EA019118B1 - Способ желатинизации фиброина шелка и регулирования времени желатинизации, способ инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка (варианты) - Google Patents

Способ желатинизации фиброина шелка и регулирования времени желатинизации, способ инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка (варианты) Download PDF

Info

Publication number
EA019118B1
EA019118B1 EA200971116A EA200971116A EA019118B1 EA 019118 B1 EA019118 B1 EA 019118B1 EA 200971116 A EA200971116 A EA 200971116A EA 200971116 A EA200971116 A EA 200971116A EA 019118 B1 EA019118 B1 EA 019118B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
silk fibroin
solution
gelatinization
silk
time
Prior art date
Application number
EA200971116A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200971116A1 (ru
Inventor
Сяоцин Ван
Джон Клуге
Гэри Г. Леиск
Дэвид Л. Каплан
Original Assignee
Трастиз Оф Тафтс Колледж
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Трастиз Оф Тафтс Колледж filed Critical Трастиз Оф Тафтс Колледж
Publication of EA200971116A1 publication Critical patent/EA200971116A1/ru
Publication of EA019118B1 publication Critical patent/EA019118B1/ru

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/24Mucus; Mucous glands; Bursa; Synovial fluid; Arthral fluid; Excreta; Spinal fluid
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22Hormones
    • A61K38/25Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5089Processes
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43586Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from silkworms
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005Wall or coating material
    • A61K9/5021Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5052Proteins, e.g. albumin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005Wall or coating material
    • A61K9/5063Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу желатинизации фиброина шелка, который содержит обработку фиброина шелка, включая обработку ультразвуком в течение периода времени от 5 до 60 с для инициации желатинизации, где желатинизация фиброина шелка происходит менее чем за 24 ч после обработки ультразвуком, при этом фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН 7,5 или выше. Изобретения также относится к способу регулирования времени желатинизации фиброина шелка путем ультразвуковой обработки раствора фиброина шелка в течение периода времени, достаточного для инициации желатинизации. Также предложены способы инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка, который включает обработку раствора фиброина шелка ультразвуком в течение периода времени, достаточного для инициации желатинизации, при этом фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН 7,5 или выше. Полученный вышеуказанным способом инкапсулированный в фиброин шелка биологический материал подходит для приспособления для биодоставки.

Description

Изобретение обеспечивает способы желатинизации фиброина шелка путем ультразвуковой обработки. Гидрогели, полученные данным способом, могут быть полезны, например, в качестве систем биодоставки.
Уровень техники
Биосовместимые и биологически разлагаемые полимерные гидрогели представляют собой полезные носители для доставки биоактивных молекул и клеток для применения в таких областях биомедицины, как тканевая инженерия и контролируемая скорость высвобождения лекарств. Очищенный нативный фиброин шелка формирует из водных растворов структуры гидрогелей, обогащенные складчатыми βслоями с поперечными межмолекулярными связями, причем детали процесса и свойства геля зависят от параметров окружающей среды. В предшествующих методиках время желатинизации часто составляло дни и недели для водных растворов природного белка шелка, а для повышения кинетики использовались такие параметры, как высокая температура и низкий рН. Такие условия, хотя и пригодны для введения некоторых биоактивных молекул, могут оказаться слишком медленными для введения активной клетки и лабильных биоактивных молекул.
Следовательно, в данной области техники существует необходимость в разработке способов быстрой желатинизации фиброина шелка при мягких физиологических условиях.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу желатинизации фиброина шелка. Способ желатинизации фиброина шелка согласно изобретению содержит обработку фиброина шелка, включая обработку ультразвуком в течение периода времени от 5 до 60 с для инициации желатинизации, где желатинизация фиброина шелка происходит менее чем за 24 ч после обработки ультразвуком, при этом фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН, 7,5 или выше.
Предпочтительно желатинизация фиброина шелка происходит менее чем за два часа после обработки ультразвуком. Причем фиброин шелка подвергают желатинизации в период времени в интервале от 5 мин до 2 ч после обработки ультразвуком. Обработку далее осуществляют с включением раствора соли, где раствор соли содержит ионы, выбранные из группы, состоящей из калия, кальция, натрия, магния, меди, цинка и их комбинаций.
