KR20230036059A - 표적 핵산을 변형시키는 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20230036059A
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비바스반 비쿤타
알렉산더 마슨
저스틴 에켐
브라이언 샤이
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
더 제이. 데이비드 글래드스톤 인스티튜트, 어 테스터멘터리 트러스트 이스타빌리쉬드 언더 더 윌 오브 제이. 데이비드 글래드스톤
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Abstract

본 개시내용은 세포 (예를 들어, T 세포)에서 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)을 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))로 변형시키는 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

표적 핵산을 변형시키는 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2020년 3월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 62/989,505에 대해 우선권 주장하며, 그 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 및 CRISPR-연관 (Cas) 단백질의 적용은 게놈 편집을 가능하게 함으로써 분자 생물학에 혁신을 일으켰다. CRISPR-매개 유전자 편집은 새로운 과학적 도구를 고안하고, 임상적으로 관련이 있는 돌연변이를 수정하고, 새로운 세포-기반 면역요법을 설계할 가능성이 있는 강하고 실용적인 도구이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물을 특색으로 하며, 여기서 gRNA는 CTGGATATCTGTGGGACAAG (서열식별번호 (SEQ ID NO): 3), ATCTGTGGGACAAGAGGATC (서열식별번호: 4), TCTGTGGGACAAGAGGATCA (서열식별번호: 5), GGGACAAGAGGATCAGGGTT (서열식별번호: 6), TCTTTGCCCCAACCCAGGCT (서열식별번호: 7), CTTTGCCCCAACCCAGGCTG (서열식별번호: 8), TGGAGTCCAGATGCCAGTGA (서열식별번호: 9), actaccgtttactcgatata (서열식별번호: 17), tcgagtaaacggtagtgctg (서열식별번호: 18), tagtgctggggcttagacgc (서열식별번호: 19), ATGGGAGGTTTATGGTATGT (서열식별번호: 20), CTGGGCATTAGCAGAATGGG (서열식별번호: 21), CTAATGCCCAGCCTAAGTTG (서열식별번호: 22), GTACATCTTGGAATCTGGAG (서열식별번호: 23), AACTCTGGCAGAGTAAAGGC (서열식별번호: 24), CTGCCAGAGTTATATTGCTG (서열식별번호: 25), GTGAACGTTCACTGAAATCA (서열식별번호: 26), AGCTATCAATCTTGGCCAAG (서열식별번호: 27), 또는 CAGGCACAAGCTATCAATCT (서열식별번호: 28)의 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 gRNA는 TTTGGCCTACGGCGACGGGA (서열식별번호: 29), CGATAAGCGTCAGAGCGCCG (서열식별번호: 30), GCATGACTagaccatccatg (서열식별번호: 31), GTGATTGCTGTAAACTAGCC (서열식별번호: 32), TAGTTTACAGCAATCACCTG (서열식별번호: 33), ggacccgataaaatacaaca (서열식별번호: 34), catagcaattgctctatacg (서열식별번호: 35), TTCCTAAGTGGATCAACCCA (서열식별번호: 36), GGAATGCTATGAGTGCTGAG (서열식별번호: 37), GAAGCTGCCACAAAAGCTAG (서열식별번호: 38), ACTGAACGAACATCTCAAGA (서열식별번호: 39), 또는 ATTGTTTAGAGCTACCCAGC (서열식별번호: 40)의 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 gRNA는 aaggtctagttctatcaccc (서열식별번호: 41), tatgtataatcctagcactg (서열식별번호: 42), gtacgtgtacgacagtgtgt (서열식별번호: 43), AGCacttgggctaagaacca (서열식별번호: 44), tcagtcctcaacttaatacg (서열식별번호: 45), agaccatcctgctagcatgg (서열식별번호: 46), tctcgacttcgtgatcagcc (서열식별번호: 47), acctgtattcccaacgacac (서열식별번호: 48), tgtattcccaacgacacagg (서열식별번호: 49), GGGTTTCTCTGATTAGAACG (서열식별번호: 50), CATCCCTCACCTGATCAAGA (서열식별번호: 51), 또는 TAAGTCACATAAGCACCCAG (서열식별번호: 52)의 서열을 포함한다.
상기 측면의 일부 실시양태에서, 조성물은 상동성-지정-복구 주형 (HDRT)을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 Cas 단백질 표적 서열이 HDRT에 융합된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 가이드 RNA (gRNA) 및 적어도 1개의 Cas 단백질 표적 서열에 융합되는 HDRT를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 gRNA는 TCAGGGTTCTGGATATCTGT (서열식별번호: 2)의 서열을 포함하고 Cas 단백질 표적 서열은 상보적 폴리뉴클레오티드 서열과 이중 가닥 이중체를 형성한다.
일부 실시양태에서, 2개의 Cas 단백질 표적 서열이 HDRT에 융합된다. 특정 실시양태에서, 제1 Cas 단백질 표적 서열은 HDRT의 5' 말단에 융합되고 제2 Cas 단백질 표적 서열은 HDRT의 3' 말단에 융합된다. 특정 실시양태에서, Cas 단백질 표적 서열은 상보적 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화되어 이중 가닥 이중체를 형성한다.
특정 실시양태에서, HDRT는 단일 가닥 HDRT이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 Cas 단백질 (예를 들어, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, 또는 그의 변이체)을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas9 뉴클레아제이다.
일부 실시양태에서, HDRT는 서열식별번호: 10 또는 11의 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 음이온성 중합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 음이온성 중합체는 폴리글루탐산 (PGA), 폴리아스파르트산, 또는 폴리카르복시글루탐산을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 조성물을 세포 (예를 들어, T 세포)로 도입하는 것을 포함하는, 세포 (예를 들어, T 세포)에서 내인성 세포 표면 단백질을 CAR 또는 외인성 단백질로 변형시키는 방법을 제공하며, 여기서 CAR 또는 외인성 단백질은 내인성 세포 표면 단백질 게놈 유전자좌로 통합된다.
이 측면의 일부 실시양태에서, 내인성 세포 표면 단백질은 내인성 TCR이다. 특정 실시양태에서, 외인성 단백질은 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질이다. 이 측면의 일부 실시양태에서, 외인성 세포 표면 단백질은 외인성 TCR이다. 일부 실시양태에서, 내인성 세포 표면 단백질 게놈 유전자좌는 T 세포 수용체 알파 불변 쇄 (TRAC) 게놈 유전자좌이다. 일부 실시양태에서, 내인성 세포 표면 단백질은 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M)이다. 특정 실시양태에서, 내인성 세포 표면 단백질 게놈 유전자좌는 B2M 게놈 유전자좌이다. 일부 실시양태에서, 내인성 세포 표면 단백질은 내인성 CD4이다. 특정 실시양태에서, 내인성 세포 표면 단백질 게놈 유전자좌는 CD4 게놈 유전자좌이다.
이 측면의 일부 실시양태에서, 도입은 전기천공을 포함한다.
이 측면의 일부 실시양태에서, 도입은 바이러스 전달을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 전달은 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 사용을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 내인성 세포 표면 단백질을 발현하지 않는 세포 (예를 들어, T 세포)를 선택하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 선택은 항체-코팅된 자기 비드를 사용하여 선택하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 하기 단계를 포함하는, 세포의 집단 (예를 들어, T 세포의 집단)으로부터 변형된 세포 (예를 들어, 변형된 T 세포)를 선택하는 방법을 제공하며, 여기서 세포 (예를 들어, T 세포)의 적어도 일부에서 내인성 세포 표면 단백질은 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 외인성 단백질로 대체된다: (1) 세포의 집단 (예를 들어, T 세포의 집단)을 포함하는 용액을 세포 (예를 들어, T 세포)의 내인성 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계; 및 (2) 용액으로부터 항체-결합된 세포 (예를 들어, 항체-결합된 T 세포)를 분리하는 단계 및 (3) 남아 있는 용액을 별개의 용기로 이동시키는 단계이며, 여기서 이동 후, 용액은 내인성 세포 표면 단백질이 CAR 또는 외인성 단백질로 대체된 변형된 세포 (예를 들어, 변형된 T 세포)가 풍부한 것인 단계.
일부 실시양태에서, 내인성 세포 표면 단백질은 내인성 TCR이다.
특정 실시양태에서, 외인성 단백질은 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질이다. 일부 실시양태에서, 외인성 세포 표면 단백질은 외인성 TCR이다.
일부 실시양태에서, 내인성 세포 표면 단백질은 내인성 B2M 또는 내인성 CD4이다.
일부 실시양태에서, 항체는 고체 지지체에 결합된다. 특정 실시양태에서, 고체 지지체는 자기 비드이다.
본 출원은 하기 도면을 포함한다. 도면은 조성물 및 방법의 특정 실시양태 및/또는 특색을 예시하고, 조성물 및 방법의 임의의 설명(들)을 보충하기 위한 것으로 의도된다. 도면은 서면 설명이 그러한 경우인 것을 분명하게 나타내지 않는 한, 조성물 및 방법의 범주를 제한하지 않는다.
도 1a-1c: 내인성 TRAC 유전자좌에서의 CAR 또는 외인성 TCR의 도입을 위한 녹인(Knockin) 전략. 도 1a는 TRAC 유전자좌 플랭킹 엑손 6, gRNA G526 및 gRNA G527 표적 서열의 위치, 및 좌측 및 우측 상동성 아암 (각각 LHA 및 RHA)을 나타낸다. 도 1b 및 1c는 Cas 단백질 표적 서열 (도 1b) 또는 rAAV-매개 전달 (도 1c)을 사용하는 B-세포 성숙 항원 (BCMA)-CAR 녹인을 위한 HDRT 설계도를 나타낸다. P2A = 자기-절단 펩티드, CBS = 선택된 gRNA에 상보적인 Cas9 결합 부위, ITR = 긴 말단 반복부.
도 2a-2c: rAAV-매개 녹인. 도 2a는 스크램블 gRNA 또는 G526 gRNA 또는 G526 gRNA + TRAC-CAR rAAV로 전기천공된 T 세포의 CAR 및 TCR 유세포 분석법을 나타낸다. 도 2b는 높은 녹인 효율이 다수의 공여자로 재현가능하다는 것을 나타낸다. 도 2c는 인트론의 일부를 표적화하는 gRNA G527을 사용하여, CAR + T 세포가 TCR 음성 집단에서 풍부화될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 3a-3c: ssDNA 셔틀-매개 녹인. gRNA G526 및 gRNA G527 ssDNA 셔틀 변이체 둘 다는 최대 녹인 효율을 증가시켰고 (도 3a), 세포 생존율을 증가시켰고 (도 3b), 목적하는 유전자 변화로 회복된 세포의 총 개수를 증가시켰다 (도 3c).
도 4a 및 4b: TCR-음성 선택에 의한 녹인의 풍부화. TCR-음성 선택은 가이드 G527이 사용되지만 가이드 G526은 아닐 때 목적하는 녹인을 갖는 세포를 유의하게 풍부화시킨다.
도 5: 서열식별번호: 2-9의 gRNA를 사용하는 TRAC 유전자좌로의 CRISPR/Cas9-표적화된 통합의 도식적인 표시.
도 6a 및 6b: TRAC 유전자좌로의 CRISPR/Cas9-표적화된 통합의 도식적인 표시. 표적화 구축물은 TRAC 유전자좌에 상동성인 서열 (LHA 및 RHA: 좌측 및 우측 상동성 아암)에 의해 플랭킹된, 스플라이스 수용자 (SA), 이어서 2A 절단 펩티드, 코딩 서열, 1928z CAR 유전자 및 폴리A 서열을 함유한다. 통합되면, 내인성 TCRα 프로모터가 CAR 발현을 구동시키는 반면에, TRAC 유전자좌는 파괴된다. TRAV: TCR 알파 가변 영역. TRAJ: TCR 알파 연결 영역. 2A: 자기-절단 돼지 테스코바이러스 2A 서열. pA: 소 성장 호르몬 폴리A 서열.
도 6c 및 6d: 유전자좌에서 상이한 영역을 표적화하는 gRNA를 사용하는 TRAC 유전자좌로의 CRISPR/Cas9-표적화된 통합의 도식적인 표시.
도 6e: TCR 음성 정제 전 및 그 후에, Cas9 및 TRAC gRNA RNP로 전기천공되고 rAAV로 형질도입된 T 세포의 대표적인 TCR/CAR 유세포 플롯.
도 7a는 TRAC 유전자좌 및 제1 인트론을 표적화하는 gRNA의 도식적인 표시를 나타낸다.
도 7b는 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 세포 표면 TCR 파괴 및 게놈 커팅 효율을 나타낸다.
도 7c는 표시된 gRNA를 사용한 TRAC 유전자좌에서의 GFP 유전자 표적화 효율 및 TCR 파괴를 나타낸다.
도 7d는 B2M 유전자좌 및 제1 및 제2 인트론을 표적화하는 gRNA의 도식적인 표시를 나타낸다.
도 7e는 B2M 유전자좌에서의 B2M 단백질 파괴 및 게놈 커팅 효율을 나타낸다.
도 7f는 B2M 엑손 또는 인트론 RNP 및 연관된 NGFR 공여자 주형으로의 T 세포의 전기천공 후 4일차의 대표적인 유세포 플롯을 나타낸다. 하단 (인트론) 상태는 B2M 음성 세포에서의 NGFR 양성 세포 (KI 양성)의 풍부화를 나타낸다. 따라서, B2M 음성 선택은 KI 양성 세포의 풍부화를 야기한다.
도 7g는 CD4 유전자좌 및 제1 및 제2 인트론을 표적화하는 gRNA의 도식적인 표시를 나타낸다.
도 8a는 인트론 또는 엑손 gRNA를 사용한 TRAC 유전자좌에서의 KI의 도식적인 표시를 나타낸다.
도 8b는 표시된 gRNA 및 공여자 주형으로 조작된 T 세포의 도식적인 유세포 플롯을 나타낸다. 하단 라인은 TCR 음성 선택 후 CAR 양성 세포의 개선된 풍부화를 나타낸다.
도 9a-9c는 상이한 인트론 KI 전략의 도식적인 표시를 나타낸다. SA: 스플라이스 수용자, SD: 스플라이스 공여자, 2A: 절단 펩티드, 적색 막대: 정지 코돈, LHA: 좌측 상동성 아암, RHA: 우측 상동성 아암.
도 10은 말단절단된-신경 성장 인자 수용체 (NGFR) (B2M 인트론 표적화 G576 (서열식별번호: 34)을 사용하여 녹인됨) 및 BCMA-CAR (TRAC 인트론 표적화 G527 (서열식별번호: 3)을 사용하여 녹인됨) 둘 다를 발현하는 세포를 위한 음성-선택 풍부화의 대표적인 유세포 플롯을 나타낸다.
하기 설명은 본 조성물 및 방법의 다양한 측면 및 실시양태를 상술한다. 특정 실시양태는 조성물 및 방법의 범주를 한정하기 위한 것으로 의도되지 않는다. 오히려, 실시양태는 단지 적어도 개시된 조성물 및 방법의 범주 내에 포함되는 다양한 조성물 및 방법의 비-제한적인 예를 제공한다. 본 설명은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 관점에서 판독되어야 하고; 따라서, 통상의 기술자에게 널리 공지된 정보가 반드시 포함되는 것은 아니다.
