JP2024521475A - 一本鎖ｒｎａ精製方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、改善された治療用ＲＮＡ組成物に関する。より具体的には、本開示は、治療用ＲＮＡ及び関連する治療用ＲＮＡ調製物を精製するための改善された方法に関する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年６月１４日に出願された米国仮出願第６３／２１０，１０１号の米国特許法第１１９（ｅ）条に基づく利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＢＬＵＥ－１３６＿ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔである。テキストファイルは３９，８０４バイトのサイズであり、２０２２年６月９日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される。

本開示は、改善されたＲＮＡ組成物に関する。より具体的には、本開示は、治療用ＲＮＡ及び関連する治療用ＲＮＡ調製物を精製するための改善された方法に関する。

関連分野に関する記載
過去３０～４０年にわたり、ＲＮＡ系技術の緩やかな出現があり、ＲＮＡ送達のための新しい方法が開発され、インビボで効果的であることが証明されるにつれて、近年注目が高まっている。例えば、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ）、リボザイム、アプタマー、及び関連技術は、疾患関連タンパク質の発現を減少させる、又はその活性を調節するために使用されてきた。他の事例では、ＲＮＡは、治療目的のために、インビトロ、エクスビボ、又はインビボのいずれかでタンパク質を発現するために使用されてきた。しかしながら、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、特定の状況では細胞に毒性があり得る。特に生体内での治療用途のために、ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡを特異的に除去するための改善された方法を開発する必要性が依然として存在する。

本開示は、概して、部分的には、ｄｓＲＮＡを除去する工程を含むＲＮＡ精製方法／プロセスに関する。いくつかの実施形態では、方法／プロセスは、１つ以上のオリゴｄＴ精製の工程及びｄｓＲＮＡ除去の工程を含む。

一態様では、ＲＮＡ精製プロセスであって、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、一本鎖ＲＮＡを精製することと、を含む、プロセスが提供される。

別の態様では、ＲＮＡ精製プロセスであって、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、一本鎖ＲＮＡを精製することと、を含み、それによって治療用ＲＮＡを産生する、プロセスが提供される。

別の態様では、ＲＮＡ精製プロセスであって、ヌクレアーゼをコードする一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、一本鎖ＲＮＡを精製することと、を含み、ヌクレアーゼを編集する割合が、ｄｓＲＮＡと結合する抗体と接触しないＲＮＡによってコードされるヌクレアーゼの編集する割合と比較して増加する、プロセスが提供される。

別の態様では、ＲＮＡ精製プロセスであって、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、一本鎖ＲＮＡを精製することと、を含み、細胞又は対象に投与された場合のＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性が、ＲＮＡがｄｓＲＮＡと結合する抗体と接触していない場合の、細胞又は対象に投与されたＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性よりも低い、プロセスが提供される。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。

様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。

様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、ポリアデニル化されている、及び／又はプロセスは、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させる前にポリアデニル化の工程を含む。

様々な実施形態では、プロセスは、ポリアデニル化ＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴ（オリゴｄＴ）プローブと接触させることと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させる前に、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、を含む。

様々な実施形態では、プロセスは、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させた後に、ポリアデニル化ＲＮＡを、第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させることを更に含む。

様々な実施形態では、ＲＮＡ試料は、化学合成を通じて新たに得られる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、インビトロ転写反応から得られる。

様々な実施形態では、細胞に投与された場合の精製されたＲＮＡの、インピーダンスによって測定される細胞傷害性が、ＲＮＡがｄｓＲＮＡ及び／又は第２のオリゴｄＴと結合する抗体と接触していない場合の、細胞に投与されたＲＮＡの細胞傷害性よりも低い。

様々な実施形態では、第１及び／又は第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブは、表面と結合する。いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブは、表面と共有結合する。

様々な実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写反応から得られ、共転写的にキャッピングされている。いくつかの実施形態では、キャップは、キャップ０又はキャップ１である。いくつかの実施形態では、キャップは、ＡＲＣＡキャップ又は修飾ＡＲＣＡキャップである。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピング酵素、グアノシン三リン酸、及びＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンを使用して、その５’末端でキャッピングされる。特定の実施形態では、キャッピング酵素は、ワクシニアグアニリルトランスフェラーゼである。いくつかの実施形態では、キャッピングは、グアノシン三リン酸を含む。いくつかの実施形態では、キャッピングは、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニンを含む。いくつかの実施形態では、キャッピングは、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを含む。

様々な実施形態では、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片は、ラクダＩｇ、ラマＩｇ、アルパカＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ラクダ科ＶＨＨ、ナノボディ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｊ２、Ｊ５、Ｋ１、Ｋ２、１Ｄ３、ＣＡＢＴ－Ｂ２１２、及び９Ｄ５からなる群から選択される。特定の実施形態では、抗体は、Ｊ２である。

様々な実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、少なくとも約１．５ｍｏｌ％、少なくとも約２ｍｏｌ％、少なくとも約２．５ｍｏｌ％、少なくとも約３ｍｏｌ％、少なくとも約３．５ｍｏｌ％、少なくとも約４ｍｏｌ％、少なくとも約４．５ｍｏｌ％、少なくとも約５ｍｏｌ％、少なくとも約５．５ｍｏｌ％、少なくとも約６ｍｏｌ％、少なくとも約６．５ｍｏｌ％、少なくとも約７ｍｏｌ％、少なくとも約７．５ｍｏｌ％、少なくとも約１５ｍｏｌ％、少なくとも約３０ｍｏｌ％、又は少なくとも約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、少なくとも約１．５ｍｏｌ％、少なくとも約７．５ｍｏｌ％、少なくとも約１５ｍｏｌ％、少なくとも約３０ｍｏｌ％、又は少なくとも約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、少なくとも約７．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％、約２．５ｍｏｌ％、約３ｍｏｌ％、約３．５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％、約４．５ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約５．５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％、約６．５ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％、約７．５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、又は約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約７．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約２ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約２．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約３ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約３．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約４ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約４．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約５．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約６ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約６．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約７ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約７．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約７．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約７ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約６．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約５．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約４．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約３．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％の抗体と接触する。

様々な実施形態では、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体は、抗体系親和性クロマトグラフィーによって一本鎖ＲＮＡから分離される。いくつかの実施形態では、抗体系親和性クロマトグラフィーは、１ｍｌカラムを含む。いくつかの実施形態では、抗体系親和性クロマトグラフィーは、５ｍｌカラムを含む。いくつかの実施形態では、抗体系親和性クロマトグラフィーは、１０ｍｌカラムを含む。

様々な実施形態では、プロセスは、ＩＶＴの工程の前にプラスミド消化の工程を含む。

様々な実施形態では、プロセスは、残留プラスミドＤＮＡ鋳型を除去するために、試料をＤＮａｓｅで処理する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ処理の工程は、ＩＶＴの工程の後、及び／又はキャッピングの工程の後に生じる。

様々な実施形態では、プロセスは、１つ以上の限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）の工程を更に含む。いくつかの実施形態では、ＵＦ／ＤＦの工程は、プラスミド消化の工程、インビトロ転写の工程、キャップ反応の工程、又は親和性クロマトグラフィーの工程（例えば、ｄＴ又はＪ２）の後である。

様々な実施形態では、プロセスは、最終滅菌濾過の工程を更に含む。いくつかの実施形態では、最終滅菌濾過の工程は、０．２２μｍフィルタを通した濾過を含む。

様々な実施形態では、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ又はエクソヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はそのバリアントである。

様々な実施形態では、精製されたＲＮＡを投与された対象におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＡＳＴ）レベルは、ｄｓＲＮＡ及び／又は第２のオリゴｄＴと結合する抗体と接触していない精製されたＲＮＡを投与された対象におけるＡＳＴレベルよりも低い。

様々な実施形態では、精製されたＲＮＡを投与された対象におけるＩＬ－６レベルは、ｄｓＲＮＡ及び／又は第２のオリゴｄＴと結合する抗体と接触していない精製されたＲＮＡを投与された対象におけるＩＬ－６レベルよりも低い。

様々な実施形態では、精製されたＲＮＡを投与された対象におけるＭＣＰ－１レベルは、ｄｓＲＮＡ及び／又は第２のオリゴｄＴと結合する抗体と接触していない精製されたＲＮＡを投与された対象におけるＭＣＰ－１レベルよりも低い。

例示的なＲＮＡ精製方法のための異なる単位操作を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 過剰な抗ｄｓＲＮＡ抗体を除去するための異なるクロマトグラフィーカラム体積を使用した精製されたｍＲＮＡのｄｓＲＮＡドットブロット分析を示す。 過剰な抗ｄｓＲＮＡ抗体を除去するための異なるクロマトグラフィーカラム体積を使用した精製されたｍＲＮＡの試料中のｄｓＲＮＡ含有量％を示す。 残留抗ｄｓＲＮＡ抗体を直接ブロットするための二次蛍光標識を使用した精製されたｍＲＮＡのドットブロット分析を示す。 異なる量の抗ｄｓＲＮＡ抗体を使用した精製されたｍＲＮＡの試料中のｄｓＲＮＡ含有量％を示す。 同上。 異なる量の抗ｄｓＲＮＡ抗体を使用した精製されたｍＲＮＡのインビトロ細胞傷害性を示す。 同上。 異なる方法によって精製された試料中の全長ｍＲＮＡ％を示す。 異なる方法によって精製された試料中のｄｓＲＮＡ含有量％を示す。 異なる方法によって精製されたｍＲＮＡ試料のインビトロ細胞傷害性を示す。 異なる方法によって精製されたｍＲＮＡによってコードされるＰＣＳＫ９ ｍｅｇａＴＡＬ及びＴｒｅｘ２によるインビボ編集後のＩＮＤＥＬ倍率変化％を示す。 異なる方法によって精製されたＰＣＳＫ９ ｍｅｇａＴＡＬ及びＴｒｅｘ２ ｍＲＮＡのインビボ毒性を示す。 異なる方法によって精製されたＰＣＳＫ９ ｍｅｇａＴＡＬ及びＴｒｅｘ２ ｍＲＮＡによって誘導される免疫原性（サイトカイン／ケモカイン放出）の程度を示す。 異なる方法によって精製された試料中の全長ｍＲＮＡ％を示す。 異なる方法によって精製された試料中のｄｓＲＮＡ含有量％を示す。 異なる方法によって精製されたｍＲＮＡ試料のインビトロ細胞傷害性を示す。 異なる方法によって精製されたｍＲＮＡによってコードされるＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬによるエクスビボ編集後のＩＮＤＥＬ％を示す。 異なる方法によって精製されたｍＲＮＡによってコードされるＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬによるエクスビボ編集後のＰＤ－１表面発現％を示す。 異なるＲＮＡ精製方法間のｄｓＲＮＡ含有量（％）を示す。 ＲＮＡ調製物の細胞の細胞傷害性とｄｓＲＮＡ含有量％との間の相関を示す。

配列識別子に関する簡単な説明
配列番号１は、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ ＤＮＡ配列である。
配列番号２は、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ ＲＮＡ配列である。
配列番号３は、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ ＲＮＡ配列である。
配列番号４は、ＰＤ１ ｍｅｇａＴＡＬ ＤＮＡ配列である。
配列番号５は、ＰＤ１ ｍｅｇａＴＡＬ ＲＮＡ配列である。
配列番号６は、ＰＤ１ ｍｅｇａＴＡＬ ＲＮＡ配列である。
配列番号７は、ＰＣＳＫ９ ｍｅｇａＴＡＬ ＤＮＡ配列である。
配列番号８は、ＰＣＳＫ９ ｍｅｇａＴＡＬ ＲＮＡ配列である。
配列番号９は、ＰＣＳＫ９ ｍｅｇａＴＡＬ ＲＮＡ配列である。
配列番号１０は、Ｔｒｅｘ２ ＤＮＡ配列である。
配列番号１１は、Ｔｒｅｘ２ ＲＮＡ配列である。
配列番号１２は、Ｔｒｅｘ２ ＲＮＡ配列である。

前述の配列において、Ｘは、存在する場合には任意のアミノ酸を指し、又はアミノ酸の非存在を指す。
［発明を実施するための形態］

Ａ．概要
本開示は、概して、部分的には、ＲＮＡ精製及びＲＮＡ組成物の調製の改善された方法に関する。より具体的には、本開示は、治療用一本鎖ＲＮＡから二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を分離するための改善された方法及び関連する治療用一本鎖ＲＮＡ組成物に関する。ＲＮＡ調製物は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで使用するためのものであり得る。いかなる特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、抗ｄｓＲＮＡ抗体を使用したＲＮＡ精製（例えば、抗体系親和性クロマトグラフィー）が、一本鎖ＲＮＡを精製し、エクスビボ及びインビボで細胞に送達されたＲＮＡの免疫原性及び細胞毒性を低減するのに驚くほど効果的であることを発見した。特定の実施形態では、ＲＮＡ精製方法は、１つ以上のオリゴｄＴ精製の工程と、抗ｄｓＲＮＡ抗体系除去の工程と、を含む。

したがって、ＲＮＡの免疫原性及び毒性の問題は、本明細書で更に記載されるように、抗ｄｓＲＮＡ抗体の除去及び／又はオリゴｄＴ精製を利用することによって解決される。特定の実施形態で企図される組成物及び方法を使用して精製されたＲＮＡは、インビトロ、エクスビボ、又はインビボ用途での使用に好適である。

一態様では、ＲＮＡ精製プロセスであって、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、ＲＮＡを精製することと、を含む、プロセスが提供される。様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡはポリアデニル化されており、及び／又はプロセスは、ポリアデニル化の工程を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、ＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する１つ以上のオリゴヌクレオチドｄＴ（オリゴｄＴ）プローブと接触させることと、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、を含む。