Предпочтительно фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН, составляющим рН 4 или ниже, либо составляет рН 7,5 или выше, а соль является солью калия, концентрация соли менее 100 ммоль/л, а рН раствора соли составляет рН 4 или ниже.
Вариант осуществления изобретения также относится к способу регулирования времени желатинизации фиброина шелка путем ультразвуковой обработки раствора фиброина шелка в течение периода времени, достаточного для инициации желатинизации.
Способ регулирования времени желатинизации фиброина шелка путем обработки раствора фиброина шелка ультразвуком сргласно изобретению осуществляют в течение периода времени от 5 до 60 с для инициации желатинизации, где фиброин шелка подвергают желатинизации в течение примерно 2 ч при этом фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН, 7,5 или выше.
Предпочтительно фиброин шелка подвергают желатинизации в период времени в интервале от 5 мин до 2 ч после обработки ультразвуком, причем время желатинизации регулируют амплитудой обработки ультразвуком и концентрацией раствора фиброина шелка. Обработку далее осуществляют с включением раствора соли. Время желатинизации регулируют концентрацией раствора фиброина шелка и концентрацией раствора соли, где концентрация фиброина шелка составляет 4% (весовая концентрация) или ниже, раствор соли содержит ионы калия, и концентрация раствора соли калия находится в пределах от 20 до 100 ммоль/л. Время желатинизации регулируют концентрацией и рН раствора соли, где раствор соли содержит ионы калия, концентрация раствора соли калия находится в пределах от 20 до 100 ммоль/л и рН раствора составляет рН 4 или ниже. Предпочтительно время желатинизации составляет менее 2 ч.
Следующий вариант осуществления относится к инкапсуляции компонента в фиброин шелка. Способ инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка согласно изобретению включает обработку раствора фиброина шелка ультразвуком в течение периода времени от 5 до 60 с для инициации желатинизации, при этом фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН, 7,5 или выше; и введение компонента(ов) в раствор фиброина шелка до того, как произойдет желатинизация в растворе фиброина шелка; для получения компонента, инкапсулированного в фиброин шелка. Компонент может являться лечебным препаратом или биологическим материалом или и тем и другим. Также компонент может являться лечебным средством.
Предпочтительно компонент представляет собой по меньшей мере один биологический материал, выбранный из группы, содержащей клетки, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, пептиднуклеиновые кислоты, аптамеры, антитела, гормоны, ростовые факторы, цитокины, ферменты, антимикробные вещества и их комбинации. Причем указанные клетки являются стволовыми клетками. В фиброин шелка вместе с биологическим материалом может вводиться среда для роста клеток. При этом желатинизация происходит в течение 2 ч. Предпочтительно желатинизация происходит в период времени в интервале от 5
- 1 019118 мин до 2 ч. При этом обработку далее осуществляют с включением раствора соли. Предпочтительно фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН, составляющим рН 4 или ниже, либо составляет рН 7,5 или выше.
В другом варианте способ инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка включает введение компонента(ов) в раствор фиброина шелка, при этом фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН, 7,5 или выше; и обработку раствора фиброина шелка ультразвуком в течение периода времени от 5 до 60 с для инициации желатинизации; для получения компонента, инкапсулированного в фиброин шелка.
Еще одним аспектом заявленного изобретения является инкапсулированный в фиброин шелка биологический материал полученный вышеуказанным способом, где инкапсулированный в фиброин шелка биологический материал подходит для приспособления для биодоставки.
Как указано выше, способ включает ультразвуковую обработку раствора фиброина шелка в течение периода времени, достаточного для инициации желатинизации, и введение компонента в раствор фиброина шелка до того, как в растворе фиброина шелка произойдет значительная желатинизация, таким образом получая компонент, инкапсулированный в фиброин шелка. В качестве альтернативы, компонент может быть добавлен в фиброин шелка перед обработкой ультразвуком. Компонент может представлять собой лечебный препарат или биологический материал, такой как клетка. К примеру мезенхимальные стволовые клетки, происходящие из костного мозга человека (ЬМЗСз), были успешно введены в гидрогели фиброина шелка после обработки ультразвуком, за которой следовали быстрая желатинизация и поддержание клеточной функции.
