ES2325977T3 - Fibrillas de colageno obtenidas por biotecnologia. - Google Patents
Fibrillas de colageno obtenidas por biotecnologia. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2325977T3 ES2325977T3 ES00967071T ES00967071T ES2325977T3 ES 2325977 T3 ES2325977 T3 ES 2325977T3 ES 00967071 T ES00967071 T ES 00967071T ES 00967071 T ES00967071 T ES 00967071T ES 2325977 T3 ES2325977 T3 ES 2325977T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- collagen
- chains
- solution
- agent
- coagulation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/24—Collagen
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Prostheses (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Un método para producir cadenas que comprende: (a) extruir de forma continua un material a través de un primer orificio en un entorno gaseoso para formar pequeñas gotas, (b) extruir las gotas a través de un segundo orificio para alargar las gotas formando cadenas, y (c) depositar las cadenas en un agente de coagulación que solidifica el material en esa forma, donde el material se selecciona entre el grupo consistente en colágeno, ácido hialurónico, mezclas de colágeno y ácido hialurónico, ácido poliglicólico y ácido poliláctico.
Description
Fibrillas de colágeno obtenidas por
biotecnología.
La invención se refiere a una clase de
composiciones de fibras o cadenas en suspensión, incluyendo métodos
y aparatos para producir dichas composiciones. Las composiciones
pueden procesarse adicionalmente para formar pastas viscoelásticas
o sólidos porosos. Las composiciones preferidas de la invención
comprenden materiales obtenidos biológicamente o materiales
compatibles biológicamente, tales como colágeno que puede inyectarse
o implantarse para aumentar o reparar tejidos.
El colágeno es la principal proteína estructural
del cuerpo y constituye aproximadamente un tercio de la proteína
corporal total. Constituye la mayor parte de la materia orgánica de
la piel, los tendones, los huesos y los dientes y aparece como
inclusiones fibrosas en la mayoría de las otras estructuras
corporales. Algunas de las propiedades del colágeno son su alta
resistencia a la tracción; su alta capacidad de intercambio iónico,
debida en parte a la unión de electrólitos, metabolitos y fármacos;
su baja antigenicidad, debido al enmascaramiento de los posibles
determinantes antigénicos por la estructura helicoidal, y su baja
extensibilidad, semipermeabilidad y solubilidad. Además, el
colágeno es una sustancia natural para la adhesión celular. Estas
propiedades hacen que esta proteína sea adecuada para la
fabricación de productos de investigación
bio-remodelables y dispositivos médicos tales como
prótesis implantables, sustratos de crecimiento celular y
construcciones de tejidos celulares y acelulares.
Las composiciones de colágeno típicamente se
preparan a partir de piel o tendones por dispersión, digestión o
disolución, o una combinación de las mismas, del colágeno tisular
nativo. La dispersión implica la cizalla mecánica del tejido para
producir una suspensión de fibras de colágeno. La digestión implica
la degradación enzimática de las partes telopeptídicas no
helicoidales de la molécula de colágeno, dando como resultado una
solución de colágeno atelopeptídico. La disolución implica la
escisión de entrecruzamientos lábiles a ácidos en fibras de
colágeno formadas recientemente que tiene como resultado una
solución de monómeros y de polímeros de colágeno usando
procedimientos que implican extracción ácida o enzimática. La
extracción enzimática es preferible en muchos casos porque su
metodología produce un mayor rendimiento y un colágeno de mayor
pureza. Sin embargo, la extracción enzimática tiene el
inconveniente de que produce colágeno parcialmente degradado, es
decir, las enzimas de extracción escinden la molécula de colágeno en
las regiones terminales no helicoidales que contienen los
entrecruzamientos intermoleculares. Un método previo descrito, por
ejemplo, en el documento WO 9640216 se refiere a una extrusión
discontinua de colágeno que requiere medios mecánicos para regular
la producción de cantidades crecientes de
colágeno.
colágeno.
En la técnica se han usado formulaciones
inyectables como composiciones para aumentar el volumen de tejidos,
particularmente en urología y cirugía plástica. Después de la
implantación en un paciente, sin embargo, la persistencia del
volumen de los implantes previos se reduce debido en parte a la
absorción del vehículo acuoso por el cuerpo y debido en parte a la
baja concentración del colágeno. Normalmente se requieren
inyecciones de seguimiento o de "retoque" en el sitio con
composiciones de colágeno creadas previamente porque el volumen se
reduce debido a la absorción del componente líquido de la
composición por el cuerpo. Por lo tanto, se desea la persistencia
del volumen y la persistencia de la forma de un implante de colágeno
inyectable. Las mayores concentraciones de colágeno ayudan a
mantener la persistencia del volumen, pero al mismo tiempo reducen
la extruibilidad y la intruibilidad de la composición a través de
la aguja y al interior del tejido del paciente.
Aparte de la persistencia del volumen, se desea
la persistencia de la forma de las composiciones de colágeno
inyectables conocidas en la técnica. Cuando se inyecta, el colágeno
tiende a migrar a través del tejido; por lo tanto, si se requiere
un aumento o expansión específica y local del tejido, esta migración
necesitaría inyecciones posteriores.
La presente invención describe una composición
de colágeno en forma de fibras de colágeno obtenidas por
biotecnología, métodos y aparatos para fabricar fibras de colágeno
obtenidas por biotecnología y su uso como una composición de
colágeno inyectable que supera los inconvenientes de las
composiciones de colágeno inyectables conocidas en la técnica.
También se describen otras realizaciones preferidas dirigidas a
fibras de colágeno obtenidas por biotecnología transformadas en un
sustrato de matriz para el cultivo celular y a una composición que
comprende fibras compactadas para implantación quirúrgica.
La invención proporciona fibras de colágeno
obtenidas por biotecnología y composiciones de colágeno inyectables
que comprenden fibras de colágeno obtenidas por biotecnología y
aparatos y métodos para fabricar y usar dichas fibras de colágeno
obtenidas por biotecnología.
La presente invención proporciona composiciones
de colágeno inyectables que tienen mejores propiedades que
composiciones de colágeno inyectables conocidas en la técnica.
Las composiciones de colágeno inyectables
preferidas preparadas de acuerdo con la presente invención tienen
una alta concentración de colágeno. Las composiciones inyectables
son útiles para aumentar tejidos, reparar tejidos y para
administrar fármacos. Las composiciones de fibras de colágeno
obtenidas por biotecnología pueden usarse para fabricar un sustrato
de matriz para el cultivo de células o una matriz compactada sólida
de fibras para implantación. Las composiciones de fibras de
colágeno obtenidas por biotecnología tienen mejores características
para el bio-remodelamiento que otras composiciones
conocidas.
La Figura 1 es una representación esquemática de
un aparato para uso en los métodos para producir cadenas de
colágeno reconstituidas.
La Figura 2 es un dibujo de la realización
preferida del puente de aguja usado para administrar colágeno
axialmente en el centro de una corriente de PEG que fluye en un
sistema cerrado.
La Figura 3 es una representación esquemática de
un aparato de ensayo de infiltración unidimensional usado para
determinar la permeabilidad de formulaciones de fibras de colágeno
obtenidas por biotecnología.
La Figura 4 representa los valores de
permeabilidad para diferentes formulaciones a diferentes
concentraciones.
La Figura 5 es una representación esquemática
del dispositivo de carga de compresión reducido axisimétrico usado
para determinar la respuesta de plastodeformación de formulaciones
de fibras de colágeno obtenidas por biotecnología en
compresión.
La Figura 6 muestra gráficos representativos de
la respuesta de carga sobre composiciones de fibras de colágeno
obtenidas por biotecnología. La Figura 6a muestra la baja respuesta
de plastodeformación a la carga; la 6b la alta respuesta de
plastodeformación a la carga de fibras de colágeno obtenidas por
biotecnología compactadas y la 6c la respuesta de recuperación de
fibras de colágeno obtenidas por biotecnología después de la
compresión.
La Figura 7 muestra la compactación a corto
plazo de dos formulaciones de fibras de colágeno obtenidas por
biotecnología en implantes subcutáneos en oreja de conejo.
La Figura 8 demuestra la persistencia de la
altura del implante subcutáneo en oreja de conejo durante 330 días
para fibras de colágeno obtenidas por biotecnología de cadena larga
y ancha y para fibras de colágeno obtenidas por biotecnología de
cadena corta y delgada.
La Figura 9 demuestra la persistencia de la
altura del implante subcutáneo en oreja de conejo durante 84 días
para fibras de colágeno obtenidas por biotecnología fabricadas
usando colágeno Vitrogen 100.
La invención se refiere a fibras o cadenas
formadas a partir de materiales viscosos o viscoelásticos, a métodos
para la producción de dichas fibras o cadenas formadas a partir de
materiales viscosos o viscoelásticos, a composiciones formadas con
dichas fibras y a usos de los mismos.
No hay limitaciones en los materiales de partida
que se usan para producir las cadenas con la excepción de que sean
extruibles y puedan inducirse para que se vuelvan suficientemente
sólidos por algún medio después de la extrusión en un agente de
coagulación para que se mantenga la forma de la cadena extruida. El
método para producir la composición de la invención comprende un
medio para extruir un material a través de un orificio dentro de un
agente de coagulación para formar cadenas a partir del material; un
medio de filtración para retirar las cadenas del agente de
coagulación; y, opcionalmente, un medio de concentración para
concentrar las cadenas producidas. El método para producir estas
cadenas se puede repetir y aumentar a escala, y puede realizarse en
un sistema cerrado para mantener condiciones de procesamiento
asépticas.
En el método de la invención, el material se
pasa a través y se reforma por un orificio que determina la
dimensión y la forma de las cadenas producidas. El tamaño y la
forma del orificio pueden cambiarse para alterar la forma de las
cadenas. Después de la extrusión del material desde el orificio, el
material entra en contacto con un agente de coagulación que hace
que el material solidifique, o al menos se convierta en un material
parcialmente sólido en comparación con su estado previo a la puesta
en contacto con el agente. Preferiblemente, el agente de
coagulación y el material extruido generalmente son inmiscibles. Hay
dos estrategias fundamentales para la producción por extrusión de
las cadenas de la presente invención: un método de extrusión de una
sola etapa y un método de extrusión de dos etapas.