I. 서론
키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))로의 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, T 세포 수용체 (TCR))의 표적화된 및 고효율 대체를 위한 조성물 및 방법이 본원에 기재된다. CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))의 통합 (녹인)은 동시에 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)의 발현을 제거한다 (녹아웃(knockout)). 따라서, 내인성 세포 표면 단백질-음성 세포에 대한 선택은 각각이 치료적 적용에 바람직한 내인성 세포 표면 단백질-녹아웃 및 CAR 또는 외인성 단백질 녹인 둘 다를 갖는 세포를 풍부화시킬 수 있다. 음성 선택에 의해 변형된 세포를 풍부화시키기 위해, 녹아웃될 내인성 유전자는 세포-표면 단백질을 코딩해야 한다. 녹인될 외인성 유전자는 임의의 외인성 단백질, 예컨대 임의의 세포내 단백질 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, TCR)을 코딩할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 외인성 세포내 단백질을 함유하는 변형된 세포는 양성 선택을 통해 선택될 수 없기 때문에, 음성 선택에 의한 변형된 세포의 풍부화는 이러한 변형된 세포를 풍부화시키는 데 고유한 이점을 제공한다.
목적하는 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))의 발현을 생성하는 것에 더하여, 내인성 세포 표면 단백질의 동시 녹아웃은 잠재적인 오프-타켓 효과를 감소시키고, 이전에 배제된 환자, 예컨대 자가면역 질환을 갖는 자에게 요법을 개방하고, 동종이계 설정에서 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)에 대한 가능성을 감소시킨다. 상이한 인트론 KI 전략의 도식적인 표시가 도 9a-9c에 제시된다. 도 9a는 엑손의 5' 단부에 가까운 인트론 KI 전략의 예를 예시한다. 트랜스진의 서열은 엑손에 병치되고 신규 스플라이스 수용자가 부가된다. 도 9b는 엑손의 3' 단부에 가까운 인트론 KI 전략의 예를 예시한다. 트랜스진의 서열은 엑손에 병치되고 신규 스플라이스 공여자가 부가된다. 도 9c는 인트론의 가운데에서의 인트론 KI 전략의 예를 예시하며, 여기서 스플라이스 수용자 및 스플라이스 공여자는 전사체에 새로운 엑손을 부가한다. 도 9a-9c에 제시된 3개의 예에 대해, 상단 공여자 주형 구축물은 내인성 유전자의 전사 조절을 보존하기 위해 2A 서열에 의해 플랭킹된 트랜스진을 포함한다. 하단 공여자 주형 구축물은 정지 코돈 및 폴리아데닐화 서열로 번역 및 전사를 종결시킨다.
목적하는 유전자 변화는 내인성 세포 표면 단백질 유전자좌 (예를 들어, T 세포 수용체 알파 불변 쇄 (TRAC) 게놈 유전자좌 (도 1a)) 내 선택된 gRNA 서열에서 이중 가닥 또는 단일 가닥 파단을 도입하는 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질) 및 가이드 RNA (gRNA) 리보핵단백질 (RNP)의 도입에 의해 자극된다. 이 파단의 복구는 복구 결과를 지정하는 데 상동성 DNA 주형을 사용하는 상동성-지정-복구 (HDR), 또는 오류-유발(error-prone) 방식으로 파단된 단부를 직접적으로 라이게이션하여 주변 염기의 빈번한 삽입 또는 결실 (indel)을 일으키는 비-상동성-단부-연결 (NHEJ)에 의해 진행할 수 있다. NHEJ-매개 indel의 효과는 gRNA 표적 서열의 위치에 의존한다. 코딩 서열 또는 인근 구조적 요소를 표적화하는 이들 gRNA는 단백질 또는 mRNA 발현을 파괴하기 쉬우며, 이는 표적화된 유전자의 NHEJ-매개 녹아웃을 일으킨다. NHEJ 대 HDR 사건의 균형은 gRNA 표적 서열의 선택 및 HDR 주형 (HDRT)의 이용가능성 둘 다에 의존한다.
본원에 기재된 바와 같이, gRNA 표적 부위에서의 T 세포로의 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))의 통합은 게놈 파단에 플랭킹된 서열에 대해 상동성을 갖고 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR)) 삽입물을 둘러싸는 좌측 및 우측 상동성 아암 (각각 LHA 및 RHA)을 포함하는 HDRT의 공동-전달에 의해 지시된다. 일부 실시양태에서, CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))은 자기-절단 펩티드 (예를 들어, P2A, E2A, T2A, 또는 F2A)에 이어서 내인성 세포 표면 단백질 유전자좌 (예를 들어, TRAC 유전자좌)에서 프레임 내 (in-frame) 통합된다 (도 1b 및 1c). 이는 동시에 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)의 발현을 방해하면서 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR)) 삽입물의 발현을 일으킨다.
녹인 효율은 HDRT의 핵 농도와 직접적으로 상관관계가 있고 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV, 도 2a-2c) 또는 ssDNA/dsDNA 혼성체 Cas9 셔틀 (ssDNA 셔틀, 도 3a-3c)을 사용하여 HDRT를 전달함으로써 증가될 수 있다. 후자는 상기 기재된 바와 같이, Cas 단백질 표적 서열 (예를 들어, "셔틀 서열")을 포함하는 dsDNA 단부를 부가하면서 ssDNA HDRT를 생성하는 것을 수반한다. 이는 공동-전달된 RNP로 하여금 HDRT에 직접적으로 결합하게 하며, 이는 HDRT의 안정성 및 핵 전달을 개선시킨다. 도 3a-3c에 예시된 바와 같이, 이 시스템은 HDRT의 세포 독성을 감소시키면서 녹인 효율을 유의하게 증가시킨다. 상기에 더하여, HDRT는 또한 선형 ssDNA, 선형 dsDNA, 플라스미드 및/또는 미니서클 DNA, 또는 바이러스 DNA (예를 들어, 비-통합 렌티 또는 레트로바이러스 게놈 DNA)를 사용하여 전달될 수 있다.
일부 실시양태에서, 높은 수준의 HDR을 자극하지만, 또한 낮은 수준의 NHEJ-매개 세포 표면 단백질 (예를 들어, TCR) 파괴를 보여주는 gRNA 표적 서열이 선택된다. HDR-매개 녹인이 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)의 발현을 제거하기 때문에, HDR 사건은 내인성 세포 표면 단백질-음성 세포를 선택함으로써 풍부화될 수 있다. 이 풍부화 전략은 내인성 세포 표면 단백질의 HDR-매개 손실 (목적하는 결과) 및 NHEJ-매개 녹아웃을 갖는 세포의 혼합을 일으킬 수 있다. NHEJ-매개 녹아웃의 수준이 더 낮을수록, 이 풀 내에서 HDR:NHEJ 사건의 비율은 더 커지고, 이 전략은 목적하는 녹인을 더 풍부화시킬 것이다. 일부 실시양태에서, 높은 비율의 HDR:NHEJ 사건을 갖는 목적하는 녹인을 풍부화시키기 위해, gRNA 표적 서열의 선택은 무작위 indel이 단백질 코딩-서열 또는 인근 구조적 요소를 파괴하지 않도록 엑손으로부터 충분한 거리를 갖는다. 도 2-4는 2개의 상이한 gRNA 서열, G526 및 G527로부터의 데이터를 보여준다. HDRT의 부재 하에, G526은 거의 모든 단백질 발현을 파괴하는 반면에, 인트론 영역에서 더 상류에 배치된 G527은 보다 낮은 수준의 단백질 파괴를 나타낸다 (도 4a 및 4b). HDRT와 조합되면, 두 gRNA는 거의 동등한 고효율 녹인을 자극할 수 있다. 그러나, 내인성 세포 표면 단백질-음성 (예를 들어, 내인성 TCR-음성) 집단에 대한 선택은 오직 G527을 사용한 녹인 사건만을 유의하게 풍부화시킨다 (도 4a 및 4b).
II. 정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수형을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "CRISPR-Cas" 시스템은 외래 핵산에 대한 방어를 위한 박테리아 시스템의 부류를 지칭한다. CRISPR-Cas 시스템은 광범위한 진정세균 및 고세균 유기체에서 발견된다. CRISPR-Cas 시스템은 유형 I, II 및 III 하위유형을 포함한다. 야생형 유형 II CRISPR-Cas 시스템은 가이드 및 활성화 RNA (예를 들어, 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA)와 복합체화되는 RNA-매개 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 단백질을 외래 핵산, 즉, 천연 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 외래 핵산을 인식하고 절단하는 데 이용한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이중 가닥 이중체"는 서로 상보적이고 수소 결합을 통해 서로 혼성화하여 이중 가닥 영역을 형성하는 폴리뉴클레오티드의 2개의 영역을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상보적 폴리뉴클레오티드의 2개의 영역은 동일한 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내에 있을 수 있다. 다른 실시양태에서, 상보적 폴리뉴클레오티드의 2개의 영역은 폴리뉴클레오티드 분자의 별개의 가닥으로부터의 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Cas 단백질 표적 서열"은 Cas 단백질에 의해 인식되고 결합되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. Cas 단백질은 gRNA를 통해 Cas 단백질 표적 서열을 간접적으로 인식하고 이에 결합한다. Cas 단백질은 Cas 단백질 표적 서열에 혼성화하는 gRNA에 결합한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 표적 서열은 표적 핵산의 일부이다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 표적 서열은 15 내지 40개 (예를 들어, 15 내지 35개, 15 내지 30개, 15 내지 25개, 15 내지 20개, 20 내지 35개, 25 내지 35개, 또는 30 내지 35개)의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 표적 서열은 또한 셔틀 서열로 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 표적 핵산에 혼성화함으로써 Cas 단백질을 표적 핵산으로 가이드할 수 있는 DNA-표적화 RNA를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질을 표적 핵산으로 표적화하는 가이드 서열 (즉, 단일 가이드 RNA의 crRNA 등가 부분) 및 Cas 단백질과 상호작용하는 스캐폴드 서열 (즉, 단일 가이드 RNA의 tracrRNA 등가 부분)을 함유하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 가이드 RNA는 2개의 성분, Cas 단백질을 표적 핵산으로 표적화하는 가이드 서열 (즉, 단일 가이드 RNA의 crRNA 등가 부분) 및 Cas 단백질과 상호작용하는 스캐폴드 서열 (즉, 단일 가이드 RNA의 tracrRNA 등가 부분)을 함유할 수 있다. 가이드 서열의 일부는 스캐폴드 서열의 일부에 혼성화하여 2-성분 가이드 RNA를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혼성화하다" 또는 "혼성화"는 상보적 핵염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오티드 사이에서 발행하는 수소 결합 상호작용을 통한 상보적 핵산의 어닐링을 지칭한다. 수소 결합 상호작용은 왓슨(Watson)-크릭(Crick) 수소 결합 또는 훅스틴(Hoogsteen) 또는 역 훅스틴 수소 결합일 수 있다. 상보적 핵염기 쌍의 예는 모두 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 형성하는 아데닌 및 티민, 시토신 및 구아닌, 및 아데닌 및 우라실을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 핵염기, 뉴클레오시드, 또는 뉴클레오티드 사이의 염기 쌍 형성에 대한 능력, 뿐만 아니라 1개의 폴리뉴클레오티드와 또 다른 폴리뉴클레오티드 사이의 염기 쌍 형성에 대한 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 1개의 폴리뉴클레오티드는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 대해 "완전한 상보성"을 갖거나 또는 "완전히 상보적"일 수 있으며, 이는 2개의 폴리뉴클레오티드가 임의로 정렬될 때, 1개의 폴리뉴클레오티드의 각각의 뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레오티드의 그의 상응하는 뉴클레오티드와의 왓슨-크릭 염기 쌍 형성에 관여할 수 있다는 것을 의미한다. 다른 실시양태에서, 1개의 폴리뉴클레오티드는 또 다른 폴리뉴클레오티드에 대해 "부분적인 상보성"을 갖거나 또는 "부분적으로 상보적"일 수 있으며, 이는 2개의 폴리뉴클레오티드가 임의로 정렬될 때, 1개의 폴리뉴클레오티드의 적어도 60% (예를 들어, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97%) 내지 100% 미만의 뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레오티드의 그의 상응하는 뉴클레오티드와의 왓슨-크릭 염기 쌍 형성에 관여할 수 있다는 것을 의미한다. 다시 말해서, 2개의 폴리뉴클레오티드가 혼성화될 때 적어도 1개 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개)의 미스매치된 뉴클레오티드 염기 쌍이 있다. 왓슨-크릭 염기 쌍 형성에 관여하는 뉴클레오티드의 쌍은, 예를 들어, 모두 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 형성하는 아데닌 및 티민, 시토신 및 구아닌, 및 아데닌 및 우라실을 포함한다. 미스매치된 염기의 예는 구아닌 및 우라실, 구아닌 및 티민, 및 아데닌 및 시토신 쌍 형성을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 어구 표적에 "특이적으로 결합하다"는 작용제 (예를 들어, 항체)가 구조적으로 상이한 분자에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 큰 결합력, 및/또는 큰 지속기간으로 표적에 결합하는 결합 반응을 지칭한다. 전형적인 실시양태에서, 작용제 (예를 들어, 항체)는 동일한 친화도 검정 조건 하에 검정될 때 관련이 없는 분자와 비교하여, 표적에 대해 적어도 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 20-배, 25-배, 50-배, 또는 100-배, 또는 그 이상의 친화도를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Cas 단백질"은 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부-연관 단백질 또는 뉴클레아제를 지칭한다. Cas 단백질은 야생형 Cas 단백질 또는 Cas 단백질 변이체일 수 있다. Cas9 단백질은 유형 II CRISPR-Cas 시스템에 속하는 Cas 단백질의 예이다 (예를 들어, Rath et al., Biochimie 117:119, 2015). Cas 단백질의 다른 예는 본원에 추가로 상세하게 기재된다. 천연 발생 Cas 단백질은 부위-특이적 DNA 인식 및 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA 둘 다를 필요로 한다. crRNA는 부분적인 상보성의 영역을 통해 tracrRNA와 회합하여 Cas 단백질을 표적 DNA에서 crRNA에 상동성인 영역 ("프로토스페이서"로 불림)으로 가이드한다. 천연 발생 Cas 단백질은 DNA를 절단하여 crRNA 전사체 내에 함유된 가이드 서열에 의해 명시된 부위에서의 이중 가닥 파단에서 평활 단부를 생성한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 표적 gRNA 또는 공여자 gRNA와 회합하여 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 형성한다. 본원에 기재된 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 뉴클레아제 활성을 갖는다. 다른 실시양태에서, Cas 단백질은 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Cas 단백질 변이체"는 야생형 Cas 단백질의 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 치환 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상의 아미노산 치환)을 갖고/거나 야생형 Cas 단백질의 말단절단된 버전 또는 단편인 Cas 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 변이체는 야생형 Cas 단백질의 서열에 대해 적어도 75% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성)을 갖는다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 변이체는 야생형 Cas 단백질의 단편이고 야생형 Cas 단백질의 서열에 비해 적어도 1개의 아미노산 치환을 갖는다. Cas 단백질 변이체는 Cas9 단백질 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 변이체는 뉴클레아제 활성을 갖는다. 다른 실시양태에서, Cas 단백질 변이체는 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리보핵단백질 복합체" 또는 "RNP 복합체"는 Cas 단백질 또는 변이체 (예를 들어, Cas9 단백질 또는 변이체) 및 gRNA를 포함하는 복합체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포의 게놈에서 표적 핵산을 변형시키는 맥락에서 용어 "변형"은 표적 핵산에서 변화 (예를 들어, 절단)를 유도하는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변화는 표적 핵산의 서열에서의 구조적 변화일 수 있다. 