別の態様では、ＲＮＡ精製プロセスであって、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを精製することと、を含む、プロセスが提供される。様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡはポリアデニル化されており、及び／又はプロセスは、ポリアデニル化の工程を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。

別の態様では、ＲＮＡ精製プロセスであって、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、を含み、それによって一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを精製する、プロセスが提供される。様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡはポリアデニル化されており、及び／又はプロセスは、ポリアデニル化の工程を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。

別の態様では、ＲＮＡ精製プロセスであって、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、試料を、第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させて、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを捕捉することと、を含み、それによって一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを精製する、プロセスが提供される。様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡはポリアデニル化されており、及び／又はプロセスは、ポリアデニル化の工程を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。

特定の実施形態では、ＲＮＡは、治療用ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。特定の実施形態では、ＲＮＡは、治療用ポリペプチドをコードする。

別の態様では、ヌクレアーゼを編集する効率を増加させるためのプロセスであって、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを精製することと、を含み、ヌクレアーゼを編集する割合が、ｄｓＲＮＡと結合する抗体と接触しないＲＮＡによってコードされるヌクレアーゼの編集する割合と比較して増加する、プロセスが提供される。様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡはポリアデニル化されており、及び／又はプロセスは、ポリアデニル化の工程を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。

別の態様では、ヌクレアーゼを編集する効率を増加させるためのプロセスであって、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、を含み、ヌクレアーゼを編集する割合が、ｄｓＲＮＡと結合する抗体と接触しないＲＮＡによってコードされるヌクレアーゼの編集する割合と比較して増加する、プロセスが提供される。様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡはポリアデニル化されており、及び／又はプロセスは、ポリアデニル化の工程を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。

別の態様では、ヌクレアーゼを編集する効率を増加させるためのプロセスであって、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、試料を、第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させて、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを捕捉することと、を含み、ヌクレアーゼを編集する割合が、ｄｓＲＮＡ及び／又は第２のオリゴｄＴと結合する抗体と接触しないＲＮＡによってコードされるヌクレアーゼの編集する割合と比較して増加する、プロセスが提供される。様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡはポリアデニル化されており、及び／又はプロセスは、ポリアデニル化の工程を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。

様々な実施形態では、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ又はエクソヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９及びそのバリアント）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。

別の態様では、細胞又は対象に投与されるＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性を低減させるプロセスであって、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを精製することと、を含み、細胞又は対象に投与された場合のＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性が、ＲＮＡがｄｓＲＮＡと結合する抗体と接触していない場合の、細胞又は対象に投与されたＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性よりも低い、プロセスが提供される。様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡはポリアデニル化されており、及び／又はプロセスは、ポリアデニル化の工程を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。

別の態様では、細胞又は対象に投与されるＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性を低減させるプロセスであって、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、を含み、細胞又は対象に投与された場合のＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性が、ＲＮＡがｄｓＲＮＡと結合する抗体と接触していない場合の、細胞又は対象に投与されたｍＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性よりも低い、プロセスが提供される。様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡはポリアデニル化されており、及び／又はプロセスは、ポリアデニル化の工程を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。

別の態様では、細胞又は対象に投与されるＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性を低減させるプロセスであって、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、試料を、第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させて、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを捕捉することと、を含み、細胞又は対象に投与された場合のＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性が、ＲＮＡがｄｓＲＮＡと結合する抗体と接触していない場合の、細胞又は対象に投与されたＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性よりも低い、プロセスが提供される。様々な実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡはポリアデニル化されており、及び／又はプロセスは、ポリアデニル化の工程を含む。いくつかの実施形態では、試料中のＲＮＡは、キャッピングされている、及び／又はプロセスは、試料中のＲＮＡをキャッピングすることを含む。

本明細書で企図される実施形態のいずれかでは、抗ｄｓＲＮＡ抗体は、Ｊ２、Ｊ５、Ｋ１、Ｋ２、１Ｄ３、ＣＡＢＴ－Ｂ２１２、及び９Ｄ５、又はその機能的誘導体若しくは断片からなる群から選択される。特定の実施形態では、抗ｄｓＲＮＡ抗体は、Ｊ２である。

実施形態のいずれかでは、本明細書で企図される方法、手順、又はプロセスは、追加の工程、例えば、プラスミド直線化／消化、インビトロ転写、透析濾過、限外濾過、及び最終濾過を含み得る。

組換え（すなわち、操作された）ＤＮＡ、ペプチド及びオリゴヌクレオチド合成、免疫アッセイ、組織培養、形質変換（例、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応、精製並びに関連する技術及び手法は、本明細書を通じて引用され、考察される、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学及び免疫学における様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されるように一般的に行われてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００８年７月に更新）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ，１９８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）、Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｕｌｉｅ Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｎｉｃｋ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ ＣＣ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）、Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、並びにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの専門誌の研究論文を参照されたい。

Ｂ．定義
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書において使用されるべきある特定の用語の定義を提供することは、その理解に役立ち得る。

他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって普遍的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載するものと類似した、又は均等の方法及び材料を、特定の実施形態の実施又は検証に使用することができるが、本明細書においては好ましい組成物、方法及び材料の実施形態を開示している。本開示の目的に対し、以下の用語を、以下に規定する。

冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、本明細書において、当該冠詞の文法上の対象の１つ以上（すなわち少なくとも１つ、又は１つ以上）を指すために使用される。例示として、「要素」は、１つの要素又は１つ以上の要素を意味する。

選択肢（例えば、「又は」）の使用は、いずれか１つ、両方、又はその選択肢の任意の組み合わせを意味すると理解されたい。

「及び／又は」という用語は、いずれか１つ、又はその選択肢の両方を意味すると理解されたい。

本明細書において使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さに対し、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％までも変化する数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さを指す。一実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さに関し、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％又は±１％の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さの範囲を指す。

一実施形態では、例えば、１～５、約１～５、又は約１～約５といった範囲は、当該範囲に包含される各数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態では、範囲「１～５」は、表現１、２、３、４、５、又は１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、若しくは５．０、又は１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、若しくは５．０と同等である。

本明細書中で使用するように、用語「実質的に」は、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、又は長さを指す。一実施形態では、「実質的に同一」とは、基準の数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さとおよそ同じである、例えば、生理学的効果などの効果を生じさせる数量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、大きさ、量、重さ、又は長さを指す。

本明細書全体を通じて、文脈が別段要求しない限り、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含むこと」は、規定される工程若しくは要素又は工程若しくは要素のグループを含むことを暗示するが、任意の他の工程若しくは要素又は工程若しくは要素のグループを除外することを暗示しないことは理解されるだろう。「～からなる」とは、語句「からなる」に先行するもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。このように、文言「～からなる」は、列記される要素が必要又は義務であり、他の要素は存在し得ないことを示す。「本質的に～からなる」とは、当該文言の後に列記される任意の要素、及び列記される要素に関して本開示中に特定される活性若しくは作用に干渉しない、又は寄与しない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。このように、文言「本質的に～からなる」は、列記される要素が必須又は義務であり、しかし列記される要素の活性又は作用に実質的に影響を与える他の要素は存在しないことを示す。

本明細書全体を通じて「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加的な実施形態」、若しくは「更なる実施形態」、又はそれらの組み合わせに対する参照は、当該実施形態と関連付けて記載される特定の性質、構造又は特徴が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。このように、本明細書全体の様々な箇所での前述の文言の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。更に、特定の性質、構造、又は特徴は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされ得る。また、一実施形態における特性の前向きな列挙は、特定の実施形態における特性を除外するための基準としての役割を果たすことも理解される。

用語「エクスビボ」は、一般的に、生物の外側の、好ましくは、自然条件の最小限の変化を伴う、人工環境で行われる実験若しくは測定又は生きている組織での実験若しくは測定などの、生物の外側の場所で生じる活動を指す。特定の実施形態では、「エクスビボ」手法は、生物から採取され、実験装置で、通常、無菌条件下で、典型的には、数時間又は最大約２４時間であるが、状況に応じて最大４８時間又は７２時間培養されるか、又は調節される生きた細胞又は組織を含む。特定の実施形態では、このような組織又は細胞は、収集され、凍結され、その後、エクスビボでの処置のため融解することができる。生きた細胞又は組織を使用して数日以上継続する組織培養実験又は手法は、典型的には、「インビトロ」であるとみなされるが、特定の実施形態では、この用語は、エクスビボと互換的に使用され得る。

用語「インビボ」は、一般的に、生物の内部で生じる活動を指す。一実施形態では、細胞ゲノムは、インビボで操作されるか、編集されるか、又は修飾される。

「増加した」又は「増強した」量は、典型的には、「統計上有意な」量であり、ビヒクル又は対照により生じる応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（間で１より上の全ての整数及び小数点を含む、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である増加を含み得る。

「減少」又は「低減した」量は、典型的には、「統計上有意な」量であり、ビヒクル、又は対照により生じる応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（間で１より上の全ての整数及び小数点を含む、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である減少を含み得る。

「持続」、又は「保つ」、又は「維持」、又は「変化なし」、又は「実質的な変化なし」、又は「実質的な減少なし」とは、基準応答、ビヒクル、又は対照と有意に異ならない、又は測定可能なほどに異ならない応答を指す。

本明細書で使用される「特異的結合親和性」、又は「特異的に結合する」、又は「特異的に結合した」、又は「特異的結合」、又は「特異的に標的とする」という用語は、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と結合する抗体、ポリ（Ａ）テイルと結合するヌクレオチド（例えば、オリゴｄＴ）、又は標的部位と結合するメガヌクレアーゼ（又は結合ドメイン）など、バックグラウンド結合よりも高い結合親和性での、ある分子と別の分子との結合について説明する。抗体、ヌクレオチド、又は結合ドメインは、例えば、約１０^５Ｍ^－１以上の親和性若しくはＫ_ａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡会合定数）で分子と結合又は会合する場合、別の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はポリペプチド）と「特異的に結合」する。特定の実施形態では、結合ドメインは、約１０^６Ｍ^－１、１０^７Ｍ^－１、１０^８Ｍ^－１、１０^９Ｍ^－１、１０^１０Ｍ^－１、１０^１１Ｍ^－１、１０^１２Ｍ^－１、又は１０^１３Ｍ^－１以上のＫ_ａで標的部位と結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１、少なくとも１０^１３Ｍ^－１、又はそれ以上のＫ_ａを有するそれらの結合ドメインを指す。

用語「選択的に結合する」又は「選択的に結合した」又は「選択的結合」又は「選択的に標的化する」は、複数のオフターゲット分子の存在下で、標的分子に１つの分子が優先的に結合すること（オンターゲット結合）を説明する。特定の実施形態では、抗ｄｓＲＮＡ抗体又はその断片は、抗ｄｓＲＮＡ抗体が一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）と結合するよりも約５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、又は１０００倍の頻度でｄｓＲＮＡと選択的に結合する。

用語「抗体」は、免疫細胞によって認識されるものなどの、ペプチド、脂質、多糖類、又は抗原決定基を含有する核酸などの１つ以上の抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域又はその断片を少なくとも含むポリペプチドである結合剤を指す。いくつかの実施形態では、抗体は、抗ｄｓＲＮＡ抗体である。特定の実施形態では、抗ｄｓＲＮＡ抗体及びｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成する。

用語「抗体」は、本明細書の他の箇所に更に記載されるような、任意の天然に存在する、組換え、修飾又は操作された免疫グロブリン様構造又は抗原結合断片若しくはその一部、又はそれらの誘導体を包含する。したがって、この用語は、標的抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子を指し、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び二重特異性抗体を含む。インタクトな抗体は、一般に、少なくとも２つの完全長重鎖及び２つの完全長軽鎖を含むが、場合によっては、重鎖のみを含むことができるラクダ科動物に天然起源の抗体などのより少ない鎖を含むことができる。抗体は、単一の供給源のみから誘導することができ、又は「キメラ」であり得、すなわち、抗体の異なる部分を２つの異なる抗体から誘導することができる。抗体又はその抗原結合部分は、ハイブリドーマにおいて、組換えＤＮＡ技術によって、又はインタクト抗体の酵素的若しくは化学的切断によって産生され得る。

用語「抗原結合断片」又は「抗原結合部分」は、抗原（例えば、ｄｓＲＮＡ）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗原結合断片は、限定するものではないが、複合体を形成する抗原に特異的に結合する任意の天然起源の、酵素的に取得可能な、合成された、又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、抗体の抗原結合部分は、例えば、抗体可変及び任意に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含むタンパク質分解消化又は組換え遺伝子工学技術などの任意の適切な標準技術を用いて、完全な抗体分子から誘導され得る。

「単離された抗体又はその抗原結合断片」は、その自然環境の構成要素から識別され、分離及び／又は回収された抗体又はその抗原結合断片を指す。

本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」又は「目的のポリヌクレオチド」は、目的のポリペプチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドを指す。文脈に応じて、目的の遺伝子は、デオキシリボ核酸、例えば、ＲＮＡ転写物に転写され得るＤＮＡ鋳型中の目的の遺伝子、又はリボ核酸、例えば、インビトロ、インビボ、インサイチュ、若しくはエクスビボで翻訳されてコードされた目的のポリペプチドを産生することができるＲＮＡ転写産物中の目的の遺伝子を指す。以下でより詳細に説明するように、目的のポリペプチドには、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質又はペプチド、エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結される」は、記載される構成要素が、それらが意図された様式で機能することができるような関係にある並置を意味する。一実施形態では、用語は、核酸発現制御配列（プロモーター及び／又はエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドとの間の機能的結合を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。例えば、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと作動可能に連結される目的の遺伝子は、目的の遺伝子の転写を可能にする。

本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」「ポリペプチド断片」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、別段の指定がない限り、従来の意味に従って、すなわちアミノ酸配列として相互交換可能に使用される。ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加及び／又は挿入において天然起源のポリペプチドとは異なり得る。かかるバリアントは、天然起源のものであってもよく、又は合成的に生成されてもよく、例えば、ポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって生成されてもよい。

