JP2024515936A - Ｃａｓ酵素を用いたマルチプレックス編集 - Google Patents

Abstract

本明細書では、Ｃａｓ酵素を使用したマルチプレックス編集、又はＣａｓ酵素を使用したＴ細胞若しくは関連細胞の編集のための方法、組成物、及びシステムが記載される。【選択図】図１

Description

相互参照
本出願は、２０２１年３月１９日に出願された「ＭＵＬＴＩＰＬＥＸ ＥＤＩＴＩＮＧ ＷＩＴＨ ＣＡＳ ＥＮＺＹＭＥＳ」と題する、米国仮特許出願第６３／１６３，５１０号、２０２１年５月１０日に出願された「ＭＵＬＴＩＰＬＥＸ ＥＤＩＴＩＮＧ ＷＩＴＨ ＣＡＳ ＥＮＺＹＭＥＳ」と題する、米国仮特許出願第６３／１８６，５０６号、及び２０２１年９月８日に出願された「ＭＵＬＴＩＰＬＥＸ ＥＤＩＴＩＮＧ ＷＩＴＨ ＣＡＳ ＥＮＺＹＭＥＳ」と題する、米国仮特許出願第６３／２４１，９１６号の利益を主張し、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含有し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年３月１７日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーは、５５９２１－７１９－６０１－ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、７０，６１２バイトのサイズである。

Ｃａｓ酵素は、それらの関連するクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ガイドリボ核酸（ＲＮＡ）と共に、原核生物の免疫システムの広範（細菌の約４５％、古細菌の約８４％）な成分であるようであり、ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡガイド核酸切断による感染性ウイルス及びプラスミドなどの非自己核酸からこうした微生物を保護するのに役立つ。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡエレメントをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エレメントは、構造及び長さが比較的保存され得るが、それらのＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、高度に多様であり、非常に様々な核酸相互作用ドメインを含有する。ＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡエレメントは、早くも１９８７年に観察されているが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体のプログラム可能なエンドヌクレアーゼ切断能力は、比較的最近でしか認識されておらず、多様なＤＮＡ操作及び遺伝子編集用途における組換えＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用につながっている。

一部の態様では、本開示は、細胞内の２つ以上の遺伝子座を編集する方法を提供し、方法は、当該細胞に、（ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）第１の操作されたガイドＲＮＡであって、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び１つ以上の標的遺伝子座の第１のセットにハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、第１の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体、（ｂ）クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）第２の操作されたガイドＲＮＡであって、クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び１つ以上の標的遺伝子座の第２のセットにハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、第２の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を接触させることを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼではない。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１若しくは４のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号７又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の操作されたガイドＲＮＡ又は当該第２の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３、６、又は９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくはそれ以上の効率を有する当該第１の遺伝子座、及び／又は少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくはそれ以上の効率を有する当該第２の遺伝子座のゲノム配列を編集する。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、２００ｐｍｏｌ以下、１００ｐｍｏｌ以下、５０ｐｍｏｌ以下、２５ｐｍｏｌ以下、５ｐｍｏｌ以下、又は１ｐｍｏｌ以下の濃度で導入される。一部の実施形態では、当該細胞内のオフターゲット部位は、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、０．２％未満の頻度で破壊される。一部の実施形態では、当該細胞内のオフターゲット部位は、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、０．０１％未満の頻度で破壊される。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセット、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を含む。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列は、配列番号１０～１５のうちのいずれか１つ、その相補体、又はその逆相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセット、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットは、アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列は、配列番号１７～１９のうちのいずれか１つ、その相補体、又はその逆相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセット、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットは、核内受容体サブファミリー３グループＣメンバー１（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子座を含む。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列は、配列番号１６、２０、２１、若しくは２２のうちのいずれか１つ、その相補体、又はその逆相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、異種の操作されたＴ細胞受容体分子をコードするオープンリーディングフレームを含むドナーＤＮＡ配列、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットの第１の側に位置するＤＮＡ配列を含む第１の相同アーム、及び１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットの第２の側に位置するＤＮＡ配列を含む第２の相同アームを導入することを更に含む。一部の実施形態では、編集は、インデルの挿入、未成熟終止コドン、ミスセンスコドン、フレームシフト変異、アデニン脱アミノ化、シトシン脱アミノ化、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

一部の態様では、本開示は、グルココルチコイド抵抗性の操作されたＴ細胞を作製する方法を提供し、方法は、Ｔ細胞又はその前駆体に、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡと、（ｉｉ）第１の操作されたガイドＲＮＡであって、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成されたＲＮＡ配列、及び当該ＴＣＲ遺伝子座の少なくとも一部にハイブリダイズするように構成された第１のスペーサー配列を含む、第１の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、ＴＣＲ遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体、並びに（ｂ）Ｔ細胞受容体核内受容体サブファミリー３グループＣメンバー１（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）第２の操作されたガイドＲＮＡであって、当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成されたＲＮＡ配列、及び当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座の少なくとも一部にハイブリダイズするように構成された第２のスペーサー配列を含む、第２の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、Ｔ細胞受容体ＮＲ３Ｃ１遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体を導入することを含む。一部の実施形態では、当該ＴＣＲ遺伝子座の当該少なくとも一部は、当該Ｔ細胞遺伝子座内にある。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、（ｂ）異種の操作されたＴ細胞受容体分子をコードするオープンリーディングフレームを含むドナーＤＮＡ配列、当該ＴＣＲ遺伝子座内の、当該標的配列の第１の側に位置するＤＮＡ配列を含む第１の相同アーム、及び当該第２の標的配列の第２の側に位置するＤＮＡ配列を含む第２の相同アームを導入することを更に含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ、又はクラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含み、当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含み、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該異種の操作されたＴ細胞受容体は、ＣＡＲ分子である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部は、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座又はＴ細胞受容体ベータ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子座である。一部の実施形態では、当該相同アームは、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部に近位の当該ＴＣＲ遺伝子座内に、イントロン領域又はエクソン領域を含む。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部は、ＴＲＡＣの第１又は第３のエクソンである。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又はそれ以上の効率で、当該ＴＣＲ遺伝子座及び当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座のゲノム配列を破壊する。一部の実施形態では、当該効率は、当該ＴＣＲ遺伝子座及びＮＲ３Ｃ１遺伝子座から発現されたタンパク質に対するフローサイトメトリーによって決定される。一部の実施形態では、当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座の当該少なくとも一部は、エクソン２又はエクソン３である。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又はそれ以上の効率で、ＣＡＲ分子に対して陽性、かつＮＲ３Ｃ１に対して陰性の細胞を産生する。一部の実施形態では、方法は、（ａ）～（ｃ）を当該Ｔ細胞又はその前駆体に同時に導入することを更に含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、配列番号１、４、若しくは７のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の操作されたガイドＲＮＡ又は当該第２の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３、６、若しくは９のうちのいずれか１つ、その相補体、又はその逆相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、１００ｐｍｏｌ以下、５０ｐｍｏｌ以下、２５ｐｍｏｌ以下、５ｐｍｏｌ以下、又は１ｐｍｏｌ以下の濃度で存在する。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞又はその当該前駆体は、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。一部の実施形態では、当該第２のスペーサー配列は、配列番号１６、２０、２１、若しくは２２のうちのいずれか１つ、その相補体、又はその逆相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１又は当該第２のスペーサー配列は、少なくとも約１９～２４個のヌクレオチド、少なくとも約１９個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２２個のヌクレオチド、又は少なくとも約２４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、当該ドナーＤＮＡ配列は、ウイルスベクター中で送達される。一部の実施形態では、当該ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター又はＡＡＶ－６ベクターである。

一部の態様では、本開示は、（ａ）ＴＣＲ遺伝子座内の配列番号１０～１５のうちのいずれか１つのハイブリダイゼーション領域の１００、７５、５０、２５、又は１０ヌクレオチド内の異種配列を含む、グルココルチコイド抵抗性Ｔ細胞又はその前駆体の集団を提供する。一部の実施形態では、Ｔ細胞又はその前駆体は、（ｂ）インデルを含むＮＲ３Ｃ１遺伝子座を更に含む。一部の実施形態では、当該異種配列は、インデルである。一部の実施形態では、当該異種配列は、異種Ｔ細胞受容体又はＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む。一部の実施形態では、当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座は、配列番号１６、２０、２１、又は２２のうちのいずれか１つのハイブリダイゼーション領域の１００、７５、５０、２５、又は１０ヌクレオチド内のインデルを含む。一部の実施形態では、当該細胞の０．２％未満が、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、オフターゲット遺伝子座にインデルを有する。一部の実施形態では、当該細胞の０．０１％未満が、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、オフターゲット遺伝子座にインデルを有する。一部の実施形態では、当該細胞の集団は、染色体転座を実質的に含まない。

一部の態様では、本開示は、細胞内の２つ以上の遺伝子座を編集する方法を提供し、方法は、当該細胞に、（ａ）第１のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）第１のＣａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）１つ以上の操作されたガイドＲＮＡであって、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び第１の標的配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、１つ以上の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体、（ｂ）第２のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）第２のＣａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）１つ以上の操作されたガイドＲＮＡであって、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び第２の標的配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、１つ以上の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体を接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、（ｃ）第１の導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、当該第１の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む５’相同アーム、及び当該第１の標的配列の３’側に位置するＤＮＡ配列を含む３’相同アームを含む、第１のドナーＤＮＡ配列、並びに（ｄ）第２の導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、当該第２の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む５’相同アーム、及び当該第２の標的配列の３’側に位置するＤＮＡ配列を含む３’相同アームを含む、第２のドナーＤＮＡ配列を導入することを更に含む。一部の実施形態では、当該第１の導入遺伝子及び当該第２の導入遺伝子は、異なっている。一部の実施形態では、当該第１の標的配列又は当該第２の標的配列は、Ｔ細胞受容体遺伝子座、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＮＲ３Ｃ１、若しくはＡＡＶＳ１遺伝子座、又はそれらの任意の組み合わせ内の標的配列である。一部の実施形態では、当該第１又は第２の導入遺伝子は、ＧＲのアルファ、ベータ、アルファ－Ｄ３、若しくはベータ－Ｄ３アイソフォーム、ＣＡＲ分子、短縮型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）配列、上皮成長因子受容体の短縮型（ｔＥＧＦＲ）、ＧＦＰコード配列、又はそれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態では、当該第１の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む当該５’相同アーム、又は当該第２の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む当該５’相同アームは、配列番号４２若しくは２３、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む当該３’相同アーム、又は当該第２の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む当該３’相同アームは、配列番号４３若しくは２４、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１又は当該第２のクラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１若しくは４のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の操作されたガイドＲＮＡ又は当該第２の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３、６、若しくは９のうちのいずれか１つ、その相補体、又はその逆相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の標的配列にハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列、又は当該第２の標的配列にハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列は、配列番号１６、２０、２１、２２、若しくは４１のうちのいずれか１つ、又はその相補体、その相補体、又はその逆相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、当該第１又は当該第２のエンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、若しくはクラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

一部の態様では、本開示は、配列番号６３～６５のうちのいずれか１つの配列、又はそれに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、単離された核酸を提供する。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸配列のうちのいずれか、その相補体、又はその逆相補体を含む単離された核酸を提供する。一部の実施形態では、単離された核酸は、ガイドＲＮＡである。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸のうちのいずれかを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、当該細胞は、Ｔ細胞又はその前駆体である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞又はその前駆体は、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。

一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される核酸のうちのいずれかを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、当該ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、当該ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－６血清型ベクターである。

一部の態様では、本開示は、配列番号２３、２４、４２、又は４３のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含む、ベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号２３、２４、４２、又は４３のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する当該配列が隣接した導入遺伝子を更に含む。一部の実施形態では、当該導入遺伝子は、ＧＲのアルファ、ベータ、アルファ－Ｄ３、若しくはベータ－Ｄ３アイソフォーム、ＣＡＲ分子、短縮型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）配列、上皮成長因子受容体の短縮型（ｔＥＧＦＲ）、ＧＦＰコード配列、又はそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号６３のｔＥＧＦＲコード配列、又はそれに対して７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアントを更に含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号６４のｔＬＮＧＦＲコード配列、又はそれに対して７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアントを含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号６３のＭＮＤプロモーター、又はそれに対して７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアントを更に含む。一部の実施形態では、ベクターは、配列番号６４のＭＳＣＶプロモーター、又はそれに対して７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアントを更に含む。

一部の態様では、本開示は、細胞内の２つ以上の遺伝子座を編集する方法を提供し、方法は、当該細胞に、（ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）１つ以上の操作されたガイドＲＮＡであって、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び１つ以上の標的遺伝子座の第１のセットにハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、１つ以上の操作されたガイドＲＮＡと、を含むか、又はそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を接触させるか、又は導入することを含む。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、（ｂ）（ｉ）クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）１つ以上の操作されたガイドＲＮＡであって、クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び１つ以上の標的遺伝子座の第２のセットにハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、１つ以上の操作されたガイドＲＮＡと、を含むクラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を接触させるか、又は導入することを含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼではない。一部の実施形態では、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１若しくは４のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号７又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の操作されたガイドＲＮＡ又は当該第２の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３、６、若しくは９のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくはそれ以上の効率を有する当該第１の遺伝子座、及び／又は少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくはそれ以上の効率を有する当該第２の遺伝子座のゲノム配列を編集する。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、２００ｐｍｏｌ以下、１００ｐｍｏｌ以下、５０ｐｍｏｌ以下、２５ｐｍｏｌ以下、５ｐｍｏｌ以下、又は１ｐｍｏｌ以下の濃度で導入される。一部の実施形態では、当該細胞内のオフターゲット部位は、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、０．２％未満の頻度で破壊される。一部の実施形態では、当該細胞内のオフターゲット部位は、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断によって決定される場合、０．０１％未満の頻度で破壊される。一部の実施形態では、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析は、ＨＴＧＴＳアッセイ（ハイスループット、ゲノムワイドな転座シーケンシング；例えば、Ｃｈｉａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１１ Ｓｅｐ ３０；１４７（１）：１０７－１９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０７．０４９（参照により全ての目的のために本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと）、ＬＡＭ－ＨＴＧＴＳアッセイ（線形増幅媒介ハイスループットゲノムワイドシーケンシング；例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６．１１（５）：８５３－７１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１６．０４３（参照により全ての目的のために本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと）、又はＤｉｇｅｎｏｍｅ－Ｓｅｑアッセイ（インビトロＣａｓ－消化全ゲノムシーケンシング；例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５．１２（３）：２３７－４３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３２８４（参照により全ての目的のために本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセット、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を含む。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列は、配列番号１０～１５のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセット、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットは、核内受容体サブファミリー３グループＣメンバー１（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子座を含む。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列は、配列番号１６、２０、２１、若しくは２２のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、異種の操作されたＴ細胞受容体分子をコードするオープンリーディングフレームを含むドナーＤＮＡ配列、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットの第１の側に位置するＤＮＡ配列を含む第１の相同アーム、及び１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットの第２の側に位置するＤＮＡ配列を含む第２の相同アームを導入することを更に含む。一部の実施形態では、編集は、インデルの挿入、未成熟終止コドン、ミスセンスコドン、フレームシフト変異、アデニン脱アミノ化、シトシン脱アミノ化、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