예를 들어, 변형은 뉴클레오티드 서열을 표적 핵산으로 삽입하는 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 외인성 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산으로 삽입될 수 있다. 표적 핵산은 또한 절제되고 외인성 뉴클레오티드 서열로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, 변형은 뉴클레오티드 서열을 표적 핵산으로 삽입하지 않으면서 표적 핵산을 절단하는 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산은 절단되고 절제될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 표적 핵산 내에 이중 가닥 파단을, 또는 반대 가닥 상에 한 쌍의 단일 가닥 닉을 유도하고 표적 핵산을 플랭킹함으로써 수행될 수 있다. 표적 핵산에서 또는 내에서 단일 또는 이중 가닥 파단을 유도하는 방법은 표적 핵산으로 지시된 본원에 기재된 바와 같은 Cas 단백질의 사용을 포함한다. 다른 실시양태에서, 표적 핵산을 변형시키는 것은 또 다른 단백질을 표적 핵산으로 표적화하는 것을 포함하고 표적 핵산을 절단하는 것을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "외인성 단백질"은 세포에서 발견되지 않는 단백질 또는 일반적으로 표적화된 게놈 위치에서 발견되지 않지만 세포에는 달리 존재하는 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "음이온성 중합체"는 전체 음전하를 갖는 다수의 서브유닛 또는 단량체로 구성된 분자를 지칭한다. 중합체의 각각의 서브유닛 또는 단량체는, 독립적으로, 아미노산, 소형 유기 분자 (예를 들어, 유기 산), 당 분자 (예를 들어, 단당류 또는 이당류), 또는 뉴클레오티드일 수 있다. 음이온성 중합체는 다수의 아미노산, 소형 유기 분자 (예를 들어, 유기 산), 뉴클레오티드 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드, 또는 그의 유사체), 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 음이온성 중합체는 중합체의 모든 서브유닛 또는 단량체가 동일한 음이온성 동종중합체일 수 있다. 음이온성 중합체는 중합체의 서브유닛 및 단량체가 상이한 음이온성 이종중합체일 수 있다. 음이온성 중합체는 완전히 뉴클레오티드로 구성된 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA)을 지칭하지 않는다. 그러나, 음이온성 중합체는 다른 서브유닛 또는 단량체, 예컨대 아미노산 및/또는 소형 유기 분자 (예를 들어, 유기 산)와 함께 1개 이상의 핵염기 (예를 들어, 구아노신, 시티딘, 아데노신, 티미딘, 및 우리딘)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체의 서브유닛 또는 단량체의 적어도 50% (예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)는 뉴클레오티드가 아니거나 또는 핵염기를 함유하지 않는다. 음이온성 중합체는 음이온성 폴리펩티드 또는 음이온성 다당류일 수 있다. 음이온성 중합체는 적어도 2개의 서브유닛 또는 단량체 (예를 들어, 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 또는 400개의 서브유닛 또는 단량체; 100개 내지 400개, 120개 내지 400개, 140개 내지 400개, 160개 내지 400개, 180개 내지 400개, 200개 내지 400개, 220개 내지 400개, 240개 내지 400개, 260개 내지 400개, 280개 내지 400개, 300개 내지 400개, 320개 내지 400개, 340개 내지 400개, 360개 내지 400개, 380개 내지 400개, 100개 내지 380개, 100개 내지 360개, 100개 내지 340개, 100개 내지 320개, 100개 내지 300개, 100개 내지 280개, 100개 내지 260개, 100개 내지 240개, 100개 내지 220개, 100개 내지 200개, 100개 내지 180개, 100개 내지 160개, 100개 내지 140개, 또는 100개 내지 120개의 서브유닛 또는 단량체)를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "음이온성 폴리펩티드"는 그의 서브유닛 또는 단량체의 적어도 50% (예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)가 아미노산, 예컨대 산성 아미노산 (예를 들어, 글루탐산 및 아스파르트산), 또는 그의 유도체인 음이온성 중합체를 지칭한다. 아미노산 외에, 음이온성 폴리펩티드는 또한 소형 유기 분자 (예를 들어, 유기 산), 당 분자 (예를 들어, 단당류 또는 이당류), 또는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온성 폴리펩티드는 그의 서브유닛 모두가 동일한 동종중합체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 음이온성 폴리펩티드는 2종 이상의 상이한 서브유닛을 함유하는 이종중합체일 수 있다. 예를 들어, 음이온성 폴리펩티드는 폴리글루탐산 (PGA) (예를 들어, 폴리-감마-글루탐산), 폴리아스파르트산, 및 폴리카르복시글루탐산일 수 있다. 또 다른 예에서, 음이온성 폴리펩티드는 글루탐산 및 아스파르트산의 혼합물을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온성 폴리펩티드의 서브유닛 또는 단량체의 적어도 50% (예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)가 글루탐산 및/또는 아스파르트산일 수 있다. 음이온성 폴리펩티드는 적어도 2개의 서브유닛 또는 단량체 (예를 들어, 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 또는 400개의 서브유닛 또는 단량체; 100개 내지 400개, 120개 내지 400개, 140개 내지 400개, 160개 내지 400개, 180개 내지 400개, 200개 내지 400개, 220개 내지 400개, 240개 내지 400개, 260개 내지 400개, 280개 내지 400개, 300개 내지 400개, 320개 내지 400개, 340개 내지 400개, 360개 내지 400개, 380개 내지 400개, 100개 내지 380개, 100개 내지 360개, 100개 내지 340개, 100개 내지 320개, 100개 내지 300개, 100개 내지 280개, 100개 내지 260개, 100개 내지 240개, 100개 내지 220개, 100개 내지 200개, 100개 내지 180개, 100개 내지 160개, 100개 내지 140개, 또는 100개 내지 120개의 서브유닛 또는 단량체)를 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "음이온성 다당류"는 그의 서브유닛 또는 단량체의 적어도 50% (예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)가 당 분자, 예컨대 단당류 (예를 들어, 프룩토스, 갈락토스, 및 글루코스) 및 이당류 (예를 들어, 히알루론산, 락토스, 말토스, 및 수크로스), 또는 그의 유도체인 음이온성 중합체를 지칭한다. 당 분자 외에, 음이온성 다당류는 또한 소형 유기 분자 (예를 들어, 유기 산), 아미노산 (예를 들어, 글루탐산 또는 아스파르트산), 또는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온성 다당류는 그의 서브유닛 모두가 동일한 동종중합체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 음이온성 다당류는 2종 이상의 상이한 서브유닛을 함유하는 이종중합체일 수 있다. 예를 들어, 음이온성 다당류는 히알루론산 (HA), 헤파린, 헤파린 술페이트, 또는 글리코사미노글리칸일 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온성 다당류의 서브유닛 또는 단량체의 적어도 50% (예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)가 HA일 수 있다. 음이온성 다당류는 적어도 2개의 서브유닛 또는 단량체 (예를 들어, 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 또는 400개의 서브유닛 또는 단량체; 100개 내지 400개, 120개 내지 400개, 140개 내지 400개, 160개 내지 400개, 180개 내지 400개, 200개 내지 400개, 220개 내지 400개, 240개 내지 400개, 260개 내지 400개, 280개 내지 400개, 300개 내지 400개, 320개 내지 400개, 340개 내지 400개, 360개 내지 400개, 380개 내지 400개, 100개 내지 380개, 100개 내지 360개, 100개 내지 340개, 100개 내지 320개, 100개 내지 300개, 100개 내지 280개, 100개 내지 260개, 100개 내지 240개, 100개 내지 220개, 100개 내지 200개, 100개 내지 180개, 100개 내지 160개, 100개 내지 140개, 또는 100개 내지 120개의 서브유닛 또는 단량체)를 함유할 수 있다.
III. 내인성 세포 표면 단백질을 변형시키는 조성물 및 방법
세포에서 내인성 세포 표면 단백질을 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질)로 변형시키는 본원에 기재된 조성물 및 방법에서, gRNA가 표적화하는 내인성 세포 표면 단백질 유전자좌 (예를 들어, T 세포 수용체 알파 불변 쇄 (TRAC) 게놈 유전자좌)에서의 위치는 높은 수준의 HDR 및 빈번한 indel을 일으키는 오류-유발 방식으로 절단된 단부를 직접적으로 라이게이션하는, 낮은 수준의 NHEJ를 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 코딩 서열 또는 인근 구조적 요소를 표적화하는 gRNA는 단백질 또는 mRNA 발현을 파괴할 수 있으며, 이는 또한 유전자의 목적하지 않은 NHEJ-매개 녹아웃을 일으킬 수 있다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 내인성 세포 표면 단백질 유전자좌 (예를 들어, TRAC 유전자좌)에서의 인트론 영역 (예를 들어, TRAC 유전자좌의 인트론 5, 6, 또는 7에서의 인트론 영역), 또는 그의 일부를 표적화하는 gRNA를 갖는 것은 높은 수준의 HDR 및 낮은 수준의 NHEJ를 일으킬 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA는 인트론 영역 (예를 들어, TRAC 유전자좌의 인트론 5, 6, 또는 7에서의 인트론 영역) 및 엑손 영역 둘 다를 함유하는 내인성 세포 표면 단백질 유전자좌 (예를 들어, TRAC 유전자좌)에서의 영역을 표적화한다.
일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 2-9 (예를 들어, gRNA G526, gRNA G527, gRNA G528, gRNA G529, gRNA G530, gRNA G531, gRNA G532, 및 gRNA G533) 중 임의의 하나의 서열에 대해 적어도 85% (예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 도 5에 제시된 바와 같이, gRNA G526, gRNA G527, gRNA G528, 및 gRNA G529 각각은 인트론 영역 및 엑손 영역 둘 다를 함유하는 TRAC 유전자좌에서의 영역을 표적화한다. 추가로, gRNA G530, gRNA G531, gRNA G532, 및 gRNA G533 각각은 인트론 영역인 TRAC 유전자좌에서의 영역을 표적화한다.
일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 17-28 (예를 들어, gRNA G542, gRNA G543, gRNA G544, gRNA G545, gRNA G546, gRNA G547, gRNA G548, gRNA G549, gRNA G550, gRNA G551, gRNA G552, 및 gRNA G553) 중 임의의 하나의 서열에 대해 적어도 85% (예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. gRNA G542, gRNA G543, gRNA G544, gRNA G545, gRNA G546, gRNA G547, gRNA G548, gRNA G549, gRNA G550, gRNA G551, gRNA G552, 및 gRNA G553 각각은 인트론 영역을 함유하는 TRAC 유전자좌에서의 영역을 표적화한다.
일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 29-40 (예를 들어, gRNA G571, gRNA G572, gRNA G573, gRNA G574, gRNA G575, gRNA G576, gRNA G577, gRNA G578, gRNA G579, gRNA G580, gRNA G581, 및 gRNA G582) 중 임의의 하나의 서열에 대해 적어도 85% (예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. gRNA G571, gRNA G572, gRNA G573, gRNA G574, gRNA G575, gRNA G576, gRNA G577, gRNA G578, gRNA G579, gRNA G580, gRNA G581, 및 gRNA G582 각각은 B2M 유전자좌에서의 영역을 표적화한다. 일부 실시양태에서, B2M 유전자좌는 진뱅크(GenBank) 유전자 ID:567의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 41-52 (예를 들어, gRNA G559, gRNA G560, gRNA G561, gRNA G562, gRNA G563, gRNA G564, gRNA G565, gRNA G566, gRNA G567, gRNA G568, gRNA G569, 및 gRNA G570) 중 임의의 하나의 서열에 대해 적어도 85% (예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. gRNA G559, gRNA G560, gRNA G561, gRNA G562, gRNA G563, gRNA G564, gRNA G565, gRNA G566, gRNA G567, gRNA G568, gRNA G569, 및 gRNA G570 각각은 CD4 유전자좌에서의 영역을 표적화한다. 일부 실시양태에서, CD4 유전자좌는 진뱅크 유전자 ID:920의 서열을 포함한다.
gRNA를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 gRNA는 CTGGATATCTGTGGGACAAG (서열식별번호: 3; gRNA G527), ATCTGTGGGACAAGAGGATC (서열식별번호: 4; gRNA G528), TCTGTGGGACAAGAGGATCA (서열식별번호: 5; gRNA G529), GGGACAAGAGGATCAGGGTT (서열식별번호: 6; gRNA G530), TCTTTGCCCCAACCCAGGCT (서열식별번호: 7; gRNA G531), CTTTGCCCCAACCCAGGCTG (서열식별번호: 8; gRNA G532), 또는 TGGAGTCCAGATGCCAGTGA (서열식별번호: 9; gRNA G533)의 서열을 포함한다. 서열식별번호: 3의 서열을 갖는 gRNA는 그 서열이 서열식별번호: 1에 제시된 TRAC 유전자좌의 뉴클레오티드 798 내지 817을 표적화한다. 서열식별번호: 4의 서열을 갖는 gRNA는 TRAC 유전자좌의 뉴클레오티드 792 내지 811을 표적화한다. 서열식별번호: 5의 서열을 갖는 gRNA는 TRAC 유전자좌의 뉴클레오티드 791 내지 810을 표적화한다. 서열식별번호: 6의 서열을 갖는 gRNA는 TRAC 유전자좌의 뉴클레오티드 786 내지 805을 표적화한다. 서열식별번호: 7의 서열을 갖는 gRNA는 TRAC 유전자좌의 뉴클레오티드 746 내지 765를 표적화한다. 서열식별번호: 8의 서열을 갖는 gRNA는 TRAC 유전자좌의 뉴클레오티드 745 내지 764를 표적화한다. 서열식별번호: 9의 서열을 갖는 gRNA는 TRAC 유전자좌의 뉴클레오티드 727 내지 746을 표적화한다. 도 1a에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 3의 서열을 갖는 gRNA는 TRAC 엑손 6의 5' 말단에서의 일부 및 TRAC 엑손 6으로부터 상류에 위치한 인트론 (예를 들어, 인트론 5)의 일부에 혼성화한다.
또 다른 측면에서, TCAGGGTTCTGGATATCTGT (서열식별번호: 2)의 서열을 갖는 gRNA가 또한 TRAC 유전자좌를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 서열식별번호: 2의 서열을 갖는 gRNA는 TRAC 유전자좌의 뉴클레오티드 806 내지 825를 표적화한다. 도 1a에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 2의 서열을 갖는 gRNA는 또한 TRAC 엑손 6의 5' 말단에서의 일부 및 TRAC 엑손 6으로부터 상류에 위치한 인트론 (예를 들어, 인트론 5)의 일부에 혼성화한다. 도 6a-6d는 상이한 gRNA를 사용하는 TRAC 유전자좌로의 CRISPR/Cas9-표적화된 통합의 도식적인 표시를 나타낸다.
또한 gRNA를 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 여기서 gRNA는 서열식별번호: 17-52 중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
추가로, 절단의 부위에서 높은 농도의 상동성-지정-복구 주형 (HDRT)을 갖는 것은 또한 높은 수준의 HDR을 촉진할 수 있다. 이 측면에서, HDRT는 1개 이상의 Cas 단백질 표적 서열에 융합될 수 있으며, 이는 유전자 변형 효율을 증진시키기 위해 gRNA를 통해 Cas 단백질과 상호작용하고 그에 의해 결합되어 HDRT를 표적화된 핵산 (예를 들어, TRAC 유전자좌)에 근접하는 목적하는 세포 위치로 "실어 나를" 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 표적 서열은 또한 셔틀 서열로 지칭된다.