Гидрогели, полученные согласно способу изобретения, демонстрируют хорошие механические свойства и профили протеолитической деградации. Например, обработанные ультразвуком растворы фиброина шелка 4, 8 и 12% (вес./об.), с последующим добавлением НМЗСз. желатинировались в период от 0,5 до 2 ч. Клетки росли и пролиферировали в 4% гелях в течение двадцати одного дня. Кроме того, низкие концентрации ионов К+ и низкие значения рН могут применяться для ускорения желатинизации.
Описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует желатинизацию фиброина шелка (8Е) при различных условиях обработки ультразвуком. Использовалось 0,5 мл водного раствора, обработка ультразвуком осуществлялась при амплитуде 20% и в течение времени от 5 до 30 с. Приведены средние величины ± стандартное отклонение не менее чем по N=3 образцам для каждой группы. *Значимые различия между группами (критерий Стьюдента, р<0,01).
Фиг. 2А-2С иллюстрируют динамическое формирование β-складчатых структур в течение процесса желатинизации. Фиг. 2А показывает измерения кругового дихроизма (СИ) для обработанных ультразвуком 2% (вес./об.) водных растворов фиброина шелка со сканированием длины волны каждые 8 мин после обработки ультразвуком в течение 120 мин. Фиг. 2В показывает график увеличения эллиптичности при длине волны 217 нм (пик, соответствующий структуре β-складчатого слоя), зарегистрированного в указанное время. Фиг. 2С является схематической иллюстрацией механизма желатинизации шелка. Процесс желатинизации включает два кинетических этапа (а) структурный переход от случайной спирали к структуре β-складчатого слоя с некоторыми межцепочечными физическими поперечными сшивками, образующимися за короткий промежуток времени; (Ь) распространение структуры β-складчатого слоя с образованием большого количества межцепочечных поперечных взаимодействий, свойственных βслоям, и организацией молекул в сеть геля за относительно длинный промежуток времени.
Фиг. 3А-3С демонстрируют влияние соли и рН на желатинизацию фиброина шелка. До обработки ультразвуком растворы в различной концентрации были дополнены К+ (фиг. 3А) и Са2+ (фиг. 3В) до конечных концентраций 20-200 мМоль. Фиг. 3С показывает влияние изменения рН водного раствора фиброина шелка перед обработкой ультразвуком. Ультразвуковая обработка проводилась при амплитуде 20% в течение 15 с для всех образцов. Приведены средние величины ± стандартное отклонение не менее чем по N=3 образцам для каждой группы. *Значимые различия между группами (критерий Стьюдента, р<0,05).
Фиг. 4А-4С демонстрирует графики анализа механических свойств гидрогелей фиброина шелка. Два верхних графика показывают опубликованные результаты для гидрогелей, не подвергавшихся обработке ультразвуком, а два нижних графика показывают результаты для гидрогелей, обработанных ультразвуком соответственно способу изобретения. Два графика слева демонстрируют эффекты напряжения при сжатии, а два графика справа демонстрируют эффекты модуля упругости при сжатии. Приготовление гидрогелей из водных растворов фиброина шелка (два верхних графика) проводилось при различных температурах, гидрогели, полученные обработкой ультразвуком (два нижних графика), были приготовлены при различных условиях обработки ультразвуком. Приведены средние величины ± стандартное отклонение не менее чем по N=3 образцам.
Фиг. 5 описывает ферментативную деградацию гидрогелей фиброина шелка. Гидрогели с концентрациями 4, 8 и 12% (вес./об.) были получены путем обработки ультразвуком и погружены либо в фосфатно-солевой буферный раствор рН 7,4 (контроль), либо в фосфатно-солевой буферный раствор, со
- 2 019118 держащий протеазу XIV (5 ед./мл) в течение семи дней. Остаточная масса была определена путем сравнения мокрого веса пробок геля в каждой временной точке с исходным мокрым весом. Приведены средние величины ± стандартное отклонение не менее чем по N=4 образцам.