En el método de extrusión de una etapa, el
material se extruye desde un orificio sumergido en una corriente de
un agente de coagulación que fluye, de forma que se produce una
separación por el líquido de la corriente extruida. En otras
palabras, el material se introduce desde el orificio, extendiéndose
desde el mismo una longitud, hasta que las fuerzas de cizallamiento
del agente de coagulación que fluye a su alrededor hacen que la
cadena se rompa en un punto próximo a la abertura del orificio que
está en contacto con la corriente. La longitud de la cadena que se
está formando en el punto de separación por el líquido puede
modularse variando los diferentes caudales y las características de
flujo del material y del agente de coagulación para variar la
longitud y forma resultantes de la cadena. El especialista en la
técnica puede determinar y realizar alteraciones en las
configuraciones de producción manipulando uno cualquiera o más de
los parámetros mencionados anteriormente en este proceso para
producir el material de cadena de la invención. El proceso
preferiblemente se realiza cuando las propiedades del material
extruido producen un tamaño y forma transversal similares a los del
orificio de extrusión. La coagulación o solidificación del material
extruido tiene lugar en esa forma de cadena, de manera que su forma
se mantiene cuando se lleva aguas abajo en el agente de
coagulación.
En el método de extrusión de dos etapas, el
material primero se extruye en un entorno gaseoso para formar
pequeñas gotas de material debido a la tensión superficial del
material. El tamaño de las gotas se determina y se controla por el
tamaño del orificio, el flujo de gas de cizallamiento, las
perturbaciones del flujo u otros métodos disponibles para los
especialistas en la técnica. Mientras las gotas del material aún se
están solidificando, pasan a través de un segundo orificio al
interior del agente de coagulación para crear la forma de la
cadena. En esa forma se completa la coagulación y la forma de la
cadena queda retenida en la forma de cadena final. Después de que
el agente de coagulación ha actuado sobre el material de partida
extruido para formar la cadena, la cadena formada se filtra para
separarse del agente de coagulación.
En el método de producción generalmente es
deseable la filtración de las cadenas formadas del agente de
coagulación para recoger las cadenas formadas durante la
producción. Los medios de filtración incluyen, pero sin limitación:
técnicas y aparatos de macrofiltración convencionales tales como
filtración de vacío en lecho plano, filtración en línea
("dead-end"), y por otras técnicas conocidas en
el campo de la filtración. En el método de una etapa, donde se usan
altos caudales de tampón de coagulación para efectuar la formación
por cizallamiento de la forma de la cadena, un medio de filtración
preferido es la filtración de flujo tangencial continua. En el
proceso de dos etapas, el cizallamiento se consigue por el flujo de
gas o por la velocidad de extrusión sola, por lo tanto pueden
emplearse filtración de flujo tangencial continua u otros métodos de
filtración. La filtración de flujo tangencial requiere el bombeo
continuo del material de cadena dentro del agente de coagulación a
través de la perforación del filtro en el ciclo de filtración para
evitar la formación de bloques y la obstrucción del filtro. Como
las cadenas de esta invención generalmente son sensibles al
cizallamiento y se enredarían fácilmente en el equipo de bombeo y
las válvulas convencionales, el método incluye una técnica de
filtración eficaz para filtrar el agente de coagulación y separarlo
de las cadenas usando presión hidrostática como fuerza directora y
una única configuración de válvula para permitir un flujo
prácticamente continuo del agente de coagulación. Esta técnica no
es la única manera de realizar la filtración, pero es el método de
filtración preferido para uso en el método de producción de la
invención.
Después de haber completado la producción y
filtración de una cantidad de cadenas, se recogen o concentran para
formar composiciones de pasta u otros materiales. En la etapa de
concentración puede emplearse uno cualquiera o varios medios,
técnicas y aparatos de concentración tales como: centrifugación,
filtración en lecho plano, sedimentación por gravedad u otras
técnicas conocidas en el campo de la concentración. En algunos
casos, puede ser deseable usar más de un método de concentración en
un proceso de concentración de múltiples etapas. En el método
preferido se usa un segundo esquema de filtración de flujo
tangencial para proporcionar concentraciones uniformes y un
procesamiento continuo aséptico adyacente al ciclo de
producción.
En una realización más preferida, las cadenas
formadas a partir de las soluciones de colágeno son fibras de
colágeno obtenidas por biotecnología que tienen una forma alargada y
sustancialmente cilíndrica. En un método más preferido, la
invención se refiere a un método para producir composiciones de
fibras de colágeno para uso en medicina y cirugía. El método de la
invención es particularmente adaptable para producir composiciones
que comprenden cadenas de biomaterial que comprende componentes de
matriz extracelular tales como colágeno o ácido hialurónico o
mezclas de los mismos y para materiales biocompatibles tales como
ácido poliglicólico (PGA) o ácido poliláctico (PLA). Como el
colágeno es el material de partida más preferido para la producción
de cadenas extruidas, el método descrito más adelante es el método
preferido para producir cadenas de colágeno a partir de una
solución que comprende colágeno. En el método más preferido de la
invención, se emplea un sistema de flujo cerrado para facilitar la
producción aséptica de las cadenas de colágeno.
En el método más preferido, se preparan cadenas
de colágeno por el método que comprende: extruir una solución que
contiene colágeno en un agente de coagulación que comprende un
agente de deshidratación o un agente de neutralización del pH, o
ambos; dejar o inducir al colágeno extruido para que forme una
cadena o segmento unitario discreto que tiene una forma alargada y
algo cilíndrica; dejar o inducir al colágeno para que se deshidrate
o neutralice para solidificarse de manera que forme una cadena; y
recoger las cadenas formadas del agente de coagulación usando un
medio de filtración.
En un método incluso más preferido, se dispensa
una solución ácida de colágeno desde un depósito de contención
usando un medio de bombeo de fluido a través de un orificio
dispuesto y sumergido en el flujo de un agente de coagulación para
que entre en contacto la solución de colágeno con el agente de
coagulación. El colágeno se extruye a tal velocidad que se produce
una masa continua de colágeno, que se extiende y se alarga desde el
orificio y después se rompe o se separa del orificio por el flujo
del coagulante para producir un segmento unitario discreto o una
masa de colágeno. Cuando se produce el contacto con el agente de
coagulación, la solución ácida de colágeno se neutraliza o
experimenta algún grado de deshidratación, o ambas cosas, haciendo
que las moléculas de colágeno solubilizadas precipiten y se vuelvan
fibrilares dentro de una cadena de colágeno unitaria cohesiva. Por
medio de la precipitación y la formación de fibrillas, el colágeno
solidifica volviéndose una cadena sólida viscoelástica deshidratada
de colágeno, una fibra de colágeno obtenida por biotecnología.
Después de haberse cortado la cadena del orificio y de que se ha
llevado por el agente de coagulación que fluye, la cadena de
colágeno continúa formándose y solidificándose hasta que se recoge
por el aparato de filtración y se aclara para retirar el agente de
coagulación. El método para reducir las cadenas a un producto útil
final incluye la concentración de las cadenas de colágeno, pero
cualquier método de concentración preferido depende finalmente de
las cualidades deseadas del material en su forma final. El producto
final puede parecerse a una pasta o el material puede procesarse
adicionalmente en una forma sólida para producir otras
construcciones útiles. En algunos métodos preferidos, las cadenas
pueden liofilizarse, es decir, secarse por congelación para retirar
el agua de la composición de la cadena, antes o después de cualquier
grado de concentración. En otros métodos preferidos, las cadenas de
colágeno se compactan para eliminar el exceso de líquido de las
cadenas para producir una matriz de colágeno fibrilar densa.
Las fibras de colágeno obtenidas por
biotecnología después pueden esterilizarse terminalmente usando
medios conocidos en la técnica de la esterilización de dispositivos
médicos. Un método preferido para la esterilización es poner en
contacto las fibras con ácido peracético (PA) al 0,1% estéril
neutralizado con una cantidad suficiente de hidróxido sódico (NaOH)
10 N, de acuerdo con la Patente de Estados Unidos Nº 5.460.962, cuya
descripción se incorpora en la presente memoria como referencia. En
el ciclo de concentración se realiza descontaminación, en un ciclo
de esterilización integrado con el aparato, o en un recipiente
separado durante un período de hasta aproximadamente 24 horas. Las
fibras después se aclaran poniéndolas en contacto con tres volúmenes
de agua estéril durante 10 minutos en cada lavado. Otro medio de
esterilización preferido es por irradiación gamma. Las cadenas de
colágeno se empaquetan en jeringas, bolsas u otros recipientes
hechos de un material adecuado para la irradiación gamma entre 25,0
y 35,0 kGy. Otro medio de esterilización preferido es la
esterilización con haces de electrones o esterilización
"e-beam" donde el producto de cadenas de
colágeno se somete a un haz de electrones para inactivar cualquier
microorganismo presente.
El colágeno para uso en la presente invención
puede obtenerse a partir de cualquier fuente adecuada, típicamente
piel y tendones. Los especialistas en la técnica conocen muchos
procedimientos para obtener y purificar colágeno que implican
típicamente extracción ácida o enzimática, y pueden usarse para
preparar colágeno para uso en la presente invención. El colágeno
obtenido usando métodos de extracción ácida es más preferible que el
obtenido con los métodos de extracción enzimática tales como los
métodos de extracción con pepsina, ya que cuando se usan los
métodos de extracción ácida se mantienen en la molécula de colágeno
las regiones telopeptídicas no helicoidales. Aunque no se desea
limitación por ninguna teoría, se cree que las regiones
telopeptídicas juegan un papel integral en la fibrilogénesis del
colágeno y es deseable la naturaleza fibrilar de la composición de
colágeno de la invención. Una composición de colágeno preferida para
uso en la presente invención es el colágeno de tendón bovino
extraído con ácido descrito en la Patente de Estados Unidos Nº
5.106.949, incorporada en este documento como referencia. Sin
embargo, puede ser deseable colágeno atelopeptídico debido a su
menor antigenicidad y su uso extendido en ciertas técnicas médicas.
