 안정성 증가를 포함하여 대상체에서의 신경전달물질의 증가를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 신경전달물질의 증가는 대상체의 뇌 조직에서 검출된다. 일부 구현예에서, 신경전달물질의 증가는 대상체의 중추신경계(CNS)에서 검출된다. 일부 구현예에서, 신경전달물질은 세로토닌, 도파민, 노르아드레날린, 에피네프린 또는 노르에피네프린이다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 PAH를 포함하는 rAAV를 투여하기 전 대상체의 신경전달물질 기준선 수준과 비교하여 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 또는 약 10% 증가시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 95% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 90% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 85% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 80% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 75% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 70% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 65% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 60% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 55% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 50% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 45% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 40% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 35% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 30% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 25% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 20% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 15% 증가시킨다. 일부 구현예에서, PAH를 포함하는 투여된 rAAV는 대상체에서 하나 이상의 신경전달물질을 약 10% 증가시킨다.
일부 구현예에서, 대상체에 대한 AAV 벡터의 투여 후 대상체에서 검출 가능한 기능적 PAH의 수준은 PAH를 포함하는 rAAV의 투여 전 대상체에서 검출 가능한 기능적 PAH의 양보다 약 2 내지 10배 더 크다.
일부 구현예에서, 대상체에 대한 AAV 벡터의 투여 후 검출 가능한 기능적 PAH의 수준은 인간 치료 수준을 충족하거나 초과한다. 일부 구현예에서, rAAV 벡터의 투여 후 기능적 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 2 내지 35배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 2배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 기능적 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 3배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 기능적 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 4배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 5배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 6배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 6배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 7배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 8배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 9배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 10배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 15배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 20배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준 은 인간 치료 수준의 약 25배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 활성 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 30배이다. 일부 구현예에서, 투여 후 기능적 PAH의 수준은 인간 치료 수준의 약 35배이다.
일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터는 대상체 별 단회 용량으로 전달된다. 일부 구현예에서, 대상체는 최소 유효 용량(MED)을 전달받는다. 본원에 사용된 바와 같은 MED는 대상체에서 감소된 Phe 수준을 초래하는 PAH 활성을 달성하는 데 필요한 rAAV PAH 벡터 용량을 나타낸다.
벡터 역가는 벡터 조제물의 DNA 함량을 기반으로 결정된다. 일부 구현예에서, 정량적 PCR 또는 최적화된 정량적 PCR이 rAAV PAH 벡터 조제물의 DNA 함량을 결정하는 데 사용된다. 최적화된 정량적 PCR의 예는 이중 액적 PCR을 포함한다. 한 구현예에서, 투여량은 종말점을 포함하여, 약 1x1011 벡터 게놈(vg)/체중 kg 내지 약 1x1013 vg/kg이다.
일부 구현예에서, 투여량은 1x10n vg/kg이다. 또 다른 구현예에서, 투여량은 1x1012 vg/kg이다. 특정 구현예에서, 대상체에 투여되는 rAAV.hPAH의 용량은 적어도 1x1010 vg/kg, 5x1010 vg/kg, 1x1011 vg/kg, 5.0 x 1011 vg/kg, 1 x 1012 vg/kg, 2.0 x 1012 vg/kg, 3.5 x 1012 vg/kg, 4.0 x 1012 vg/kg, 4.5 x 1012 vg/kg, 5.0 x 1012 vg/kg, 5.5 x 1012 vg/kg, 6.0 x 1012 vg/kg, 6.5 x 1012 vg/kg, 7.0 x 1012 vg/kg, 8.0 x 1012 vg/kg, 9.0 x 1012 vg/kg, 1.0 x 1013 vg/kg, 2.5 x 1013 vg/kg, 5 x 1013 vg/kg, 7.5 x 1013 vg/kg 또는 1.0 x 1014 vg/kg이다.