本明細書で使用される場合、「ポリＡテイル」、「ポリ（Ａ）テイル」、又は「ポリ（Ａ）」は、アデニンヌクレオチドの鎖を指す。用語は、ＲＮＡ転写物に付加されるポリ（Ａ）テイルを指し得るか、又はＲＮＡ転写物の３’末端に既に存在するポリ（Ａ）テイルを指し得る（例えば、ＤＮＡコード化ポリ（Ａ）テイル）。以下でより詳細に説明するように、ポリ（Ａ）テイルは、典型的には、５～３００個のヌクレオチドの長さ（配列番号１３）である。

用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」という用語と互換性があり、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。したがって、用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β－Ｄ－リボ構造を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構造を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含むＬＮＡ）、又はそのハイブリッドを含むが、これらに限定されない。

追加の定義は、本開示全体を通じて記載されている。

Ｃ．方法
本開示を通じて論じたように、本発明者らは、特にインビボでの治療用ＲＮＡ応用の状況において、ｄｓＲＮＡがＲＮＡ組成物における免疫原性の増加及び細胞毒性の増加に関与していることを認識した。更に、発明者らは驚くべきことに、ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡを除去するための改善された方法／プロセスを発見した。

方法が、概して、ＲＮＡ精製用であるか、又は特定の用途用であるか（例えば、インビボ治療用ｍＲＮＡ処置、又はインビボでの遺伝子編集を改善するためのプロセス）にかかわらず、方法は、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、一本鎖ＲＮＡを精製することと、を含む。

一態様では、プロセスは、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを精製することと、を含む。

別の態様では、プロセスは、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、を含み、それによって一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを精製する。

更に別の態様では、プロセスは、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、試料を、第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させて、一本鎖ポリアデニル化ｍＲＮＡを捕捉することと、を含み、それによって一本鎖キャッピングポリアデニル化ＲＮＡを精製する。

以下で更に説明するように、方法は、他の工程、例えば、プラスミド直線化／消化、インビトロ転写、ポリアデニル化、キャッピング、透析濾過、限外濾過、及び最終濾過を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ、エクスビボ、又はインビボ方法で使用するためのものであり得る。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。特定の実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。

１．ＤＮＡ
本明細書に開示される方法は、ＲＮＡ源を有していなければならない。ＲＮＡは、細胞又は組織から得られる又は単離することができる。あるいは、ＲＮＡは、化学合成を通じて新たに調製されてもよい。様々な実施形態では、ＲＮＡは、ＤＮＡ源（例えば、単離されたゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又は直線状／直線化ＤＮＡ）からインビトロで転写され得る。様々な実施形態では、ＲＮＡは、直線化プラスミドＤＮＡを使用するインビトロ転写（ＩＶＴ）アッセイから得られる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、直線状ＤＮＡ／ベクターを使用するインビトロ転写（ＩＶＴ）アッセイから得られる。

本明細書で使用する場合、用語「プラスミドＤＮＡ」又は「プラスミドＤＮＡベクター」は、環状核酸分子、好ましくは人工／組換えＤＮＡ分子を指す。いくつかの実施形態では、プラスミドＤＮＡベクターは、直線化することができる。あるいは、「直線状ＤＮＡ」、「直線状ＤＮＡベクター」、又は「直線状ベクター」は、直線状核酸分子、好ましくは人工／組換え直線状ＤＮＡ分子を指す。本開示の文脈におけるプラスミド又は直線状ＤＮＡベクターは、少なくとも１つの目的のポリペプチド又は遺伝子をコードする、ＲＮＡ及び／又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする配列を含む核酸配列などの、目的の所望の核酸配列若しくは遺伝子を組み込む又は保持するのに好適である。本明細書に記載の方法において有用な例示的なプラスミドとしては、ｐＵＣ系ベクター、例えば、ｐＵＣ１９が含まれるが、これらに限定されない。例示的な直線状ＤＮＡベクターには、ｐＪＡＺＺ（登録商標）、ｐＳＭＡＲＴ（登録商標）（Ｌｕｃｉｇｅｎ（商標））、及びＤｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）／ｄｂＤＮＡ（登録商標）（Ｔｏｕｃｈｌｉｇｈｔ）ベクターが含まれるが、これらに限定されない。

発現ベクターは、ＲＮＡインビトロ転写と呼ばれるプロセスにおけるＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡなどの発現産物の産生に使用され得る。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列、例えば、ＲＮＡプロモーター配列など、ベクターの配列ストレッチのＲＮＡインビトロ転写に必要な配列を含み得る。

好ましくは、ＤＮＡベクターは、マルチクローニング部位、ＲＮＡプロモーター配列、ＲＮＡポリ（Ａ）テイル、任意に、選択マーカー（抗生物質耐性因子など）、及びベクターの増殖に好適な配列、例えば、複製起点を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡベクター又は発現ベクターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７、及びＳｐ６を含む。プラスミドＤＮＡはまた、直線化のための制限部位を含んでもよい。

本明細書で使用する場合、用語「鋳型ＤＮＡ」（又は「ＤＮＡ鋳型」）は、インビトロ転写されるＲＮＡ配列をコードする核酸配列を含むＤＮＡ分子を指す。したがって、鋳型ＤＮＡは、インビトロ転写に必要な全ての要素、特に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、標的ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列の５’側に作動可能に連結されたＴ３、Ｔ７、及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの結合のためのプロモーター要素を含む。鋳型ＤＮＡはまた、目的の遺伝子の３’側に位置するポリ（Ａ）テイルをコードする配列を含んでもよい。

本明細書に記載の組換え鋳型又はプラスミドＤＮＡの生成、複製、及びクローニングの方法は、当技術分野で公知である。

用語「鋳型ＤＮＡ」は、ＲＮＡ配列をコードする核酸配列を含むプラスミドＤＮＡベクターを指し得る。更に、「鋳型ＤＮＡ」は、直線状又は環状のＤＮＡ分子であってもよい。特定の実施形態では、鋳型ＤＮＡは、直線化／消化プラスミドＤＮＡ分子である。

直線化鋳型ＤＮＡプラスミドは、制限酵素がその認識部位でプラスミドＤＮＡを切断し、プラスミド構造を破壊するように、好適な条件下でプラスミドＤＮＡを制限酵素と接触させることによって得ることができる。プラスミドＤＮＡが制限酵素に対する１つの認識部位のみを含む場合、直線化鋳型ＤＮＡはプラスミドＤＮＡと同じ数のヌクレオチドを有する。プラスミドＤＮＡが制限酵素に対する１つを超える認識部位を含む場合、直線化鋳型ＤＮＡはプラスミドＤＮＡよりも少ない数のヌクレオチドを有する。次いで、直線化鋳型ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡの断片であり、ＲＮＡインビトロ転写に必要な要素、すなわち、ＲＮＡ転写用のプロモーター要素及び鋳型ＤＮＡ要素を含む。プラスミドＤＮＡのＤＮＡの切断及び／又は直線化に好適な制限酵素は当分野に公知であり、ＢｃｉＶＩ、ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＢｓａＩ、ＡｆＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、及びＳａｐＩが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、制限酵素は、ＩＩＳ型制限酵素である。ＩＩＳ型制限酵素には、ＡｃｕＩ、ＡＬｗＩ、ＢｏａｅＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｓＩ－ＨＦ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＭｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＰｐｉＩ、ＰｓｒＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、制限酵素は、ＢｓａＩである。

直線状ＤＮＡベクター／鋳型はまた、エンドヌクレアーゼによる制限を受け得る。いくつかの実施形態では、直線状ＤＮＡベクター／鋳型を制限酵素と接触させて、末端アデニン（Ａ）ヌクレオチドを産生する。

いくつかの実施形態では、制限に続いて、プラスミド又は直線状ＤＮＡ鋳型は、適切な溶媒、例えば、水、ＴＥ（トリス－ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５、ＨＥＰＥＳ／ホスフェートなどで濾過される（例えば、限外濾過及び／又は透析濾過によって）。

直線化又は直線状のＤＮＡ鋳型は、インビトロ転写のための鋳型として使用される前に精製され得る。例えば、直線化又は直線状のＤＮＡ鋳型は、フェノール／クロロホルム抽出と、それに続くアルコール沈殿、クロマトグラフィー法若しくは濾過法、又はシリカ系ＤＮＡ捕捉法によって精製することができる。この工程はまた、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質、制限酵素、及びＢＳＡ（反応緩衝液中に含有される）を含む、前の製造工程からの不純物（例えば、タンパク質）の低減を確実にする。

様々な実施形態では、プロセスは、残留プラスミドＤＮＡ鋳型（環状又は直線状残留ＤＮＡ）を除去するために、試料をＤＮａｓｅで処理する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ処理の工程は、ＩＶＴの工程の後、及び／又はキャッピングの工程の後に生じる。特定の実施形態では、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅ Ｉである。

２．ＲＮＡ産生
特定の実施形態では、直線化ＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を使用して、本明細書に記載される方法で使用するためのＲＮＡを生成することができる。ＩＶＴ系は、典型的には、転写緩衝液、三リン酸ヌクレオチド（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びＲＮＡポリメラーゼを含む。インビトロ転写の方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｂｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；７０３：２９－４１を参照されたい。ＩＶＴ用の市販キットの例としては、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（商標））、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））、ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）又はＲｉｂｏＭＡＸ（商標）ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標））、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔｓ（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標））、及びＲＮＡＭａｘｘ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））が含まれるが、これらに限定されない。

あるいは、ＩＶＴアッセイは、各構成要素を別々に取得し、当該技術分野で既知の方法を使用することによって、組み立てられ、インハウスで実施することができる。ＮＴＰは、インハウスで製造されてもよく、又は商業供給者（例えば、Ｔｒｉｌｉｎｋ（登録商標）及びＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標））から購入されてもよい。任意の数のＲＮＡポリメラーゼ又はそのバリアントが、本明細書に記載される方法で使用され得、商業供給者（例えば、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（商標））を通じて容易に入手可能である。ポリメラーゼは、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、及び／又は変異体ポリメラーゼ、例えば、限定されないが、修飾核酸を組み込むことができるポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。

典型的なインビトロ転写反応は、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ鋳型、ヌクレオチド（ＮＴＰ）、ＭｇＣｌ２、及び緩衝液、例えば、ＨＥＰＥＳ又はＴｒｉｓなどを含む。ＩＶＴ反応はまた、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び／又はスペルミジン、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、及び／又はＥＤＴＡを含み得る。インビトロ転写反応は、例えば、３７℃で４時間一定の混合下で進行させることができる。

３．キャッピング反応
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法で使用されるＲＮＡは、キャッピングされている。ＲＮＡをキャッピングすることは、安定性を増加させ、分解を低減することによって、細胞における発現の効率を最大化する。いくつかの実施形態では、方法で使用されるＲＮＡ分子は、キャッピング酵素系の存在下でキャッピングされていないＲＮＡをインキュベートすることによってインビトロで合成される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写後に５’末端で酵素的にキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５’末端で共転写的に酵素的にキャッピングされる。したがって、キャッピングは、例えば、オリゴｄＴ精製などのＲＮＡの更なる精製の前又は後のいずれか実施され得る。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ親和性精製及び限外濾過／透析濾過は、キャッピング反応の前に実施される。

本明細書で使用される、用語「５’キャップ」又は「５’キャップ構造」又は「５’キャップ部分」は、ｍＲＮＡの５’末端に組み込まれた化学修飾を指す。５’キャップは、核輸送、ｍＲＮＡ安定性、及び翻訳に関与する。

特定の実施形態では、本明細書で意図されるｍＲＮＡは、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間の５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を含む５’キャップを含む。次に、この５’－グアニル酸キャップをメチル化して、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成してもよい。

本明細書で企図されるｍＲＮＡポリヌクレオチドの特定の実施形態での使用に好適な５’キャップの例示的な例としては、非メチル化５’キャップ類似体、例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、メチル化５’キャップ類似体、例えば、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、及びｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ジメチル化５’キャップ類似体、例えば、ｍ^２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ^２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、及びｍ^２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、トリメチル化５’キャップ類似体、例えば、ｍ^{２，２，７}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ^{２，２，７}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、及びｍ^{２，２，７}Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ジメチル化対称５’キャップ類似体、例えば、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐｍ^７（５’）Ｇ、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐｍ^７（５’）Ｃ、及びｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐｍ^７（５’）Ａ、並びに抗リバース５’キャップ類似体、例えば、抗リバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップ、示される３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、２’Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、２’Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、２’Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ^７２’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ^７２’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、ｍ^７２’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ^７３’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ^７３’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、ｍ^７３’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、及びそれらのテトラホスフェート誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８－１１２２（２００３）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。

特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、三リン酸架橋を介して第１の転写ヌクレオチドの５’末端と連結され、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（式中、Ｎは任意のヌクレオシドである）を生じる、７－メチルグアニル酸（「ｍ^７Ｇ」）である５’キャップを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップがキャップ０構造（キャップ０構造は、塩基１及び２に付着したリボースの２’－Ｏ－メチル残基を欠く）、キャップ１構造（キャップ１構造は、塩基２及び３の両方に付着した２’－Ｏ－メチル残基を有する）、又はキャップ２構造（キャップ２構造は、２’－Ｏ－メチル残基を有する）である５’キャップを含む。

例えば、ＲＮＡは、ワクシニアグアニリルトランスフェラーゼ、グアノシン三リン酸、及びｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニンを使用して５’末端で酵素的にキャッピングされて、キャップ０構造を得ることができる。逆位７－メチルグアノシンキャップは、５’から５’への三リン酸架橋を介して付加される。あるいは、ワクシニアグアニリルトランスフェラーゼとともに２’Ｏ－メチルトランスフェラーゼを使用すると、キャップ１構造をもたらし、キャップ０構造に加えて、２’ＯＨ基は、最後から２番目のヌクレオチド上でメチル化される。Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）は、メチルトランスファー試薬として利用される補因子である。