一部の態様では、本開示は、グルココルチコイド抵抗性の操作されたＴ細胞を作製する方法を提供し、方法は、Ｔ細胞又はその前駆体に、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡと、（ｉｉ）第１の操作されたガイドＲＮＡであって、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成されたＲＮＡ配列、及び当該ＴＣＲ遺伝子座の少なくとも一部にハイブリダイズするように構成された第１のスペーサー配列を含む、第１の操作されたガイドＲＮＡと、を含むか、又はそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、ＴＣＲ遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体、並びに（ｂ）Ｔ細胞受容体核内受容体サブファミリー３グループＣメンバー１（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）第２の操作されたガイドＲＮＡであって、当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成されたＲＮＡ配列、及び当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座の少なくとも一部にハイブリダイズするように構成された第２のスペーサー配列を含む、第２の操作されたガイドＲＮＡと、を含むか、又はそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、Ｔ細胞受容体ＮＲ３Ｃ１遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体を導入することを含む。一部の実施形態では、当該ＴＣＲ遺伝子座の当該少なくとも一部は、当該Ｔ細胞遺伝子座内にある。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、（ｂ）異種の操作されたＴ細胞受容体分子をコードするオープンリーディングフレームを含むドナーＤＮＡ配列、当該ＴＣＲ遺伝子座内の、当該標的配列の第１の側に位置するＤＮＡ配列を含む第１の相同アーム、及び当該第２の標的配列の第２の側に位置するＤＮＡ配列を含む第２の相同アームを導入することを更に含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ、又はクラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含み、当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含み、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該異種の操作されたＴ細胞受容体は、ＣＡＲ分子である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部は、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座又はＴ細胞受容体ベータ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子座である。一部の実施形態では、当該相同アームは、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部に近位の当該ＴＣＲ遺伝子座内に、イントロン領域又はエクソン領域を含む。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部は、ＴＲＡＣの第１又は第３のエクソンである。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又はそれ以上の効率で、当該ＴＣＲ遺伝子座及び当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座のゲノム配列を破壊する。一部の実施形態では、当該効率は、当該ＴＣＲ遺伝子座及びＮＲ３Ｃ１遺伝子座から発現されたタンパク質に対するフローサイトメトリーによって決定される。一部の実施形態では、当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座の当該少なくとも一部は、エクソン２又はエクソン３である。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又はそれ以上の効率で、ＣＡＲ分子に対して陽性、かつＮＲ３Ｃ１に対して陰性の細胞を産生する。一部の実施形態では、方法は、（ａ）～（ｃ）を当該Ｔ細胞又はその前駆体に同時に導入することを含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、配列番号１、４、又は７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の操作されたガイドＲＮＡ又は当該第２の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３、６、若しくは９のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、１００ｐｍｏｌ以下、５０ｐｍｏｌ以下、２５ｐｍｏｌ以下、５ｐｍｏｌ以下、又は１ｐｍｏｌ以下の濃度で存在する。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞又はその当該前駆体は、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。一部の実施形態では、当該第２のスペーサー配列は、配列番号１６、２０、２１、若しくは２２のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１又は当該第２のスペーサー配列は、少なくとも約１９～２４個のヌクレオチド、少なくとも約１９個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２２個のヌクレオチド、又は少なくとも約２４個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、当該ドナーＤＮＡ配列は、ウイルスベクター中で送達される。一部の実施形態では、当該ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター又はＡＡＶ－６ベクターである。

一部の態様では、本開示は、（ａ）ＴＣＲ遺伝子座内の配列番号１０～１５のうちのいずれか１つのハイブリダイゼーション領域の１００、７５、５０、２５、若しくは１０ヌクレオチド内の異種配列、又は配列番号４２のハイブリダイゼーション領域の１００、７５、５０、２５、若しくは１０ヌクレオチド内の異種配列を含む、Ｔ細胞の集団を提供する。一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、（ｂ）インデルを含むＮＲ３Ｃ１遺伝子座を更に含む。一部の実施形態では、当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座中の当該インデルは、当該Ｔ細胞にグルココルチコイド抵抗性を付与する。当該異種配列のハイブリダイゼーション領域の１００、７５、５０、２５、又は１０ヌクレオチド内の異種配列は、インデルである。一部の実施形態では、当該異種配列は、異種Ｔ細胞受容体又はＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む。一部の実施形態では、当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座は、配列番号１６、２０、２１、又は２２のうちのいずれか１つのハイブリダイゼーション領域の１００、７５、５０、２５、又は１０ヌクレオチド内のインデルを含む。一部の実施形態では、０．２％未満が、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、オフターゲット遺伝子座にインデルを有する。一部の実施形態では、０．０１％未満が、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、オフターゲット遺伝子座にインデルを有する。一部の実施形態では、当該細胞の集団は、染色体転座を実質的に含まない。

一部の態様では、本開示は、細胞内の２つ以上の遺伝子座を編集する方法を提供し、方法は、当該細胞に、（ａ）第１のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）第１のＣａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）１つ以上の操作されたガイドＲＮＡであって、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び第１の標的配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、１つ以上の操作されたガイドＲＮＡと、を含むか、又はそれらをコードするポリヌクレオチドを含む、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体、（ｂ）第２のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）第２のＣａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）１つ以上の操作されたガイドＲＮＡであって、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び第２の標的配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、１つ以上の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体を接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、（ｃ）第１の導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、当該第１の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む５’相同アーム、及び当該第１の標的配列の３’側に位置するＤＮＡ配列を含む３’相同アームを含む、第１のドナーＤＮＡ配列、並びに（ｄ）第２の導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、当該第２の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む５’相同アーム、及び当該第２の標的配列の３’側に位置するＤＮＡ配列を含む３’相同アームを含む、第２のドナーＤＮＡ配列を導入することを更に含む。一部の実施形態では、当該第２の導入遺伝子は、異なっている。一部の実施形態では、当該第１の標的配列又は当該第２の標的配列は、Ｔ細胞受容体遺伝子座、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＮＲ３Ｃ１、若しくはＡＡＶＳ１遺伝子座、又はそれらの任意の組み合わせ内の標的配列である。一部の実施形態では、当該第１又は第２の導入遺伝子は、ＧＲのアルファ、ベータ、アルファ－Ｄ３、又はベータ－Ｄ３アイソフォーム、ＣＡＲ分子、又はそれらの任意の組み合わせである。一部の実施形態では、当該第１の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む当該５’相同アーム、又は当該第２の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む当該５’相同アームは、配列番号４２又は２３を含む。一部の実施形態では、当該第１の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む当該３’相同アーム、又は当該第２の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む当該３’相同アームは、配列番号４３又は２４を含む。一部の実施形態では、当該第１又は当該第２のクラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１若しくは４のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の操作されたガイドＲＮＡ又は当該第２の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３、６、若しくは９のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の標的配列にハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列、又は当該第２の標的配列にハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列は、配列番号１６、２０、２１、２２、若しくは４１のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、当該第１又は当該第２のエンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、若しくはクラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

本開示の更なる態様及び利点は、以下の詳細な説明から、当業者に容易に明らかになり、ここで、本開示の例示的な実施形態のみが示され、記載される。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態をすることができ、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、様々な明白な点において改変することができる。したがって、図面及び説明は、本質的に例示とみなされるべきであり、制限としみなされるべきではない。

参照による組み込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により組み込まれるべきことが具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に特記して記載される。本発明の特徴及び利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるだろう。

ＣＡＲ－Ｔドナー配列を送達するＡＡＶベクターと組み合わせて、本明細書に記載されるＣａｓエンドヌクレアーゼを使用して同種ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生するためのスキームを示す。 Ｃａｓ９対照と共に、ＴＲＡＣを標的化するガイドＲＮＡを含有するＭＧ３－６、ＭＧ３－８、及びＭＧ２９－１ ＲＮＰによるＴＲＡＣにおけるインデル形成を試験する、実施例１の実験の結果を示す。左のパネルは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって測定されたインデルの形成％を示し、一方で、右のパネルは、フローサイトメトリーによって評価された細胞表現型（ＴＣＲ＋又はＴＣＲ－）を示す。 ＣＡＲ－Ｔ配列を含有するＡＡＶドナーベクターと組み合わせてＴＲＡＣを標的化する、本明細書に記載されるＲＮＰヌクレアーゼ複合体を使用した、標的化されたＣＡＲ－Ｔ組み込みを試験する実施例１の実験の結果を示す。ＣＡＲ抗原結合ドメインの発現（ｙ軸）と共に、ＴＣＲ発現状態（ＴＣＲ－又はＴＣＲ＋、ｘ軸）を示すフローサイトメトリープロットが示されている。ＭＧ３－６、ＭＧ３－８、及びＭＧ２９－１の全てについて、同様の結果が得られた。 実施例２に記載されるように、ＭＧ３－６及びＭＧ２９－１ ＲＮＰ複合体の組み合わせを使用した、２つの遺伝子座（１つはＴＲＡＣである）のマルチプレックス編集を示す。 実施例２に記載されるように、ＭＧ３－６及びＭＧ２９－１ ＲＮＰ複合体の組み合わせを使用した、３つの遺伝子座（１つはＴＲＡＣである）のマルチプレックス編集を示す。 実施例３にあるように、各部位を標的化する別々のドナーＤＮＡへの曝露と共に異なるＣａｓ酵素を使用して、ＡＡＶＳ１及びＴＲＡＣ遺伝子座が同時に標的化された実験の結果を示す、ＡＡＶＳ１遺伝子座（Ａ）又はアガロースゲル写真（Ｂ及びＣ）への、ＧＲ導入遺伝子の組み込みを試験するための、実施例３にあるようなＰＣＲ実験の設計を示す。（Ｂ）は、Ｔ細胞が、ＧＲ導入遺伝子担持ＡＡＶ構築物（レーン２～５）、ＧＲ導入遺伝子ＡＡＶ構築物／ＡＡＶＳ１を標的化するＳｐＣａｓ９／ＴＲＡＣを標的化するＭＧ３－６／ＣＡＲ導入遺伝子ＡＡＶ（レーン６～９）、又はＧＲ ＡＡＶ構築物／２５Ｋの感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶＳ１を単独で標的化するＳｐＣａｓ９（レーン１０～１３）に曝露されたいずれかの条件からのＧＲ導入遺伝子の増幅を示す。（Ｃ）は、Ｔ細胞が、アッセイ対照（偽トランスフェクション若しくは導入遺伝子なしのＣａｓ複合体；レーン２～４）、５０ＫのＭＯＩでのＧＲ ＡＡＶ構築物／ＡＡＶＳ１を単独で標的化するＳｐＣａｓ９（レーン５～８）、又は１００ＫのＭＯＩでのＧＲ ＡＡＶ構築物／５０Ｋの多重感染度（ＭＯＩ）でＡＡＶＳ１を単独で標的化するＳｐＣａｓ９（レーン９～１２）に曝露されたいずれかの状態からのＧＲ導入遺伝子の増幅を示す。結果は、追加のＴＲＡＣ遺伝子座が標的化されたかどうかにかかわらず、同様の効率でＡＡＶＳ１遺伝子座内に組み込まれたＧＲ導入遺伝子を示す。 実施例３にあるように、各部位を標的化する別々のドナーＤＮＡへの曝露と共に異なるＣａｓ酵素を使用して、ＡＡＶＳ１及びＴＲＡＣ遺伝子座が同時に標的化された、実施例３にあるような実験の結果を示すフローサイトメトリープロットを示す。各ＧＲ導入遺伝子を担持するＡＡＶが、ＡＡＶＳ１標的化ＳｐＣａｓ９複合体、ＴＲＡＣ標的化ＭＧ３－６複合体、及びＣＡＲ担持ＡＡＶと共にＴ細胞に導入された、個々のプロット（Ａ～Ｄ）が示されている。結果は、ＴＣＲノックアウト及びＣＡＲ組み込みが、全てのＧＲ導入遺伝子で同様に効率的であったこと、及びＡＡＶＳ１遺伝子座の同時標的化にもかかわらず高かかったこと（５１．３１％～６１．１％の効率）を示す。 実施例４にあるように、ＳｐＣａｓ９（「Ｃａｓ９」）と共に、ＭＧ３－６、ＭＧ３－８、及びＭＧ２９－１エンドヌクレアーゼのオフターゲット特異性を評価するために実施された、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析アッセイの結果を示す。 活性な完全ＴＣＲを作製するデルタ鎖、ガンマ鎖、及びイプシロン鎖の集合の図である。 インデルを含有する標的遺伝子座における配列の割合によって評価される場合の、実施例５に記載されるような、一次Ｔ細胞におけるマルチプレックスＴＲＡＣ／ＴＲＢＣ編集を示す。結果は、両方の部位が同時に標的化される場合の、両方の部位での高頻度な破壊を示す。 実施例６に記載される単一遺伝子ノックアウト実験に対するフローサイトメトリーによる、遺伝子編集結果を示す。ＴＣＲ及びＢ２Ｍのノックアウトを評価する４つの表現型（ＴＣＲ－Ｂ２Ｍ－ＤＫＯ、ＴＣＲ－Ｂ２Ｍ＋、ＴＣＲ＋Ｂ２Ｍ－、及びＴＣＲ＋Ｂ２Ｍ＋）の各々を含有する、解析された細胞の割合を示す棒グラフが示されている。このグラフは、（ａ）ＴＣＲ標的化条件の全てが、ＴＣＲノックアウトを効率的にもたらし、ＭＧ３－６ ＴＲＡＣ６及びＭＧ３－６ ＴＲＢＣ Ｅ２ ｓｇＲＮＡが、最も効率的なＴＣＲノックアウトをもたらしたこと、並びに（ｂ）Ｂ２Ｍ標的化条件の全てが、Ｂ２Ｍノックアウトをもたらし、Ｂ２Ｍ Ｈ１及びＢ２Ｍ Ｄ２が、最も効率的なＢ２Ｍノックアウトをもたらしたことを示す。 実施例６のＢ２Ｍ及びＴＲＡＣ条件を使用するが、組み合わせて使用する、実施例７に記載される二重遺伝子ノックアウト実験に対するフローサイトメトリーによる、遺伝子編集結果を示す。ＴＣＲ及びＢ２Ｍのノックアウトを評価する４つの表現型（ＴＣＲ－Ｂ２Ｍ－ＤＫＯ、ＴＣＲ－Ｂ２Ｍ＋、ＴＣＲ＋Ｂ２Ｍ－、及びＴＣＲ＋Ｂ２Ｍ＋）の各々を含有する、解析された細胞の割合を示す棒グラフが示されている。グラフは、最も効率的な二重標的化条件が、ＭＧ２９－１ Ｂ２Ｍ Ｈ１、Ｄ２、又はＡ３条件と共にＭＧ３－６ ＴＲＡＣ６条件を伴う、Ａ４、Ｂ４、及びＣ４であったことを示す。最も効率的な二重標的化条件は、ＭＧ３－６ ＴＲＡＣ６ ｓｇＲＮＡ及びＭＧ２９－１ Ｂ２Ｍ Ｄ２ ｓｇＲＮＡを使用したＢ４であるように見えた。 実施例６からのＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、及びＴＲＢＣ条件を使用するが、組み合わせて使用する、実施例８に記載される三重遺伝子ノックアウト実験に対するフローサイトメトリーによる、遺伝子編集結果を示す。 実施例６からのＢ２Ｍ、ＴＲＡＣ、及びＴＲＢＣ条件を使用するが、組み合わせて使用する、実施例８に記載される三重遺伝子ノックアウト実験に対するＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果を示す。 実施例８に記載される三重遺伝子ノックアウト実験に対する次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって決定された、遺伝子編集結果の解析を示す。 実施例９に記載される実験に対する、Ｔ細胞におけるタンパク質レベルでの遺伝子編集結果を示す。実施例９に記載されるヌクレアーゼ、ガイド、及びＡＡＶの組み合わせを使用して、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって決定される場合の、ＧＦＰ／ｔＥＧＦＲ、ｔＬＮＧＦＲ、二重標的組み込み（ＧＦＰ／ｔＬＮＧＦＲ）、二重標的組み込み（ｔＥＧＦＲ／ｔＬＮＧＦＲ）、又はＴＣＲに対して陽性のＴ細胞の割合（％）を示す棒グラフを示す。 実施例１０に記載される実験についての、ＡＡＶＳ１部位及びＴＲＡＣ遺伝子座に対するＴ細胞におけるＤＮＡレベルでの遺伝子編集結果を示す。実施例１０に記載される条件を使用して、ＡＡＶＳ１遺伝子座で検出された少なくとも１つのインデルを有する次世代シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ）によって検出された配列の割合（インデルの％）の棒グラフを示す。