일부 구현예에서, rAAV PAH 벡터 조성물은 약 1.0 x 109 vg 내지 약 1.0 x 1015 vg 범위인 양의 복제-결함 바이러스를 함유하도록 하는 투여량 단위로 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "투여량"은 치료 과정에서 대상체에게 전달된 총 투여량, 또는 다회 투여를 포함하는 치료 과정에서 단회 투여로 전달되는 양을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 투여량은 환자의 혈장 Phe 수준을 25% 이상 감소시키는 데 충분하다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 PKU의 치료를 위해 하나 이상의 치료법과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 PKU 식이와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 저단백 식이와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 PKU 기능식품 또는 영양 보충제 또는 영양 포뮬라와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 중성 아미노산 치료법과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 약리학적 약물과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 사프로프테린 2염산염과 함께 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 Kuvan®과 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 PKU 대사 효소와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 페가발리아제와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV PAH는 Palynziq®와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, rAAV 투여는 다른 PKU 치료법에 선행하거나, 다른 PKU 치료법과 동시적이거나 이의 투여 후에 전달된다.
실시예
본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 하기 실시예에서 명백하다. 그러나, 본 발명의 구현예를 나타내는 실시예는 제한이 아니라 단지 예시로서 제공됨이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형은 실시예로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
실시예 1. 벡터 설계
페닐알라닌 하이드록실라제(PAH) 서열 및 이의 변이를 포함하는 대표적인 rAAV 발현 작제물(rAAV 벡터)을 생성하는 예시적인 방법 및 설계를 이 실시예에 제공한다.
이 연구에서는 재조합 AAV 벡터(rAAV8)를 사용했다. rAAV 벡터의 기본 설계는 5'-ITR 및 3'-ITR인 역 말단 반복부(ITR)가 측면에 있는 발현 카세트를 포함한다. 이러한 ITR은 벡터 생산체 세포에서 AAV 복제 단백질 Rep 및 연관 인자에 의한 벡터 게놈의 복제 및 패키징을 매개한다. 전형적으로, 발현 카세트는 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이 프로모터, 코딩 서열, 폴리A 꼬리 및/또는 태그를 함유한다. 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 hPAH를 암호화하는 예시적인 발현 작제물을 설계하고 제조하였다. hPAH에 대한 코딩 서열을 프로모터, hTTR(인간 트랜스티레틴 프로모터)의 하류에 삽입하였다. 추가적으로, 간 특이적 시스-작용 조절 모듈(CRM)을 프로모터의 상류에 삽입하였고, 마우스 바이러스 미세(MVM) 인트론 서열을 프로모터의 하류에 삽입하였다. 이 조절 및 프로모터 조합을 시험하여 하기 실시예에 나타낸 바와 같이 형질도입 수준을 평가했다. 발현 작제물을 후속적으로 AAV 벡터에 결찰하고 시퀀싱에 의해 확인하였다.
코돈 최적화
hPAH에 대한 코딩 서열은 CpG 부위 수, GC 함량, 회문, 반복 염기 서열 그리고 제한효소 부위 및 스플라이스 부위의 배제와 같은 다중 매개변수에 기초하여 코돈 최적화하였다. 면역 반응을 유발할 수 있는 CpG 섬 서열의 수는 6개 미만으로 감소시켰다. GC 함량은 대략 57%(±3%)로 유지하였다. 10 bp 이상인 반복 염기도 제거하였다.
PAH를 포함하는 예시적인 작제물에 대한 개략도를 도 1a-1d에 나타낸다. 상기 작제물의 임의의 수의 변이를 수행할 수 있다. 예를 들어, 하나 초과의 프로모터가 사용될 수 있고/있거나 WPRE 서열을 도입할 수 있다. 추가적으로, 조절 영역, 프로모터 및 인트론의 상이한 조합을 고려한다.
실시예 2. 코돈-최적화 hPAH 서열을 포함하는 rAAV8 벡터의 시험관내 발현
이 실시예는 코돈-최적화 hPAH 서열을 포함하는 rAAV8 벡터가 시험관내 hPAH의 발현을 유도하는 데 효과적임을 예시한다.
HepG2(인간 간암 세포주) 세포를 야생형 hPAH 서열 또는 코돈-최적화 hPAH 서열을 포함하는 rAAV 벡터에 의해 감염시켰다. 세포 용해물에서의 PAH 발현 수준을 PAH에 대한 항체로 웨스턴 블롯을 사용하여 측정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 코돈-최적화 hPAH 서열(S01)을 포함하는 rAAV8은 야생형 hPAH(T01)를 포함하는 rAAV8과 비교하여 더 큰 hPAH의 발현을 초래하였다.
