JP2023519819A - 標的核酸を改変するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、細胞（例えばT細胞）における内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）をCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））で改変するための組成物および方法を提供する。TIFF2023519819000019.tif24170

Description

関連出願の相互参照
本願は、2020年3月13日に出願された米国仮出願第62/989,505号に基づく優先権を主張し、その内容は、参照によりあらゆる目的で、そのまま本明細書に組み入れられる。

本開示の背景
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）（CRISPR）およびCRISPR関連（Cas）タンパク質の応用は、ゲノム編集を可能にすることにより、分子生物学に革命を起こした。CRISPRによる遺伝子編集は、新しい科学的ツールを生み出し、臨床上問題となる変異を矯正し、新しい細胞ベースの免疫療法を工学的に作出する潜在力を持つ、強力で実用的なツールである。

本開示の概要
一局面において、本開示は、配列

を含むガイドRNA（gRNA）を含む組成物を特徴とする。

別の一局面において、本開示は、配列

を含むガイドRNA（gRNA）を含む組成物を提供する。

別の一局面において、本開示は、配列

を含むガイドRNA（gRNA）を含む組成物を提供する。

上記局面のいくつかの態様において、本組成物は相同組換え修復テンプレート（homology-directed-repair template:HDRT）をさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも1つのCasタンパク質標的配列がHDRTに融合している。

別の一局面において、本開示は、ガイドRNA（gRNA）と少なくとも1つのCasタンパク質標的配列に融合しているHDRTとを含む組成物であって、gRNAが

の配列を含み、Casタンパク質標的配列が相補的ポリヌクレオチド配列との二本鎖デュプレックス（double-stranded duplex）を形成する、組成物を提供する。

いくつかの態様では、2つのCasタンパク質標的配列がHDRTに融合している。特定の態様では、第1のCasタンパク質標的配列がHDRTの5'末端に融合しており、第2のCasタンパク質標的配列がHDRTの3'末端に融合している。特定の態様において、Casタンパク質標的配列は、相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズして二本鎖デュプレックスを形成する。

特定の態様において、HDRTは一本鎖HDRTである。

いくつかの態様において、本組成物は、Casタンパク質（例えばCas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1およびCsx12としても知られる）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、またはそれらのバリアント）を、さらに含む。

いくつかの態様において、Casタンパク質はCas9ヌクレアーゼである。

いくつかの態様において、HDRTはSEQ ID NO:10または11の配列を含む。

特定の態様において、本組成物はアニオン性ポリマーを含む。特定の態様において、アニオン性ポリマーは、ポリグルタミン酸（PGA）、ポリアスパラギン酸、またはポリカルボキシグルタミン酸を含む。

別の一局面において、本開示は、細胞（例えばT細胞）における内在性細胞表面タンパク質を、CARまたは外因性タンパク質で改変するための方法であって、本明細書に記載する組成物を前記細胞（例えばT細胞）中に導入する工程を含み、前記CARまたは外因性タンパク質が内在性細胞表面タンパク質ゲノム座位に組み込まれる方法を提供する。

この局面のいくつかの態様において、内在性細胞表面タンパク質は内在性TCRである。特定の態様において、外因性タンパク質は外因性細胞内または細胞表面タンパク質である。この局面のいくつかの態様において、外因性細胞表面タンパク質は外因性TCRである。いくつかの態様において、内在性細胞表面タンパク質ゲノム座位はT細胞受容体α定常鎖（TRAC）ゲノム座位である。いくつかの態様において、内在性細胞表面タンパク質は内在性β2ミクログロブリン（B2M）である。特定の態様において、内在性細胞表面タンパク質ゲノム座位はB2Mゲノム座位である。いくつかの態様において、内在性細胞表面タンパク質は内在性CD4である。特定の態様において、内在性細胞表面タンパク質ゲノム座位はCD4ゲノム座位である。

この局面のいくつかの態様において、導入する工程はエレクトロポレーションを含む。

この局面のいくつかの態様において、導入する工程はウイルス送達を含む。いくつかの態様において、ウイルス送達は組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の使用を含む。

いくつかの態様において、本方法は、内在性細胞表面タンパク質を発現しない細胞（例えばT細胞）を選択する工程をさらに含む。特定の態様において、選択する工程は、抗体被覆磁性ビーズを用いて選択する工程を含む。

別の一局面において、本開示は、細胞の集団（例えばT細胞の集団）から改変細胞（例えば改変T細胞）を選択するための方法であって、前記細胞（例えばT細胞）の少なくとも一部において内在性細胞表面タンパク質がキメラ抗原受容体（CAR）または外因性タンパク質で置き換えられており、（1）細胞の集団（例えばT細胞の集団）を含む溶液を、細胞（例えばT細胞）の内在性細胞表面タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させる工程、および（2）抗体が結合している細胞（例えば抗体が結合しているT細胞）を前記溶液から分離する工程、および（3）残りの溶液を別の容器に移す工程を含み、前記移す工程後の溶液では、内在性細胞表面タンパク質がCARまたは外因性タンパク質で置き換えられている改変細胞（例えば改変T細胞）が濃縮されている、方法を提供する。

いくつかの態様において、内在性細胞表面タンパク質は内在性TCRである。

特定の態様において、外因性タンパク質は外因性細胞内または細胞表面タンパク質である。いくつかの態様において、外因性細胞表面タンパク質は外因性TCRである。

いくつかの態様において、内在性細胞表面タンパク質は内在性B2Mまたは内在性CD4である。

いくつかの態様において、抗体は固体支持体に結合される。特定の態様において、固体支持体は磁性ビーズである。

本願は以下の図面を含む。図面は、本組成物および方法の特定の態様および/または特徴を例示すること、ならびに本組成物および方法の説明を補うことを意図している。図面は、その旨を明示する記載がある場合を除き、本組成物および方法の範囲を限定しない。

図1A～図1C:内在性TRAC座位にCARまたは外因性TCRを導入するためのノックイン戦略。図1Aは、エクソン6に隣接するTRAC座位、gRNA G526およびgRNA G527標的配列の位置、ならびに左および右相同性アーム（それぞれLHAおよびRHA）を表す。図1Bおよび図1Cは、Casタンパク質標的配列（図1B）またはrAAV媒介送達（図1C）を使ったB細胞成熟抗原（BCMA）-CARノックインのためのHDRTデザインを表す。P2A＝自己切断ペプチド、CBS＝選択したgRNAに相補的なCas9結合部位、ITR＝長末端反復。 図2A～図2C:rAAV媒介ノックイン。図2Aは、スクランブルgRNAまたはG526 gRNAをエレクトロポレーションしたT細胞、またはG526 gRNA＋TRAC-CAR rAAVのT細胞の、CARおよびTCRフローサイトメトリー解析を表す。図2Bは、高いノックイン効率が複数のドナーで再現可能であることを表す。図2Cは、イントロンの一部分を標的とするgRNA G527により、TCR陰性集団においてCAR＋T細胞が濃縮されうることを表す。 図3A～図3C:ssDNAシャトル媒介ノックイン。gRNA G526およびgRNA G527のssDNAシャトルバリアントはどちらも、最大ノックイン効率を増加させ（図3A）、細胞生存率を増加させ（図3B）、所望の遺伝子変化を伴って回収される細胞の総数を増加させた（図3C）。 図3Aの説明を参照。 図3Aの説明を参照。 図4Aおよび図4B:TCR陰性選択によるノックインの濃縮。ガイドG527を使用した場合、TCR陰性選択は、所望のノックインを持つ細胞を有意に濃縮するが、ガイドG526を使用した場合はそうではない。 図4Aの説明を参照。 図5:SEQ ID NO:2～9のgRNAを使ったTRAC座位へのCRISPR/Cas9標的組込みの概略図。 図6Aおよび図6B:TRAC座位へのCRISPR/Cas9標的組込みの概略図。ターゲティングコンストラクトは、スプライスアクセプター（SA）と、それに続く2A切断ペプチド、コード配列である1928z CAR遺伝子およびポリA配列を含有し、それらに、TRAC座位に相同な配列（LHAおよびRHA:左および右相同性アーム）が隣接している。組み込まれると、内在性TCRαプロモーターがCAR発現を駆動すると共に、TRAC座位は破壊される。TRAV:TCRアルファ可変領域。TRAJ:TCRアルファ連結領域。2A:自己切断ブタテッショウウイルス2A配列。pA:ウシ成長ホルモンポリA配列。 図6Aの説明を参照。 図6Cおよび6D:座位中の異なる領域を標的とするgRNAを使ったTRAC座位へのCRISPR/Cas9標的組込みの概略図。 図6Cの説明を参照。 図6E:Cas9およびTRAC gRNA RNPをエレクトロポレーションしrAAVによる形質導入を行ったT細胞の、TCR陰性精製前後の、代表的なTCR/CARフロープロット。 図7Aは、TRAC座位と、その第1イントロンを標的とするgRNAの概略図である。 図7Bは、フローサイトメトリーによって測定される細胞表面のTCR破壊およびゲノム切断効率を表す。 図7Cは、表示のgRNAによるTRAC座位におけるGFP遺伝子ターゲティング効率およびTCR破壊を表す。 図7Dは、B2M座位と、その第1イントロンおよび第2イントロンを標的とするgRNAの概略図である。 図7Eは、B2Mタンパク質破壊およびB2M座位におけるゲノム切断効率を表す。 図7Fは、B2MエクソンまたはイントロンRNPおよび関連NGFRドナーテンプレートをT細胞にエレクトロポレーションした4日後の代表的なフロープロットを表す。下側の（イントロン）条件は、B2M陰性細胞におけるNGFR陽性細胞（KI陽性）の濃縮を表す。このようにB2M陰性選択はKI陽性細胞の濃縮をもたらす。 図7Gは、CD4座位と、その第1イントロンおよび第2イントロンを標的とするgRNAの概略図である。 図8Aは、TRAC座位におけるイントロンgRNAまたはエクソンgRNAによるKIの概略図である。 図8Bは、表示のgRNAおよびドナーテンプレートで工学的に操作されたT細胞のフロープロットの概略を表す。最下行は、TCR陰性選択後の、CAR陽性細胞の改良された濃縮を表す。 図9A～9Cは、異なるイントロンKI戦略の概略図である。SA:スプライスアクセプター、SD:スプライスドナー、2A:切断ペプチド、赤いバー:停止コドン、LHA:左相同性アーム、RHA:右相同性アーム。 図9Aの説明を参照。 図9Aの説明を参照。 図10は、切断型神経成長因子受容体（NGFR）（B2MイントロンターゲティングG576（SEQ ID NO:34）によるノックイン）とBCMA-CAR（TRACイントロンターゲティングG527（SEQ ID NO:3）によるノックイン）の両方を発現する細胞についての、陰性選択濃縮の代表的なフロープロットを表す。

本開示の詳細な説明
以下の説明では、本組成物および方法のさまざまな局面および態様を具陳する。どの特定態様も組成物および方法の範囲を画定しようとするものではない。むしろ、これらの態様は、開示される組成物および方法の範囲内に少なくとも含まれるさまざまな組成物および方法の、非限定的な例を提供するにすぎない。以下の説明は、当業者の観点から読まれるべきであり、したがって当業者に周知の情報は、必ずしも含まれていない。