一実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップを含む。

一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップ又は修飾ＡＲＣＡキャップを含む。

様々な実施形態では、ＲＮＡは、別個の反応で共転写的にキャッピングされるか、又は酵素的にキャッピングされる。５’末端キャップは、内因性キャップ又はキャップ類似体を含み得る。５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体としては、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。

５’キャップ構造の更なる例には、グリセリル、逆位デオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’メチレンヌクレオチド、１－（ベータ－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、アルファ－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ－ペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’－セコヌクレオチド、非環状 ３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環状 ３，５ ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－逆位ヌクレオチド部分、３’－３’－逆位塩基部分、３’－２’－逆位塩基部分、３’－２’－逆位塩基部分、１，４－ブタンジオールホスフェート、３’－ホスホルアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート部分が含まれる。本発明の文脈において使用され得る更なる修飾５’－キャップ構造は、キャップ１（ｍ７ＧｐｐｐＮの隣接ヌクレオチドのリボースのメチル化）、キャップ２（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の第２のヌクレオチドのリボースのメチル化）、キャップ３（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の第３のヌクレオチドのリボースのメチル化）、キャップ４（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の第４のヌクレオチドのリボースのメチル化）、ＡＲＣＡ（抗逆ＣＡＰ類似体、修飾ＡＲＣＡ（例えば、ホスホチオエート修飾ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンである。

真核生物では、機能的キャップ０（ＲＮＡトリホスファターゼ（ＴＰａｓｅ）、ＲＮＡグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴａｓｅ）、及びグアニン－Ｎ７メチルトランスフェラーゼ（グアニン－Ｎ７ ＭＴａｓｅ）を生成するために、少なくとも３つの酵素活性が必要である。キャップ１構造については、リボースの２’Ｏ位で＋１リボヌクレオチドをメチル化するために、追加のｍ７Ｇ－特異的２’Ｏメチルトランスフェラーゼ（２’Ｏ ＭＴａｓｅ）が必要である。真核生物キャッピング酵素は当技術分野で公知である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第４４巻、第１６号、２０１６年９月１９日、７５１１～７５２６頁）。

ウイルスＲＮＡキャッピング酵素も当該技術分野で公知である。一部の例では、ウイルスキャッピング酵素は、酵素活性を多機能タンパク質に結合することが知られている。例えば、フラビウイルス、デングウイルス、ウエストナイル、及びパラミクソウイルスは、ＧＴａｓｅ及びＭＴａｓｅ活性をそれらのＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）に結合する。あるいは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素及びブルータングウイルススキャッピング酵素は、ＲＮＡキャッピングの必要な全ての酵素活性を結合して、キャップ０又はキャップ１を生成する。したがって、その単純性及び有効性により、ワクシニアウイルスキャッピング酵素であるワクシニアグアニリルトランスフェラーゼは、多くの場合好ましいキャッピング酵素であるが、必須ではない。当技術分野で公知の他のウイルスキャッピング酵素としては、クロレラウイルス、アルファウイルス、ラブドウイルス、及び水疱性口内炎ウイルスキャッピング酵素が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化ｍＲＮＡは、ワクシニアグアニリルトランスフェラーゼ、グアノシン三リン酸、及びＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）を使用してその５’末端でキャップされ、キャップ０構造を産生する。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化ｍＲＮＡは、ワクシニアグアニリルトランスフェラーゼ、グアノシン三リン酸、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）、及び２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを使用してその５’末端でキャップされ、キャップ１構造を産生する。

キャッピング方法及び条件は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ，２０１０ Ｊｕｌ－Ａｕｇ；１（１）：１５２－１７２、及びＮａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１１ Ｄｅｃ ５；１０（１）：５１－６５を参照されたい。例示的なキャッピング反応は、Ｓ－アデノシルメチオンクロリド（ＳＡＭ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、緩衝液（例えば、ＮＥＢキャッピング緩衝液）、ＧＴＰ、ワクシニア酵素、ｍＲＮＡキャップ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、及びＥＤＴＡを含む。反応は、３７℃で一定の混合下で行われる。

４．親和性クロマトグラフィー
これまでに、生物学的産物、例えばモノクローナル抗体、治療用タンパク質、ワクチン、及び他の生物学的産物（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）などを精製するための主要な手段は、捕捉クロマトグラフィー、例えば、親和性クロマトグラフィーの使用を通じてきた。本明細書中で使用するように、用語「捕捉クロマトグラフィー」及び「親和性クロマトグラフィー」は、カラムへの、及びカラムからの所望の産物（例えば、ＲＮＡ）の結合及び溶出を含む、クロマトグラフィー構成要素、又は関連する方法工程を指す。捕捉又は親和性クロマトグラフィーは、典型的には、分析物と特定の分子（例、クロマトグラフィー媒質に結合された特定のリガンド）の間での選択的な非共有結合性相互作用を使用する。例えば、捕捉又は親和性クロマトグラフィーは、捕捉試薬としてプロテインＡ、プロテインＧ、抗体（例えば、抗ｄｓＲＮＡ抗体）、特定の基質／プローブ（例えば、オリゴｄＴ）、リガンド又は抗原を使用し得る。次いで、捕捉試薬がカラム内の樹脂／表面に移動（連結又は結合）し、試料が樹脂／表面上（すなわち、カラムを通して）を通過する。次いで、結合した生成物がカラムから溶出される。

クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー）のためのシステムは、当業者に公知であり、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）、及び高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ；例えば、ＡＫＴＡ（商標）システム）である。本明細書に記載される方法での使用に好適なクロマトグラフィーカラムも当業者に公知である。カラムは、任意の好適な体積／サイズ、例えば、０．２ｍＬ、１．０ｍＬ、５．０ｍＬ、又は１０ｍＬであり得る。クロマトグラフィーカラム、システム、及び材料の例示的な製造者としては、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｗａｔｅｒｓ（商標）、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）、及びＣｙｔｉｖａが含まれるが、これらに限定されない。

カラムは、基質又はプローブを保持するための適切な樹脂／表面を含み得る。適切な樹脂／表面材料は、当技術分野で公知である。表面として使用することができる材料の例としては、アクリル、カーボン（例えば、グラファイト、カーボンファイバー）、セルロース（例えば、酢酸セルロース）、セラミックス、制御細孔ガラス、架橋ポリサッカライド（例えば、アガロース又はセファロース（商標））、ゲル、ガラス（例えば、修飾又は機能化ガラス）、金（例えば、原子的に滑らかなＡｕ（１１１））、グラファイト、無機ガラス、無機ポリマー、ラテックス、金属酸化物（例えば、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、ステンレス鋼）、半金属、金属（例えば、原子的に滑らかなＡｕ（１１１））、雲母、硫化モリブデン、ナノ材料（例えば、高配向性熱分解グラファイト（ＨＯＰＧ）ナノシート）、ニトロセルロース、ＮＹＬＯＮ（商標）、光ファイバー束、有機ポリマー、紙、プラスチック、ポラクリロイルモルホリド、ポリ（４－メチルブテン）、ポリエチレンテレフタレート）、ポリ（ビニルブチレート）、ポリブチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレン、ポリホルムアルデヒド、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリサッカライド、ポリスチレン、ポリ（スチレン－ジビニルベンゼン）、ポリウレタン、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、石英、レーヨン、樹脂、ビーズ、ゴム、半導体材料、シリカ、シリコン（例えば、表面酸化シリコン）、硫化物、及びＴＥＦＬＯＮ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。

様々な実施形態では、ＲＮＡは、オリゴデオキシチミジン（ｄＴ）プローブ又は基質を使用するクロマトグラフィー法によって精製される。精製の機構は、高塩条件下でのオリゴヌクレオチドリガンド（オリゴｄＴ）とのＲＮＡのポリ（Ａ）テイルのハイブリダイゼーションを含む。ＤＮＡ鋳型及び／又は他の不純物は結合しないであろう。更に、ポリ（Ａ）ストレッチを含まないＲＮＡ転写物は樹脂に結合せず、親和性リガンドと二本鎖を形成しないであろう。次いで、ポリアデニル化ＲＮＡは、低イオン強度緩衝液又は競合結合オリゴヌクレオチド溶液を利用して樹脂から溶出することができる。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡ試料を、クロマトグラフィーカラム内で可動化された第１又は第２のオリゴｄＴプローブ／基質と接触させ、それによってオリゴｄＴ：ポリアデニル化ＲＮＡ複合体を形成することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、オリゴｄＴ：ポリアデニル化ＲＮＡ複合体から非結合ＲＮＡ及び／又は混入物を分離することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ポリアデニル化ＲＮＡをカラムから溶出することと、溶出されたＲＮＡを更なる精製のために保持することと、を含む。

特定の実施形態では、方法は、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、一本鎖ポリアデニル化ｍＲＮＡを精製することと、を含む。

いくつかの実施形態では、方法は、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、を含み、それによって一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを精製する。

様々な実施形態では、本明細書に記載される方法は、１つを超えるオリゴｄＴプローブ又は精製の工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、２つのオリゴｄＴプローブ又は精製の工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーを使用して、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体から分離されたポリアデニル化ＲＮＡを第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させる。

特定の実施形態では、方法は、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させ、試料から非結合ＲＮＡを除去することと、試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を試料から除去することと、試料を、第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させて、一本鎖ポリアデニル化ＲＮＡを捕捉することと、を含み、それによって一本鎖ポリアデニル化ｍＲＮＡを精製する。

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブは、表面と結合する。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドｄＴプローブは、表面と結合する。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブは、表面と結合する。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴプローブは、セルロース樹脂と結合又は共有結合している。いくつかの実施形態では、予め充填されたオリゴｄＴカラムが使用される。クロマトグラフィー用の予め充填されたオリゴｄＴカラムは、当該技術分野で公知であり、例えば、ＰＯＲＯＳ（商標）ＧｏＰｕｒｅ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などで市販されている。

オリゴｄＴ基質／プローブは、異なる長さのものであり得、例えば、約１５～約３０個のチミジン残基を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１６～約３０個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１７～約３０個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１８～約３０個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１９～約３０個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２０～約３０個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２１～約３０個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２２～約３０個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２３～約３０個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２４～約３０個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２５～約３０個のチミジン残基を含む。

いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５～約２９個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５～約２８個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５～約２７個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５～約２６個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５～約２５個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５～約２４個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５～約２３個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５～約２２個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５～約２１個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５～約２０個のチミジン残基を含む。

いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２１～約２９個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２２～約２８個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２３～約２７個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２４～約２６個のチミジン残基を含む。

オリゴｄＴ基質／プローブは、異なる長さのものであり得、例えば、少なくとも約１５個のチミジン残基、少なくとも約１６個のチミジン残基、少なくとも約１７個のチミジン残基、少なくとも約１８個のチミジン残基、少なくとも約１９個のチミジン残基、少なくとも約２０個のチミジン残基、少なくとも約２１個のチミジン残基、少なくとも約２２個のチミジン残基、少なくとも約２３個のチミジン残基、少なくとも約２４個のチミジン残基、少なくとも約２５個のチミジン残基、少なくとも約２６個のチミジン残基、少なくとも約２７個のチミジン残基、少なくとも約２８個のチミジン残基、少なくとも約２９個のチミジン残基、又は少なくとも約３０個のチミジン残基を含み得る。

いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１５個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１６個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１７個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１８個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約１９個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２０個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２１個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２２個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２３個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２４個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２５個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２６個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２７個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２８個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約２９個のチミジン残基を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、約３０個のチミジン残基を含む。好ましい実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、２３個又は２５個のチミジン残基（それぞれ、配列番号１６及び１５）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、２３個のチミジン残基（配列番号１６）を含む。いくつかの実施形態では、オリゴｄＴ基質／プローブは、２５個のチミジン残基（配列番号１５）を含む。

様々な実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡを更に除去するための追加のクロマトグラフィーの工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、一本鎖ＲＮＡ（例えば、キャッピングポリアデニル化ｍＲＮＡ）及びｄｓＲＮＡを含む試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を一本鎖ＲＮＡ（例えば、キャッピングポリアデニル化ｍＲＮＡ）から分離することと、を含む。

様々な実施形態では、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体は、親和性クロマトグラフィーによって一本鎖ＲＮＡから分離される。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、１ｍｌカラムを含む。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、５ｍｌカラムを含む。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーは、１０ｍｌカラムを含む。

抗ｄｓＲＮＡ抗体と結合することができる任意の樹脂／カラムを本明細書に記載される方法で使用して、抗体：ｄｓＲＮＡ複合体を枯渇させ、抗体をＲＮＡ試料から遊離することができる。例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ結合樹脂が最も典型的には、抗体及び抗体複合体を捕捉するために使用される。プロテインＡ及びプロテインＧは、元々細菌から単離された免疫グロビン結合タンパク質である。好ましい実施形態では、樹脂は、プロテインＡ結合樹脂又はビーズである。プロテインＡ樹脂又はビーズは当技術分野で公知であり、例えば、ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）Ａ Ｓｅｌｅｃｔ ＰｒｏＡ（商標）樹脂が市販されている。

いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片は、ラクダＩｇ、ラマＩｇ、アルパカＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、単鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ラクダ科ＶＨＨ、ナノボディ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｊ２、Ｊ５、Ｋ１、Ｋ２、１Ｄ３、ＣＡＢＴ－Ｂ２１２、及び９Ｄ５からなる群から選択される。特定の実施形態では、抗体は、Ｊ２である。

ｄｓＲＮＡと結合する抗体は公知であり、市販されている。上記に列挙したｄｓＲＮＡ抗体のうちの１つ以上を販売する商業者としては、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｃｉｃｏｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、及びＣｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。