실시예 3. 코돈-최적화 hPAH 서열을 갖는 rAAV8 벡터의 생체내 유효성
이 실시예는 PAH 녹아웃(PAH-KO) 마우스에서 Phe, Trp 및 Tyr의 혈장 수준을 정상화하는 데 있어서 코돈-최적화 rAAV8 hPAH 작제물의 생체내 유효성을 예시한다.
PAH-KO 마우스에 야생형 hPAH 서열(A군, T01); 또는 코돈-최적화 hPAH 서열(B군 및 C군, S01 및 S03)을 포함하는 rAAV 벡터를 주사하였다. rAAV 벡터 작제물을 도 1a 및 도 1b에 도시한다. 마우스에 1 x 1013 vg/kg의 벡터를 수여하였고 혈장 샘플을 rAAV의 투여 전 및 주사 1주, 2주, 3주, 4주 및 5주 후 수집하였다. 5주차에 마우스를 희생시키고 조직 샘플을 수확하였다. 추가로, 마우스의 외피 색상을 모니터링했다. 야생형 마우스군 및 미처리 PAH-KO 마우스군을 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 실험 설계를 하기의 표 3에 요약한다.
Figure pct00008
벡터-매개 발현된 PAH의 유효성을 페닐알라닌(Phe), 티로신(Try) 및 트립토판(Trp)의 혈장 수준을 모니터링하여 결정하였다. PAH 효소는 페닐알라닌 처리의 첫 번째 단계를 담당하고 Tyr 및 Trp의 생합성에 관여한다. 결과를 도 3a에 도시한다. 코돈-최적화 작제물, S01(B군) 및 S03(C군)이 투여된 마우스는 미처리 마우스 또는 대조군 벡터 T01(A군)이 투여된 마우스와 비교하여 혈장에서 유의미하게 감소된 Phe 농도를 나타내었다. 투여 2주 후, B군 및 C군의 마우스에서의 Phe의 수준은 야생형 마우스(D군)에서와 유사하였다. 더욱이, 감소된 Phe 수준은 단회 용량 투여 5주 후에도 유지되었다. Tyr 및 Trp 수준이 또한 A군 또는 미처리 KO 마우스(E군)의 것과 비교하여 B군 및 C군의 마우스에서 증가하였다.
또한, 코돈-최적화 인간 PAH를 포함하는 rAAV8의 전사 효율을 야생형 인간 PAH를 포함하는 rAAV8의 전사 효율과 비교하였다. 결과를 도 3b에 나타낸다. rAAV8을 포함하는 코돈-최적화 인간 PAH와 rAAV8을 포함하는 야생형 인간 PAH 간 형질도입은 필적하였지만, 코돈-최적화 hPAH의 전사가 더 우수하였음을 나타낸다.
마우스의 외피 색깔도 모니터링했다. 놀랍게도, 외피 색상은 도 4에 나타낸 바와 같이 코돈-최적화 PAH를 갖는 rAAV8의 투여 3주 후 교정되었다.
실시예 4. 코돈-최적화 hPAH를 포함하는 rAAV8 벡터를 사용한 유전자 치료법이 용량 의존적 방식으로 PKU 바이오마커를 정상화함
이 실시예는 코돈-최적화 hPAH 서열을 포함하는 rAAV8 벡터를 사용한 유전자 치료법이 용량 의존적 방식으로 Phe, Tyr 및 Trp의 혈장 수준 및 외피 색상을 정상화함을 예시한다.
PAH-KO 마우스에 저(1 x 1012 vg/kg) 또는 고(1 x 1013 vg/kg) 용량으로 코돈-최적화 hPAH 벡터를 발현하는 rAAV8 벡터를 주사했다. 혈장 샘플을 rAAV 투여 전 및 주사 1주, 2주, 3주, 4주 및 5주 후에 수집하고 Phe, Tyr 및 Trp의 수준을 각 시점에서 측정하였다. 추가로 마우스의 외피 색상을 모니터링했다. 미처리 PAH-KO 마우스군을 음성 대조군으로 사용했다. 실험 설계를 하기의 표 4에 요약한다.
Figure pct00009
결과를 도 5에 도시한다. 혈장 Phe 수준은 용량 의존적 방식으로 코돈-최적화 hPAH가 투여된 마우스에서 유의미하게 감소했다. 고용량의 S01이 투여된 마우스는 3주 후에 100% 외피 색상 전환을 나타냈다. 고용량보다 10배 낮은 저용량은 지연된 동역학으로 임상적 이익을 나타낸다. 또한, PAH-KO 마우스의 혈장에서의 티로신 및 트립토판은 S01의 저용량 투여 후 정상화되었다.
