CN116648303A - 用于使用蠕动泵和阻尼器来生产药物组合物的系统和方法 - Google Patents

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C·A·佩特里
F·J·利姆
H·哈斯
S·赫尔纳
F·贝茨
T·坎德
P·A·伯杰
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Abstract

本文提供了用于与蠕动泵一起使用的方法和系统。更具体地，本文提供了蠕动泵系统，其包括阻尼器，所述阻尼器用于减少来自所述蠕动泵系统的流速的脉动以产生、混合、输送和/或制造药物组合物和制剂，所述药物组合物和制剂包括包含脂质和RNA的药物组合物和制剂。

Description

用于使用蠕动泵和阻尼器来生产药物组合物的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月8日提交的美国临时申请号63/075,723的优先权，该美国临时申请全文以引用方式并入本文。
序列表
本申请含有序列表。以下提交的以ASCII文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式(CRF)(文件名：146392048140SEQLIST.TXT，记录日期：2021年9月3日，大小：9,549字节)。
技术领域
本公开涉及用于产生、混合、输送和/或制造药物组合物和制剂的方法和系统。在一些实施例中，提供了用于与蠕动泵一起使用以用于形成药物混合物的管套件。更具体地，本公开涉及蠕动泵系统，其包括阻尼器，所述阻尼器用于减少来自蠕动泵系统的流速的脉动以产生、混合、输送和/或制造药物组合物和制剂，所述药物组合物和制剂包括包含脂质(例如，脂质体或脂质体复合物)和RNA的药物组合物和制剂。
背景技术
蠕动泵为正排量泵，其可以用于泵送各种流体。通常，蠕动泵包括循环泵壳和对管进行压缩的转子，该循环泵壳具有安装或连接在壳的内部的管。转子包括附接至转子的外周边的多个滚筒。当转子转动时，经压缩的管的部分被阻塞，从而迫使流体移动穿过管。由于每次旋转泵送固定量的流体，因此蠕动泵可以用于粗略测量待泵送的流体量。
蠕动泵的一个主要缺点为它们可能提供不均匀的流量。由于使用滚筒以压缩泵壳内的管，因此来自蠕动泵的流速会产生脉冲或振荡。因此，蠕动泵不太适合需要平稳一致的流动的地方。
核酸(如DNA和RNA)在各种治疗中越来越受到关注。各种报告描述了用于施用核酸的方法。参见，例如，US10485884，其出于所有目的通过引用并入本文。一种方法是利用阳离子脂质体(该阳离子脂质体诱导DNA/RNA缩合)的能力以促进将DNA或RNA细胞摄取至特定细胞中。阳离子脂质体通常由阳离子脂质(如DOTMA和/或DOTAP)和一种或多种辅助脂质(如DOPE)组成。所谓的“脂质体复合物”可以由阳离子(带正电荷)脂质体和阴离子(带负电荷)核酸形成。脂质体复合物可以通过将核酸与脂质体混合来自发形成，该混合由带正电荷的脂质体与带负电荷的核酸之间的静电相互作用来驱动。因此，需要用于生产、混合、输送和/或制造包含RNA和脂质(例如，脂质体)的药物组合物和制剂的方法和系统。
发明内容
本文提供了蠕动泵系统，其包括阻尼器，该阻尼器用于减少来自系统中的蠕动泵的流速的脉动或振荡。在一些实施例中，这些系统可用于生产、混合、输送和/或制造药物组合物和制剂，该药物组合物和制剂包括例如包含RNA和脂质(包括脂质体复合物或脂质体)的组合物和制剂。如上所解释的，由于蠕动泵的性质，来自蠕动泵的流速可能随时间而产生脉冲或振荡。因此，蠕动泵可能不适用于需要平稳或一致流速的某些用途。此类用途的一个实例可以为当蠕动泵用于对药物组合物进行排量时。这些药物组合物可能包含精巧且昂贵的组分。此外，药物组合物中给定组分的量对该药物组合物对于其预期用途是否有效和安全可能是至关重要的。例如，包含RNA和脂质(诸如脂质体复合物或脂质体)的药物组合物和制剂对以下敏感：(1)混合后形成核酸与脂质/脂质体时的核酸与脂质/脂质体的动态比率，以及；(2)在混合期间使用的平均流速。如果核酸的动态流速在操作过程中动态变化，则核酸与脂质/脂质体的比率将在整个混合操作中发生变化，从而导致所得脂质体复合物的质量属性(尺寸、多分散性指数、表面电荷等)的异质性更大。注射泵可以用于将核酸和脂质体/脂质(包括例如，RNA和脂质)混合，以形成可用于制造RNA疫苗的脂质体复合物(参见，例如，Oberli M.A等人Nano Lett.2017,17,1326-1335，或Kauffman,K.J.等人NanoLett.2015,15,7300-7306；还参见WO2019077053)。注射泵生成具有相对较低的脉动的流量，并且两种或更多种溶液的混合比率可以进行很好地控制。然而，普通注射器不提供A级洁净室环境之外的封闭的、无菌的边界，因为在拉动注射器柱塞以将流体加载至注射器筒中之前，注射器筒的内部暴露于周围环境。这对于其中脂质体和/或脂质体复合物太大以至于无法通过灭菌级过滤器并且无法在不显著降解的情况下进行最终灭菌的系统至关重要。相比之下，蠕动泵可以与完全封闭的流体路径一起使用，该完全封闭的流体路径不需要在A级洁净室环境中操作以保持无菌加工和灭菌保证。这是一个很大的优点，因为A级洁净室环境的维护成本高昂，并且需要耗时的环境监测控制。因此，申请人已经发现了使用蠕动泵的方法和系统，该蠕动泵包括阻尼器以大幅减少来自蠕动泵的脉动或振荡，该蠕动泵可用于生产、混合、输送和/或制造药物组合物和制剂，该药物组合物和制剂包括例如包含RNA和脂质(包括脂质体复合物或脂质体)的组合物和制剂，例如RNA疫苗。尽管本文所公开的阻尼器与蠕动泵结合进行讨论，但是泵系统不一定为蠕动泵系统，因为阻尼器可以与生成脉冲作为其作用机制的一部分的任何泵送系统(包括例如，膜、活塞等)结合。例如，注射泵系统可以使用本文所公开的阻尼器。在一些实施例中，使用包括阻尼器的蠕动泵的这些方法和系统适用于确保平稳或一致的流速，以产生、混合、输送和/或制造包含RNA和脂质(包括脂质体复合物或脂质体)的药物组合物，包括例如RNA疫苗。
在一些实施例中，一种用于形成混合物的管套件包括：第一管部分，其配置为流体连接至含有第一组合物的容器；第二管部分，其配置为流体连接至含有第二组合物的容器；阻尼器，其流体连接至第一管部分并且流体连接至第二管部分；混合器，其用于将来自第一管部分的第一组合物与来自第二管部分的第二组合物混合；混合物容器，其用于从混合器收集经混合的第一组合物与第二组合物，其中第一管部分配置为连接至至少一个蠕动泵头，以用于将第一组合物从含有第一组合物的容器泵送至混合物容器，并且第二管部分配置为连接至至少一个蠕动泵头，以用于将第二组合物从含有第二组合物的容器泵送至混合物容器。在一些实施例中，阻尼器包括封闭体积的流体。在一些实施例中，流体为空气。在一些实施例中，阻尼器为管阻尼器。在一些实施例中，阻尼器包括柔性膜。在一些实施例中，管套件包括将阻尼器、第一管部分和第一管混合器输入部分流体连接的第一三通连接器，其中第一管混合器输入部分流体连接至混合器。在一些实施例中，管套件包括将阻尼器、第二管部分和第二管混合器输入部分流体连接的第二三通连接器，其中第二管混合器输入部分流体连接至混合器。在一些实施例中，第一管部分包括第一管区段和第二管区段，其中第一管区段和第二管区段并行地流体连接。在一些实施例中，第一管区段配置为连接至第一蠕动泵头，并且第二管区段配置为连接至第二蠕动泵头。在一些实施例中，第二管部分包括第三管区段和第四管区段，其中第三管部分和第四管部分并行地流体连接。在一些实施例中，第三管区段配置为连接至第三蠕动泵头，并且第四管区段配置为连接至第四蠕动泵头。在一些实施例中，混合器包括流体连接至第一管部分的输入端、流体连接至第二管部分的输入端，以及流体连接至混合物容器的输出端。在一些实施例中，混合器包括Y形连接器、螺旋混合器或静态混合器。在一些实施例中，管套件包括第一阻尼器连接器和第二阻尼器连接器，该第一阻尼器连接器将第一管部分流体连接至阻尼器并且流体连接至混合器，并且该第二阻尼器连接器将第二管部分流体连接至阻尼器并且流体连接至混合器。在一些实施例中，混合物容器为袋子、器皿或瓶子。
在一些实施例中，一种用于形成药物组合物或药物组合物的混合物的系统，该系统包括：第一容器，其含有第一药物组合物；第二容器，其含有第二药物组合物；第一管部分，其流体连接至第一容器；第二管部分，其流体连接至第二容器；阻尼器，其流体连接至第一管部分并且流体连接至第二管部分；混合器，其用于将来自第一管部分的第一药物组合物与来自第二管部分的第二药物组合物混合；以及混合物容器，其用于从混合器收集经混合的第一药物组合物与第二药物组合物。在一些实施例中，该系统包括连接至第一管部分的至少一个蠕动泵头，以用于将第一组合物从含有第一组合物的容器泵送至混合物容器；以及连接至第二管部分的至少一个蠕动泵，以用于将第二组合物从含有第一组合物的容器泵送至混合物容器。在一些实施例中，第一组合物或第二组合物包含核酸，一种或多种脂质，一种或多种蛋白质，或缓冲剂。在一些实施例中，第一组合物包含核酸并且第二组合物包含一种或多种脂质。在一些实施例中，第一组合物包含RNA并且第二组合物包含一种或多种脂质。在一些实施例中，RNA包含一种或多种多核苷酸，该一种或多种多核苷酸编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的10个至20个新表位。在一些实施例中，RNA被配制在脂质体复合物纳米颗粒或脂质体中。在一些实施例中，脂质体复合物纳米颗粒或脂质体包含一种或多种脂质，该一种或多种脂质形成包封RNA的多层结构。在一些实施例中，所述一种或多种脂质包含至少一种阳离子脂质和至少一种辅助脂质。在一些实施例中，所述一种或多种脂质包含(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油酰氧基-1-丙铵氯化物(DOTMA)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一些实施例中，在生理pH，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比为1.3:2(0.65)。在一些实施例中，RNA包含RNA分子，该RNA分子在5'→3'方向上包含：(1)5'帽；(2)5'非翻译区(UTR)；(3)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；(4)编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的该一个或多个新表位的多核苷酸序列；(5)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；(6)3'UTR，其包含：(a)分裂的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及(7)poly(A)序列。在一些实施例中，RNA分子进一步包含编码氨基酸接头的多核苷酸序列；其中编码氨基酸接头的多核苷酸序列与该一个或多个新表位中的第一新表位形成第一接头-新表位模块；并且其中在5'→3'方向上，形成第一接头-新表位模块的多核苷酸序列在编码分泌性信号肽的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。在一些实施例中，氨基酸接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:21)。在一些实施例中，编码氨基酸接头的多核苷酸序列包含序列GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCCGGAGGC(SEQ ID NO:19)。在一些实施例中，RNA分子在5'→3'方向上进一步包含：至少第二接头-表位模块，其中至少第二接头-表位模块包含编码氨基酸接头的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；其中在5'→3'方向上，形成第二接头-新表位模块的多核苷酸序列在编码第一接头-新表位模块的新表位的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间；并且其中第一接头-表位模块的新表位不同于第二接头-表位模块的新表位。在一些实施例中，RNA分子包含5个接头-表位模块，并且其中5个接头-表位模块各自编码不同的新表位。在一些实施例中，RNA分子包含10个接头-表位模块，并且其中10个接头-表位模块各自编码不同的新表位。在一些实施例中，RNA分子包含20个接头-表位模块，并且其中20个接头-表位模块各自编码不同的新表位。在一些实施例中，RNA分子进一步包含编码氨基酸接头的第二多核苷酸序列，其中编码氨基酸接头的第二多核苷酸序列在编码3'方向上最远的新表位的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。在一些实施例中，5'帽包含以下结构的D1非对映异构体：
在一些实施例中，5'UTR包含序列
UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:5)。在一些实施例中，5'UTR包含序列
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:3)。在一些实施例中，分泌性信号肽包含氨基酸序列MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ ID NO:9)。在一些实施例中，编码分泌性信号肽的多核苷酸序列包含序列
AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:7)。在一些实施例中，MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分包含氨基酸序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA(SEQ IDNO:12)。在一些实施例中，编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列包含序列
AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC(SEQ ID NO:10)。在一些实施例中，AES mRNA的3'非翻译区包含序列
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ IDNO:15)。在一些实施例中，线粒体编码的12S RNA的非编码RNA包含序列
CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:17)。在一些实施例中，3'UTR包含序列
CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:13)。在一些实施例中，poly(A)序列包含120个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，RNA包含RNA分子，该RNA分子在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:1)；编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的该一个或多个新表位的多核苷酸序列；以及多核苷酸序列
AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，一种用于使用蠕动泵来输送药物组合物的方法包括：使用至少一个蠕动泵，从第一容器穿过第一管部分泵送第一组合物；使用至少一个蠕动泵，穿过第二管部分从第二容器泵送第二组合物；以及使用流体连接至第一管部分并且流体连接至第二管部分的阻尼器，阻尼在第一管部分中的第一组合物的流体流动中的脉冲并且阻尼在第二管部分中的第二组合物的流体流动中的脉冲。在一些实施例中，该方法包括：在流体连接至第一管部分和第二管部分的混合器中，将来自第一管部分的第一组合物与来自第二管部分的第二组合物混合。在一些实施例中，该方法包括：将含有第一组合物和第二组合物的混合物沉积至流体连接至混合物的混合物容器中。在一些实施例中，第一组合物或第二组合物包含核酸，一种或多种脂质，一种或多种蛋白质，或缓冲剂。在一些实施例中，第一组合物包含核酸并且第二组合物包含一种或多种脂质。在一些实施例中，第一组合物包含RNA并且第二组合物包含一种或多种脂质。在一些实施例中，RNA包含一种或多种多核苷酸，该一种或多种多核苷酸编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的10个至20个新表位。在一些实施例中，RNA被配制在脂质体复合物纳米颗粒或脂质体中。在一些实施例中，脂质体复合物纳米颗粒或脂质体包含一种或多种脂质，该一种或多种脂质形成包封RNA的多层结构。在一些实施例中，所述一种或多种脂质包含至少一种阳离子脂质和至少一种辅助脂质。在一些实施例中，所述一种或多种脂质包含(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油酰氧基-1-丙铵氯化物(DOTMA)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一些实施例中，在生理pH，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比为1.3:2(0.65)。在一些实施例中，RNA包含RNA分子，该RNA分子在5'→3'方向上包含：(1)5'帽；(2)5'非翻译区(UTR)；(3)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；(4)编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的该一个或多个新表位的多核苷酸序列；(5)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；(6)3'UTR，其包含：(a)分裂的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及(7)poly(A)序列。在一些实施例中，RNA分子进一步包含编码氨基酸接头的多核苷酸序列；其中编码氨基酸接头的多核苷酸序列与该一个或多个新表位中的第一新表位形成第一接头-新表位模块；并且其中在5'→3'方向上，形成第一接头-新表位模块的多核苷酸序列在编码分泌性信号肽的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。在一些实施例中，氨基酸接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:21)。在一些实施例中，编码氨基酸接头的多核苷酸序列包含序列GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCCGGAGGC(SEQ ID NO:19)。在一些实施例中，RNA分子在5'→3'方向上进一步包含：至少第二接头-表位模块，其中至少第二接头-表位模块包含编码氨基酸接头的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；其中在5'→3'方向上，形成第二接头-新表位模块的多核苷酸序列在编码第一接头-新表位模块的新表位的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间；并且其中第一接头-表位模块的新表位不同于第二接头-表位模块的新表位。在一些实施例中，RNA分子包含5个接头-表位模块，并且其中5个接头-表位模块各自编码不同的新表位。在一些实施例中，RNA分子包含10个接头-表位模块，并且其中10个接头-表位模块各自编码不同的新表位。在一些实施例中，RNA分子包含20个接头-表位模块，并且其中20个接头-表位模块各自编码不同的新表位。在一些实施例中，RNA分子进一步包含编码氨基酸接头的第二多核苷酸序列，其中编码氨基酸接头的第二多核苷酸序列在编码3'方向上最远的新表位的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。在一些实施例中，5'帽包含以下结构的D1非对映异构体：
在一些实施例中，5'UTR包含序列
UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:5)。在一些实施例中，5'UTR包含序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:3)。在一些实施例中，分泌性信号肽包含氨基酸序列MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ IDNO:9)。在一些实施例中，编码分泌性信号肽的多核苷酸序列包含序列
AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:7)。在一些实施例中，MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分包含氨基酸序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA(SEQ IDNO:12)。在一些实施例中，编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列包含序列
AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC(SEQ ID NO:10)。在一些实施例中，AES mRNA的3'非翻译区包含序列
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ IDNO:15)。在一些实施例中，线粒体编码的12S RNA的非编码RNA包含序列
CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:17)。在一些实施例中，3'UTR包含序列
CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:13)。在一些实施例中，poly(A)序列包含120个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，RNA包含RNA分子，该RNA分子在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:1)；编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的该一个或多个新表位的多核苷酸序列；以及多核苷酸序列
AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，一种用于使用蠕动泵来输送药物组合物的方法包括：使用至少一个蠕动泵头，以第一流速从第一容器穿过第一管部分泵送第一组合物；使用至少一个蠕动泵，以第二流速从第二容器穿过第二管部分泵送第二组合物；以及使用流体连接至第一管部分并且流体连接至第二管部分的阻尼器，阻尼在第一管部分中的第一组合物的流体流动中的脉冲并且阻尼在第二管部分中的第二组合物的流体流动中的脉冲，其中第一管部分中在阻尼器之后的第一流速的流速脉动水平(LoP)小于10，并且第二管部分中在阻尼器之后的第二流速的流速脉动水平(LoP)小于10。
在一些实施例中，一种用于制造包含核酸和一种或多种脂质的药物组合物的方法，该方法包括：使用至少一个蠕动泵头，以第一流速从第一容器穿过第一管部分泵送包含核酸的第一组合物；使用至少一个蠕动泵头，以第二流速从第二容器穿过第二管部分泵送包含一种或多种脂质的第二组合物；使用流体连接至第一管部分并且流体连接至第二管部分的阻尼器，阻尼在第一管部分中的第一组合物的流体流动中的脉冲并且阻尼在第二管部分中的第二组合物的流体流动中的脉冲；在流体连接至第一管部分和第二管部分的混合器中，将来自第一管部分的包含核酸的第一组合物与来自第二管部分的包含该一种或多种脂质的第二组合物混合；以及将包含核酸和该一种或多种脂质的组合物沉积至流体连接至混合物的容器中。
在一些实施例中，第一管部分和第二管部分配置为连接至同一蠕动泵的泵头。在一些实施例中，第一管部分、第二管部分、阻尼器、混合器和/或混合物容器由一次性使用的材料制成。管套件或系统为无菌的、封闭的管套件或系统；或者该方法在无菌的、封闭的系统中执行。