I. 序論
本明細書には、キメラ抗原受容体（CAR）または外因性タンパク質（例えば外因性細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））による、内在性細胞表面タンパク質（例えばT細胞受容体（TCR））の、高効率な標的置き換えのための組成物および方法が記載されている。CARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））の組込み（ノックイン）は、それと同時に、内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）の発現を除去する（ノックアウト）。したがって、内在性細胞表面タンパク質陰性細胞を選択すれば、それぞれが治療的応用にとって望ましい内在性細胞表面タンパク質ノックアウトとCARまたは外因性タンパク質ノックインとの両方を有する細胞を濃縮することができる。陰性選択によって改変細胞を濃縮するには、ノックアウトされる内在性遺伝子が細胞表面タンパク質をコードしていなければならない。ノックインされる外因性遺伝子は、任意の外因性タンパク質、例えば任意の細胞内タンパク質または細胞表面タンパク質（例えばTCR）をコードすることができる。特定の態様において、本明細書に記載するように、陰性選択による改変細胞の濃縮には、外因性細胞内タンパク質を含有する改変細胞の濃縮において、ユニークな利点がある。というのも、そのような改変細胞は陽性選択では選択することができないからである。

所望のCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））の発現を生じさせることに加えて、内在性細胞表面タンパク質の同時ノックアウトは、潜在的オフターゲット効果を低減し、自己免疫疾患を持つ患者など、これまでは除外されていた患者へも治療を広げ、同種移植における移植片対宿主病（GVHD）の可能性を低減する。さまざまなイントロンKI戦略の概略図を図9A～9Cに示す。図9Aは、エクソンの5'末端に近いイントロンKI戦略の一例を示す。導入遺伝子の配列はエクソンに並置され、新規スプライスアクセプターが付加される。図9Bは、エクソンの3'末端に近いイントロンKI戦略の一例を示す。導入遺伝子の配列はエクソンに並置され、新規スプライスドナーが付加される。図9Cは、イントロンの中間におけるイントロンKI戦略の一例を示し、この場合はスプライスアクセプターとスプライスドナーが転写産物に新しいエクソンを付加する。図9A～9Cに示す3つの例の場合、上側のドナーテンプレートコンストラクトは、内在性遺伝子転写調節が保たれるように、2A配列に挟まれた導入遺伝子を含む。下側のドナーテンプレートコンストラクトは、停止コドンおよびポリアデニル化配列で、翻訳および転写を終結する。

所望の遺伝子変化は、内在性細胞表面タンパク質座位（例えばT細胞受容体α定常鎖（TRAC）ゲノム座位（図1A））内の選ばれたgRNA配列に二本鎖切断または一本鎖切断を導入するCasタンパク質（例えばCas9タンパク質）およびガイドRNA（gRNA）リボヌクレオタンパク質（RNP）の導入によって刺激される。この切断の修復は、相同なDNAテンプレートを利用して修復結果を導く相同組換え修復（HDR）によって進行するか、または周辺塩基の挿入もしくは欠失（インデル）につながる誤りがちな様式で切断端を直接ライゲートする非相同末端連結（NHEJ）によって進行しうる。NHEJ媒介インデルの効果はgRNA標的配列の場所に依存する。コード配列または近くの構造要素を標的とするgRNAはタンパク質またはmRNA発現を破壊しがちであり、それが、標的である遺伝子のNHEJ媒介ノックアウトにつながる。NHEJ事象とHDR事象とのバランスは、gRNA標的配列の選択と、HDRテンプレート（HDRT）の利用可能性との両方に依存する。

本明細書に記載するように、T細胞への、gRNA標的部位における、CARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））の組込みは、ゲノム切断点を挟む配列に対して相同性を有すると共にCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））インサートを囲む左および右相同性アーム（それぞれLHAおよびRHA）を含むHDRTとの同時送達によって導かれる。いくつかの態様において、CARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））は、内在性細胞表面タンパク質座位（例えばTRAC座位）に、自己切断ペプチド（例えばP2A、E2A、T2AまたはF2A）に続いて、インフレームで組み込まれる（図1Bおよび図1C）。これは、CARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））インサートの発現をもたらすと当時に、内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）の発現を中断させる。

ノックイン効率はHDRTの核内濃度に直接的に相関し、HDRTを組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV、図2A～2C）またはssDNA/dsDNAハイブリッドCas9シャトル（ssDNAシャトル、図3A～3C）のどちらか一方で送達することによって向上させることができる。後者は、上述のように、Casタンパク質標的配列（例えば「シャトル配列」）を含むdsDNA端が付加されたssDNA HDRTを生成させる工程を伴う。これにより、同時送達されたRNPはHDRTに直接結合することが可能になり、HDRTの安定性と核送達が改良される。図3A～3Cに図解するように、この系は、ノックイン効率を有意に増加させると同時に、HDRTの細胞毒性を低減する。上記に加えて、HDRTは、線状ssDNA、線状dsDNA、プラスミドおよび/またはミニサークルDNA、またはウイルスDNA（例えば非組込み型レンチウイルスまたはレトロウイルスゲノムDNA）で送達することもできる。

いくつかの態様では、高レベルのHDRを刺激するが低レベルのNHEJ媒介細胞表面タンパク質（例えばTCR）破壊を示すgRNA標的配列が選ばれる。HDR媒介ノックインは内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）の発現を除去するので、内在性細胞表面タンパク質陰性細胞を選択することにより、HDR事象を濃縮することができる。この濃縮戦略は、内在性細胞表面タンパク質のHDR媒介喪失（所望の結果）を伴う細胞とNHEJ媒介ノックアウトを伴う細胞の混合物をもたらしうる。NHEJ媒介ノックアウトのレベルが低いほど、そのプール内でのHDR:NHEJ事象の比は大きくなり、この戦略によって所望のノックインがより大きく濃縮される。いくつかの態様では、高いHDR:NHEJ事象比で所望のノックインを濃縮するために、ランダムなインデルがタンパク質コード配列または近くの構造要素を破壊しないように、gRNA標的配列の選択は、エクソンから十分な距離を有する。図2～図4は2つの異なるgRNA配列G526とG527からのデータを示している。HDRTが存在しない場合、G526はほとんどすべてのタンパク質発現を破壊し、一方、さらに上流のイントロン領域に配置されるG527は、それより低レベルのタンパク質破壊を呈する（図4Aおよび図4B）。HDRTと組み合わせれば、どちらのgRNAも、ほぼ同等の高効率ノックインを刺激することができる。しかし、内在性細胞表面タンパク質陰性（例えば内在性TCR陰性）集団の選択は、G527でのみ、ノックイン事象を有意に濃縮する（図4Aおよび図4B）。

II. 定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上そうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を包含する。

本明細書にいう「CRISPR-Cas」系は、外来核酸からの防御のための細菌系の一種を指す。CRISPR-Cas系は広範な真正細菌生物および古細菌生物に見いだされる。CRISPR-Cas系にはI型、II型およびIII型のサブタイプが含まれる。野生型II型CRISPR-Cas系は、ガイドおよび活性化RNA（例えばシングルガイドRNAまたはsgRNA）との複合体を形成したRNA依存性ヌクレアーゼ、例えばCas9タンパク質を利用して、外来核酸を、すなわち天然ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含む外来核酸を、認識し、切断する。

本明細書において使用する場合、「二本鎖デュプレックス（double-stranded duplex）」という用語は、互いに相補的であり、水素結合を介して互いにハイブリダイズして二本鎖領域を形成する、ポリヌクレオチドの2つの領域を指す。いくつかの態様において、相補的ポリヌクレオチドの2つの領域は、同じ鎖のポリヌクレオチド分子内にあることができる。別の態様において、相補的ポリヌクレオチドの2つの領域は、複数のポリヌクレオチド分子の別々の鎖に由来することができる。

本明細書において使用する場合、「Casタンパク質標的配列」という用語は、Casタンパク質によって認識され結合されるヌクレオチド配列を指す。Casタンパク質は、gRNAを介して間接的に、Casタンパク質標的配列を認識し、結合することができる。Casタンパク質は、Casタンパク質標的配列にハイブリダイズするgRNAに結合する。いくつかの態様において、Casタンパク質標的配列は標的核酸の一部分である。いくつかの態様において、Casタンパク質標的配列は、15～40（例えば15～35、15～30、15～25、15～20、20～35、25～35、または30～35）ヌクレオチドを有する。いくつかの態様では、Casタンパク質標的配列をシャトル配列ともいう。

本明細書において使用する場合、「ガイドRNA」または「gRNA」という用語は、標的核酸にハイブリダイズすることによってCasタンパク質を標的核酸にガイドすることができるDNAターゲティングRNAを指す。いくつかの態様において、ガイドRNAは、Casタンパク質を標的核酸に向かわせるガイド配列（すなわちシングルガイドRNAのcrRNA相当部分）と、Casタンパク質と相互作用するスキャフォールド配列（すなわちシングルガイドRNAのtracrRNA相当部分）とを含有するシングルガイドRNA（sgRNA）であることができる。別の態様において、ガイドRNAは、Casタンパク質を標的核酸に向かわせるガイド配列（すなわちシングルガイドRNAのcrRNA相当部分）と、Casタンパク質と相互作用するスキャフォールド配列（すなわちシングルガイドRNAのtracrRNA相当部分）という、2つの成分を含むことができる。ガイド配列の一部分は、スキャフォールド配列の一部分にハイブリダイズして二成分ガイドRNAを形成することができる。

本明細書において使用する場合、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド間に生じる水素結合相互作用による相補的核酸のアニーリングを指す。水素結合相互作用は、ワトソン・クリック型水素結合またはフーグスティーン型もしくは逆フーグスティーン型水素結合でありうる。相補的核酸塩基対の例としては、限定するわけではないが、アデニンとチミン、シトシンとグアニン、およびアデニンとウラシルが挙げられ、これらはいずれも水素結合の形成によって対合する。

本明細書において使用する場合、「相補的」または「相補性」という用語は、核酸塩基間、ヌクレオシド間またはヌクレオチド間の塩基対合の能力、およびあるポリヌクレオチドともう一つのポリヌクレオチドの間の塩基対合の能力を指す。いくつかの態様において、あるポリヌクレオチドは、もう一つのポリヌクレオチドに対して、「完全な相補性」を有すること、または「完全に相補的」であることができる。これは、それら2つのポリヌクレオチドを任意でアライメントした場合に、一方のポリヌクレオチド中の各ヌクレオチドが、それぞれに対応する他方のポリヌクレオチド中のヌクレオチドとのワトソン・クリック型塩基対合に関わりうることを意味する。別の態様において、あるポリヌクレオチドは、もう一つのポリヌクレオチドに対して、「部分的相補性」を有すること、または「部分的に相補的」であることができる。これは、2つのポリヌクレオチドを任意でアライメントした場合に、一方のポリヌクレオチド中のヌクレオチドのうちの少なくとも60％（例えば65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または97％）、ただし100％未満が、それぞれに対応する他方のポリヌクレオチド中のヌクレオチドとのワトソン・クリック型塩基対合に関わりうることを意味する。言い換えると、2つのポリヌクレオチドがハイブリダイズした場合に、少なくとも1つ（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個）のミスマッチヌクレオチド塩基対がある。ワトソン・クリック型塩基対合に関わるヌクレオチドの対には、例えばアデニンとチミン、シトシンとグアニン、およびアデニンとウラシルがあり、これらはいずれも水素結合の形成によって対合する。ミスマッチ塩基の例としては、グアニンとウラシル、グアニンとチミン、およびアデニンとシトシンの対合が挙げられる。

本明細書において使用する場合、標的に「特異的に結合する」という表現は、ある作用物質（例えば抗体）がその標的に、構造が異なる分子へのその結合よりも、強いアフィニティで、強いアビディティで、および/または長時間にわたって、結合する結合反応を指す。典型的態様において、作用物質（例えば抗体）は、同じアフィニティアッセイ条件下でアッセイした場合に、無関係な分子と比較して、標的に対して少なくとも5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、もしくは100倍、またはそれ以上のアフィニティを有する。