실시예 5. 코돈-최적화 hPAH를 포함하는 AAV8 벡터를 사용한 유전자 치료법에 의한 PAH-KO 마우스의 뇌에서 중성 아미노산 및 신경전달물질 수준의 정상화
이 실시예는 PAH 녹아웃(PAH-KO) 마우스의 뇌에서 Phe, Trp 및 Tyr의 수준을 정상화하는데 있어서 코돈-최적화 rAAV8 hPAH 작제물의 생체내 유효성을 설명한다. 또한, 코돈 최적화 hPAH 서열을 포함하는 AAV8 벡터로 유전자 치료법에 의해 처리된 PAH-KO 마우스에서 뇌의 도파민 및 세로토닌 수준이 회복되었다.
먼저 야생형(wt) 및 PAH-KO 마우스의 뇌에서 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판의 수준을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 모든 대형 중성 아미노산(LNAA) 중에서 페닐알라닌이 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러 LNAA를 수송하는 대형 중성 아미노산 수송체(LNAAT)에 대한 친화도가 가장 높다. Phe가 혈액에 과도하게 존재하면 수송체를 포화시키고, 이에 따라 뇌에서 비-Phe LNAA의 수준을 감소시킨다. 이러한 아미노산은 단백질 및 신경전달물질 합성에 필요하기 때문에 Phe 축적은 뇌의 발달과 기능을 방해한다. 실제로, WT 및 PAH-KO 마우스의 표현형분석으로 LNAA(Phe, Try, 및 Trp) 및 신경전달물질(도파민, 세로토닌 및 노르아드레날린)이 도 6에 나타낸 바와 같이 PAH-KO 마우스의 뇌에서 이상조절됨을 확인하였다. Phe, Tyr 및 Trp의 농도를 표 4에 나타낸 마우스군으로부터 5주차에 추출된 뇌 조직에서 측정하였다. 결과를 도 7a에 나타낸다. 뇌에서 Phe의 수준은 용량 의존적 방식으로 코돈-최적화 hPAH 서열을 갖는 AAV8로의 유전자 치료법으로 처리된 PAH-KO 마우스에서 유의미하게 감소하였다. 일관되게, Tyr 및 Trp 둘 모두의 수준은 용량 의존적 방식으로 코돈-최적화 hPAH 서열을 포함하는 AAV8로의 유전자 치료법에 의해 처리된 PAH-KO 마우스의 뇌에서 증가되었다. 더욱이, 세로토닌 및 노르아드레날린 둘 모두의 수준은 도 7b에 나타낸 바와 같이 용량 의존적 방식으로 처리된 PAH-KO 마우스의 뇌에서 회복되었다.
실시예 6. 코돈-최적화 hPAH를 포함하는 AAV8 벡터로의 유전자 치료법에 의한 PAH-KO 마우스에서의 Phe 수준의 장기간 안정화
이 실시예는 PAH-KO 마우스에서 코돈-최적화 hPAH 서열을 포함하는 AAV8 벡터로의 유전자 치료법의 장기 생체내 유효성을 예시한다(도 8).
PAH 녹아웃(PAH-KO) 마우스에 저(1 x 1012 vg/kg), 중간 또는 고용량(1 x 1013 vg/kg)으로 코돈-최적화 rAAV8 hPAH 작제물을 주사했다. 혈장 샘플을 rAAV8 투여 전 및 주사 7, 14, 35, 56, 98, 140 및 182일 후에 수집하였다. 페닐알라닌의 수준을 혈장에서 측정하고 대조군(C22)-처리 PAH-KO 마우스 및 대조군 C22-처리 wt 마우스에서의 Phe의 수준과 비교하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
Phe의 수준은 대조군 C22-처리 PAH-KO 마우스에 비해 코돈-최적화 rAAV8 hPAH 작제물로 처리된 PAH-KO 마우스에서 유의미하게 감소되었다. hPAH 처리를 수여받은 마우스의 Phe 수준은 C22 대조군-처리 wt 마우스에서의 Phe 수준과 필적했다.