1개 이상의 Cas 단백질 표적 서열에 융합되는 HDRT의 일부 실시양태에서, Cas 단백질 표적 서열은 도 1b에 제시된 바와 같이 상보적 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화되어 이중 가닥 이중체를 형성한다. 일부 실시양태에서, HDRT는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시양태에서, HDRT는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, HDRT는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있고 이는 1개 이상의 Cas 단백질 표적 서열에 융합되며, 여기서 각각의 Cas 단백질 표적 서열은 상보적 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화된다. 특정 실시양태에서, HDRT는 2개의 Cas 단백질 표적 서열에 융합된다. 예를 들어, 제1 Cas 단백질 표적 서열은 HDRT의 5' 말단에 융합될 수 있고 제2 Cas 단백질 표적 서열은 HDRT의 3' 말단에 융합될 수 있다. 특정 실시양태에서, HDRT는 각각 B-세포 성숙 항원 (BCMA)-CAR 서열을 함유하는 서열식별번호: 10 또는 11의 서열에 대해 적어도 85% (예를 들어, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 100%) 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 다른 실시양태에서, CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR)) 대신에, 면역요법을 위한 트랜스진, 예컨대 Syn-Notch 유전자 또는 미니-Notch 유전자가 T 세포의 게놈으로 통합될 수 있다. 본원에 기재된 조성물에 의해 표적화될 수 있는 트랜스진의 다른 예는 키메라 수용체 (예를 들어, 키메라 항원 수용체, 키메라 공동-자극 수용체, 전환 수용체 (PD1/28, CD80/4-1BB, TGFBR/4-1BB와 같으나, 이에 제한되지는 않는 2종의 수용체의 세포외 및 세포내 사이의 융합), T 세포 수용체 및 그의 변이체 (예를 들어, HLA-독립적 TCR), SynNotch 및 그의 변이체, 동종 면역을 조정하는 수용체 (예를 들어, CD47, HLA-E, 및 ADR (동종 면역 방어 수용체)), CD4, CD8, CD95L (FasL), 및 전사 인자 (예를 들어, TOX, TCF1, IRF8, BTAF, Fli1, 및 c-Jun)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 조성물은 Cas 단백질, 예컨대 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, 또는 그의 변이체를 추가로 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas9 뉴클레아제이다. Cas 단백질의 추가적인 설명이 본원에 추가로 제공된다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질 대신에, 맞춤형 엔도뉴클레아제, 예컨대 메가뉴클레아제, 아연-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성자-유사 (TAL) 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 귀소 엔도뉴클레아제, 또는 메가-Tal이 HDRT에 융합되는 1개 이상의 셔틀 서열에 결합하고 HDRT를 유전자 변형의 부위로 운반하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 핵 위치 신호 (NLS) 서열에 융합된다. NLS 서열의 예는, 예를 들어, 문헌 [Lange et al., J Biol Chem. 282(8):5101-5, 2007]에 기재된 바와 같이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 또한 AVKRPAATKKAGQAKKKKLD (서열식별번호: 12), MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN (서열식별번호: 13), PAAKRVKLD (서열식별번호: 14), KLKIKRPVK (서열식별번호: 15), 및 PKKKRKV (서열식별번호: 16)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. Cas 단백질에 융합될 수 있는 다른 펩티드 또는 단백질의 예, 예컨대 세포-침투 펩티드 및 세포-표적화 펩티드는 관련 기술분야에서 이용가능하고, 예를 들어, 문헌 [Vives et al., Biochim Biophys Acta. 1786(2):126-38, 2008]에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, Cas 단백질은 뉴클레아제 활성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, Cas 단백질은 뉴클레아제 활성을 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 서열식별번호: 2-9 및 17-52 중 임의의 하나의 서열을 갖는 gRNA 및 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 뉴클레아제)을 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA 및 Cas 단백질은, 예를 들어, 37℃에서 30분 동안 함께 인큐베이션되어 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 형성할 수 있다. 추가로, 음이온성 중합체가 RNP 복합체를 안정화시키고 응집을 방지하기 위해 조성물에 첨가될 수 있다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 음이온성 중합체는 생리학상 pH에서 양으로 하전된 Cas 단백질과 유리하게 상호작용하고, 분산된 입자로 RNP 복합체를 안정화시키고, 응집을 방지하고, 뉴클레아제 편집 활성 및 효율을 개선시킬 수 있다. 음이온성 중합체의 예는 폴리글루탐산 (PGA), 폴리아스파르트산, 또는 폴리카르복시글루탐산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 음이온성 중합체의 추가적인 설명이 본원에 추가로 상세하게 제공된다.
본원에 기재된 조성물은 세포 (예를 들어, T 세포)에서 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)을 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))로 변형시키는 데 사용될 수 있다. 세포 표면 단백질 유전자좌 (예를 들어, TRAC 유전자좌)에서 유전자를 변형시킴으로써, CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))의 녹인은 동시에 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)을 녹아웃시킬 수 있다. 추가로, 방법은 내인성 세포 표면 단백질에 대해 음성인 변형된 세포를 선택함으로써, 방법이 또한 CAR 또는 외인성 단백질 녹인을 갖는 세포를 풍부화시키는 이점을 제공한다. 도 8a는 TRAC 유전자좌에서의 인트론 또는 엑손 gRNA를 사용한 KI의 도식적인 표시를 나타낸다. 추가로, 표시된 gRNA 및 공여자 주형으로 조작된 T 세포의 도식적인 유세포 플롯이 도 8b에 제시된다. 도 8b에서 하단 라인은 TCR 음성 선택 후 CAR 양성 세포의 개선된 풍부화를 나타낸다. 세포 표면 단백질 유전자좌 (예를 들어, TRAC 유전자좌)에서 유전자를 변형시키기 위해, gRNA, Cas 단백질, 및 HDRT가 관련 기술분야에서 이용가능한 상이한 기술, 예컨대 본원에 추가로 상세하게 기재된 전기천공 및 바이알 전달을 사용하여 T 세포로 도입될 수 있다.
녹인 및 음성 선택 풍부화를 위해 본원에 기재된 조성물에 의해 변형될 수 있는 유전자의 예는 TRAC, TRBC, TRGC, TRDC, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 제타 (CD247), B2M, CD4, CD8 알파, CD8 베타, CTLA4, PD-1, TIM-3, LAG3, TIGIT, CD28, CD25, CD69, CD95 (Fas), CD52, CD56, CD38, KLRG-1, 및 NK 특이적 유전자 (예를 들어, NKG2A, NKG2C, NKG2D, NKp46, CD16, CD84, CD84, 2B4, 및 KIR-L)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 다수의 게놈 유전자좌 (예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 게놈 유전자좌)에서 다수의 세포 표면 단백질을 변형시키는 데, 즉, 다수의 동시 인트론 녹인시키는 데 사용될 수 있다. 다수의 세포 표면 단백질은 상이한 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질)로 대체될 수 있다. 목적하는 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질) 모두를 함유하는 변형된 세포는 음성 선택에서, 예를 들어, 내인성 세포 표면 단백질을 표적화하는 항체를 사용하여 풍부화될 수 있다. 이 방식으로, 목적하는 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질)에 의해 대체되지 않은 1개 이상의 내인성 세포 표면 단백질을 함유하는 세포는 모두 항체를 사용하여 빼내질 수 있으며, 이는 후속적으로 목적하는 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질) 모두를 함유하는 세포를 풍부화시킨다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 다수의 동시 인트론 녹인은 3개의 상이한 유전자좌에서 3개의 내인성 세포 표면 단백질을 대체하는 3개의 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 재조합 MHC-I 제한된 TCR은 TRAC 유전자좌에서 내인성 TCR을 대체할 수 있고; NK 세포 조정제 (예를 들어, HLA-E (HLA 부류 I 조직적합성 항원, 알파 쇄 E) 단백질)는 B2M 유전자좌에서 내인성 B2M 단백질을 대체할 수 있고; CD8 (예를 들어, CD8 알파 및 베타 쇄)은 CD4 유전자좌에서 내인성 CD4 단백질을 대체할 수 있다. 3개의 재조합 MHC-I 제한된 TCR, HLA-E, 및 CD8 모두를 함유하는 세포를 음성적으로 풍부화시키기 위해, 내인성 TCR, B2M, 및 CD4를 표적화하는 항체가 여전히 내인성 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR, B2M, 및 CD4) 중 1개, 내인성 단백질 중 2개, 또는 내인성 단백질 중 3개 모두를 함유하는 세포를 빼내고, 후속적으로 재조합 MHC-I 제한된 TCR, HLA-E, 및 CD8 중 3개 모두를 함유하는 세포를 풍부화시키는 데 사용될 수 있다. 본 개시내용은 또한 서열식별번호: 2-9 및 17-52 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 제1 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 제1 조성물 및 서열식별번호: 2-9 및 17-52 중 임의의 하나의 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 제2 조성물을 T 세포로 도입하는 것을 포함하는, T 세포에서 적어도 2개 이상의 내인성 세포 표면 단백질을 변형시키는 방법을 제공하며, 여기서 2개 이상의 내인성 세포 표면 단백질은 상이하고 제1 gRNA 및 제2 gRNA는 상이하다.
IV. 전달의 방법
세포 (예를 들어, T 세포)에서 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)을 변형시키는 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 조성물은 관련 기술분야의 다수의 기술을 사용하여 T 세포로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 전기천공을 통해 세포로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 뉴클레아제) 및 gRNA를 함유하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체가 먼저 형성되고, 이어서 세포로 전기천공될 수 있다. 전기천공을 위한 방법, 조성물, 및 장치는 관련 기술분야에서 이용가능하고, 예를 들어, WO2006/001614 또는 문헌 [Kim, J.A. et al. Biosens. Bioelectron. 23, 1353-1360 (2008)]에 기재된 것이다. 전기천공을 위한 추가적인 또는 대안적인 방법, 조성물, 및 장치는 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0094095; 2005/0064596; 또는 2006/0087522에 기재된 것을 포함할 수 있다. 전기천공을 위한 추가적인 또는 대안적인 방법, 조성물, 및 장치는 문헌 [Li, L.H. et al. Cancer Res. Treat. 1, 341-350 (2002)]; 미국 특허 번호: 6,773,669; 7,186,559; 7,771,984; 7,991,559; 6,485,961; 및 7,029,916; 및 미국 특허 출원 공개 번호: 2014/0017213; 및 2012/0088842에 기재된 것을 포함할 수 있다. 전기천공을 위한 추가적인 또는 대안적인 방법, 조성물, 및 장치는 문헌 [Geng, T. et al. J. Control Release 144, 91-100 (2010)]; 및 문헌 [Wang, J., et al. Lab Chip 10, 2057-2061 (2010)]에 기재된 것을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 중 Cas 단백질, HDRT, 및 gRNA는 바이러스 벡터를 사용하는 바이러스 전달을 통해 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 백시니아 바이러스, 폴리오바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV) (예를 들어, 재조합 AAV (rAAV)), SV40, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 등에 기반할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하베이 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터, 렌티바이러스 (예를 들어, 통합 결핍 렌티바이러스), 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 유방 종양 바이러스 등에 기반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 레트로바이러스 벡터는 통합 결핍 감마 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 다른 유용한 발현 벡터는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 다수가 상업적으로 이용가능하다. 하기 예시적인 벡터가 진핵 숙주 세포에 대한 예로서 제공된다: pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVLSV40. 바이러스 벡터를 세포로 도입하는 데 사용될 수 있는 기술의 예는 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 형질감염, 원형질체 융합, 리포펙션, 인산 칼슘 침전, 폴리에틸렌이민 (PEI)-매개 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포솜-매개 형질감염, 인산 칼슘 침전, 나노입자-매개 핵산 전달 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
V. 선택의 방법
내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)이 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))로 대체된 세포는 관련 기술분야에서 이용가능한 다양한 기술을 사용하여 선택될 수 있다. 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)을 발현하지 않는 변형된 세포를 선택함으로써, 방법은 또한 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR)) 녹인을 갖는 세포를 풍부화시키고 있다. 일부 실시양태에서, 선택 방법은 여전히 내인성 세포 표면 단백질을 발현하는 비변형된 T 세포를 표적화하고 선택적으로 빼내어, 상청액 중에 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질)을 발현하는 변형된 T 세포를 남기며, 이는 또한 음성 선택으로 지칭된다. 음성 선택에서, 선택 방법은 목적하지 않은 성분 (예를 들어, 변형되어야 하는 내인성 세포 표면 단백질)을 표적화하고, 변형된 T 세포의 목적하는 집단을 그대로 남긴다. 일부 실시양태에서, 음성 선택은 양성 선택보다 더 효율적이고 (더 적은 세포 손실), 세포에 대해 덜 독성이고, 더 빠르다. 양성 선택에서, 선택 방법은 목적하는 성분 또는 변형된 T 세포로 도입되는 성분 (예를 들어, CAR, 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질), 또는 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질))과 함께 공동-발현되는 단백질을 표적화한다. 게다가, CAR 또는 외인성 단백질을 표적화하는 양성 선택은 T 세포의 항종양 활성에 해로운 T 세포 활성화를 일으킬 수 있다. 추가로, CAR과 함께 공동-발현될 수 있는 단백질, 예를 들어, 말단절단된 EGFR을 표적화하는 양성 선택은 HDRT의 크기를 증가시키는 것을 필요로 하며, 이는 녹인 효율 및 세포 생존율에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
특정 측면에서, T 세포의 집단이 제공된다. T 세포의 집단은 본원에 기재된 변형된 세포를 포함할 수 있다. 변형된 세포는 세포의 불균질한 집단 내에 있을 수 있다. 세포의 집단은 게놈 편집된 세포의 백분율과 관련하여 불균질할 수 있다. T 세포의 집단은 집단의 10% 초과, 20% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 또는 90% 초과가 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))을 코딩하는 통합된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
T 세포의 집단으로부터, T 세포에서 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)이 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))로 대체된 변형된 T 세포를 선택하는 방법이 제공된다. Cas 단백질, 세포 표면 단백질 유전자좌 (예를 들어, TRAC 유전자좌)를 표적화하는 gRNA, 및 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))을 코딩하는 HDRT를 함유하는 본원에 기재된 조성물이 T 세포의 집단으로 도입 (예를 들어, 전기천공 또는 바이러스 전달을 통해 도입)되고 세포가 며칠 동안 인큐베이션되어 변형이 일어난 후에, 변형된 T 세포는 T 세포의 집단을 항체-코팅된 자기 비드와 접촉시킴으로써 선택 (예를 들어, 음성적으로 선택)될 수 있으며, 여기서 자기 비드 상 항체는 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)을 표적화한다. 이 방식으로, 변형되지 않고 여전히 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)을 발현하는 T 세포는 내인성 세포 표면 단백질이 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질)에 의해 대체된 변형된 T 세포로부터 분리될 수 있다. 내인성 세포 표면 단백질이 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 재조합 TCR))로 대체되는 경우에, 항체에 의해 인식되는 에피토프가 오직 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)에만 존재하고 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 재조합 TCR))에는 존재하지 않도록 해야 한다. 이어서, 비변형된 T 세포에 결합된 항체-코팅된 자기 비드는 자기 분리 랙을 사용하여 변형된 T 세포로부터 분리될 수 있다. 변형된 T 세포를 함유하는 상청액은 별개의 용기로 수집될 수 있다.