在一些实施例中，一种用于形成混合物的管套件包括：第一管部分，其配置为流体连接至含有第一组合物的第一容器；第二管部分，其配置为流体连接至含有第二组合物的第二容器；管阻尼器，其包括流体连接至第一管部分和第二管部分的封闭体积的流体；混合器，其流体连接至在流体阻尼器的下游的第一管部分和第二管部分，并且配置为将来自第一管部分的第一组合物与来自第二管部分的第二组合物混合；混合物容器，其流体连接至混合器，并且配置为从混合器收集经混合的第一组合物与第二组合物，其中第一管部分配置为连接至管阻尼器的上游的第一蠕动泵头，以用于将第一组合物从第一容器泵送至混合物容器，并且第二管部分配置为连接至管阻尼器的上游的第二蠕动泵头，以用于将第二组合物从第二容器泵送至混合物容器。
在一些实施例中，一种用于形成药物组合物或药物组合物的混合物的系统，该系统包括：第一容器，其含有第一药物组合物；第二容器，其含有第二药物组合物；第一管部分，其流体连接至第一容器；第二管部分，其流体连接至第二容器；蠕动泵，其包括：第一蠕动泵头，该第一蠕动泵头连接至第一管部分，以用于从第一容器泵送第一药物组合物；以及第二蠕动泵头，该第二蠕动泵头连接至第二管部分，以用于从第二容器泵送第二药物组合物；管阻尼器，其包括流体连接至在蠕动泵的下游的第一管部分和第二管部分的封闭体积的流体；混合器，其流体连接至在流体阻尼器的下游的第一管部分和第二管部分，并且配置为将来自第一管部分的第一药物组合物与来自第二管部分的第二药物组合物混合；以及混合物容器，其流体连接至混合器，并且配置为从混合器收集经混合的第一药物组合物与第二药物组合物。
在一些实施例中，一种用于使用蠕动泵来输送药物组合物的方法包括：使用第一蠕动泵头，从第一容器穿过第一管部分泵送第一组合物；使用第二蠕动泵头，从第二容器穿过第二管部分泵送第二组合物；以及使用包括流体连接至第一管部分和第二管部分的封闭体积的流体的管阻尼器，阻尼在第一蠕动泵头下游的第一管部分中的第一组合物的流体流动中的脉冲并且阻尼在第二蠕动泵头下游的第二管部分中的第二组合物的流体流动中的脉冲；在流体连接至在流体阻尼器的下游的第一管部分和第二管部分的混合器中，将来自第一管部分的第一组合物与来自第二管部分的第二组合物混合；以及将包含经混合的第一组合物与第二组合物的组合物沉积至流体连接至混合器的容器中。
在一些实施例中，一种用于形成混合物的管套件包括：第一管部分，其配置为流体连接至含有第一组合物的容器；第二管部分，其配置为流体连接至含有第二组合物的容器；第一阻尼器，其流体连接至第一管部分；第二阻尼器，其流体连接至第二管部分；混合器，其用于将来自第一管部分的第一组合物与来自第二管部分的第二组合物混合；混合物容器，其用于从混合器收集经混合的第一组合物与第二组合物，其中第一管部分配置为连接至至少一个蠕动泵头，以用于将第一组合物从含有第一组合物的容器泵送至混合物容器，并且第二管部分配置为连接至至少一个蠕动泵头，以用于将第二组合物从含有第二组合物的容器泵送至混合物容器。在一些实施例中，第一阻尼器和/或第二阻尼器包括封闭体积的流体。在一些实施例中，流体为空气。在一些实施例中，第一阻尼器和/或第二阻尼器为管阻尼器。在一些实施例中，阻尼器包括柔性膜。在一些实施例中，管套件包括将第一阻尼器、第一管部分和第一管混合器输入部分流体连接的第一三通连接器，其中第一管混合器输入部分流体连接至混合器。在一些实施例中，管套件包括将第二阻尼器、第二管部分和第二管混合器输入部分流体连接的第二三通连接器，其中第二管混合器输入部分流体连接至混合器。在一些实施例中，第一管部分包括第一管区段和第二管区段，其中第一管区段和第二管区段并行地流体连接。在一些实施例中，第一管区段配置为连接至第一蠕动泵头，并且第二管区段配置为连接至第二蠕动泵头。在一些实施例中，其中第二管部分包括第三管区段和第四管区段，其中第三管部分和第四管部分并行地流体连接。在一些实施例中，其中第三管区段配置为连接至第三蠕动泵头，并且第四管区段配置为连接至第四蠕动泵头。在一些实施例中，混合器包括流体连接至第一管部分的输入端、流体连接至第二管部分的输入端，以及流体连接至混合物容器的输出端。在一些实施例中，混合器包括Y形连接器、螺旋混合器或静态混合器。在一些实施例中，管套件包括第一阻尼器连接器和第二阻尼器连接器，该第一阻尼器连接器将第一管部分流体连接至第一阻尼器并且流体连接至混合器，并且该第二阻尼器连接器将第二管部分流体连接至第二阻尼器并且流体连接至混合器。在一些实施例中，混合物容器为袋子、器皿或瓶子。
在一些实施例中，一种用于流体泵的脉动阻尼器包括：生物处理袋，其包括流体入口和流体出口，其中流体入口配置为流体连接至流体泵的下游；外壳，其配置为容纳生物处理袋，其中外壳包括基底和多个侧壁，该基底和多个侧壁形成用于生物处理袋的空腔，并且至少一个侧壁包括一个或多个缺口，该一个或多个缺口配置为提供通向生物处理袋的流体入口和流体出口的通路；以及外壳盖，其配置为附接至该多个侧壁并且闭合外壳。在一些实施例中，生物处理袋包括气体入口，其中气体入口配置为流体连接至气体源。在一些实施例中，该一个或多个缺口配置为提供通向生物处理袋的气体入口的通路。在一些实施例中，外壳的基底包括窗口。在一些实施例中，窗口包括在外壳的基底中的开口或在外壳的基底中的透明材料。在一些实施例中，外壳盖包括窗口。在一些实施例中，窗口包括在外壳盖中的开口或在外壳盖中的透明材料。在一些实施例中，阻尼器包括配置为连接至外壳的至少一个侧壁和/或外壳盖的前板，其中前板包括配置为容纳流体入口和流体出口的至少一个孔。在一些实施例中，流体泵为循环泵。在一些实施例中，循环泵为蠕动泵。在一些实施例中，流体出口配置为流体连接至流体储存容器。在一些实施例中，流体出口包括止回阀。
从以下详细描述中，额外的优点对本领域技术人员来说将是显而易见的。本文的实例和描述应被认为是本质上是说明性的而不是限制性的。
附图说明
参考附图来描述示例性实施例，其中：
图1示出了根据本文所公开的一些实施例的用于测量蠕动泵的流速的实验设置的实例。
图2示出了在实验1中实现的穿过蠕动泵的水的流速。
图3示出了根据本文所公开的一些实施例的用于测量具有阻尼器的蠕动泵的流速的实验设置的实例。
图4为如本文所公开的具有各种三通连接器的注射器阻尼器的图像。
图5示出了在实验2中实现的穿过蠕动泵的流速。
图6示出了在实验4中实现的穿过蠕动泵的流速。
图7示出了在实验6中实现的穿过蠕动泵的流速。
图8为如本文所公开的具有三通连接器的膜阻尼器的图像。
图9示出了根据本文所公开的一些实施例的三通连接器管连接器的实例。
图10示出了根据本文所公开的一些实施例的十字管连接器的实例。
图11示出了根据本文所公开的一些实施例的用于测量具有阻尼器的双源蠕动泵系统的流速的实验设置的实例。
图12示出了将两条单独的流体管线连接的阻尼器回路的实例。
图13示出了在实验19中实现的穿过蠕动泵系统的水的流速。
图14示出了在实验20中实现的穿过蠕动泵的水的流速。
图15示出了根据本文所公开的一些实施例的管套件的实例。
图16示出了示例性RNA分子(即，多新表位RNA)的一般结构。该图为RNA原料药的一般结构的示意图，其具有恒定5'-帽(β-S-ARCA(D1))、5'-非翻译区和3'-非翻译区(分别为hAg-Kozak和FI)、N末端和C末端融合标签(分别为sec2.0和MITD)和poly(A)尾巴(A120)以及编码通过富含GS的接头融合的新表位(neo1至neo10)的肿瘤特异性序列。
图17为示例性RNA分子(SEQ ID NO:24)的恒定区的核糖核苷酸序列(5'->3')。前两个G残基之间的键结为独特的键(5'→5')-ppsp-，如图18中的5'加帽结构所示。患者癌症特异性序列的在C131与A132残基(以粗体标记)之间。“N”是指编码一个或多个(例如，1-20个)新表位(由任选的接头隔开)的一个或多个多核苷酸序列的位置。
图18为在RNA恒定区的5'末端所用的5'-加帽结构β-S-ARCA(D1)(m2 7·2'·OGppspG)。立体P中心为“D1”异构体中的Rp构型。注释：红色示出β-S-ARCA(D1)与碱性帽结构m7GpppG之间的差异；结构单元m7G的C2'位置处的-OCH3基团和β-磷酸酯处的非桥接氧被硫取代。由于存在立体P中心(带有*标记)，硫代磷酸酯帽类似物β-S-ARCA以两种非对映异构体形式存在。根据它们在反相高效液相色谱中的洗脱顺序，将其称为01和02。
图19为本文所解释的实验中使用的HPPD装置的示意性概述。
图20示出了利用玻璃瓶作为HPPD的实验设置。
图21为描绘图20的玻璃瓶阻尼器实现恒定压力所花费的时间，以及在泵已经停止之后同一HPPD消散该所获取的压力所花费的时间的图表。
图22为描绘图20的玻璃瓶阻尼器在恒定持续时间内在各种流速下的排量的图表。
图23为显示玻璃瓶HPPD装置上方的压差(HPPD之前的压力与HPPD之后的压力)作为不断增加的气穴尺寸的函数的图表。
图24示出了基于实验室烧瓶的HPPD(左)和具有可移除的衬垫的相同装置(其允许HPPD在理论上被视为一次性使用的装置)(右)。
图25为描绘具有和不具有衬垫(即，气囊阻尼器)的图24的HPPD阻尼器的效率的图表。
图26示出了一种柔性的、一次性使用的HPPD设计，该设计基于经修改的生物处理袋，该经修改的生物处理袋包括经升高的入口管，以确保在高背压的情况下经泵送的流体不会发生反冲洗；并且包含额外的第三点，该额外的第三点允许插入气体以用气垫来预填充袋子，以改善该装置的启动效率。
图27示出了具有纸箱壳的生物处理袋阻尼器。
图28A为根据本文所公开的一些实施例的HPPD的分解图。
图28B为根据本文所公开的一些实施例的HPPD的外壳。
图28C为根据本文所公开的一些实施例的使用中的HPPD。
图29A示出了蠕动泵实验设置和流动曲线结果。
图29B示出了注射泵实验设置和流动曲线结果。
图29C示出了具有本文所公开的HPPD阻尼器的蠕动泵实验设置和流动曲线结果。
图30示出了商业Cole-Parmer HPPD。
图31A示出了Cole-Parmer HPPD设置的流动曲线。
图31B示出了本文所公开的HPPD阻尼器的流动曲线。
图32示出了本文所公开的HPPD阻尼器的死体积和阻尼器入口处的压力随着流速不断增加的变化。
图33A示出了1.6mm的内径对如本文所公开的脉动的影响。
图33B示出了3.2mm的内径对如本文所公开的脉动的影响。
图33C示出了6mm的内径对如本文所公开的脉动的影响。
图34A示出了1米的管长度对如本文所公开的脉动的影响。
图34B示出了2米的管长度对如本文所公开的脉动的影响。
图34C示出了20米的管长度对如本文所公开的脉动的影响。
具体实施方式
申请人已经发现了使用蠕动泵的方法和系统，该蠕动泵包括阻尼器以大幅减少来自蠕动泵的脉动或振荡。本文所公开的方法和系统可以最小化实现阻尼所需的部件数量。此外，本文所公开的套件和系统可以是一次性使用的一次性套件和系统，该一次性套件和系统可以为生产、混合、输送和/或制造药物组合物和制剂提供主要益处，该药物组合物和制剂包括例如包含RNA和脂质(包括脂质体复合物或脂质体)的组合物和制剂。在本文所公开的一些实施例中，包含RNA和脂质(包括脂质体复合物或脂质体)的组合物和制剂为RNA疫苗。
本公开还提供了适用于两个流体源一起使用的蠕动泵、阻尼器和管套件系统，该两个流体源包括例如本文所述的药物组合物，并且特别是包含RNA、RNA分子或RNA疫苗的第一药物组合物和包含一种或多种脂质的第二药物组合物，可以将该第一药物组合物和该第二药物组合物混合以产生、输送或制造包含RNA-脂质体复合物、RNA脂质体或RNA疫苗的最终药物组合物。在一些实施例中，本文所述的方法和系统可以用于GMP制造过程，该过程需要显著减少当使用蠕动泵时通常观察到的流速的脉动或振荡。
I.定义
在详细描述本发明之前，应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定实施例的目的，并非旨在进行限制。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用语旨在具有所要求保护的主题物所属领域的普通技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为清晰起见和/或为便于参考，本文定义了具有通常理解含义的术语，并且与现有技术中通常理解的术语定义相比，本文包含的这些定义不一定解释成表示与本领域的通常理解存在明显差异。
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确地指出。还应理解，本文所用的术语“和/或”是指并涵盖相关列出项中的一项或多项的任何和所有可能组合。还应进一步理解，当在本文使用术语“包括”和/或“包含”时，其指定所规定的特征、整数、步骤、操作、要素、组分和/或单元的存在，但并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、单元和/或它们的组。
在整个本公开中，以范围格式呈现各个方面。应当理解，以范围格式进行的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开的不灵活限制。因此，对范围的描述应当被认为已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，在提供值范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限与在所述范围内的任何其他所述值或中间值之间的每个中间值都涵盖在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，并且也包括在本公开中，但要遵守所述范围内的任何明确排除的限制。若所述范围包括一个或两个限值，则排除那些所包括限制中的任意一个或两个的范围也包括在本公开内容中。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用的术语“约”是指针对容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包括(且描述)涉及该值或参数本身的实施例。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。在一些实施例中，“约”可以是指如本领域技术人员所理解的±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±1％。
如本文所用，组合物是指一种或多种产物、物质或化合物的任何混合物，包括细胞。它可以为溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或它们的任意组合。
如本文所用，“蠕动泵”是指一种可以用于泵送各种流体的正排量泵。蠕动泵包括但不限于Masterflex泵(HV-77921-75)和Watson Marlow Flexicon(PD12I)。通常，蠕动泵用于生物制药有两个原因：(1)该系统可以经由封闭的系统来泵送流体(即，没有暴露的泵部件与流体接触；以及(2)剪切应力很小。
术语“阻尼器”是指可以减少来自泵(包括例如，蠕动泵)的流速的脉动和/或振荡的任何部件、装置或机构。
术语“管套件”是指管道/管和可以与管道/管相互作用的其他部件的组件。
术语“药物组合物”或“药物制剂”或“药物组合物和制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用该药物组合物的受试者具有不可接受的毒性的附加组分的制剂。此类制剂为无菌制剂。“药用”赋形剂(载体、添加剂)是指可合理地施用于受试哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的赋形剂。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在本文所述的一些实施例中，药物组合物包含核酸(包括例如，RNA、mRNA或RNA疫苗)和/或一种或多种脂质(包括例如，阳离子脂质和/或中性“辅助”脂质)。
“个体”、“受试者”或“患者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些方面，个体或受试者是人。
术语“核酸”或“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团组成。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)、基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。“分离的”核酸是指已从其自然环境的组分中分离的核酸分子。经分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有核酸分子的细胞中，但该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
术语“RNA”或“RNA分子”涉及包含核糖核苷酸残基并且优选完全或基本上由核糖核苷酸残基组成的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基基团的2'-位置处具有羟基基团的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，诸如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA以及经修饰的RNA，该经修饰的RNA通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或改变而不同于天然存在的RNA。此类改变可以包括添加非核苷酸材料，诸如添加至RNA的末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，诸如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的RNA可以称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
术语“RNA”还包括并且优选涉及意指“信使RNA”的“mRNA”，并且涉及可以使用DNA作为模板而进行生产并且编码肽或蛋白质的“转录物”。mRNA通常包含5'非翻译区(5'-UTR)、蛋白质或肽编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。mRNA在细胞中并且在体外的具有有限的半衰期。mRNA可以使用DNA模板通过体外转录或化学合成来进行生产。体外转录方法为技术人员已知的。例如，存在各种市售的体外转录套件。
如本文所用，“RNA疫苗”是指编码一种或多种抗原并且当施用于受试者或个体时诱导免疫应答(例如，针对抗原的保护性免疫)的RNA、RNA多核苷酸或RNA分子。已经描述了若干RNA疫苗。(参见，例如，Pardi等人“mRNA vaccines—a new era in vaccinology”.NatRev Drug Discov 17,261–279(2018).https://doi.org/10.1038/nrd.2017.243。
术语“脂质体复合物”或“RNA脂质体复合物”是指脂质和核酸(例如RNA)的复合物。当阳离子脂质和/或脂质体(其通常还包括中性“辅助”脂质)与核酸混合时，脂质体复合物会自发形成。
当本公开涉及电荷(诸如正电荷、负电荷或中性电荷，或者阳离子化合物、阴性化合物或中性化合物)时，这通常是指所提及的电荷存在于选定的pH(例如生理pH)下。例如，术语“阳离子脂质”是指在选定的pH(例如生理pH)下具有净正电荷的脂质。术语“中性脂质”意指不具有净正电荷或净负电荷的脂质，并且可以在选定的pH(例如生理pH)下以不带电或中性两性离子的形式存在。本文的“生理pH”意指约7.5的pH。
用于本发明的本文所述的脂质载体包括RNA可以与其缔合的任何物质或载体，例如通过与RNA形成复合物或形成将RNA封闭或包封在其中的囊泡。这可能导致与裸RNA相比，RNA的稳定性增加。特别地，血液中RNA的稳定性可能增加。
阳离子脂质、阳离子聚合物和其他具有正电荷的物质可能与带负电荷的核酸形成复合物。这些阳离子分子可以用于复合核酸，从而分别形成例如所谓的脂质体复合物或多聚复合物。
脂质体为微观脂质囊泡，其通常具有一个或多个双层的形成囊泡的脂质，例如磷脂，并且能够包封药物或核酸分子，例如RNA。在本发明的上下文中可以采用不同类型的脂质体，其包括但不限于多层囊泡(MLV)、小单层囊泡(SUV)、大单层囊泡(LUV)、空间稳定的脂质体(SSL)、多泡囊泡(MV)和大多泡囊泡(LMV)以及本领域已知的其他双层形式。脂质体的尺寸和脂双层将取决于制备方式，并且待使用的囊泡类型的选择取决于优选的施用模式。存在若干其他形式的超分子组织，其中脂质可以存在于水性介质中，该水性介质包含层状相、六方相和反六方相、立方相、胶束、由单层组成的反胶束。这些相也可以在与DNA或RNA的结合中获得，并且与RNA和DNA的相互作用可能显著影响相态。
对于脂质体的形成，可以使用任何合适的形成脂质体的方法，只要该方法提供适用于制造所设想的RNA脂质体复合物的脂质体。脂质体可以使用标准方法来形成，该标准方法为诸如逆相蒸发法(REV)、乙醇注射法、脱水-再水合法(DRV)、超声处理或其他合适的方法。脂质体形成后，可以按照脂质体的尺寸进行分类，以获得具有基本上同质的尺寸范围的脂质体群体。
形成双层的脂质通常具有两条烃链(特别是酰基链)和极性或非极性的头部基团。形成双层的脂质由天然存在或合成来源的脂质(包括磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂)组成，其中两条烃链的长度通常介于约14个至22个碳原子之间，并具有不同的不饱和度。其他适用于本发明的组合物的脂质包括糖脂和甾醇(例如胆固醇)及其也可以用于脂质体的各种类似物。
阳离子脂质通常具有亲脂性部分，诸如甾醇、酰基链或二酰基链，并且具有总体净正电荷。脂质的头部基团通常携带正电荷。阳离子脂质优选具有1价至10价的正电荷，更优选1价至3价的正电荷，并且更优选1价的正电荷。阳离子脂质的实例包括但不限于1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)；二甲基双十八烷基铵(DDAB)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷基氧基-3-二甲基铵丙烷；双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-1,3-二甲基羟基乙基铵(DMRIE)和2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺三氟乙酸酯(DOSPA)。优选的是DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。最优选的是DOTMA。
II.概述
本文提供了蠕动泵系统，其包括阻尼器，该阻尼器用于减少来自系统中蠕动泵的流速的脉动或振荡，以及使用这些系统以产生、混合、输送和/或制造药物组合物和制剂的方法，该药物组合物和制剂包括例如包含RNA和脂质(包括脂质体复合物或脂质体)的组合物和制剂。在一些实施例中，药物组合物和制剂包含RNA、RNA分子或RNA疫苗。
本公开还提供了适用于两个流体源一起使用的蠕动泵、阻尼器和管套件系统，该两个流体源包括例如本文所述的药物组合物，并且特别是包含RNA、RNA分子或RNA疫苗的第一药物组合物和包含本文所述的一种或多种脂质的第二药物组合物，可以将该第一药物组合物和该第二药物组合物混合或输送以产生或制造包含RNA-脂质体复合物、RNA脂质体或RNA疫苗的最终药物组合物。
III.蠕动泵、阻尼器和管套件系统
本文提供了用于与蠕动泵系统一起使用的管套件。在一些实施例中，蠕动泵可以为Masterflex泵(HV-77921-75)，其具有四个滚筒并且可以适于具有多个泵头。在一些实施例中，蠕动泵可以为Watson Marlow。在一些实施例中，管套件可以用于形成药物组合物、制剂和/或混合物。在一些实施例中，管套件可用于在线混合以形成药物组合物、制剂和/或混合物。在一些实施例中，药物组合物、制剂和/或混合物可以通过将第一药物组合物与第二药物组合物混合来形成。图15示出了管套件1的实例。管套件可以包括配置为流体连接至容器的第一管部分。第一管部分的实例在图15中示出为管的一部分2。
管的一部分2可以包含入口管2a、泵管2b和2c、泵出口管2d和阻尼器后管2e。入口管2a可以流体连接至流体源或容器。在一些实施例中，第一管部分可以包含用于将第一管部分流体连接至流体源或容器的连接器4。在一些实施例中，将第一管部分流体连接至流体源或容器的连接器可以为无菌连接器。在一些实施例中，从容器至管的任何连接器均可以工作。在一些实施例中，容器可以包含第一流体或组合物。在一些实施例中，第一组合物可以为第一药物组合物，其包括例如，含有脂质或RNA的组合物。在一些实施例中，容器可以为流体容器，诸如袋子、瓶子和/或器皿。
第一管部分可以包括第一管区段和第二管区段。在一些实施例中，第一管区段和第二管区段并行地流体连接。例如，第一管部分包括泵管2b和泵管2c，如图15所示。在一些实施例中，第一管区段配置为连接或装配至蠕动泵的第一泵头，并且第二管区段配置为连接或装配至蠕动泵的第二泵头。