1 x 1013 vg/kg의 고용량에서 혈장 Phe 수준은 기준선 수준과 유사하고 투여 7, 14, 35, 56, 98, 140 및 182일 후 wt 마우스에서의 Phe 수준과 필적하는 낮은 수준으로 유지되어 PAH-KO 마우스에서 AAV8 코돈-최적화 hPAH로의 유전자 치료법의 장기간 유효성을 실증하였다.
균등부 및 범위
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 균등부를 정례적인 실험만을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명으로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 오히려 하기 청구범위에 제시된 바와 같다.
<110> Takeda Pharmaceutical Company Limited <120> ADENO ASSOCIATED VIRUS BASED GENE THERAPY FOR PHENYLKETONURIA <130> SHR-2010WO <140> PCT/IB21/00008 <141> 2021-01-15 <150> 62/962,011 <151> 2020-01-16 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Thr Ala Val Leu Glu Asn Pro Gly Leu Gly Arg Lys Leu Ser 1 5 10 15 Asp Phe Gly Gln Glu Thr Ser Tyr Ile Glu Asp Asn Cys Asn Gln Asn 20 25 30 Gly Ala Ile Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Glu Glu Val Gly Ala Leu 35 40 45 Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Asp Val Asn Leu Thr His 50 55 60 Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe 65 70 75 80 Thr His Leu Asp Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Thr Asn Ile Ile Lys 85 90 95 Ile Leu Arg His Asp Ile Gly Ala Thr Val His Glu Leu Ser Arg Asp 100 105 110 Lys Lys Lys Asp Thr Val Pro Trp Phe Pro Arg Thr Ile Gln Glu Leu 115 120 125 Asp Arg Phe Ala Asn Gln Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Leu Asp Ala 130 135 140 Asp His Pro Gly Phe Lys Asp Pro Val Tyr Arg Ala Arg Arg Lys Gln 145 150 155 160 Phe Ala Asp Ile Ala Tyr Asn Tyr Arg His Gly Gln Pro Ile Pro Arg 165 170 175 Val Glu Tyr Met Glu Glu Glu Lys Lys Thr Trp Gly Thr Val Phe Lys 180 185 190 Thr Leu Lys Ser Leu Tyr Lys Thr His Ala Cys Tyr Glu Tyr Asn His 195 200 205 Ile Phe Pro Leu Leu Glu Lys Tyr Cys Gly Phe His Glu Asp Asn Ile 210 215 220 Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Gln Phe Leu Gln Thr Cys Thr Gly Phe 225 230 235 240 Arg Leu Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ser Arg Asp Phe Leu Gly 245 250 255 Gly Leu Ala Phe Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Gly 260 265 270 Ser Lys Pro Met Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Ile Cys His Glu Leu Leu 275 280 285 Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln 290 295 300 Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys 305 310 315 320 Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln 325 330 335 Gly Asp Ser Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe Gly 340 345 350 Glu Leu Gln Tyr Cys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Leu Leu Pro Leu Glu 355 360 365 Leu Glu Lys Thr Ala Ile Gln Asn Tyr Thr Val Thr Glu Phe Gln Pro 370 375 380 Leu Tyr Tyr Val Ala Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Val Arg 385 390 395 400 Asn Phe Ala Ala Thr Ile Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asp Pro 405 410 415 Tyr Thr Gln Arg Ile Glu Val Leu Asp Asn Thr Gln Gln Leu Lys Ile 420 425 430 Leu Ala Asp Ser Ile Asn Ser Glu Ile Gly Ile Leu Cys Ser Ala Leu 435 440 445 Gln Lys Ile Lys 450 <210> 2 <211> 218 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 60 ggctaagtcc accgggggag gctgctggtg aatattaacc aaggtcaccc cagttatcgg 120 aggagcaaac aggggctaag tccaccgggg gaggctgctg gtgaatatta accaaggtca 180 ccccagttat cggaggagca aacaggggct aagtccac 218 <210> 3 <211> 233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 aaatgaccta ttaagaatat ttcatagaac gaatgttccg atgctctaat ctctctagac 60 aaggttcata tttgtatggg ttacttattc 