本明細書において使用する場合、「Casタンパク質」という用語は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）関連タンパク質またはヌクレアーゼを指す。Casタンパク質は野生型Casタンパク質またはCasタンパク質バリアントであることができる。Cas9タンパク質は、II型CRISPR-Cas系に属するCasタンパク質の一例である（例えばRath et al.,Biochimie 117:119,2015）。Casタンパク質の他の例は本明細書においてさらに詳述される。天然のCasタンパク質は、部位特異的なDNAの認識と切断のために、crRNAとtracrRNAの両方を必要とする。crRNAは、部分的相補性を持つ領域を介してtracrRNAと会合することで、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的DNA中のcrRNAに相同な領域に、Casタンパク質をガイドする。天然のCasタンパク質は、DNAを切断して、crRNA転写産物内に含まれるガイド配列によって指定される部位の二本鎖切断点に平滑端を生成させる。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの態様において、Casタンパク質は標的gRNAまたはドナーgRNAと会合して、リボヌクレオタンパク質（RNP）複合体を形成する。本明細書に記載の組成物および方法のいくつかの態様において、Casタンパク質はヌクレアーゼ活性を有する。別の態様において、Casタンパク質はヌクレアーゼ活性を有しない。

本明細書において使用する場合、「Casタンパク質バリアント」という用語は、野生型Casタンパク質の配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、またはそれより多くのアミノ酸置換）を有する、および/または野生型Casタンパク質の切断型もしくはフラグメントである、Casタンパク質を指す。いくつかの態様において、Casタンパク質バリアントは、野生型Casタンパク質の配列に対して、少なくとも75％の配列同一性（例えば少なくとも75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の配列同一性）を有する。いくつかの態様において、Casタンパク質バリアントは、野生型Casタンパク質のフラグメントであり、野生型Casタンパク質の配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。Casタンパク質バリアントはCas9タンパク質バリアントであることができる。いくつかの態様において、Casタンパク質バリアントはヌクレアーゼ活性を有する。別の態様において、Casタンパク質バリアントはヌクレアーゼ活性を有しない。

本明細書において使用する場合、「リボヌクレオタンパク質複合体」または「RNP複合体」という用語は、Casタンパク質またはバリアント（例えばCas9タンパク質またはバリアント）とgRNAとを含む複合体を指す。

本明細書において使用する場合、細胞のゲノム中の標的核酸を改変するという文脈での「改変する」という用語は、標的核酸における変化（例えば切断）を誘導することを指す。いくつかの態様において、変化は、標的核酸の配列における構造変化であることができる。例えば改変は、標的核酸中にヌクレオチド配列を挿入するという形態をとることができる。例えば外因性ヌクレオチド配列を標的核酸中に挿入することができる。標的核酸を切り出して、外因性ヌクレオチド配列で置き換えることもできる。別の一例では、改変は、標的核酸中にヌクレオチド配列を挿入することなく、標的核酸を切断するという形態をとることができる。例えば標的核酸を切断し、切り出すことができる。そのような改変は、例えば標的核酸内で二本鎖切断を誘導することによって、または向かい合った鎖上に標的核酸に隣接して1対の一本鎖ニックを誘導することによって、実施することができる。標的核酸においてまたは標的核酸内で一本鎖切断または二本鎖切断を誘導するための方法には、標的核酸に向けられた本明細書に記載のCasタンパク質の使用が含まれる。別の態様において、標的核酸の改変は、別のタンパク質を標的核酸に向かわせることを含み、標的核酸を切断することを含まない。

本明細書において使用する場合、「外因性タンパク質」という用語は、その細胞において見いだされないタンパク質、または標的であるゲノム位置には通常見いだされないが、その細胞における別の場所には存在するタンパク質を指す。

本明細書において使用する場合、「アニオン性ポリマー」という用語は、複数のサブユニットまたはモノマーで構成されていて全体として負の電荷を有する分子を指す。ポリマー中の各サブユニットまたはモノマーは、独立して、アミノ酸、有機低分子（例えば有機酸）、糖分子（例えば単糖または二糖）、またはヌクレオチドであることができる。アニオン性ポリマーは、複数のアミノ酸、有機低分子（例えば有機酸）、ヌクレオチド（例えば天然もしくは非天然ヌクレオチド、またはその類似体）、またはそれらの組合せを含有することができる。アニオン性ポリマーは、ポリマー中のすべてのサブユニットまたはモノマーが同じであるアニオン性ホモポリマーであることができる。アニオン性ポリマーは、ポリマー中のサブユニットおよびモノマーが異なるアニオン性ヘテロポリマーであることができる。アニオン性ポリマーは、もっぱらヌクレオチドで構成される核酸、例えばデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）を指さない。ただしアニオン性ポリマーは、1つまたは複数の核酸塩基（例えばグアノシン、シチジン、アデノシン、チミジン、およびウリジン）を、他のサブユニットまたはモノマー、例えばアミノ酸および/または有機低分子（例えば有機酸）と一緒に含むことができる。いくつかの態様において、ポリマー中のサブユニットまたはモノマーのうちの少なくとも50％（例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）はヌクレオチドではないか、または核酸塩基を含有しない。アニオン性ポリマーはアニオン性ポリペプチドまたはアニオン性多糖であることができる。アニオン性ポリマーは、少なくとも2つのサブユニットまたはモノマー（例えば少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390または400個のサブユニットまたはモノマー;100～400、120～400、140～400、160～400、180～400、200～400、220～400、240～400、260～400、280～400、300～400、320～400、340～400、360～400、380～400、100～380、100～360、100～340、100～320、100～300、100～280、100～260、100～240、100～220、100～200、100～180、100～160、100～140または100～120個のサブユニットまたはモノマー）を含有することができる。

本明細書において使用する場合、「アニオン性ポリペプチド」という用語は、そのサブユニットまたはモノマーのうちの少なくとも50％（例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）がアミノ酸、例えば酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸）、またはその誘導体である、アニオン性ポリマーを指す。アミノ酸の他に、アニオン性ポリペプチドは、有機低分子（例えば有機酸）、糖分子（例えば単糖または二糖）、またはヌクレオチドも含有することができる。いくつかの態様において、アニオン性ポリペプチドは、そのサブユニットのすべてが同じであるホモポリマーであることができる。別の態様において、アニオン性ポリペプチドは、2つ以上の異なるサブユニットを含有するヘテロポリマーであることができる。例えばアニオン性ポリペプチドは、ポリグルタミン酸（PGA）（例えばポリ-ガンマ-グルタミン酸）、ポリアスパラギン酸、およびポリカルボキシグルタミン酸であることができる。別の一例において、アニオン性ポリペプチドはグルタミン酸とアスパラギン酸の混合物を含有することができる。いくつかの態様において、アニオン性ポリペプチド中のサブユニットまたはモノマーのうちの少なくとも50％（例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）は、グルタミン酸および/またはアスパラギン酸であることができる。アニオン性ポリペプチドは、少なくとも2つのサブユニットまたはモノマー（例えば少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390または400個のサブユニットまたはモノマー;100～400、120～400、140～400、160～400、180～400、200～400、220～400、240～400、260～400、280～400、300～400、320～400、340～400、360～400、380～400、100～380、100～360、100～340、100～320、100～300、100～280、100～260、100～240、100～220、100～200、100～180、100～160、100～140または100～120個のサブユニットまたはモノマー）を含有することができる。

本明細書において使用する場合、「アニオン性多糖」という用語は、そのサブユニットまたはモノマーのうちの少なくとも50％（例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）が糖分子、例えば単糖（例えばフルクトース、ガラクトース、およびグルコース）および二糖（例えばヒアルロン酸、ラクトース、マルトース、およびスクロース）、またはそれらの誘導体である、アニオン性ポリマーを指す。糖分子の他に、アニオン性多糖は、有機低分子（例えば有機酸）、アミノ酸（例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸）、またはヌクレオチドも含有することができる。いくつかの態様において、アニオン性多糖は、そのサブユニットのすべてが同じであるホモポリマーであることができる。別の態様において、アニオン性多糖は、2つ以上の異なるサブユニットを含有するヘテロポリマーであることができる。例えばアニオン性多糖は、ヒアルロン酸（HA）、ヘパリン、ヘパリン硫酸、またはグリコサミノグリカンであることができる。いくつかの態様において、アニオン性多糖中のサブユニットまたはモノマーのうちの少なくとも50％（例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）はHAであることができる。アニオン性多糖は、少なくとも2つのサブユニットまたはモノマー（例えば少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390または400個のサブユニットまたはモノマー;100～400、120～400、140～400、160～400、180～400、200～400、220～400、240～400、260～400、280～400、300～400、320～400、340～400、360～400、380～400、100～380、100～360、100～340、100～320、100～300、100～280、100～260、100～240、100～220、100～200、100～180、100～160、100～140または100～120個のサブユニットまたはモノマー）を含有することができる。

III. 内在性細胞表面タンパク質を改変するための組成物および方法
細胞における内在性細胞表面タンパク質をCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質）で改変する本明細書に記載の組成物および方法において、内在性細胞表面タンパク質座位（例えばT細胞受容体α定常鎖（TRAC）ゲノム座位）中でgRNAが標的とする場所は、高レベルのHDRと、低レベルのNHEJ（NHEJは、高頻度のインデルをもたらす誤りがちな様式で切断端を直接ライゲートする）を促進することができる。いくつかの態様において、コード配列または近くの構造要素を標的とするgRNAは、タンパク質またはmRNA発現を破壊し、それが遺伝子の望ましくないNHEJ媒介ノックアウトにもつながりうる。いかなる理論にも束縛されないが、内在性細胞表面タンパク質座位（例えばTRAC座位）中のイントロン領域（例えばTRAC座位のイントロン5、6または7中のイントロン領域）またはその一部分を標的とするgRNAを使用することは、高レベルのHDRおよび低レベルのNHEJにつながりうる。いくつかの態様において、gRNAは、内在性細胞表面タンパク質座位（例えばTRAC座位）中の、イントロン領域（例えばTRAC座位のイントロン5、6または7中のイントロン領域）とエクソン領域との両方を含有する領域を標的とする。

いくつかの態様において、gRNAは、SEQ ID NO:2～9のいずれか一つの配列に対して少なくとも85％（例えば85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％または100％）の同一性を有する配列を有することができる（例えばgRNA G526、gRNA G527、gRNA G528、gRNA G529、gRNA G530、gRNA G531、gRNA G532、およびgRNA G533）。図5に示すように、gRNA G526、gRNA G527、gRNA G528、およびgRNA G529は、それぞれ、TRAC座位中のイントロン領域とエクソン領域との両方を含有する領域を標的とする。さらに、gRNA G530、gRNA G531、gRNA G532、およびgRNA G533は、それぞれ、TRAC座位中のイントロン領域である領域を標的とする。

いくつかの態様において、gRNAは、SEQ ID NO:17～28のいずれか一つの配列に対して少なくとも85％（例えば85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％または100％）の同一性を有する配列を有することができる（例えばgRNA G542、gRNA G543、gRNA G544、gRNA G545、gRNA G546、gRNA G547、gRNA G548、gRNA G549、gRNA G550、gRNA G551、gRNA G552、およびgRNA G553）。gRNA G542、gRNA G543、gRNA G544、gRNA G545、gRNA G546、gRNA G547、gRNA G548、gRNA G549、gRNA G550、gRNA G551、gRNA G552、およびgRNA G553は、それぞれ、TRAC座位中のイントロン領域を含有する領域を標的とする。