Las soluciones de colágeno que comprenden colágeno para fabricar
segmentos de cadena de colágeno por los métodos descritos en la
presente memoria generalmente están a una concentración comprendida
preferiblemente entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 10
mg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 2 mg/ml a
aproximadamente 6 mg/ml, y más preferiblemente de aproximadamente
4,5 a aproximadamente 5,5 mg/ml para el colágeno telopeptídico y
entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 4,0 mg/ml, más
preferiblemente entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3,5
mg/ml para el colágeno atelopeptídico. El pH preferido para la
solución de colágeno es un pH de aproximadamente 2 a aproximadamente
4. Un disolvente preferido para el colágeno es ácido acético
diluido en agua a aproximadamente 0,05%-aproximadamente 0,1%, más
preferiblemente a aproximadamente 0,05%, pH 3,5. Otros disolventes
ácidos diluidos que pueden usarse son ácido clorhídrico, ácido
cítrico y ácido fórmico. Otra solución de colágeno preferida es
Vitrogen 100 (obtenida en Collagen Corp.), una solución purificada
de 3 mg/ml de colágeno de dermis bovina atelopeptídico solubilizado
con pepsina disuelto en HCl 0,012 N (pH 2,0). En el colágeno
atelopeptídico, los extremos no helicoidales no están completamente
intactos y como resultado hay menos fibrillas con bandas
transversales de forma nativa en la formulación de colágeno
descrita en la presente memoria. La solución de colágeno puede
contener opcionalmente sustancias tales como agentes farmacéuticos;
factores de crecimiento; hormonas; otros componentes de la matriz
extracelular; otros tipos de colágeno; o material genético tal como
vectores u otras construcciones genéticas, u oligonucleótidos
antisentido, o similares, incluidos en la solución. Cuando se forman
segmentos de fibras de colágeno con estas sustancias en la solución
de colágeno, estas sustancias se incorporarán en los segmentos. La
presencia de estos componentes en las fibras de colágeno cuando se
implanten, hará que se emitan señales a las células del paciente
para que infiltren el área de implante a la velocidad de
infiltración preferida o que las células del paciente se
transformen con los vectores de forma que las células sinteticen
agentes terapéuticos para ayudar a la curación o integración del
implante el sitio del implante.
El agente de coagulación es un agente capaz de
solidificar el material extruido en tal grado que se mantenga la
forma de la cadena. Un agente de coagulación, o coagulante,
preferido debe ser inmiscible con la solución de colágeno y debe
ser capaz de eliminar el agua de la solución de colágeno de forma
que la solución de colágeno se transforme en una masa semisólida
concentrada que tiene una forma predeterminada por el orificio.
Cuando el colágeno se concentra, se vuelve más sólido y, a nivel
molecular, las moléculas de colágeno se ponen muy próximas entre sí
para que se produzca la fibrilogénesis. Un agente de coagulación
preferido comprende un agente de deshidratación que tiene mayor
presión osmótica que la de la solución de colágeno, preferiblemente
al menos aproximadamente 250 mOsm y un pH preferido de
aproximadamente 5 a aproximadamente 10, y un pH más preferido de
aproximadamente 7 a aproximadamente 9. El pH del agente de
coagulación se mantiene usando un agente tamponante tal como tampón
fosfato, tampón borato o tampón citrato. Un agente tamponante
preferido es uno que promueve la fibrilogénesis de moléculas de
colágeno para que se produzcan cadenas de colágeno fibrilares. El
agente tamponante más preferido es tampón fosfato. Los agentes de
deshidratación preferidos incluyen polímeros biocompatibles neutros
hidrosolubles tales como DEXTRAN® y polietilenglicol (PEG). Otros
agentes de deshidratación preferidos son alcohol isopropílico y
acetona. En la realización más preferida, se usa polietilenglicol al
20% p/v, PM 8000 (PEG-8000) en tampón fosfato. Las
composiciones de polietilenglicol están disponibles en un intervalo
de pesos moleculares y pueden usarse a concentraciones variables
para obtener la composición de la invención.
Sólo con el fin de ilustrar realizaciones
preferidas de la invención y no para limitarla, el aparato de la
presente invención se ilustrará describiendo la preparación de
cadenas de colágeno. La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de
una forma de un aparato que puede usarse para producir fibras de
colágeno obtenidas por biotecnología de acuerdo con la presente
invención. El aparato para la producción de cadenas de colágeno
comprende un elemento de producción y un elemento de filtración, y
puede comprender opcionalmente un elemento de concentración. Estos
elementos son circuitos o ciclos que pueden ensamblarse para formar
un sistema de producción cerrado para proporcionar un procesamiento
aséptico de la composición de cadena.
El proceso empieza en el ciclo de producción del
aparato. Los recipientes de depósito 33, 34, 25 y 43 se rellenan
con un agente de coagulación que comprende 20% (p/p) de PEG 8000 en
agua con tampones fosfato en el orificio de entrada 5, con una
bomba peristáltica 51, a través de un filtro 52. Una solución de
colágeno de 5 mg/ml se almacena a 4ºC en un refrigerador 17. Ésta
se bombea desde el depósito de colágeno 11, por medio de una bomba
peristáltica 13, controlada por el peso 12. Se desplaza a través del
tubo 93 de tamaño 16, a través del regulador de colágeno 14, y una
válvula de seguridad 15, donde se extruye a través de la aguja 16,
en el puente de aguja 21 donde el colágeno entra en el PEG
circulante.
La cadena de colágeno sale y se extiende desde
el orificio de la aguja y finalmente se separa del orificio a una
longitud predeterminada por la fuerza de cizallamiento establecida
por la velocidad del PEG circulante, y se desplaza a lo largo de
una longitud de aproximadamente 8 pies (2,44 m) de tubo 92 de tamaño
17, hasta la campana de muestreo. Al principio, las muestras se
cogen para asegurar que se están produciendo fibras de colágeno
producidas por biotecnología del tamaño apropiado. Mientras se
realizan los ajustes en el flujo, las fibras de colágeno obtenidas
por biotecnología se depositan en el filtro de residuos 24. Una vez
que se están produciendo las fibras de colágeno obtenidas por
biotecnología del tamaño apropiado, la corriente se desvía al
recipiente del depósito 25. Cuando se llena el recipiente del
depósito, el sensor de proximidad capacitivo 61 detecta el nivel
del fluido y activa la bomba 31, a través de un relé 63, para que
envíe las firmas formadas desde el ciclo de producción a ciclo de
filtración.
El puente de aguja 21 se detalla en la Figura 2.
En esta realización, el puente de aguja es un sistema de flujo
coaxial con colágeno que fluye en la región central y PEG que fluye
en la región anular exterior. El colágeno se introduce a través de
una aguja de calidad médica que se inserta, a través de una junta de
silicona sellada, en el centro del flujo de PEG que de otra forma
sería un flujo de Hagen-Poiseuille. Éste es el
método preferido para la introducción del colágeno en el PEG debido
a que se consigue una menor variabilidad y una mayor flexibilidad
en métodos de rotura de flujo que producen la formación de las
cadenas. Por ejemplo, los especialistas en la técnica de chorros de
líquido pueden facilitar la formación de las cadenas por vibración
axial del flujo de colágeno además o en lugar del cizallamiento por
el tampón de coagulación. Sin embargo, el colágeno puede
introducirse en el flujo en cualquier ángulo siempre que el
componente de la velocidad del colágeno en la dirección del flujo
de PEG no sea
cero.
cero.
Específicamente, el puente de aguja 21 comprende
un cuerpo 211, una placa de junta 212, un tapón de transición 213,
una junta de goma 215, juntas de anillo tórico de silicio 216, y una
aguja 230. El cuerpo 211 está hecho de policarbonato u otro
material biocompatible rígido y tiene una sección transversal con
forma de L con una primera perforación 220 que comunica los dos
extremos de mayor longitud de la L y una segunda perforación 221
que comunica con el extremo corto de la L y la luz de la primera
perforación. La aguja 230 se inserta en el puente de aguja a través
de la placa de junta 212 y la junta de goma 215 que sella la entrada
de la aguja y atraviesa el tapón de transición 213 de forma que la
punta de la aguja está aguas abajo de la unión de la primera y
segunda perforaciones y su longitud está centrada coaxialmente
dentro de la primera perforación. La aguja 230 preferiblemente es
roma pero también puede estar angulada y afilada y puede formar
otros ángulos en lugar de estar insertada y colocada central y
coaxialmente. La junta de anillo tórico 216 en el extremo aguas
abajo fija y sella la unión del tubo donde el flujo de PEG lleva las
cadenas hacia el exterior del puente de aguja en la abertura 242.
El flujo de PEG entra en el puente de aguja en la abertura, se
desplaza a través de la perforación 221, gira en la unión de la
perforación 221 y la perforación 220 y a través de la perforación
220, pasa a la aguja 230 donde el colágeno sale por el edificio de
la aguja y se corta por el flujo. El PEG que fluye lleva la fibra
de colágeno en formación hacia el exterior por la abertura 242 al
resto del ciclo de procesamiento.
A lo largo de la producción, las fibras de
colágeno obtenidas por biotecnología se transfieren al ciclo de
filtración para sacarlas del ciclo de producción. Haciendo
referencia de nuevo a la Figura 1, las fibras se bombean a un
primer depósito de filtro 32 para retirarlas del flujo de
producción. Las fibras se cambian a través del filtro 34, y un
segundo recipiente de depósito de filtro 33, por medio de presión de
aire. El aire entra a través de la válvula de orificio 75 y después
se filtra a través de un filtro 74. La válvula de presión 72 regula
el cambio de la presión desde el depósito 33 al depósito 32 y se
controla por el peso con el controlador de peso 71, y la báscula de
plataforma 35. Cuando se presuriza el depósito 32, el depósito 33 se
despresuriza a través del filtro 73. Cuando las fibras de colágeno
obtenidas por biotecnología se cambian, el PEG se recicla desde el
alojamiento de filtro 34 al depósito de PEG 43. El nivel del fluido
en el depósito de PEG 43 se controla por un sensor de proximidad
capacitivo 62 que activa el relé 64 y abre/cierra la válvula 41. El
caudal del efluente se controla por un medidor de flujo 42 y se
recoge con un registrador de datos 47. El PEG después se bombea
desde el depósito de PEG 43, con una bomba peristáltica 44, a través
de un regulador 45 y el medidor de flujo 46 y de nuevo al puente de
aguja 21.