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ttgcctacaa ttaccgccat ggacagccca tcccaagggt ggaatacatg 540 gaagaggaga agaaaacctg gggcacagtg ttcaagaccc tgaagagcct gtacaagacc 600 catgcctgct atgagtacaa ccacatcttt cccctgctgg aaaagtactg tgggttccat 660 gaggacaata tccctcagct ggaggatgtg tcccagttcc tccagacctg cactggcttt 720 aggctgaggc ctgtggctgg cctgctgtcc agtagggact tcctgggggg cttggccttc 780 agagtcttcc actgcaccca gtacatcaga catggcagca agcccatgta caccccagag 840 cctgacatct gccatgaact cctgggccat gtgcccctct tcagtgacag atcctttgcc 900 cagttcagcc aagagatcgg gctggcctcc ctgggtgccc ctgatgagta cattgaaaaa 960 ctggccacca tctactggtt tactgtggag tttggcctct gcaagcaagg ggacagcatc 1020 aaggcctatg gagctgggct cctcagcagc tttggagagc tccaatactg cctgtctgag 1080 aaacccaagc tgctccccct ggagctggag aagacagcca tccagaacta cacagtcaca 1140 gagttccagc ctctctacta cgtggctgag agcttcaatg atgccaagga gaaggtgagg 1200 aactttgctg ccaccatccc cagacccttc tctgtgaggt atgaccccta cactcagagg 1260 attgaggtgc tggacaacac ccagcagctc aagattctgg ctgactccat caactcagag 1320 attggcatcc tgtgctctgc cctgcagaag atcaagtaa 1359 <210> 22 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 22 atgagcacag cagtgttgga gaaccctggg cttgggagga aactgtctga ctttgggcaa 60 gagacctcct acattgaaga caactgcaat cagaatggag ccatcagcct catcttttcc 120 ctgaaagagg aggtgggggc cctggccaaa gtcctgaggc tctttgagga gaatgacgtg 180 aacctgaccc acattgagag taggcccagc agactgaaga aggatgaata tgaattcttc 240 acccacctgg acaagaggag cctgcctgcc ctcaccaaca tcatcaaaat cctgaggcat 300 gacattgggg ccactgtcca cgagctctca agggacaaga agaaagacac agtcccctgg 360 tttccaagga ccatccaaga gcttgaccgc tttgccaacc agatcctctc ctatggggct 420 gagctggatg ctgaccaccc tggctttaag gacccagtgt atagggccag aaggaagcag 480 tttgctgata ttgcctacaa ctacagacat ggccagccca tcccaagggt ggaatacatg 540 gaggaagaga aaaagacctg gggcacagtg ttcaagaccc tgaagagcct gtacaagacc 600 catgcctgct atgagtacaa ccacatcttc cccctgctgg aaaagtactg tggcttccat 660 gaggacaata tccctcagct ggaggatgtg tcccagttcc tccagacctg cactgggttt 720 aggctgaggc ctgtggctgg gctcctcagc agccgggact tcctgggggg gctggccttc 780 agagtcttcc actgcaccca gtacatccgc catgggagca agcccatgta caccccagag 840 ccagacatct gccatgaact gctgggccat gtgcccctct tcagtgacag atcctttgcc 900 cagttctccc aagaaattgg actggcctcc ctgggtgccc ctgatgagta catagagaag 960 ctggctacca tctactggtt cacagtggag tttggcctct gcaagcaagg ggactccatc 1020 aaggcctatg gagctggcct gctgtccagc tttggagagc tgcagtattg cctgagtgag 1080 aaacccaagc tcctgcccct ggagctggag aagacagcca tccagaacta tactgtgact 1140 gagttccagc ctctctacta tgtggcagag agcttcaatg atgccaagga gaaggtgagg 1200 aactttgcag ccaccatccc cagacccttc tctgtgaggt atgaccccta cactcagagg 1260 atagaagtgc tggacaacac ccagcagctc aagatcctgg cagacagcat caactcagag 1320 attggcatcc tgtgctctgc cctccagaag attaagtaa 1359 <210> 23 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 23 atgtccactg ctgttctgga gaaccctgga ctggggagga agctctctga ctttgggcaa 60 gagacctcct acattgagga caactgcaac cagaatgggg ccatcagcct catcttctcc 120 ctgaaagagg aggtgggggc cctggccaag 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gcaagcaagg ggacagcatc 1020 aaggcctatg gagctggcct gctcagctcc tttggagagc tgcagtattg tctgtctgag 1080 aagcccaagc tcctgcccct ggagctggaa aagacagcca tccagaacta cacagtgaca 1140 gagttccagc ctctgtacta tgtggctgag tccttcaatg atgccaagga gaaggtgagg 1200 aattttgctg ccaccattcc cagacccttc tctgtgaggt atgaccccta cactcagagg 1260 attgaagtgc tggacaacac ccagcagctc aagatcctgg cagactccat caactcagag 1320 attggcatcc tgtgttctgc cctccagaag atcaagtga 