本発明の様々な実施形態は本明細書に示され、記載されるが、このような実施形態が、例示の目的でのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、及び置換は、本発明から逸脱することなく、当業者にとって生じ得る。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が用いられ得ることは、理解されるべきである。

本明細書に開示されるいくつかの方法の実践は、別段の示唆がない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、及び組換えＤＮＡの技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（２０１０））（参照により本明細書に完全に組み込まれる）を参照のこと。

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形も含むことが意図される。更に、用語「含むこと」、「含む」、「有すること」、「有する」、「有する」、又はそのバリアントが、詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかで使用される限りにおいて、かかる用語は、用語「含むこと」と類似した様式で包含的であることが意図される。

用語「約」又は「およそ」は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣行によると、１つ以上の標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、又は最大１％の範囲を意味し得る。

本明細書で使用される場合、「細胞」は概して生物学的細胞を指す。細胞は、生きている生物の基本的な構造、機能、及び／又は生物学的単位であり得る。細胞は、１つ以上の細胞を有する任意の生物を起源とし得る。いくつかの非限定的な例としては、原核細胞、真核生物の細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単一細胞の真核生物の細胞、原虫細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果実、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ、トウモロコシ、小麦、種子、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、大麻、タバコ、開花している植物、針葉樹、ジムノスパーム、シダ、ヒカゲノカズラ、ツノゴケ、コケ植物、コケ由来の細胞）、藻類の細胞（例えば、ボトリオコッカス・ブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・ラインハートティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガジタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、サルガッスム・パテンスＣ．アガード（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ ｐａｔｅｎｓ Ｃ．Ａｇａｒｄｈ）など）、海藻（例えば、ケルプ）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞）、動物細胞、脊椎動物（例えば、フルーツフライ、クニダリアン、エキノデルム、線虫など）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞、哺乳類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯類、ラット、マウス、非ヒト霊長類、ヒトなど）由来の細胞などが挙げられる。細胞は、天然の生物に由来するものではない場合もある（例えば、細胞は、合成的に作製されてもよく、時には人工細胞と呼ばれることがある）。

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、概して、塩基－糖－リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは、合成ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ））の単量体単位であってもよい。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、又はその誘導体を含み得る。かかる誘導体としては、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰ及び７－デアザ－ｄＡＴＰ、並びにそれらを含有する核酸分子にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を挙げることができる。本明細書で使用される場合、ヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）及びその誘導体を指す場合がある。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の例としては、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、及びｄｄＴＴＰが挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、光学的に検出可能な部分（例えば、フルオロフォア）を含む部分を使用するなど、非標識又は検出可能に標識されてもよい。標識はまた、量子ドットを用いて行われてもよい。検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、及び酵素標識を挙げることができる。ヌクレオチドの蛍光標識は、フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２′７′－ジメトキシ－４′５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、４－（４′ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレット、シアニン及び５－（２′－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含むが、これらに限定されない。蛍光標識されたヌクレオチドの具体的な例としては、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆから入手可能な［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、及び［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌ．から入手可能なフルオロ結合デオキシヌクレオチド、フルオロ結合Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、フルオロ結合Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、フルオロ結合フルオロＸ－ｄＣＴＰ、フルオロ結合Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、及びフルオロ結合Ｃｙ５－ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．から入手可能なフルオレセイン－１５－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチル－ローダミン－６－ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０－９－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、及びフルオレセイン－１５－２′－ｄＡＴＰ；並びにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇから入手可能な染色体標識ヌクレオチド、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、カスケードブルー－７－ＵＴＰ、カスケードブルー－７－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８－５－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、テキサスレッド－５－ＵＴＰ、テキサスレッド－５－ｄＵＴＰ、及びテキサスレッド－１２－ｄＵＴＰを挙げることができる。ヌクレオチドはまた、化学修飾によって標識又は印付けられてもよい。化学修飾された単一ヌクレオチドは、ビオチン－ｄＮＴＰであり得る。ビオチン化ｄＮＴＰのいくつかの非限定的な例としては、ビオチン－ｄＡＴＰ（例えば、ビオ－Ｎ６－ｄｄＡＴＰ、ビオチン－１４－ｄＡＴＰ）、ビオチン－ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＣＴＰ、ビオチン－１４－ｄＣＴＰ）、及びビオチン－ｄＵＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＵＴＰ、ビオチン－１６－ｄＵＴＰ、ビオチン－２０－ｄＵＴＰ）が挙げられる。ヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログを含んでもよい。一部の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドのある特定の化学特性を変化させるが、ヌクレオチドアナログがその意図された機能（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ中の他のヌクレオチドへのハイブリダイゼーション）を行う能力を保持するように、任意の位置で修飾される天然ヌクレオチドの構造を含んでもよい。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例としては、５位、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン、５－プロピンウリジン、５－プロペニルウリジンなど；６位、例えば、６－（２－アミノ）プロピルウリジン；アデノシン及び／又はグアノシンについては８位、例えば、８－ブロモグアノシン、８－クロログアノシン、８－フルオログアノシンなどが挙げられる。ヌクレオチドアナログはまた、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン：Ｏ－及びＮ－修飾（例えば、アルキル化、例えば、Ｎ６－メチルアデノシン、又は別の方法で適切に修飾された）ヌクレオチド、並びにＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，２０００ Ａｕｇ．１０（４）：２９７－３１０に記載されるものなどの他の複素環修飾されたヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログはまた、ヌクレオチドの糖部分に対する修飾を含んでもよい。例えば、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、又はＯＲから選択される基によって置き換えられてもよく、式中、Ｒは、置換又は非置換のＣ１－Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。他の可能な修飾としては、米国特許第５，８５８，９８８号及び同第６，２９１，４３８号に記載されるものが挙げられる。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例としては、５位、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン、５－プロピンウリジン、５－プロペニルウリジンなど；６位、例えば、６－（２－アミノ）プロピルウリジン；アデノシン及び／又はグアノシンについては８位、例えば、８－ブロモグアノシン、８－クロログアノシン、８－フルオログアノシンなどが挙げられる。ヌクレオチドアナログはまた、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン：Ｏ－及びＮ－修飾（例えば、アルキル化、例えば、Ｎ６－メチルアデノシン、又は別の方法で適切に修飾された）ヌクレオチド、並びにＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，２０００ Ａｕｇ．１０（４）：２９７－３１０に記載されるものなどの他の複素環修飾されたヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログはまた、ヌクレオチドの糖部分に対する修飾を含んでもよい。例えば、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、又はＯＲから選択される基によって置き換えられてもよく、式中、Ｒは、置換又は非置換のＣ１－Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。他の可能な修飾としては、米国特許第５，８５８，９８８号及び同第６，２９１，４３８号に記載されるものが挙げられる。

用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」は、概して、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそのアナログのいずれかを、一本鎖、二本鎖、又は多本鎖の形態で、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すように互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、細胞にとって外因性又は内因性であってもよい。ポリヌクレオチドは、無細胞環境に存在してもよい。ポリヌクレオチドは、遺伝子又はその断片であってもよい。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、任意の機能を発揮してもよい。ポリヌクレオチドは、１つ以上のアナログ（例えば、改変された骨格、糖、又は核酸塩基）を含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前又は後に付与されてもよい。アナログのいくつかの非限定的な例としては、５－ブロモウラシル、ペプチド核酸、異種核酸、モルホリノ、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コーディセピン、７－デアザ－ＧＴＰ、フルオロフォア（例えば、糖に結合したローダミン又はフルオレセイン）、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、ＣｐＧアイランド、メチル－７－グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、クエオシン、及びワイオシンが挙げられる。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、結合解析から定義した遺伝子座（遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロ－ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、細胞を含まないＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）及び細胞を含まないＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）を含む細胞を含まないポリヌクレオチド、核酸プローブ、並びにプライマーが挙げられる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、自然界に見られるヌクレオチド及びヌクレオチドアナログ（例えば、合成ヌクレオチドアナログ）の混合物を含んでもよい。

用語「トランスフェクション」又は「トランスフェクトされた」は、概して、非ウイルス又はウイルスベースの方法による細胞内への核酸の導入を指す。核酸分子は、完全なタンパク質又はその機能的部分をコードする遺伝子配列であってもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１８．１－１８．８８（参照により本明細書に完全に組み込まれる）を参照のこと。

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、概して、ペプチド結合によって結合された少なくとも２つのアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、ポリマーの特定の長さを意味しておらず、ペプチドが組換え技術、化学若しくは酵素合成を使用して産生されるか、又は天然に存在するかを暗示又は区別することを意図するものではない。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー並びに少なくとも１つの修飾アミノ酸を含むアミノ酸ポリマーに適用する。場合によっては、ポリマーは、非アミノ酸によって中断されてもよい。用語は、全長タンパク質、及び２次及び／又は３次構造を有するか又は有さないタンパク質（例えば、ドメイン）を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を含む。用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質形成、アセチル化、リン酸化、酸化、及び標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」及び「複数のアミノ酸」という用語は、概して、修飾アミノ酸及びアミノ酸アナログを含むが、これに限定されない天然及び非天然アミノ酸を指す。修飾アミノ酸は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含んでもよく、これは、アミノ酸上に天然に存在しない基又は化学的部分を含むように化学的に修飾されている。アミノ酸アナログは、アミノ酸誘導体を指す場合がある。用語「アミノ酸」は、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の両方を含む。

本明細書で使用される場合、「非天然」は、概して、天然の核酸又はタンパク質に存在しない核酸又はポリペプチド配列を指すことができる。非天然は、親和性タグを指してもよい。非天然は、融合物を指してもよい。非天然は、変異、挿入、及び／又は欠失を含む、天然に存在する核酸又はポリペプチド配列を指してもよい。非天然配列は、非天然配列が融合される核酸配列及び／又はポリペプチド配列によっても呈され得る活性（例えば、酵素活性、メチルトランスフェラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を示し得、かつ／又はコードし得る。非天然核酸又はポリペプチド配列を、遺伝子操作によって天然に生じる核酸及び／又はポリペプチド配列（若しくはそのバリアント）に連結して、キメラ核酸又はポリペプチドをコードするキメラ核酸及び／又はポリペプチド配列を生成してもよい。

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、概して、遺伝子の転写又は発現を制御し、ＲＮＡ転写が開始されるヌクレオチドのヌクレオチド又はヌクレオチドの領域に隣接するか、又は重複して位置し得る調節ＤＮＡ領域を指す。プロモーターは、しばしば転写因子と呼ばれるタンパク質因子に結合する特定のＤＮＡ配列を含有してもよく、これは、ＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡへの結合を促進し、これにより、遺伝子転写をもたらす。「コアプロモーター」とも呼ばれる「基礎プロモーター」は、概して、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写発現を促進するための全ての塩基性要素を含有するプロモーターを指してもよい。真核生物の基礎プロモーターは、必ずしもではないが典型的には、ＴＡＴＡ－ボックス及び／又はＣＡＡＴボックスを含む。