いくつかの態様において、gRNAは、SEQ ID NO:29～40のいずれか一つの配列に対して少なくとも85％（例えば85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％または100％）の同一性を有する配列を有することができる（例えばgRNA G571、gRNA G572、gRNA G573、gRNA G574、gRNA G575、gRNA G576、gRNA G577、gRNA G578、gRNA G579、gRNA G580、gRNA G581、およびgRNA G582）。gRNA G571、gRNA G572、gRNA G573、gRNA G574、gRNA G575、gRNA G576、gRNA G577、gRNA G578、gRNA G579、gRNA G580、gRNA G581、およびgRNA G582は、それぞれ、B2M座位中の領域を標的とする。いくつかの態様において、B2M座位はGenBank遺伝子ID:567の配列を含む。

いくつかの態様において、gRNAは、SEQ ID NO:41～52のいずれか一つの配列に対して少なくとも85％（例えば85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％または100％）の同一性を有する配列を有することができる（例えばgRNA G559、gRNA G560、gRNA G561、gRNA G562、gRNA G563、gRNA G564、gRNA G565、gRNA G566、gRNA G567、gRNA G568、gRNA G569、およびgRNA G570）。gRNA G559、gRNA G560、gRNA G561、gRNA G562、gRNA G563、gRNA G564、gRNA G565、gRNA G566、gRNA G567、gRNA G568、gRNA G569、およびgRNA G570は、それぞれ、CD4座位中の領域を標的とする。いくつかの態様において、CD4座位はGenBank遺伝子ID:920の配列を含む。

本明細書では、配列

を含むgRNAを含む組成物が提供される。SEQ ID NO:3の配列を有するgRNAは、SEQ ID NO:1に示す配列を持つTRAC座位のヌクレオチド798～817を標的とする。SEQ ID NO:4の配列を有するgRNAはTRAC座位のヌクレオチド792～811を標的とする。SEQ ID NO:5の配列を有するgRNAはTRAC座位のヌクレオチド791～810を標的とする。SEQ ID NO:6の配列を有するgRNAはTRAC座位のヌクレオチド786～805を標的とする。SEQ ID NO:7の配列を有するgRNAはTRAC座位のヌクレオチド746～765を標的とする。SEQ ID NO:8の配列を有するgRNAはTRAC座位のヌクレオチド745～764を標的とする。SEQ ID NO:9の配列を有するgRNAはTRAC座位のヌクレオチド727～746を標的とする。図1Aに示すように、SEQ ID NO:3の配列を有するgRNAは、TRACエクソン6の5'末端にある一部分と、TRACエクソン6の上流に位置するイントロン（例えばイントロン5）の一部分とにハイブリダイズする。

別の一局面では、TRAC座位を標的とするために、配列

を有するgRNAも使用することができる。SEQ ID NO:2の配列を有するgRNAはTRAC座位のヌクレオチド806～825を標的とする。図1Aに示すように、SEQ ID NO:2の配列を有するgRNAも、TRACエクソン6の5'末端にある一部分と、TRACエクソン6の上流に位置するイントロン（例えばイントロン5）の一部分とにハイブリダイズする。図6A～6Dは、異なるgRNAを使ったTRAC座位へのCRISPR/Cas9標的組込みの概略図である。

また、SEQ ID NO:17～52のいずれか一つの配列を含むgRNAを含む組成物も本明細書で提供される。

さらに、切断部位において高濃度の相同組換え修復テンプレート（HDRT）を使用すれば、高レベルのHDRを促進することもできる。この局面において、HDRTは、遺伝子改変効率を向上させるために、gRNAを介してCasタンパク質と相互作用してCasタンパク質に結合されることで、標的である核酸（例えばTRAC座位）に近い所望の細胞内位置にHDRTを「シャトルする」ことができる1つまたは複数のCasタンパク質標的配列に、融合することができる。いくつかの態様では、Casタンパク質標的配列を本明細書ではシャトル配列ともいう。

1つまたは複数のCasタンパク質標的配列に融合しているHDRTのいくつかの態様では、図1Bに示すように、Casタンパク質標的配列が相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズして、二本鎖デュプレックスを形成する。いくつかの態様において、HDRTは一本鎖ポリヌクレオチドであることができる。別の態様において、HDRTは二本鎖ポリヌクレオチドであることができる。いくつかの態様において、HDRTは一本鎖ポリヌクレオチドであることができ、HDRTは1つまたは複数のCasタンパク質標的配列に融合し、各Casタンパク質標的配列は相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる。特定態様において、HDRTは2つのCasタンパク質標的配列に融合している。例えば、第1のCasタンパク質標的配列はHDRTの5'末端に融合することができ、第2のCasタンパク質標的配列はHDRTの3'末端に融合することができる。特定の態様において、HDRTは、SEQ ID NO:10または11の配列（これらはそれぞれ、B細胞成熟抗原（BCMA）-CAR配列を含有する）に対して少なくとも85％（例えば85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％または100％）の同一性を有する配列を有する。別の態様では、CARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））の代わりに、免疫治療用の導入遺伝子、例えばSyn-Notch遺伝子またはMini-Notch遺伝子を、T細胞のゲノムに組み込むことができる。本明細書に記載の組成物によってターゲティングされうる導入遺伝子の他の例としては、キメラ受容体（例えばキメラ抗原受容体、キメラ共刺激受容体、スイッチ受容体（2つの受容体の細胞外と細胞内の間の融合物、例えば限定するわけではないが、PD1/28、CD80/4-1BB、TGFBR/4-1BB）、T細胞受容体およびそのバリアント（例えばHLA非依存的TCR）、SynNotchおよびそのバリアント、同種免疫を調整する受容体（例えばCD47、HLA-E、およびADR（Alloimmune Defense Receptor:同種免疫防御受容体））、CD4、CD8、CD95L（FasL）、および転写因子（例えばTOX、TCF1、IRF8、BTAF、Fli1、およびc-Jun）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書に記載の組成物は、Casタンパク質、例えばCas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1およびCsx12としても知られる）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、またはそれらのバリアントを、さらに含有することができる。特定態様において、Casタンパク質はCas9ヌクレアーゼである。Casタンパク質については本明細書においてさらに詳しく説明する。

いくつかの態様では、HDRTに融合している1つまたは複数のシャトル配列に結合して、HDRTを遺伝子改変の部位に輸送するために、Casタンパク質の代わりに、テーラード（tailored）エンドヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様（TAL）エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、またはMega-Talを使用することができる。

いくつかの態様において、Casタンパク質は、核局在化シグナル（NLS）配列に融合している。NLS配列の例は、例えばLange et al.,J Biol Chem.282（8）:5101-5,2007に記載されているように、当技術分野において公知であり、それには

も含まれるが、それらに限定されるわけではない。Casタンパク質に融合することができる他のペプチドまたはタンパク質の例、例えば細胞透過性ペプチドおよび細胞ターゲティングペプチドも、当技術分野では利用することができ、例えばVives et al.,Biochim Biophys Acta.1786（2）:126-38,2008に記載されている。特定の態様において、Casタンパク質はヌクレアーゼ活性を有する。さらに別の態様において、Casタンパク質はヌクレアーゼ活性を有しない。

いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、SEQ ID NO:2～9およびSEQ ID NO:17～52のいずれか一つの配列を有するgRNAとCasタンパク質（例えばCas9ヌクレアーゼ）とを含む。いくつかの態様では、gRNAとCasタンパク質を一緒にして例えば37℃で30分間インキュベートすることで、リボヌクレオタンパク質（RNP）複合体を形成させることができる。さらに、RNP複合体を安定化し、凝集を防止するために、組成物にアニオン性ポリマーを加えることができる。いかなる理論にも束縛されないが、アニオン性ポリマーは、生理的pHでは正に荷電しているCasタンパク質と好ましく相互作用して、RNP複合体を分散した粒子中に安定化し、凝集を防止し、ヌクレアーゼの編集活性および編集効率を改良しうる。アニオン性ポリマーの例として、ポリグルタミン酸（PGA）、ポリアスパラギン酸、またはポリカルボキシグルタミン酸が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。アニオン性ポリマーについては本明細書においてさらに詳しく説明する。

本明細書に記載の組成物は、細胞（例えばT細胞）における内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）をCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））で改変するために使用することができる。細胞表面タンパク質座位（例えばTRAC座位）中で遺伝子を改変することにより、CARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））のノックインは、同時に、内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）をノックアウトすることができる。さらに本方法には、本方法が、内在性細胞表面タンパク質が陰性である改変細胞を選択することにより、CARまたは外因性タンパク質ノックインを有する細胞の濃縮も行っているという利点がある。図8Aは、TRAC座位におけるイントロンgRNAまたはエクソンgRNAによるKIの概略図である。さらに、表示のgRNAおよびドナーテンプレートで工学的に操作されたT細胞のフロープロットの概略を、図8Bに示す。図8Bの最下行は、TCR陰性選択後の、CAR陽性細胞の改良された濃縮を表す。細胞表面タンパク質座位（例えばTRAC座位）中の遺伝子を改変するために、本明細書においてさらに詳述する、エレクトロポレーションやウイルス送達などの、当技術分野において利用可能なさまざまな技法を使って、gRNA、Casタンパク質、およびHDRTをT細胞に導入することができる。

ノックインと陰性選択濃縮のための本明細書に記載の組成物によって改変することができる遺伝子の例としては、TRAC、TRBC、TRGC、TRDC、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD3ガンマ、CD3ゼータ（CD247）、B2M、CD4、CD8アルファ、CD8ベータ、CTLA4、PD-1、TIM-3、LAG3、TIGIT、CD28、CD25、CD69、CD95（Fas）、CD52、CD56、CD38、KLRG-1、およびNK特異的遺伝子（例えばNKG2A、NKG2C、NKG2D、NKp46、CD16、CD84、CD84、2B4、およびKIR-L）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

他の態様において、本明細書に記載の組成物および方法は、複数のゲノム座位（例えば少なくとも2、3、4、または5個のゲノム座位）で複数の細胞表面タンパク質を改変するために、すなわち複数の同時イントロンノックインのために、使用することができる。複数の細胞表面タンパク質を、異なるCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質）で置き換えることができる。所望のCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質）のすべてを含有する改変細胞を、陰性選択で、例えば内在性細胞表面タンパク質を標的とする抗体を使った陰性選択で、濃縮することができる。このようにして、所望のCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質）で置き換えられなかった内在性細胞表面タンパク質を1つまたは複数含有する細胞を、抗体を使ってすべて取り出した後に、所望のCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質）のすべてを含有する細胞を濃縮することができる。

例えばいくつかの態様において、複数の同時イントロンノックインは、3つの異なる座位で3つの内在性細胞表面タンパク質と置き換わった3つの外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質）を含むことができる。例えば、TRAC座位では組換えMHC-I拘束性TCRで内在性TCRを置き換えることができ、B2M座位ではNK細胞モジュレーター（例えばHLA-E（HLAクラスI組織適合性抗原アルファ鎖E）タンパク質）で内在性B2Mタンパク質を置き換えることができ、CD4座位ではCD8（例えばCD8アルファおよびベータ鎖）で内在性CD4タンパク質を置き換えることができる。組換えMHC-I拘束性TCR、HLA-EおよびCD8の3つすべてを含有する細胞を陰性に濃縮するために、内在性TCR、B2MおよびCD4を標的とする抗体を使って、内在性タンパク質（例えば内在性TCR、B2MおよびCD4）のうちの1つ、内在性タンパク質のうちの2つ、または内在性タンパク質のうちの3つすべてを依然として含有している細胞を取り出した後に、組換えMHC-I拘束性TCR、HLA-EおよびCD8の3つすべてを含有する細胞を濃縮することができる。本開示は、T細胞における少なくとも2つ以上の内在性細胞表面タンパク質を改変するための方法であって、SEQ ID NO:2～9およびSEQ ID NO:17～52のいずれか一つの配列を含む第1ガイドRNA（gRNA）を含む第1組成物と、SEQ ID NO:2～9およびSEQ ID NO:17～52のいずれか一つの配列を含む第2gRNAを含む第2組成物とを、T細胞に導入する工程を含み、前記2つ以上の内在性細胞表面タンパク質は異なり、第1gRNAと第2gRNAが異なる方法も提供する。