1359 <210> 24 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 24 atgagcacag cagttctgga gaaccctgga ctggggagga agctgtctga ctttggacaa 60 gagacctcct acatagagga caactgcaat cagaatggag ccatcagcct catcttcagc 120 ctcaaggagg aagtgggggc cctggccaag gtcctgaggc tgtttgagga gaatgatgtg 180 aacctgactc acattgagag taggccctca aggctcaaga aggatgagta tgagttcttc 240 acccacctgg ataagaggtc cctgcctgcc ctgaccaaca tcatcaaaat cctgcgccat 300 gacattgggg ccacagtgca cgagctctca agggacaaga agaaagacac agtcccctgg 360 tttccccgca ccatccaaga gctggacaga tttgccaacc 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cactcagagg 1260 attgaggtgc tggacaacac ccagcagctc aagattctgg ctgactccat caactcagag 1320 attggcatcc tgtgttctgc cctccagaag atcaagtga 1359 <210> 25 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 25 atgagcacag ctgtgctgga gaaccctggg cttggaagga agctcagtga ctttggccaa 60 gagacctcct acattgagga caactgcaat cagaatggag ccatcagcct catcttttcc 120 ttgaaggaag aagtgggggc cttggccaaa gtcctgaggc tgtttgagga gaatgacgtc 180 aacctgactc acattgaatc taggccttca aggctcaaga aggatgagta tgaattcttc 240 acccacctgg acaagaggag cctgcctgct ctgaccaaca tcatcaaaat cttgaggcat 300 gacattggag caacagtcca cgagcttagc agagacaaaa agaaagacac cgtgccctgg 360 ttcccaagaa ccattcaaga gttggatagg tttgccaacc agatcctctc ctatggggct 420 gagctggatg ctgaccaccc tggctttaag gaccctgtgt atagagccag aagaaagcag 480 tttgctgata ttgcctacaa ttacagacat ggacagccca tccccagagt ggagtacatg 540 gaggaagaga aaaaaacctg gggcactgtc ttcaagaccc tgaaatctct gtacaagaca 600 catgcctgct atgagtacaa ccacatcttc cctctgttgg agaagtactg tggcttccat 660 gaagataaca ttccccagct tgaggatgtg tctcaatttc tccagacctg cactggattc 720 agactcagac cagtggctgg cctgctgtcc agtagggact tcctgggagg actggccttt 780 agggtgttcc actgcacaca gtacatcaga cacggcagca agcccatgta cacaccagag 840 ccagacatct gccatgagct cctgggccat gtccccctct tctctgacag atcctttgcc 900 cagttctccc aagaaattgg tctggcttcc ctgggtgccc ctgatgaata tatagaaaag 960 ctggccacca tctactggtt tacagtggaa tttgggctct gcaaacaagg agactccatt 1020 aaggcctatg gagctgggct gctcagcagc tttggagagc tgcaatactg cctgtctgaa 1080 aaacccaagc ttctgcccct ggaactggag aaaacagcaa tccagaacta cactgtgact 1140 gagttccagc ctctctacta cgtggcagag agcttcaatg atgccaagga gaaggtgaga 1200 aactttgcag ccactatccc aaggcccttc agtgttagat atgaccccta cacccagagg 1260 attgaggtgc ttgacaatac tcagcagctg aagattctgg cagattccat caactcagag 1320 attggcatcc tgtgttctgc cctgcagaag atcaagtaa 1359 <210> 26 <400> 26 000 <210> 27 <211> 1359 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide <400> 27 atgtccactg ctgtgttgga gaaccctgga 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gagctttgcc 900 cagttcagcc aagagattgg ccttgcctct ctgggggctc ctgatgagta catcgagaag 960 ctggctacca tctactggtt caccgtggaa tttggcctgt gcaaacaagg agactccatc 1020 aaggcctatg gagctgggct gctctcctcc tttggagagc tccagtactg cctgtctgaa 1080 aaacccaagc tcctgcccct ggagctggaa aagacagcca tccagaacta cacagtgaca 1140 gaattccagc ctctgtacta cgtggctgag agcttcaatg atgccaagga gaaggtgaga 1200 aactttgctg ccaccattcc tcggcccttt tctgtgcgct atgaccccta cacccaaaga 1260 attgaggtgc tggacaacac ccagcagctc aagattctgg cagacagcat caactcagag 1320 atcggcatcc tctgctccgc ccttcagaag atcaagtaa 1359

Claims (40)

  1. 인간 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)를 암호화하는 코돈-최적화 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터(rAAV)로서, 상기 코돈-최적화 서열이 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 70% 동일성을 갖는, 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터 (rAAV).