일부 경우에, T 세포의 집단은 대상체로부터 제거되고, 본원에 기재된 조성물 및 방법 중 임의의 것을 사용하여 변형되고, 대상체에게 투여된다. 다른 경우에, 본원에 기재된 조성물은 대상체에게 생체내 전달될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 9737604 및 문헌 [Zhang et al. "Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery of CRISPR/Cas9 for tumor therapy," NPG Asia Materials Volume 9, page e441 (2017)]을 참조한다.
본원에 기재된 조성물은 세포 (예를 들어, T 세포)에서 내인성 세포 표면 단백질 (예를 들어, 내인성 TCR)을 CAR 또는 외인성 단백질 (예를 들어, 외인성 세포내 또는 세포 표면 단백질 (예를 들어, 외인성 TCR))로 변형시키는 방법에 사용될 수 있다. 세포는 시험관내, 생체외, 또는 생체내 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 조절 T 세포, 이펙터 T 세포, 또는 나이브 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4-CD8- T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 αβ T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 γδ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 방법은 변형된 T 세포의 집단을 확장시키는 것을 추가로 포함한다.
또한, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 또한 조혈 줄기, 전구 세포, T 세포 (CD4 T 세포, CD8 T 세포, T-조절 세포, 감마/델타 T 세포), 자연 살해 (NK) 세포, NK T 세포, iPS/ES 세포, iPS/ES-유래 NK 세포, iPS/ES-유래 NK T 세포, B 세포, 골수 세포, iPS/ES 유래 B 세포, 및 iPS/ES 유래 골수 세포와 같으나, 이에 제한되지는 않는 다른 세포 유형에 적용될 수 있다.
VI. 가이드 RNA
Cas 단백질은 가이드 RNA (gRNA)에 의해 그의 표적 핵산으로 가이드될 수 있다. gRNA는 2-조각 gRNA 또는 단일, 연속적인 서열로 조작된 천연 발생 2-조각 가이드 RNA (crRNA 및 tracrRNA)의 버전이다. gRNA는 Cas 단백질을 표적 핵산으로 표적화하는 가이드 서열 (예를 들어, gRNA의 crRNA 등가 부분) 및 Cas 단백질과 상호작용하는 스캐폴드 서열 (예를 들어, gRNA의 tracrRNA 등가 부분)을 함유할 수 있다. gRNA는 소프트웨어를 사용하여 선택될 수 있다. 비-제한적인 예로서, gRNA를 선택하기 위한 고려 사항은, 예를 들어, 사용될 Cas 단백질을 위한 PAM 서열, 및 오프-타켓 변형을 최소화하기 위한 전략을 포함할 수 있다. 도구, 예컨대 뉴팩(NUPACK)® 및 CRISPR 설계 도구는 gRNA를 제조하고/거나, 표적 변형 효율을 평가하고/거나, 오프-타켓 부위에서의 절단을 평가하기 위한 서열을 제공할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, gRNA가 표적화하는 내인성 세포 표면 단백질 게놈 유전자좌 (예를 들어, TRAC 게놈 유전자좌)에서의 위치는 높은 수준의 HDR 및 낮은 수준의 NHEJ를 촉진하는 데 중요하다. 게다가, 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 세포 표면 단백질 유전자좌 (예를 들어, TRAC 유전자좌)에서 인트론 영역, 또는 그의 일부를 표적화하는 gRNA를 갖는 것은 높은 수준의 HDR 및 낮은 수준의 NHEJ를 일으킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 표면 단백질 유전자좌 (예를 들어, TRAC 유전자좌)에서 영역을 표적화하는 gRNA는 서열식별번호: 2-9 및 17-52 중 임의의 하나의 서열을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, TRAC 유전자좌에서 영역을 표적화하는 gRNA는 서열식별번호: 2-9 중 임의의 하나의 서열을 가질 수 있다.
가이드 서열
gRNA의 가이드 서열은 표적 핵산 내 특정 서열에 상보적일 수 있다. 표적 핵산 서열의 3' 단부에 이어서 PAM 서열일 수 있다. PAM 서열의 대략 20개의 뉴클레오티드 상류가 표적 핵산이다. 일반적으로, Cas9 단백질 또는 그의 변이체는 PAM 서열의 약 3개의 뉴클레오티드 상류를 절단한다. gRNA의 가이드 서열은 표적 핵산 중 어느 하나의 가닥에 상보적일 수 있다.
일부 실시양태에서, gRNA의 가이드 서열은 약 10개 내지 약 2000개의 핵산, 예를 들어, 약 10개 내지 약 100개의 핵산, 약 10개 내지 약 500개의 핵산, 약 10개 내지 약 1000개의 핵산, 약 10개 내지 약 1500개의 핵산, 약 10개 내지 약 2000개의 핵산, 약 50개 내지 약 100개의 핵산, 약 50개 내지 약 500개의 핵산, 약 50개 내지 약 1000개의 핵산, 약 50개 내지 약 1500개의 핵산, 약 50개 내지 약 2000개의 핵산, 약 100개 내지 약 500개의 핵산, 약 100개 내지 약 1000개의 핵산, 약 100개 내지 약 1500개의 핵산, 약 100개 내지 약 2000개의 핵산, 약 500개 내지 약 1000개의 핵산, 약 500개 내지 약 1500개의 핵산, 약 500개 내지 약 2000개의 핵산, 약 1000개 내지 약 1500개의 핵산, 또는 약 1000개 내지 약 2000개의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA의 가이드 서열은 gRNA의 5' 단부에서 RNA-DNA 상보성 염기 쌍 형성을 사용하여 Cas 단백질을 표적 핵산 부위로 지시할 수 있는 약 100개의 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열은 gRNA의 5' 단부에서 RNA-DNA 상보성 염기 쌍 형성을 사용하여 Cas 단백질을 표적 핵산 부위로 지시할 수 있는 20개의 핵산을 포함한다. 다른 실시양태에서, 가이드 서열은 표적 핵산 부위에 상보적인 20개 미만, 예를 들어, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개 또는 그 이하의 핵산을 포함한다. 일부 경우에, gRNA의 가이드 서열은 표적 핵산 부위의 상보성 영역에서 적어도 1개의 핵산 미스매치를 함유한다. 일부 경우에, 가이드 서열은 표적 핵산 부위의 상보성 영역에서 약 1개 내지 약 10개의 핵산 미스매치를 함유한다.
스캐폴드 서열
gRNA의 스캐폴드 서열은 Cas 단백질 또는 그의 변이체와 상호작용하는 단백질-결합 서열로서 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA의 스캐폴드 서열은 서로 혼성화하여 이중 가닥 RNA 이중체 (dsRNA 이중체)를 형성하는 뉴클레오티드의 2개의 상보적 스트레치를 포함할 수 있다. 스캐폴드 서열은 구조, 예컨대 하부 스템(lower stem), 벌지(bulge), 상부 스템(upper stem), 넥서스(nexus), 및/또는 헤어핀(hairpin)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, gRNA의 스캐폴드 서열은 약 90개의 핵산 내지 약 120개의 핵산, 예를 들어, 약 90개의 핵산 내지 약 115개의 핵산, 약 90개의 핵산 내지 약 110개의 핵산, 약 90개의 핵산 내지 약 105개의 핵산, 약 90개의 핵산 내지 약 100개의 핵산, 약 90개의 핵산 내지 약 95개의 핵산, 약 95개의 핵산 내지 약 120개의 핵산, 약 100개의 핵산 내지 약 120개의 핵산, 약 105개의 핵산 내지 약 120개의 핵산, 약 110개의 핵산 내지 약 120개의 핵산, 또는 약 115개의 핵산 내지 약 120개의 핵산일 수 있다.
VII. Cas 단백질
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 뉴클레아제 활성을 갖는다. 예를 들어, Cas 단백질은 표적 핵산을 절단시킴으로써 표적 핵산을 변형시킬 수 있다. 이어서, 절단된 표적 핵산은 인근 HDRT를 사용한 상동성 재조합을 받을 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 표적 핵산의 위치에서 하나의 또는 두 가닥의 절단을 지시할 수 있다. Cas 단백질의 비-제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, 그의 상동체, 그의 변이체, 그의 돌연변이체, 및 그의 유도체를 포함한다. Cas 단백질의 3종의 주 유형 (유형 I, 유형 II, 및 유형 III), 및 5종의 유형 I, 3종의 유형 II, 및 2종의 유형 III 단백질을 포함하는 10종의 하위유형이 있다 (예를 들어, 문헌 [Hochstrasser and Doudna, Trends Biochem Sci, 2015:40(1):58-66]을 참조). 유형 II Cas 단백질은 Cas1, Cas2, Csn2, Cas9, 및 Cfp1을 포함한다. 이들 Cas 단백질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 야생형 Cas9 폴리펩티드의 아미노산 서열이, 예를 들어, NBCI 참조 서열 번호 NP_269215에 제시되어 있고, 스트렙토코쿠스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 야생형 Cas9 폴리펩티드의 아미노산 서열이, 예를 들어, NBCI 참조 서열 번호 WP_011681470에 제시되어 있다.
Cas 단백질, 예를 들어, Cas9 뉴클레아제는 베일로넬라 아티피칼(Veillonella atypical), 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 필리팩터 알로시스(Filifactor alocis), 솔로박테리움 무우레이(Solobacterium moorei), 코프로코쿠스 카투스(Coprococcus catus), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 펩토니필루스 듀어데니이(Peptoniphilus duerdenii), 카테니박테리움 미츠오카이(Catenibacterium mitsuokai), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 리스테리아 인노쿠아(Listeria innocua), 스타필로코쿠스 슈딘터메디우스(Staphylococcus pseudintermedius), 아시다미노코쿠스 인테스틴(Acidaminococcus intestine), 올세넬라 울리(Olsenella uli), 오에노코쿠스 키타하라에(Oenococcus kitaharae), 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum), 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실루스 가세리(Lactobacillus gasseri), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 마이코플라스마 모빌레(Mycoplasma mobile), 마이코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 마이코플라스마 오비뉴모니아에(Mycoplasma ovipneumoniae), 마이코플라스마 카니스(Mycoplasma canis), 마이코플라스마 시노비아에(Mycoplasma synoviae), 유박테리움 렉탈레(Eubacterium rectale), 스트렙토코쿠스 써모필루스, 유박테리움 돌리춤(Eubacterium dolichum), 락토바실루스 코리니포르미스(Lactobacillus coryniformis) 아종 토르쿠엔스(Torquens), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 루미노코쿠스 알부스(Ruminococcus albus), 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 아시도써무스 셀룰로리티쿠스(Acidothermus cellulolyticus), 비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 엘루시미크로비움 미누툼(Elusimicrobium minutum), 니트라티프락터 살수기니스(Nitratifractor salsuginis), 스파에로카에타 글로부스(Sphaerochaeta globus), 피브로박터 석시노게네스(Fibrobacter succinogenes) 아종 석시노게네스, 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 캡노사이토파가 오크라세아(Capnocytophaga ochracea), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 프레보텔라 미칸스(Prevotella micans), 프레보텔라 루미니콜라(Prevotella ruminicola), 플라보박테리움 콜룸나레(Flavobacterium columnare), 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸 마리눔(Candidatus Puniceispirillum marinum), 베르미네프로박터 에이세니아에(Verminephrobacter eiseniae), 랄스토니아 시지기이(Ralstonia syzygii), 디노로세오박터 쉬베(Dinoroseobacter shibae), 아조스피릴룸(Azospirillum), 니트로박터 함부르겐시스(Nitrobacter hamburgensis), 브라디리조비움(Bradyrhizobium), 월리넬라 석시노게네스(Wolinella succinogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 아종 제주니, 헬리코박터 무스텔라에(Helicobacter mustelae), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 아시도보락스 에베레우스(Acidovorax ebreus), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 로세부리아 인테스티날리스(Roseburia intestinalis), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 아종 물토시다, 수테렐라 와드스워텐시스(Sutterella wadsworthensis), 프로테오박테리움(proteobacterium), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 파라수테렐라 엑스크레멘티호미니스(Parasutterella excrementihominis), 월리넬라 석시노게네스, 및 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 박테리아 종으로부터 유래될 수 있다.
Cas9 단백질은 RNA-가이드된 이중 가닥 DNA-결합 뉴클레아제 단백질 또는 니카제 단백질을 지칭한다. 야생형 Cas9 뉴클레아제는 상이한 DNA 가닥을 커팅하는 2개의 기능적 도메인, 예를 들어, RuvC 및 HNH를 갖는다. Cas9는 두 기능적 도메인이 활성일 때 게놈 DNA (표적 핵산)에서 이중 가닥 파단을 유도할 수 있다. Cas9 효소는 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라, 레지오넬라, 트레포네마, 필리팩터, 유박테리움, 스트렙토코쿠스, 락토바실루스, 마이코플라스마, 박테로이데스, 플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움, 스파에로카에타, 아조스피릴룸, 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아, 로세부리아, 파르비바쿨룸, 스타필로코쿠스, 니트라티프락터, 및 캄필로박터로 이루어진 군에 속하는 박테리아로부터 유래된 Cas9 단백질의 1개 이상의 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9는 융합 단백질일 수 있고, 예를 들어, 2개의 촉매 도메인은 상이한 박테리아 종으로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 Cas 단백질 변이체일 수 있다. 예를 들어, Cas9 뉴클레아제의 유용한 변이체는 단일 불활성 촉매 도메인, 예컨대 RuvC- 또는 HNH- 효소 또는 니카제를 포함할 수 있다. Cas9 니카제는 오직 1개의 활성 기능적 도메인만을 갖고 표적 핵산의 오직 1개의 가닥만을 커팅할 수 있으며, 이로써 단일 가닥 파단 또는 닉을 생성한다. 일부 실시양태에서, Cas9 뉴클레아제는 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 갖는 돌연변이 Cas9 뉴클레아제일 수 있다. 예를 들어, 적어도 D10A 돌연변이를 갖는 돌연변이 Cas9가 Cas9 니카제이다. 다른 실시양태에서, 적어도 H840A 돌연변이를 갖는 돌연변이 Cas9 뉴클레아제가 Cas9 니카제이다. Cas9 니카제에 존재하는 돌연변이의 다른 예는 N854A 및 N863A를 제한 없이 포함한다. 반대 DNA 가닥을 표적화하는 적어도 2개의 DNA-표적화 RNA가 사용되는 경우에, 이중 가닥 파단은 Cas9 니카제를 사용하여 도입될 수 있다. 이중 닉 유도된 이중 가닥 파단은 NHEJ 또는 HDR에 의해 복구될 수 있다 (Ran et al., 2013, Cell, 154:1380-1389). Cas9 뉴클레아제 또는 니카제의 비-제한적인 예는, 예를 들어, 미국 특허 번호 8,895,308; 8,889,418; 및 8,865,406 및 미국 출원 공개 번호 2014/0356959, 2014/0273226 및 2014/0186919에 기재되어 있다. Cas9 뉴클레아제 또는 니카제는 표적 세포 또는 표적 유기체에 대해 코돈-최적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas 단백질 변이체는 절단 (예를 들어, 니카제) 활성이 결여된다. Cas 단백질 변이체는 단백질의 니카제 활성을 제거하는 1개 이상의 점 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 활성이 결여된 Cas 단백질 변이체는 Cas 단백질 표적 서열에 혼성화하는 gRNA를 통해 HDRT에 융합된 Cas 단백질 표적 서열에 결합할 수 있다. 다른 실시양태에서, 절단 활성이 결여된 Cas 단백질 변이체는 다른 단백질에 융합되고 다른 단백질을 표적 핵산으로 지시하는 표적화 도메인으로서 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 니카제 활성이 없는 Cas 단백질 변이체는 전사 활성화 또는 억제 도메인에 융합되어 유전자 발현을 제어할 수 있다 (Ma et al., Protein and Cell, 2(11):879-888, 2011; Maeder et al., Nature Methods, 10:977-979, 2013; and Konermann et al., Nature, 517:583-588, 2014).