IV. 送達の方法
細胞（例えばT細胞）における内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）を改変する方法において使用するための本明細書に記載の組成物は、当技術分野におけるいくつかの技法を使ってT細胞中に送達することができる。いくつかの態様において、組成物は、エレクトロポレーションによって細胞に導入することができる。いくつかの態様では、Casタンパク質（例えばCas9ヌクレアーゼ）とgRNAとを含有するリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体をまず形成させてから、それを細胞にエレクトロポレーションすることができる。当技術分野では、WO2006/001614またはKim,J.A.et al.Biosens.Bioelectron.23,1353-1360（2008）に記載されているものなどといった、エレクトロポレーションのための方法、組成物およびデバイスを利用することができる。エレクトロポレーションのためのさらなるまたは代替的な方法、組成物およびデバイスとしては、米国特許出願公開第2006/0094095号、同第2005/0064596号または同第2006/0087522号に記載のものを挙げることができる。エレクトロポレーションのためのさらなるまたは代替的な方法、組成物およびデバイスとしては、Li,L.H.et al.Cancer Res.Treat.1,341-350（2002）、米国特許第6,773,669号、同第7,186,559号、同第7,771,984号、同第7,991,559号、同第6,485,961号および同第7,029,916号、ならびに米国特許出願公開第2014/0017213号および同第2012/0088842号に記載のものを挙げることができる。エレクトロポレーションのためのさらなるまたは代替的な方法、組成物およびデバイスとしては、Geng,T.et al.J.Control Release 144,91-100（2010）およびWang,J.,et al.Lab Chip 10,2057-2061（2010）に記載のものを挙げることができる。

他の態様において、本明細書に記載の組成物中のCasタンパク質、HDRTおよびgRNAは、ウイルスベクターを用いるウイルス送達によって細胞に導入することができる。例えばウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）（例えば組換えAAV（rAAV））、SV40、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどに基づくことができる。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、およびレトロウイルス由来のベクター、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス（例えば組込み欠損レンチウイルス）、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳房腫瘍ウイルスなどに基づくことができる。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは、組込み欠損ガンマレトロウイルスベクターであることができる。他の有用な発現ベクターは当業者に公知であり、多くが市販されている。真核宿主細胞用の例として以下の例示的ベクターが挙げられる:pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVLSV40。ウイルスベクターを細胞に導入するために使用しうる技法の例には、ウイルス感染またはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（PEI）媒介トランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子媒介核酸送達などがあるが、それらに限定されるわけではない。

V. 選択方法
内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）がCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））で置き換えられている細胞は、当技術分野において利用可能な種々の技法を用いて選択することができる。本方法は、内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）を発現しない改変細胞を選択することにより、CARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））ノックインを有する細胞の濃縮も行っている。いくつかの態様において、本選択方法は、内在性細胞表面タンパク質を依然として発現する未改変T細胞を標的とし、それらを選択的に取り出して、CARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質）を発現する改変T細胞を上清に残す。これを陰性選択ともいう。陰性選択の場合、選択方法は、所望でない成分（例えば改変しようとしている内在性細胞表面タンパク質）を標的とし、所望の改変T細胞集団はそのままにしておく。いくつかの態様において、陰性選択は、陽性選択よりも効率よく（細胞の損失が少なく）、細胞に対する細胞傷害性が低く、速い。陽性選択の場合、選択方法は、所望の成分または改変T細胞に導入される成分（例えばCAR、外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質）、またはCARもしくは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質）と共発現されるタンパク質）を標的とする。さらにまた、CARまたは外因性タンパク質を標的とする陽性選択は、T細胞の抗腫瘍活性にとって有害なT細胞活性化につながる場合がある。さらに、CARと共発現されうるタンパク質、例えば切断型EGFRを標的とする陽性選択には、HDRTのサイズを増加させることが必要になり、それはノックイン効率および細胞生存性に負の影響を有しうる。

特定の一局面では、T細胞の集団が提供される。T細胞の集団は本明細書に記載の改変細胞を含むことができる。改変細胞は不均一な細胞の集団内に存在することができる。細胞の集団は、ゲノム編集されている細胞のパーセンテージに関して不均一でありうる。T細胞の集団では、集団のうちの10％超、20％超、30％超、40％超、50％超、60％超、70％超、80％超、または90％超に、CARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））をコードするヌクレオチド配列を組み込まれている場合がある。

T細胞における内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）がCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））で置き換えられている改変T細胞を、T細胞の集団から選択するための方法が提供される。Casタンパク質、細胞表面タンパク質座位（例えばTRAC座位）を標的とするgRNA、およびCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））をコードするHDRTを含有する本明細書に記載の組成物をT細胞の集団中に導入（例えばエレクトロポレーションまたはウイルス送達によって導入）し、改変が起こるように細胞を数日間インキュベートした後、T細胞の集団を、磁性ビーズ上の抗体が内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）を標的とする抗体被覆磁性ビーズと接触させることによって、改変T細胞を選択（例えば陰性に選択）することができる。このようにして、改変されておらず、内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）を依然として発現するT細胞を、内在性細胞表面タンパク質がCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質）で置き換えられている改変T細胞から分離することができる。内在性細胞表面タンパク質が外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性組換えTCR））で置き換えられる場合は、抗体によって認識されるエピトープが内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）だけに存在し、外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性組換えTCR））には存在しないことを保証する必要がある。未改変T細胞に結合している抗体被覆磁性ビーズは、次に、磁気分離ラックを使って改変T細胞から分離することができる。改変T細胞を含有する上清は別の容器に収集することができる。

いくつかの例では、T細胞の集団を対象から取り出し、本明細書に記載の組成物および方法のいずれかを使って改変し、前記対象に投与する。別の例では、本明細書に記載の組成物を対象にインビボで送達することができる。例えば米国特許第9737604号およびZhang et al.「Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery of CRISPR/Cas9 for tumor therapy」NPG Asia Materials Volume 9,page e441（2017）を参照されたい。

本明細書に記載の組成物は、細胞（例えばT細胞）における内在性細胞表面タンパク質（例えば内在性TCR）をCARまたは外因性タンパク質（例えば外因性細胞内または細胞表面タンパク質（例えば外因性TCR））で改変する方法において使用することができる。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにあることができる。いくつかの態様において、T細胞は、制御性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞である。いくつかの態様において、T細胞はCD4^＋T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はCD8^＋T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はCD4^＋CD8^＋T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はCD4^-CD8^-T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はαβ型T細胞である。いくつかの態様において、T細胞はγδ型T細胞である。いくつかの態様において、本方法は、改変T細胞の集団を拡大培養する工程をさらに含む。

さらに、本明細書に記載の組成物および方法を、他の細胞タイプ、例えば限定するわけではないが、造血幹細胞、前駆細胞、T細胞（CD4 T細胞、CD8 T細胞、制御性T細胞、ガンマ/デルタ型T細胞）、ナチュラルキラー（NK）細胞、NK T細胞、iPS/ES細胞、iPS/ES由来NK細胞、iPS/ES由来NK T細胞、B細胞、骨髄性細胞、iPS/ES由来B細胞、およびiPS/ES由来骨髄性細胞に応用することもできる。

VI. ガイドRNA
Casタンパク質はガイドRNA（gRNA）によってその標的核酸にガイドされうる。gRNAは、天然の二成分（two-piece）ガイドRNA（crRNAおよびtracrRNA）を二成分gRNAまたは単一連続配列に工学的に操作したものである。gRNAは、Casタンパク質を標的核酸に向かわせるガイド配列（例えばgRNAのcrRNA相当部分）と、Casタンパク質と相互作用するスキャフォールド配列（例えばgRNAのtracrRNA相当部分）とを含有することができる。gRNAはソフトウェアを用いて選択することができる。非限定的な一例として、gRNAを選択するために考慮すべき事項には、例えば使用するCasタンパク質のためのPAM配列、およびオフターゲット改変を最小限に抑えるための戦略が含まれうる。NUPACK（登録商標）およびCRISPR Design Toolなどのツールは、gRNAを調製するための配列を提供し、標的改変効率を評価しおよび/またはオフターゲット部位における切断を評価することができる。本明細書に記載するように、内在性細胞表面タンパク質ゲノム座位（例えばTRACゲノム座位）中でgRNAが標的とする場所は、高レベルなHDRおよび低レベルなNHEJを促進する上で重要である。さらに、いかなる理論にも束縛されないが、細胞表面タンパク質座位（例えばTRAC座位）中のイントロン領域またはその一部分を標的とするgRNAを使用することは、高レベルのHDRおよび低レベルのNHEJにつながりうる。特定態様において、細胞表面タンパク質座位（例えばTRAC座位）中の領域を標的とするgRNAは、SEQ ID NO:2～9およびSEQ ID NO:17～52のいずれか一つの配列を有することができる。いくつかの態様において、TRAC座位中の一領域を標的とするgRNAは、SEQ ID NO:2～9のいずれか一つの配列を有しうる。

ガイド配列
gRNA中のガイド配列は標的核酸内の特異的配列に相補的でありうる。標的核酸配列の3'端にはPAM配列が続きうる。PAM配列の上流およそ20ヌクレオチドが標的核酸である。一般にCas9タンパク質またはそのバリアントは、PAM配列の約3ヌクレオチド上流を切断する。gRNA中のガイド配列は標的核酸のどちらかの鎖に相補的であることができる。

いくつかの態様において、gRNAのガイド配列は、約10～約2000、例えば約10～約100、約10～約500、約10～約1000、約10～約1500、約10～約2000、約50～約100、約50～約500、約50～約1000、約50～約1500、約50～約2000、約100～約500、約100～約1000、約100～約1500、約100～約2000、約500～約1000、約500～約1500、約500～約2000、約1000～約1500、または約1000～約2000個の核酸を含みうる。いくつかの態様において、gRNAのガイド配列は、gRNAの5'端に、RNA-DNA相補性塩基対合を使ってCasタンパク質を標的核酸部位に向かわせることができる約100個の核酸を含む。いくつかの態様において、ガイド配列は、gRNAの5'端に、RNA-DNA相補性塩基対合を使ってCasタンパク質を標的核酸部位に向かわせることができる20核酸を含む。別の態様において、ガイド配列は、標的核酸部位に相補的な20個未満、例えば19個、18個、17個、16個、15個、またはそれより少ない核酸を含む。いくつかの例では、gRNA中のガイド配列が、核酸標的部位の相補性領域に少なくとも1つの核酸ミスマッチを含有する。いくつかの例では、ガイド配列が核酸標的部位の相補性領域に約1～約10個の核酸ミスマッチを含有する。

スキャフォールド配列
gRNA中のスキャフォールド配列は、Casタンパク質またはそのバリアントと相互作用するタンパク質結合配列として役立つことができる。いくつかの態様において、gRNA中のスキャフォールド配列は、互いにハイブリダイズして二本鎖RNAデュプレックス（double-stranded RNA duplex:dsRNAデュプレックス）を形成する2つの相補的なヌクレオチドストレッチを含むことができる。スキャフォールド配列は、下ステム（lower stem）、バルジ（bulge）、上ステム（upper stem）、ネクサス（nexus）および/またはヘアピン（hairpin）などの構造を有しうる。いくつかの態様において、gRNA中のスキャフォールド配列は、約90～約120、例えば約90～約115、約90～約110、約90～約105、約90～約100、約90～約95、約95～約120、約100～約120、約105～約120、約110～約120、または約115～約120個の核酸であることができる。