在一些实施例中，入口管2a可以穿过连接器5来流体连接至泵管2b和2c。在一些实施例中，将入口管流体连接至泵管的连接器为Y形连接器或混合器(例如，静态的、螺旋的等)。在一些实施例中，泵管不需要分成并行的泵管，如图15所示。因此，连接器可能不是必要的，并且入口管和泵管可以为同一者。在一些实施例中，第一管部分可以配置为连接或安装至蠕动泵。在一些实施例中，蠕动泵可以为多头蠕动泵，例如双头蠕动泵。在一些实施例中，泵管2b和2c连接或安装至第一蠕动泵。例如，如果蠕动泵为双头蠕动泵，则泵管2b可以连接或安装至一个泵头，并且泵管2c可以连接或安装至另一个泵头。相同的逻辑可用于具有多于两个泵头的泵。在实施例中，第一蠕动泵为单头蠕动泵。因此，泵管2b或2c中的仅一者连接或安装至第一蠕动泵，或者单个入口管/泵管可以连接或安装至第一蠕动泵。
在一些实施例中，泵管或入口管/泵管可以流体连接至泵出口管。在一些实施例中，泵管2b和2c穿过连接器5(例如，Y型连接器)流体连接至泵出口管2d。在一些实施例中，泵管不需要分成并行的泵管。因此，泵后的连接器可能不是必要的，并且泵管和泵出口管可以为同一者。例如，管可以为入口管、泵管和泵出口管。
在一些实施例中，管套件可以包括流体连接至第一管部分的阻尼器。第一管部分可以穿过连接器流体连接至阻尼器。在一些实施例中，此类连接器可以为三通连接器、4通连接器或各种其他类型的连接器。图15示出了穿过连接器6流体连接至阻尼器7的第一管部分2。具体地，泵出口管2d穿过连接器6流体连接至阻尼器7。在一些实施例中，第一管部分2可以流体连接至其自己的第一阻尼器。在一些实施例中，阻尼器也可以流体连接至阻尼器后管。在一些实施例中，泵出口管穿过连接器(例如，如图15所示的连接器5)流体连接至阻尼器后管。在一些实施例中，阻尼器、泵出口管、连接器和阻尼器后管被流体连接。
管套件还可以包括配置为流体连接至容器的第二管部分。第二管部分的实例在图15中示出为管的一部分3。在一些实施例中，第一管部分和第二管部分并行地流体连接。
管的一部分3可以包含入口管3a、泵管3b和3c、泵出口管3d和阻尼器后管3e。入口管3a可以流体连接至流体源或容器。在一些实施例中，第二管部分可以包含用于将第二管部分流体连接至流体源或容器的连接器4。在一些实施例中，将第二管部分流体连接至流体源或容器的连接器可以为无菌连接器。在一些实施例中，从容器至管的任何连接器均可以工作。在一些实施例中，容器可以包含不同于第一流体或组合物的第二流体或组合物。在一些实施例中，容器可以包含与第一流体或组合物相同的流体或组合物。在一些实施例中，第二组合物可以为第二药物组合物，其包括例如，含有脂质或RNA的组合物。在一些实施例中，容器可以为流体容器，诸如袋子、瓶子和/或器皿。
第二管部分可以包含第三管区段和第四管区段。在一些实施例中，第三管区段和第四管区段并行地流体连接。例如，第二管部分包括泵管3b和泵管3c，如图15所示。在一些实施例中，第三管区段配置为连接或装配至蠕动泵的第一泵头，并且第四管区段配置为连接或装配至蠕动泵的第二头。在一些实施例中，连接或安装至第二管部分的蠕动泵不同于连接或安装至第一管部分的蠕动泵。在一些实施例中，同一蠕动泵连接或安装至第一管部分和第二管部分。因此，第一管部分可以连接或安装至蠕动泵的一个或多个第一泵头，并且第二管部分可以连接或安装至蠕动泵的一个或多个第二泵头。
在一些实施例中，入口管3a可以穿过连接器5来流体连接至泵管3b和3c。在一些实施例中，将入口管流体连接至泵管的连接器为Y形连接器或混合器(例如，静态的、螺旋的等)。在一些实施例中，泵管不需要分成并行的泵管，如图15所示。因此，连接器可能不是必要的，并且入口管和泵管可以为同一者。在一些实施例中，第二管部分可以配置为连接或安装至第二蠕动泵。在一些实施例中，蠕动泵可以为多头蠕动泵，例如双头蠕动泵。在一些实施例中，泵管3b和3c连接或安装至第二蠕动泵。例如，如果蠕动泵为双头蠕动泵，则泵管3b可以连接或安装至一个泵头，并且泵管3c可以连接或安装至另一个泵头。相同的逻辑可用于具有多于两个泵头的泵。在一些实施例中，第二蠕动泵为单头蠕动泵。因此，泵管3b或3c中的仅一者连接或安装至第二蠕动泵，或者单个入口管/泵管可以连接或安装至第二蠕动泵。
在一些实施例中，第一蠕动泵为与第二蠕动泵相同的泵，并且管的各个部分配置为连接或安装至泵的单独的泵头。因此，泵管2b可以连接或安装至第一泵头，泵管2c可以连接或安装至第二泵头，泵管3c可以连接或安装至第三泵头，并且泵管3b可以连接或安装至第四泵头。或者，泵管2b或2c中的仅一者可以连接或安装至第一泵头，或者第一单个入口管/泵管可以连接或安装至第一泵头，并且泵管3b或3c中的仅一者可以连接或安装至第二泵头，或者第二单个入口管/泵管可以连接或安装至第二泵头。
在一些实施例中，泵管或入口管/泵管可以流体连接至泵出口管。在一些实施例中，泵管3b和3c穿过连接器5(例如，Y型连接器)流体连接至泵出口管3d。在一些实施例中，泵管不需要分成并行的泵管。因此，泵后的连接器可能不是必要的，并且泵管和泵出口管可以为同一者。例如，管可以为入口管、泵管和泵出口管。
在一些实施例中，管套件可以包括流体连接至第二管部分的阻尼器。在一些实施例中，阻尼器流体连接至第一管部分并且流体连接至第二管部分。在一些实施例中，阻尼器穿过连接器(诸如三通连接器、4通连接器等)流体连接至第一管部分和/或第二管部分。
阻尼器可以为任何装置，其中阻尼通过封闭体积的流体来执行。在一些实施例中，阻尼器中的流体的体积可以取决于流速和/或暴露的表面积。在一些实施例中，阻尼器通过封闭体积的空气来阻尼脉动。在一些实施例中，阻尼器可以为注射器阻尼器、膜阻尼器(例如，柔性膜阻尼器)或管阻尼器。在一些实施例中，管阻尼器可以为死端管阻尼器，使得阻尼器的一端流体连接至第一管部分或第二管部分并且阻尼器的另一端为封闭的。在一些实施例中，阻尼器的另一端可以通过夹具、端盖来闭合，连接至另一条阻尼管线或能够封闭来自环境的气体的另一部分。在一些实施例中，管阻尼器由硅胶管制成。
在一些实施例中，管阻尼器的一端流体连接至第一管部分并且管阻尼器的另一端流体连接至第二管部分，从而形成环形管阻尼器。在一些实施例中，环形管阻尼器在第一管部分和第二管部分上方，使得来自第一管部分和/或第二管部分的极少流体不会进入阻尼器并且空气保留在阻尼器中。例如，如果溶液在表面上水平流动，则阻尼器可以竖直放置在高于预期流体路径的高度处，使得在泵送期间气穴保持在液面上方。在一些实施例中，环形管阻尼器可以放置或安装在第一管部分和第二管部分上方。在一些实施例中，环形管阻尼器可以安装在水平杆上或附接(即，用胶带粘贴)在第一管部分和第二管部分上方。
第二管部分可以穿过连接器流体连接至阻尼器。在一些实施例中，此类连接器可以为三通连接器、4通连接器或各种其他类型的连接器。图15示出了穿过连接器6流体连接至阻尼器7的第二管部分3。具体地，泵出口管3d穿过连接器6流体连接至阻尼器7。在一些实施例中，第二管部分3可以流体连接至其自己的第二阻尼器。在一些实施例中，泵出口管2d流体连接至其自己的阻尼器，并且泵出口管3d连接至其自己的不同阻尼器。在一些实施例中，阻尼器也可以流体连接至阻尼器后管。在一些实施例中，泵出口管穿过连接器(例如，如图15所示的连接器5)流体连接至阻尼器后管。在一些实施例中，阻尼器、泵出口管、连接器和阻尼器后管被流体连接。
在一些实施例中，本文所公开的管套件可以包含用于混合来自第一管部分的第一流体或组合物与来自第二管部分的第二流体或组合物的混合器。因此，第一管部分和第二管部分可以流体连接至混合器。在一些实施例中，第一管部分和第二管部分流体连接至在阻尼器下游的混合器。在一些实施例中，第一管部分的阻尼器后管(即，第一管混合器输入部分)和第二管部分的阻尼器后管(即，第二管混合器输入部分)流体连接至混合器。在一些实施例中，连接器(例如，连接器6)将阻尼器、第一管部分和第一管混合器输入部分流体连接。在一些实施例中，连接器(例如，连接器6)将阻尼器、第二管部分和第二管混合器输入部分流体连接。在一些实施例中，第一阻尼器连接器将第一管部分流体连接至阻尼器并且流体连接至混合器，并且第二阻尼器连接器将第二管部分流体连接至阻尼器并且流体连接至混合器。
在一些实施例中，混合器包括流体连接至第一管部分的输入端、流体连接至第二管部分的输入端，以及输出端。在一些实施例中，混合器可以为Y形连接器、螺旋混合器或静态混合器。在一些实施例中，输出端可以流体连接至管(例如，输出管8)。在一些实施例中，混合器包括流体连接至混合物容器(例如，第一源混合物容器和第二源混合物容器9)的输出端。混合物容器可以从混合器收集经混合的第一流体或组合物和第二流体或组合物。在一些实施例中，混合物容器可以为流体容器，诸如袋子、瓶子和/或器皿。
在一些实施例中，第一管部分配置为连接或安装至第一蠕动泵或泵头，以用于将第一流体或组合物从容器泵送至混合物容器。在一些实施例中，第二管部分配置为连接或安装至第二蠕动泵或泵头，以用于将第二流体或组合物从容器泵送至混合物容器。在一些实施例中，穿过管套件泵送的流体或组合物为药物组合物，该药物组合物包括例如含有脂质或RNA的组合物。本文所公开的药物组合物可以包含核酸(包括例如RNA或mRNA)、一种或多种脂质、蛋白质、缓冲剂、小分子、氨基酸和/或多肽。在一些实施例中，核酸可以为RNA(包括例如mRNA)和/或DNA。在一些实施例中，该一种或多种脂质可以呈脂质体或脂质体复合物的形式。在一些实施例中，药物组合物可以为个性化癌症疫苗或RNA疫苗的组分，该药物组合物包含一起形成脂质体复合物的核酸和脂质。
本文所公开的管套件、方法和/或系统包括阻尼器，以用于减少来自蠕动泵(其中流体来自一个或两个源)的流速的脉动或振荡。在一些实施例中，本文所公开的与蠕动泵(其中流体来自一个或两个源)一起使用的管套件、方法和/或系统的脉动水平(“LoP”)小于约40、小于约35、小于约30、小于约25、小于约20、小于约15、小于约12、小于约10、小于约9、小于约8、小于约7、小于约6、小于约5、小于约4、小于约3、小于约2或小于约1。在一些实施例中，本文所公开的与蠕动泵(其中流体来自一个或两个源)一起使用的管套件、方法和/或系统的脉动水平(“LoP”)介于约7与约40之间或介于约10与约20之间。在一些实施例中，本文所公开的与蠕动泵(其中流体来自一个或两个源)一起使用的管套件、方法和/或系统的脉动水平(“LoP”)可以为约7、约8、约10、约15、大约20或约25。
在一些实施例中，与缺乏如本文所述的阻尼器的蠕动泵(其中流体来自一个或两个源)的脉动水平(“LoP”)相比，使用本文所公开的管套件、方法和/或系统的蠕动泵(其中流体来自一个或两个源)的LoP的减少为约98％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％或约20％。
尽管大多数实例和描述讨论了将阻尼器用于药物组合物和制剂，但本文所公开的阻尼器和泵系统不限于用于药物组合物和制剂。例如，本文所公开的泵系统可以用于填充操作或使用蠕动泵在容器之间简单地移动溶液，其中具有一致的流速可能为有利的。本文所公开的系统可以与除了蠕动泵之外的任何泵(包含但不限于活塞、隔膜、螺杆等)一起使用；与任何流速一起使用；与任何类型的阻尼器一起使用；并且与任何管尺寸和管材料(例如，管道、塑料、不锈钢)一起使用。在一些实施例中，因为管系统接触产物，所以管系统可以在使用之前进行灭菌。此类灭菌可以用高压釜、γ射线等来进行。
IV.液压气动脉动阻尼器
如上所解释的，当使用循环泵送系统(例如蠕动泵)时，压力和流速的波动可能发生在泵下游的流体路径中。这种所谓的脉动可以通过使用不同的技术解决方案来减少，该技术解决方案包括液压气动脉动阻尼器(HPPD)，其可以通过压缩所捕获的流体(例如，气态的)垫来吸收脉动，从而减少脉动并且得到稳定、平稳的流体流动。
在最初的实验中，该概念被证明是有效的，其使用玻璃瓶(该玻璃瓶具有浸没在经泵送的流体(例如，水)中的入口和出口)以捕获可压缩气体(例如，空气)以吸收脉动。该概念在图19中示出。为了模拟无菌制造场景，由500mL实验室瓶制成的HPPD在各种流速下进行了测试，并且评估了上升至恒定压力所需的时间量和在泵停止后从该压力下降所需的时间量(即，使流体路径压力归一化所需的时间)。图20示出了初始HDDP设置，其由以下组成：流体(水)储存器；蠕动泵；用盖来闭合的500mL实验室烧瓶，该盖由两个端口(其中一个端口浸没在可泵送流体中)组成；以及流体路径的出口处的收集器皿。如图21所示，在较低流速下，建立压力的时间迅速增加，直至流速为大约150mL/min，此时上升和下降时间在较高流速下保持相当。这分别需要约75秒和40秒以建立恒定压力并且消散回到零。
还针对该玻璃瓶阻尼器测量了残余背压对排量速率的影响。图22证实，尽管将HPPD系统加压和减压需要大量时间，但HPPD集成系统的实际排量为恒定的并且相当于简单的泵到出口设置。
还研究了瓶子尺寸对压差的影响。具体地，通过以恒定速率泵送穿过HPPD(使用尺寸为250mL至2000mL的实验室瓶来进行创建)，研究了气穴尺寸的影响。图23证明，相对于将泵直接连接至出口，较小的空气体积会导致在入口处的背压较高，但HPPD装置的总体压力损失较低。观察到该压力损失不影响出口处流动的平稳性。
为了测试针对HPPD的一次性使用设计的概念，将衬垫插入实验室烧瓶中，从而允许在每次使用后更换接触表面和流体路径。这在图24中示出。可以看出，由于柔性衬垫的延展性增加，因此添加该衬垫显著减少了HPPD的通量，如图25所示。衬垫阻尼器(即，气囊阻尼器)在流体流动的归一化方面也运作良好，并且是有利的，因为它确保在泵送过程中流体流动不会与空气接触。然而，泵停止后，泵送效率以残余压力和流体径流的形式显著降低，从而导致系统效率显著降低。
因此，玻璃瓶阻尼器证明成功地减少了脉动。此外，它的优点为相对较大的通常可获得的实验室瓶可能导致较大的死体积和较大的气穴，这可能增加系统的可压缩性，从而通过能量损失来降低出口压力。缺点为，没有衬垫，玻璃瓶不适合一次性使用，并且需要事先组装。此外，需要较长的启动和运行时间以平衡和停止系统，从而导致高死体积。
为了进一步减少死体积并且实现稳健的一次性使用良好制造工艺(GMP)设计，将玻璃瓶更换为生物处理袋，诸如图26中示出的50mL生物处理袋。袋可以修改为包含经升高的入口管。该入口管的入口可以远离袋子周边朝向袋子中部进行定位，如图26所示。相比之下，气体入口(例如，无菌空气、氮气)和出口可以位于袋子的周边。使生物处理袋的入口管朝向袋子中部进行定位可以有助于确保在高背压的情况下经泵送的流体不会发生反冲洗。此外，气体入口可以允许插入气体以用气垫来预填充袋子，以改善HPPD的启动效率。
如图27所示，原型壳也由纸箱制成，以增加袋子的刚度并且最小化其随着泵流速和压力的增加而发生的膨胀，从而改善经泵送的流体的通流。具体地，如图27所示，将袋固定在纸箱壳中。这有助于确保袋子不会进一步膨胀，并且可以形成气垫。结果发现，这有助于减少死体积并且缩短启动时间。然而，由于纸箱材料较弱，HPPD仅能在某一压力下稳定。因此，申请人发现了用刚性更好的外壳来替换纸箱。
具体地，图28A示出了用于流体泵的脉动阻尼器100的分解图。在一些实施例中，脉动阻尼器可以包含生物处理袋102。生物处理袋可以为袋。例如，生物处理袋可以为50mL/>袋，但也可以使用其他尺寸的生物处理袋(例如，介于5mL与50L之间的任何尺寸)。生物处理袋可以包括流体入口105和流体出口106。在一些实施例中，流体入口和/或流体出口可以流体连接至管。在一些实施例中，流体入口和/或流体出口可以包含管本身。在一些实施例中，流体入口和/或流体出口或者连接至流体入口/流体出口的流体管可以远离袋子周边朝向袋子中部进行定位，如图26所示。在一些实施例中，流体入口可以流体连接至流体泵(例如循环泵(例如，蠕动泵))的下游。在一些实施例中，流体出口可以流体连接至流体储存容器。在一些实施例中，流体出口可以包括止回阀。在一些实施例中，止回阀可以具有约0.05巴至0.5巴、约0.05巴至0.4巴、约0.05巴至0.3巴、约0.1巴至0.2巴或约0.14巴的突破阻力。
在一些实施例中，生物处理袋可以包含气体入口107。气体入口可以配置为流体连接至气体源。在一些实施例中，气体源为空气(例如，无菌空气)和/或氮气。气体入口可以向生物处理袋提供气体，使得该袋子包含用于脉动阻尼的气垫。
在一些实施例中，脉动阻尼器100可以包含外壳101。图28B示出了没有脉动阻尼器的其他部件的外壳101。外壳可以配置为容纳生物处理袋。在一些实施例中，外壳可以包含基底111。基底可以为基板。在一些实施例中，外壳可以包含多个侧壁104。在一些实施例中，该多个侧壁可以沿着基底的周边远离基底延伸。在一些实施例中，该多个侧壁可以连接至基底的周边。在一些实施例中，该多个侧壁和基底可以为单个一体部件。在一些实施例中，基底和该多个侧壁可以形成空腔，该空腔配置为容纳/保持生物处理袋。
在一些实施例中，外壳的至少一个侧壁可以具有一个或多个缺口108。如图28B所示，外壳101包含侧壁104中的三个缺口108。该一个或多个缺口可以为进入外壳的至少一个侧壁中的凹痕或凹部。在一些实施例中，该一个或多个缺口可以配置为提供通向生物处理袋的流体入口、流体出口和/或气体入口的通路。在一些实施例中，该一个或多个缺口可以配置为容纳生物处理袋的流体入口、流体出口和/或气体入口。如下文更详细描述的，外壳可以经由外壳盖来闭合。因此，进出生物处理袋的任何流体或流体管可以穿过外壳的至少一个侧壁中的该一个或多个缺口来进入/离开。
在一些实施例中，外壳可以包含窗口110。在一些实施例中，外壳的基底可以包含窗口。在一些实施例中，窗口可以为外壳的基底中的开口。在一些实施例中，窗口可以为外壳的基底中的透明材料(例如，玻璃或透明塑料)。窗口可以允许在使用期间目视检查生物处理袋。
在一些实施例中，阻尼器100可以包括外壳盖103。外壳可以配置为闭合外壳，使得生物处理袋由外壳和外壳盖来包围。在一些实施例中，外壳盖配置为附接至外壳的多个侧壁。在一些实施例中，外壳盖可以经由任何附接机构(例如，粘合剂、螺钉、钉子、螺栓、魔术贴、夹子(如图28C中所示)、锁定机构等)来附接至外壳。在一些实施例中，外壳盖可以附接至至少一个侧壁，使得外壳盖充当外壳的门(即，铰链机构)。在一些实施例中，外壳盖可以包括窗口。在一些实施例中，窗口可以为外壳盖中的开口。类似于外壳的基底中的任何窗口，窗口可以为外壳的基底中的透明材料(例如，玻璃或透明塑料)。
在一些实施例中，阻尼器100可以包括前板109。在一些实施例中，前板可以连接至外壳101的至少一个侧壁104和/或外壳盖103。前板可以包括至少一个孔，该至少一个孔配置为容纳生物处理袋的流体入口、流体出口和/或气体入口。可以包括前板，以确保生物处理袋的任何入口/出口或对应的管在阻尼器100的外壳内保持在合适的位置。在一些实施例中，可以包括前板，以确保生物处理袋的入口/出口或对应的管在其整个使用过程中均在恒定的均匀压力下。
在一些实施例中，外壳和/或外壳盖可以由刚性材料(例如，塑料/聚合物、金属、陶瓷)制成。在一些实施例中，外壳和/或外壳盖可以进行3D打印。在一些实施例中，阻尼器100的内部尺寸可以为90x80x10 mm并且可以设计为配合50mL生物处理袋。该阻尼器可以为用于流体流动系统的一次性使用组件，其可以借由气垫来吸收发生的脉动，以将流速的波动减少至最小。在一些实施例中，死体积可以取决于外壳中生物处理袋的高度中的相对位置。因此，可以定义阻尼器的高度，以确保的恒定的死体积和/或相对于流体路径的要求(例如，流速和流动速度、由泵头产生的脉动幅度、系统背压等)的最佳阻尼效应。
脉动阻尼器可以包含两种流体：(1)经排量的脉动流体(例如，水)；和(2)可压缩流体(例如，空气)。当经排量的流体被泵送穿过生物处理袋时，所捕获的可压缩流体可以吸收经排量的流体内的脉动并且可以仅在稳定的、无脉动的流动上进行泵送。
使用具有和不具有阻尼器的蠕动泵在不同流速下并且使用注射泵在参考设置下，对本节中公开的阻尼器的脉动阻尼能力进行了系统性测试。如下文更详细解释的，结果表明，阻尼器将脉动显著降低至用注射泵系统实现的甚至更低的水平(假设其无脉动)。
图29A示出了使用内径为3.6mm的管的蠕动泵的设置。用时间分辨率为0.1秒并且值分辨率为0.8mL/min的超声流量传感器(Levitronix)来测量脉动。水被泵送穿过系统。图29A还示出了经测试的系统在100秒的总时间段内的流动曲线。该系统由蠕动泵和流量传感器组成。经测试的流速为50mL/min、60mL/min、70mL/min和100mL/min。由于蠕动泵的滚动，因此观察到高脉动。
图29B示出了由使用内径为3.6mm的管的注射泵组成的设置。用时间分辨率为0.1秒并且值分辨率为0.8mL/min的超声流量传感器来测量脉动。水被泵送穿过系统。图29B还示出了经测试的系统在100秒的总时间段内的流动曲线。经测试的流速为50mL/min、60mL/min、70mL/min和100mL/min，并且测量到低脉动。
图29C示出了一种设置，该设置由使用内径为3.6mm的管的蠕动泵和连接至其的如本文所公开的HPPD阻尼器组成。HPPD阻尼器的出口与突破阻力为0.14巴的止回阀连接。脉动用时间分辨率为0.1秒并且值分辨率为0.8mL/min的超声流量传感器来测量。水被泵送穿过系统。图29C还示出了使用HPPD阻尼器的流动曲线。如图所示，脉动显著降低(振幅较低)。已经成功(在数值上)观察到HPPD效应。此外，与注射泵相比，HPPD设置产生了甚至更小的流速波动。
为了测试该刚性阻尼器，在本节中公开的HPPD阻尼器与Cole-Parmer HPPD之间进行了可比性研究，如图30所示。Cole-Parmer HPPD的阻尼原理基于所捕获的气穴的压缩。具体地，Cole-Parmer HPPD的内部体积为大约190mL。泵送时的死体积为大约40mL至50mL。在使用50mL生物处理袋的同时，当与本节中公开的HPPD阻尼器相比时，该死体积更高。此外，Cole-Parmer HPPD需要更长时间以启动，并且必须放置在固定的水平位置以产生脉动阻尼效应。相比之下，本节中公开的HPPD装置在使用期间不需要为水平的，而是可以在任何方向上进行取向。如下文更详细解释的，当与Cole-Parmer HPPD相比时，本节中描述的HPPD阻尼器具有低得多并且更可预测的死体积和经减少的启动时间，同时在各种流速下示出甚至更高的阻尼效率。
图31A示出了在100秒的总时间段内使用Cole-Parmer HPPD的流动曲线。该系统由蠕动泵、Cole-Parmer HPPD和流量传感器组成。将水在50mL/min、60mL/min、70mL/min和100mL/min的测试流速下进行泵送。将水用蠕动泵泵送穿过内径为3.6mm的管。用时间分辨率为0.1秒并且值分辨率为0.8mL/min的超声流量传感器来测量脉动。
图31B示出了在100秒的总时间段内的经测试的系统(图29C)的流动曲线。将水在50mL/min、60mL/min、70mL/min和100mL/min的流速下进行了测试。将水用蠕动泵泵送穿过内径为3.6mm的管。HPPD的出口与突破阻力为0.14巴的止回阀连接。同样，脉动用分辨率为0.1秒并且值分辨率为0.8mL/min的超声流量传感器来测量。在Cole-Parmer与本节中公开的HPPD之间未发现脉动阻尼的显著差异。
接下来，当系统已经达到其运行平衡时，填充体积和压力被记录为启动后的泵送流速的函数。结果表明，本文所公开的HPPD阻尼器的死体积在达到大约70mL/min和更高的流速后可以保持恒定。为了测试，将水用连接至本节中公开的HPPD阻尼器的蠕动泵来进行泵送。压力传感器安装在HPPD阻尼器的入口上和具有阻力为0.14巴的止回阀的出口上。流速用时间分辨率为0.1秒并且值分辨率为0.8mL/min的超声流量传感器来测量。
图32示出了本节中公开的HPPD阻尼器的死体积和阻尼器入口处的压力随着流速不断增加的变化。具体地，阻尼器的入口处的压力随流速成比例增加。死体积在70mL/min的流速下达到稳定。该死体积可以通过减少生物处理袋的总体积来降低。然而，刚性外壳在实现稳定的阻尼效应方面发挥了重要作用。可能影响死体积和压力的额外参数可以为动水压力的变化，该动水压力的变化可以由泵、阻尼器和流体容器的相对位置来进行调整。它可以影响阻尼器中的压力平衡，从而影响阻尼器中的死体积。在较高流速(例如，200mL/min)下，该效应可以忽略不计。另一个参数可以为来源-流体-容器、泵与阻尼器之间的空管的体积。阻尼器内的空气量可以由在发生系统的初始填充步骤时泵送至阻尼器中的空管中的空气体积来确定。在图32中，菱形图标代表死体积的值，并且方块代表所测量的压力。
接下来，研究了管直径和长度对脉动的影响。阻尼效应通过由硅胶管的弹性吸收脉动来获得。使用蠕动泵在恒定流速下研究了三种不同的管直径。结果表明，随着管直径的减小，所测量的脉动显著减少。为了测量，将水用连接至具有1米的恒定长度的不同内径管的蠕动泵(型号Watson Marlow 323)来进行泵送。随着管内径的增加，泵送RPM降低以便实现恒定通量。用超声流量传感器来测量脉动，其中测量间隔为20ms。对于分析，每个设置分析了300个测量点，并且计算了算术平均值和标准偏差。流速标准偏差的减少指示脉动阻尼得到改善。/>