Después de completarse la producción, las fibras
de colágeno obtenidas por biotecnología se cambian a través del
sistema de filtración durante aproximadamente 12 horas, mientras se
empapan con PEG. Después se concentran en un volumen de 1000 ml
permitiendo que el flujo de efluente continúe después de que se haya
detenido el flujo de producción. Las cadenas se aclaran con agua
estéril (WFI) hasta que el porcentaje de PEG en la composición es
menor de aproximadamente 0,02%. Usando el filtro 52 en el orificio
de entrada 5 y el filtro 2 en el orificio de salida 23 se bombean
múltiples cambios de volumen de agua estéril a través del sistema.
En este punto, las fibras de colágeno obtenidas por biotecnología
formadas pueden retirarse del sistema para uso o para un
procesamiento adicional fuera del sistema, o pueden concentrarse en
un ciclo de concentración integral al ciclo de filtración.
Las cadenas de colágeno pueden concentrarse
usando el mismo método de filtración de flujo tangencial modificado
que se emplea para la filtración. La suspensión diluida de cadenas
en agua o tampón se bombea desde el depósito de filtración hasta
pequeños cilindros de concentración. Se usa un pistón para obligar a
las cadenas a desplazarse hacia atrás y hacia adelante desde un
cilindro al otro a través de un filtro de flujo tangencial de
conexión. La liberación lenta y controlada del agua o tampón a
través del filtro provoca un aumento de concentración en las
cadenas de colágeno hasta el punto en el que la suspensión se
convierte en una composición de tipo pasta. El pistón puede
dirigirse y controlarse por presión de aire, como se describe en la
presente memoria, por medios mecánicos o por otros medios conocidos
en la técnica.
Las fibras de colágeno obtenidas por
biotecnología se vacían desde el depósito 33 a través de un tubo, en
uno o más lotes, tales como dos lotes de 400 ml, hasta un primer
depósito de concentración 81. Se cambian a través del filtro 83, y
un segundo depósito de concentración 82, por medio de presión de
aire. El aire se filtra a través de un filtro 811. Las válvulas de
presión 86 y 87 regulan el cambio de la presión desde el depósito
81 al 82 y éste se controla por el peso con el controlador del peso
82 y la báscula de plataforma 89. Cuando el aire en el depósito 81
se presuriza, el aire en el depósito 82 se despresuriza a través de
un filtro 810. El efluente se retira del alojamiento de filtro 83,
a través de un filtro 813, con una bomba peristáltica 85. Se
dispone de una bomba adicional 84 y un filtro 814 para rellenar el
alojamiento de filtro 83. Después de la concentración, las fibras
de colágeno obtenidas por biotecnología concentradas se transfieren
desde el depósito 82 y se cargan la jeringa 812.
Un método alternativo preferido para la
concentración de la composición es retirar la composición del
sistema después de la filtración y aclarado o después de la
concentración parcial a aproximadamente 10-20 mg/ml
y después secar la composición, preferiblemente por liofilización
(es decir, secado por congelación), para retirar sustancialmente
todo el agente de aclarado para obtener una composición
sustancialmente seca. Una vez que la composición se ha secado, la
masa de la composición seca se puede determinar fácilmente pesando.
Después de determinar el peso, la composición puede reconstituirse
añadiendo una cantidad específica de agente de vehículo líquido,
preferiblemente un agente de vehículo acuoso, para rehidratar la
composición para formar una composición de fibra de colágeno
reconstituida que tiene una concentración deseada. De esta manera
pueden conseguirse concentraciones de composición fuera de las
limitaciones del aparato de concentración de la invención.
En otra realización preferida, la administración
de fibras de colágeno obtenidas por biotecnología a un paciente se
realiza por inyección a través de una jeringa, donde la composición
se carga después de la filtración o concentración en una cámara de
jeringa y la composición se liofiliza o se seca mientras que está en
la cámara de jeringa. La composición seca después puede
esterilizarse terminalmente y después almacenarse de forma estéril
en la jeringa durante un período de tiempo prolongado hasta que se
necesite. Cuando se necesita, la composición seca se rehidrata
introduciendo una cantidad deseada de agente de vehículo acuoso en
la jeringa para reconstituir la composición y formar una
composición de fibra de colágeno reconstituida que tenga la
concentración deseada. Este método de concentración es el método
preferido debido a la flexibilidad en el control sobre los niveles
de concentración por los usuarios finales, permitiendo una mejor
reproducibilidad a menores concentraciones y aumentando la vida
útil del producto. Para aplicaciones biomédicas, esta realización
preferiblemente se realizaría como parte del sistema aséptico
realizado en el sistema descrito anteriormente por medio de la
unión de un colector al orificio de salida de los cilindros de
concentración.
En forma seca, la esterilización terminal puede
realizarse por los métodos disponibles convencionales incluyendo,
pero sin limitación la irradiación gamma, irradiación con haces de
electrones e irradiación ultravioleta. También puede ser deseable
reticular las cadenas de fibra de colágeno. La reticulación
proporciona resistencia a las fibras de colágeno y regula el
bio-remodelamiento del colágeno por las células del
paciente cuando se implanta en un paciente. Aunque la reticulación
puede realizarse sin aclarar las cadenas de fibra de colágeno
después de la producción, en realizaciones preferidas las cadenas de
fibra de colágeno se aclaran para retirar el coagulante antes de la
reticulación. En la Figura 1, el agente de reticulación puede
introducirse en el ciclo de producción en un orificio de entrada
5.
A partir de este material pueden fabricarse
construcciones sólidas y mallas no tejidas por la concentración
continuada desde la forma de pasta a una forma sólida. El resultado
es un sólido poroso hidratado formado a partir de fibras de
colágeno obtenidas por biotecnología. Este sólido poroso hidratado
se obtiene por compactación mecánica o moldeo por inyección usando
moldes porosos u otros métodos disponibles para los especialistas en
la técnica. Diferentes niveles de compactación producen
construcciones con diferentes propiedades mecánicas. En otra
realización preferida, las cadenas de fibras se forman a partir del
colágeno y permanecen hidratadas después del aclarado y la
concentración. Concentradas como una formulación inyectable, las
cadenas pueden variar de 10 a 100 mg/ml, más preferiblemente de 20
a 60 mg/ml y aún más preferiblemente de 30 a 40 mg/ml. Estos
niveles de concentración pueden conseguirse en la realización
preferida de los métodos de producción, filtración y concentración
y de aparato descritos anteriormente. Para las construcciones de
tejidos blandos, se requieren fibras de colágeno obtenidas por
biotecnología más concentradas. La fuerza mecánica que obliga a
salir el fluido de las fibras de colágeno obtenidas por
biotecnología crea la construcción deseada. Esto se consigue
comprimiendo las fibras de colágeno obtenidas por biotecnología en
una configuración de compresión reducida usando rodillos porosos.
Como alternativa, este resultado se conseguirá rellenando un molde
poroso con fibras de colágeno obtenidas por biotecnología. La
fuerza de inyección en el molde fuerza a salir al fluido de
vehículo a través de los poros que son demasiado pequeños para que
pasen las fibras de colágeno obtenidas por biotecnología, de forma
que las fibras quedan compactadas según se hace entrar más material
en el fluido de vehículo en el molde. Un método menos controlado,
aunque también adecuado y deseable para una geometría irregular, es
la manipulación mecánica y compresión a presión atmosférica (al aire
libre).
Las fibras de colágeno obtenidas por
biotecnología pueden reticularse con un agente de reticulación,
preferiblemente un agente de reticulación químico que conserva la
bio-remodelabilidad del material de fibras de
colágeno obtenido por biotecnología. En la técnica se conocen
diversos tipos de agentes reticulación y pueden usarse, tales como
ribosa y otros azúcares, agentes de oxidación y métodos
deshidrotérmicos (DHT). Un agente de reticulación preferido es
hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDC). En otro método preferido, se añade
sulfo-N-hidroxisuccinimida al agente
de reticulación EDC como se describe por Staros, J.V., Biochem. 21,
3950-3955, 1982.
En el método más preferido, la EDC se solubiliza
en agua a una concentración comprendida preferiblemente entre
aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 100 mM, más preferiblemente
entre aproximadamente 1,0 mM y aproximadamente 10 mM y aún más
preferiblemente a aproximadamente 1,0 mM. Además puede usarse agua,
solución salina tamponada con fosfato o un tampón (ácido
2-[N-morfolino]etanosulfónico) (MES) para
disolver el EDC. Pueden añadirse otros agentes a la solución, tales
como acetona o un alcohol, hasta 99% v/v en agua, típicamente 50%,
para que la reticulación sea más uniforme y eficaz. Estos agentes
retiran el agua de las fibras de matriz conjuntamente para promover
la reticulación. La relación entre estos agentes y el agua en el
agente reticulación puede usarse para regular la reticulación. La
solución de reticulación de EDC se prepara inmediatamente antes del
uso, ya que la EDC perderá su actividad a lo largo del tiempo. Para
poner en contacto el agente de reticulación con las fibras de
colágeno obtenidas por biotecnología, las fibras de colágeno
obtenidas por biotecnología hidratadas se sumergen en agente de
reticulación durante un período comprendido entre aproximadamente 30
minutos y aproximadamente 24 horas, más preferiblemente entre 4 y
aproximadamente 16 horas a una temperatura comprendida entre
aproximadamente 4ºC y aproximadamente 20ºC. La reticulación puede
regularse con la temperatura: a temperaturas inferiores, la
reticulación es más eficaz cuando se ralentiza la reacción; a
temperaturas superiores, la reticulación es menos eficaz cuando la
EDC es menos estable.