VII. Casタンパク質
いくつかの態様において、Casタンパク質はヌクレアーゼ活性を有する。例えばCasタンパク質は標的核酸を切断することによって標的核酸を改変することができる。切断された標的核酸は次に、近くのHDRTとの相同組換えを起こすことができる。例えばCasタンパク質は、標的核酸中のある場所で、一方または両方の鎖の切断を指示することができる。Casタンパク質の非限定的な例として、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1およびCsx12としても知られる）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、それらのホモログ、それらのバリアント、それらの変異体、およびそれらの誘導体が挙げられる。Casタンパク質には3つの主要タイプ（I型、II型およびIII型）と、5種のI型、3種のII型および2種のIII型タンパク質を含む10種のサブタイプがある（例えばHochstrasser and Doudna,Trends Biochem Sci,2015:40（1）:58-66参照）。II型Casタンパク質には、Cas1、Cas2、Csn2、Cas9、およびCfp1が含まれる。これらのCasタンパク質は当業者に公知である。例えば、化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）野生型Cas9ポリペプチドのアミノ酸配列はNBCIリファレンス配列番号NP＿269215などに示されており、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）野生型Cas9ポリペプチドのアミノ酸配列はNBCIリファレンス配列番号WP＿011681470などに示されている。

Casタンパク質、例えばCas9ヌクレアーゼは、限定するわけではないが、ベイロネラ・アティピカ（Veillonella atypical）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatum）、フィリファクター・アロシス（Filifactor alocis）、ソロバクテリウム・ムーレイ（Solobacterium moorei）、コプロコッカス・カツス（Coprococcus catus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ペプトニフィラス・デュエルデニイ（Peptoniphilus duerdenii）、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Catenibacterium mitsuokai）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、リストリア・イノキュア（Listeria innocua）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Staphylococcus pseudintermedius）、アシダミノコッカス・インテスチニ（Acidaminococcus intestine）、オルセネラ・ウリ（Olsenella uli）、オエノコッカス・キタハラエ（Oenococcus kitaharae）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、マイコプラズマ・ モービレ（Mycoplasma mobile）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）、マイコプラズマ・オビニューモニエ（Mycoplasma ovipneumoniae）、マイコプラズマ・カニス（Mycoplasma canis）、マイコプラズマ・シノビエ（Mycoplasma synoviae）、ユーバクテリウム・レクタレ（Eubacterium rectale）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ユーバクテリウム・ドリクム（Eubacterium dolichum）、ラクトバチルス・コリニフォルミス亜種トルクエンス（Lactobacillus coryniformis subsp.Torquens）、イリオバクター・ポリトロプス（Ilyobacter polytropus）、ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）、アシドサーマス・セルロリチカス（Acidothermus cellulolyticus）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Corynebacterium diphtheria）、エルシミクロビウム・ミヌトゥム（Elusimicrobium minutum）、ニトラティフラクター・サルスガイニス（Nitratifractor salsuginis）、スフェロケータ・グロブス（Sphaerochaeta globus）、フィブロバクター・スクシノゲネス亜種スクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes subsp.Succinogenes）、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、キャプノサイトファーガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、プレボテラ・ミカンス（Prevotella micans）、プレボテラ・ルミニコラ（Prevotella ruminicola）、フラボバクテリウム・カラムナーレ（Flavobacterium columnare）、アミノモナス・パウシボランス（Aminomonas paucivorans）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、カンジダツスス・プニセイスピリルム・マリヌム（Candidatus Puniceispirillum marinum）、ベルミネフロバクター・エイセニアエ（Verminephrobacter eiseniae）、ラルストニア・シザイギイ（Ralstonia syzygii）、ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）、アゾスピリラム（Azospirillum）、ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Nitrobacter hamburgensis）、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、カンピロバクター・ジェジュニ亜種ジェジュニ（Campylobacter jejuni subsp.Jejuni）、ヘリコバクター・ムステラエ（Helicobacter mustelae）、セレウス菌（Bacillus cereus）、アシドボラクス・エブレウス（Acidovorax ebreus）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、ロゼブリア・インテスチナリス（Roseburia intestinalis）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、パスツレラ・マルトシダ亜種マルトシダ（Pasteurella multocida subsp.Multocida）、サテレラ・ワズワーセンシス（Sutterella wadsworthensis）、プロテオバクテリア、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、パラサテレラ・エクスクレメンチホミニス（Parasutterella excrementihominis）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Wolinella succinogenes）、およびフランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）を含む、さまざまな細菌種に由来しうる。

Cas9タンパク質とは、RNAガイド二本鎖DNA結合ヌクレアーゼタンパク質またはニッカーゼタンパク質を指す。野生型Cas9ヌクレアーゼは、異なるDNA鎖を切る2つの機能ドメイン、例えばRuvCおよびHNHを有する。Cas9は、両方の機能ドメインが活性である場合には、ゲノムDNA（標的核酸）における二本鎖切断を誘導することができる。Cas9酵素は、コリネバクター（Corynebacter）、サテレラ（Sutterella）、レジオネラ（Legionella）、トレポネーマ（Treponema）、フィリファクター（Filifactor）、ユーバクテリウム（Eubacterium）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、バクテロイデス（Bacteroides）、フラビイボラ（Flaviivola）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）、スフェロケータ（Sphaerochaeta）、アゾスピリラム、グルコンアセトバクター（Gluconacetobacter）、ナイセリア（Neisseria）、ロゼブリア（Roseburia）、パルビバクラム（Parvibaculum）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ニトラティフラクター（Nitratifractor）、およびカンピロバクター（Campylobacter）からなる群に属する細菌に由来するCas9タンパク質の1つまたは複数の触媒ドメインを含むことができる。いくつかの態様において、Cas9は融合タンパク質であることができ、例えば2つの触媒ドメインは異なる細菌種に由来する。

いくつかの態様において、Casタンパク質はCasタンパク質バリアントであることができる。例えば、Cas9ヌクレアーゼの有用なバリアントは、RuvC^-もしくはHNH^-酵素またはニッカーゼなど、1つの不活性触媒ドメインを含むことができる。Cas9ニッカーゼは活性な機能ドメインを1つだけ有し、標的核酸の一方の鎖だけを切ることで、一本鎖切断、すなわちニックを生成することができる。いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼは1つまたは複数のアミノ酸変異を有する変異型Cas9ヌクレアーゼであることができる。例えば、少なくともD10A変異を有する変異型Cas9はCas9ニッカーゼである。別の態様において、少なくともH840A変異を有する変異型Cas9ヌクレアーゼはCas9ニッカーゼである。Cas9ニッカーゼ中に存在する変異の他の例には、N854AおよびN863Aがあるが、それらに限定されるわけではない。向かい合ったDNA鎖を標的とする少なくとも2つのDNAターゲティングRNAを使用するのであれば、Cas9ニッカーゼを使って二本鎖切断を導入することができる。二重ニック誘導二本鎖切断（double-nicked induced double-strand break）は、NHEJまたはHDRによって修復されうる（Ran et al.,2013,Cell,154:1380-1389）。Cas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼの非限定的な例は、例えば米国特許第8,895,308号、同第8,889,418号および同第8,865,406号、ならびに米国特許出願公開第2014/0356959号、同第2014/0273226号および同第2014/0186919号に記載されている。Cas9ヌクレアーゼまたはニッカーゼは、標的細胞用または標的生物用に、コドン最適化することができる。

いくつかの態様において、Casタンパク質バリアントは切断（例えばニッカーゼ）活性を欠く。Casタンパク質バリアントは、タンパク質のニッカーゼ活性を排除する1つまたは複数の点突然変異を含有しうる。いくつかの態様において、切断活性を欠くCasタンパク質バリアントは、HDRTに融合しているCasタンパク質標的配列に、Casタンパク質標的配列にハイブリダイズするgRNAを介して結合することができる。別の態様では、切断活性を欠くCasタンパク質バリアントを他のタンパク質に融合させて、前記他のタンパク質を標的核酸に向かわせるためのターゲゲティングドメインとして役立たせることができる。例えば、ニッカーゼ活性を持たないCasタンパク質バリアントを、遺伝子発現を制御するために、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインに融合させてもよい（Ma et al.,Protein and Cell,2（11）:879-888,2011、Maeder et al.,Nature Methods,10:977-979,2013、およびKonermann et al.,Nature,517:583-588,2014）。

いくつかの態様において、Casタンパク質は、オフターゲット効果が低減していて頑健なオンターゲット切断を行う、高忠実度の、または特異性が向上した、Cas9ポリペプチドバリアントであることができる。オンターゲット特異性が改良されているCas9ポリペプチドバリアントの非限定的な例には、Slaymaker et al.,Science,351（6268）:84-8（2016）に記載のSpCas9（K855A）、SpCas9（K810A/K1003A/R1060A）（eSpCas9（1.0）ともいう）およびSpCas9（K848A/K1003A/R1060A）（eSpCas9（1.1）ともいう）バリアント、ならびに以下の変異:N497A、R661A、Q695A、およびQ926Aのうちの1つ、2つ、3つまたは4つを含有するKleinstiver et al.,Nature,529（7587）:490-5（2016）に記載のSpCas9バリアント（例えばSpCas9-HF1は4つの変異を含有する）がある。

いくつかの態様において、切断活性を全く持たないCasタンパク質バリアントは、RuvC1ヌクレアーゼドメインとHNHヌクレアーゼドメインの2つのサイレンシング変異（D10AおよびH840A）を含有するCas9ポリペプチドであることができ、これはdCas9と呼ばれる（Jinek et al.,Science,2012,337:816-821、Qi et al.,Cell,152（5）:1173-1183）。一態様において、化膿性レンサ球菌由来のdCas9ポリペプチドは、位置D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、A987またはそれらの任意の組合せに、少なくとも1つの変異を含む。そのようなdCas9ポリペプチドおよびそのバリアントの説明は、例えば国際公開WO2013/176772でなされている。dCas9酵素は、H840またはN863における変異に加えて、D10、E762、H983またはD986に変異を含有することができる。いくつかの例において、dCas9酵素はD10AまたはD10N変異を含有することができる。また、dCas9酵素は、H840A、H840Y、またはH840Nを含有することができる。いくつかの態様において、dCas9酵素は、D10AおよびH840A;D10AおよびH840Y;D10AおよびH840N;D10NおよびH840A;D10NおよびH840Y;またはD10NおよびH840N置換を含有することができる。置換は、Cas9ポリペプチドを触媒的に不活性にすると共に、標的核酸には結合できるように、保存的置換または非保存的置換であることができる。