图33A示出了针对内径为1.6mm且固定长度为1米并且泵速为285rpm的管，对脉动的研究。算术平均值为75.6mL/min并且标准偏差为3.4mL/min。图33B示出了针对内径为3.2mm且固定长度为1米并且泵速为70rpm的管，对脉动的研究。算术平均值为77.3mL/min并且标准偏差为6.7mL/min。图33C示出了针对内径为6mm且固定长度为1米并且泵速为20rpm的管，对脉动的研究。算术平均值为77.3mL/min并且标准偏差为6.7mL/min。使用更小的管内径和相应的更高的抽速，流速标准偏差显著降低，同时脉动减少。
接下来，研究了管长度增加的脉动阻尼效应。这可以证明，除了管直径减少外，增加管长度还可以进一步降低脉动。然而，这导致压力损失增加。为了测试，将水用连接至不同管长度和1.6mm的恒定内径的蠕动泵来进行泵送。由于高背压，随着管长度为20米，泵送RPM增加，以达到与其他设置相当的流速。超声流量传感器来测量脉动，其中测量间隔为20ms。对于分析，每个设置分析了300个测量点，并且计算了算术平均值和标准偏差。流速标准偏差的减少指示脉动阻尼得到改善。
图34A示出了针对固定长度为1米、内径为1.6mm并且泵速为285rpm的管，对脉动的研究。算术平均值为75.6mL/min并且标准偏差为3.4mL/min。图34B示出了针对固定长度为2米、内径为1.6mm、泵速为285rpm的管，对脉动的研究。算术平均值为77.7mL/min并且标准偏差为2.0mL/min。图34C示出了针对固定长度为20米、内径为1.6mm并且泵速为400rpm的管，对脉动的研究。算术平均值为85.8mL/min并且标准偏差为1.6mL/min。使用更长的管和相应的更高的抽速，流速标准偏差可以显著降低，并且脉动减少。与利用本文所公开的HPPD阻尼器相比，当仅使用管以用于脉动阻尼时，死体积可以进一步减少，并且可以跳过单独的启动步骤。然而，管的延伸长度上的压力损失比当利用HPPD阻尼器时要大得多。
用于上述实验的材料见下表：
材料
蠕动泵；ISMATEC IP 65，MCP工艺，型号：ISM915A
注射泵；kd Scientific，型号：Legato210
管1.6mm；硅胶管1.6x4.8
管3.2mm；硅胶管3.2x4.8
管6mm；硅胶管
双止回阀；DCV 125-001
超声流量传感器；Levitronix
Water B.Braun
压力传感器；SciLog；SciPress Pressure；流通池S1-240141-1019
玻璃瓶；Schott
Flexboy；50mL袋子
Cole parmer阻尼器；Masterflex；编号：GZ-07596-20
V.RNA疫苗
本公开的某些方面涉及包含个性化癌症疫苗(PCV)的药物组合物的生产、混合或制造。在一些实施例中，PCV为RNA疫苗，其包括例如mRNA疫苗。示例性RNA疫苗的特征如下文所述。在一些实施例中，本公开提供了一种RNA多核苷酸或RNA分子，其包含下文描述的RNA疫苗的特征/序列中的一种或多种特征/序列。在一些实施例中，RNA多核苷酸或RNA分子为单链mRNA多核苷酸。在其他实施例中，本公开提供了一种编码RNA分子的DNA多核苷酸，其包含下文描述的RNA疫苗的特征/序列中的一种或多种特征/序列。
个体化癌症疫苗包含个体化新抗原(即在患者癌症中特异性表达的肿瘤相关抗原(TAA))，这些个体化新抗原经鉴定具有潜在的免疫刺激活性。在本文所述的实施例中，PCV为核酸，例如信使RNA。因此，不受理论的约束，据信在施用后，个体化癌症疫苗被吸收并且由抗原呈递细胞(APC)翻译，并且所表达的蛋白质经由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递在APC的表面上。由此诱导针对表达TAA的癌症细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和记忆T细胞依赖性免疫反应两者。
PCV通常包括多个新抗原表位(“新表位”)，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、28个、29个或30个新表位或者至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、28个、29个或30个新表位，任选地在各个新表位之间具有接头序列。在一些实施例中，如本文所用的新表位是指对患者的癌症具有特异性但不存在于患者的正常细胞中的新颖表位。在一些实施例中，新表位在结合至MHC时呈递给T细胞。在一些实施例中，PCV还包括5'mRNA帽类似物、5'UTR、信号序列、促进抗原表达的结构域、3'UTR和/或polyA尾巴。在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子包含一种或多种编码10个至20个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子包含一种或多种编码至少5个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子包含一种或多种编码5个至20个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子包含一种或多种编码5个至10个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生。
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子包含一个或多个编码氨基酸接头的多核苷酸序列。例如，可在2个患者特异性新表位序列之间、患者特异性新表位序列与融合蛋白标签(例如，包含来源于MHC复合物多肽的序列)之间或分泌性信号肽与患者特异性新表位序列之间使用氨基酸接头。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子编码多种接头。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子包含一种或多种编码5个至20个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生，并且编码每个表位的多核苷酸由编码接头序列的多核苷酸隔开。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子包含一种或多种编码5个至10个新表位的多核苷酸，这些新表位由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生，并且编码每个表位的多核苷酸由编码接头序列的多核苷酸隔开。在一些实施例中，编码接头序列的多核苷酸还存在于编码N末端融合标签(例如，分泌性信号肽)的多核苷酸与编码新表位中的一个的多核苷酸之间，和/或存在于编码新表位中的一个或多个的多核苷酸与编码C末端融合标签(例如，包含MHC多肽的一部分)的多核苷酸之间。在一些实施例中，由RNA疫苗或RNA分子编码的两种或更多种接头包含不同的序列。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子编码多种接头，其全部共享相同的氨基酸序列。
各种接头序列是本领域中已知的。在一些实施例中，接头为柔性接头。在一些实施例中，接头包含G、S、A和/或T残基。在一些实施例中，接头由甘氨酸和丝氨酸残基组成。在一些实施例中，接头的长度在约5个氨基酸与20个氨基酸之间或在约5个氨基酸与12氨基酸之间，例如长度为约5个氨基酸、约6个氨基酸、约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸、约15个氨基酸、约16个氨基酸、约17个氨基酸、约18个氨基酸、约19个氨基酸或约20个氨基酸。在一些实施例中，接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:21)。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的接头包含序列GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCC GGAGGC(SEQ ID NO:19)。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的接头由包含序列GGCGGCTCTGGAGGAGGCGGCTCCGGAGGC(SEQ ID NO:20)的DNA编码。
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子包含5'帽。已知mRNA帽结构包含2个核苷酸(例如，两个鸟嘌呤)与远处鸟嘌呤上的7-甲基基团之间的5'-5'三磷酸酯键，即m7GpppG。示例性帽结构可以见于例如美国专利号8,153,773和9,295,717以及Kuhn,A.N.。(2010)Gene Ther.17:961-971。在一些实施例中，5'帽具有结构m2 7,2'-OGppspG。在一些实施例中，5'帽为β-S-ARCA帽。S-ARCA帽结构包括2'-O甲基取代(例如，在m7G的C2'位置)和一个或多个磷酸酯基团处的S-取代。在一些实施例中，5'帽包含以下结构：
在一些实施例中，5'帽为β-S-ARCA的D1非对映异构体(参见例如美国专利第9,295,717号)。上述结构中的*表示立体P中心，其可能存在于两种非对映异构体(称为D1和D2)中。β-S-ARCA的D1非对映异构体或β-S-ARCA(D1)为β-S-ARCA的非对映异构体，与β-S-ARCA的D2非对映异构体(β-S-ARCA(D2))相比，在HPLC色谱柱上首先洗脱，并由此表现出较短的保留时间。HPLC优选为分析型HPLC。在一个实施例中，利用Supelcosil LC-18-T RP色谱柱(优选以下规格：5μm，4.6×250mm)进行分离，其中可采用流速1.3ml/min。在一个实施例中，利用乙酸铵中的甲醇梯度，例如在15min内，0.05M乙酸铵溶液(pH＝5.9)中的甲醇以线性梯度从0％增加至25％。可在260nm下进行UV检测(VWD)，并且可采用280nm的激发波长和337nm的检测波长进行荧光检测(FLD)。
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子包含5'UTR。研究表明，存在于mRNA中的蛋白质编码序列的5'末端的某些非翻译序列可提高翻译效率。参见，例如，Kozak,M.(1987)J.Mol.Biol.196:947-950。在一些实施例中，5'UTR包含来自人α球蛋白mRNA的序列。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子包含UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:5)的5'UTR序列。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的5'UTR序列由包含序列TTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:6)的DNA编码。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的5'UTR序列包含序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:3)。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的5'UTR序列由包含序列GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:4)的DNA编码。
在本文提供的方法的一些实施例中，示例性RNA疫苗的恒定区包含以下的核糖核苷酸序列(5'->3')：SEQ ID NO:24.前两个G残基之间的键结为独特的键(5'→5')-ppsp-，例如，如表6和图18中的5'加帽结构所示。“N”是指编码一个或多个(例如，1-20个)新表位(由任选的接头隔开)的一个或多个多核苷酸序列的位置。肿瘤特异性序列的插入位点(C131-A132；以粗体标记)以粗体显示。有关示例性RNA序列中经修饰的碱基和不常见的键，参见表6。
表6
类型 位置 说明
经修饰的碱基 G1 m2 7·2'·O G
不常见键 G1-G2 (5'→5')-ppsp-
不常见键 C131-A132 肿瘤特异性序列的插入位点
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子包含编码分泌性信号肽的多核苷酸序列。如本领域已知的，分泌性信号肽是一种氨基酸序列，在翻译后引导多肽从内质网中转运出并且进入分泌途径。在一些实施例中，信号肽源自一种人多肽，诸如MHC多肽。参见，例如，Kreiter,S.等人(2008)J.Immunol.180:309-318，其中描述了一
种示例性分泌性信号肽，该分泌性信号肽改善了人类树突细胞中MHC I类和II类表位的加工和呈递。在一些实施例中，在翻译后，信号肽为RNA疫苗编码的一个或多个新表位序列的N末端。在一些实施例中，分泌性信号肽包含序列MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ ID NO:9)。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的分泌性信号肽包含序列AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ IDNO:7)。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的分泌性信号肽由包含序列ATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:8)的DNA编码。
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子包含编码跨膜和/或胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列。在一些实施例中，跨膜和/或胞质结构域来自MHC分子的跨膜/胞质结构域。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”是指一种存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白质或分子在正常免疫应答中淋巴细胞和抗原呈递细胞之间的信号传导中的功能涉及它们结合肽并且将其呈递以便由T细胞受体(TCR)进行识别。MHC分子在细胞内加工区室中结合肽，并且将抗原呈递细胞表面上的这些肽呈递给T细胞。人类MHC区，也称为HLA，位于6号染色体上，并且包含I类区和II类区。I类α链为分子量约44kDa的糖蛋白。多肽链的长度略多于350个氨基酸残基。它可分为三个功能区：外部区、跨膜区和胞质区。外部区的长度为283个氨基酸残基，并且分为三个结构域，即α1、α2和α3。这些结构域和区通常由I类基因的单独的外显子编码。跨膜区横跨质膜的脂质双层。它由23个通常疏水的氨基酸残基组成，这些氨基酸残基排列成α螺旋形式。胞质区，即朝向细胞质并且与跨膜区连接的部分，其长度通常为32个氨基酸残基，并且能够与细胞骨架的元件相互作用。α链与β2-微球蛋白相互作用，由此在细胞表面上形成α-β2二聚体。术语“MHC II类”或“II类”是指主要组织相容性复合物II类蛋白质或基因。在人类MHC II类区内，存在II类α链基因和β链基因的DP、DQ和DR亚区(即DPα、DPβ、DQα、DQβ、DRα和DRβ)。II类分子为各自由α链和β链组成的异二聚体。两条链为具有31-34kDa(a)或26-29kDA(β)的分子量的糖蛋白。α链的总长度在229个与233个氨基酸残基之间变化，并且β链的总长度为225个残基至238个残基。α链和β链均由外部区、连接肽、跨膜区和胞质尾区组成。外部区由两个结构域(即α1和α2或β1和β2)组成。连接肽在α链和β链中分别为β和9个残基长。它将两个结构域连接至跨膜区，该跨膜区在α链和β链中均由23个氨基酸残基组成。胞质区(即朝向细胞质并且与跨膜区连接的部分)的α链长度在3个残基至16个残基之间变化，β链长度在8个残基至20个残基之间变化。示例性跨膜/胞质结构域序列描述于美国专利号8,178,653和8,637,006中。在一些实施例中，在翻译后，跨膜和/或胞质结构域为RNA疫苗编码的一个或多个新表位序列的C末端。在一些实施例中，MHC分子的跨膜和/或胞质结构域包含序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGS DVSLTA(SEQ ID NO:12)。在一些实施例中，MHC分子的跨膜和/或胞质结构域包含序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC(SEQ ID NO:10)。在一些实施例中，MHC分子的跨膜和/或胞质结构域由包含序列ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCC(SEQ ID NO:11)的DNA编码。
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子包含编码位于该一个或多个新表位序列的N末端的分泌性信号肽的多核苷酸序列以及编码位于该一个或多个新表位序列的C末端的跨膜和/或胞质结构域的多核苷酸序列。研究表明，将此类序列组合可改善人类树突细胞中MHC I类和II类表位的加工和呈递。参见，例如，Kreiter,S.等人(2008)J.Immunol.180:309-318。
在骨髓DC中，RNA释放到细胞溶质中并且翻译为多新表位肽。-多肽包含额外的序列以增强抗原呈递。在一些实施例中，利用来自多肽的N-末端的MHCI重链的信号序列(sec)将新生分子靶向内质网，已表明这种做法可提高MHCI呈递效率。不受理论的约束，据信MHCI重链的跨膜和胞质结构域将多肽引导至表现出改善的MHCII呈递的内体/溶酶体区室。
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子包含3'UTR。研究表明，存在于mRNA中的蛋白质编码序列的3'末端的某些非翻译序列可改善RNA稳定性、翻译和蛋白质表达。适合用作3'UTR的多核苷酸序列描述于例如PG公开号US20190071682中。在一些实施例中，3'UTR包含AES的3'非翻译区或其片段和/或线粒体编码的12S RNA的非编码RNA。术语“AES”是指分裂的氨基末端增强子并且包括AES基因(参见例如NCBI基因ID：166)。由该基因编码的蛋白质属于groucho/TLE蛋白质家族，其可作为同源寡聚体或与其他家族成员形成异源寡聚体以显性抑制其他家族成员基因的表达。一种示例性AES mRNA序列提供于NCBI参考序列登录号NM_198969。术语“MT_RNR1”是指线粒体编码的12S RNA并且包括MT_RNR1基因(参见例如NCBI基因ID：4549)。该RNA基因属于Mt_rRNA类基因。与MT-RNR1相关联的疾病包括限制型心肌病和听神经病。其相关途径包括真核生物中的核糖体生物发生和CFTR翻译保真性(I类突变)。一种示例性MT_RNR1 RNA序列存在于以下NCBI参考序列的序列内：登录号NC_012920.在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的3'UTR包含序列CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGG GUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCU CCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ IDNO:15)。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的3'UTR包含序列CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:17)。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的3'UTR包含序列CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ ID NO:15)和序列CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:17)。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的3'UTR包含序列CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:13)。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的3'UTR由包含序列CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC(SEQ IDNO:16)的DNA编码。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的3'UTR由包含序列CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:18)的DNA编码。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的3'UTR由包含序列CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCA CCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC(SEQ ID NO:16)和序列CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:18)的DNA编码。在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子的3'UTR由包含序列CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT(SEQ ID NO:14)的DNA编码。
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子包含在其3'末端的poly(A)尾巴。在一些实施例中，poly(A)尾巴包含多于50个或多于100个腺嘌呤核苷酸。例如，在一些实施例中，poly(A)尾巴包含120个腺嘌呤核苷酸。已证明该poly(A)尾巴能够增强RNA稳定性和翻译效率(Holtkamp,S.等人(2006)Blood 108:4009-4017)。在一些实施例中，包含poly(A)尾巴的RNA通过转录DNA分子产生，该DNA分子在5'→3'转录方向上包含编码至少50个、100个或120个腺嘌呤连续核苷酸以及IIS型限制性内切酶的识别序列的多核苷酸序列。改善翻译的示例性poly(A)尾巴和3'UTR序列见于例如美国专利No.9,476,055所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子包含一般结构(在5'→3'方向上)：(1)5'帽；(2)5'非翻译区(UTR)；(3)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；(4)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；(5)3'UTR，该3'UTR包含：(a)分裂的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及(6)poly(A)序列。在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCG CCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUC UGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQID NO:1)；和多核苷酸序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:2)。有利地，包含结构或序列的这一组合和取向的RNA疫苗的特征在于以下各项中的一者或多者：改善的RNA稳定性、增强的翻译效率、改善的抗原呈递和/或加工(例如，通过DC)和增加的蛋白质表达。