様々な実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、少なくとも約１．５ｍｏｌ％、少なくとも約２ｍｏｌ％、少なくとも約２．５ｍｏｌ％、少なくとも約３ｍｏｌ％、少なくとも約３．５ｍｏｌ％、少なくとも約４ｍｏｌ％、少なくとも約４．５ｍｏｌ％、少なくとも約５ｍｏｌ％、少なくとも約５．５ｍｏｌ％、少なくとも約６ｍｏｌ％、少なくとも約６．５ｍｏｌ％、少なくとも約７ｍｏｌ％、少なくとも約７．５ｍｏｌ％、少なくとも約１５ｍｏｌ％、少なくとも約３０ｍｏｌ％、又は少なくとも約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。例えば、ＲＮＡのモルは、試料中のＲＮＡの総質量をＲＮＡ転写物の分子量（ＭＷ）で割ることによって決定することができる。ＲＮＡ転写物の分子量は、その予測長に３３０ｇ／ｍｏｌ（ＲＮＡヌクレオチドの平均ＭＷ）を乗じて決定することができる。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって決定することができ、次いで、これを体積で乗じて、試料中のＲＮＡの総質量を得ることができる。抗ｄｓＲＮＡ抗体のモルも同様に決定することができる。抗ｄｓＲＮＡ抗体の濃度が不明である場合、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって決定することができる。抗ｄｓＲＮＡ抗体の濃度及び体積が既知である場合、総質量を抗体のＭＷで単に除算して、抗体の総モルを得ることができる。ＲＮＡの総モル及び抗ｄｓＲＮＡ抗体のモルが決定されると、適切なパーセントの抗ｄｓＲＮＡ抗体をＲＮＡ試料に加えることができる（例えば、７．５ｍｏｌ％、１５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％、又は６０ｍｏｌ％の抗ｄｓＲＮＡ抗体）。例えば、試料中に１００モルのＲＮＡが存在する場合、６０モルの抗ｄｓＲＮＡ抗体をＲＮＡ試料に加えて、６０モル％の抗ｄｓＲＮＡを得ることができる。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、少なくとも約１．５ｍｏｌ％、少なくとも約７．５％ｍｏｌ％、少なくとも約１５％ｍｏｌ％、少なくとも約３０％ｍｏｌ％、又は少なくとも約６０％ｍｏｌ％の抗体と接触する。特定の実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、少なくとも約７．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。

様々な実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％、約２．５ｍｏｌ％、約３ｍｏｌ％、約３．５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％、約４．５ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約５．５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％、約６．５ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％、約７．５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、又は約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。特定の実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約７．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。特定の実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１５ｍｏｌ％の抗体と接触する。特定の実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約３０ｍｏｌ％の抗体と接触する。特定の実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。

様々な実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約２ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約２．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約３ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約３．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約４ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約４．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約５．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約６ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約６．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約７ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約７．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する。

様々な実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約７．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約７ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約６．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約５．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約４．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約３．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％の抗体と接触する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ試料は、試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％の抗体と接触する。

５．濾過
ＲＮＡ調製物からの不純物は、本明細書に記載される方法の１つ以上の工程中に濾過して除去することができる。例えば、ＲＮＡ調製物を膜（例えば、限外濾過膜）に通して、前の反応から不要なタンパク質（例えば、酵素／タンパク質）を除去し、及び／又は調製物中のＲＮＡ濃度を増加させることができる。

本明細書で使用される場合、用語「限外濾過」又は「ＵＦ」は、溶液又は懸濁液を、溶媒及び小さな溶質分子を通過させながら高分子を保持する半透膜に供される任意の技術を指す。用語「限外濾過膜」及び「ＵＦ膜」は、約１０ナノメートル～約１００ナノメートル（すなわち、約０．０１マイクロメートル～約０．１マイクロメートル）の範囲の孔径を有する膜を指す。限外濾過を使用して、試料中のＲＮＡの濃度を増加させ、及び／又は不純物（例えば、タンパク質）を除去することができる。ＲＮＡ限外濾過技術及び方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｒｏｓｓ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｂｙ ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ，”Ａｃｔａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２：４９－５６，１９９２を参照されたい）。

あるいは、透析濾過を使用して、緩衝液交換を実施し、及び／又はＲＮＡ調製物を濃縮することができる。一般的に、透析濾過は、膜を使用して、タンパク質、ペプチド、核酸、及び他の生体分子を含む溶液から塩若しくは溶媒を除去、置換、又は濃度を低下させる技術である。したがって、本明細書で使用される場合、用語「透析濾過」又は「ＤＦ」は、可溶性透過物成分の濃度を低減するために、保持物が溶媒で希釈され、再濾過される、特殊な種類の濾過を指す。用語「保持物」は、膜により保持された試料／調製物又は供給物給液の部分を指し、保持物は、保持された種が濃縮された流れである。

例えば、連続透析濾過では、溶媒は、濾液が生成されるのと同じ速度で保持物に連続的に追加される。この場合、保持物体積及び保持された成分の濃度は、プロセス中に変化しない。一方で、不連続又は連続希釈透析濾過では、限外濾過の工程に続いて、保持物側に溶媒が追加され、保持物側に追加される溶媒の体積が、生成される濾液の体積と等しくないか、又はそれ以上でない場合、保持される成分の濃度は、高い濃度を有することになる。

透析濾過は、高分子の溶液又は懸濁液のｐＨ、イオン強度、塩組成物、緩衝液組成物、又は他の特性を変化させるために使用され得る。

本明細書で使用される場合、用語「限外濾過／透析濾過」又は「ＵＦ／ＤＦ」は、限外濾過及び／又は透析濾過を連続的又は同時のいずれかで達成する任意のプロセス、技術、又は技術の組み合わせを指す。ＵＦ／ＤＦ技術、方法、及び膜は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｅｏｎ－Ｄｕｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３ Ｍａｙ １；３１６（１）：６６－７３を参照されたい。

様々な実施形態では、限外濾過、透析濾過、及び／又はＵＦ／ＤＦの工程は、接線流濾過（例えば、接線流限外濾過／透析濾過）を利用する。接線流濾過（ＴＦＦ）は、膜を使用して、サイズ、分子量、又は他の差異に基づいて、液体溶液又は懸濁液（例、供給試料）中の構成要素を分離する過程である。これらのプロセスでは、供給試料は、膜表面に沿って接線方向にポンプ注入され、膜を通過するには大き過ぎる粒子又は分子は保持され、供給試料が十分に明らかにされ、濃縮され、又は精製されるまで、膜を横切る追加の通過（すなわち、再循環）のために過程タンクに戻される。ＴＦＦのクロスフローの性質は、膜の汚損を最小限にし、バッチ当たり大量処理を可能にする。

限外濾過及び／又は透析濾過に好適な膜は、当技術分野で公知の様々な異なる基材又はポリマーで作製され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＴＦＦカセット又は中空繊維カートリッジは、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリビニリデンフルオリド、修飾セルロース、再生セルロース、デルタ再生セルロース、セルロースアセテート、及び／又は当業者に公知の他のポリマー若しくは基材で作製された膜を含む。いくつかの実施形態では、膜は、ポリスルホン膜である。いくつかの実施形態では、膜は、ポリエーテルスルホン膜である。いくつかの実施形態では、膜は、ポリ（メチルメタクリレート）膜である。いくつかの実施形態では、膜は、ポリフッ化ビニリデン膜である。いくつかの実施形態では、膜は、修飾セルロース膜である。いくつかの実施形態では、膜は、再生セルロース膜である。いくつかの実施形態では、膜は、デルタ再生セルロース膜である。いくつかの実施形態では、膜は、セルロースアセテート膜である。好ましい実施形態では、膜は、中空繊維膜である。

本明細書中の特定の実施形態において企図される方法のために有用である例示的なＴＦＦカセット／膜には、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎ．Ｙ．）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、及びＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ（Ｂｏｈｅｍｉａ，Ｎ．Ｙ．）により供給されるＴＦＦカセットが含まれるが、これらに限定されない。例示的なＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＴＦＦカセットには、Ｂｉｏｍａｘ（商標）膜、Ｕｌｔｒａｃｅｌ（商標）膜、又はＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）膜を伴うＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）カセット（例、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２カセット、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２ミニカセット、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２Ｍａｘｉカセット、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３カセット）が含まれるが、これらに限定されない。Ｐａｌｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＴＦＦカセットの例には、Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ（商標）カセット及びＣａｄｅｎｃｅ（商標）単回使用カセットが含まれるが、これらに限定されない。例示的なＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＴＦＦカセットには、Ｋｖｉｃｋ（商標）フローカセットが含まれるが、これらに限定されない。例示的なＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧカセットには、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）カセットが含まれるが、これらに限定されない。

様々な実施形態では、本明細書で企図される方法は、追加の濾過の工程を含む。いくつかの実施形態では、濾過の工程は、最終フィルタ（すなわち、方法における最後のフィルタ）を含む。いくつかの実施形態では、フィルタは、滅菌フィルタである。いくつかの実施形態では、フィルタは、マイクロ濾過膜を含む。いくつかの実施形態では、フィルタは、限外濾過膜を含む。いくつかの実施形態では、フィルタは、ナノ濾過膜を含む。いくつかの実施形態では、フィルタは、０．２２μｍのフィルタである。

Ｄ．ＲＮＡ並びに関連する治療用遺伝子及びタンパク質
リボ核酸（ＲＮＡ）は、核酸分子、すなわち、ヌクレオチドモノマーからなるポリマーである。これらのヌクレオチドは通常、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、ウリジン－モノホスフェート（ＵＭＰ）、グアノシン－モノホスフェート（ＧＭＰ）、及びシチジン－モノホスフェート（ＣＭＰ）モノマー又はその類似体であり、分子骨格を介して互いに接続される。骨格は、各ヌクレオチドモノマー（塩基）の糖部分、すなわち、リボース間のホスホジエステル結合によって形成される。

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、リン酸化糖とＮ－グリコシド結合した複素環式窒素塩基を指す。ヌクレオチドは、天然塩基、及び当該技術分野で認識される広範な修飾塩基を含むと理解される。かかる塩基は一般的に、ヌクレオチド糖部分の１’位に配置される。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖及びリン酸基を含む。リボ核酸（ＲＮＡ）では、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）では、糖はデオキシリボースであり、すなわち、デオキシリボースは、リボース中に存在するヒドロキシル基を欠いた糖である。天然の窒素含有塩基の例としては、プリン類のアデノシン（Ａ）及びグアニジン（Ｇ）、そしてピリミジン類のシチジン（Ｃ）及びチミジン（Ｔ）（又はＲＮＡの場合には、ウラシル（Ｕ））が挙げられる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１、又はプリンのＮ－９に結合される。ヌクオチドは通常、一、二又は三リン酸塩である。ヌクレオチドは、非修飾であっても、又は糖部分、リン酸部分、及び／若しくは塩基部分で修飾されてもよい（ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、及び非標準ヌクレオチドと相互交換可能に言及される。例えばＷＯ９２／０７０６５及びＷＯ９３／１５１８７を参照されたい）。修飾核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３－２１９６）に要約されている。

ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルとみなすこともでき、エステル化は、糖のＣ－５に結合したヒドロキシル基上で発生する。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、糖とＮ－グリコシド結合した複素環の窒素含有塩基を指す。ヌクレオシドは当該技術分野において、天然塩基を含むと認識されており、また周知の修飾塩基も含むと認識されている。かかる塩基は一般的に、ヌクレオシド糖部分の１’位に配置される。ヌクレオシドは一般的に塩基と糖類を含む。ヌクレオシドは、非修飾であっても、又は糖部分及び／若しくは塩基部分で修飾されてもよい（ヌクレオシド類似体、ヌクレオシド誘導体、修飾ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、又は非標準ヌクレオシドと相互交換可能に言及される）。また、上述のように、修飾核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３－２１９６）に要約されている。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、遺伝子の遺伝子配列に対応するＲＮＡの一本鎖分子である。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ配列の転写によって、例えば、細胞内で得ることができる。細胞では、ＤＮＡの転写は、典型的には、未成熟ｍＲＮＡの生成をもたらし、その後成熟ｍＲＮＡにプロセシングされる。未成熟ＲＮＡから成熟メッセンジャーＲＮＡへのプロセシングは、通常、スプライシング、５’キャッピング、ポリアデニル化、及び核又はミトコンドリアからの輸送を含む。あるいは、ｍＲＮＡは、インビトロ（上述の通り）又はインビボのいずれかで組換えＤＮＡから転写され得る。この場合、翻訳された組換えＤＮＡ配列は、典型的にはイントロンを含まないため、プロセシング中にエクソンのスプライシングは必要とされない。

成熟ｍＲＮＡは、通常、特定のペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得るヌクレオチド配列を提供する。典型的には、成熟ｍＲＮＡは、５’－キャップ、任意に５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、任意に３’ＵＴＲ及びポリ（Ａ）配列を含む。

本明細書に提供される方法／プロセスに有用なＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＤＮＡ転写（例えば、ＲＮＡ転写物）の産物であってもよく、又は化学的に合成されてもよい。ＲＮＡ転写物（例えば、インビトロ転写ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写反応のポリヌクレオチド産物である。

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ鋳型及びＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写反応によって産生されるリボ核酸を指す。ＲＮＡ転写物は、典型的には、目的の遺伝子のコード配列及びポリ（Ａ）テイルを含む。ＲＮＡ転写物は、修飾、例えば、修飾ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、ＲＮＡ転写物という用語は、ＤＮＡ鋳型から転写されるか、又は化学的に合成されるかにかかわらず、ｍＲＮＡを含み、ｍＲＮＡと互換性がある。