VIII. アニオン性ポリマー
本明細書に記載の組成物のいくつかの態様では、例えばCasタンパク質とgRNAのリボヌクレオタンパク質複合体（RNP）の安定性および編集効率を改良するために、アニオン性ポリマーを組成物に加えることができる。いくつかの態様において、Casタンパク質（例えばCas9タンパク質）を含有する組成物またはCasタンパク質（例えばCas9タンパク質）とgRNAのRNP複合体を含有する組成物へのアニオン性ポリマーの添加は、Casタンパク質またはRNP複合体を安定化し、凝集を防止することができ、それが高いヌクレアーゼ活性および編集効率につながる。いかなる理論にも束縛されないが、アニオン性ポリマー（例えばPGA）は、Casタンパク質と好ましく相互作用しうる。すなわち、アニオン性ポリマー（例えばPGA）は、（生理的pHにおいて）正に荷電しているCas9タンパク質と好ましく相互作用し、RNP複合体を分散粒子へと安定化し、凝集を防止し、ヌクレアーゼの編集活性および編集効率を改良しうる。アニオン性ポリマーは水溶性であることができる。アニオン性ポリマーは生物学的に不活性であることができる。いくつかの局面において、アニオン性ポリマーはDNA配列ではない。アニオン性ポリマーは、完全なまたは実質的な機能性を保ったまま、凍結/融解サイクル操作を受けることが可能でありうる。アニオン性ポリマーは、完全なまたは実質的な機能性を保ったまま、凍結乾燥することができる。アニオン性ポリマーは、15,000～50,000kDa（例えば15,000～45,000kDa、15,000～40,000kDa、15,000～35,000kDa、15,000～30,000kDa、15,000～25,000kDa、15,000～20,000kDa、20,000～50,000kDa、25,000～50,000kDa、30,000～50,000kDa、35,000～50,000kDa、40,000～50,000kDa、または45,000～50,000kDa）の分子量を有することができる。アニオン性ポリマーはポリグルタミン酸（PGA）であることができる。いくつかの態様では、アニオン性ポリマーの代わりにまたはアニオン性ポリマーに加えて、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ssODN）を使用することができる。ssODNの例は、例えばOkamoto et al.,Scientific Report 9:4811,2019およびHu et al.,Nucleic Acids,17:P198,2019に記載されている。

本明細書に記載のアニオン性ポリマーは、組成物を安定化し、編集を改良し、活性の喪失を伴わない組成物の凍結乾燥を可能にするために、組成物に加えることができる。いくつかの態様において、Casタンパク質とアニオン性ポリマーとを含有する組成物は、均一であるように見え、透明な外観を有し、濁った沈殿物または凝集物を含有しない水性組成物である。いくつかの態様において、Casタンパク質およびgRNAのRNP複合体とアニオン性ポリマーとを含有する組成物は、均一であるように見え、透明な外観を有し、濁った沈殿物または凝集物を含有しない水性組成物である。安定な組成物を使用すれば、効率のよい遺伝子ノックアウトおよび大きな導入遺伝子ノックインが、高い細胞生存率で可能になる。さらに、本組成物は、長期貯蔵のために凍結乾燥し、その後の使用のために再構成することができる。アニオン性ポリマーを含む組成物は、標的核酸を除去し、もしくは外因性核酸配列で置き換え、または外因性核酸配列を標的核酸内に挿入することができる、標的核酸を改変する方法においても、使用することができる。

本明細書に記載の組成物に加えることができるアニオン性ポリマーは、サブユニットまたはモノマーで構成されていて全体として負の電荷を有する分子である。アニオン性ポリマーはアニオン性ポリペプチドまたはアニオン性多糖であることができる。アニオン性ポリペプチドは、そのサブユニットまたはモノマーのうちの少なくとも50％（例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）がアミノ酸、例えば酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸）、またはその誘導体であるアニオン性ポリマーである。アニオン性ポリペプチドの例としては、ポリグルタミン酸（PGA）（例えばポリ-ガンマ-グルタミン酸）、ポリアスパラギン酸、およびポリカルボキシグルタミン酸が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、アニオン性ポリペプチドは、PGA（例えばポリ-ガンマ-グルタミン酸）、例えばポリ（L-グルタミン）酸またはポリ（D-グルタミン）酸である。アニオン性ポリペプチドは、グルタミン酸とアスパラギン酸との混合物を含有することができる。いくつかの態様において、アニオン性ポリペプチド中のサブユニットまたはモノマーのうちの少なくとも50％（例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）は、グルタミン酸および/またはアスパラギン酸であることができる。アニオン性多糖は、そのサブユニットまたはモノマーのうちの少なくとも50％（例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）が糖分子、例えば単糖（例えばフルクトース、ガラクトース、およびグルコース）および二糖（例えばヒアルロン酸、ラクトース、マルトース、およびスクロース）、またはそれらの誘導体である、アニオン性ポリマーである。アニオン性多糖の例としては、ヒアルロン酸（HA）、ヘパリン、ヘパリン硫酸、およびグリコサミノグリカンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、アニオン性多糖中のサブユニットまたはモノマーのうちの少なくとも50％（例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）はHAであることができる。アニオン性ポリマーの他の例としては、ポリ（アクリル酸）（PAA）、ポリ（メタクリル酸）（PMAA）、ポリ（スチレンスルホン酸）、およびポリリン酸が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。

本明細書におけるアニオン性ポリマーは、もっぱらヌクレオチドで構成される核酸、例えばデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）を指さない。いくつかの態様において、アニオン性ポリマーは、1つまたは複数の核酸塩基（例えばグアノシン、シチジン、アデノシン、チミジン、およびウリジン）を、他のサブユニットまたはモノマー、例えばアミノ酸および/または有機低分子（例えば有機酸）と一緒に含むことができる。いくつかの態様において、アニオン性ポリマー中のサブユニットまたはモノマーのうちの少なくとも50％（例えば55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）はヌクレオチドではないか、または核酸塩基を含有しない。アニオン性ポリマーは、少なくとも2つのサブユニットまたはモノマー（例えば少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390または400個のサブユニットまたはモノマー;100～400、120～400、140～400、160～400、180～400、200～400、220～400、240～400、260～400、280～400、300～400、320～400、340～400、360～400、380～400、100～380、100～360、100～340、100～320、100～300、100～280、100～260、100～240、100～220、100～200、100～180、100～160、100～140または100～120個のサブユニットまたはモノマー）を含有することができる。いくつかの態様において、アニオン性ポリマーは、少なくとも3kDa（例えば5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50kDa）の分子量を有する。いくつかの態様において、アニオン性ポリマーは、3kDa～50kDa（例えば3kDa～45kDa、3kDa～40kDa、3kDa～35kDa、3kDa～30kDa、3kDa～25kDa、3kDa～20kDa、3kDa～15kDa、3kDa～10kDa、3kDa～5kDa、5kDa～50kDa、10kDa～50kDa、15kDa～50kDa、20kDa～50kDa、25kDa～50kDa、30kDa～50kDa、35kDa～50kDa、40kDa～50kDa、または45kDa～50kDa）の分子量を有する。いくつかの態様において、アニオン性ポリマーは、50kDa～150kDa（例えば50kDa～140kDa、50kDa～130kDa、50kDa～120kDa、50kDa～110kDa、50kDa～100kDa、50kDa～90kDa、50kDa～80kDa、50kDa～70kDa、50kDa～60kDa、60kDa～150kDa、70kDa～150kDa、80kDa～150kDa、90kDa～150kDa、100kDa～150kDa、110kDa～150kDa、120kDa～150kDa、130kDa～150kDa、または140kDa～150kDa）の分子量を有する。いくつかの態様において、アニオン性ポリマーは、15kDa～50kDa（例えば15kDa～45kDa、15kDa～40kDa、15kDa～35kDa、15kDa～30kDa、15kDa～25kDa、15kDa～20kDa、20kDa～50kDa、25kDa～50kDa、30kDa～50kDa、35kDa～50kDa、40kDa～50kDa、または45kDa～50kDa）の分子量を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、10:1～120:1、例えば10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110:1、または120:1;10:1～110:1、10:1～100:1、10:1～90:1、10:1～80:1、10:1～70:1、10:1～60:1、10:1～50:1、10:1～40:1、10:1～30:1、10:1～20:1、20:1～120:1、30:1～120:1、40:1～120:1、50:1～120:1、60:1～120:1、70:1～120:1、80:1～120:1、90:1～120:1、100:1～120:1、または110:1～120:1の、アニオン性ポリマー:Casタンパク質のモル比を有する。

以下の実施例は例示のために記載されるに過ぎず、限定のために記載されるのではない。変更または改変しても本質的に同じまたは類似する結果を与えうる種々の決定的でないパラメータは当業者にはすぐにわかるだろう。

実施例1-方法
細胞培養
Trima Accelアフェレーシス後の白血球低減チャンバ残留物から、健常ヒトドナーの初代成人細胞を得た。SepMateチューブ（STEMCELL）を（製造者の説明書に従って）使用し、Ficoll-Paque（GE Healthcare）遠心分離によって、末梢血単核球を単離した。次に、EasySepバルク（CD3^＋）T細胞単離キット（STEMCELL）を（製造者の説明書に従って）使用し、磁気陰性選択によって、リンパ球をさらに単離した。

5％ウシ胎児血清、50μM 2-メルカプトエタノール、10mM N-アセチルL-システイン、ビーズ対細胞比が1:1である抗ヒトCD3/CD28磁性Dynaビーズ（Thermo Fisher）、ならびにIL-2が500U・ml^-1（UCSF Pharmacy）、IL-7が5ng・ml^-1（R＆D Systems）およびIL-15が5ng・ml^-1（R＆D Systems）のサイトカインカクテルを含むXVivo15培地（Lonza）中、75万細胞・ml^-1で、単離されたT細胞を、2日間、活性化し、培養した。活性化T細胞をそれぞれの培養容器から収集し、細胞をEasySep細胞分離マグネット（STEMCELL）上に5分間置くことによって、Dynaビーズを除去した。

RNP形成
Cas9 RNPはエレクトロポレーションの直前に調剤した。合成CRISPR RNA（crRNA）およびトランス活性化crRNA（tracrRNA）を化学合成し（Dharmacon）、160μMの濃度でIDTデュプレックス緩衝液（IDT duplex buffer）に再懸濁し、小分けして-80℃で貯蔵した。gRNAを作るために、crRNAとtracrRNAのアリコートを融解し、1:1 v/v混合し、37℃で30分間のインキュベーションによってアニールさせることで、80μM gRNA溶液を形成させた。Cas9-NLSはUniversity of California Berkeley QB3 MacroLabから購入した。RNPを作るために、gRNAを40μM Cas9-NLSタンパク質と1:1 v/v混合することで、gRNA:Cas9のモル比を2:1にした。5～50kDa PGA（Sigma）を100mg・ml^-1になるように水に再懸濁し、滅菌濾過し、調製したばかりのgRNAと0.8:1の体積比で混合してから、gRNA:PGA:Cas9の最終体積比が1:0.8:1になるようにCas9タンパク質との複合体を形成させた。

HDRテンプレート生成
P2A-BCMA-CAR-P2Aインサートを挟む左相同性アームと右相同性アームとをコードする長い二本鎖HDRテンプレートをpUC19プラスミドにクローニングし、次にこれをPCRアンプリコンを生成させるためのテンプレートとして使用した。左相同性アームおよび右相同性アーム±追加のgRNA特異的シャトルを標的とするPCRプライマーを使って、KAPA HiFiポリメラーゼ（Kapa Biosystems）でHDRTを増幅した。ssDNAを生成させるために、リバースプライマー上に5'ビオチン化を含めた。PCR産物をSPRIビーズクリーンアップによって精製し、NanoDrop分光測光器（Thermo Fisher）で吸光度によって測定して0.5～2μg・μl^-1になるように、水に再懸濁した。ビオチン化PCR産物をストレプトアビジン結合磁性ビーズと共にインキュベートし、125mM NaOHで変性させることにより、ssDNAを生成させた。遊離の非ビオチン化鎖を含有する上清を、1×TE中の60mM酢酸ナトリウムpH5.2で中和した。ssDNAをSPRIビーズ精製によって濃縮し、0.5～2μg・μl^-1になるように水に再懸濁した。長いssDNAバックボーンを対応する5'および3'相補的オリゴヌクレオチドと共に1:1:1のモル比でインキュベートすることによって、ssDNAシャトルコンストラクトを生成させた。