Independientemente del material de partida usado
en este proceso para formar las cadenas, la eliminación de la
solución de aclarado o el vehículo fluido de las cadenas permite el
enmarañamiento y entrelazado adicional de las cadenas para
proporcionar una estructura de red que es continuamente porosa. Las
propiedades del material resultante dependen de la concentración de
las cadenas y de las dimensiones de las cadenas. Sin embargo, en
todos los casos las cadenas experimentan una transición desde un
fluido a un fluido viscoelástico, hasta un sólido viscoelástico
cuando se retira el vehículo. El material final tiene las
propiedades de una matriz porosa demostrables por el comportamiento
de plastodeformación debido a una exudación adicional de fluido y a
la permeabilidad hidráulica. La capacidad de este material de
obtener diferentes características fundamentales dependiendo de la
concentración de las cadenas es el fundamento de la tecnología. Un
alto grado de concentración en tal grado que las interacciones de
las cadenas (entrelazado mecánico) sean suficientemente cohesivas
para proporcionar una estructura más parecida a un sólido puede
conseguirse de varias maneras. Algunos métodos descritos más
adelante se basan en el objetivo final para la composición.
Hay unos pocos aspectos esenciales de esta clase
de material que hacen que sea particularmente adecuado para la
implantación por inyección, construcciones de tejidos blandos y
soporte de células, o dispositivos de liberación. Este material
experimenta transiciones a diferentes niveles de estructura que se
obtienen dependiendo del grado de compactación o concentración del
material. Además, a pesar de su comportamiento parecido a un sólido
en el estado compactado, el material sigue siendo un material poroso
con sitio para que el fluido fluya a su través y entre las cadenas
de interconexión proporcionando una matriz que es accesible a la
infiltración de las células hospedadoras y que permite el
suministro de nutrientes para esas células. Estos aspectos del
material se deben a su respuesta única en el ensayo de
plastodeformación y el ensayo de infiltración unidimensional. Estos
ensayos se aplican a materiales porosos pero no a materiales
viscoelásticos convencionales y los datos demuestran que la
respuesta de este material en esos ensayos depende de la
concentración del material.
Como una composición inyectable, las fibras de
colágeno obtenidas por biotecnología proporcionan una ventaja única
debido a su estructura dependiente de la concentración. El material
puede inyectarse como un fluido en el tejido del hospedador y las
fuerzas del tejido desplazado actúan sobre las fibras de colágeno
obtenidas por biotecnología forzando al vehículo fluido a exudar
del implante, consiguiéndose de esta forma, en efecto, la
concentración de las fibras de colágeno obtenidas por biotecnología
en una matriz in situ. Hay una transición estructural que
experimentan las fibras de colágeno obtenidas por biotecnología
cuando cambian de un líquido a un sólido. El grado de compactación
y solidificación in vivo de las fibras de colágeno obtenidas
por biotecnología es una función de la permeabilidad hidráulica y de
la estructura de la red (resistencia a la compresión) de las fibras
de colágeno obtenidas por biotecnología como se ha descrito
anteriormente y las propiedades del tejido circundante.
Como una pasta inyectable o composición sólida
compactada, estas fibras de colágeno obtenidas por biotecnología
son útiles para la implantación en un paciente para la reparación o
reemplazo de tejido, aumento de tejido, liberación de células o
liberación de citoquinas, factores de crecimiento o ADN modificado
genéticamente. La composición de fibras de colágeno inyectable de
la invención es útil para el aumento de tejidos, particularmente
para aumentar el volumen del esfínter urinario en pacientes con
incontinencia.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
explicar mejor la práctica de la presente invención y de ninguna
manera deben interpretarse para limitar el alcance de la presente
invención. Se apreciará que el diseño del dispositivo en su
composición, forma y espesor se selecciona dependiendo de la
indicación final para la construcción. Los especialistas en la
técnica reconocerán que pueden realizarse diversas modificaciones en
los métodos descritos en este documento sin apartarse del espíritu
y alcance de la presente invención.
Este estudio se realizó para demostrar la
flexibilidad del método de producción ya que es capaz de producir
las formulaciones de cadena de colágeno a partir de numerosos tipos
de soluciones de colágeno diferentes. Se usó el método de
producción de extrusión de una etapa descrito en la realización
preferida del aparato de fabricación descrito anteriormente con 20%
de PEG (PM 8000) a 700 mOsm como agente de coagulación. En este
ejemplo, el objetivo era sólo fabricar pequeños lotes del material.
En este ejemplo, se usó el aparato de la Figura 1 empleando el
filtro de bolsa 24 para recoger y retirar las cadenas de colágeno
formadas.
Se han producido satisfactoriamente cadenas de
colágeno a partir de las siguientes preparaciones de colágeno:
colágeno de tendón bovino extraído con ácido, de
telopéptidos intactos, de tipo I en solución de ácido acético al
0,05% a pH 3,5 a las siguientes concentraciones: 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3
mg/ml, 4 mg/ml, 4,6 mg/ml, 5 mg/ml y 5,5 mg/ml.
colágeno digerido con pepsina, atelopeptídico,
de tipo I procedente de piel bovina (Vitrogen 100; Collagen
Corporation, Palo Alto, CA) en ácido clorhídrico a pH 2,0.
\vskip1.000000\baselineskip
Se formaron composiciones de cadenas de colágeno
usando el aparato y se recogieron en la bolsa 24. Se seleccionaron
muestras de cadenas de cada preparación de colágeno, se midieron y
se examinaron con microscopía óptica. Se consiguió un intervalo de
dimensiones de cadena de 1 mm a 15 mm de longitud y de 0,2 mm a 0,7
mm de anchura con cada una de las soluciones de colágeno indicadas
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra la flexibilidad del
método de producción, ya que puede producir las formulaciones de
cadenas de colágeno usando diferentes tampones de coagulación. Se
usó el método de producción de extrusión de una etapa descrito en
la realización preferida del aparato de fabricación descrito
anteriormente usando colágeno extraído con ácido en ácido acético
al 0,05% a pH 3,5. Como el objetivo de este estudio fue fabricar
únicamente lotes pequeños del material, se usó el filtro de bolsa 24
(mostrado en la Figura 1) para recoger y retirar las cadenas de
colágeno formadas del sistema y se usó para contener la muestra
cuando se concentró eliminando por compresión el exceso de fluido
de la muestra. Se seleccionaron muestras de cadenas de cada
preparación de colágeno, se midieron y se examinaron con microscopía
óptica.
A partir de este estudio, se produjeron cadenas
de colágeno usando los siguientes tampones de coagulación basados
en PEG que varían en el peso molecular, en la cantidad de PEG usada
y la osmolalidad del tampón y su contenido iónico. Las condiciones
de los tampones se indican más adelante en la Tabla 1. Las
dimensiones de las cadenas formadas variaban de 1 mm a 15 mm de
longitud y de 0,2 mm a 0,7 mm de anchura.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cadenas de colágeno producidas por el método
de producción de extrusión de una etapa descrito anteriormente se
producen reproduciblemente tanto dentro de un lote como en
comparaciones entre lotes.
Se usó una bomba de jeringa para extruir
colágeno extraído con ácido a 5,6 mg/ml a una velocidad de 0,8
ml/min a través de una aguja de calibre 20 en una corriente de PEG
cerrada. El tampón de coagulación era polietilenglicol (PEG) PM
8000 a 20% p/v y 700 mOsm. El caudal de PEG se estableció a 500
ml/min en un tubo de 0,25 pulgadas (0,64 cm) de diámetro en el
punto de extrusión de colágeno en medio de la corriente. Trece lotes
realizados de esta manera tuvieron cadenas con longitudes y
anchuras de 7,7 mm y 0,64 mm respectivamente en promedio. Las
desviaciones típicas para la longitud y anchura fueron de 0,35 mm y
0,03 mm respectivamente.
Pueden producirse cadenas finas y largas usando
una aguja de calibre 25 en lugar de una aguja de calibre 20 y
modificando los caudales de colágeno y PEG. La siguiente Tabla 2
demuestra varias formulaciones diferentes con los caudales
apropiados. La variabilidad dentro de un lote se indica para cada
lote como desviación típica (SD) tanto para la longitud (L) como
para la anchura (W) en la tabla:
El tamaño de la aguja y la concentración de la
composición de cadenas de colágeno afectan a la fuerza necesaria
para la extrusión, tal como cuando la composición se administra a un
paciente. La capacidad para inyectar el material usando una jeringa
se evaluó de dos maneras: (1) Una jeringa con una aguja unida se
montó en un sistema de ensayo MTS Bionix, se extruyó un volumen de
material a un caudal constante y se registró la fuerza; y, (2) el
material se extruyó desde una jeringa de forma manual y la fuerza se
registró desde una celda de carga acoplada.
A continuación se proporcionan ejemplos
específicos de formulaciones inyectables preparadas de las cadenas.
Un material se considera inyectable si requiere menos de 40 N de
fuerza para extruirse desde una jeringa (Wallace, 1989). Las
formulaciones de cadenas de colágeno descritas en este documento se
extruyeron con 15-25 N de fuerza a través de agujas
de calibre 20:
Composición 4A: La longitud y anchura de
las cadenas de colágeno eran de 11,1 (SD \pm 1,4) mm y 0,58 (SD
\pm 0,13) mm respectivamente y la concentración de colágeno en la
composición que contenía las cadenas y el vehículo fue de 49 mg de
colágeno/ml. La extrusión a través de una aguja de calibre 20 desde
una jeringa de 3 ml requería 19,2 N (48,1 máx) de forma manual y
21,7 (SD \pm 9,7) N a 5 ml/min en el MTS.
Composición 4B: La longitud y anchura
fueron de 4,17 (SD \pm 1,28) mm y 0,58 (SD \pm 0,12) mm
respectivamente y la concentración de colágeno en la composición
que contenía las cadenas y el vehículo fue de 61 mg de colágeno/ml.
La extrusión a través de una aguja de calibre 20 desde una jeringa
de 3 ml requería 18,8 N (53,0 N máx) de forma manual y 22,4 (SD
\pm 14,6) N a 5 ml/min en el MTS.
Composición 4C: (Efecto de la
concentración y el calibre de la aguja): Una mayor concentración y
calibre de la aguja (orificio de menor diámetro) aumenta la fuerza
necesaria para extrusión. Esta formulación se ensayó a 50, 70 y 85
mg de colágeno/ml en el MTS usando agujas de calibre 18, 20 y 22. La
Tabla 3 mostrada a continuación indica la fuerza en Newtons
necesaria para la extrusión.