本明細書で使用される場合、用語「発現」は、概して、核酸配列若しくはポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡ若しくは他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、及び／又は転写ｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、「遺伝子産物」と総称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核生物の細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含む。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」、「作動可能な連結」、「作動可能に連結された」、又はその文法的な均等物は、概して、遺伝子エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列などの並列化を指し、ここで、エレメントは、それらが予期される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーター配列及び／又はエンハンサー配列を含み得る、調節エレメントは、調節エレメントが、コード配列の転写を開始するのを助ける場合、コード領域に作動可能に連結される。この機能的関係が維持される限り、制御エレメントとコード領域との間に介在する残基があってもよい。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、概して、ポリヌクレオチドを含むか、又はポリヌクレオチドと会合し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用され得る高分子又は高分子の会合を指す。ベクターの例としては、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、及び他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。ベクターは、概して、標的中の遺伝子の発現を促進するために遺伝子に作動可能に連結された、遺伝子エレメント、例えば、制御エレメントを含む。

本明細書で使用される場合、「発現カセット」及び「核酸カセット」は、又は発現のために作動可能に連結される核酸配列又はエレメントの組み合わせを指すために概して互換的に使用される。場合によっては、発現カセットは、発現のために作動可能に連結されている制御エレメントと遺伝子又は複数の遺伝子との組み合わせを指す。

本明細書で使用される場合、「操作された」対象は、概して、対象がヒトの介入によって修飾されたことを示す。非限定的な実施例によれば、核酸は、その配列を、天然では生じない配列に改変することによって修飾されてもよく、核酸は、ライゲーションされた産物が、オリジナルの核酸に存在しない機能を有するように、天然では関連しない核酸にライゲーションすることによって修飾されてもよく、操作された核酸は、天然では存在しない配列を用いてインビトロで合成されてもよく、タンパク質は、天然では存在しない配列にそのアミノ酸配列を変更することによって修飾されてもよく、操作されたタンパク質は、新しい機能又は特性を獲得してもよい。「操作された」システムは、少なくとも１つの操作された構成要素を含む。

本明細書で使用される場合、「合成」及び「人工」は一般に、天然に存在するヒトタンパク質と低い配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性、２５％未満の配列同一性、１０％未満の配列同一性、５％未満の配列同一性、１％未満の配列同一性）を有するタンパク質又はそのドメインを指すために互換的に使用され得る。例えば、ＶＰＲドメイン及びＶＰ６４ドメインは、合成トランス活性化ドメインである。

本明細書で使用される場合、用語「Ｃａｓ１２ａ」は概して、クラス２、タイプＶ－Ａ Ｃａｓエンドヌクレアーゼであり、（ａ）ＣＲＩＳＰＲアレイからの転写後にヌクレアーゼ自体によって処理される比較的小さいガイドＲＮＡ（約４２～４４ヌクレオチド）を使用し、かつ（ｂ）互い違いの切断部位を残すようにＤＮＡを切断する、Ｃａｓエンドヌクレアーゼのファミリーを指す。この酵素ファミリーの更なる特徴は、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｍｏｈａｎｒａｊｕ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１７；３５：３１－３４、及びＺｅｔｓｃｈｅ Ｂ，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ ＪＳ，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ＯＯ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ２０１５；１６３：７５９－７７１に見られ得、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「ガイド核酸」又はそのバリアントは、概して、別の核酸にハイブリダイズし得る核酸を指すことができる。ガイド核酸は、ＲＮＡであってもよい。ガイド核酸は、ＤＮＡであってもよい。ガイド核酸は、部位特異的に核酸の配列に結合するようにプログラムされてもよい。標的化されるべき核酸、又は標的核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。ガイド核酸は、ヌクレオチドを含んでもよい。標的核酸の一部は、ガイド核酸の一部に対して相補的であってもよい。ガイド核酸に相補的であり、ガイド核酸とハイブリダイズする二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖を、相補鎖と呼ぶことができる。相補鎖に相補的であり、それゆえ、ガイド核酸に相補的ではない二本鎖標的ポリヌクレオチドの鎖は、非相補鎖と呼ばれてもよい。ガイド核酸は、ポリヌクレオチド鎖を含んでもよく、また「単一ガイド核酸」と呼ばれ得る。ガイド核酸は、２つのポリヌクレオチド鎖を含んでもよく、また「ダブルガイド核酸」と呼ばれ得る。そうでない場合、用語「ガイド核酸」は、単一ガイド核酸とダブルガイド核酸の両方を指す、包括的であってもよい。ガイド核酸は、「核酸標的化セグメント」又は「核酸標的化配列」又は「スペーサー配列」と称され得るセグメントを含み得る。核酸標的化セグメントは、「タンパク質結合セグメント」又は「タンパク質結合配列」又は「Ｃａｓタンパク質結合セグメント」と称され得るサブセグメントを含んでもよい。ガイド核酸は、ｓｇＲＮＡを含み得る。ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含み得る。

２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語「配列同一性」又は「パーセント同一性」は、概して、配列比較アルゴリズムを使用して測定された場合、局所比較ウィンドウ又はグローバル比較ウィンドウにわたって最大対応のために比較及び整列されたとき、同一であるか、又は特定のパーセンテージの、同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する、２つ（例えば、ペアワイズアラインメントで）又はそれ以上（例えば、複数の配列アラインメントにおける）の配列を指す。ポリペプチド配列に好適な配列比較アルゴリズムとしては、例えば、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、及び１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、かつ３０残基より長いポリペプチド配列についての条件付き組成スコアマトリックス調整を使用したＢＬＡＳＴＰ；２のワード長（Ｗ）、１００００００の期待値（Ｅ）のパラメーター、及びオープンギャップに対して９及び３０残基より短い配列についての拡張ギャップに対して１でのＰＡＭ３０スコアリング設定ギャップコストを使用したＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能なＢＬＡＳＴにおいてＢＬＡＳＴＰについてのデフォルトのパラメーターが存在する）；２の一致、－１のミスマッチ、及び－１のギャップのＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムパラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷ；デフォルトパラメーターを用いたＭＵＳＣＬＥ；２のリツリー及び１０００の最大反復のパラメーターを用いたＭＡＦＦＴ；デフォルトパラメーターを用いたＮｏｖａｆｏｌｄ；デフォルトパラメーターを用いたＨＭＭＥＲ ｈｍｍａｌｉｇｎが挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「キメラ抗原受容体」、「ＣＡＲ」、又は「ＣＡＲ分子」は概して、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び本明細書に定義される刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む、細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）を含む、組換えポリペプチド構築物を指す。一部の実施形態では、刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体又はＮＫＧ２Ｄのシグナル伝達ドメインに関連したゼータ鎖である。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、以下に定義される少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを更に含む。一部の実施形態では、共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、及び／又はＣＤ２８から選択される。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメイン、及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに１つ以上の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達ドメイン、及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに１つ以上の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達ドメイン、及び刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意のリーダー配列を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインのＮ末端にリーダー配列を更に含み、リーダー配列は、細胞プロセシング及びＣＡＲの細胞膜への局在化の最中、抗原認識ドメイン、例えばｓｃＦｖ）から任意選択的に切断される。

用語「シグナル伝達ドメイン」は概して、細胞内の情報を伝達することによって作用して、第２のメッセンジャーを生成することによって、又はかかるメッセンジャーに応答することによってエフェクターとして機能することによって、定義されたシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節する、タンパク質の機能的部分を指す。

本明細書で使用される場合、用語「抗体」は概して、例えば、非共有結合的に、可逆的に、及び特定の様式で抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質又はポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル、複数鎖又は一本鎖、又はインタクトな免疫グロブリンであってもよく、天然源又は組換え源に由来してもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であってもよい。例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）を含む四量体である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超変動性の領域に更に細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫システムの様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体システムの第１の構成要素（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ抗体、及びキメラ抗体を含むが、これらに限定されない。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のものであってもよい。

用語「抗体断片」は、インタクトな抗体又はその組換えバリアントの少なくとも一部分を指し、抗原結合ドメイン、例えば、抗体断片の認識及び抗原などの標的への特異的結合を付与するのに十分である、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、一本鎖又は「ｓｃＦｖ」抗体断片、線状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬ又はＶＨのいずれか）などの単一ドメイン抗体、ラクダＶＨＨドメイン、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片、及び重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片を含む、融合タンパク質を指し、軽鎖及び重鎖の可変領域は、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結され、単鎖ポリペプチドとして発現することができ、ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。本明細書で使用される場合、指定されない限り、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨ可変領域を、例えば、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、いずれかの順序で有してもよく、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含んでもよいか、又はＶＨ－リンカー－ＶＬを含んでもよい。

抗体又はその抗体断片を含むＣＡＲ組成物の部分は、様々な形態で存在し得、そこで、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、及びヒト化抗体を含む、連続ポリペプチド鎖の一部として発現される（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片を含む。

１つ以上の保存的アミノ酸置換を有する本明細書に記載される酵素のうちのいずれかのバリアントが、本開示に含まれる。こうした保存的置換は、ポリペプチドの三次元構造又は機能を破壊することなく、ポリペプチドのアミノ酸配列においてなされ得る。保存的置換は、アミノ酸を、互いに同様の疎水性、極性、及びＲ鎖長で置換することによって達成することができる。加えて、又は代わりに、異なる種由来の相同なタンパク質のアラインされた配列を比較することによって、保存的置換は、コードされたタンパク質の基本的な機能を変化させることなく、種間で変異したアミノ酸残基（例えば、非保存残基）を見つけることによって特定され得る。このような保存的置換されたバリアントは、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼタンパク質配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントを含んでもよい。一部の実施形態では、このような保存的に置換されたバリアントは、機能的バリアントである。こうした機能的バリアントは、エンドヌクレアーゼの１つ以上の重要な活性部位残基又はガイドＲＮＡ結合残基の活性が破壊されないように、置換を有する配列を包含することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質のうちのいずれかの機能的バリアントは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの特徴である保存された残基又は機能的残基のうちの少なくとも１つの置換を欠く。一部の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質のうちのいずれかの機能的バリアントは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの特徴である保存された残基又は機能的残基の全ての置換を欠く。

また、本開示には、酵素の活性を減少させる又は排除するための１つ以上の触媒残基の置換を有する、本明細書に記載される酵素のうちのいずれかのバリアント（例えば、活性低下バリアント）も含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質としての活性低下バリアントは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＲｕｖＣ触媒残基の破壊的置換を含む。

機能的に類似したアミノ酸をもたらす保存的置換表は、様々な参考文献から入手可能である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照のこと））。以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。

概要
固有の機能性及び構造を有する新しいＣａｓ酵素の発見は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）編集テクノロジーを更に破壊し、速度、特異性、機能性、及び使いやすさを改善する可能性を付与する可能性がある。微生物におけるクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムの予測される保有率及び微生物種の純多様性と比較して、比較的少数の機能的に特徴付けられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が、文献に存在する。これは、一部、実験室条件下では、膨大な数の微生物種が容易には培養されないためである。多数の微生物種を含有する天然の環境ニッチからのメタゲノムシークエンシングは、文書化された新しいＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの数を劇的に増加させ、新しいオリゴヌクレオチド編集機能の発見を早める可能性を付与する可能性がある。このようなアプローチの実りのある最近の例は、天然微生物群集のメタゲノム解析からのＣａｓＸ／ＣａｓＹ ＣＲＩＳＰＲシステムの２０１６年の発見によって示される。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、微生物における適応免疫システムとして機能すると記載されているＲＮＡ指向ヌクレアーゼ複合体である。それらの自然な状況では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）オペロン又は遺伝子座において生じ、これは概して、２つの部分：（ｉ）ＲＮＡベースの標的化エレメントをコードする、同等に短いスペーサー配列によって分けられた短い反復配列（３０～４０ｂｐ）のアレイ；及び（ｉｉ）アクセサリータンパク質／酵素と並んだＲＮＡベースの標的化エレメントによって指示されるヌクレアーゼポリペプチドをコードするＣａｓをコードするＯＲＦを含む。特定の標的核酸配列の効率的なヌクレアーゼ標的化は、概して、（ｉ）標的（標的シード）の最初の６～８個の核酸とｃｒＲＮＡガイドとの間の相補的なハイブリダイゼーション；及び（ｉｉ）標的シードの画定された近傍内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の存在の両方を必要とする（ＰＡＭは、通常、宿主ゲノム内に一般的に表されない配列である）。システムの正確な機能及び構成に応じて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、共有された機能的特徴及び進化的類似性に基づき、２つのクラス、５つのタイプ、及び１６のサブタイプに一般的に構成されている（図１を参照されたい）。

クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、大型の複数サブユニットエフェクター複合体を有し、タイプＩ、ＩＩＩ、及びＩＶを含む。クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、概して、単一ポリペプチド複数ドメインヌクレアーゼエフェクターを有し、タイプＩＩ、Ｖ及びＶＩを含む。

タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、構成要素の点で最も単純なものとみなされる。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、ＣＲＩＳＰＲアレイを成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングすることは、特別なエンドヌクレアーゼサブユニットの存在を必要としないが、むしろ、アレイリピート配列に相補的な領域を有する小さなトランスコードｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）であり、ｔｒａｃｒＲＮＡは、その対応するエフェクターヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）及びリピート配列の両方と相互作用して、前駆ｄｓＲＮＡ構造を形成し、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの両方を負荷した成熟エフェクター酵素を生成するために、内因性ＲＮＡｓｅ ＩＩＩによって切断される。Ｃａｓ ＩＩヌクレアーゼは、ＤＮＡヌクレアーゼとして特定される。タイプ２エフェクターは、概して、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのフォールドに挿入された無関係なＨＮＨヌクレアーゼドメインを有するＲＮａｓｅ Ｈフォールドに適合するＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含む構造を呈する。ＲｕｖＣ様ドメインは、標的（例えば、ｃｒＲＮＡ相補的）ＤＮＡ鎖の切断に関与し、一方、ＨＮＨドメインは、置換ＤＮＡ鎖の切断に関与する。

タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＲｕｖＣ様ドメインを含む、タイプＩＩエフェクターの構造と類似したヌクレアーゼエフェクター（例えば、Ｃａｓ１２）構造によって特徴付けられる。タイプＩＩと同様に、ほとんどの（全てではない）タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｔｒａｃｒＲＮＡを使用して、プレｃｒＲＮＡを成熟ｃｒＲＮＡに処理するが、プレｃｒＲＮＡを複数のｃｒＲＮＡに切断するためのＲＮＡｓｅ ＩＩＩを必要とするタイプＩＩシステムとは異なり、タイプＶシステムは、エフェクターヌクレアーゼ自体を使用してプレｃｒＲＮＡを切断することができる。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと同様に、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの場合もやはり、ＤＮＡヌクレアーゼとして特定される。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムとは異なり、一部のタイプＶ酵素（例えば、Ｃａｓ１２ａ）は、二本鎖標的配列の第１のｃｒＲＮＡ指向切断によって活性化される、強固な一本鎖非特異的デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するようである。

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、近年、その標的性及び使いやすさから、遺伝子編集技術として浮上している。最も一般的に使用されるシステムは、クラス２タイプＩＩ ＳｐＣａｓ９及びクラス２タイプＶ－Ａ Ｃａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１）である。具体的に、タイプＶ－Ａシステムは、細胞におけるその報告された特異性が、他のヌクレアーゼよりも高く、オフターゲット効果がより少ないか又は全くないため、より広く使用されるようになってきている。Ｖ－Ａシステムはまた、ガイドＲＮＡが小さく、（ＳｐＣａｓ９についての約１００ｎｔと比較して４２～４４ヌクレオチド）、ＣＲＩＳＰＲアレイからの転写後にヌクレアーゼ自体によって処理され、複数の遺伝子編集を伴う多重化アプリケーションを簡素化するという点で有利である。更に、Ｖ－Ａシステムは、互い違いの切断部位を有し、これは、マイクロホモロジー依存的標的組み込み（ＭＩＴＩ）などの指向型修復経路を容易にし得る。

最も一般的に使用されるタイプＶ－Ａ酵素は、選択された標的部位の隣に５’プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とする：Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６ ＬｂＣａｓ１２ａ及びＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＡｓＣａｓ１２ａに対して５’－ＴＴＴＶ－３’；及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ ＦｎＣａｓ１２ａに対して５’－ＴＴＶ－３’。オルソログの最近の調査は、例えばＹＴＶ、ＹＹＮ、又はＴＴＮなどの哺乳動物細胞培養においても活性である、制限のより少ないＰＡＭ配列を有するタンパク質を明らかにした。しかしながら、これらの酵素は、Ｖ－Ａの生物多様性及び標的性を完全に包含するものではなく、全ての可能な活性及びＰＡＭ配列要件を表すものではない可能性がある。ここで、タイプＶ－Ａヌクレアーゼについて、多数のメタゲノムから数千のゲノム断片を引き出した。文書化されたＶ－Ａ酵素の多様性は拡大されている可能性があり、新規システムは、高度に標的化可能で、コンパクト、かつ正確な遺伝子編集剤へと開発されている可能性がある。

例示的な実施形態
一部の態様では、本開示は、細胞内の２つ以上の遺伝子座を編集する方法を提供し、方法は、当該細胞に、（ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）１つ以上の操作されたガイドＲＮＡであって、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び１つ以上の標的遺伝子座の第１のセットにハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、１つ以上の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を接触させるか、又は導入することを含む。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、（ｂ）（ｉ）クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）１つ以上の操作されたガイドＲＮＡであって、クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び１つ以上の標的遺伝子座の第２のセットにハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、１つ以上の操作されたガイドＲＮＡと、を含むクラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を接触させるか、又は導入することを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）粒子の形態で接触する（例えば、脂質ベース又はエレクトロポレーション／ヌクレオフェクションベースのトランスフェクションの場合）。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、当該エンドヌクレアーゼ又は関連ガイドＲＮＡをコードする配列の形態で導入される（例えば、ベクター、又はインビトロ転写されたｍＲＮＡの場合）。一部の実施形態では、編集は、インデルの挿入、未成熟終止コドン、ミスセンスコドン、フレームシフト変異、アデニン脱アミノ化、シトシン脱アミノ化、又はそれらの任意の組み合わせを含む。

Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、特定のＣａｓエンドヌクレアーゼであり得るか、特定のパラメーターの下で導入され得るか、又は特定の目標測定基準を達成する様式で導入され得る。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼではない。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼである。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号１若しくは４のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、配列番号７又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の操作されたガイドＲＮＡ又は当該第２の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３、６、又は９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくはそれ以上の効率を有する当該第１の遺伝子座、及び／又は少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくはそれ以上の効率を有する当該第２の遺伝子座のゲノム配列を編集する。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、２００ｐｍｏｌ以下、１００ｐｍｏｌ以下、５０ｐｍｏｌ以下、２５ｐｍｏｌ以下、５ｐｍｏｌ以下、又は１ｐｍｏｌ以下の濃度で導入される。一部の実施形態では、オフターゲット部位は、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、０．２％未満の頻度で破壊される。一部の実施形態では、オフターゲット部位は、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、０．０１％未満の頻度で破壊される。一部の実施形態では、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析は、ＨＴＧＴＳアッセイ（ハイスループット、ゲノムワイドな転座シーケンシング；例えば、Ｃｈｉａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１１ Ｓｅｐ ３０；１４７（１）：１０７－１９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０７．０４９（参照により全ての目的のために本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと）、ＬＡＭ－ＨＴＧＴＳアッセイ（線形増幅媒介ハイスループットゲノムワイドシーケンシング；例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６．１１（５）：８５３－７１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１６．０４３（参照により全ての目的のために本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと）、又はＤｉｇｅｎｏｍｅ－Ｓｅｑアッセイ（インビトロＣａｓ－消化全ゲノムシーケンシング；例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５．１２（３）：２３７－４３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３２８４（参照により全ての目的のために本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと）を含む。

標的化遺伝子座は、任意の遺伝子座を含むことができる。標的化された遺伝子座は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座（ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣなどのＴ細胞の保存された複数のサブタイプである、ＴＣＲ遺伝子座の定常領域を含む）、グルココルチコイド受容体遺伝子座（別名、ＧＲ遺伝子座）、他の核ホルモン受容体をコードする遺伝子座（例えば、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、若しくはアンドロゲン受容体遺伝子座）、又は特定のがん遺伝子若しくは腫瘍抑制因子をコードする遺伝子座など、特定の治療的に興味深い遺伝子座であり得る。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセット、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を含む。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列は、配列番号１０～１５のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセット、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットは、核内受容体サブファミリー３グループＣメンバー１（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子座を含む。一部の実施形態では、１つ以上の標的遺伝子座の当該第１のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列、又は１つ以上の標的遺伝子座の当該第２のセットにハイブリダイズするように構成された当該スペーサー配列は、配列番号１６、２０、２１、又は２２のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する。

本明細書で使用される編集方法のうちのいずれかを、ドナー核酸分子と併せて使用して、例えば、Ｃａｓ酵素又はＣａｓ複合体によって標的化される部位のうちの１つでの相同組換えによって、導入遺伝子を導入することができる。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、内在性遺伝子のトランスジェニック型をコードするオープンリーディングフレームを含むドナーＤＮＡ配列、内在性遺伝子の遺伝子座内の、当該標的配列の第１の側に位置するＤＮＡ配列を含む第１の相同アーム、及び当該第２の標的配列の第２の側に位置するＤＮＡ配列を含む第２の相同アームを導入することを更に含む。場合によっては、導入遺伝子は、ＣＡＲ－Ｔ分子であってもよい。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、異種の操作されたＴ細胞受容体分子をコードするオープンリーディングフレームを含むドナーＤＮＡ配列、ＴＣＲ遺伝子座内の、当該標的配列の第１の側に位置するＤＮＡ配列を含む第１の相同アーム、及び当該第２の標的配列の第２の側に位置するＤＮＡ配列を含む第２の相同アームを導入することを更に含む。

一部の態様では、本開示は、グルココルチコイド抵抗性の操作されたＴ細胞を作製する方法を提供し、方法は、Ｔ細胞又はその前駆体に、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、又は当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡと、（ｉｉ）第１の操作されたガイドＲＮＡであって、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成されたＲＮＡ配列、及び当該ＴＣＲ遺伝子座の少なくとも一部にハイブリダイズするように構成された第１のスペーサー配列を含む、第１の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、ＴＣＲ遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体を導入することを含む。一部の実施形態では、方法は、当該Ｔ細胞又はその当該前駆体に、（ｂ）Ｔ細胞受容体核内受容体サブファミリー３グループＣメンバー１（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体であって、（ｉ）第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと、（ｉｉ）第２の操作されたガイドＲＮＡであって、当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成されたＲＮＡ配列、及び当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座の少なくとも一部にハイブリダイズするように構成された第２のスペーサー配列を含む、第２の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、Ｔ細胞受容体ＮＲ３Ｃ１遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体を導入することを更に含む。一部の実施形態では、当該ＴＣＲ遺伝子座の当該少なくとも一部は、当該Ｔ細胞遺伝子座内にある。一部の実施形態では、方法は、当該細胞に、（ｂ）異種の操作されたＴ細胞受容体分子をコードするオープンリーディングフレームを含むドナーＤＮＡ配列、ＴＣＲ遺伝子座内の、当該標的配列の第１の側に位置するＤＮＡ配列を含む第１の相同アーム、及び当該第２の標的配列の第２の側に位置するＤＮＡ配列を含む第２の相同アームを導入することを更に含む。

タイプＩＩ又はタイプＶエンドヌクレアーゼは、特定のＣａｓエンドヌクレアーゼを含み得る。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、クラス２、タイプＩＩ、又はクラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含み、当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含み、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、当該クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、配列番号１、４、又は７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１の操作されたガイドＲＮＡ又は当該第２の操作されたガイドＲＮＡは、配列番号３、６、又は９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は当該第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、１００ｐｍｏｌ以下、５０ｐｍｏｌ以下、２５ｐｍｏｌ以下、５ｐｍｏｌ以下、又は１ｐｍｏｌ以下の濃度で存在する。

本明細書で使用される編集方法のうちのいずれかを、ドナー核酸分子と併せて使用して、例えば、Ｃａｓ酵素又はＣａｓ複合体によって標的化される部位のうちの１つでの相同組換えによって、導入遺伝子を導入することができる。一部の実施形態では、当該異種の操作されたＴ細胞受容体は、ＣＡＲ分子である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部は、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座又はＴ細胞受容体ベータ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子座である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部は、ＴＲＡＶ遺伝子座又はＴＲＡＪ遺伝子座である。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部は、ＴＲＢＶ遺伝子座又はＴＲＢＪ遺伝子座である。一部の実施形態では、当該相同アームは、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部に近位のＴＣＲ遺伝子座内に、イントロン領域又はエクソン領域を含む。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞受容体遺伝子座の当該少なくとも一部は、ＴＲＡＣの第１又は第３のエクソンである。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又はそれ以上の効率で、当該ＴＣＲ遺伝子座及び当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座のゲノム配列を破壊する。一部の実施形態では、当該効率は、当該ＴＣＲ遺伝子座又はＮＲ３Ｃ１遺伝子座から発現されたタンパク質に対するフローサイトメトリーによって決定される。一部の実施形態では、当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座の当該少なくとも一部は、エクソン２又はエクソン３である。一部の実施形態では、当該方法は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又はそれ以上の効率で、ＣＡＲ分子に対して陽性、かつＮＲ３Ｃ１に対して陰性の細胞を産生する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）～（ｃ）を当該Ｔ細胞又はその前駆体に同時に導入することを含む。一部の実施形態では、当該Ｔ細胞又はその当該前駆体は、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。一部の実施形態では、当該第２のスペーサー配列は、配列番号１６、２０、２１、又は２２のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、当該第１又は当該第２のスペーサー配列は、少なくとも約１９～２４個のヌクレオチド、少なくとも約１９個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２２個のヌクレオチド、又は少なくとも約２４個のヌクレオチドを含む。

本明細書に記載される方法と併せて使用されるドナー配列は、その方法において様々な形態で提供され得る。一部の実施形態では、ドナー配列は、核酸分子（例えば、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ、又はＲＮＡ）の形態で提供される。一部の実施形態では、ドナー配列は、ベクター（例えば、プラスミド、ＹＡＣｍｉｄ、ＢＡＣｍｉｄ、ファージミド、又はウイルスベクター）中で提供される。ウイルスベクターの場合、ウイルスベクターは、特定の血清型を有するＡＡＶウイルスを含むことができる。一部の実施形態では、当該ドナーＤＮＡ配列は、ウイルスベクター中で送達される。一部の実施形態では、当該ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター又はＡＡＶ－６ベクターである。

一部の態様では、本開示は、（ａ）ＴＣＲ遺伝子座内の配列番号１０～１５のうちのいずれか１つのハイブリダイゼーション領域の１００、７５、５０、２５、又は１０ヌクレオチド内の異種配列を含む、グルココルチコイド抵抗性ＣＡＲ－Ｔ細胞の集団を提供する。一部の実施形態では、集団は、（ｂ）インデルを含むＮＲ３Ｃ１遺伝子座を更に含む。一部の実施形態では、当該異種配列は、インデルである。一部の実施形態では、当該異種配列は、異種Ｔ細胞受容体又はＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む。一部の実施形態では、当該ＮＲ３Ｃ１遺伝子座は、配列番号１６、２０、２１、又は２２のうちのいずれか１つのハイブリダイゼーション領域の１００、７５、５０、２５、又は１０ヌクレオチド内のインデルを含む。一部の実施形態では、当該集団の細胞の０．２％未満が、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、オフターゲット遺伝子座にインデルを有する。一部の実施形態では、当該集団の細胞の０．０１％未満が、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、オフターゲット遺伝子座にインデルを有する。一部の実施形態では、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析は、ＨＴＧＴＳアッセイ（ハイスループット、ゲノムワイドな転座シーケンシング；例えば、Ｃｈｉａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１１ Ｓｅｐ ３０；１４７（１）：１０７－１９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１１．０７．０４９（参照により全ての目的のために本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと）、ＬＡＭ－ＨＴＧＴＳアッセイ（線形増幅媒介ハイスループットゲノムワイドシーケンシング；例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６．１１（５）：８５３－７１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１６．０４３（参照により全ての目的のために本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと）、又はＤｉｇｅｎｏｍｅ－Ｓｅｑアッセイ（インビトロＣａｓ－消化全ゲノムシーケンシング；例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５．１２（３）：２３７－４３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３２８４（参照により全ての目的のために本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと）を含む。一部の実施形態では、当該細胞の集団は、染色体転座を実質的に含まない。