ＲＮＡ転写物及びｍＲＮＡは、典型的には、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）であるが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、転写（例えば、インビトロ転写）の一般的な副産物である。ｄｓＲＮＡは、限定されないが、ターンアラウンド転写（シス）、不完全転写物のランダムプライミング（シス／トランス）、及び／又はＤＮＡのアンチセンス転写を含む、複数の方法で発生し得ると仮定される。ｄｓＲＮＡ形成の機序にもかかわらず、ｄｓＲＮＡは典型的には細胞に対して毒性であることが知られており、例えば、ｄｓＲＮＡがインビボで投与される場合、レシピエント細胞は、免疫応答を誘発し得る侵入ウイルスとしてそれを感知し得る。

本明細書に記載される方法／プロセスで精製されるＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡサンプル）は、ＲＮＡの供給源によって限定されない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、直線化若しくは直線状プラスミドベクターにクローン化された遺伝子を含むＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって、又はＰＣＲ若しくはＲＴ－ＰＣＲによって合成されるＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって（すなわち、ＰＣＲ増幅産物のＩＶＴによって）合成される。ＲＮＡは、上述のようにキャッピングされ得る。一実施形態では、ＲＮＡ転写物は、典型的には転写後に付加される５’キャップを含む。

特定の実施形態では、ＲＮＡは、ポリアデニル化されている（ポリ（Ａ））。ポリ（Ａ）は、ＤＮＡ鋳型にコードされてもよく、又は転写後に付加されてもよい。特定の実施形態では、本明細書で企図されるＲＮＡは、エクソヌクレアーゼ分解からＲＮＡを保護し、ＲＮＡを安定化し、翻訳を促進するのを助けるためのポリ（Ａ）テイルを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テイル構造を含む。ＲＮＡをポリアデニル化するための方法は、当該技術分野で公知である（ＰＬ Ｗｉｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９０ Ａｐｒ；１０（４）：１７０５－１７１３、及びＷａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ．１９９７ Ｄｅｃ；７９（１２）：７８１－５）。

特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルの長さは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは少なくとも約５００個以上のアデニンヌクレオチド、又は任意の介在する数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルの長さは、少なくとも約１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、若しくは２７５個又はそれ以上のアデニンヌクレオチドである。

特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テイルの長さは、約１０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約３００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約５０～約４００個のアデニンヌクレオチド、約５０～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１００～約４００個のアデニンヌクレオチド、約１００～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００～約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約４００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約２５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０～約２００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２００～約４００個のアデニンヌクレオチド、約２００～約３５０個のアデニンヌクレオチド、約２００～約３００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約４００個のアデニンヌクレオチド、約２５０～約３５０個のアデニンヌクレオチド、又は約２５０～約３００個のアデニンヌクレオチド又は任意の介在する範囲のアデニンヌクレオチドである。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む。

ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ転写物又はｍＲＮＡ）の配向を記載する用語には、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）及び３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の配向又は３’から５’の配向で注釈付けされ得る。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについて、５’から３’の鎖は、その配列が、プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるために、「センス」鎖、「プラス」鎖、又は「コード」鎖と指定される［ＤＮＡ中のチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡ中のウラシル（Ｕ）を除く］。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについては、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である相補的な３’から５’鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、又は「非コード」鎖として指定される。本明細書で使用される、用語「逆配向」は、３’から５’の配向に書かれた５’から３’の配列、又は５’から３’の配向に書かれた３’から５’の配列を指す。

用語「相補的」及び「相補性」は、塩基対形成規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ ３’の相補鎖は、３’Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ５’である。後者の配列は、しばしば、５’末端が左に、３’末端が右にある、５’Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ ３’、逆相補体として記載される。その逆相補鎖と等しい配列は、パリンドローム配列であると言われる。相補性は、核酸塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致する、「部分的」であり得るか、又は核酸間に「完全な」又は「全体的な」相補性が存在し得る。

更に、当業者であれば、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書で企図される、ポリペプチド又はそのバリアントの断片をコードし得る多くのヌクレオチド配列があることを理解するであろう。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用における差異に起因して変化するポリヌクレオチド、例えば、ヒト及び／又は霊長類のコドン選択に最適化されたポリヌクレオチドが、特定の実施形態で具体的に企図される。一実施形態では、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、及び／又は置換など、１つ以上の変異の結果として修飾される内在性ポリヌクレオチド配列である。

ＲＮＡ転写物は、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質若しくは細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、ヒト疾患に関連するタンパク質、標的化部分、融合タンパク質、酵素、エンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９及びそのバリアント）、メガヌクレアーゼ若しくはホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｅｇａＴＡＬ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、腫瘍抗原、病原性抗原、アレルギー性抗原、自己免疫抗原、又はヒトゲノムによってコードされるタンパク質を含むが、これらに限定されない、タンパク質又はその断片若しくはバリアントをコードするコーディングＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり得る。ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡ配列は、公共及び私設のデータベース、例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ又はＰｕｂＭｅｄを使用することによって、当業者によって容易に同定され得る。特定の実施形態では、コードＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又はレプリコンＲＮＡであり得る。

様々な実施形態では、ＲＮＡ転写物又はｍＲＮＡは、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ又はエクソヌクレアーゼ）をコードする。用語「エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖ハイブリッド、及び合成ＤＮＡ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ以外の塩基を含む）であってもよい。エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドを対称的に切断して、「平滑」末端を残すか、又は直接的に対向しない位置に、「付着末端」と呼ばれ得るオーバーハングを形成し得る。本明細書に記載される方法及び組成物は、エンドヌクレアーゼによって生成される切断部位に適用され得る。エンドヌクレアーゼとしては、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、又はそれらの機能的バリアントなどの遺伝子編集酵素が含まれるが、これらに限定されない。

様々な実施形態では、ＲＮＡ転写物又はｍＲＮＡは、遺伝子編集エンドヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子編集エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）である。特定の実施形態では、遺伝子編集エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）、又はｍｅｇａＴＡＬである。

用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」及び「メガヌクレアーゼ」は、互換的に使用され、１２～４５塩基対の切断部位（例えば、標的部位）を認識し、かつ配列及び構造モチーフ：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１４）、ＧＩＹ－ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓ ｂｏｘ、及びＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫに基づく５つのファミリーに一般にグループ化される、天然発生型ヌクレアーゼを指す。例えば、Ｓｔｏｄｄａｒｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１１ Ｊａｎ １２；１９（１）：７－１５を参照されたい。

「ｍｅｇａＴＡＬ」は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、標的遺伝子内のＤＮＡ標的配列と結合して切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、を含む、ポリペプチドを指す。例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１５）；１２３９：１７１－９６を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、１つ以上のリンカー及び／又は追加の機能ドメイン、例えば、５’－３’エクソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリ性エクソヌクレアーゼ、３’－５’エクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２、ＥｘｏＩ、又はＥｘｏＸ）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、又は鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを更に含む。

用語「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」又は「ＣＲＩＳＰＲ」は、細菌及び古細菌などの原核生物のゲノムに元々見られるＤＮＡ配列のファミリーを指し、バクテリオファージからのＤＮＡを検出及び破壊するために使用される。ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）と組み合わせたＣＲＩＳＰＲ配列を使用して、生物内の遺伝子を編集し、研究、遺伝子編集、及び治療において様々な用途を有することもできる。例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ３８，ｐａｇｅｓ ８２４－８４４（２０２０）を参照されたい。

用語「ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ」及び「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、互換的に使用され、ＤＮＡに特定の一本鎖又は二本鎖切断を生成するガイドとしてＣＲＩＳＰＲ配列を使用するＲＮＡガイド配列特異的ヌクレアーゼを指す。一般的に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによる標的化は、標的ＤＮＡ部位の近くで発生するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られる短い配列を必要とする。

用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合することによって生成される人工制限酵素を指す。ジンクフィンガードメインは、所望の標的部位と結合するように操作することができる。いくつかの実施形態では、切断ドメインは、ＦｏｋＩの非特異的切断ドメインを含む。他の実施形態では、切断ドメインは、別のヌクレアーゼの全部又は活性部分を含む。

用語「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、ヌクレアーゼドメインと融合されたＴＡＬエフェクタードメイン（ＴＡＬＥ）を含むヌクレアーゼを指す。植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓから単離されたＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインが記載されている（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９ Ｏｃｔ．２００９（１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１）、及びＭｏｓｃｏｕ ａｎｄ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９ Ｏｃｔ．２００９（ｌ０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１７８８１７）を参照されたい）。これらのＤＮＡ結合ドメインは、所望の標的と結合するように操作され、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインなどのヌクレアーゼドメインと融合されて、ＴＡＬエフェクタードメイン－ヌクレアーゼ融合タンパク質を誘導することができる。

「標的部位」又は「標的配列」は、結合及び／又は切断に十分な条件が存在するという条件で、結合分子が結合し、かつ／又は切断する核酸の一部分を定義する染色体又は染色体外核酸配列である。標的部位又は標的配列の１つの鎖のみを参照するポリヌクレオチド配列又は配列番号に言及するとき、ヌクレアーゼバリアントによって結合され、かつ／又は切断される標的部位又は標的配列は、二本鎖であり、参照配列及びその相補鎖を含むことは理解される。様々な実施形態では、標的部位は、免疫系チェックポイント遺伝子、グロビン遺伝子、γ－グロビン遺伝子発現及び／若しくはＨｂＦの抑制に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子、又は免疫抑制シグナル伝達遺伝子内にある。

様々な実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ、ＨＥ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）標的部位は、免疫系チェックポイント遺伝子、グロビン遺伝子、γ－グロビン遺伝子発現及びＨｂＦの抑制に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子、又は免疫抑制シグナル伝達遺伝子内にある。いくつかの実施形態では、標的部位は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＴＣＲβ、ＩＬ１０Ｒα、ＩＬ１０Ｒβ、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、及びＢＣＬ１１Ａ遺伝子からなる群から選択される遺伝子内にある。

いくつかの実施形態では、標的部位は、ヒトＴＲＡＣ遺伝子内の配列である。いくつかの実施形態では、標的部位は、ＰＤ１遺伝子内の配列である。いくつかの実施形態では、標的部位は、ＰＣＳＫ９遺伝子内の配列である。いくつかの実施形態では、標的部位は、ＢＣＬ１１Ａ内の配列である。いくつかの実施形態では、標的部位は、ＢＣＬ１１Ａ内の配列である。

他の標的遺伝子としては、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＳＯＸ６、ＧＡＴＡ１、ＬＳＤ１、アルファ葉酸受容体（ＦＲα）、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ６、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１）、ＣＤ２サブセット１（ＣＳ－１）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫関連抗原１（ＣＴＡＧＥ１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、上皮性糖タンパク質２（ＥＧＰ２）、上皮性糖タンパク質４０（ＥＧＰ４０）、上皮性細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、エフリンＡ型受容体２（ＥＰＨＡ２）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、胎児性アセチルコリンエステラーゼ受容体（ＡｃｈＲ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧ３（ＧＤ３）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＩＬ－１１Ｒα、ＩＬ－１３Ｒα２、カッパ、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１Ａ）、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ（ＬｅＹ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１－ＣＡＭ）、黒色腫抗原遺伝子（ＭＡＧＥ）－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥＡ１０、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（ＭｅｌａｎＡ又はＭＡＲＴ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、ポリシアル酸；胎盤特異性１（ＰＬＡＣ１）、黒色腫で優位に発現された抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異性膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫、Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、ＴＥＭ５、ＴＥＭ８、トロホブラスト糖タンパク質（ＴＰＢＧ）、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ－１）遺伝子、並びにウィスコット－アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子が含まれ得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ、ＨＥ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）標的部位は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１、ＰＤＣＤ１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ－３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（ＣＴＬＡ－４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリン及び免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、並びにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＣＲ５、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）、ＩＬ１０Ｒα、ＴＧＦＢＲ２、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＣＳＫ９、ＡＨＲ、ＢＴＫ、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、及びＢＣＬ１１Ａ遺伝子からなる群から選択される遺伝子内にある。

様々な実施形態では、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ、ＨＥ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、又はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）標的部位は、ＴＲＡＣ（ＴＣＲα）遺伝子、ＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）遺伝子、又はＰＣＳＫ９遺伝子内にある。特定の実施形態では、ＴＣＲα ｍｅｇａＴＡＬ ＲＮＡは、配列番号２又は３に示される配列を含む（例えば、ＷＯ２０１８／０７１５６５を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、ＰＤ－１ ｍｅｇａＴＡＬ ＲＮＡは、配列番号５又は６に示される配列を含む（例えば、ＷＯ２０１８／０４９２２６を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９ ｍｅｇａＴＡＬ ＲＮＡは、配列番号８又は９に示される配列を含む（例えば、ＷＯ２０１９／０７０９７４を参照されたく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

様々な実施形態では、ＲＮＡ転写物は、エクソヌクレアーゼ、末端処理酵素、又はそれらの断片若しくはバリアントをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通型ドメインを含まないＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、ＥｘｏＩ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、ＥｘｏＸ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエクソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼＩ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７－エクソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルス組み込みタンパク質（ＩＮ）、Ｂｌｏｏｍ、南極ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、緑豆ヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌミュー、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４、及びＵＬ－１２からなる群から選択される、エクソヌクレアーゼ、末端プロセシング酵素、又はそれらの断片若しくはバリアントである。いくつかの実施形態では、エクソヌクレアーゼは、Ｔｒｅｘ２又はその生物学的に活性な断片である。特定の実施形態では、Ｔｒｅｘ２ ＲＮＡは、配列番号１１又は１２に示される配列を含む。

様々な実施形態では、ＲＮＡ転写物は、疾患に関連するタンパク質又はポリペプチド（例えば、治療的に活性なタンパク質又はポリペプチド）をコードし得る。いくつかの実施形態では、治療的に活性なタンパク質又はポリペプチドは、α－グロビン、β－グロビン、γ－グロビン、ＦＶＩＩＩ、又は抗血友病因子（ＡＨＦ）、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）、アデノシンデアミナーゼ、インターロイキン２受容体ガンマ、トリペプチジルペプチダーゼ１、アルファ－Ｌイズロニダーゼ、イズロネート２－スルファターゼである。