Se fabricaron ECF como se ha descrito en la
realización preferida y se concentraron únicamente a aproximadamente
5 mg/ml. Se fabricaron cadenas de tamaño medio para las siguientes
construcciones.
Muestra 5A: La ECF se vertió en una forma
homogénea diluida en un Transwell. Después, el vehículo se extrajo
de la ECF desde el fondo por acción capilar usando un material
absorbente. De esta manera, la ECF forma una capa cohesiva en la
base del Transwell. Después se añaden células a la superficie de la
capa y se infiltran en la capa fácilmente. Las células se adhieren
a la matriz, son viables y funcionan normalmente.
Muestra 5B: Para esta muestra se usó ECF
fabricada a partir de colágeno tratado con NaOH. El material se
liofilizó, se esterilizó por radiación gamma y después se
reconstituyó con solución salina tamponada con fosfato al 10% (v/v)
a una concentración de 12,47 mg/ml, determinada por ensayo con
hidroxiprolina. Se rellenaron placas petri estériles de 60 mm, se
enrollaron en "blue-wrap" estéril y se
congelaron a -80ºC durante 2 horas. Después se liofilizaron durante
aproximadamente 2 días. La ECF formó una matriz coherente en la
placa petri. Se sembraron fibroblastos dérmicos humanos sometidos a
pocos pases en la matriz en medio de cultivo que comprendía DMEM
que contenía suero de ternero recién nacido. El crecimiento de
células en la construcción era saludable con evidencia de
crecimiento celular en la construcción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron experimentos de infiltración
unidimensionales en una ECF fabricada a partir de cadenas largas y
anchas (LW) y cadenas cortas y finas (ST). Se diseñó un aparato
axialmente simétrico para mantener la ECF entre dos discos de
filtro porosos a un espesor prescrito y ajustable (t) (Figura 3). Se
hace pasar agua a través de la ECF usando una bomba de jeringa y la
presión se registra en un transductor de presión en serie acoplado
a un registrador de datos. Después se cargan 0,5 ml de ECF en la
cámara proporcionando un espesor inicial (t), t = 4 mm, la presión
se aumenta 5 psi (34,46 kPa) usando un caudal (Q) de 1 ml/min. El
flujo después se reduce a 0,1 ml/min y el nivel de presión (P) se
controla hasta que se alcanza un valor constante. Esta presión se
usa para calcular la permeabilidad aparente como: K_{app} =
(Q\cdott)/(P\cdotA), donde A es el área transversal de los
filtros. El espesor de la ECF después se redujo en este experimento
en incrementos de 0,8 mm, por compresión mecánica de la muestra
entre los filtros porosos. La dilatación de la ECF de esta manera
es equivalente a la concentración de la pasta de ECF. La
permeabilidad en cada punto se usó para determinar la permeabilidad
dependiente de la deformación (o la dependencia de la concentración
de la permeabilidad) ajustando los datos a la ley exponencial
establecida por Lai et al (1980) para tejidos blandos, K_{app} =
K_{o}exp(-M\cdote), donde e es la dilatación de la matriz.
Los resultados demuestran que a una
concentración específica, hay una reducción sustancial de la
permeabilidad debido al cambio estructural en el material de la ECF
ya que las cadenas individuales se entrelazan y proporcionan una
matriz cohesiva. En esta transición las concentraciones de las
cadenas fueron 13.000 y 80.000 cadenas/ml para las formulaciones de
LW y ST respectivamente. Los valores de permeabilidad en ese punto
fueron comparables a 13,8e-13 m^{4}/Ns (LW) y
12,8e-13 m^{4}/Ns (ST). La compactación de la ECF
redujo la permeabilidad de una forma no lineal como se observa en
la Figura 4. La concentración de transición (y el espesor) para cada
formulación se usó como punto de partida para calcular la
dilatación en el análisis de permeabilidad dependiente de la
deformación. Las dos formulaciones se ajustaron bien al modelo con
R^{2} = 0,991 en los dos casos. Los parámetros de ajuste fueron
k_{o} = 13,4 m^{4}/Ns y M = 2,3 para el material LW y k_{o} =
13,0 m^{4}/Ns y M = 1,9 para el material ST.
Los resultados de infiltración demuestran la
continuidad de la estructura porosa y la idoneidad a ese respecto
como un implante de tejidos blandos. También demuestra que la
estructura de la ECF cambia con las dimensiones de sus cadenas
componentes y su concentración. Se deduce que la ECF podría
modificarse para proporcionar implantes de diferentes estructuras
para adecuarse a las necesidades de una aplicación particular. Desde
un punto de vista mecánico, está claro que la permeabilidad de la
estructura es una función de las dimensiones y la concentración de
ECF.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron muestras de ECF (0,8 mm) a una
compresión uniaxial reducida entre un pistón sólido y un filtro
poroso. El aparato que se usó se muestra esquemáticamente en la
Figura 5. Se usó un pasador de cierre para iniciar la carga en
escalones y fijar el desplazamiento para el equilibrio del material
cuando fue necesario. Un micrómetro láser registró tanto las
alturas de referencia como los desplazamientos del pistón a lo largo
del tiempo. El protocolo de carga fue el siguiente: se aplicó una
carga de tara de 0,77 kPa y se dejó equilibrar durante 10 minutos.
Esto se consideró el estado de carga de referencia. Posteriormente,
se aplicó una carga en escalón de 3,9 kPa y la se controló la
plastodeformación de la muestra durante una hora. Después se cerró
el pistón durante diez minutos para permitir cualquier equilibrio
adicional de la muestra. Esto se continuó por una carga en escalón
de 15,6 kPa aplicada a la misma muestra durante tres horas. De
nuevo, el pistón se cerró en su sitio y se dejó equilibrar la
muestra. A continuación, la carga se retiró y se controló la
recuperación de la muestra durante una hora más hasta la carga de
tara. Para cada una de las tres fases, las deformaciones se
calcularon como desplazamiento con respecto a la altura de la
muestra al principio de la fase. Se evaluaron modelos empíricos
para determinar la mejor descripción de la plastodeformación y los
datos de recuperación como medio para comparar las formulaciones LW
y ST y la plastodeformación frente a la respuesta de recuperación
por una formulación dada.
Se ajustó satisfactoriamente un modelo lineal
logarítmico, \varepsilon = M*In(t) - c, a los datos
experimentales para la primera fase de plastodeformación incluso
para los puntos de tiempo muy tempranos (Figura 6a). Tanto para la
fase de segunda carga como para la fase de recuperación del ensayo,
un modelo de ley de potencias, \varepsilon = bt^{\alpha},
ajusta los datos muy bien (Figuras 6b y 6c). Los resultados de estos
ajustes empíricos se muestran en la Tabla 4 presentada a
continuación.
Usando estos modelos pueden distinguirse las
formulaciones LW y ST de ECF en sus respuestas a la recuperación y
plastodeformación. La velocidad de compresión inicial es más rápida
(mayor M, p<0,05) y la velocidad de recuperación es más lenta
(menor \alpha (alfa) p<0,05) para las cadenas más finas y más
cortas en comparación con las cadenas más largas y más anchas.
Además, la velocidad de recuperación es más lenta (menor \alpha
(alfa) p<0,05) que la velocidad de compresión para el material
ST.
Este ensayo demuestra la estructura
continuamente porosa de la matriz de ECF. La concentración y las
dimensiones de sus cadenas componentes influyen en la cinética de
respuesta a la compresión de la matriz.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cargaron fibras de colágeno obtenidas por
biotecnología (0,8 ml) en un sistema de compresión reducido (Figura
5) para una altura inicial de aproximadamente de 0,25 pulgadas (0,64
cm). Se bajó un pistón de policarbonato sobre el material y después
se añadieron los pesos a la parte superior del pistón. La adición de
200 g al pistón (15,9 kPa) produjo una construcción comprimida y
compactada de fibras de colágeno obtenidas por biotecnología con
una altura menor de 0,25 pulgadas (0,64 cm) en 24 horas. La
construcción se retiró del interior del sistema de compresión para
el ensayo y evaluación. La construcción de fibras de colágeno
obtenida por biotecnología compactada mantuvo su forma y era
mecánicamente estable incluso cuando se agitaba en agua durante
varios días.
\vskip1.000000\baselineskip
La matriz de colágeno fabricada como se ha
descrito anteriormente se inyectó por vía subcutánea en las orejas
de conejos blancos New Zealand usando una aguja de calibre 20. Antes
de la inyección, se midió la altura del sitio del implante usando
un calibre micrométrico. Inmediatamente después de la inyección, se
midió la altura de los implantes. Todos los implantes tenían 0,5
ml. La persistencia se definió como la altura del implante en el
momento de medición (h_{i}) con respecto a la altura inicial del
implante (h_{o}). En un experimento se investigó la compactación
a corto plazo mientras que un segundo experimento se centró en la
persistencia a largo plazo de los implantes fabricados a partir de
cadenas de diferentes tamaños. En el experimento a corto plazo, la
altura del implante se midió a 1 hora (h_{o}), 4 horas y 3 días.
En el experimento a largo plazo, los implantes se midieron a 1
(h_{o}), 21, 42, 84, 180 y 330 días. Los animales se sacrificaron
a esos tiempos (excepto el día 1) y los implantes se cortaron del
tejido circundante, se fijaron en formalina y se tiñeron con
hematoxilina y eosina para la evaluación histológica.
Durante los 3 primeros días, la altura del
implante se redujo en 15-25% (Figura 7). Esto se
debe a la compactación o concentración inicial de las cadenas desde
una pasta inyectable a un sólido viscoelástico, por las fuerzas del
tejido circundante. La permeabilidad y la elasticidad de la
formulación, el tejido circundante in situ y el volumen y
concentración del material implantado determinan el grado de
exudación de fluido desde el implante. La persistencia de la altura
del implante durante 330 días para los materiales LW y ST se muestra
en la Figura 8. El implante es palpable y medible a lo largo de
todo el período y retiene 50% de su altura a los 330 días. La
evaluación histológica indica vascularización de los implantes y
crecimiento de fibroblastos así como una nueva deposición de
colágeno sustancial a los 3 meses. A los 330 días sigue habiendo una
cantidad sustancial de implante inicial en el sitio de
implantación. No hay indicios de que las cadenas de ECF se dispersen
a áreas circundantes.