一部の態様では、本開示は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって産生される細胞を提供する。

一部の態様では、本開示は、以下の表１に提供されるタンパク質配列又はヌクレオチド配列を提供する。

場合によっては、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼのうちのいずれかは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有するバリアントを含んでもよい。ＮＬＳは、エンドヌクレアーゼのＮ末端又はＣ末端の近位にあってもよい。ＮＬＳは、配列番号２５～４０のうちのいずれか１つ、又は配列番号２５～４０のうちのいずれか１つに対して少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するバリアントに対してＮ末端又はＣ末端に付加されてもよい。場合によっては、ＮＬＳは、配列番号２５～４０のうちのいずれか１つに対して実質的に同一な配列を含んでもよい。

場合によっては、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼ方法のうちのいずれかは、細胞に、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ修復鋳型を導入することを更に含むことができる。場合によっては、操作されたヌクレアーゼシステムは、一本鎖ＤＮＡ修復鋳型を更に含む。場合によっては、操作されたヌクレアーゼシステムは、二本鎖ＤＮＡ修復鋳型を更に含む。場合によっては、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ修復鋳型は、５’から３’の方向に、当該標的デオキシリボ核酸に対して５’の、少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含む第１の相同アーム、少なくとも１０個のヌクレオチドの合成ＤＮＡ配列、及び当該標的配列に対して３’の、少なくとも２０個のヌクレオチドの配列を含む第２の相同アームを含んでもよい。

場合によっては、第１の相同アームは、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、又は少なくとも１０００個のヌクレオチドの配列を含む。場合によっては、第２の相同アームは、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも７５０、又は少なくとも１０００個のヌクレオチドの配列を含む。

場合によっては、第１及び第２の相同アームは、原核生物のゲノム配列に対して相同である。場合によっては、第１及び第２の相同アームは、細菌のゲノム配列に対して相同である。場合によっては、第１及び第２の相同アームは、真菌のゲノム配列に対して相同である。場合によっては、第１及び第２の相同アームは、真核生物のゲノム配列に対して相同である。

場合によっては、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼ方法のうちのいずれかは、細胞にＤＮＡ修復鋳型を導入することを更に含むことができる。ＤＮＡ修復鋳型は、二本鎖ＤＮＡセグメントを含んでもよい。二本鎖ＤＮＡセグメントには、１つの一本鎖ＤＮＡセグメントが隣接していてもよい。二本鎖ＤＮＡセグメントには、２つの一本鎖ＤＮＡセグメントが隣接していてもよい。場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、二本鎖ＤＮＡセグメントの５’末端にコンジュゲートされる。場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、二本鎖ＤＮＡセグメントの３’末端にコンジュゲートされる。

場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、１～１５ヌクレオチド塩基の長さを有する。場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、４～１０ヌクレオチド塩基の長さを有する。場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、４ヌクレオチド塩基の長さを有する。場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、５ヌクレオチド塩基の長さを有する。場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、６ヌクレオチド塩基の長さを有する。場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、７ヌクレオチド塩基の長さを有する。場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、８ヌクレオチド塩基の長さを有する。場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、９ヌクレオチド塩基の長さを有する。場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、１０ヌクレオチド塩基の長さを有する。

場合によっては、一本鎖ＤＮＡセグメントは、スペーサー配列内の配列に相補的なヌクレオチド配列を有する。場合によっては、二本鎖ＤＮＡ配列は、バーコード、オープンリーディングフレーム、エンハンサー、プロモーター、タンパク質コード配列、ｍｉＲＮＡコード配列、ＲＮＡコード配列、又は導入遺伝子を含む。

場合によっては、本明細書に記載される配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＭＵＳＣＬＥ、若しくはＭＡＦＦＴアルゴリズム、又はＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムパラメーターを用いたＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムによって決定され得る。配列同一性は、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）のパラメーター、及び１１の存在、１の延長でギャップコストを設定しているＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用し、条件付き組成スコアマトリックス調整を使用した、当該ＢＬＡＳＴＰ相同性検索アルゴリズムによって決定され得る。

本開示のシステム又は方法は、例えば、核酸分子に結合する（例えば、配列特異的結合）、核酸編集（例えば、遺伝子編集）などの様々な用途に使用され得る。このようなシステム又は方法は、例えば、対象において疾患を引き起こす可能性のある遺伝的に受け継がれた突然変異に対処する（例えば、除去又は置換する）ため、細胞におけるその機能を確認するために遺伝子を不活性化するため、疾患を引き起こす遺伝子エレメントを検出する診断ツールとして（例えば、逆転写されたウイルスＲＮＡ若しくは疾患を引き起こす突然変異をコードする増幅されたＤＮＡ配列の切断を介して）、特定のヌクレオチド配列（例えば、細菌内の抗生物質耐性をコードする配列）を標的化するためのプローブと組み合わせた不活性化した酵素として、ウイルスゲノムを標的化することによってウイルスを不活性化するか、若しくは宿主細胞に感染できないようにするため、価値ある低分子、高分子、若しくは二次代謝産物を生じるように生物を操作するための遺伝子を加えるか、若しくは代謝経路を修正するため、進化的選択のための遺伝子駆動エレメントを確立するため、バイオセンサーとして外来低分子及びヌクレオチドによる細胞の摂動を検出するため使用され得る。

実施例１－ＴＣＡＲ遺伝子座での編集
本明細書に記載されるヌクレアーゼを使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞（及び異種Ｔ細胞受容体を担持する他のＴ細胞様細胞）を産生するためのワークフローを開発した（図１）。したがって、Ｔ細胞受容体遺伝子座（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子座）を標的化するためのヌクレアーゼ複合体を開発した。スペーサー配列（配列番号１０～１５）を、クラス２タイプＩＩエンドヌクレアーゼＭＧ３－６（配列番号１）、又はＳｐＣａｓ９、又はクラス２、タイプＶのエンドヌクレアーゼＭＧ２９－１（配列番号７）と組み合わせてＴＲＡＣ遺伝子を標的化するために開発し、各酵素の対応するｓｇＲＮＡに導入した（表１を参照のこと）。各ＴＲＡＣ標的化ｓｇＲＮＡを含有するＲＮＰ複合体を集合させ、（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ＃１７９５１）を使用した負の選択によるＰＢＭＣからの精製、及びＣＤ２／３／２８ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｔ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ ＃１３０－０９１－４４１）による活性化の後、４日間培養したヒトＴ細胞にヌクレオフェクトした（プログラムＥＯ－１１５及びＰ３緩衝液を使用して、Ｌｏｎｚａ ４－Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、２００，０００個のＴ細胞）。ＴＲＡＣ遺伝子におけるインデル形成に対する次世代シーケンシング（ＮＧＳ）（図２左）によって、かつ偽トランスフェクトされたＴ細胞と共にＴＣＲ発現に対するフローサイトメトリー（図２右）によって、細胞を解析した。ＮＧＳ及びフローサイトメトリーの両方による解析は、インデル形成又はトランスフェクトされたＴ細胞におけるＴ細胞受容体発現の破壊の誘導について、ＭＧ３－６及びＭＧ２９－１がＳｐＣａｓ９と同等又はより良好であったことを示した。

次に、ＴＲＡＣ遺伝子座へのＣＡＲ－Ｔ分子の標的組み込みを促進するための、上記のＲＮＰ複合体を使用した編集能力を試験した。ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する５’及び３’相同アーム（例えば、配列番号２３～２４）が隣接したＣＡＲ－Ｔ分子を含む、ヌクレオチド配列を含むＡＡＶ－６ベクターを開発した。上記のＭＧ２９－１ ＲＮＰを使用したＴＲＡＣ標的化を実施したが、次いで、トランスフェクション後にＡＡＶ－６ベクターの１００，０００個のベクターゲノム（ｖｇ）をＴ細胞に添加した。細胞を、ＴＣＲ受容体について、及びＣＡＲ抗原結合ドメインの発現について、フローサイトメトリーを使用して解析した（図３）。フローサイトメトリーは、ＡＡＶ－エンドヌクレアーゼの組み合わせで処置されたＴ細胞の約６０％が、ＣＡＲ抗原結合ドメインを発現したことを示した。ＡＡＶ－６／ＣＡＲ－Ｔ組み込み構築物と、ＴＲＡＣを標的化するＭＧ３－６及びＭＧ３－８ ＲＮＰを組み合わせた実験で、同様の結果を得た。

実施例２－ＴＣＲ様細胞におけるマルチプレックス編集
ＴＲＡＣ遺伝子座の修飾（例えば、ＣＡＲ－Ｔ組み込み）と組み合わせて、他の遺伝子を修飾することが有利であり得る。したがって、本明細書に記載されるヌクレアーゼ複合体が、ＴＲＡＣ及び追加の遺伝子座を標的化する能力を決定した。１つのかかる遺伝子座は、ＮＲ３Ｃ１（別名、ＧＲ、又はグルココルチコイド受容体）遺伝子座であり、これは、グルココルチコイド薬剤に対する非応答性をＣＡＲ－Ｔ細胞に付与するように破壊するのに有利であり得る（例えば、グルココルチコイドで同時に治療されているがん患者の場合、又はグルココルチコイド維持を必要とする自己免疫障害を有するがん患者の場合）。３つのＭＧ２９－１適合性標的化配列（標的Ｂ－Ｄ；配列番号２０、２１、２２）を、ＮＲ３Ｃ１遺伝子を標的化するように設計し、ＭＧ２９－１ガイドＲＮＡに組み入れた。これらのガイドＲＮＡを有するＭＧ２９－１を含むＲＮＰ複合体を集合させた。上記のＭＧ２９－１／ＮＲ３Ｃ１ ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体及びＭＧ３－６／ＴＲＡＣ ＲＮＰの様々な組み合わせを用いたヌクレオフェクションによって、Ｔ細胞を処理した（図４）。ヌクレオフェクション後にＮＧＳを使用して細胞を解析して、各遺伝子座におけるインデル形成を評価した。結果は、異なるガイドＲＮＡが、ＮＲ３Ｃ１を標的化する異なる効率を有した一方で（「ＭＧ２９－１ ＧＲ－１３」、「ＭＧ２９－１ ＧＲ－２８」、「ＭＧ２９－１ ＧＲ－２９」を参照のこと）、ＴＲＡＣを標的化するＭＧ３－６複合体及びＮＲ３Ｃ１を標的化するＭＧ２９－１複合体の組み合わせが、両方の遺伝子におけるインデル形成を効率的に誘導することができたことを示した（図４の右端の３つの条件を参照のこと）。

本明細書に記載されるヌクレアーゼ複合体を使用して２つの異なる遺伝子座を標的化する能力を確立した後、３つの遺伝子座（例えば、ＴＲＡＣ、遺伝子座Ｂ－２９／配列番号１６、遺伝子座Ｃ－８７／配列番号１７、遺伝子座Ｃ－７４／配列番号１８、又は遺伝子座Ｃ－８３／配列番号１９から選択される）を標的化する能力を、遺伝子座の各々に対応するＲＮＰを単独で、及び３つを組み合わせて、上記のように、Ｔ細胞にヌクレオフェクトし、ＮＧＳによってインデル形成を評価することによって評価した（図５を参照のこと）。この実験の結果は、異なる遺伝子座を標的化する３つの異なるＲＮＰを組み合わせた条件でさえ、３つ全ての遺伝子座におけるインデルが、かなりの量で産生されたことを示した。

実施例３－多重遺伝子置換を伴うマルチプレックス編集
複数の遺伝子座を編集し、導入遺伝子を少なくとも１つの遺伝子座に組み込む能力を確立した後、２つ以上の遺伝子座を同時に編集し、両方の遺伝子座における遺伝子を同時に組み込む能力を、Ｔ細胞内の２つの異なる遺伝子座を編集し、２つの異なる遺伝子座を標的化する２つの異なるドナーＤＮＡ鋳型を提供することによって試験した。上記のＡＡＶＳ１（セーフハーバー）遺伝子座及びＴＲＡＣ遺伝子座を標的部位として選択した。実施例１及び２にあるように調製された初代Ｔ細胞（２×１０^５）を、（ａ）ＳｐＣａｓ９（１２ｐｍｏｌ）、及びＡＡＶＳ１遺伝子座を標的化する適合性ｓｇＲＮＡ（６０ｐｍｏｌ、配列番号４１はスペーサー配列を示す）、並びに（ｂ）ＭＧ３－６（５２ｐｍｏｌ）、及び適合性ＴＲＡＣ３－６ ６ ｓｇＲＮＡ（６０ｐｍｏｌ、配列番号１０）の組み合わせでヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後、細胞を、２つの異なるＡＡＶ－６ベクター：（ａ）ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的化する５’及び３’相同アーム（配列番号４２及び４３）が隣接した、ＧＲの４つの異なるアイソフォーム（ＧＲ－アルファ、ＧＲ－ベータ、ＧＲ－アルファＤ３、及びＧＲ－ベータＤ３）の各々を含む導入遺伝子を担持するもの、並びに（ｂ）ＴＲＡＣ遺伝子座を標的化する５’及び３’相同アーム（配列番号２３～２４）が隣接した、ＣＡＲを担持するものと、各々５０，０００の多重感染度（ＭＯＩ）でインキュベートした。４日間のインキュベーション後、Ｔ細胞を、（ａ）ＡＡＶＳ１遺伝子座でのＧＲ導入遺伝子の存在に対するＰＣＲ（ＰＣＲの設計及び結果については図６を参照のこと）、又は（ｂ）ＴＲＡＣ遺伝子座でのＣＡＲの組み込みを評価するための、ＣＡＲ抗原結合ドメイン及びＴ細胞受容体に対するフローサイトメトリーによって解析した（図７）。ＰＣＲ及びフローサイトメトリー実験からのデータは、両方の導入遺伝子（ＧＲ及びＣＡＲ）が、性能の大幅な喪失なしに同時に挿入され得ることを示し、二重ＡＡＶＳ１／ＴＣＲ標的化条件下でのＧＲ導入遺伝子に対するＰＣＲ（中央の４つのレーン、図６Ｂ）は、ＡＡＶＳ１標的化単独（最後の４つのレーン、図７Ｂ又は中央の４つのレーン、図７Ｃ）と類似した組み込み結果を示したが、ＴＣＲに対するフローサイトメトリー（図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ）は、ＡＡＶＳ１が同時に標的化された場合でさえ、ＣＡＲの高い組み込み及びＴＣＲの喪失を示した。