  2. 제1항에 있어서, 상기 코돈-최적화 서열이 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는, rAAV.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 코돈-최적화 서열이 서열 번호 11-27 중 하나와 동일한, rAAV.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 AAV8 캡시드를 암호화하는, rAAV.
  5. 제4항에 있어서, 상기 AAV8 캡시드가 야생형 AAV8 캡시드와 비교하여 개선된 간 친화성(tropism)을 갖는 변형된 AAV8 캡시드인, rAAV.
  6. 제5항에 있어서, 상기 AAV8 캡시드가 야생형 AAV8 캡시드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는, rAAV.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 WPRE 서열을 추가로 포함하는, rAAV.
  8. 제7항에 있어서, 상기 WPRE 서열이 자연-발생 WPRE 서열인, rAAV.
  9. 제7항에 있어서, 상기 WPRE 서열이 변형된 WPRE 서열인, rAAV.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 간-특이적 프로모터를 추가로 포함하는, rAAV.
  11. 제10항에 있어서, 상기 간-특이적 프로모터가 트랜스티레틴 프로모터(TTR)인, rAAV.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 시스 작용 조절 모듈(CRM)을 포함하는, rAAV.
  13. 제12항에 있어서, 상기 벡터가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 CRM 반복부를 포함하는, rAAV.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 CRM이 CRM8인, rAAV.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 PAH 서열의 상류에 인트론을 추가로 포함하는, rAAV.
  16. 제15항에 있어서, 상기 인트론이 마우스 미세 바이러스(MVM) 인트론인, rAAV.
  17. 페닐케톤뇨증(PKU)을 치료하는 방법으로서, 치료를 필요로 하는 대상체에 인간 페닐알라닌 하이드록실라제(PAH)를 암호화하는 코돈-최적화 서열을 포함하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV)를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 코돈-최적화 서열은 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 70% 동일성을 갖는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 rAAV의 투여가 대조군과 비교하여 대상체에서 혈장 페닐알라닌(Phe) 수준의 감소를 초래하는, 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 rAAV의 투여가 대조군과 비교하여 대상체에서 혈장 티로신 수준의 증가를 초래하는, 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV의 투여가 대조군과 비교하여 대상체에서 혈장 트립토판 수준의 증가를 초래하는, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군이 대상체의 치료 전 수준인, 방법.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조군이 과거 데이터에 기반한 참조 수준인, 방법.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코돈-최적화 서열이 서열 번호 11-27 중 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는, 방법.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코돈-최적화 서열이 서열 번호 11-27 중 하나와 동일한, 방법.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 AAV8 캡시드를 암호화하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 AAV8 캡시드가 야생형 AAV8 캡시드와 비교하여 개선된 간 친화성을 갖는 변형된 AAV8 캡시드인, 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 AAV8 캡시드가 야생형 AAV 캡시드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는, 방법.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 WPRE 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 WPRE 서열이 자연-발생 WPRE 서열인, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 WPRE 서열이 변형된 WPRE 서열인, 방법.
  31. 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 간-특이적 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 간-특이적 프로모터가 트랜스티레틴 프로모터(TTR)인, 방법.
  33. 제17항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 시스-작용 조절 모듈(CRM)을 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 벡터가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 CRM 반복부를 포함하는, 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 CRM이 CRM8인, 방법.
  36. 제17항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 PAH 서열의 상류에 인트론을 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 인트론이 마우스 미세 바이러스(MVM) 인트론인, 방법.
  38. 제17항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 약 1x1010 vg/kg, 약 1x1011 vg/kg, 약 1x1012 vg/kg, 약 1x1013 vg/kg, 약 1x1014 vg/kg, 또는 약 1x1015 vg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
  39. 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 전신 투여되는, 방법.
  40. 제17항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV가 정맥내 투여되는, 방법.
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