\vskip1.000000\baselineskip
La matriz de colágeno fabricada como se ha
descrito anteriormente en la realización preferida se inyectó en el
músculo de la pata trasera de 15 conejos blancos New Zealand usando
una aguja de calibre 20. Todos los implantes eran de 0,5 ml. La
persistencia y migración del material se evaluó en secciones
histológicas. Los conejos se sacrificaron a 21, 42, 84, 180 y 330
días, tres en cada punto de tiempo, y los implantes se cortaron del
tejido circundante, se fijaron en formalina y se tiñeron con
hematoxilina y eosina para la evaluación histológica. Se descubrió
que los implantes se integraban bien a lo largo del tiempo con el
tejido muscular adyacente. Hubo alguna infiltración de células
hospedadoras sin una gran cantidad de remodelación. Los implantes
estaban bien contenidos dentro del músculo con muy poca extensión.
Además, se ensayaron los sueros de los conejos y se descubrió que
eran negativos para anticuerpos específicos para el colágeno.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo una composición de colágeno
inyectable fabricada de acuerdo con el método descrito anteriormente
usando Vitrogen 100 como solución de colágeno de partida. Se
inyectó el material en las dos orejas de ocho conejos y se midió la
persistencia a 4, 7, 14, 21, 42, 63 y 84 días. La mitad de los
animales se sacrificaron a los 21 días y el resto a los 84 días
para la evaluación histológica. La persistencia relativa al día 1 se
mantuvo casi a 80% para algunos implantes durante 84 días. Los
datos se muestran en la Figura 9. La evaluación histológica indicó
una respuesta del hospedador muy latente al material. Además, el
material se mantuvo localizado en el sitio de implantación. Se
ensayaron los sueros de los conejos y se descubrió que eran
negativos para anticuerpos específicos para el
colágeno.
colágeno.
\newpage
Para evaluar las siguientes formulaciones del
material también se usaron los modelos descritos en los ejemplos
previos: (1) material que no se había esterilizado terminalmente con
ácido peracético (pero producido en condiciones asépticas); (2)
material que se había sometido a liofilización antes de la
implantación; (3) material que se había sometido a liofilización y
esterilización terminal por irradiación gamma; y (4) una formulación
producida usando PEG con una baja osmolalidad (430 mOsm).
Todas las formulaciones se inyectaron
satisfactoriamente en el modelo de oreja de conejo y se compactaron
en diversos grados. Las composiciones permanecieron en la
localización deseada tanto en el modelo de músculo como en el
modelo de oreja y fueron medibles a los tres meses.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fabricaron composiciones de fibra de colágeno
en un sistema equivalente al descrito anteriormente. En este
ejemplo, el tampón de coagulación usado para la producción era un
tampón de baja osmolalidad (430 mOsm) de polietilenglicol (PEG) al
20% p/v. En este ejemplo, el material se liofilizó después de la
concentración, se sometió a irradiación gamma para la
esterilización terminal y se reconstituyó con solución salina
tamponada con fosfato antes del uso.
En este ejemplo se usaron tres cerdos enanos,
uno para cada punto de tiempo: 5, 10 y 21 días. En cada animal se
realizaron 14 heridas en el lomo (2 filas de siete heridas paralelas
a la columna vertebral) con un punzón de biopsia de 1 cm de
diámetro. Diez heridas se rellenaron con la composición de fibras de
colágeno y cuatro se dejaron sin tratar. Todas se vendaron
únicamente con una pulverización oclusiva sobre la venda
(Op-Site).
Los criterios de valoración incluían
vascularización, avance epitelial, proyecciones epiteliales (papilas
epiteliales) y densidad de la matriz. La vascularización se evaluó
por recuento manual de vasos sanguíneos dentro de la herida con un
microscopio óptico. Estos datos se recogieron únicamente para el día
21. El avance epitelial se determinó como un porcentaje de la
anchura total de la herida en secciones histológicas. Estas
mediciones se realizaron manualmente y para todos los puntos de
tiempo. El número de papilas epiteliales por unidad de longitud se
contó como una medida de la calidad del cierre de la herida a los 21
días. La densidad de la matriz tanto dentro como adyacente a la
herida se midió cuantitativamente usando técnicas de análisis de
imágenes. Estas evaluaciones se realizaron usando tinción Picro
Sirius Red (PSR), que muestra sólo la matriz, y microscopía de luz
polarizada. La respuesta celular se evaluó usando secciones teñidas
con hematoxilina y eosina.
Los resultados indicados demostraron que las
heridas tratadas eran ricas en fibrina después de 5 días y había
una proliferación extensiva de fibroblastos acompañada de deposición
de colágeno. Notablemente, no quedaba ECF en las heridas, lo cual
indica su aparente disolución/degradación. Después de cinco días, no
había diferencia estadística en el avance epitelial entre las
heridas tratadas con ECF y las no tratadas. Los dos tipos estaban
cubiertos aproximadamente en 22-23%. Sin embargo,
después de 10 días, las heridas tratadas con ECF estaban cubiertas
en 85% mientras que las heridas no tratadas estaban cubiertas en 72%
y esta diferencia era estadísticamente significativa
(p<0,001).
A los 10 días en las heridas de cerdos normales
había una cantidad considerable de epitelización y el tejido de
granulación era rico de fibroblastos en proliferación. Hubo
deposición de colágeno visiblemente más densa en el tejido de
granulación de las heridas tratadas con ECF en comparación con las
heridas no tratadas. En algunas secciones el tejido fue similar al
observado en las secciones de control a los 21 días. No hubo
respuesta a cuerpos extraños.
A los 21 días, el grado de número de vasos
sanguíneos por área unitaria dentro de las heridas tratadas con ECF
(0,5 \pm 0,09) fue menor que en las heridas no tratadas (0,34
\pm 0,03) (p<0,001). Además, la densidad de la matriz dentro
de la herida era significativamente más parecida a la densidad de
matriz del tejido adyacente (p=0,038) en las heridas tratadas con
ECF con una diferencia de 23,1 \pm 8,5 en comparación con los
controles no tratados a 33,9 \pm 5,1. Aunque no hubo una
diferencia estadística (p>0,5) para el parámetro de las papilas
epiteliales, parecía ser que en los bordes de las heridas tratadas
había algunas papilas epiteliales mientras que no había ninguna en
los controles.
Aunque la invención anterior se ha descrito con
algunos detalles a modo de ilustración y ejemplo con fines de
claridad y comprensión, será evidente para un especialista en la
técnica que pueden ponerse en práctica ciertos cambios y
modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Claims (27)
1. Un método para producir cadenas que
comprende:
- (a)
- extruir de forma continua un material a través de un primer orificio en un entorno gaseoso para formar pequeñas gotas,
- (b)
- extruir las gotas a través de un segundo orificio para alargar las gotas formando cadenas, y
- (c)
- depositar las cadenas en un agente de coagulación que solidifica el material en esa forma,
donde el material se selecciona entre el grupo
consistente en colágeno, ácido hialurónico, mezclas de colágeno y
ácido hialurónico, ácido poliglicólico y ácido poliláctico.
2. El método de la reivindicación 1, donde el
agente de coagulación comprende un agente de deshidratación
seleccionado entre el grupo consistente en polietilenglicol,
dextrano, alcohol isopropílico y acetona.
3. Un método para producir cadenas que
comprende
- (a)
- extruir de forma continua un material a través de un primer orificio en un entorno gaseoso para formar pequeñas gotas, y
- (b)
- pasar las gotas a través de un segundo orificio en un agente de coagulación para alargar las gotas formando cadenas, y solidificarlas en esa forma,
donde el material se selecciona entre el grupo
consistente en colágeno, ácido hialurónico, mezclas de colágeno y
ácido hialurónico, ácido poliglicólico y ácido poliláctico.
4. El método de la reivindicación 3, donde el
agente de coagulación comprende un agente de deshidratación
seleccionado entre el grupo consistente en polietilenglicol,
dextrano, alcohol isopropílico y acetona.
5. El método de las reivindicaciones 1 a 4,
donde el método comprende además filtrar las cadenas separándolas
del agente de coagulación.
6. El método de las reivindicaciones 1 a 5,
donde las cadenas se concentran.
7. El método de las reivindicaciones 1 a 6,
donde el material que se extruye comprende colágeno en solución.
8. El método de las reivindicaciones 1 a 7,
donde las cadenas de colágeno se reticulan.
9. El método de la reivindicación 8, donde las
cadenas de colágeno se reticulan con hidrocloruro de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
10. El método de la reivindicación 7, donde la
solución de colágeno contiene uno o más componentes seleccionados
entre el grupo consistente en agentes farmacéuticos, factores de
crecimiento, hormonas, componentes de la matriz extracelular,
material genético y células.
11. El método de las reivindicaciones 1 a 10,
donde el agente de coagulación comprende polietilenglicol en tampón
fosfato.
12. El método de las reivindicaciones 1 a 11 que
comprende además concentrar las cadenas forzando continuamente a
una solución de las cadenas hacia atrás y hacia adelante de una
manera alterna a través de la luz de un filtro de flujo tangencial
con lo que el efluente transluminal pasa a través del filtro dando
como resultado una solución de cadenas más concentrada.
13. El método de las reivindicaciones 7 a 11,
donde una solución de cadenas de colágeno se fuerza de forma
continua hacia atrás y hacia adelante de una manera alterna a través
de la luz de un filtro de flujo tangencial con lo que el efluente
transluminal pasa a través del filtro dando como resultado una
solución de cadenas de colágeno más concentrada.
14. El método de las reivindicaciones 1 a 13,
donde una solución de cadenas se seca y se reconstituye con un
agente de vehículo líquido.
15. El método de las reivindicaciones 1 a 14,
donde una solución de cadenas se compacta entre filtros porosos.
16. El método de las reivindicaciones 1 a 15,
que comprende además concentrar las cadenas rellenando moldes
sólidos o porosos de malla con una solución de cadenas.
17. El método de las reivindicaciones 1 a 16,
donde una solución de cadenas se deseca parcialmente poniéndola en
contacto con materiales porosos.