実施例４－ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析による特異性解析
ＭＧ３－６、ＭＧ３－８、及びＭＧ２９－１の標的特異性を、ＳｐＣａｓ９（「Ｃａｓ９」）と共にゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析を介して評価した。結果を図８に示す。結果は、ＭＧ３－６、ＭＧ３－８、及びＭＧ２９－１が、Ｃａｓ９よりも低いレベルのオフターゲット編集を有したことを示した。

実施例５－Ｔ細胞におけるマルチプレックス編集
組換えＴＣＲベースのＴ細胞生成物を作製することは、ＴＣＲの新しく、望ましいアルファ鎖及びベータ鎖をＴ細胞のプールに導入することを必要とし、これは、ａ／ｂ鎖が、抗原特異的認識を与えるＴＣＲのサブユニットであるためである。これらの新しいａ／ｂ鎖は、次いで、デルタ／ガンマ／イプシロン鎖と集合して、活性で完全なＴＣＲを作製することができる（図９を参照のこと）。残念なことに、この単純な場合、既存のａ／ｂ鎖は、レシピエント細胞においてまだ発現されている。これは、既存のアルファが新しいベータと対形成することができ、新しいアルファが既存のベータと対形成することができるという望ましくない可能性を持ち込み、例えば、新しく、望ましいＴＣＲ ａ／ｂ鎖は、それらが一緒に対形成すること「ことになっている」ことを知らない。更なる作用なしに、Ｔ細胞はここで、４つの異なるＴＣＲ（ａ／ｂ、ａ’／ｂ、ａ／ｂ’、ａ’／ｂ’）を発現し、１つは、操作された特異性を有する。これは、２つの問題を引き起こす：ｉ）新しく、望ましいＴＣＲの発現を４倍低減する、ｉｉ）２つのハイブリッドａ／ｂ対（ａ’／ｂ及びａ／ｂ’）は、予測不可能な、潜在的に自己反応性の様式で抗原を認識するため、自己免疫のリスクをもたらす。

この実験では、ＣＤ２／３／２８ビーズで増殖した一次Ｔ細胞を、Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーター及び溶液Ｐ３を使用して、１条件当たり２００Ｋ細胞を使用してヌクレオフェクトし、１０４ｐｍｏｌのＭＧ３－６タンパク質及び１２８ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ、又は同量のタイプＶ酵素ＭＧ２９－１、又はＭＧ３－６及びＭＧ２９－１の両方を送達した。使用したＭＧ３－６ガイドは、ＭＧ３－６－ＴＲＡＣ－６（配列番号４４）及びＭＧ３－６－ＴＲＢＣ（配列番号４５）であり、長さは、２２ｎｔである。ゲノムＤＮＡを、これらの細胞から３日後に回収し、ＮＧＳによって解析した（図１０を参照のこと）。インデルを有する標的部位での配列の割合を示す図１０の結果は、両方の部位を標的化するＲＮＰが同時に細胞に導入される場合に、これらの細胞において二重ＴＲＡＣ／ＴＲＢＣノックアウトがあることを実証する。

実施例６－単一遺伝子ノックアウトに対するフローサイトメトリーによる遺伝子編集結果。
初代Ｔ細胞を、製造元の推奨に従って、負の選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用して、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）から精製した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用して、ＲＮＰ（１００ｐｍｏｌのタンパク質／１５０ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ）のＴ細胞（２００，０００）へのヌクレオフェクションを実施した。フローサイトメトリーによる解析のために、ヌクレオフェクションの３日後、１００，０００個のＴ細胞を抗ＣＤ３及び抗Ｂ２Ｍ抗体で４℃において３０分間染色し、Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔフローサイトメーターで解析した（図１１）。ＴＣＲ及びＢ２Ｍのノックアウトを評価する、４つの表現型の各々を含有する解析された細胞の割合を示す図１１は、（ａ）ＴＣＲ標的化条件の全てが、ＴＣＲノックアウトを効率的にもたらし、ＭＧ３－６ ＴＲＡＣ６及びＭＧ３－６ ＴＲＢＣ Ｅ２ ｓｇＲＮＡが、最も効率的なＴＣＲノックアウトをもたらしたこと、並びに（ｂ）Ｂ２Ｍ標的化条件の全てが、Ｂ２Ｍノックアウトをもたらし、Ｂ２Ｍ Ｈ１及びＢ２Ｍ Ｄ２が、最も効率的なＢ２Ｍノックアウトをもたらしたことを示す。

実施例７－二重遺伝子ノックアウトに対するフローサイトメトリーによる遺伝子編集結果。
実施例６において単独でＴＣＲ／Ｂ２Ｍ標的化条件の性能を評価した後、条件の組み合わせを使用した同時二重切断も、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ標的化について試験した（図１２）。初代Ｔ細胞を、製造元の推奨に従って、負の選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから精製した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用して、ＲＮＰ（１００ｐｍｏｌのタンパク質／１５０ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ）のＴ細胞（２００，０００）へのヌクレオフェクションを実施した。フローサイトメトリーによる解析のために、ヌクレオフェクションの３日後、１００，０００個のＴ細胞を抗ＣＤ３及び抗Ｂ２Ｍ抗体で４℃において３０分間染色し、Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔフローサイトメーターで解析した（図１２）。ＴＣＲ及びＢ２Ｍのノックアウトを評価する、４つの表現型の各々を含有する解析された細胞の割合を示す図１２は、最も効率的な二重標的化条件が、ＭＧ２９－１ Ｂ２Ｍ Ｈ１、Ｄ２、又はＡ３条件と共にＭＧ３－６ ＴＲＡＣ６条件を伴う、Ａ４、Ｂ４、及びＣ４であったことを示す。最も効率的な二重標的化条件は、ＭＧ３－６ ＴＲＡＣ６ ｓｇＲＮＡ及びＭＧ２９－１ Ｂ２Ｍ Ｄ２ ｓｇＲＮＡを使用したＢ４であるように見えた。

実施例８－三重遺伝子ノックアウトに対するフローサイトメトリーによる遺伝子編集結果。
実施例６及びにおいて単独で、及び実施例７において二重で、ＴＣＲ／Ｂ２Ｍ標的化条件の性能を評価した後、条件の組み合わせを使用した同時二重切断も、同時のＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、及びＢ２Ｍ標的化について試験した。初代Ｔ細胞を、製造元の推奨に従って、負の選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから精製した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用して、ＲＮＰ（１００ｐｍｏｌのタンパク質／１５０ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ）のＴ細胞（２００，０００）へのヌクレオフェクションを実施した。フローサイトメトリーによる解析のために、ヌクレオフェクションの３日後、１００，０００個のＴ細胞を抗ＣＤ３及び抗Ｂ２Ｍ抗体で４℃において３０分間染色し、Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔフローサイトメーターで解析した（図１３）。フローサイトメトリーの結果は、条件Ｂ２、Ｅ１、及びＦ１が、ノックアウトのための最も効率的な三重標的化条件であったことを示す。

細胞を回収し、トランスフェクションの５日後にゲノムＤＮＡを調製した。ＮＧＳベースのＤＮＡシーケンシングでの使用に適したＰＣＲプライマーを作製し、最適化し、各ガイドＲＮＡの個々の標的配列を増幅するために使用した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑマシン上で配列決定し、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析して、遺伝子編集を測定した（図１４）。ここでのシーケンシング結果は、インデルが必ずしも遺伝子の機能的破壊を反映しない可能性があるため（フローサイトメトリーによって測定されるように）、図１３の結果と矛盾した。

したがって、シーケンシングによって三重ノックアウト細胞の生成を検証するために、追加の解析を実施した（図１５を参照のこと）。三重ノックアウト細胞の生成が成功したことを実証するデータを図１５に示す。「編集」列のデータは、図１４から取得され、「野生型」列のデータは、１００％から編集の割合を引いたものである。二重及び三重ノックアウトの最小（Ｍｉｎ．）頻度を、個々の細胞における編集事象間の最小の重複を仮定して計算する。したがって、ＴＲＢＣとＢ２Ｍとの間の最小の二重ノックアウト頻度は、１００％から、ＴＲＢＣについての野生型の細胞の割合及びＢ２Ｍについての野生型の細胞の割合を引いたものである。したがって、最小の三重ノックアウト頻度は、１００％から、二重ノックアウトを含有しない可能性がある細胞の割合から、ＴＲＡＣについての野生型の細胞の割合を引いたものである。観察された高い編集頻度は、編集事象の全てが別々の細胞において生じた可能性を除外する。したがって、図１５のデータは、三重ノックアウトＴＲＡＣ／ＴＲＢＣ／Ｂ２Ｍ細胞の作製に成功したことを実証する。

実施例９－編集されたＴ細胞におけるＧＦＰマーカー及び表面マーカーの発現
初代ヒトＴ細胞を、製造元の推奨に従って、負の選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから精製した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用して、ＭＧ３－６ ｍＲＮＡ（５００ｎｇ／１５０ｐｍｏｌガイド）、ＭＧ２９－１ ＲＮＰ（１００ｐｍｏｌ／１５０ｐｍｏｌガイド）、及び／又はＳｐＣａｓ９ ＲＮＰ（１２ｐｍｏｌ／６０ｐｍｏｌガイド）のＴ細胞（２００，０００）へのヌクレオフェクションを実施した。ヌクレオフェクション後、ＡＡＶ－６を含有する培地中で細胞を直ちに回収した（５０，０００ ＭＯＩ）。使用したＡＡＶベクターには、（ａ）ＭＧ３－６－ＴＲＡＣ－６（配列番号６４）又はＭＧ２９－１－ＴＲＡＣ－３５（配列番号６５）の切断部位に対応する相同アームが隣接した、ＭＳＣＶプロモーター駆動の短縮型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）コード配列を送達するＡＡＶベクター、及び（ｂ）Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．ＡＡＶＳ１ Ｔ２（配列番号６３）の切断部位に対応する相同アームが隣接した、上皮成長因子受容体の短縮型（ｔＥＧＦＲ）と共に、ＧＦＰをコードするＭＮＤプロモーター駆動の多シストロン性構築物を送達するＡＡＶベクターが含まれる。トランスフェクションの４日後、生存率（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、並びにｔＬＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）（ＶｉｏＢｌｕｅ ＲＥＡｆｉｎｉｔｙ（商標）、クローンＲＥＡ８４４；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｔＥＧＦＲ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ Ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７、クローンＨｕ１；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＴＣＲ ａ／ｂ（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７８５、クローンＩＰ２６；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の発現について、１００，０００個の細胞を染色した。細胞を４℃で３０分間染色し、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターでデータを取得した。ｔＬＮＧＦＲ、ＧＦＰ、ｔＥＧＦＲ、及び／又はＴＣＲ ａ／ｂを発現する細胞を、単一の生細胞上でゲーティングした（図１６）。

実施例１０－編集されたＴ細胞におけるＡＡＶＳ１部位でのインデル解析
初代Ｔ細胞を、製造元の推奨に従って、負の選択キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してＰＢＭＣから精製した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄエレクトロポレーターを使用して、ＭＧ３－６ ｍＲＮＡ（５００ｎｇ／１５０ｐｍｏｌガイド）、ＭＧ２９－１ ＲＮＰ（１００ｐｍｏｌ／１５０ｐｍｏｌガイド）、及び／又はＳｐＣａｓ９ ＲＮＰ（１２ｐｍｏｌ／６０ｐｍｏｌガイド）のＴ細胞（２００，０００）へのヌクレオフェクションを実施した。ヌクレオフェクション後、ＡＡＶ－６を含有する培地中で細胞を直ちに回収した（５０，０００ ＭＯＩ）。使用したＡＡＶベクターには、ＭＧ３－６－ＴＲＡＣ－６又はＭＧ２９－１－ＴＲＡＣ－３５の切断部位に対応する相同アームが隣接した、ＭＳＣＶプロモーター駆動の短縮型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）コード配列、ＧＦＰをコードするＭＮＤプロモーター駆動の多シストロン性構築物、及びＭａｌｉ ｅｔ ａｌ．ＡＡＶＳ１ Ｔ２の切断部位に対応する相同アームが隣接した、上皮成長因子受容体の短縮型（ｔＥＧＦＲ）が含まれる。細胞を回収し、トランスフェクションの４日後にゲノムＤＮＡを調製した。ＮＧＳベースのＤＮＡシーケンシングでの使用に適したＰＣＲプライマーを生成し、最適化し、これらの実験で使用した異なるＡＡＶＳ１部位特異的ＲＮＡガイドの標的部位を含む領域を増幅するために使用した。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑマシン上で配列決定し、独自のＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて解析して、遺伝子編集を測定した（図１７）。結果は、ＴＲＡＣ及びＡＡＶＳ１の最も効率的な二重標的化条件が、ｓｇＲＮＡ Ｆ３を有するＭＧ２９－１及びｓｇＲＮＡ ＴＲＡＣ３－６ ＃６を有するＭＧ３－６を伴う条件であったことを示した。

本発明の好ましい実施形態は本明細書に示され、記載されるが、このような実施形態が、例示の目的でのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書内で提供される特定の実施例によって限定されることは意図されていない。本発明は前述の説明を参照して記載されているが、本明細書の実施形態の記載及び説明は、限定された意味で解釈されることを意図していない。多数の変形、変更、及び置換は、ここで、本発明から逸脱することなく、当業者にとって生じるであろう。更に、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する、本明細書に記載される特定の描写、構成又は相対的割合に限定されないことが理解されよう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明の実施に用いられ得ることは、理解されるべきである。したがって、本発明は、こうした任意の代替、修正、変形、又は均等物も包含することが企図される。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲、及びそれによって包含されるこれらの請求の範囲及びそれらの均等物内のその方法及び構造を定義することが意図される。

Claims (73)