在一些实施例中，本公开的RNA疫苗或RNA分子包含SEQ ID NO:24的序列(在5'→3'方向上)。参见，例如，图17。在一些实施例中，N是指编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或30个不同新表位的多核苷酸序列。在一些实施例中，N是指编码一个或多个接头-表位模块(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或30个不同接头-表位模块)的多核苷酸序列。在一些实施例中，N是指编码一个或多个接头-表位模块(例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或30个不同接头-表位模块)和3'末端的额外氨基酸接头的多核苷酸序列。
在一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子进一步包含编码至少一个新表位的多核苷酸序列；其中在5'→3'方向上，编码该至少一个新表位的多核苷酸序列在编码分泌性信号肽的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。在一些实施例中，RNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸序列。
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子在5'→3'方向上进一步包含：编码氨基酸接头的多核苷酸序列；以及编码新表位的多核苷酸序列。在一些实施例中，编码氨基酸接头和新表位的多核苷酸序列形成接头-新表位模块(例如，在5'→3'方向上在同一开放阅读框中的连续序列)。在一些实施例中，在5'→3'方向上，形成接头-新表位模块的多核苷酸序列在编码分泌信号肽的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间，或在SEQ ID NO:1的序列与SEQID NO:2的序列之间。在一些实施例中，RNA疫苗或分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、28个、29个或30个接头-表位模块。在一些实施例中，接头-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，RNA疫苗或分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个接头-表位模块，并且RNA疫苗或分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸。在一些实施例中，RNA疫苗或分子包含5个、10个或20个接头-表位模块s。在一些实施例中，接头-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，接头-表位模块在5'→3'方向上在同一开放阅读框中形成连续序列。在一些实施例中，编码第一接头-表位模块的接头的多核苷酸序列为编码分泌性信号肽的多核苷酸序列的3'端。在一些实施例中，编码最后一个接头-表位模块的新表位的多核苷酸序列为编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列的5'端。
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子的长度为至少800个核苷酸、至少1000个核苷酸或至少1200个核苷酸。在一些实施例中，RNA疫苗的长度为少于2000个核苷酸。在一些实施例中，RNA疫苗的长度为至少800个核苷酸但少于2000个核苷酸，长度为至少1000个核苷酸但少于2000个核苷酸，长度为至少1200个核苷酸但少于2000个核苷酸，长度为至少1400个核苷酸但少于2000个核苷酸，长度为至少800个核苷酸但少于1400个核苷酸，或长度为至少800个核苷酸但少于2000个核苷酸。例如，包含如上所述的元件的RNA疫苗的恒定区的长度为约800个核苷酸。在一些实施例中，包含5个患者特异性新表位(例如，各自编码27个氨基酸)的RNA疫苗的长度大于1300个核苷酸。在一些实施例中，包含10个患者特异性新表位(例如，各自编码27个氨基酸)的RNA疫苗的长度大于1800个核苷酸。
脂质体复合物/脂质体
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子被配制在脂质体复合物纳米颗粒或脂质体中。在一些实施例中，RNA的脂质体复合物纳米颗粒制剂(RNA-脂质体复合物)用于实现本公开的RNA疫苗的静脉内递送。在一些实施例中，利用包含合成阳离子脂质(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油酰氧基-1-丙铵氯化物(DOTMA)和磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)的RNA癌症疫苗的脂质体复合物纳米颗粒制剂，例如以实现IV递送。DOTMA/DOPE脂质体组分已针对脾脏和其他淋巴器官中抗原呈递细胞的IV递送和靶向进行了优化。-
在一些实施例中，可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA分子与包含一种或多种阳离子脂质的药物组合物混合，该一种或多种阳离子脂质包含例如(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油酰氧基-1-丙铵氯化物(DOTMA)和磷脂1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一个实施例中，药物组合物包含至少一种脂质。在一个实施例中，药物组合物包含至少一种阳离子脂质。阳离子脂质可为单阳离子脂质或多阳离子脂质。任何阳离子两亲分子(例如，包含至少一个亲水部分和亲脂性部分的分子)均为本发明的含义范围内的阳离子脂质。在一个实施例中，正电荷由所述至少一种阳离子脂质产生，负电荷由RNA产生。在一个实施例中，药物组合物包含至少一种辅助脂质。辅助脂质可为中性脂质或阴离子脂质。辅助脂质可为天然脂质(诸如磷脂)或天然脂质的类似物或全合成脂质或与天然脂质无相似性的类脂质分子。在一个实施例中，阳离子脂质和/或辅助脂质为双层形成脂质。
在一个实施例中，所述至少一种阳离子脂质包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)或其类似物或衍生物和/或1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)或其类似物或衍生物。
在一个实施例中，所述至少一种辅助脂质包含1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其类似物或衍生物、胆固醇(Chol)或其类似物或衍生物和/或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)或其类似物或衍生物。
在一个实施例中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种辅助脂质的摩尔比为10:0至3:7，优选为9:1至3:7、4:1至1:2、4:1至2:3、7:3至1:1或2:1至1:1，优选为约1:1。在一个实施例中，在该摩尔比下，阳离子脂质的摩尔量由阳离子脂质的摩尔量乘以阳离子脂质中的正电荷数得到。
在一个实施例中，脂质包含在包封所述RNA的囊泡中。囊泡可为多层囊泡、单层囊泡或它们的混合物。囊泡可为脂质体。
可以根据阳离子脂质与RNA的(+/-)电荷比调整正电荷与负电荷并且将RNA与阳离子脂质混合，形成本文所述的脂质体复合物或脂质体。本文所述的药物组合物中阳离子脂质与RNA的+/-电荷比可以通过以下公式进行计算。(+/-电荷比)＝[(阳离子脂质量(mol))×(阳离子脂质中正电荷总数)]:[(RNA量(mol))×(RNA中负电荷总数)]。本领域的技术人员根据制备纳米颗粒时的负载量，可轻松确定RNA量和阳离子脂质量。对于示例性药物组合物的进一步描述，参见，例如，PG Pub.号US20150086612中。
在一个实施例中，药物组合物中正电荷与负电荷的总电荷比(例如，在生理pH下)介于1.4:1与1:8之间，优选介于1.2:1与1:4之间，例如介于1:1与1:3之间，诸如介于1:1.2与1:2之间、介于1:1.2与1:1.8之间、介于1:1.3与1:1.7之间，特别是介于1:1.4与1:1.6之间，例如约1:1.5。在一些实施例中，在生理pH下，纳米颗粒的正电荷与负电荷的总电荷比介于1:1.2与1:2(0.5)之间。在一些实施例中，在生理pH下，药物组合物的正电荷与负电荷的总电荷比介于1.6:2(0.8)与1:2(0.5)之间或介于1.6:2(0.8)与1.1:2(0.55)之间。在一些实施例中，在生理pH下，药物组合物的正电荷与负电荷的总电荷比为1.3:2(0.65)。在一些实施例中，在生理pH下，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比不低于1.0:2.0。在一些实施例中，在生理pH下，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比不高于1.9:2.0。在一些实施例中，在生理pH下，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比不低于1.0:2.0并且不高于1.9:2.0。如对技术人员显而易见的，本公开的药物组合物可以包括包含RNA的第一药物组合物和包含脂质的第二药物组合物，使得当使用本公开的方法和系统混合时，实现了前述正电荷与负电荷的比率。
在一个实施例中，药物组合物包含摩尔比为10:0至1:9、优选8:2至3:7并且更优选7:3至5:5的DOTMA与DOPE，并且其中DOTMA的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.8:2至0.8:2、更优选1.6:2至1:2、甚至更优选1.4:2至1.1:2并且甚至更优选约1.2:2。在一个实施例中，药物组合物包含摩尔比为10:0至1:9、优选8:2至3:7并且更优选7:3至5:5的DOTMA与胆固醇，并且其中DOTMA的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.8:2至0.8:2、更优选1.6:2至1:2、甚至更优选1.4:2至1.1:2并且甚至更优选约1.2:2。在一个实施例中，药物组合物包含摩尔比为10:0至1:9、优选8:2至3:7并且更优选7:3至5:5的DOTAP与DOPE，并且其中DOTMA的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.8:2至0.8:2、更优选1.6:2至1:2、甚至更优选1.4:2至1.1:2并且甚至更优选约1.2:2。在一个实施例中，药物组合物包含摩尔比为2:1至1:2、优选2:1至1:1的DOTMA与DOPE，并且其中DOTMA的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.4:1或更小。在一个实施例中，药物组合物包含摩尔比为2:1至1:2、优选2:1至1:1的DOTMA与胆固醇，并且其中DOTMA的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.4:1或更小。在一个实施例中，药物组合物包含摩尔比为2:1至1:2、优选2:1至1:1的DOTAP与DOPE，并且其中DOTAP的正电荷与RNA的负电荷的电荷比为1.4:1或更小。如对技术人员显而易见的，本公开的药物组合物可以包括包含RNA的第一药物组合物和包含脂质(包括例如DOTMA、DOPE、DOTAP和/或胆固醇)的第二药物组合物，使得当使用本公开的方法和系统混合时，实现了前述正电荷与负电荷的比率和/或摩尔比。
在一个实施例中，在按照本公开的方法和系统结合两种或更多种本文所述的药物组合物之后产生或制造的脂质体复合物或脂质体的ζ电位为-5或更小、-10或更小、-15或更小、-20或更小或-25或更小。在各种实施例中，脂质体复合物或脂质体的ζ电位为-35或更高、-30或更高或-25或更高。在一个实施例中，纳米颗粒或脂质体具有0mV至-50mV、优选0mV至-40mV或-10mV至-30mV的ζ电位。
在一些实施例中，在按照本公开的方法和系统结合本文所述的两种或更多种药物组合物之后产生或制造的脂质体复合物或脂质体的多分散性指数为0.5或更小、0.4或更小或0.3或更小，如通过动态光散射所测量的。
在一些实施例中，在按照本公开的方法和系统结合本文所述的两种或更多种药物组合物之后产生或制造的纳米颗粒脂质体具有在约50nm至约1000nm范围内、在约100nm至约800nm范围内、在约200nm至约600nm范围内、在约250nm至约700nm范围内或在约250nm至约550nm范围内的平均直径，如通过动态光散射所测量的。
本文进一步提供了DNA分子，该DNA分子编码可以与本公开的方法和系统一起使用的RNA疫苗或RNA分子中的任一者。例如，在一些实施例中，本公开的DNA分子包含一般结构(在5'→3'方向上)：(1)编码5'非翻译区(UTR)的多核苷酸序列；(2)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；(3)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；(4)编码3'UTR的多核苷酸序列，该3'UTR包含：(a)分裂的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及(5)编码poly(A)序列的多核苷酸序列。在一些实施例中，本公开的DNA分子在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCC ACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGC GCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:22)；和多核苷酸序列ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCCTAGTAACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT(SEQ ID NO:23)。
在一些实施例中，DNA分子在5'→3'方向上进一步包含：编码氨基酸接头的多核苷酸序列；以及编码新表位的多核苷酸序列。在一些实施例中，编码氨基酸接头和新表位的多核苷酸序列形成接头-新表位模块(例如，在5'→3'方向上在同一开放阅读框中的连续序列)。在一些实施例中，在5'→3'方向上，形成接头-新表位模块的多核苷酸序列在编码分泌信号肽的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间，或在SEQ ID NO:22的序列与SEQ ID NO:23的序列之间。在一些实施例中，DNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、28个、29个或30个接头-表位模块，并且接头-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，DNA分子包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个接头-表位模块，并且DNA分子包含编码至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或20个不同新表位的多核苷酸。在一些实施例中，DNA分子包含5个、10个或20个接头-表位模块。在一些实施例中，接头-表位模块中的每一个编码不同的新表位。在一些实施例中，接头-表位模块在5'→3'方向上在同一开放阅读框中形成连续序列。在一些实施例中，编码第一接头-表位模块的接头的多核苷酸序列为编码分泌性信号肽的多核苷酸序列的3'端。在一些实施例中，编码最后一个接头-表位模块的新表位的多核苷酸序列为编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列的5'端。
在一些实施例中，本公开的RNA或DNA分子包含IIS型限制性切割位点，该位点允许在5'RNA聚合酶启动子的控制下转录RNA，并且包含多聚腺苷酸盒(poly(A)序列)，其中识别序列位于poly(A)序列的3'末端，而切割位点位于上游并因此在poly(A)序列内。IIS型限制性切割位点的限制性切割使质粒能够在poly(A)序列内线性化，如描述于美国专利号9,476,055和10,106,800中。然后可使用线性化质粒作为体外转录的模板，所得转录物以未掩蔽的poly(A)序列结尾。可以使用美国专利号9,476,055和10,106,800中描述的任意IIS型限制性切割位点。
在本文提供的方法的一些实施例中，RNA疫苗或RNA分子包含一种或多种多核苷酸，该一种或多种多核苷酸编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的10个至20个(例如，10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个中的任一者)新表位。在某些实施例中，RNA疫苗或RNA分子被配制在脂质体复合物纳米颗粒或脂质体中。在某些实施例中，脂质体复合物纳米颗粒或脂质体包含一种或多种脂质，所述一种或多种脂质形成包封RNA疫苗的RNA的多层结构。在某些实施例中，所述一种或多种脂质包含至少一种阳离子脂质和至少一种辅助脂质。在某些实施例中，该一种或多种脂质包含(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油酰氧基-1-丙铵氯化物(DOTMA)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在某些实施例中，在生理pH，脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比为1.3:2(0.65)。
在某些实施例中，RNA疫苗包含RNA分子，该RNA分子在5'→3'方向上包含：(1)5'帽；(2)5'非翻译区(UTR)；(3)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；(4)编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的一个或多个新表位的多核苷酸序列；(5)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；(6)3'UTR，其包含：(a)分裂的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及(7)poly(A)序列。
在某些实施例中，RNA分子进一步包含编码氨基酸接头的多核苷酸序列；其中编码氨基酸接头的多核苷酸序列与该一个或多个新表位中的第一新表位形成第一接头-新表位模块；并且其中在5'→3'方向上，形成第一接头-新表位模块的多核苷酸序列在编码分泌性信号肽的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。在某些实施例中，氨基酸接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:21)。在某些实施例中，编码氨基酸接头的多核苷酸序列包含序列GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCCGGAGGC(SEQ IDNO:19)。
在某些实施例中，RNA分子在5'→3'方向上进一步包含：至少第二接头-表位模块，其中所述至少第二接头-表位模块包含编码氨基酸接头的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；其中在5'→3'方向上，形成第二接头-新表位模块的多核苷酸序列在编码第一接头-新表位模块的新表位的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间；并且其中第一接头-表位模块的新表位不同于第二接头-表位模块的新表位。在某些实施例中，RNA分子包含5个接头-表位模块，其中5个接头-表位模块各自编码不同的新表位。在某些实施例中，RNA分子包含10个接头-表位模块，其中10个接头-表位模块各自编码不同的新表位。在某些实施例中，RNA分子包含20个接头-表位模块，其中20个接头-表位模块各自编码不同的新表位。
在某些实施例中，RNA分子进一步包含编码氨基酸接头的第二多核苷酸序列，其中编码氨基酸接头的第二多核苷酸序列在编码3'方向上最远的新表位的多核苷酸序列与编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列之间。
在某些实施例中，5'帽包含以下结构的D1非对映异构体：
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在某些实施例中，5'UTR包含序列UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:5)。在某些实施例中，5'UTR包含序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:3)。
在某些实施例中，分泌性信号肽包含氨基酸序列MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ ID NO:9)。在某些实施例中，编码分泌性信号肽的多核苷酸序列包含序列AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ IDNO:7)。
在某些实施例中，MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分包含氨基酸序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA(SEQ ID NO:12)。在某些实施例中，编码MHC分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列包含序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC(SEQ ID NO:10)。
在某些实施例中，AES mRNA的3'非翻译区包含序列CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ ID NO:15)。在某些实施例中，线粒体编码的12S RNA的非编码RNA包含序列CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:17)。在某些实施例中，3'UTR包含序列CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQID NO:13)。
在某些实施例中，poly(A)序列包含120个腺嘌呤核苷酸。
在某些实施例中，RNA疫苗包含RNA分子，该RNA分子在5'→3'方向上包含：多核苷酸序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCG CCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUC UGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:1)；编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的该一个或多个新表位的多核苷酸序列；以及多核苷酸序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:2)。
实例
参考以下实例将更全面地理解本公开。但是，它们不应被解释为限制本发明的范围。应当理解，本文描述的实例和实施例仅用于说明目的，并且鉴于其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并且将被包括在本申请的精神和界限内以及所附权利要求的范围内
在开发本文所公开的方法和系统之前，执行了各种实验以理解、开发并且优化方法和系统。具体地，实验分三个阶段执行：(1)了解蠕动泵流速脉动(实例1)；(2)开发并且优化阻尼器和蠕动泵配置，以保持如通过脉动水平(“LoP”)所测量的一致的稳定流速(实例2)；并且(3)优化阻尼器和蠕动泵配置，以适于具有来自两个源的流体的流动过程(实例3)。这些实验为评估和量化影响LoP的大量参数的有效性提供了机会。