あるいは、選択されるＲＮＡ配列は、本明細書で定義される任意のＲＮＡ、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）、リボザイム、アプタマー、リボスイッチ、免疫刺激ＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）低分子核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、天然起源のヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含み得る。

一実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、プソイドウリジン、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジン、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、２－メトキシ－アデニン、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンらなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。

一実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、プソイドウリジン、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－プソイドウリジン、２－チオ－プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－プソイドウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－プソイドウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－プソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－プソイドウリジン、４－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－プソイドウリジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－プソイドウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－プソイドウリジンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。

一実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、５－アザ－シチジン、プソイドイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－プソイドイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－プソイドイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－プソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－プソイドイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－プソイドイソシチジンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。

一実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンからなる群からなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。

一実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。

一実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、１つ以上のプソイドウリジン、１つ以上の５－メチル－シトシン、及び／又は１つ以上の５－メチル－シチジンを含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上のプソイドウリジンを含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上の５－メチル－シチジンを含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、１つ以上の５－メチル－シトシンを含む。

本明細書において引用される全ての刊行物、特許出願、及び登録された特許は、あたかも個々の刊行物、特許出願、又は登録された特許が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示したかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

前述の実施形態は、明確性及び理解を目的として、図及び実施例により詳細に記載されているが、本明細書において企図される教示に照らし、特定の変化及び修飾が、添付の請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく実施され得ることが当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、説明の目的のみで提供され、限定の目的で提供されるものではない。当業者であれば、本質的に類似した結果をもたらすために変更又は修正され得る様々な非臨界パラメータを容易に認識するであろう。

実施例１
治療用ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡを除去するための新しい方法
驚くべきことに有効であり、インビボで細胞毒性を低減する、ｄｓＲＮＡを除去するための新しい改善された方法／プロセスを開発した。図１Ａ～１Ｆは、例示的な方法単位操作を示す。簡潔に述べると、プロセスは、非増幅直線状ＤＮＡ（例えば、消化プラスミドなどから）を、目的の遺伝子をコードする鋳型として使用する。インビトロ転写反応を使用して（例えば、Ｔ７ファージポリメラーゼ及びヌクレオチド三リン酸を使用して）、直線状ＤＮＡからのＲＮＡ転写物を合成する。ＲＮＡ転写物は、キャッピング酵素、例えば、ワクシニアグアニリルトランスフェラーゼ、グアノシン三リン酸、及びＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンを使用して、５’末端で翻訳後に（又は共転写的に）酵素的にキャッピングされ、キャップ０構造をもたらす。あるいは、２’Ｏ－メチルトランスフェラーゼを使用して、キャップ１構造を得ることができる。キャップ１構造は、最後から２番目のヌクレオチドにメチル化２’ＯＨ基を含む。いくつかの実施形態では、キャッピングは、既知の方法及び／又は市販の製品（例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標））を使用して共転写的に行われる。

次いで、ｄｓＲＮＡと結合する抗体をＲＮＡ転写物とバッチインキュベートして、ｄｓＲＮＡ不純物と結合させる。樹脂（例えば、ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）Ａ Ｓｅｌｅｃｔ ＰｒｏＡ（商標）樹脂）を使用して、試料から抗体－ｄｓＲＮＡ複合体及び遊離抗体を枯渇させ、抗体を遊離する。ＲＮＡ転写物はまた、オリゴｄＴ親和性カラム／樹脂（例えば、オリゴｄＴセルロース樹脂／カラム又はＰＯＲＯＳ（商標）Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５カラム（配列番号１５））を使用する親和性クロマトグラフィーによって、反応単位操作の間にクロマトグラフィー的に精製し、所望の製剤緩衝液に透析濾過した。ｍＲＮＡを、最終工程として０．２２μｍフィルタを通して濾過した。

実施例２
Ｊ２抗体及びオリゴｄＴ親和性クロマトグラフィーは、ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡを効果的に除去する
ＴＣＲａ ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡ（配列番号２）を、実施例１に記載したプロセス単位操作を使用して精製した（図１Ｃも参照されたい）。具体的には、ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）Ａ Ｓｅｌｅｃｔ ＰｒｏＡ（商標）樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））と結合した抗ｄｓＲＮＡ抗体Ｊ２を使用して、ＲＮＡ試料からｄｓＲＮＡを除去した。ＰｒｏＡ樹脂／Ｊ２抗体の１ｍＬ及び５ｍｌカラム（「１ｘＰｒｏＡカラム」及び「５ｘＰｒｏＡカラム」）、並びにＪ２抗体精製の工程（「５ｘＰｒｏＡカラム＋ｄＴ」）の後に親和性クロマトグラフィー精製（オリゴｄＴ）の追加の工程を含む５ｍｌカラム（ＰｒｏＡ樹脂／Ｊ２抗体）の使用を試験した。ｄｓＲＮＡ含有量を、Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１１ Ｎｏｖ；３９（２１）：ｅ１４２に記載されているように、ｄｓＲＮＡドットブロットアッセイによって測定した。簡潔に述べると、ｍＲＮＡロットを、合成１００％二本鎖ＲＮＡ対照とともに、帯電したＮｙｔｒａｎ（商標）膜上にブロットした。膜を乾燥させ、ブロッキングし、Ｊ２抗ｄｓＲＮＡ ＩｇＧ２ａモノクローナル抗体と一晩インキュベートした。数回の洗浄後、蛍光二次抗体を使用して、Ｊ２抗体と結合させた。数回の洗浄後、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ ＣＬｘ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して画像を捕捉し、ｍＲＮＡロット中の二本鎖ＲＮＡの割合の分析を、１００％対照と比較した蛍光強度比較によって実施した。

１ｍＬカラムでは、蛍光の減少によって示されるように、ｄｓＲＮＡ含有量の顕著な枯渇があった（図２Ａ及び２Ｂ）。抗体：ｄｓＲＮＡ複合体の更なる枯渇は、ＰｒｏＡ樹脂の体積を増加させることによって、すなわち、５ｍＬカラムを使用することによって観察された。しかしながら、驚くべきことに、抗体：ｄｓＲＮＡ複合体の更なる枯渇は、Ｊ２抗体精製の工程の後に親和性クロマトグラフィー精製の工程（すなわち、オリゴｄＴ精製の工程）を追加することによって達成された（図２Ｂ）。更に、二次蛍光標識した試料の直接的なドットブロットは、図２Ｂのドットブロットで検出された残留蛍光シグナルが、ＰｒｏＡカラムを通過した残留Ｊ２抗体に起因することを示す（図２Ｃ）。したがって、ｄｓＲＮＡドットブロットによるｄｓＲＮＡ含有量の評価は、上述の抗体及びオリゴｄＴ系の精製を組み合わせる場合、ｍＲＮＡ試料中のｄｓＲＮＡの割合がアッセイによって検出できないことを示す。

実施例３
Ｊ２抗体滴定
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）クリアランスのためのＪ２ ｍＡｂの有効量を決定するためのＪ２滴定実験を実施した。ＰＤ１ ｍｅｇａＴＡＬ（配列番号５、約３０００ｎｔ）及びＴｒｅｘ２（配列番号１１、約１０００ｎｔ）ｍＲＮＡを、インハウスのｍＲＮＡ産生プロセスを使用して調製した。簡潔に述べると、ｍＲＮＡ材料は、インビトロ転写によって生成され、Ｊ２滴定実験の前にキャップ０構造で５’末端でキャッピングされた。Ｊ２の量を、ｍＲＮＡ分子（最大６０ｍｏｌ％）に従って計算した。試料を、適切な量のＪ２と室温で３０分間インキュベートし、続いてＰｒｏＡ樹脂を添加して、抗体：ｄｓＲＮＡ複合体を捕捉した（室温で１時間インキュベートした）。次いで、精製されたｍＲＮＡ材料を真空マニホールドを通して収集した。Ｊ２ドットブロット（上述）及びインピーダンスアッセイ（以下に記載）を実施して、ＢＪ線維芽細胞に対するｄｓＲＮＡ含有量及び毒性を決定した。

ｍＲＮＡロットの細胞傷害性の評価を、ＢＪ線維芽細胞及びＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）ＲＴＣＡ ＭＰ機器を使用した細胞インピーダンスアッセイを介して実施した。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ機器は、非侵襲的な電気インピーダンスモニタリングを使用して、「細胞指標」値の形態で細胞生存率を継続的に測定する。細胞を、櫛型電極を含むＡＣＥＡのＥプレートに接着させ、２４時間かけて増殖させた。次いで、細胞をｍＲＮＡロット及び二本鎖ｍＲＮＡ殺傷対照でトランスフェクトし、トランスフェクション後７２時間モニタリングした。ＡＣＥＡソフトウェアを使用して、トランスフェクション後７２時間ウィンドウにわたる各ウェルの細胞指標値を分析して、細胞指標の勾配の値を報告する。所与のｍＲＮＡロットの細胞指標の勾配を、ＬＮＰのみの細胞指数及び二本鎖殺傷対照の細胞指数の勾配と比較して、細胞傷害性の指標を得た。

両方のｍＲＮＡ構築物を用いた滴定実験は、≧７．５ｍｏｌ％のＪ２で有効なｄｓＲＮＡクリアランスを示した（図３Ａ及び３Ｂ）。更に、インビトロ毒性結果は、ｄｓＲＮＡ含有量と親密に相関し、より低いｄｓＲＮＡレベルで細胞傷害性の減少を示している（図３Ｃ及び３Ｄ）。

実施例４
インビボ遺伝子編集及びｍＲＮＡの特性
インハウスで生成したＰＣＳＫ９ ｍｅｇａＴＡＬ及びＴｒｅｘ２ ｍＲＮＡ（それぞれ配列番号８及び１１）の粗インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ材料を商業ベンダーに送り、シリカ樹脂（市販－シリカ）又はＨＰＬＣ（市販－ＨＰＬＣ）のいずれかでキャッピング及び精製した。同じ粗ＩＶＴ材料を、上述のように、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ単離（オリゴｄＴ精製）及びｄｓＲＮＡ枯渇（Ｊ２精製）を用いてインハウスで精製した。３つの方法を使用して精製したＰＣＳＫ９ ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡを、３つの別個のインビトロアッセイで比較した（図４Ａ～４Ｆ）。ｍＲＮＡの長さは、ｍＲＮＡを製造業者の推奨プロトコルに従って、それらの標準的なＲＮＡ分析試薬を使用して、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、キャピラリー電気泳動系断片分析器上で実行することによって測定した。曲線下面積を、ＰｒｏＳｉｚｅソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して測定し、３つの複製について選択したピークの平均総面積をプロットした（図４Ａ）。

二本鎖ｍＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、インビボに送達されると毒性であり得る。ｍＲＮＡ調製物中のｄｓＲＮＡの量を測定するために、上述のようにｄｓＲＮＡドットブロットアッセイを実施した。Ｊ２／ｄＴ ｍＲＮＡ産生プロセスは、ＨＰＬＣ及びシリカ精製ｍＲＮＡと同等又はそれよりも良好な、検出不可能なレベルのｄｓＲＮＡを含むｍＲＮＡを産生する（図４Ｂ）。

ｍＲＮＡ毒性を、ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．のＲＴＣＡ ｉＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）インピーダンス系アッセイを使用して、インビトロ細胞増殖アッセイで測定した。ヒトＢＪ線維芽細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２５２２）細胞をｉＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅプレートに播種し、１８～２４時間接着させた。ｍＲＮＡを、製造業者の推奨プロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘトランスフェクション試薬に配合し、細胞をトランスフェクトするために使用した。細胞増殖の量を４８時間測定し、増殖の勾配を毒性の指標としてグラフ化した（図４Ｃ）。

３つの方法を使用して精製したＰＣＳＫ９ ｍｅｇａＴＡＬ及びＴｒｅｘ２ ｍＲＮＡを、液体ナノ粒子（ＬＮＰ）（Ａｃｕｉｔａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）で１．０：１．０モル比で製剤化した。ｍＲＮＡ／ＬＮＰ製剤をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、条件ごとに５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスに１ｍｇ／ｋｇの用量で投与した（尾静脈注射を介して）（図４Ｄ～４Ｆ）。ＩＮＤＥＬ分析を次世代アンプリコンシーケンシングを使用して実施し、シリカ条件と比較して倍率変化としてグラフ化した（図４Ｄ）。

各ｍＲＮＡ調製物の相対毒性を、投与後２４時間で動物から下顎出血を採取し、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）酵素レベルを測定することによってアッセイした（図４Ｅ）。精製ｍＲＮＡのインビボ免疫原性を、ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＭＩＬＬＩＰＬＥＸ ＭＡＰマウスサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズ系Ｌｕｍｉｎｅｘパネル（カタログ番号：ＭＣＹＴＯＭＡＧ－７０ＫＭ）を使用して、ｍＲＮＡ製剤投与の４時間後に採取した血清からケモカイン及びサイトカインレベル（すなわち、ＩＬ－６及びＭＣＰ－１）を定量することによって測定した（図４Ｆ）。

全体として、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ精製及びｄｓＲＮＡ枯渇を含むインハウスの（Ｊ２／ｄＴ）方法は、インビトロｍＲＮＡ特性又はインビボ活性及び毒性／免疫原性アッセイの両方において、市販のシリカ又はＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡと同等又はより良好な質であるｍＲＮＡを産生した。