1. 細胞内の２つ以上の遺伝子座を編集する方法であって、前記細胞に、
   （ａ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、
   （ｉ）クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、
   （ｉｉ）第１の操作されたガイドＲＮＡであって、
   前記クラス２、クラスＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び
   １つ以上の標的遺伝子座の第１のセットにハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、第１の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体、
   （ｂ）クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、
   （ｉ）クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼと、
   （ｉｉ）第２の操作されたガイドＲＮＡであって、
   前記クラス２、クラスＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び
   １つ以上の標的遺伝子座の第２のセットにハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、第２の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体を接触させることを含む、方法。
2. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼではない、請求項１に記載の方法。
3. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１２ａエンドヌクレアーゼである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号１若しくは４のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号７又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記第１の操作されたガイドＲＮＡ又は前記第２の操作されたガイドＲＮＡが、配列番号３、６、又は９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記方法が、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくはそれ以上の効率を有する前記第１の遺伝子座、及び／又は少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくはそれ以上の効率を有する前記第２の遺伝子座のゲノム配列を編集する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は前記第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、２００ｐｍｏｌ以下、１００ｐｍｏｌ以下、５０ｐｍｏｌ以下、２５ｐｍｏｌ以下、５ｐｍｏｌ以下、又は１ｐｍｏｌ以下の濃度で導入される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記細胞内のオフターゲット部位が、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、０．２％未満の頻度で破壊される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記細胞内のオフターゲット部位が、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、０．０１％未満の頻度で破壊される、請求項９に記載の方法。
11. １つ以上の標的遺伝子座の前記第１のセット、又は１つ以上の標的遺伝子座の前記第２のセットが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. １つ以上の標的遺伝子座の前記第１のセットにハイブリダイズするように構成された前記スペーサー配列、又は１つ以上の標的遺伝子座の前記第２のセットにハイブリダイズするように構成された前記スペーサー配列が、配列番号１０～１５のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の方法。
13. １つ以上の標的遺伝子座の前記第１のセット、又は１つ以上の標的遺伝子座の前記第２のセットが、アルブミン（ＡＬＢ）遺伝子座を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. １つ以上の標的遺伝子座の前記第１のセットにハイブリダイズするように構成された前記スペーサー配列、又は１つ以上の標的遺伝子座の前記第２のセットにハイブリダイズするように構成された前記スペーサー配列が、配列番号１７～１９のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する、請求項１３に記載の方法。
15. １つ以上の標的遺伝子座の前記第１のセット、又は１つ以上の標的遺伝子座の前記第２のセットが、核内受容体サブファミリー３グループＣメンバー１（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子座を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. １つ以上の標的遺伝子座の前記第１のセットにハイブリダイズするように構成された前記スペーサー配列、又は１つ以上の標的遺伝子座の前記第２のセットにハイブリダイズするように構成された前記スペーサー配列が、配列番号１６、２０、２１、若しくは２２のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記細胞に、異種の操作されたＴ細胞受容体分子をコードするオープンリーディングフレームを含むドナーＤＮＡ配列、１つ以上の標的遺伝子座の前記第１のセットの第１の側に位置するＤＮＡ配列を含む第１の相同アーム、及び１つ以上の標的遺伝子座の前記第１のセットの第２の側に位置するＤＮＡ配列を含む第２の相同アームを導入することを更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 編集が、インデルの挿入、未成熟終止コドン、ミスセンスコドン、フレームシフト変異、アデニン脱アミノ化、シトシン脱アミノ化、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. グルココルチコイド抵抗性の操作されたＴ細胞を作製する方法であって、Ｔ細胞又はその前駆体に、
    （ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体であって、
    （ｉ）第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は前記第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡと、
    （ｉｉ）第１の操作されたガイドＲＮＡであって、
    前記第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成されたＲＮＡ配列、及び
    前記ＴＣＲ遺伝子座の少なくとも一部にハイブリダイズするように構成された第１のスペーサー配列を含む、第１の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、ＴＣＲ遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体、並びに
    （ｂ）Ｔ細胞受容体核内受容体サブファミリー３グループＣメンバー１（ＮＲ３Ｃ１）遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体であって、
    （ｉ）第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと、
    （ｉｉ）第２の操作されたガイドＲＮＡであって、
    前記第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと複合体を形成するように構成されたＲＮＡ配列、及び
    前記ＮＲ３Ｃ１遺伝子座の少なくとも一部にハイブリダイズするように構成された第２のスペーサー配列を含む、第２の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、Ｔ細胞受容体ＮＲ３Ｃ１遺伝子座を標的化するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ複合体を導入することを含む、方法。
20. 前記ＴＣＲ遺伝子座の前記少なくとも一部が、前記Ｔ細胞遺伝子座内にある、請求項１９に記載の方法。
21. 前記細胞に、（ｂ）異種の操作されたＴ細胞受容体分子をコードするオープンリーディングフレームを含むドナーＤＮＡ配列、前記ＴＣＲ遺伝子座内の、前記標的配列の第１の側に位置するＤＮＡ配列を含む第１の相同アーム、及び前記第２の標的配列の第２の側に位置するＤＮＡ配列を含む第２の相同アームを導入することを更に含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
22. 前記第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は前記第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩ、又はクラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含み、前記第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、前記クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、前記クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含み、前記第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、前記クラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記異種の操作されたＴ細胞受容体が、ＣＡＲ分子である、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記Ｔ細胞受容体遺伝子座の前記少なくとも一部が、Ｔ細胞受容体アルファ定常（ＴＲＡＣ）遺伝子座又はＴ細胞受容体ベータ定常（ＴＲＢＣ）遺伝子座である、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記相同アームが、前記Ｔ細胞受容体遺伝子座の前記少なくとも一部に近位の前記ＴＣＲ遺伝子座内に、イントロン領域又はエクソン領域を含む、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記Ｔ細胞受容体遺伝子座の前記少なくとも一部が、ＴＲＡＣの第１又は第３のエクソンである、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記方法が、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又はそれ以上の効率で、前記ＴＣＲ遺伝子座及び前記ＮＲ３Ｃ１遺伝子座のゲノム配列を破壊する、請求項１９～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記効率が、前記ＴＣＲ遺伝子座及びＮＲ３Ｃ１遺伝子座から発現されたタンパク質に対するフローサイトメトリーによって決定される、請求項２８に記載の方法。
31. 前記ＮＲ３Ｃ１遺伝子座の前記少なくとも一部が、エクソン２又はエクソン３である、請求項１９～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記方法が、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又はそれ以上の効率で、前記ＣＡＲ分子に対して陽性、かつＮＲ３Ｃ１に対して陰性の細胞を産生する、請求項１９～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. （ａ）～（ｃ）を前記Ｔ細胞又はその前駆体に同時に導入することを含む、請求項１９～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は前記第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、配列番号１、４、又は７のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記第１の操作されたガイドＲＮＡ又は前記第２の操作されたガイドＲＮＡが、配列番号３、６、又は９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９～３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記第１のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又は前記第２のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、１００ｐｍｏｌ以下、５０ｐｍｏｌ以下、２５ｐｍｏｌ以下、５ｐｍｏｌ以下、又は１ｐｍｏｌ以下の濃度で存在する、請求項１９～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記Ｔ細胞又はその当該前駆体が、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、請求項１９～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記第２のスペーサー配列が、配列番号１６、２０、２１、若しくは２２のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１９～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記第１又は前記第２のスペーサー配列が、少なくとも約１９～２４個のヌクレオチド、少なくとも約１９個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２２個のヌクレオチド、又は少なくとも約２４個のヌクレオチドを含む、請求項１９～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記ドナーＤＮＡ配列が、ウイルスベクター中に送達される、請求項１９～３８のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶベクター又はＡＡＶ－６ベクターである、請求項４０に記載の方法。
42. グルココルチコイド抵抗性Ｔ細胞の集団であって、
    （ａ）ＴＣＲ遺伝子座内の配列番号１０～１５のうちのいずれか１つのハイブリダイゼーション領域の１００、７５、５０、２５、又は１０ヌクレオチド内の異種配列、
    （ｂ）インデルを含むＮＲ３Ｃ１遺伝子座を含む、グルココルチコイド抵抗性Ｔ細胞の集団。
43. 前記異種配列が、インデルである、請求項４２に記載のグルココルチコイド抵抗性Ｔ細胞の集団。
44. 前記異種配列が、異種Ｔ細胞受容体又はＣＡＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含むオープンリーディングフレームを含む、請求項４２又は４３に記載のグルココルチコイド抵抗性Ｔ細胞の集団。
45. 前記ＮＲ３Ｃ１遺伝子座が、配列番号１６、２０、２１、又は２２のうちのいずれか１つのハイブリダイゼーション領域の１００、７５、５０、２５、又は１０ヌクレオチド内にインデルを含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載のグルココルチコイド抵抗性Ｔ細胞の集団。
46. ０．２％未満が、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、オフターゲット遺伝子座にインデルを有する、請求項４２～４５のいずれか一項に記載のグルココルチコイド抵抗性Ｔ細胞の集団。
47. ０．０１％未満が、ゲノムワイドなオフターゲット二本鎖切断解析によって決定される場合、オフターゲット遺伝子座にインデルを有する、請求項４３に記載のグルココルチコイド抵抗性Ｔ細胞の集団。
48. 前記細胞の集団が、染色体転座を実質的に含まない、請求項４２～４７のいずれか一項に記載のグルココルチコイド抵抗性Ｔ細胞の集団。
49. 細胞内の２つ以上の遺伝子座を編集する方法であって、前記細胞に、
    （ａ）第１のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、
    （ｉ）第１のＣａｓエンドヌクレアーゼと、
    （ｉｉ）１つ以上の操作されたガイドＲＮＡであって、
    前記クラス２、クラスＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び
    第１の標的配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、１つ以上の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、第１のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体、
    （ｂ）第２のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体であって、
    （ｉ）第２のＣａｓエンドヌクレアーゼと、
    （ｉｉ）１つ以上の操作されたガイドＲＮＡであって、
    前記クラス２、クラスＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼに結合するように構成されたＲＮＡ配列、及び
    第２の標的配列にハイブリダイズするように構成されたスペーサー配列を含む、１つ以上の操作されたガイドＲＮＡと、を含む、第２のＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体を接触させることを含む、方法。
50. 前記細胞に、
    （ｃ）第１の導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、前記第１の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む５’相同アーム、及び前記第１の標的配列の３’側に位置するＤＮＡ配列を含む３’相同アームを含む、第１のドナーＤＮＡ配列、並びに
    （ｄ）第２の導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム、前記第２の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む５’相同アーム、及び前記第２の標的配列の３’側に位置するＤＮＡ配列を含む３’相同アームを含む、第２のドナーＤＮＡ配列を導入することを更に含む、請求項４９に記載の方法。
51. 前記第１の導入遺伝子及び前記第２の導入遺伝子が、異なっている、請求項５０に記載の方法。
52. 前記第１の標的配列又は前記第２の標的配列が、Ｔ細胞受容体遺伝子座、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＮＲ３Ｃ１、若しくはＡＡＶＳ１遺伝子座、又はそれらの任意の組み合わせ内の標的配列である、請求項５０～５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記第１又は第２の導入遺伝子が、ＧＲのアルファ、ベータ、アルファ－Ｄ３、若しくはベータ－Ｄ３アイソフォーム、ＣＡＲ分子、短縮型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）配列、上皮成長因子受容体の短縮型（ｔＥＧＦＲ）、ＧＦＰコード配列、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記第１の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む前記５’相同アーム、又は前記第２の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む前記５’相同アームが、配列番号４２又は２３を含む、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 前記第１の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む前記３’相同アーム、又は前記第２の標的配列の５’側に位置するＤＮＡ配列を含む前記３’相同アームが、配列番号４３又は２４を含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の方法。
56. 前記第１又は前記第２のクラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼが、配列番号１若しくは４のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４９～５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 前記第１の操作されたガイドＲＮＡ又は前記第２の操作されたガイドＲＮＡが、配列番号３、６、又は９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項４９～５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 前記第１の標的配列にハイブリダイズするように構成された前記スペーサー配列、又は前記第２の標的配列にハイブリダイズするように構成された前記スペーサー配列が、配列番号１６、２０、２１、２２、若しくは４１のうちのいずれか１つ、又はその相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する、請求項４９～５７のいずれか一項に記載の方法。
59. 前記第１又は前記第２のエンドヌクレアーゼが、クラス２、タイプＩＩ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、若しくはクラス２、タイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４９～５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 配列番号６３～６５のうちのいずれか１つの配列、又はそれに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、単離された核酸。
61. 請求項６０に記載の単離された核酸を含む、細胞。
62. 前記細胞が、Ｔ細胞又はその前駆体である、請求項６１に記載の細胞。
63. 前記Ｔ細胞又はその前駆体が、Ｔ細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、請求項６２に記載の細胞。
64. 請求項６０に記載の単離された核酸の配列を含む、ベクター。
65. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項６４に記載のベクター。
66. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ－６血清型ベクターである、請求項６５に記載のベクター。
67. 配列番号２３、２４、４２、又は４３のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含む、ベクター。
68. 配列番号２３、２４、４２、又は４３のうちのいずれか１つに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する前記配列が隣接した導入遺伝子を更に含む、請求項６７に記載のベクター。
69. 前記導入遺伝子が、ＧＲのアルファ、ベータ、アルファ－Ｄ３、若しくはベータ－Ｄ３アイソフォーム、ＣＡＲ分子、短縮型低親和性神経成長因子受容体（ｔＬＮＧＦＲ）配列、上皮成長因子受容体の短縮型（ｔＥＧＦＲ）、ＧＦＰコード配列、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６８に記載のベクター。
70. 配列番号６３のｔＥＧＦＲコード配列、又はそれに対して７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアントを含む、請求項６７又は６８に記載のベクター。
71. 配列番号６４のｔＬＮＧＦＲコード配列、又はそれに対して７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアントを含む、請求項６７又は６８に記載のベクター。
72. 配列番号６３のＭＮＤプロモーター、又はそれに対して７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアントを含む、請求項６７又は６８に記載のベクター。
73. 配列番号６４のＭＳＣＶプロモーター、又はそれに対して７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有するバリアントを含む、請求項６７又は６８に記載のベクター。