这些实验的目标是开发具有可接受LoP的方法和系统，包括例如，与其他替代方案(例如注射泵)的类似性和/或对其的改善，并且易于使用一次性使用材料(即，用于与本文所述的药物制剂一起使用的构造材料和灭菌注意事项)在无菌的、封闭的良好生产规范(“GMP”)环境中实施。构造材料可能很重要，因为产物接触表面不应渗入产物(产物也不应从材料中提取任何物质)。因此，此类材料应足以用于制造或输送药物组合物，包括本文所述的药物组合物和制剂，诸如例如铂固化硅胶管。
实例中使用的测量和计算
在实例中所述的实验中，非产品接触流量计(例如，Keyence输入端型号FD-XA1)用于监测流速和LoP。基于靶标管外径，传感器头FD-Xs8与夹具组FD-XCR2或FD-XCR1配对。每个Keyence仪表均连接至Keysight高速数据记录器(例如，U2541A)，并且随附的Keysight软件用于每10ms记录一次数据。流量计用于测量系统中的动态流速，并且LoP使用稳态运行期间的系统中的动态流速来确定。
流量计放置在远离流动路径中的任何变化(诸如阻尼器、连接器、急转弯等)的最少10个内径处，以消除来自流动测量的入口效应。在每次实验之前，将每个仪表初始化，将其设置为0mL/min流速。以100Hz的采样率记录了最少7秒。将代表性的秒(通常为第四秒或第五秒)用于脉动计算和数据图两者，因为在一秒中存在多个周期(即，流速峰值之间的距离)。在一些实施例中，数据取自一旦建立了稳态流动后的10秒周期。
脉动水平：脉动水平(“LoP”)计算在用于数据图的代表性的秒上执行。该计算如下：
(最大流速-最小流速)/平均流速x100。
最大流速百分比和最小流速百分比：最大流速百分比和最小流速百分比计算如下：
最大流速百分比＝((最大流速-平均流速)/平均流速x100
最小流速百分比＝((平均流速-最小流速)/平均流速x100
对于所有实验，使用了单个蠕动泵。对于具有两个泵头的实验，单个泵安装有两个泵头。在其中存在与滚筒接触的四个生产线的实验中(具有两个单独的流的双头泵)，使用具有两个泵头的单个泵并且两条线被馈入单个泵头，而不是使用具有两个泵头的两个单独的泵。除非另有说明，否则实例中所述的泵的平均流速为约50mL/min。
实例1：了解蠕动泵流速脉动
如本文所述，由于蠕动泵的性质，来自蠕动泵的流速可能随时间而产生脉冲或振荡。参见例如，实验1(如表1A(实验的设置细节)和表1B(实验1的结果)中所述，其中在给定的时间段内测量了穿过蠕动泵移动的水的流速。简而言之，实验1使用单个泵头来执行，其不含使用在阻尼器下游的30cm长的管的阻尼器。该设置代表了蠕动泵系统预期LoP的实验基线，而没有任何尝试以减少流速变化。图1示出了用于实验1的实验设置。该设置包含水容器、蠕动泵和流量计，该流量计用于测量出自蠕动泵的水流。泵的平均流速为约50mL/min。
图2示出了所测量的穿过蠕动泵的水的流速随时间的变化。如图2所示，流速随时间显著振荡。表1A和1B提供了额外的细节和实验1的结果总结。
图1A
实验1中观察到的最小流速达到了0以下的值；然而，这归因于以下的结合：(1)固有溶液倒吸；和(2)传感器测量误差程度小。
实例2：优化蠕动泵系统中的阻尼器配置以产生一致的稳定流速
一种减少来自蠕动泵的脉动的潜在方式为使用阻尼器。因此，检查了蠕动泵之后阻尼器的各种设计和配置。空气和/或气体可以用作阻尼器，因为它是高度可压缩的。因此，阻尼器的设计可以直接对空气开放，或者该阻尼器可以具有与流体和空气接触的膜。图3示出了用于使用一个或两个蠕动泵头和蠕动泵后的阻尼器来测量流速的实验设置。阻尼器可以减少或消除由蠕动泵产生的压力和流动的变化。具体地，阻尼器可以在峰值流速期间吸收多余的流体并且在下行时释放该流体，以使流速平稳。对于实验1至3，使用了一个泵头。本文所述的所有其他实验均使用了两个泵头。
图3中的实验设置包含蠕动泵之后的阻尼器。如图3所示，阻尼器为具有三通连接器的注射器阻尼器。三通连接器可以为T形配件，该配件具有与主管线连接成90度的两个出口。它可以为具有横向出口的短管件。三通的相对尺寸/开口可能影响阻尼效率。阻尼器和三通连接器流体连接至来自蠕动泵的出口管，如图3所示。阻尼器的一个实例为注射器阻尼器。蠕动泵之后的管可以流体连接至注射器阻尼器。在一些实施例中，蠕动泵之后的管可以流体连接至三通连接器，该三通连接器流体连接至注射器。具有各种三通连接器的注射器阻尼器的图像的实例在图4中示出。可以将注射器的柱塞拉回，使得可以针对给定的用途来调整注射器内的空气体积。注射器内的空气可以充当空间缓冲剂，其中当蠕动泵处于活动状态时，可以临时储存多余的流体。该临时储存可以增加气压，当来自蠕动泵的流速降低时，该气压将流体推出。
根据图3中示出的实验设置，通过调整以下变量来进行使用水的若干实验(即，实验2至16)：(1)所使用的泵头数(给予关于泵相同的设定，使用N个泵头可以将流速粗略乘以N。大多数泵可以根据用于该泵的滚筒的最小和最大RPM来调整至许多种流速)；(2)存在注射器阻尼器或不存在注射器阻尼器；(3)所使用的三通连接器的尺寸(大多数情况下，三通可能不影响流速，除非在其中三通具有小开口并且现在正在限制流速的极少数场景下)；(4)管出口长度(出口管长度可能影响脉动。出口越长，则LoP可能越低，因为管的柔性自然会阻尼系统)；以及(5)注射器中的空气体积。这些实验(实验2至9和12至16)的额外的细节和结果总结在表2A(实验的设置细节)和表2B(实验结果)中。
表2A
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表2B
实验2、4和6中实现的流速随时间的变化分别在图5、6和7中示出。如这些图所示，使用两个泵头的实验6的流速(图7)、处于最大空气体积(即，60mL)处的60mL注射器阻尼器和60cm的管出口长度显著减少了整个实验过程中的脉动。
实验4评估了第二泵头(例如，具有由同一电机驱动的经附接的两个泵头的单个泵)的影响。该实验通过打开邻近第二泵头的阀来进行。参见图3。尽管LoP降低至134，但仍然存在流速变化，如图6所示。添加后续泵头可能会进一步降低LoP；然而，这将增加用于系统的产物流动路径和管套件的复杂性，并且许多蠕动泵仅具有两个固定泵头。
实验2和5添加了注射器阻尼器。这通过打开附接至三通和60mL注射器的阀来完成。参见图3。在打开阀之前，将注射器调整至最大位置(60mL标记)，连接至鲁尔锁三通，并且将三通内联连接至出口管，溶液将在该出口管中流动而没有任何急转弯。对于实验2和5，LoP值分别大大降低至35和23的值。因此，注射器阻尼器被证明是有效的，但仍观察到轻微的脉动。
用于减少流速变化的另一种潜在方法为增加出口管的长度。在实验3和6中，与实验2和5相比，出口管长度从30cm改变为60cm。LoP值从35和23(分别参见表2B实验2和5)降低至25和21(分别参见表2B，实验3和6)。
实验12至16探索了60mL注射器阻尼器内的空气体积，以更好地了解可以有效阻尼流动的最小体积。对于这些实验，将柱塞的位置调整至60cc、40cc、20cc、10cc和5cc的容积刻度线，并且LoP分别为22、21、22、30和47，如表2B所报道。因此，直至将柱塞位置调整至10cc和5cc，LoP之间都不存在显著差异，其中阻尼器变得不太有效。
在实验期间，阻尼器的有效性受到阻尼器/三通系统中气液界面位置的影响。因此，实验7使用与实验6相同的设置来进行，但与其中溶液在测试期间保留在三通中的实验6不同，在实验7期间观察到溶液爬升穿过三通进入阀，该溶液在实验的持续时间内保留在该阀中。LoP在实验6与7之间从21增加至28(参见表2B)，表明气液界面表面积可能影响阻尼器的有效性。鲁尔三通的内径为3.1mm，而鲁尔阀的内径为4.1mm。鲁尔三通被确定为不稳健，因此在实验9中测试了内径为9.5mm的较大三通。LoP降低至18，证实阻尼器/三通系统中的气液界面表面积为一个需要控制的参数。
实施蠕动泵阻尼器的能力可能取决于许多变量，包括构造材料、进行灭菌的能力以及几何形状(即，气压响应于流体脉冲而以多快的速度加压)。上述实验1至16证明，使用阻尼器可以减少流速脉动，但注射器阻尼器可能不满足与本文所述的药物组合物一起使用的标准(例如，如下文所解释的用于GMP用途的LoP和/或灭菌稳健性)，该药物组合物包括例如包含RNA或脂质的药物组合物(例如RNA疫苗)。实验1至16提供了LoP可以被减少的概念证明，并且进一步优化了额外的参数以增加观察到的LoP的减少。一个此类参数用于开发阻尼器，该阻尼器可以易于实施，以用于与包含RNA或脂质的药物制剂(例如RNA疫苗)一起使用。
除了注射器阻尼器之外，可以使用的另一种类型的脉动阻尼器为膜阻尼器。因此，蠕动泵之后的管可以流体连接至膜阻尼器。在一些实施例中，蠕动泵之后的管可以流体连接至三通连接器，该三通连接器流体连接至膜。示例性膜阻尼器在图8中示出。膜阻尼器类似于本文所公开的其他阻尼器，因为可压缩气体用膜作为屏障来执行阻尼器。在一些情况下，可以使用具有可压缩气体阻尼的封闭系统，该可压缩气体用膜充当气体与溶液之间的屏障。对于本文所述的实验，气体为大气，所以在该场景下还不够；封闭系统可以用可压缩气体和柔性膜来设计。膜(柔性、表面积、硬度等)和可压缩气体的微调有助于减少LoP。
为了检查膜阻尼器的潜在影响，根据图3中示出的实验设置来进行了使用水的实验，但用膜阻尼器替换了注射器阻尼器。该实验(实验10)的额外的细节和结果总结在表3A(实验的设置细节)和表3B(实验结果)中。
表3A
表3B
实验10评估了具有柔性膜的三通的阻尼器。理论上，与大气压结合的膜应充当阻尼器。然而，该系统的LoP为65，表明膜在减少流速脉动方面仅略微有效，并且对于与本文所述的药物组合物一起使用而言仍然太高，该药物组合物包括例如包含RNA或脂质的药物组合物(例如RNA疫苗)。
除了膜或注射器之外，充气管本身也可能用作脉动阻尼器。因此，蠕动泵之后的管可以流体连接至管阻尼器。管阻尼器的示例性配置在图9和10中示出。如图9所示，管阻尼器可以为三通连接器管阻尼器。当使用此类三通连接器管阻尼器时，蠕动泵之后的管可以流体连接至三通连接器，该三通连接器流体连接至管阻尼器。管阻尼器的管可以由与蠕动泵之后的管相同或不同的材料制成。在一些实施例中，管阻尼器的管可以为硅胶。在一些实施例中，管阻尼器可以包括夹具或其他物体，使得管阻尼器的与流体连接至三通连接器的端部相对的端部为封闭的。管阻尼器的工作方式与其他阻尼器类似，因为经封闭的气体可以执行阻尼。
图10示出了具有十字或4通连接器的管阻尼器的实例。代替三通连接器，图10中的4通连接器(阻尼有效性可能取决于阀开口尺寸)允许将管阻尼器的两端均连接至4通连接器，而不是使用夹具或其他装置以关闭管阻尼器的一端。当使用4通管阻尼器时，蠕动泵之后的管可以流体连接至4通连接器，该4通连接器流体连接至管阻尼器。因此，来自蠕动泵的流体可以进入4通连接器的开口中的一个开口并且从另一个开口离开，而管阻尼器可以连接至另外两个未使用的开口，使得管阻尼器的两端均流体连接至4通连接器。4通管阻尼器的工作方式可以与其他阻尼器类似，因为经封闭的气体可以执行阻尼。
为了检查三通连接器管阻尼器(如图9所示)或4通管阻尼器(如图10所示)的潜在影响，根据图3中示出的实验设置来进行了使用水的实验，但用三通连接器管阻尼器或4通连接器管阻尼器替换了注射器阻尼器。这些实验(实验11、17和18)的额外的细节和结果总结在表4A(实验的设置细节)和表4B(实验结果)中。
表4A
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作为初步事项，实验11用30cm的薄壁柔性管(7.9mm OD，0.8mm壁厚)替换了三通/阻尼器。使用薄壁柔性管作为阻尼器的概念建立在实验3和6(参见表2B)的基础上，其中较长的管出口长度减少了LoP。不受理论的束缚，流体将由管进行阻尼，并且随着管的柔性增加(即，从刚性管变为柔性管)，阻尼效应也增加。由此，与实验3和6中使用的管相比，较短长度的薄壁柔性管可以实现相同的LoP。为了测试该假设，执行了实验11，并且使用30cm的薄壁管，LoP从134(参见表2B，实验4，无阻尼器)增加至152(参见表3B)。尽管最初观察到通过使用薄壁柔性管而增加LoP，但如实验17和18进一步所述，进一步探索了使用管作为阻尼器背后的概念。如果一根管内的经封闭的空气体积可以替换注射器的空气体积并且有效减少LoP，则可以满足许多工艺要求，诸如灭菌和溶液滞留。
因此，实验17利用了一根闭端(即，夹紧)硅胶管(即，如图9所示的三通连接器管阻尼器)代替注射器，其中管长度为42cm(大约30cc的管内空气)。此外，也改变了三通的位置，使其更容易安装，但假设这对阻尼器没有影响。如表3B所报道，观察到的LoP为19，这与使用注射器阻尼器的值相当(参见例如，表2B)。这些结果表明，闭端管的阻尼水平与注射器阻尼器的阻尼水平相当。如先前所述，使用闭端管而不是注射器的好处在于，此类系统可以满足用于药物组合物和制剂的GMP工艺要求。在一些实施例中，阻尼器可以为开放式(即，对大气开放)管阻尼器。
实验18用定位成“X”或“十字”(如图10所示)的四通连接器替换了三通，其中两个端口与单根硅胶管连接，从而形成回路，并且另外两个端口是用于流体流动。实验18的目标为评估与实验17相比，在该阻尼器之间是否存在任何优点。实验18的LoP与实验17的LoP相同。参见表3B。
尽管我们观察到在若干阻尼器和管套件配置中使用时，LoP显著减少(甚至实现了低至18至22的LoP值)，但脉动和振荡的水平对于混合和/或制造本文所述的药物组合物仍然不是最佳的，该药物组合物包括例如包含RNA或脂质(包括脂质体复合物或脂质体)的药物组合物(例如RNA疫苗)，并且该水平通常高于当使用替代注射泵配置时观察到的LoP值(参见表5A和5B，实例24至26)。因此，评估了额外的参数以更进一步减少LoP值。尽管我们的目标为减少LoP值，但技术人员会理解，在实例2中观察到的LoP的减少可能适用于其他应用和药物组合物，包括例如将药物组合物输送和/或填充至容器(诸如袋子或小瓶)中。
实例3:将阻尼器配置应用于具有两个流体源的流动过程。
实验1至18主要针对具有一个流体源的系统。然而，蠕动泵也可以用于具有多于一个流体源的系统。一个此类实例为当将两种药物组合物混合或结合以形成最终药物组合物时，包括例如当将包含RNA或RNA疫苗的第一种药物组合物与包含一种或多种脂质的第二种药物组合物结合以形成包含RNA-脂质体复合物或RNA脂质体的最终药物组合物时。因为药物组合物可能包含精巧并且包含昂贵的成分，所以用于最终药物组合物或制剂的这些组分的量对最终药物组合物是否将是有效、安全和具有成本效益的可能是至关重要的。因为最终药物组合物的成分来源于不同的来源或容器，重要的是在蠕动泵系统中这些成分或中间药物组合物的流速不发生脉冲，该脉冲使得成分或中间药物组合物无法以适当比例有效地混合，该适当比例用于使包含中间体药物组合物混合物的最终药物组合物为有效的。
因为本文所述的药物组合物(包括例如包含RNA或脂质的药物组合物，例如RNA疫苗)经常进行混合，以产生包含RNA-脂质体复合物或RNA脂质体的最终药物组合物，因此执行了评估两种不同流体源与两个蠕动泵的实验。特别地，进行了实验以评估可以在两个蠕动泵之间实现一致流速的阻尼器类型。图11示出了用于使用一个蠕动泵和蠕动泵后的阻尼器来测量双流体源系统的流速的实验设置。尽管图11中示出仅存在一个蠕动泵，但在一些实施例中，蠕动泵可以为双头蠕动泵或具有多于一个头的蠕动泵。因此，来自每个流体源的管可以附接至双头蠕动泵的泵头，使得仅需要一个蠕动泵。在一些实施例中，流体源中的每个流体源可以具有它们自己的蠕动泵。然而，对于在实验19至20中进行的实验，来自每个源的入口被分成两个流，使得使用了蠕动泵中的每个蠕动泵的双泵头的每个泵头。实验19和20使用了单个蠕动泵，但泵具有两个由电机驱动的泵头。在实验21至22中，使用了每个双头蠕动泵的泵头中的仅一个泵头。
当与图3相比时，除了不同的设置之外，还对图11的实验设置进行了额外的改变。首先，所使用的蠕动泵为Watson Marlow Flexicon PD12l，并且管出口尺寸为2.4mm ID而不是3.2mm ID。实验20建立了在不针对两条入口管线使用阻尼器的该设置中观察到的针对LoP的基线。对于每个入口，最小流速为约80mL/min，这与先前使用的约50mL/min不同。如图11所示，流量计放置在两个入口泵的下游以及Y型连接器的下游。
实验19实施了阻尼器。在一些实施例中，阻尼器可以为两个单独的闭端管阻尼器。然而，申请人发现在阻尼管回路的形成中，可以在两个入口上同时使用单个管阻尼器。图12示出了阻尼器回路的实例。阻尼回路可以连接至泵后入口管线上的两个三通连接器。此外，阻尼回路安装在流动路径上方，以防止溶液进入回路。
实验21和22评估了更进一步通过针对每个入口利用单个泵头而不是具有双泵头来简化管套件的可能性。这可以消除直接在泵头上游和下游对Y型连接器的需求。然而，仍然需要参与混合两个单独的入口的Y型连接器。
使用图11中的设置的实验19至22的额外的细节和结果总结在表5A(实验的设置细节)和表5B(实验结果)中。
实验24、25和26使用两种类型的注射泵来进行，目标为将LoP值与实验19(具有回路阻尼器的蠕动泵)中观察到的LoP值直接进行比较。实验24至26的额外的细节和结果总结在表5A(实验的设置细节)和表5B(实验结果)中。
表5A
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实验19.1、20.1、21.1和22.1的结果均来自附接至第一源入口的流量计。实验19.2、20.2、21.2和22.2的结果均来自附接至第二源入口的流量计。实验19.3、20.3、21.3和22.3的结果均来自经结合的第一源和第二源的Y型连接器或混合器之后的流量计。如表5B所报道，针对实验21和22，在将两个入口混合后所测量的流速分别为大约91mL/min和161mL/min，并且其对应的LoP分别为约15(14至16)和约9(8至10)。尽管较高流速下(实验22)的LoP为10或更小，但由于实验21的LoP增加，因此具有单个泵头的设置在各种流速下可能并不稳健。
如表5B所报道，针对实验20(无阻尼)的每个入口的LoP为80和87，并且出口的LoP为80。相比之下，使用回路阻尼器的实验19(有阻尼)的LoP均为7，并且出口处的LoP为8。这些结果满足对于生产、混合、输送和/或制造本文所述的药物组合物和制剂，实现LoP小于10(例如，以便充分控制多个泵和/或流体源的流速以确保药物组合物的适当混合，并且以便实现与用注射泵通常实现的等效或更好的LoP值)的可接受目标，该药物组合物和制剂包括例如包含RNA或脂质的药物组合物(例如RNA疫苗)，并且阻尼回路满足先前概述的所有GMP工艺目标，同时实施起来简单且具有成本效益，并且与一次性使用采购兼容。图13示出了根据实验19的穿过蠕动泵系统的水的流速，并且图14示出了根据实验20的实验的穿过蠕动泵的水的流速。
实验24.1、25.1和26.1的结果均来自附接至第一源入口的流量计。实验14.2、25.2和26.2的结果均来自附接至第二源入口的流量计。实验24.3、25.3、26.3的结果均来自经结合的第一源和第二源的Y型连接器或混合器之后的流量计。
如表5B所报道，针对实验24和25，在将两个入口混合后所测量的流速分别为大约111mL/min和57mL/min，并且其对应的LoP分别平均为约25.5(25至26)和约24.5(21至28)。这些实验使用了现成的注射泵，该注射泵并非专门设计为减少泵脉动，但证明标准单元在实现小于10的LoP值方面不符合可接受目标。实验26也使用了现成的注射泵。市售注射泵的脉动可能会有所不同，但该类型的系统并非无脉动。如表5B所报道，在将两个入口混合后所测量的流速为大约141mL/min，并且对应的LoP平均为约14(10至18)。这些结果证实，实验19(回路阻尼器)实现了比两种注射泵系统更好的LoP值。
图15描述了一种能够从两个流体源实现小于10的LoP的蠕动泵、阻尼器和管套件系统，该两个流体源包括例如本文所述的药物组合物，并且特别是包括包含RNA、RNA分子或RNA疫苗的药物组合物的药物组合物，以及包含一种或多种脂质的另一种药物组合物，可以将这两种药物组合物混合以产生、输送或制造包含RNA-脂质体复合物或RNA脂质体的最终药物组合物。
本申请中提及的所有出版物，包括专利文件、科学文章和数据库，均出于所有目的通过引用整体并入，其引用程度如同每一个体出版物通过引用单独并入。如果本文阐述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中阐述的定义相反或不一致，则本文阐述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本发明并非旨在将范围限制于特定公开的实施例，提供该实施例以例如示出本发明的各个方面。从本文的描述和教导中，对所述装置和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实践此类改变，并且此类改变旨在落入本公开的范围内。
非正式的序列表所有多核苷酸序列均按5'→3方向显示。所有多肽序列均按N末端至C末端方向显示。
完整PCV RNA 5'恒定序列(SEQ ID NO:1)
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC
完整PCV RNA 3'恒定序列(SEQ ID NO:2)
AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU
完整PCV Kozak RNA(SEQ ID NO:3)
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC
完整PCV Kozak DNA(SEQ ID NO:4)
GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC
短Kozak RNA(SEQ ID NO:5)
UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC
短Kozak DNA(SEQ ID NO:6)
TTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC
sec RNA(SEQ ID NO:7)
AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC
sec DNA(SEQ ID NO:8)
ATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC
sec蛋白(SEQ ID NO:9)
MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS
MITD RNA(SEQ ID NO:10)
AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC
MITD DNA(SEQ ID NO:11)
ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCC
MITD蛋白(SEQ ID NO:12)
IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA
完整PCV FI RNA(SEQ ID NO:13)
CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU
完整PCV FI DNA(SEQ ID NO:14)
CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT
F元件RNA(SEQ ID NO:15)
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC
F元件DNA(SEQ ID NO:16)
CTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCC
I元件RNA(SEQ ID NO:17)
CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG
I元件DNA(SEQ ID NO:18)
CAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCG
接头RNA(SEQ ID NO:19)
GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCCGGAGGC
接头DNA(SEQ ID NO:20)
GGCGGCTCTGGAGGAGGCGGCTCCGGAGGC
接头蛋白(SEQ ID NO:21)
GGSGGGGSGG
完整PCV DNA 5'恒定序列(SEQ ID NO:22)
GGCGAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGAGAGTGATGGCCCCCAGAACCCTGATCCTGCTGCTGTCTGGCGCCCTGGCCCTGACAGAGACATGGGCCGGAAGC
完整PCV DNA 3'恒定序列(SEQ ID NO:23)
ATCGTGGGAATTGTGGCAGGACTGGCAGTGCTGGCCGTGGTGGTGATCGGAGCCGTGGTGGCTACCGTGATGTGCAGACGGAAGTCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCTACAGCCAGGCCGCCAGCTCTGATAGCGCCCAGGGCAGCGACGTGTCACTGACAGCCTAGTAACTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCCCGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCACCACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTAGCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGTTTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCGAGACCTGGTCCAGAGTCGCTAGCCGCGTCGCT
包含来自帽的5'GG的完整PCV RNA(SEQ ID NO:24)
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序列表
<110> 基因泰克公司 (GENENTECH, INC.)
<120> 用于使用蠕动泵和阻尼器来生产药物组合物的系统和方法
<130> 14639-30481.00
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 63/075,723
<151> 2020-09-08
<160> 24
<170> 用于 Windows 的 FastSEQ，4.0 版
<210> 1
<211> 129
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
ggcgaacuag uauucuucug guccccacag acucagagag aacccgccac caugagagug 60
auggccccca gaacccugau ccugcugcug ucuggcgccc uggcccugac agagacaugg 120
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<210> 2
<211> 488
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
aucgugggaa uuguggcagg acuggcagug cuggccgugg uggugaucgg agccguggug 60
gcuaccguga ugugcagacg gaaguccagc ggaggcaagg gcggcagcua cagccaggcc 120
gccagcucug auagcgccca gggcagcgac gugucacuga cagccuagua acucgagcug 180
guacugcaug cacgcaaugc uagcugcccc uuucccgucc uggguacccc gagucucccc 240
cgaccucggg ucccagguau gcucccaccu ccaccugccc cacucaccac cucugcuagu 300
uccagacacc ucccaagcac gcagcaaugc agcucaaaac gcuuagccua gccacacccc 360
cacgggaaac agcagugauu aaccuuuagc aauaaacgaa aguuuaacua agcuauacua 420
accccagggu uggucaauuu cgugccagcc acaccgagac cugguccaga gucgcuagcc 480
gcgucgcu 488
<210> 3
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
ggcgaacuag uauucuucug guccccacag acucagagag aacccgccac c 51
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
ggcgaactag tattcttctg gtccccacag actcagagag aacccgccac c 51
<210> 5
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
uucuucuggu ccccacagac ucagagagaa cccgccacc 39
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
ttcttctggt ccccacagac tcagagagaa cccgccacc 39
<210> 7
<211> 78
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
augagaguga uggcccccag aacccugauc cugcugcugu cuggcgcccu ggcccugaca 60
gagacauggg ccggaagc 78
<210> 8
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
atgagagtga tggcccccag aaccctgatc ctgctgctgt ctggcgccct ggccctgaca 60
gagacatggg ccggaagc 78
<210> 9
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Met Arg Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser
20 25
<210> 10
<211> 165
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
aucgugggaa uuguggcagg acuggcagug cuggccgugg uggugaucgg agccguggug 60
gcuaccguga ugugcagacg gaaguccagc ggaggcaagg gcggcagcua cagccaggcc 120
gccagcucug auagcgccca gggcagcgac gugucacuga cagcc 165
<210> 11
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
atcgtgggaa ttgtggcagg actggcagtg ctggccgtgg tggtgatcgg agccgtggtg 60
gctaccgtga tgtgcagacg gaagtccagc ggaggcaagg gcggcagcta cagccaggcc 120
gccagctctg atagcgccca gggcagcgac gtgtcactga cagcc 165
<210> 12
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Ile Val Gly Ile Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile
1 5 10 15
Gly Ala Val Val Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly
20 25 30
Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly
35 40 45
Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala
50 55
<210> 13
<211> 317
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
cucgagcugg uacugcaugc acgcaaugcu agcugccccu uucccguccu ggguaccccg 60
agucuccccc gaccucgggu cccagguaug cucccaccuc caccugcccc acucaccacc 120
ucugcuaguu ccagacaccu cccaagcacg cagcaaugca gcucaaaacg cuuagccuag 180
ccacaccccc acgggaaaca gcagugauua accuuuagca auaaacgaaa guuuaacuaa 240
gcuauacuaa ccccaggguu ggucaauuuc gugccagcca caccgagacc ugguccagag 300
ucgcuagccg cgucgcu 317
<210> 14
<211> 311
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
ctggtactgc atgcacgcaa tgctagctgc ccctttcccg tcctgggtac cccgagtctc 60
ccccgacctc gggtcccagg tatgctccca cctccacctg ccccactcac cacctctgct 120
agttccagac acctcccaag cacgcagcaa tgcagctcaa aacgcttagc ctagccacac 180
ccccacggga aacagcagtg attaaccttt agcaataaac gaaagtttaa ctaagctata 240
ctaaccccag ggttggtcaa tttcgtgcca gccacaccga gacctggtcc agagtcgcta 300
gccgcgtcgc t 311
<210> 15
<211> 136
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg uccuggguac cccgagucuc 60
ccccgaccuc gggucccagg uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120
aguuccagac accucc 136
<210> 16
<211> 136
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
ctggtactgc atgcacgcaa tgctagctgc ccctttcccg tcctgggtac cccgagtctc 60
ccccgacctc gggtcccagg tatgctccca cctccacctg ccccactcac cacctctgct 120
agttccagac acctcc 136
<210> 17
<211> 143
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
caagcacgca gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc 60
agugauuaac cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg 120
ucaauuucgu gccagccaca ccg 143
<210> 18
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
caagcacgca gcaatgcagc tcaaaacgct tagcctagcc acacccccac gggaaacagc 60
agtgattaac ctttagcaat aaacgaaagt ttaactaagc tatactaacc ccagggttgg 120
tcaatttcgt gccagccaca ccg 143
<210> 19
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
ggcggcucug gaggaggcgg cuccggaggc 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
ggcggctctg gaggaggcgg ctccggaggc 30
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 22
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
ggcgaactag tattcttctg gtccccacag actcagagag aacccgccac catgagagtg 60
atggccccca gaaccctgat cctgctgctg tctggcgccc tggccctgac agagacatgg 120
gccggaagc 129
<210> 23
<211> 488
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
atcgtgggaa ttgtggcagg actggcagtg ctggccgtgg tggtgatcgg agccgtggtg 60
gctaccgtga tgtgcagacg gaagtccagc ggaggcaagg gcggcagcta cagccaggcc 120
gccagctctg atagcgccca gggcagcgac gtgtcactga cagcctagta actcgagctg 180
gtactgcatg cacgcaatgc tagctgcccc tttcccgtcc tgggtacccc gagtctcccc 240
cgacctcggg tcccaggtat gctcccacct ccacctgccc cactcaccac ctctgctagt 300
tccagacacc tcccaagcac gcagcaatgc agctcaaaac gcttagccta gccacacccc 360
cacgggaaac agcagtgatt aacctttagc aataaacgaa agtttaacta agctatacta 420
accccagggt tggtcaattt cgtgccagcc acaccgagac ctggtccaga gtcgctagcc 480
gcgtcgct 488
<210> 24
<211> 740
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> misc_feature
<222> 1,2
<223> 通过说明书的表 6 和图 18 中所示的 (5'->5')-pp(s)p-
<220>
<221> misc_feature
<222> 132
<223> n = A、T、C、G 或 U
<220>
<221> misc_feature
<222> 132
<223> 以说明书(例如，图 17)中定义的编码一个或多个新表位的多核苷酸序列存在
<400> 24
ggggcgaacu aguauucuuc ugguccccac agacucagag agaacccgcc accaugagag 60
ugauggcccc cagaacccug auccugcugc ugucuggcgc ccuggcccug acagagacau 120
gggccggaag cnaucguggg aauuguggca ggacuggcag ugcuggccgu gguggugauc 180
ggagccgugg uggcuaccgu gaugugcaga cggaagucca gcggaggcaa gggcggcagc 240
uacagccagg ccgccagcuc ugauagcgcc cagggcagcg acgugucacu gacagccuag 300
uaacucgagc ugguacugca ugcacgcaau gcuagcugcc ccuuucccgu ccuggguacc 360
ccgagucucc cccgaccucg ggucccaggu augcucccac cuccaccugc cccacucacc 420
accucugcua guuccagaca ccucccaagc acgcagcaau gcagcucaaa acgcuuagcc 480
uagccacacc cccacgggaa acagcaguga uuaaccuuua gcaauaaacg aaaguuuaac 540
uaagcuauac uaaccccagg guuggucaau uucgugccag ccacaccgag accuggucca 600
gagucgcuag ccgcgucgcu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 660
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 740

Claims (115)

1.一种用于形成混合物的管套件，所述管套件包括：
第一管部分，其配置为流体连接至含有第一组合物的容器；
第二管部分，其配置为流体连接至含有第二组合物的容器；
阻尼器，其流体连接至所述第一管部分并且流体连接至所述第二管部分
混合器，其用于将来自所述第一管部分的所述第一组合物与来自所述第二管部分的所述第二组合物混合；
混合物容器，其用于从所述混合器收集经混合的第一组合物和第二组合物，
其中所述第一管部分配置为连接至至少一个蠕动泵头，以用于将所述第一组合物从含有所述第一组合物的所述容器泵送至所述混合物容器，并且所述第二管部分配置为连接至至少一个蠕动泵头，以用于将所述第二组合物从含有所述第二组合物的所述容器泵送至所述混合物容器。
2.根据权利要求1所述的管套件，其中所述阻尼器包括封闭体积的流体。
3.根据权利要求2所述的管套件，其中所述流体为空气。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的管套件，其中所述阻尼器为管阻尼器。
5.根据权利要求1所述的管套件，其中所述阻尼器包括柔性膜。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的管套件，其进一步包括将所述阻尼器、所述第一管部分和第一管混合器输入部分流体连接的第一三通连接器，其中所述第一管混合器输入部分流体连接至所述混合器。
7.根据权利要求6所述的管套件，其进一步包括将所述阻尼器、所述第二管部分和第二管混合器输入部分流体连接的第二三通连接器，其中所述第二管混合器输入部分流体连接至所述混合器。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的管套件，其中所述第一管部分包括第一管区段和第二管区段，其中所述第一管区段和所述第二管区段并行地流体连接。
9.根据权利要求8所述的管套件，其中所述第一管区段配置为连接至第一蠕动泵头，并且所述第二管区段配置为连接至第二蠕动泵头。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的管套件，其中所述第二管部分包括第三管区段和第四管区段，其中第三管部分和第四管部分并行地流体连接。
11.根据权利要求10所述的管套件，其中所述第三管区段配置为连接至第三蠕动泵头，并且所述第四管区段配置为连接至第四蠕动泵头。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的管套件，其中所述混合器包括流体连接至所述第一管部分的输入端、流体连接至所述第二管部分的输入端，以及流体连接至所述混合物容器的输出端。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的管套件，其中所述混合器包括Y形连接器、螺旋混合器或静态混合器。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的管套件，其进一步包括第一阻尼器连接器和第二阻尼器连接器，所述第一阻尼器连接器将所述第一管部分流体连接至所述阻尼器并且流体连接至所述混合器，并且所述第二阻尼器连接器将所述管的所述第二部分流体连接至所述阻尼器并且流体连接至所述混合器。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的管套件，其中所述混合物容器为袋子、器皿或瓶子。
16.一种用于形成药物组合物或药物组合物的混合物的系统，所述系统包括：
第一容器，其含有第一药物组合物；
第二容器，其含有第二药物组合物；
第一管部分，其流体连接至所述第一容器；
第二管部分，其流体连接至所述第二容器；
阻尼器，其流体连接至所述第一管部分并且流体连接至所述第二管部分；
混合器，其用于将来自所述第一管部分的所述第一药物组合物与来自所述第二管部分的所述第二药物组合物混合；以及
混合物容器，其用于从所述混合器收集经混合的第一药物组合物和第二药物组合物。
17.根据权利要求16所述的系统，其进一步包括连接至所述第一管部分的至少一个蠕动泵头，以用于将第一组合物从含有所述第一组合物的所述容器泵送至所述混合物容器；以及连接至所述第二管部分的至少一个蠕动泵，以用于将第二组合物从含有所述第一组合物的所述容器泵送至所述混合物容器。
18.根据权利要求16至17中任一项所述的系统，其中所述第一组合物或第二组合物包含核酸，一种或多种脂质，一种或多种蛋白质，或缓冲剂。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的系统，其中所述第一组合物包含核酸并且所述第二组合物包含一种或多种脂质。
20.根据权利要求18所述的系统，其中所述第一组合物包含RNA并且所述第二组合物包含一种或多种脂质。
21.根据权利要求20所述的系统，其中所述RNA包含一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的10个至20个新表位。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述RNA被配制在脂质体复合物纳米颗粒或脂质体中。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述脂质体复合物纳米颗粒或脂质体包含一种或多种脂质，所述一种或多种脂质形成包封所述RNA的多层结构。
24.根据权利要求20所述的系统，其中所述一种或多种脂质包含至少一种阳离子脂质和至少一种辅助脂质。
25.根据权利要求20所述的系统，其中所述一种或多种脂质包含(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油酰氧基-1-丙铵氯化物(DOTMA)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
26.根据权利要求25所述的系统，其中在生理pH下，所述脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比为1.3:2(0.65)。
27.根据权利要求20至26中任一项所述的系统，其中所述RNA包含RNA分子，所述RNA分子在5'→3'方向上包含：
(1)5'帽；
(2)5'非翻译区(UTR)；
(3)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；
(4)编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的所述一个或多个新表位的多核苷酸序列；
(5)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；
(6)3'UTR，其包含：
(a)分裂的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和
(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及
(7)poly(A)序列。