일부 실시양태에서, Cas 단백질은 감소된 오프-타켓 효과 및 강력한 온-타겟 절단을 갖는 높은 충실도 또는 개선된 특이성 Cas9 폴리펩티드 변이체일 수 있다. 개선된 온-타겟 특이성을 갖는 Cas9 폴리펩티드 변이체의 비-제한적인 예는 문헌 [Slaymaker et al., Science, 351(6268):84-8 (2016)]에 기재된 SpCas9 (K855A), SpCas9 (K810A/K1003A/R1060A) (또한 eSpCas9(1.0)로 지칭됨), 및 SpCas9 (K848A/K1003A/R1060A) (또한 eSpCas9(1.1)로 지칭됨) 변이체, 및 하기 돌연변이: N497A, R661A, Q695A, 및 Q926A 중 1개, 2개, 3개, 또는 4개를 함유하는 (예를 들어, SpCas9-HF1은 4개의 돌연변이 모두를 함유함), 문헌 [Kleinstiver et al., Nature, 529(7587):490-5 (2016)]에 기재된 SpCas9 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 어떠한 절단 활성도 없는 Cas 단백질 변이체는 RuvC1 및 HNH 뉴클레아제 도메인의 2개의 침묵 돌연변이 (D10A 및 H840A)를 함유하는 Cas9 폴리펩티드일 수 있으며, 이는 dCas9로 지칭된다 (Jinek et al., Science, 2012, 337:816-821; Qi et al., Cell, 152(5):1173-1183). 한 실시양태에서, 스트렙토코쿠스 피오게네스로부터의 dCas9 폴리펩티드는 위치 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, A987 또는 이들의 임의의 조합에서 적어도 1개의 돌연변이를 포함한다. 이러한 dCas9 폴리펩티드 및 그의 변이체의 설명은, 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2013/176772에 제공된다. dCas9 효소는 D10, E762, H983, 또는 D986에서의 돌연변이, 뿐만 아니라 H840 또는 N863에서의 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 경우에, dCas9 효소는 D10A 또는 D10N 돌연변이를 함유할 수 있다. 또한, dCas9 효소는 H840A, H840Y, 또는 H840N을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, dCas9 효소는 D10A 및 H840A; D10A 및 H840Y; D10A 및 H840N; D10N 및 H840A; D10N 및 H840Y; 또는 D10N 및 H840N 치환을 함유할 수 있다. 치환은 Cas9 폴리펩티드가 촉매적으로 불활성이 되게 하고 표적 핵산에 결합할 수 있게 하는 보존적 또는 비-보존적 치환일 수 있다.
VIII. 음이온성 중합체
본원에 기재된 조성물의 일부 실시양태에서, 음이온성 중합체가, 예를 들어, Cas 단백질 및 gRNA 리보핵단백질 복합체 (RNP)의 안정성 및 편집 효율을 개선시키기 위해 조성물에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질)을 함유하는 조성물 또는 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질) 및 gRNA RNP 복합체를 함유하는 조성물에의 음이온성 중합체의 첨가는 Cas 단백질 또는 RNP 복합체를 안정화시키고 응집을 방지할 수 있으며, 이는 높은 뉴클레아제 활성 및 편집 효율을 일으킨다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 음이온성 중합체 (예를 들어, PGA)는 Cas 단백질과 유리하게 상호작용할 수 있고, 즉, 음이온성 중합체 (예를 들어, PGA)는 (생리학상 pH에서) 양으로 하전된 Cas9 단백질과 유리하게 상호작용할 수 있고, 분산된 입자로 RNP 복합체를 안정화시키고, 응집을 방지하고, 뉴클레아제 편집 활성 및 효율을 개선시킬 수 있다. 음이온성 중합체는 수용성일 수 있다. 음이온성 중합체는 생물학적으로 불활성일 수 있다. 일부 측면에서 음이온성 중합체는 DNA 서열이 아니다. 음이온성 중합체는 완전한 또는 실질적인 기능성을 유지하면서 동결/해동 사이클링을 받을 수 있다. 음이온성 중합체는 완전한 또는 실질적인 기능성을 유지하면서 동결건조될 수 있다. 음이온성 중합체는 15,000 내지 50,000 kDa (예를 들어, 15,000 내지 45,000 kDa, 15,000 내지 40,000 kDa, 15,000 내지 35,000 kDa, 15,000 내지 30,000 kDa, 15,000 내지 25,000 kDa, 15,000 내지 20,000 kDa, 20,000 내지 50,000 kDa, 25,000 내지 50,000 kDa, 30,000 내지 50,000 kDa, 35,000 내지 50,000 kDa, 40,000 내지 50,000 kDa, 또는 45,000 내지 50,000 kDa)의 분자량을 가질 수 있다. 음이온성 중합체는 폴리글루탐산 (PGA)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 공여자 올리고뉴클레오티드 (ssODN)가 음이온성 중합체 대신에 또는 그에 더하여 사용될 수 있다. ssODN의 예는, 예를 들어, 문헌 [Okamoto et al., Scientific Report 9:4811, 2019]; 및 [Hu et al., Nucleic Acids, 17:P198, 2019]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 음이온성 중합체는 활성의 손실 없이 조성물을 안정화시키고, 편집을 개선시키고, 독성을 감소시키고, 조성물의 동결건조를 가능하게 하기 위해 조성물에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 및 음이온성 중합체를 함유하는 조성물은 균질하게 나타나고, 투명한 시각적인 외관을 갖고, 탁한 침전물 또는 응집체가 없는 수성 조성물이다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질 및 gRNA RNP 복합체 및 음이온성 중합체를 함유하는 조성물은 균질하게 나타나고, 투명한 시각적인 외관을 갖고, 탁한 침전물 또는 응집체가 없는 수성 조성물이다. 안정한 조성물을 갖는 것은 높은 세포 생존율과 함께 효율적인 유전자 녹-아웃 및 큰 트랜스진 녹-인을 허용한다. 추가로, 조성물은 또한 장기간 저장을 위해 동결건조되고 추후 사용을 위해 재구성될 수 있다. 음이온성 중합체를 포함하는 조성물은 또한 표적 핵산을 변형시키는 방법에 사용될 수 있으며, 여기서 표적 핵산은 제거되고, 외인성 핵산 서열에 의해 대체될 수 있거나, 또는 외인성 핵산 서열이 표적 핵산 내에 삽입될 수 있다.
본원에 기재된 조성물에 첨가될 수 있는 음이온성 중합체는 전체 음전하를 갖는 서브유닛 또는 단량체로 구성된 분자이다. 음이온성 중합체는 음이온성 폴리펩티드 또는 음이온성 다당류일 수 있다. 음이온성 폴리펩티드는 그의 서브유닛 또는 단량체의 적어도 50% (예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)가 아미노산, 예컨대 산성 아미노산 (예를 들어, 글루탐산 및 아스파르트산), 또는 그의 유도체인 음이온성 중합체이다. 음이온성 폴리펩티드의 예는 폴리글루탐산 (PGA) (예를 들어, 폴리-감마-글루탐산), 폴리아스파르트산, 및 폴리카르복시글루탐산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 음이온성 폴리펩티드는 PGA (예를 들어, 폴리-감마-글루탐산), 예컨대 폴리(L-글루탐)산 또는 폴리(D-글루탐)산이다. 음이온성 폴리펩티드는 글루탐산 및 아스파르트산의 혼합물을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온성 폴리펩티드의 서브유닛 또는 단량체의 적어도 50% (예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)가 글루탐산 및/또는 아스파르트산일 수 있다. 음이온성 다당류는 그의 서브유닛 또는 단량체의 적어도 50% (예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)가 당 분자, 예컨대 단당류 (예를 들어, 프룩토스, 갈락토스, 및 글루코스) 및 이당류 (예를 들어, 히알루론산, 락토스, 말토스, 및 수크로스), 또는 그의 유도체인 음이온성 중합체이다. 음이온성 다당류의 예는 히알루론산 (HA), 헤파린, 헤파린 술페이트, 및 글리코사미노글리칸을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 음이온성 다당류의 서브유닛 또는 단량체의 적어도 50% (예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)가 HA일 수 있다. 음이온성 중합체의 다른 예는 폴리(아크릴산) (PAA), 폴리(메타크릴산) (PMAA), 폴리(스티렌 술포네이트), 및 폴리포스페이트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 음이온성 중합체는 완전히 뉴클레오티드로 구성된 핵산, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA)을 지칭하지 않는다. 일부 실시양태에서, 음이온성 중합체는 다른 서브유닛 또는 단량체, 예컨대 아미노산 및/또는 소형 유기 분자 (예를 들어, 유기 산)와 함께 1개 이상의 핵염기 (예를 들어, 구아노신, 시티딘, 아데노신, 티미딘, 및 우리딘)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온성 중합체의 서브유닛 또는 단량체의 적어도 50% (예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%)는 뉴클레오티드가 아니거나 또는 핵염기를 함유하지 않는다. 음이온성 중합체는 적어도 2개의 서브유닛 또는 단량체 (예를 들어, 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 또는 400개의 서브유닛 또는 단량체; 100개 내지 400개, 120개 내지 400개, 140개 내지 400개, 160개 내지 400개, 180개 내지 400개, 200개 내지 400개, 220개 내지 400개, 240개 내지 400개, 260개 내지 400개, 280개 내지 400개, 300개 내지 400개, 320개 내지 400개, 340개 내지 400개, 360개 내지 400개, 380개 내지 400개, 100개 내지 380개, 100개 내지 360개, 100개 내지 340개, 100개 내지 320개, 100개 내지 300개, 100개 내지 280개, 100개 내지 260개, 100개 내지 240개, 100개 내지 220개, 100개 내지 200개, 100개 내지 180개, 100개 내지 160개, 100개 내지 140개, 또는 100개 내지 120개의 서브유닛 또는 단량체)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 음이온성 중합체는 적어도 3 kDa (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 kDa)의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 음이온성 중합체는 3 kDa 내지 50 kDa (예를 들어, 3 kDa 내지 45 kDa, 3 kDa 내지 40 kDa, 3 kDa 내지 35 kDa, 3 kDa 내지 30 kDa, 3 kDa 내지 25 kDa, 3 kDa 내지 20 kDa, 3 kDa 내지 15 kDa, 3 kDa 내지 10 kDa, 3 kDa 내지 5 kDa, 5 kDa 내지 50 kDa, 10 kDa 내지 50 kDa, 15 kDa 내지 50 kDa, 20 kDa 내지 50 kDa, 25 kDa 내지 50 kDa, 30 kDa 내지 50 kDa, 35 kDa 내지 50 kDa, 40 kDa 내지 50 kDa, 또는 45 kDa 내지 50 kDa)의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 음이온성 중합체는 50 kDa 내지 150 kDa (예를 들어, 50 kDa 내지 140 kDa, 50 kDa 내지 130 kDa, 50 kDa 내지 120 kDa, 50 kDa 내지 110 kDa, 50 kDa 내지 100 kDa, 50 kDa 내지 90 kDa, 50 kDa 내지 80 kDa, 50 kDa 내지 70 kDa, 50 kDa 내지 60 kDa, 60 kDa 내지 150 kDa, 70 kDa 내지 150 kDa, 80 kDa 내지 150 kDa, 90 kDa 내지 150 kDa, 100 kDa 내지 150 kDa, 110 kDa 내지 150 kDa, 120 kDa 내지 150 kDa, 130 kDa 내지 150 kDa, 또는 140 kDa 내지 150 kDa)의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 음이온성 중합체는 15 kDa 내지 50 kDa (예를 들어, 15 kDa 내지 45 kDa, 15 kDa 내지 40 kDa, 15 kDa 내지 35 kDa, 15 kDa 내지 30 kDa, 15 kDa 내지 25 kDa, 15 kDa 내지 20 kDa, 20 kDa 내지 50 kDa, 25 kDa 내지 50 kDa, 30 kDa 내지 50 kDa, 35 kDa 내지 50 kDa, 40 kDa 내지 50 kDa, 또는 45 kDa 내지 50 kDa)의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 10:1 내지 120:1, 예를 들어, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 110:1, 또는, 120:1; 10:1 내지 110:1, 10:1 내지 100:1, 10:1 내지 90:1, 10:1 내지 80:1, 10:1 내지 70:1, 10:1 내지 60:1, 10:1 내지 50:1, 10:1 내지 40:1, 10:1 내지 30:1, 10:1 내지 20:1, 20:1 내지 120:1, 30:1 내지 120:1, 40:1 내지 120:1, 50:1 내지 120:1, 60:1 내지 120:1, 70:1 내지 120:1, 80:1 내지 120:1, 90:1 내지 120:1, 100:1 내지 120:1, 또는 110:1 내지 120:1에서의 음이온성 중합체:Cas 단백질의 몰비를 갖는다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시로서 제공되며, 제한으로서 제공되는 것이 아니다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본질적으로 동일하거나 또는 유사한 결과를 산출하도록 변화되거나 또는 변형될 수 있는 다양한 비-임계 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.
실시예 1 - 방법
세포 배양
1차 성인 세포를 건강한 인간 공여자로부터 트리마 악셀(Trima Accel) 성분채집 후 백혈구 제거 챔버 잔류물로부터 획득하였다. 말초 혈액 단핵구 세포를 셉메이트(SepMate) 튜브 (스템셀(STEMCELL), 제조업체의 지시에 따름)를 사용하는 피콜-파케(Ficoll-Paque) (지이 헬스케어(GE Healthcare)) 원심분리에 의해 단리하였다. 이어서, 림프구를 이지셉(EasySep) 벌크 (CD3+) T 세포 단리 키트 (스템셀, 제조업체의 지시에 따름)를 사용하여 자기 음성 선택에 의해 추가로 단리하였다.
단리된 T 세포를 활성화시키고 2일 동안 75만개 세포 ml-1로 5% 소 태아 혈청, 50μM 2-메르캅토에탄올, 10mM N-아세틸 L-시스테인, 1:1의 비드 대 세포 비율에서의 항-인간 CD3/CD28 자기 다이나비즈(Dynabeads) (써모 피셔(Thermo Fisher)), 및 500U ml-1에서의 IL-2 (유씨에스에프 파마시(UCSF Pharmacy)), 5ng ml-1에서의 IL-7 (알앤디 시스템즈(R&D Systems)), 및 = 5ng ml-1에서의 IL-15 (알앤디 시스템즈)의 시토카인 칵테일을 포함하는 엑스비보15(XVivo15) 배지 (론자(Lonza))에서 배양하였다. 활성화된 T 세포를 그의 배양 용기로부터 수집하였고, 다이나비즈를 세포를 이지셉 세포 분리 자석 (스템셀) 상에 5분 동안 배치함으로써 제거하였다.