エレクトロポレーションおよび解析
記載したモル量のHDRテンプレートを、50pmolのRNP/エレクトロポレーションと混合し、少なくとも15分間インキュベートしてから、細胞と混合して細胞へのエレクトロポレーションを行った。96ウェルフォーマット4D-Nucleofector（Lonza）でのエレクトロポレーションの直前に、細胞を90gで10分間、遠心分離し、培地を吸引し、0.75×10⁶細胞あたり20μlの緩衝液を使って、細胞をエレクトロポレーション緩衝液P3（Lonza）に再懸濁した。パルスコードEH-115で細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後は直ちに、80μLの成長培地をエレクトロポレーションウェルに直接加えることによって細胞をレスキューし、10～20分インキュベートしてから、取り出し、0.5～1.0×10⁶細胞・ml^-1になるように、成長培地に希釈した。48時間ごとに新鮮な成長培地とサイトカインを追加した。

エレクトロポレーションの5日後に細胞を収集して、定量的細胞カウントを得るために所定の体積（1ウェルあたり60μL）をサンプリングする自動96ウェルサンプラー付きのAttune NxTフローサイトメーター（Thermo Fisher）で染色およびフローサイトメトリー解析を行った。サイトメトリーデータは、FlowJoソフトウェア（BD Biosciences）を使って処理し、解析した。ノックイン効率は、組換えBCMAタンパク質（Acro Biosystems、H82E4）と抗Myc（Cell Signaling、9B11）の組合せによって検出されるBCMA-CARコンストラクトを発現する生存シングレット細胞のパーセンテージとして計算した。生存率は、エレクトロポレーションしていない対照における生存シングレット細胞のパーセンテージと比較した生存シングレット細胞のパーセンテージとして計算した。ノックインカウントは、培地60μL中のBCMA-CARコンストラクトを発現する生存シングレット細胞の総数として計算した。

結果を図2～6に示す。図2A～2Cは、スクランブルgRNAまたはG526 gRNAまたはG526 gRNA＋TRAC-CAR rAAVをエレクトロポレーションしたT細胞の、rAAV媒介ノックインならびにCARおよびTCRフローサイトメトリー解析を示している。図3A～3Cは、ssDNAシャトル媒介ノックインを表す。gRNA G526およびgRNA G527のssDNAシャトルバリアントはどちらも、最大ノックイン効率を増加させ（図3A）、細胞生存率を増加させ（図3B）、所望の遺伝子変化を伴って回収される細胞の総数を増加させた（図3C）。さらに、図4Aおよび図4Bは、（例えば内在性TCRを標的とする抗体被覆磁性ビーズを使った）TCR陰性選択によるノックインの濃縮を表す。このTCR陰性選択は、ガイドG527を使用した場合には、所望のノックインを持つ細胞を有意に濃縮したが、ガイドG526の場合はそうではなかった。図6A～6Dは、異なるgRNAを使ったTRAC座位へのCRISPR/Cas9標的組込みの概略図である。さらに図6Eは、Cas9とTRAC gRNAのRNPをエレクトロポレーションしrAAVによる形質導入を行ったT細胞の、TCR陰性精製前後の、代表的なTCR/CARフロープロットを表す。

実施例2-さまざまなgRNA配列の、さまざまな座位におけるノックアウトおよびノックインの効率の比較
上述の方法に続いて、以下に列挙するgRNA配列を、TCR、B2Mタンパク質またはCD4タンパク質をノックアウトし、TRAC座位、B2M座位またはCD4座位にGFPをノックインする能力について試験した。活性化T細胞にCas9と表示のgRNAとをエレクトロポレーションした。細胞表面タンパク質破壊はフローサイトメトリーによって測定した。ゲノム切断効率はサンガーシーケンシングとTIDE解析によって測定した。

TRAC座位について、TRAC座位および第1イントロンを標的とするgRNAの概略図を、図7Aに示す。図7Bのラベル（1）は、フローサイトメトリーによって測定される細胞表面TCR破壊を表す。図7Bのラベル（2）はゲノム切断効率を表す。さらに、図7Cは、表示のgRNAによるTRAC座位におけるGFP遺伝子ターゲティング効率およびTCR破壊を表す。GFP KIは、フローサイトメトリーによって測定し、G526 gRNAに標準化した。細胞表面TCR破壊はフローサイトメトリーによって測定した。

B2M座位について、B2M座位ならびに第1イントロンおよび第2イントロンを標的とするgRNAの概略図を、図7Dに示す。細胞表面B2M破壊はフローサイトメトリーによって測定した。ゲノム切断効率はサンガーシーケンシングとTIDE解析によって測定した。図7Eは、B2Mタンパク質破壊およびB2M座位におけるゲノム切断効率を表す。さらに、図7Fに示すように、B2MエクソンまたはイントロンRNPおよび関連NGFRドナーテンプレートをT細胞にエレクトロポレーションした4日後の代表的なフロープロットは、陰性選択後のKI陽性細胞の濃縮を実証している。下側の（イントロン）条件は、B2M陰性細胞におけるNGFR陽性細胞（KI陽性）の濃縮を表す。このようにB2M陰性選択はKI陽性細胞の濃縮をもたらす。

CD4座位について、CD4座位ならびに第1イントロンおよび第2イントロンを標的とするgRNAの概略図を、図7Gに示す。

実施例3-多重同時イントロンノックイン
多重同時イントロンノックインを、B2MイントロンターゲティングG576（SEQ ID NO:34）およびTRACイントロンターゲティングG527（SEQ ID NO:3）で行った。T細胞にB2MイントロンターゲティングG576（SEQ ID NO:34）をエレクトロポレーションし、TRACイントロンターゲティングG527（SEQ ID NO:3）をrAAVで形質導入した。内在性B2Mイントロンには切断型神経成長因子受容体（NGFR）を挿入し、内在性TRACイントロンにはBCMA-CARを挿入した。図10における上側の条件は、濃縮前の生存T細胞における二重陽性細胞（NGFRおよびBCMA-CAR陽性）を示している。図10における下側の条件は、陰性選択によってTCR陰性およびB2M陰性生存T細胞を選択する（すなわちTCRおよびB2M陰性精製を模倣する）ためのゲーティング戦略を表す。図10に示すように、陰性選択は、無精製集団と比較した場合に、二重陽性細胞（NGFRとBCMA-CARをどちらも発現する細胞）の20倍超の濃縮をもたらした。

本明細書に記載の実施例および態様には例示という目的しかないこと、そしてそれを踏まえて、さまざまな改変または変更が当業者に示唆されること、またそれらが本願の要旨および範囲ならびに添付の請求項の範囲内に含まれることはいうまでもない。本明細書において言及される刊行物、特許および特許出願はいずれも、参照により、あらゆる目的でその全体が、本明細書に組み入れられる。

非公式の配列表

Claims (36)

1. 配列
   

   

   を含むガイドRNA（gRNA）を含む、組成物。
2. 配列
   

   

   を含むガイドRNA（gRNA）を含む、組成物。
3. 配列
   

   

   を含むガイドRNA（gRNA）を含む、組成物。
4. 相同組換え修復テンプレート（HDRT）をさらに含む、請求項1～3のいずれか一項記載の組成物。
5. 少なくとも1つのCasタンパク質標的配列が前記HDRTに融合している、請求項4記載の組成物。
6. ガイドRNA（gRNA）と、少なくとも1つのCasタンパク質標的配列に融合しているHDRTとを含む組成物であって、該gRNAが配列
   

   

   を含み、該Casタンパク質標的配列が相補的ポリヌクレオチド配列との二本鎖デュプレックスを形成する、組成物。
7. 2つのCasタンパク質標的配列が前記HDRTに融合している、請求項4～6のいずれか一項記載の組成物。
8. 第1のCasタンパク質標的配列が前記HDRTの5'末端に融合しており、第2のCasタンパク質標的配列が前記HDRTの3'末端に融合している、請求項7記載の組成物。
9. 前記Casタンパク質標的配列が相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズして二本鎖デュプレックスを形成する、請求項4～8のいずれか一項記載の組成物。
10. 前記HDRTが一本鎖HDRTである、請求項4～9のいずれか一項記載の組成物。
11. Casタンパク質をさらに含む、請求項1～10のいずれか一項記載の組成物。
12. 前記Casタンパク質が、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9（Csn1およびCsx12としても知られる）、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、またはそれらのバリアントである、請求項11記載の組成物。
13. 前記Casタンパク質がCas9ヌクレアーゼである、請求項12記載の組成物。
14. 前記HDRTが、SEQ ID NO:10または11の配列を含む、請求項4～13のいずれか一項記載の組成物。
15. アニオン性ポリマーを含む、請求項1～14のいずれか一項記載の組成物。
16. 前記アニオン性ポリマーが、ポリグルタミン酸（PGA）、ポリアスパラギン酸、またはポリカルボキシグルタミン酸を含む、請求項15記載の組成物。
17. T細胞における内在性細胞表面タンパク質を、CARまたは外因性タンパク質で改変するための方法であって、請求項1～16のいずれか一項記載の組成物を該T細胞に導入する工程を含み、該CARまたは外因性タンパク質が内在性細胞表面タンパク質ゲノム座位に組み込まれる、方法。
18. 前記内在性細胞表面タンパク質が内在性TCRである、請求項17記載の方法。
19. 前記外因性タンパク質が、外因性細胞内タンパク質または外因性細胞表面タンパク質である、請求項17または請求項18記載の方法。
20. 前記外因性細胞表面タンパク質が外因性TCRである、請求項19記載の方法。
21. 前記内在性細胞表面タンパク質ゲノム座位が、T細胞受容体α定常鎖（TRAC）ゲノム座位である、請求項17～20のいずれか一項記載の方法。
22. 前記内在性細胞表面タンパク質が内在性β2ミクログロブリン（B2M）である、請求項17記載の方法。
23. 前記内在性細胞表面タンパク質ゲノム座位がB2Mゲノム座位である、請求項17または請求項22記載の方法。
24. 前記内在性細胞表面タンパク質が内在性CD4である、請求項17記載の方法。
25. 前記内在性細胞表面タンパク質ゲノム座位がCD4ゲノム座位である、請求項17または請求項24記載の方法。
26. 前記導入する工程がエレクトロポレーションを含む、請求項17～25のいずれか一項記載の方法。
27. 前記導入する工程がウイルス送達を含む、請求項17～25のいずれか一項記載の方法。
28. 前記ウイルス送達が、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の使用を含む、請求項27記載の方法。
29. 前記内在性細胞表面タンパク質を発現しないT細胞を選択する工程をさらに含む、請求項17～28のいずれか一項記載の方法。
30. 前記選択する工程が、抗体被覆磁性ビーズを用いて選択することを含む、請求項29記載の方法。
31. T細胞の集団から改変T細胞を選択するための方法であって、該T細胞の少なくとも一部における内在性細胞表面タンパク質がキメラ抗原受容体（CAR）または外因性タンパク質で置き換えられており、
    （1）該T細胞の集団を含む溶液を、該T細胞における該内在性細胞表面タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させる工程、および
    （2）抗体が結合しているT細胞を該溶液から分離する工程、および
    （3）残りの溶液を別の容器に移す工程
    を含み、
    該移す工程の後の該溶液では、該内在性細胞表面タンパク質が該CARまたは該外因性タンパク質で置き換えられている改変T細胞が濃縮されている、方法。
32. 前記内在性細胞表面タンパク質が内在性TCRである、請求項31記載の方法。
33. 前記外因性タンパク質が、外因性細胞内タンパク質または外因性細胞表面タンパク質である、請求項31または請求項32記載の方法。
34. 前記外因性細胞表面タンパク質が外因性TCRである、請求項33記載の方法。
35. 前記抗体が固体支持体に結合している、請求項31～34のいずれか一項記載の方法。
36. 前記固体支持体が磁性ビーズである、請求項35記載の方法。

Images