28.根据权利要求27所述的系统，其中所述RNA分子进一步包含编码氨基酸接头的多核苷酸序列；其中编码所述氨基酸接头的所述多核苷酸序列与所述一个或多个新表位中的第一新表位形成第一接头-新表位模块；并且其中在所述5'→3'方向上，形成所述第一接头-新表位模块的所述多核苷酸序列在编码所述分泌性信号肽的所述多核苷酸序列与编码所述MHC分子的所述跨膜和胞质结构域的所述至少一部分的所述多核苷酸序列之间。
29.根据权利要求28所述的系统，其中所述氨基酸接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQ IDNO:21)。
30.根据权利要求28所述的系统，其中编码所述氨基酸接头的所述多核苷酸序列包含序列GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCCGGAGGC(SEQ ID NO:19)。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的系统，其中所述RNA分子在所述5'→3'方向上进一步包含：至少第二接头-表位模块，其中所述至少第二接头-表位模块包含编码氨基酸接头的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；其中在所述5'→3'方向上，形成所述第二接头-新表位模块的所述多核苷酸序列在编码所述第一接头-新表位模块的所述新表位的所述多核苷酸序列与编码所述MHC分子的所述跨膜和胞质结构域的所述至少一部分的所述多核苷酸序列之间；并且其中所述第一接头-表位模块的所述新表位不同于所述第二接头-表位模块的所述新表位。
32.根据权利要求31所述的系统，其中所述RNA分子包含5个接头-表位模块，并且其中所述5个接头-表位模块各自编码不同的新表位。
33.根据权利要求31所述的系统，其中所述RNA分子包含10个接头-表位模块，并且其中所述10个接头-表位模块各自编码不同的新表位。
34.根据权利要求31所述的系统，其中所述RNA分子包含20个接头-表位模块，并且其中所述20个接头-表位模块各自编码不同的新表位。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的系统，其中所述RNA分子进一步包含编码氨基酸接头的第二多核苷酸序列，其中编码所述氨基酸接头的所述第二多核苷酸序列在编码3'方向上最远的新表位的多核苷酸序列与编码所述MHC分子的所述跨膜和胞质结构域的所述至少一部分的所述多核苷酸序列之间。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的系统，其中所述5'帽包含以下结构的D1非对映异构体：
37.根据权利要求28至36中任一项所述的系统，其中所述5'UTR包含序列UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:5)。
38.根据权利要求28至37中任一项所述的系统，其中所述5'UTR包含序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:3)。
39.根据权利要求28至38中任一项所述的系统，其中所述分泌性信号肽包含氨基酸序列MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ ID NO:9)。
40.根据权利要求28至38中任一项所述的系统，其中编码所述分泌性信号肽的所述多核苷酸序列包含序列AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:7)。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的系统，其中所述MHC分子的所述跨膜和胞质结构域的所述至少一部分包含氨基酸序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA(SEQ ID NO:12)。
42.根据权利要求28至40中任一项所述的系统，其中编码所述MHC分子的所述跨膜和胞质结构域的所述至少一部分的所述多核苷酸序列包含序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC(SEQ ID NO:10)。
43.根据权利要求28至42中任一项所述的系统，其中所述AES mRNA的所述3'非翻译区包含序列CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ IDNO:15)。
44.根据权利要求28至43中任一项所述的系统，其中所述线粒体编码的12S RNA的所述非编码RNA包含序列CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:17)。
45.根据权利要求28至44中任一项所述的系统，其中所述3'UTR包含序列CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:13)。
46.根据权利要求28至45中任一项所述的系统，其中所述poly(A)序列包含120个腺嘌呤核苷酸。
47.根据权利要求20所述的系统，其中所述RNA包含RNA分子，所述RNA分子在所述5'→3'方向上包含：
多核苷酸序列
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:1)；
编码由存在于所述肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的所述一个或多个新表位的多核苷酸序列；以及
多核苷酸序列
AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:2)。
48.一种用于使用蠕动泵来输送药物组合物的方法，所述方法包括：
使用至少一个蠕动泵，从第一容器穿过第一管部分泵送第一组合物；
使用至少一个蠕动泵，从第二容器穿过第二管部分泵送第二组合物；以及
使用流体连接至所述第一管部分并且流体连接至所述第二管部分的阻尼器，阻尼在所述第一管部分中的所述第一组合物的流体流动中的脉冲并且阻尼在所述第二管部分中的所述第二组合物的流体流动中的脉冲。
49.根据权利要求48所述的方法，其进一步包括：在流体连接至所述第一管部分和所述第二管部分的混合器中，将来自所述第一管部分的所述第一组合物与来自所述第二管部分的所述第二组合物混合。
50.根据权利要求49所述的方法，其进一步包括：将含有所述第一组合物和所述第二组合物的所述混合物沉积至流体连接至所述混合物的混合物容器中。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中所述第一组合物或第二组合物包含核酸，一种或多种脂质，一种或多种蛋白质，或缓冲剂。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述第一组合物包含核酸并且所述第二组合物包含一种或多种脂质。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述第一组合物包含RNA并且所述第二组合物包含一种或多种脂质。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述RNA包含一种或多种多核苷酸，所述一种或多种多核苷酸编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的10个至20个新表位。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述RNA被配制在脂质体复合物纳米颗粒或脂质体中。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述脂质体复合物纳米颗粒或脂质体包含一种或多种脂质，所述一种或多种脂质形成包封所述RNA的多层结构。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述一种或多种脂质包含至少一种阳离子脂质和至少一种辅助脂质。
58.根据权利要求53所述的方法，其中所述一种或多种脂质包含(R)-N,N,N-三甲基-2,3-二油酰氧基-1-丙铵氯化物(DOTMA)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
59.根据权利要求58所述的方法，其中在生理pH下，所述脂质体的正电荷与负电荷的总电荷比为1.3:2(0.65)。
60.根据权利要求53至59中任一项所述的方法，其中所述RNA包含RNA分子，所述RNA分子在5'→3'方向上包含：
(1)5'帽；
(2)5'非翻译区(UTR)；
(3)编码分泌性信号肽的多核苷酸序列；
(4)编码由存在于肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的所述一个或多个新表位的多核苷酸序列；
(5)编码主要组织相容性复合物(MHC)分子的跨膜和胞质结构域的至少一部分的多核苷酸序列；
(6)3'UTR，其包含：
(a)分裂的氨基末端增强子(AES)mRNA的3'非翻译区或其片段；和
(b)线粒体编码的12S RNA的非编码RNA或其片段；以及
(7)poly(A)序列。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述RNA分子进一步包含编码氨基酸接头的多核苷酸序列；其中编码所述氨基酸接头的所述多核苷酸序列与所述一个或多个新表位中的第一新表位形成第一接头-新表位模块；并且其中在所述5'→3'方向上，形成所述第一接头-新表位模块的所述多核苷酸序列在编码所述分泌性信号肽的所述多核苷酸序列与编码所述MHC分子的所述跨膜和胞质结构域的所述至少一部分的所述多核苷酸序列之间。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述氨基酸接头包含序列GGSGGGGSGG(SEQ IDNO:21)。
63.根据权利要求62所述的方法，其中编码所述氨基酸接头的所述多核苷酸序列包含序列GGCGGCUCUGGAGGAGGCGGCUCCGGAGGC(SEQ ID NO:19)。
64.根据权利要求61至63中任一项所述的方法，其中所述RNA分子在所述5'→3'方向上进一步包含：至少第二接头-表位模块，其中所述至少第二接头-表位模块包含编码氨基酸接头的多核苷酸序列和编码新表位的多核苷酸序列；其中在所述5'→3'方向上，形成所述第二接头-新表位模块的所述多核苷酸序列在编码所述第一接头-新表位模块的所述新表位的所述多核苷酸序列与编码所述MHC分子的所述跨膜和胞质结构域的所述至少一部分的所述多核苷酸序列之间；并且其中所述第一接头-表位模块的所述新表位不同于所述第二接头-表位模块的所述新表位。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述RNA分子包含5个接头-表位模块，并且其中所述5个接头-表位模块各自编码不同的新表位。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述RNA分子包含10个接头-表位模块，并且其中所述10个接头-表位模块各自编码不同的新表位。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述RNA分子包含20个接头-表位模块，并且其中所述20个接头-表位模块各自编码不同的新表位。
68.根据权利要求61至67中任一项所述的方法，其中所述RNA分子进一步包含编码氨基酸接头的第二多核苷酸序列，其中编码所述氨基酸接头的所述第二多核苷酸序列在编码3'方向上最远的新表位的多核苷酸序列与编码所述MHC分子的所述跨膜和胞质结构域的所述至少一部分的所述多核苷酸序列之间。
69.根据权利要求61至68中任一项所述的方法，其中所述5'帽包含以下结构的D1非对映异构体：
70.根据权利要求61至69中任一项所述的方法，其中所述5'UTR包含序列UUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:5)。
71.根据权利要求61至70中任一项所述的方法，其中所述5'UTR包含序列GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC(SEQ ID NO:3)。
72.根据权利要求61至71中任一项所述的方法，其中所述分泌性信号肽包含氨基酸序列MRVMAPRTLILLLSGALALTETWAGS(SEQ ID NO:9)。
73.根据权利要求61至71中任一项所述的方法，其中编码所述分泌性信号肽的所述多核苷酸序列包含序列AUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:7)。
74.根据权利要求61至73中任一项所述的方法，其中所述MHC分子的所述跨膜和胞质结构域的所述至少一部分包含氨基酸序列IVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA(SEQ ID NO:12)。
75.根据权利要求61至73中任一项所述的方法，其中编码所述MHC分子的所述跨膜和胞质结构域的所述至少一部分的所述多核苷酸序列包含序列AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCC(SEQ ID NO:10)。
76.根据权利要求61至75中任一项所述的方法，其中所述AES mRNA的所述3'非翻译区包含序列CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC(SEQ IDNO:15)。
77.根据权利要求61至76中任一项所述的方法，其中所述线粒体编码的12S RNA的所述非编码RNA包含序列CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCG(SEQ ID NO:17)。
78.根据权利要求61至77中任一项所述的方法，其中所述3'UTR包含序列CUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:13)。
79.根据权利要求61至78中任一项所述的方法，其中所述poly(A)序列包含120个腺嘌呤核苷酸。
80.根据权利要求53所述的方法，其中所述RNA包含RNA分子，所述RNA分子在所述5'→3'方向上包含：
多核苷酸序列
GGCGAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGAGAGUGAUGGCCCCCAGAACCCUGAUCCUGCUGCUGUCUGGCGCCCUGGCCCUGACAGAGACAUGGGCCGGAAGC(SEQ ID NO:1)；
编码由存在于所述肿瘤样本中的癌症特异性体细胞突变产生的所述一个或多个新表位的多核苷酸序列；以及
多核苷酸序列
AUCGUGGGAAUUGUGGCAGGACUGGCAGUGCUGGCCGUGGUGGUGAUCGGAGCCGUGGUGGCUACCGUGAUGUGCAGACGGAAGUCCAGCGGAGGCAAGGGCGGCAGCUACAGCCAGGCCGCCAGCUCUGAUAGCGCCCAGGGCAGCGACGUGUCACUGACAGCCUAGUAACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGCCGCGUCGCU(SEQ ID NO:2)。
81.一种用于使用蠕动泵来输送药物组合物的方法，所述方法包括：
使用至少一个蠕动泵头，以第一流速从第一容器穿过第一管部分泵送第一组合物；
使用至少一个蠕动泵，以第二流速从第二容器穿过第二管部分泵送第二组合物；以及
使用流体连接至所述第一管部分并且流体连接至所述第二管部分的阻尼器，阻尼在所述第一管部分中的所述第一组合物的流体流动中的脉冲并且阻尼在所述第二管部分中的所述第二组合物的流体流动中的脉冲，其中所述第一管部分中在所述阻尼器之后的所述第一流速的流速脉动水平(LoP)小于10，并且所述第二管部分中在所述阻尼器之后的所述第二流速的流速脉动水平(LoP)小于10。
82.一种用于制造包含核酸和一种或多种脂质的药物组合物的方法，所述方法包括：
使用至少一个蠕动泵头，以第一流速从第一容器穿过第一管部分泵送包含核酸的第一组合物；
使用至少一个蠕动泵头，以第二流速从第二容器穿过第二管部分泵送包含一种或多种脂质的第二组合物；
使用流体连接至所述第一管部分并且流体连接至所述第二管部分的阻尼器，阻尼在所述第一管部分中的所述第一组合物的流体流动中的脉冲并且阻尼在所述第二管部分中的所述第二组合物的流体流动中的脉冲；
在流体连接至所述第一管部分和所述第二管部分的混合器中，将来自所述第一管部分的包含所述核酸的所述第一组合物与来自所述第二管部分的包含所述一种或多种脂质的所述第二组合物混合；以及
将包含所述核酸和所述一种或多种脂质的组合物沉积至流体连接至所述混合物的容器中。
83.根据权利要求1至82中任一项所述的管套件、系统或方法，其中所述第一管部分和所述第二管部分配置为连接至同一蠕动泵的泵头。
84.根据权利要求1至83中任一项所述的管套件、系统或方法，其中所述第一管部分、所述第二管部分、所述阻尼器、所述混合器和/或所述混合物容器由一次性使用的材料制成。
85.根据权利要求1至84中任一项所述的管套件、系统或方法，其进一步包括：所述管套件或系统为无菌的、封闭的管套件或系统；或所述方法在无菌的、封闭的系统中执行。
86.一种用于形成混合物的管套件，所述管套件包括：
第一管部分，其配置为流体连接至含有第一组合物的第一容器；
第二管部分，其配置为流体连接至含有第二组合物的第二容器；
管阻尼器，其包括流体连接至所述第一管部分和所述第二管部分的封闭体积的流体；
混合器，其流体连接至在流体阻尼器的下游的所述第一管部分和所述第二管部分，并且配置为将来自所述第一管部分的所述第一组合物与来自所述第二管部分的所述第二组合物混合；
混合物容器，其流体连接至所述混合器，并且配置为从所述混合器收集经混合的第一组合物和第二组合物，
其中所述第一管部分配置为连接至在所述管阻尼器的上游的第一蠕动泵头，以用于将所述第一组合物从所述第一容器泵送至所述混合物容器，并且所述第二管部分配置为连接至在所述管阻尼器的上游的第二蠕动泵头，以用于将所述第二组合物从所述第二容器泵送至所述混合物容器。
87.一种用于形成药物组合物或药物组合物的混合物的系统，所述系统包括：
第一容器，其含有第一药物组合物；
第二容器，其含有第二药物组合物；
第一管部分，其流体连接至所述第一容器；
第二管部分，其流体连接至所述第二容器；
蠕动泵，其包括：第一蠕动泵头，所述第一蠕动泵头连接至所述第一管部分，以用于从所述第一容器泵送所述第一药物组合物；
以及第二蠕动泵头，所述第二蠕动泵头连接至所述第二管部分，以用于从所述第二容器泵送所述第二药物组合物；
管阻尼器，其包括流体连接至在所述蠕动泵的下游的所述第一管部分和所述第二管部分的封闭体积的流体；
混合器，其流体连接至在流体阻尼器的下游的所述第一管部分和所述第二管部分，并且配置为将来自所述第一管部分的所述第一药物组合物与来自所述第二管部分的所述第二药物组合物混合；以及
混合物容器，其流体连接至所述混合器，并且配置为从所述混合器收集经混合的第一药物组合物与第二药物组合物。
88.一种用于使用蠕动泵来输送药物组合物的方法，所述方法包括：
使用第一蠕动泵头，从第一容器穿过第一管部分泵送第一组合物；
使用第二蠕动泵头，从第二容器穿过第二管部分泵送第二组合物；以及
使用包括流体连接至所述第一管部分和所述第二管部分的封闭体积的流体的管阻尼器，阻尼在所述第一蠕动泵头下游的所述第一管部分中的所述第一组合物的流体流动中的脉冲并且阻尼在所述第二蠕动泵头下游的所述第二管部分中的所述第二组合物的流体流动中的脉冲；
在流体连接至在所述流体阻尼器下游的所述第一管部分和所述第二管部分的混合器中，将来自所述第一管部分的所述第一组合物与来自所述第二管部分的所述第二组合物混合；以及
将包含经混合的第一组合物与第二组合物的组合物沉积至流体连接至所述混合器的容器中。
89.一种用于形成混合物的管套件，所述管套件包括：
第一管部分，其配置为流体连接至含有第一组合物的容器；
第二管部分，其配置为流体连接至含有第二组合物的容器；
第一阻尼器，其流体连接至所述第一管部分；
第二阻尼器，其流体连接至所述第二管部分；
混合器，其用于将来自所述第一管部分的所述第一组合物与来自所述第二管部分的所述第二组合物混合；
混合物容器，其用于从所述混合器收集经混合的第一组合物和第二组合物，
其中所述第一管部分配置为连接至至少一个蠕动泵头，以用于将所述第一组合物从含有所述第一组合物的所述容器泵送至所述混合物容器，并且所述第二管部分配置为连接至至少一个蠕动泵头，以用于将所述第二组合物从含有所述第二组合物的所述容器泵送至所述混合物容器。
90.根据权利要求89所述的管套件，其中所述第一阻尼器和/或第二阻尼器包括封闭体积的流体。
91.根据权利要求90所述的管套件，其中所述流体为空气。
92.根据权利要求89至91中任一项所述的管套件，其中所述第一阻尼器和/或第二阻尼器为管阻尼器。
93.根据权利要求89所述的管套件，其中所述阻尼器包括柔性膜。
94.根据权利要求89至93中任一项所述的管套件，其进一步包括将所述第一阻尼器、所述第一管部分和第一管混合器输入部分流体连接的第一三通连接器，其中所述第一管混合器输入部分流体连接至所述混合器。
95.根据权利要求94所述的管套件，其进一步包括将所述第二阻尼器、所述第二管部分和第二管混合器输入部分流体连接的第二三通连接器，其中所述第二管混合器输入部分流体连接至所述混合器。
96.根据权利要求89至95中任一项所述的管套件，其中所述第一管部分包括第一管区段和第二管区段，其中所述第一管区段和所述第二管区段并行地流体连接。
97.根据权利要求96所述的管套件，其中所述第一管区段配置为连接至第一蠕动泵头，并且所述第二管区段配置为连接至第二蠕动泵头。
98.根据权利要求89至97中任一项所述的管套件，其中所述第二管部分包括第三管区段和第四管区段，其中第三管部分和第四管部分并行地流体连接。
99.根据权利要求98所述的管套件，其中所述第三管区段配置为连接至第三蠕动泵头，并且所述第四管区段配置为连接至第四蠕动泵头。
100.根据权利要求89至99中任一项所述的管套件，其中所述混合器包括流体连接至所述第一管部分的输入端、流体连接至所述第二管部分的输入端，以及流体连接至所述混合物容器的输出端。
101.根据权利要求89至100中任一项所述的管套件，其中所述混合器包括Y形连接器、螺旋混合器或静态混合器。
102.根据权利要求89至101中任一项所述的管套件，其进一步包括第一阻尼器连接器和第二阻尼器连接器，所述第一阻尼器连接器将所述第一管部分流体连接至所述第一阻尼器并且流体连接至所述混合器，并且所述第二阻尼器连接器将所述管的所述第二部分流体连接至所述第二阻尼器并且流体连接至所述混合器。
103.根据权利要求89至102中任一项所述的管套件，其中所述混合物容器为袋子、器皿或瓶子。
104.一种用于流体泵的脉动阻尼器，其包括：
生物处理袋，其包括流体入口和流体出口，其中所述流体入口配置为流体连接至流体泵的下游；
外壳，其配置为容纳生物处理袋，其中所述外壳包括基底和多个侧壁，所述基底和多个侧壁形成用于所述生物处理袋的空腔，并且至少一个侧壁包括一个或多个缺口，所述一个或多个缺口配置为提供通向所述生物处理袋的所述流体入口和流体出口的通路；以及
外壳盖，其配置为附接至所述多个侧壁并且闭合所述外壳。
105.根据权利要求104所述的脉动阻尼器，其中所述生物处理袋包括气体入口，其中所述气体入口配置为流体连接至气体源。
106.根据权利要求105所述的脉动阻尼器，其中所述一个或多个缺口配置为提供通向所述生物处理袋的所述气体入口的通路。
107.根据权利要求104至106中任一项所述的脉动阻尼器，其中外壳的所述基底包括窗口。
108.根据权利要求107所述的脉动阻尼器，其中所述窗口包括在所述外壳的所述基底中的开口或在所述外壳的所述基底中的透明材料。
109.根据权利要求104至109中任一项所述的脉动阻尼器，其中所述外壳盖包括窗口。
110.根据权利要求109所述的脉动阻尼器，其中所述窗口包括在所述外壳盖中的开口或在所述外壳盖中的透明材料。
111.根据权利要求104至110中任一项所述的脉动阻尼器，其进一步包括配置为连接至所述外壳的至少一个侧壁和/或所述外壳盖的前板，其中所述前板包括配置为容纳所述流体入口和流体出口的至少一个孔。
112.根据权利要求104至111中任一项所述的脉动阻尼器，其中所述流体泵为循环泵。
113.根据权利要求112所述的脉动阻尼器，其中所述循环泵为蠕动泵。
114.根据权利要求104至113中任一项所述的脉动阻尼器，其中所述流体出口配置为流体连接至流体储存容器。
115.根据权利要求104至114中任一项所述的脉动阻尼器，其中所述流体出口包括止回阀。
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