RNP 제제
Cas9 RNP를 전기천공 직전에 제제화하였다. 합성 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA)를 화학적으로 합성하고 (다마콘(Dharmacon)), 160μM의 농도로 IDT 이중체 완충제 중에서 재현탁시키고, -80℃에서 분취량으로 저장하였다. gRNA를 제조하기 위해, crRNA 및 tracrRNA의 분취량을 해동시키고, 1:1 v/v로 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션에 의해 어닐링하여 80μM gRNA 용액을 형성하였다. Cas9-NLS를 유니버시티 오브 캘리포니아 버클리 QB3 마크로랩(University of California Berkeley QB3 MacroLab)으로부터 구입하였다. RNP를 제조하기 위해, gRNA를 1:1 v/v로 40μM Cas9-NLS 단백질과 혼합하여 2:1 몰비의 gRNA:Cas9를 달성하였다. 5-50kDa PGA (시그마(Sigma))를 100mg ml-1로 물 중에서 재현탁시키고, 멸균 여과하고, 1:0.8:1의 gRNA:PGA:Cas9의 최종 부피 비율을 위해 Cas9 단백질과 복합체화하기 전에 신선하게 제조된 gRNA와 0.8:1 부피 비율로 혼합하였다.
HDR 주형 생성
좌측 및 우측 상동성 아암 플랭킹 P2A-BCMA-CAR-P2A 삽입물을 코딩하는 긴 이중 가닥 HDR 주형을 pUC19 플라스미드로 클로닝하였으며, 이는 이어서 PCR 앰플리콘을 생성하기 위한 주형으로서 역할을 하였다. 좌측 및 우측 상동성 아암 +/- 추가적인 gRNA-특이적 셔틀을 표적화하는 PCR 프라이머를 카파 하이파이(KAPA HiFi) 폴리머라제 (카파 바이오시스템즈(Kapa Biosystems))를 사용하여 HDRT를 증폭시키는 데 사용하였다. ssDNA의 생성을 위해, 5'비오티닐화를 역 프라이머 상에 포함시켰다. PCR 산물을 SPRI 비드 정리에 의해 정제하고, 나노드롭(NanoDrop) 분광광도계 (써모 피셔) 상에서 흡광에 의해 측정된 0.5-2μg μl-1로 물 중에서 재현탁시켰다. ssDNA를 스트렙타비딘-커플링된 자기 비드와 함께 비오티닐화된 PCR 산물을 인큐베이션하고 125 mM NaOH 중에서 변성시킴으로써 생성하였다. 유리 비-비오티닐화된 가닥을 함유하는 상청액을 1X TE 중 pH 5.2, 60 mM 아세트산나트륨 중에서 중화시켰다. ssDNA를 SPRI 비드 정제에 의해 농축시키고 0.5-2μg μl-1로 물 중에서 재현탁시켰다. ssDNA 셔틀 구축물을 1:1:1의 몰비로 상응하는 5' 및 3' 상보적 올리고뉴클레오티드와 함께 긴 ssDNA 백본의 인큐베이션에 의해 생성하였다.
전기천공 및 분석
기재된 몰량으로 HDR 주형을 혼합하고 세포와 혼합하고 그로 전기천공하기 전에 적어도 15분 동안 50 pmol RNP/전기천공과 함께 인큐베이션하였다. 96-웰 포맷 4디-뉴클레오펙터(4D-Nucleofector) (론자)에서의 전기천공 직전에, 세포를 10분 동안 90g에서 원심분리하였고, 배지를 흡입하였고, 세포를 0.75 x 106개 세포당 20μl 완충제를 사용하는 전기천공 완충제 P3 (론자) 중에서 재현탁시켰다. 세포를 펄스 코드 EH-115로 전기천공하였다. 전기천공 직후에, 세포를 80μL의 성장 배지를 전기천공 웰로 직접적으로 첨가하여 구하고, 10-20분 동안 인큐베이션하고, 이어서 제거하고 성장 배지 중에서 0.5-1.0 x 106개 세포 ml-1로 희석시켰다. 추가적인 신선한 성장 배지 및 시토카인을 48시간마다 첨가하였다.
전기천공 후 5일에, 세포를 염색 및 한정된 부피 (웰당 60μL)를 샘플링하여 정량적인 세포 계수를 획득하는 자동화된 96-웰 샘플러 (써모 피셔)를 갖는 아튠 NxT(Attune NxT) 유세포 분석기 상 유세포 분석법을 위해 수집하였다. 세포 분석 데이터를 처리하고 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 사용하여 분석하였다. 녹인 효율을 재조합 BCMA 단백질 (아크로 바이오시스템즈(Acro Biosystems), H82E4) 및 항-Myc (셀 시그널링(Cell Signaling), 9B11)의 조합에 의해 검출된 바와 같이 BCMA-CAR 구축물을 발현하는 살아있는 단일항(singlet) 세포의 백분율로서 계산하였다. 생존율을 비-전기천공된 대조군에서의 살아있는 단일항 세포의 백분율과 비교한 살아있는 단일항 세포의 백분율로서 계산하였다. 녹인 계수를 60 μl의 배지 중에 BCMA-CAR 구축물을 발현하는 살아있는 단일항 세포의 총 개수로서 계산하였다.
결과가 도 2-6에 제시되어 있다. 도 2a-2c는 스크램블 gRNA 또는 G526 gRNA 또는 G526 gRNA + TRAC-CAR rAAV로 전기천공된 T 세포의 rAAV-매개 녹인 및 CAR 및 TCR 유세포 분석법을 보여준다. 도 3a-3c는 ssDNA 셔틀-매개 녹인을 나타낸다. gRNA G526 및 gRNA G527 ssDNA 셔틀 변이체 둘 다는 최대 녹인 효율을 증가시켰고 (도 3a), 세포 생존율을 증가시켰고 (도 3b), 목적하는 유전자 변화로 회복된 세포의 총 개수를 증가시켰다 (도 3c). 추가로, 도 4a 및 4b는 (예를 들어, 내인성 TCR을 표적화하는 항체-코팅된 자기 비드를 사용하는) TCR-음성 선택에 의한 녹인의 풍부화를 나타내며, 이는 가이드 G527이 사용되지만 가이드 G526은 아닐 때 목적하는 녹인을 갖는 세포를 유의하게 풍부화시켰다. 도 6a-6d는 상이한 gRNA를 사용하는 TRAC 유전자좌로의 CRISPR/Cas9-표적화된 통합의 도식적인 표시를 나타낸다. 추가로, 도 6e는 TCR 음성 정제 전 및 그 후에, Cas9 및 TRAC gRNA RNP로 전기천공되고 rAAV로 형질도입된 T 세포의 대표적인 TCR/CAR 유세포 플롯을 나타낸다.
실시예 2 - 다양한 유전자좌에서의 녹아웃 및 녹인의 그의 효율에서 다양한 gRNA 서열의 비교
상기 기재된 방법 후에, 하기 열거된 gRNA 서열을 TRAC 유전자좌, B2M 유전자좌, 또는 CD4 유전자좌에서 녹아웃 TCR, B2M 단백질, 또는 CD4 단백질 및 녹인 GFP에 대한 그의 능력에 대해 시험하였다. 활성화된 T 세포를 Cas9 및 표시된 gRNA로 전기천공하였다. 세포 표면 단백질 파괴를 유세포 분석에 의해 측정하였다. 게놈 커팅 효율을 생어(Sanger) 시퀀싱 및 TIDE 분석에 의해 측정하였다.
TRAC 유전자좌에 대해, TRAC 유전자좌 및 제1 인트론을 표적화하는 gRNA의 도식적인 표시가 도 7a에 제시된다. 도 7b, 표지 (1)은 유세포 분석에 의해 측정된 바와 같은 세포 표면 TCR 파괴를 나타낸다. 도 7b, 표지 (2)는 게놈 커팅 효율을 나타낸다. 추가로, 도 7c는 표시된 gRNA를 사용한 TRAC 유전자좌에서의 GFP 유전자 표적화 효율 및 TCR 파괴를 나타낸다. GFP KI를 유세포 분석에 의해 측정하고 G526 gRNA에 대해 정규화하였다. 세포 표면 TCR 파괴를 유세포 분석에 의해 측정하였다.
B2M 유전자좌에 대해, B2M 유전자좌 및 제1 및 제2 인트론을 표적화하는 gRNA의 도식적인 표시가 도 7d에 제시된다. 세포 표면 B2M 파괴를 유세포 분석에 의해 측정하였다. 게놈 커팅 효율을 생어 시퀀싱 및 TIDE 분석에 의해 측정하였다. 도 7e는 B2M 유전자좌에서의 B2M 단백질 파괴 및 게놈 커팅 효율을 나타낸다. 추가로, 도 7f에 제시된 바와 같이, B2M 엑손 또는 인트론 RNP 및 연관된 NGFR 공여자 주형으로의 T 세포의 전기천공 후 4일차의 대표적인 유세포 플롯은 음성 선택 후 KI 양성 세포의 풍부화를 보여준다. 하단 (인트론) 상태는 B2M 음성 세포에서의 NGFR 양성 세포 (KI 양성)의 풍부화를 나타낸다. 따라서, B2M 음성 선택은 KI 양성 세포의 풍부화를 야기한다.
CD4 유전자좌에 대해, CD4 유전자좌 및 제1 및 제2 인트론을 표적화하는 gRNA의 도식적인 표시가 도 7g에 제시된다.
표 1
Figure pct00001
실시예 3 - 다수의 동시 인트론 녹인
다수의 동시 인트론 녹인을 B2M 인트론 표적화 G576 (서열식별번호: 34) 및 TRAC 인트론 표적화 G527 (서열식별번호: 3)을 사용하여 수행하였다. T 세포를 B2M 인트론 표적화 G576 (서열식별번호: 34)으로 전기천공하고 rAAV에 의해 TRAC 인트론 표적화 G527 (서열식별번호: 3)로 형질도입하였다. 말단절단된-신경 성장 인자 수용체 (NGFR)를 내인성 B2M 인트론으로 삽입하였고 BCMA-CAR을 내인성 TRAC 인트론으로 삽입하였다. 도 10에서의 상단 상태는 풍부화 전에 살아있는 T 세포 중에서 이중 양성 세포 (NGFR 및 BCMA-CAR 양성)를 나타낸다. 도 10에서의 하단 상태는 음성 선택을 통한 TCR-음성 및 B2M-음성 살아있는 T 세포를 선택하는 게이팅 전략을 나타낸다 (즉, TCR 및 B2M-음성 정제를 모방함). 도 10에 제시된 바와 같이, 음성 선택은 비정제된 집단과 비교할 때 이중 양성 세포 (NGFR 및 BCMA-CAR 둘 다를 발현하는 세포)의 20-배 초과의 풍부화를 야기하였다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적인 목적만을 위한 것이고 다양한 변형 또는 변화가 그에 비추어 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제시될 것이고 본 출원의 사상 및 범주 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
약식 서열 목록
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING A TARGET NUCLEIC ACID <130> 1239343 <140> PCT/US2021/022102 <141> 2021-03-12 <150> 62/989,505 <151> 2020-03-13 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1532 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctcactagca ctctatcacg gccatattct ggcagggtca gtggctccaa ctaacatttg 60 tttggtactt tacagtttat taaatagatg tttatatgga gaagctctca tttctttctc 120 agaagagcct ggctaggaag gtggatgagg caccatattc attttgcagg tgaaattcct 180 gagatgtaag gagctgctgt gacttgctca aggccttata tcgagtaaac ggtagtgctg 240 gggcttagac gcaggtgttc tgatttatag ttcaaaacct ctatcaatga gagagcaatc 300 tcctggtaat gtgatagatt tcccaactta atgccaacat accataaacc tcccattctg 360 ctaatgccca gcctaagttg gggagaccac tccagattcc aagatgtaca gtttgctttg 420 ctgggccttt ttcccatgcc tgcctttact ctgccagagt tatattgctg gggttttgaa 480 gaagatccta ttaaataaaa gaataagcag tattattaag tagccctgca tttcaggttt 540 ccttgagtgg caggccaggc ctggccgtga acgttcactg aaatcatggc ctcttggcca 600 agattgatag cttgtgcctg tccctgagtc ccagtccatc acgagcagct ggtttctaag 660 atgctatttc ccgtataaag catgagaccg tgacttgcca gccccacaga gccccgccct 720 tgtccatcac tggcatctgg actccagcct gggttggggc aaagagggaa atgagatcat 780 gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca 840 gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca 900 aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga 960 catgaggtct atggacttca agagcaacag tgctgtggcc tggagcaaca aatctgactt 1020 tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa gacaccttct tccccagccc 1080 aggtaagggc agctttggtg ccttcgcagg ctgtttcctt gcttcaggaa tggccaggtt 1140 ctgcccagag ctctggtcaa tgatgtctaa aactcctctg attggtggtc tcggccttat 1200 ccattgccac caaaaccctc tttttactaa gaaacagtga gccttgttct ggcagtccag 1260 agaatgacac gggaaaaaag cagatgaaga gaaggtggca ggagagggca cgtggcccag 1320 cctcagtctc tccaactgag ttcctgcctg cctgcctttg ctcagactgt ttgcccctta 1380 ctgctcttct aggcctcatt ctaagcccct tctccaagtt gcctctcctt atttctccct 1440 gtctgccaaa aaatctttcc cagctcacta agtcagtctc acgcagtcac tcattaaccc 1500 accaatcact gattgtgccg gcacatgaat ac 1532 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 tcagggttct ggatatctgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ctggatatct gtgggacaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 atctgtggga caagaggatc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 tctgtgggac aagaggatca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 gggacaagag gatcagggtt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 tctttgcccc aacccaggct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 8 ctttgcccca acccaggctg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 tggagtccag atgccagtga 20 <210> 10 <211> 2923 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 10 tggcggaccg gttctggata tctgtcggag ctgctgtgac ttgctcaagg ccttatatcg 60 agtaaacggt agtgctgggg cttagacgca ggtgttctga tttatagttc aaaacctcta 120 tcaatgagag agcaatctcc tggtaatgtg atagatttcc caacttaatg ccaacatacc 180 ataaacctcc cattctgcta atgcccagcc taagttgggg agaccactcc agattccaag 240 atgtacagtt tgctttgctg ggcctttttc ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat 300 attgctgggg ttttgaagaa gatcctatta aataaaagaa taagcagtat tattaagtag 360 ccctgcattt caggtttcct tgagtggcag gccaggcctg gccgtgaacg ttcactgaaa 420 tcatggcctc ttggccaaga ttgatagctt gtgcctgtcc ctgagtccca gtccatcacg 480 agcagctggt ttctaagatg ctatttcccg tataaagcat gagaccgtga cttgccagcc 540 ccacagagcc ccgcccttgt ccatcactgg catctggact ccagcctggg ttggggcaaa 600 gagggaaatg agatcatgtc ctaaccctgg aattggatcc tcttgtctta cagatggatc 660 tggagcaaca aacttctcac tactcaaaca agcaggtgac gtggaggaga atcccggccc 720 catggcactt ccagtaactg cgctgctgct cccgctcgca ctcctgctgc atgcggcccg 780 accagaacag aagcttatct ctgaagagga tcttcaggtc caactcgttc agtccggcgc 840 ggaagtaaaa aaacctggag cgtcagttaa agtatcctgt aaggcgagtg gatattcatt 900 tcccgattat tacattaatt gggtgcgaca agcgcctggt cagggtcttg aatggatggg 960 atggatatac ttcgcgtctg ggaatagtga atacaatcag aaatttaccg gcagggtgac 1020 gatgacgcga gacacctcca ttaatactgc ctatatggaa ctcagctctc tcacttcaga 1080 ggacacagcc gtctacttct gtgcctccct ttatgattac gattggtatt ttgacgtgtg 1140 gggtcaagga actatggtta ctgtgtctag cgggggaggt ggctcaggtg ggggaggttc 1200 aggaggaggc gggtccgaca tcgtgatgac acaaacccct ctgagcctga gcgttacgcc 1260 agggcaacca gcctccattt catgcaagtc cagccagtca ctcgtgcatt caaatggaaa 1320 cacctatctg cactggtatc ttcaaaaacc aggtcagtca ccccagttgt tgatatacaa 1380 agttagtaat cgcttctccg gagtacccga tcggttcagc gggtctggtt cagggacgga 1440 tttcaccttg aaaattagcc gagttgaggc tgaagatgtg ggaatttact attgcagtca 1500 gagcagcatt tacccctgga cgttcgggca gggcaccaag ttggaaatta aggcggccgc 1560 aattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag aagagcaatg gaaccattat 1620 ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt 1680 ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc 1740 ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa 1800 catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg 1860 cgacttcgca gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta 1920 ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga 1980 tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa 2040 ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga 2100 gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct 2160 cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcgg 2220 aagcggagct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg 2280 acccaatatc cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg agagactcta aatccagtga 2340 caagtctgtc tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga 2400 ttctgatgtg tatatcacag acaaaactgt gctagacatg aggtctatgg acttcaagag 2460 caacagtgct gtggcctgga gcaacaaatc tgactttgca tgtgcaaacg ccttcaacaa 2520 cagcattatt ccagaagaca ccttcttccc cagcccaggt aagggcagct ttggtgcctt 2580 cgcaggctgt ttccttgctt caggaatggc caggttctgc ccagagctct ggtcaatgat 2640 gtctaaaact cctctgattg gtggtctcgg ccttatccat tgccaccaaa accctctttt 2700 tactaagaaa cagtgagcct tgttctggca gtccagagaa tgacacggga aaaaagcaga 2760 tgaagagaag gtggcaggag agggcacgtg gcccagcctc agtctctcca actgagttcc 2820 tgcctgcctg cctttgctca gactgtttgc cccttactgc tcttctaggc ctcattctaa 2880 gccccttctc caagtcctac agatatccag aaccgagatg gtg 2923 <210> 11 <211> 2923 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 11 tggcggacca tatctgtggg acaagcggag ctgctgtgac ttgctcaagg ccttatatcg 60 agtaaacggt agtgctgggg cttagacgca ggtgttctga tttatagttc aaaacctcta 120 tcaatgagag agcaatctcc tggtaatgtg atagatttcc caacttaatg ccaacatacc 180 ataaacctcc cattctgcta atgcccagcc taagttgggg agaccactcc agattccaag 240 atgtacagtt tgctttgctg ggcctttttc ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat 300 attgctgggg