実施例５
エクスビボ遺伝子編集及びｍＲＮＡの特性
インハウスで生成したＰＤ１ ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡ（配列番号５）の粗インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ材料を商業ベンダーに送り、シリカ樹脂（市販－シリカ）又はＨＰＬＣ（市販－ＨＰＬＣ）のいずれかでキャッピング及び精製した。同じ粗ＩＶＴ材料を、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ単離（オリゴｄＴ精製）及びｄｓＲＮＡ枯渇（Ｊ２精製）を用いてインハウスで精製した。３つの方法を使用して作製したｍＲＮＡを、３つの別個のアッセイで比較して、ｍＲＮＡの質を評価した（図５Ａ～５Ｃ）。ｍＲＮＡもＴ細胞で評価し、有効性の差を比較した（図５Ｄ及び５Ｅ）。３つのドナーからのＰＢＭＣを、αＣＤ３抗体及びαＣＤ２８抗体で刺激した。３７°Ｃで７２時間後、Ｔ細胞に、５０μｇ／ｍＬ用量のＡｍａｘａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを使用してｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。各ｍＲＮＡを、３つのドナーの各々に対して三重でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を３０℃に置いて一晩回復させ、次いで、翌日３７℃に移させた。エレクトロポレーションの９６時間後、細胞を２つのプレートに分割した。１枚のプレートをＰＭＡ／イオノマイシンで２４時間刺激し、次いでＦＡＣＳで分析して、ＰＤ１ ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡ処理細胞におけるＰＤ－１ノックダウンを観察した（図５Ｅ）。残りのプレートを、ＮＧＳを介したＩＮＤＥＬ分析のために処理した（図５Ｄ）。

実施例６
異なる精製方法間のｄｓＲＮＡレベルの比較
ｄｓＲＮＡレベルを、異なる精製方法によって生成したｍＲＮＡ間で比較した（図６Ａ）。複数のｍＲＮＡ構築物を、商業供給業者によって、それらのプラットフォームシリカ又はＨＰＬＣ精製プロセス（商業シリカ又は商業ＨＰＬＣ）を使用して作製した。更に、各シリカ精製ｍＲＮＡの一部を、ｂｌｕｅｂｉｒｄのＪ２／ｄＴプロセス（市販－Ｊ２）を使用して更に精製した。Ｊ２／ｄＴプロセスを使用したインハウスで生成したｍＲＮＡの２つのバッチを比較に含めた。分析は、追加のＪ２／ｄＴ精製が、シリカ精製材料のｄｓＲＮＡレベルを驚くべきことに減少させたことを示した。更に、Ｊ２／ｄＴによって精製されたインハウスで生成した材料は、最も低いｄｓＲＮＡレベルを示した。

ドットブロットによるｄｓＲＮＡ分析に加えて、ＢＪ線維芽細胞を使用したインピーダンス系アッセイによって、ｍＲＮＡ材料の選択的群についてインビトロ細胞傷害性を評価した。細胞増殖指数の勾配として表される細胞傷害性の結果は、ｍＲＮＡ材料のｄｓＲＮＡレベルとの強い相関を示した（図６Ｂ）。

概して、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定させるものと解釈されるべきではないが、かかる特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲とともに全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、請求の範囲は、本開示により限定されない。

Claims (78)

1. ＲＮＡ精製プロセスであって、
   （ａ）一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、
   （ｂ）前記ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を前記試料から除去することと、
   （ｃ）前記一本鎖ＲＮＡを精製することと、を含む、プロセス。
2. 治療用ＲＮＡを産生するためのプロセスであって、
   （ａ）一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、
   （ｂ）前記ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を前記試料から除去することと、
   （ｃ）前記一本鎖ＲＮＡを精製することと、を含み、
   それによって治療用ＲＮＡを産生する、プロセス。
3. ヌクレアーゼを編集する効率を増加させるためのプロセスであって、
   （ａ）ヌクレアーゼをコードする一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、
   （ｂ）前記ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を前記試料から除去することと、
   （ｃ）前記一本鎖ＲＮＡを精製することと、を含み、
   前記ヌクレアーゼを前記編集する割合が、ｄｓＲＮＡと結合する抗体と接触しないＲＮＡによってコードされるヌクレアーゼの前記編集する割合と比較して増加する、プロセス。
4. 細胞又は対象に投与されるＲＮＡの免疫原性及び／又は毒性を低減させるプロセスであって、
   （ａ）一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含むＲＮＡ試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させて、ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を形成することと、
   （ｂ）前記ｄｓＲＮＡ：抗体複合体を前記試料から除去することと、
   （ｃ）前記一本鎖ＲＮＡを精製することと、を含み、
   細胞又は対象に投与された場合の前記ＲＮＡの前記免疫原性及び／又は毒性が、前記ＲＮＡがｄｓＲＮＡと結合する抗体と接触していない場合の、細胞又は対象に投与されたＲＮＡの前記免疫原性及び／又は毒性よりも低い、プロセス。
5. 前記対象が、ヒトである、請求項４に記載のプロセス。
6. 前記一本鎖ＲＮＡが、一本鎖環状ＲＮＡ、一本鎖ｍＲＮＡ、又は一本鎖ノンコーディングＲＮＡである、請求項１～５のいずれか一項に記載のプロセス。
7. 前記一本鎖ＲＮＡが、ポリアデニル化されている、及び／又は前記プロセスが、前記試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させる前にポリアデニル化の工程を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のプロセス。
8. 前記プロセスが、前記ポリアデニル化ＲＮＡ試料を、ポリアデニル化ＲＮＡと結合する第１のオリゴヌクレオチドｄＴ（オリゴｄＴ）プローブと接触させることと、前記試料を、ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させる前に、前記試料から非結合ＲＮＡを除去することと、を含む、請求項７に記載のプロセス。
9. 前記プロセスが、ｄｓＲＮＡと結合する前記抗体又はその抗原結合断片と接触させた後に、前記ポリアデニル化ＲＮＡを、第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブと接触させることを更に含む、請求項７又は８に記載のプロセス。
10. 前記ＲＮＡ試料が、化学合成を通じて新たに得られる、請求項１～９のいずれか一項に記載のプロセス。
11. 前記ＲＮＡ試料が、インビトロ転写反応から得られる、請求項１～９のいずれか一項に記載のプロセス。
12. 細胞に投与された場合の前記精製されたＲＮＡの、インピーダンスによって測定される細胞傷害性が、前記ＲＮＡがｄｓＲＮＡ及び／又は第２のオリゴｄＴと結合する抗体と接触していない場合の、細胞に投与されたＲＮＡの細胞傷害性よりも低い、請求項１～１１のいずれか一項に記載のプロセス。
13. 前記第１及び／又は第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブが、表面と結合する、請求項８～１２のいずれか一項に記載のプロセス。
14. 前記第１及び／又は第２のオリゴヌクレオチドｄＴプローブが、前記表面と共有結合する、請求項１３に記載のプロセス。
15. 前記試料中の前記ＲＮＡが、キャッピングされている、及び／又は前記プロセスが、前記試料中の前記ＲＮＡをキャッピングすることを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のプロセス。
16. 前記ＲＮＡが、インビトロ転写反応から得られ、共転写的にキャッピングされている、請求項１～１５のいずれか一項に記載のプロセス。
17. 前記キャップが、キャップ０又はキャップ１である、請求項１５又は１６に記載のプロセス。
18. 前記キャップが、ＡＲＣＡキャップ又は修飾ＡＲＣＡキャップである、請求項１５又は１６に記載のプロセス。
19. 前記試料中の前記ＲＮＡが、キャッピング酵素、グアノシン三リン酸、及びＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニンを使用して、その５’末端でキャッピングされる、請求項１～１８のいずれか一項に記載のプロセス。
20. 前記キャッピング酵素が、ワクシニアグアニリルトランスフェラーゼである、請求項１９に記載のプロセス。
21. 前記キャッピングが、グアノシン三リン酸を含む、請求項１９又は２０に記載のプロセス。
22. 前記キャッピングが、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニンを含む、請求項１５～２１のいずれか一項に記載のプロセス。
23. 前記キャッピングが、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを含む、請求項１５～２２のいずれか一項に記載のプロセス。
24. 前記ｄｓＲＮＡと結合する抗体又はその抗原結合断片が、ラクダＩｇ、ラマＩｇ、アルパカＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、二重特異性Ｆａｂ二量体（Ｆａｂ２）、三重特異性Ｆａｂ三量体（Ｆａｂ３）、Ｆｖ、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ビス－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ラクダ科ＶＨＨ、ナノボディ）からなる群から選択される、請求項１～２３のいずれか一項に記載のプロセス。
25. ｄｓＲＮＡと結合する前記抗体又はその抗原結合断片が、モノクローナル抗体である、請求項１～２４のいずれか一項に記載のプロセス。
26. 前記抗体が、Ｊ２、Ｊ５、Ｋ１、Ｋ２、１Ｄ３、ＣＡＢＴ－Ｂ２１２、及び９Ｄ５からなる群から選択される、請求項１～２５のいずれか一項に記載のプロセス。
27. 前記抗体が、Ｊ２である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のプロセス。
28. 前記ＲＮＡが、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、少なくとも約１．５ｍｏｌ％、少なくとも約２ｍｏｌ％、少なくとも約２．５ｍｏｌ％、少なくとも約３ｍｏｌ％、少なくとも約３．５ｍｏｌ％、少なくとも約４ｍｏｌ％、少なくとも約４．５ｍｏｌ％、少なくとも約５ｍｏｌ％、少なくとも約５．５ｍｏｌ％、少なくとも約６ｍｏｌ％、少なくとも約６．５ｍｏｌ％、少なくとも約７ｍｏｌ％、少なくとも約７．５ｍｏｌ％、少なくとも約１５ｍｏｌ％、少なくとも約３０ｍｏｌ％、又は少なくとも約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
29. 前記ＲＮＡが、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、少なくとも約１．５ｍｏｌ％、少なくとも約７．５ｍｏｌ％、少なくとも約１５ｍｏｌ％、少なくとも約３０ｍｏｌ％、又は少なくとも約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
30. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、少なくとも約７．５ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
31. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％、約２．５ｍｏｌ％、約３ｍｏｌ％、約３．５ｍｏｌ％、約４ｍｏｌ％、約４．５ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、約５．５ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％、約６．５ｍｏｌ％、約７ｍｏｌ％、約７．５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％、又は約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
32. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約７．５ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
33. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
34. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約２ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
35. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約２．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
36. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約３ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
37. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約３．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
38. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約４ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
39. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約４．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
40. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
41. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約５．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
42. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約６ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
43. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約６．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
44. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約７ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
45. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約７．５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
46. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
47. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
48. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
49. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
50. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約７．５ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
51. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約７ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
52. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約６．５ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
53. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約６ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
54. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約５．５ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
55. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約５ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
56. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約４．５ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
57. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約４ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
58. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約３．５ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
59. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約３ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
60. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約２．５ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
61. 前記試料が、前記試料中のＲＮＡの総モルと比較して、約１．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％の抗体と接触する、請求項１～２７のいずれか一項に記載のプロセス。
62. 前記ｄｓＲＮＡ：抗体複合体が、抗体系親和性クロマトグラフィーによって前記一本鎖ＲＮＡから分離される、請求項１～６１のいずれか一項に記載のプロセス。
63. 前記抗体系親和性クロマトグラフィーが、１ｍｌカラムを含む、請求項６２に記載のプロセス。
64. 前記抗体系親和性クロマトグラフィーが、５ｍｌカラムを含む、請求項６２に記載のプロセス。
65. 前記抗体系親和性クロマトグラフィーが、１０ｍｌカラムを含む、請求項６２に記載のプロセス。
66. 前記プロセスが、ＩＶＴの工程の前にプラスミド消化の工程を含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。
67. 前記プロセスが、残留プラスミドＤＮＡ鋳型を除去するために、前記試料をＤＮａｓｅで処理する工程を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。
68. 前記ＤＮａｓｅ処理の工程が、ＩＶＴの工程の後、及び／又はキャッピングの工程の後に生じる、請求項６７に記載のプロセス。
69. １つ以上の限外濾過／透析濾過の工程を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。
70. 前記ＵＦ／ＤＦの工程が、プラスミド消化の工程、インビトロ転写の工程、キャップ反応の工程、又は親和性クロマトグラフィーの工程（例えば、ｄＴ又はＪ２）の後である、請求項６９に記載のプロセス。
71. 最終滅菌濾過の工程を更に含む、先行請求項のいずれか一項に記載のプロセス。
72. 前記最終滅菌濾過の工程が、０．２２μｍフィルタを通した濾過を含む、請求項７１に記載のプロセス。
73. 前記ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼ又はエクソヌクレアーゼである、請求項３及び６～７２のいずれか一項に記載のプロセス。
74. 前記ヌクレアーゼが、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬ、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、請求項３及び６～７３のいずれか一項に記載のプロセス。
75. 前記ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９又はそのバリアントである、請求項７４に記載のプロセス。
76. 前記精製されたＲＮＡを投与された対象におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ酵素（ＡＳＴ）レベルが、ｄｓＲＮＡ及び／又は第２のオリゴｄＴと結合する抗体と接触していない精製されたＲＮＡを投与された対象におけるＡＳＴレベルよりも低い、請求項１～７５のいずれか一項に記載のプロセス。
77. 前記精製されたＲＮＡを投与された対象におけるＩＬ－６レベルが、ｄｓＲＮＡ及び／又は第２のオリゴｄＴと結合する抗体と接触していない精製されたＲＮＡを投与された対象におけるＩＬ－６レベルよりも低い、請求項１～７６のいずれか一項に記載のプロセス。
78. 前記精製されたＲＮＡを投与された対象におけるＭＣＰ－１レベルが、ｄｓＲＮＡ及び／又は第２のオリゴｄＴと結合する抗体と接触していない精製されたＲＮＡを投与された対象におけるＭＣＰ－１レベルよりも低い、請求項１～７７のいずれか一項に記載のプロセス。