18. El método de las reivindicaciones 1 a 17,
donde el material está en una solución que contiene uno o más
componentes seleccionados entre el grupo consistente en agentes
farmacéuticos, factores de crecimiento, hormonas, componentes de la
matriz extracelular, material genético y células.
19. Un método para producir cadenas de colágeno
que comprende:
- (a)
- extruir de forma continua una solución de colágeno a través de un primer orificio en un entorno gaseoso para formar pequeñas gotas, y
- (b)
- pasar las gotas a través de un segundo orificio en un agente de coagulación para alargar las gotas formando cadenas de colágeno y solidificarlas en esa forma.
20. Un método para producir cadenas que
comprende:
- (a)
- extruir de forma continua un material a través de un orificio sumergido en una corriente de un agente de coagulación que fluye que separa las cadenas de material para solidificar el material en esa forma, donde el material se selecciona entre grupo consistente en colágeno, ácido hialurónico, mezclas de colágeno y ácido hialurónico, ácido poliglicólico y ácido poliláctico y
- (b)
- concentrar las cadenas forzando una solución de las cadenas hacia atrás y hacia adelante de una manera alterna a través del lumen de un filtro de flujo tangencial con lo que el efluente transluminal pasa a través del filtro dando como resultado una solución de cadenas más concentrada.
21. El método de la reivindicación 20, donde el
material que se extruye comprende colágeno en solución.
22. El método de la reivindicación 21, donde las
cadenas de colágeno se reticulan.
23. El método de la reivindicación 22, donde las
cadenas de colágeno se reticulan con hidrocloruro
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
24. El método de las reivindicaciones 21 a 23,
donde la solución de colágeno contiene uno o más componentes
seleccionados entre el grupo consistente en agentes farmacéuticos,
factores de crecimiento, hormonas, componentes de la matriz
extracelular, material genético y células.
25. El método de las reivindicaciones 19 a 24,
donde el agente de coagulación comprende polietilenglicol en tampón
fosfato.
26. Un sistema de producción cerrado para
producir cadenas de colágeno que comprende un ciclo de producción y
un ciclo de filtración:
- comprendiendo el ciclo de producción un agente de coagulación circulante, un puente de aguja que contiene una aguja sumergida en el agente de coagulación y una solución de colágeno bombeada a través del aguja al interior del agente de coagulación; y comprendiendo el ciclo de filtración un filtro de flujo tangencial.
27. El sistema de producción cerrado de la
reivindicación 26, que comprende además un ciclo de concentración,
comprendiendo el ciclo de concentración un filtro de flujo
tangencial.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15614499P | 1999-09-28 | 1999-09-28 | |
| US156144P | 1999-09-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2325977T3 true ES2325977T3 (es) | 2009-09-28 |
Family
ID=22558293
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES00967071T Expired - Lifetime ES2325977T3 (es) | 1999-09-28 | 2000-09-28 | Fibrillas de colageno obtenidas por biotecnologia. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1216296B1 (es) |
| AT (1) | ATE428768T1 (es) |
| AU (1) | AU7732600A (es) |
| CA (1) | CA2386217C (es) |
| DE (1) | DE60042027D1 (es) |
| ES (1) | ES2325977T3 (es) |
| WO (1) | WO2001023529A1 (es) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030114061A1 (en) * | 2001-12-13 | 2003-06-19 | Kazuhisa Matsuda | Adhesion preventive membrane, method of producing a collagen single strand, collagen nonwoven fabric and method and apparatus for producing the same |
| WO2004078120A2 (en) * | 2003-02-28 | 2004-09-16 | Fibrogen, Inc. | Collagen compositions and biomaterials |
| US8263109B2 (en) * | 2005-05-09 | 2012-09-11 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Injectable bulking compositions |
| US8518436B2 (en) | 2005-05-16 | 2013-08-27 | Purdue Research Foundation | Engineered extracellular matrices |
| GB2463811B (en) * | 2005-05-16 | 2010-05-05 | Purdue Research Foundation | Engineered extracellular matrices |
| US20070269476A1 (en) | 2006-05-16 | 2007-11-22 | Voytik-Harbin Sherry L | Engineered extracellular matrices control stem cell behavior |
| AU2007297611B2 (en) | 2006-09-21 | 2013-02-07 | Purdue Research Foundation | Collagen preparation and method of isolation |
| GB2468102B (en) | 2007-12-10 | 2012-12-05 | Purdue Research Foundation | Collagen-based matrices with stem cells |
| US9782457B2 (en) * | 2011-10-07 | 2017-10-10 | Tissue Repair Company | Flowable formulations for tissue repair and regeneration |
| US9878071B2 (en) | 2013-10-16 | 2018-01-30 | Purdue Research Foundation | Collagen compositions and methods of use |
| US9238090B1 (en) | 2014-12-24 | 2016-01-19 | Fettech, Llc | Tissue-based compositions |
| US11919941B2 (en) | 2015-04-21 | 2024-03-05 | Purdue Research Foundation | Cell-collagen-silica composites and methods of making and using the same |
| EP3615568A4 (en) | 2017-04-25 | 2021-01-20 | Purdue Research Foundation | TISSUE RESTORATION THREE-DIMENSIONAL (3D) ARTIFICIAL MUSCLE |
| WO2018212792A2 (en) | 2017-05-16 | 2018-11-22 | Embody Llc | Biopolymer compositions, scaffolds and devices |
| JP7529567B2 (ja) | 2017-10-24 | 2024-08-06 | エムボディ インコーポレイテッド | 生体高分子足場移植片およびその生成のための方法 |
| JP2022524714A (ja) | 2019-02-01 | 2022-05-10 | エンボディ，インコーポレイテッド | マイクロフルイディック押出 |
| AT523123B1 (de) * | 2019-11-04 | 2021-10-15 | 3D Spine Matrix Biotechnologie Gmbh | Herstellung und verwendung von verdichtetem kollagen |
| BR112023004247A2 (pt) * | 2020-09-08 | 2023-04-11 | Genentech Inc | Kits de tubulação para formar uma mistura, sistemas para formar uma composição farmacêutica, métodos para transferir composições farmacêuticas e para fabricar uma composição farmacêutica e amortecedor de pulsação |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1214505B (it) * | 1987-03-12 | 1990-01-18 | Gentili Ist Spa | Procedimento per la preparazione di collageno e prodotti cosi'ottenuto. |
| PT831882E (pt) * | 1995-06-07 | 2005-01-31 | Organogenesis Inc | Composicoes de segmentos de fibra de colagenio reconstituido e metodos de preparacao das mesmas |
-
2000
- 2000-09-28 ES ES00967071T patent/ES2325977T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-28 CA CA2386217A patent/CA2386217C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-09-28 WO PCT/US2000/026766 patent/WO2001023529A1/en active Application Filing
- 2000-09-28 EP EP00967071A patent/EP1216296B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-28 AU AU77326/00A patent/AU7732600A/en not_active Abandoned
- 2000-09-28 AT AT00967071T patent/ATE428768T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-09-28 DE DE60042027T patent/DE60042027D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE428768T1 (de) | 2009-05-15 |
| CA2386217A1 (en) | 2001-04-05 |
| AU7732600A (en) | 2001-04-30 |
| CA2386217C (en) | 2011-04-26 |
| EP1216296A1 (en) | 2002-06-26 |
| DE60042027D1 (de) | 2009-05-28 |
| EP1216296B1 (en) | 2009-04-15 |
| WO2001023529A1 (en) | 2001-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2325977T3 (es) | Fibrillas de colageno obtenidas por biotecnologia. | |
| US7025916B2 (en) | Process of making bioengineered collagen fibrils | |
| Negrini et al. | Tissue-mimicking gelatin scaffolds by alginate sacrificial templates for adipose tissue engineering | |
| Draye et al. | In vitro release characteristics of bioactive molecules from dextran dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel films | |
| JP6005685B2 (ja) | 組織工学、細胞培養、および細胞送達用の多孔質足場の調製方法 | |
| DE69819329T2 (de) | Kollagen-polysaccharid matrize zur wiederherstellung von knochen und knorpel | |
| AU722322B2 (en) | Reconstituted collagen fiber segment compositions and methods of preparation thereof | |
| JP4137382B2 (ja) | 膠原組織組成物 | |
| US9101693B2 (en) | Cell-independent fabrication of tissue equivalents | |
| Teng et al. | A tough, precision-porous hydrogel scaffold: ophthalmologic applications | |
| CN108601861B (zh) | 复合胶原水凝胶材料、包含该材料的植入式眼科装置和制造该材料和该装置的方法 | |
| JP7384767B2 (ja) | コラーゲンに基づく治療送達系 | |
| EA019118B1 (ru) | Способ желатинизации фиброина шелка и регулирования времени желатинизации, способ инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка (варианты) | |
| JP2004523484A (ja) | 電気処理されたコラーゲン | |
| WO2009004351A2 (en) | Methods for producing biomaterials with variable stiffness | |
| Steiner et al. | Enhanced vascularization and de novo tissue formation in hydrogels made of engineered RGD-tagged spider silk proteins in the arteriovenous loop model | |
| US20220088270A1 (en) | Non-Uniformly Stiff Polymeric Scaffolds and Methods for Producing Thereof | |
| JPWO2002091955A1 (ja) | 蛋白代謝機能を有する人工腎臓およびその作製方法 | |
| EP3151874B1 (en) | Collagen biomaterials | |
| KR102194155B1 (ko) | 온도 감응성 폴리머가 접합된 홍합 접착 단백질을 포함하는 온도 감응성 생체 소재 | |
| US20230119928A1 (en) | Platelet lysate foam for cell culture, cell therapy and tissular regeneration and method for obatining same | |
| JP2023521307A (ja) | 高強度コラーゲン組成物および使用方法 | |
| KR20030041389A (ko) | 조직재생을 위한 돼지의 소장점막하 조직의 제조와 응용방법 | |
| CA2223960C (en) | Reconstituted collagen fiber segment compositions and methods of preparation thereof | |
| WO2024044863A1 (es) | Método para obtener un andamio inyectable poroso basado en biopolímeros similares, pero con diferente temperatura de fusión |