ttttgaagaa gatcctatta aataaaagaa taagcagtat tattaagtag 360 ccctgcattt caggtttcct tgagtggcag gccaggcctg gccgtgaacg ttcactgaaa 420 tcatggcctc ttggccaaga ttgatagctt gtgcctgtcc ctgagtccca gtccatcacg 480 agcagctggt ttctaagatg ctatttcccg tataaagcat gagaccgtga cttgccagcc 540 ccacagagcc ccgcccttgt ccatcactgg catctggact ccagcctggg ttggggcaaa 600 gagggaaatg agatcatgtc ctaaccctgg aattggatcc tcttgtctta cagatggatc 660 tggagcaaca aacttctcac tactcaaaca agcaggtgac gtggaggaga atcccggccc 720 catggcactt ccagtaactg cgctgctgct cccgctcgca ctcctgctgc atgcggcccg 780 accagaacag aagcttatct ctgaagagga tcttcaggtc caactcgttc agtccggcgc 840 ggaagtaaaa aaacctggag cgtcagttaa agtatcctgt aaggcgagtg gatattcatt 900 tcccgattat tacattaatt gggtgcgaca agcgcctggt cagggtcttg aatggatggg 960 atggatatac ttcgcgtctg ggaatagtga atacaatcag aaatttaccg gcagggtgac 1020 gatgacgcga gacacctcca ttaatactgc ctatatggaa ctcagctctc tcacttcaga 1080 ggacacagcc gtctacttct gtgcctccct ttatgattac gattggtatt ttgacgtgtg 1140 gggtcaagga actatggtta ctgtgtctag cgggggaggt ggctcaggtg ggggaggttc 1200 aggaggaggc gggtccgaca tcgtgatgac acaaacccct ctgagcctga gcgttacgcc 1260 agggcaacca gcctccattt catgcaagtc cagccagtca ctcgtgcatt caaatggaaa 1320 cacctatctg cactggtatc ttcaaaaacc aggtcagtca ccccagttgt tgatatacaa 1380 agttagtaat cgcttctccg gagtacccga tcggttcagc gggtctggtt cagggacgga 1440 tttcaccttg aaaattagcc gagttgaggc tgaagatgtg ggaatttact attgcagtca 1500 gagcagcatt tacccctgga cgttcgggca gggcaccaag ttggaaatta aggcggccgc 1560 aattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag aagagcaatg gaaccattat 1620 ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt ctaagccctt 1680 ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc 1740 ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa 1800 catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg 1860 cgacttcgca gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta 1920 ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga 1980 tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa 2040 ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga 2100 gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct 2160 cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcgg 2220 aagcggagct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg 2280 acccaatatc cagaaccctg accctgccgt gtaccagctg agagactcta aatccagtga 2340 caagtctgtc tgcctattca ccgattttga ttctcaaaca aatgtgtcac aaagtaagga 2400 ttctgatgtg tatatcacag acaaaactgt gctagacatg aggtctatgg acttcaagag 2460 caacagtgct gtggcctgga gcaacaaatc tgactttgca tgtgcaaacg ccttcaacaa 2520 cagcattatt ccagaagaca ccttcttccc cagcccaggt aagggcagct ttggtgcctt 2580 cgcaggctgt ttccttgctt caggaatggc caggttctgc ccagagctct ggtcaatgat 2640 gtctaaaact cctctgattg gtggtctcgg ccttatccat tgccaccaaa accctctttt 2700 tactaagaaa cagtgagcct tgttctggca gtccagagaa tgacacggga aaaaagcaga 2760 tgaagagaag gtggcaggag agggcacgtg gcccagcctc agtctctcca actgagttcc 2820 tgcctgcctg cctttgctca gactgtttgc cccttactgc tcttctaggc ctcattctaa 2880 gccccttctc caagtcctct tgtcccacag atatgagatg gtg 2923 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Ala Val Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys 1 5 10 15 Lys Lys Leu Asp 20 <210> 13 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 13 Met Ser Arg Arg Arg Lys Ala Asn Pro Thr Lys Leu Ser Glu Asn Ala 1 5 10 15 Lys Lys Leu Ala Lys Glu Val Glu Asn 20 25 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 14 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Lys Leu Lys Ile Lys Arg Pro Val Lys 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 actaccgttt actcgatata 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 tcgagtaaac ggtagtgctg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 tagtgctggg gcttagacgc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 atgggaggtt tatggtatgt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 ctgggcatta gcagaatggg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 ctaatgccca gcctaagttg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 gtacatcttg gaatctggag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 aactctggca gagtaaaggc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 ctgccagagt tatattgctg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 gtgaacgttc actgaaatca 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 agctatcaat cttggccaag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 caggcacaag ctatcaatct 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 tttggcctac ggcgacggga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 30 cgataagcgt cagagcgccg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 31 gcatgactag accatccatg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 gtgattgctg taaactagcc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 tagtttacag caatcacctg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 ggacccgata aaatacaaca 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 catagcaatt gctctatacg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 ttcctaagtg gatcaaccca 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 ggaatgctat gagtgctgag 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 gaagctgcca caaaagctag 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 actgaacgaa catctcaaga 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 attgtttaga gctacccagc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 aaggtctagt tctatcaccc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 tatgtataat cctagcactg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 gtacgtgtac gacagtgtgt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 agcacttggg ctaagaacca 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 tcagtcctca acttaatacg 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 agaccatcct gctagcatgg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 tctcgacttc gtgatcagcc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 acctgtattc ccaacgacac 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 tgtattccca acgacacagg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 gggtttctct gattagaacg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 51 catccctcac ctgatcaaga 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 taagtcacat aagcacccag 20

Claims (36)

  1. 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물이며, 여기서 gRNA는 CTGGATATCTGTGGGACAAG (서열식별번호: 3), ATCTGTGGGACAAGAGGATC (서열식별번호: 4), TCTGTGGGACAAGAGGATCA (서열식별번호: 5), GGGACAAGAGGATCAGGGTT (서열식별번호: 6), TCTTTGCCCCAACCCAGGCT (서열식별번호: 7), CTTTGCCCCAACCCAGGCTG (서열식별번호: 8), TGGAGTCCAGATGCCAGTGA (서열식별번호: 9), actaccgtttactcgatata (서열식별번호: 17), tcgagtaaacggtagtgctg (서열식별번호: 18), tagtgctggggcttagacgc (서열식별번호: 19), ATGGGAGGTTTATGGTATGT (서열식별번호: 20), CTGGGCATTAGCAGAATGGG (서열식별번호: 21), CTAATGCCCAGCCTAAGTTG (서열식별번호: 22), GTACATCTTGGAATCTGGAG (서열식별번호: 23), AACTCTGGCAGAGTAAAGGC (서열식별번호: 24), CTGCCAGAGTTATATTGCTG (서열식별번호: 25), GTGAACGTTCACTGAAATCA (서열식별번호: 26), AGCTATCAATCTTGGCCAAG (서열식별번호: 27), 또는 CAGGCACAAGCTATCAATCT (서열식별번호: 28)의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  2. 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물이며, 여기서 gRNA는 TTTGGCCTACGGCGACGGGA (서열식별번호: 29), CGATAAGCGTCAGAGCGCCG (서열식별번호: 30), GCATGACTagaccatccatg (서열식별번호: 31), GTGATTGCTGTAAACTAGCC (서열식별번호: 32), TAGTTTACAGCAATCACCTG (서열식별번호: 33), ggacccgataaaatacaaca (서열식별번호: 34), catagcaattgctctatacg (서열식별번호: 35), TTCCTAAGTGGATCAACCCA (서열식별번호: 36), GGAATGCTATGAGTGCTGAG (서열식별번호: 37), GAAGCTGCCACAAAAGCTAG (서열식별번호: 38), ACTGAACGAACATCTCAAGA (서열식별번호: 39), 또는 ATTGTTTAGAGCTACCCAGC (서열식별번호: 40)의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  3. 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물이며, 여기서 gRNA는 aaggtctagttctatcaccc (서열식별번호: 41), tatgtataatcctagcactg (서열식별번호: 42), gtacgtgtacgacagtgtgt (서열식별번호: 43), AGCacttgggctaagaacca (서열식별번호: 44), tcagtcctcaacttaatacg (서열식별번호: 45), agaccatcctgctagcatgg (서열식별번호: 46), tctcgacttcgtgatcagcc (서열식별번호: 47), acctgtattcccaacgacac (서열식별번호: 48), tgtattcccaacgacacagg (서열식별번호: 49), GGGTTTCTCTGATTAGAACG (서열식별번호: 50), CATCCCTCACCTGATCAAGA (서열식별번호: 51), 또는 TAAGTCACATAAGCACCCAG (서열식별번호: 52)의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상동성-지정-복구 주형 (HDRT)을 추가로 포함하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 적어도 1개의 Cas 단백질 표적 서열이 HDRT에 융합되는 것인 조성물.
  6. 가이드 RNA (gRNA) 및 적어도 1개의 Cas 단백질 표적 서열에 융합되는 HDRT를 포함하는 조성물이며, 여기서 gRNA는 TCAGGGTTCTGGATATCTGT (서열식별번호: 2)의 서열을 포함하고 Cas 단백질 표적 서열은 상보적 폴리뉴클레오티드 서열과 이중 가닥 이중체를 형성하는 것인 조성물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 Cas 단백질 표적 서열이 HDRT에 융합되는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 제1 Cas 단백질 표적 서열이 HDRT의 5' 말단에 융합되고 제2 Cas 단백질 표적 서열이 HDRT의 3' 말단에 융합되는 것인 조성물.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질 표적 서열이 상보적 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화되어 이중 가닥 이중체를 형성하는 것인 조성물.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, HDRT가 단일 가닥 HDRT인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Cas 단백질을 추가로 포함하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, Cas 단백질이 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, 또는 그의 변이체인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, Cas 단백질이 Cas9 뉴클레아제인 조성물.
  14. 제4항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, HDRT가 서열식별번호: 10 또는 11의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온성 중합체를 포함하는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 음이온성 중합체가 폴리글루탐산 (PGA), 폴리아스파르트산, 또는 폴리카르복시글루탐산을 포함하는 것인 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 조성물을 T 세포로 도입하는 것을 포함하는, T 세포에서 내인성 세포 표면 단백질을 CAR 또는 외인성 단백질로 변형시키는 방법이며, 여기서 CAR 또는 외인성 단백질은 내인성 세포 표면 단백질 게놈 유전자좌로 통합되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 내인성 세포 표면 단백질이 내인성 TCR인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 외인성 단백질이 외인성 세포내 단백질 또는 외인성 세포 표면 단백질인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 외인성 세포 표면 단백질이 외인성 TCR인 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 세포 표면 단백질 게놈 유전자좌가 T 세포 수용체 알파 불변 쇄 (TRAC) 게놈 유전자좌인 방법.
  22. 제17항에 있어서, 내인성 세포 표면 단백질이 내인성 베타-2 마이크로글로불린 (B2M)인 방법.
  23. 제17항 또는 제22항에 있어서, 내인성 세포 표면 단백질 게놈 유전자좌가 B2M 게놈 유전자좌인 방법.
  24. 제17항에 있어서, 내인성 세포 표면 단백질이 내인성 CD4인 방법.
  25. 제17항 또는 제24항에 있어서, 내인성 세포 표면 단백질 게놈 유전자좌가 CD4 게놈 유전자좌인 방법.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 도입이 전기천공을 포함하는 것인 방법.
  27. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 도입이 바이러스 전달을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 바이러스 전달이 재조합 아데노-연관 바이러스 (rAAV)의 사용을 포함하는 것인 방법.
  29. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 세포 표면 단백질을 발현하지 않는 T 세포를 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 선택이 항체-코팅된 자기 비드를 사용하여 선택하는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 하기 단계를 포함하는, T 세포의 집단으로부터 변형된 T 세포를 선택하는 방법이며, 여기서 T 세포의 적어도 일부에서 내인성 세포 표면 단백질은 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 외인성 단백질로 대체된 것인 방법:
    (1) T 세포의 집단을 포함하는 용액을 T 세포의 내인성 세포 표면 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (2) 용액으로부터 항체-결합된 T 세포를 분리하는 단계 및
    (3) 남아 있는 용액을 별개의 용기로 이동시키는 단계이며, 여기서 이동 후, 용액은 내인성 세포 표면 단백질이 CAR 또는 외인성 단백질로 대체된 변형된 T 세포가 풍부한 것인 단계.
  32. 제31항에 있어서, 내인성 세포 표면 단백질이 내인성 TCR인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 외인성 단백질이 외인성 세포내 단백질 또는 외인성 세포 표면 단백질인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 외인성 세포 표면 단백질이 외인성 TCR인 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 고체 지지체에 결합된 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 고체 지지체가 자기 비드인 방법.
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