Фиг. 6 графически описывает количественный анализ по ДНК клеток ИМ8С8, инкапсулированных в гидрогели фиброина шелка. Содержание ДНК в каждой группе гелей анализировалось с использованием красителя РюоСгссп. результаты нормализовались по значениям мокрого веса каждой пробки геля. Приведены средние величины ± стандартное отклонение не менее чем по N=4 образцам для каждой группы. *3начимые различия между группами (критерий Стьюдента, р<0,05).
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными методикой, протоколами, реагентами и тому подобными, которые описаны в данном тексте и, соответственно, могут варьировать. Терминология, используемая в данном тексте, применяется только с целью описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не предполагает ограничения объема настоящего изобретения, который определяется исключительно формулой изобретения.
Формы единственного числа, использованные в данном тексте и формуле изобретения, включают множественное число и наоборот, при условии, что контекст в явном виде не указывает на обратное. При использовании в данном тексте, за исключением рабочих примеров, либо случаев, где указано обратное, все числа, выражающие количества ингредиентов или условия реакции, следует понимать как преобразованные во всех возможных случаях определением примерно.
Все указанные патенты либо другие публикации в явном виде введены ссылкой с целью описания и раскрытия, например, методов, описанных в таких публикациях, которые могут применяться в связи с настоящим изобретением. Данные публикации приведены исключительно в связи с их раскрытием до даты подачи настоящей заявки на изобретение. При этом ничто не должно быть истолковано как допущение, что авторы настоящего изобретения не имеют права противопоставить такое раскрытие с более ранним приоритетом на основании предшествующего изобретения или по каким-либо иным причинам. Все утверждения касательно даты представления и содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не являются допущением в отношении дат либо содержания данных документов.
Если не указано обратное, все технические и научные термины, использованные в данном тексте, имеют то же значение, которое обычно предполагается специалистом в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя при применении или испытании изобретения могут использоваться различные известные методики, приспособления и материалы, при этом конкретные методики, приспособления и материалы описаны в данном тексте.
Настоящее изобретение относится к способу быстрой желатинизации фиброина шелка. Способ описывает подвергание фиброина шелка обработке, включающей обработку ультразвуком в течение периода времени, достаточного для инициации желатинизации. Данный подход предоставляет методики, основанные на обработке ультразвуком, применяемые для ускорения перехода золь-гель контролируемым по времени образом. Время желатинизации может регулироваться от минут до часов на основе используемых параметров ультразвуковой обработки (выходная мощность, длительность по времении другие) и концентрации фиброина шелка в пределах физиологически приемлемых условий. После обработки ультразвуком, фиброин шелка претерпевает быстрые структурные изменения от случайных спиралей в β-слои, соответственно желатинизации. Компонент, например лечебный препарат или биологический фактор, может быть добавлен до, во время либо после обработки ультразвуком и инкапсулирован в процессе желатинизации. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способы, полезные для различных биомедицинских целей, таких как те, в которых инкапсуляция клеток чувствительна ко времени.
Г идрогели рассматриваются как полезные связующие для инкапсуляции и доставки клеток и биоактивных молекул, например, в целях тканевой инженерии и клеточной терапии, благодаря высокому содержанию воды; обычно >30% (Рагк & Ьакек, ΒΙΟΜΑΤ8: ΙΝΤΡΟ. 2пб еб., Р1епит Рте88, ΝΥ, 1992). Гидрогели, используемые в подобных целях, обладают механическими и структурными свойствами, схожими с некоторыми тканями и внеклеточными матриксами (ЕСМ), следовательно, они могут быть имплантированы с целью восстановления ткани или локального высвобождения лечебных препаратов. Для инкапсуляции и доставки клеток гидрогели предпочтительно должны быть образованы без повреждения клеток, быть нетоксичными для клеток и окружающей ткани, быть биосовместимыми, обладать подходящей способностью к переносу вещества для обеспечения диффузии питательных веществ и метаболитов, обладать достаточной механической целостностью и устойчивостью к манипуляциям, связанным с имплантацией, иметь контролируемые времена жизни, и должны сохранять объем геля после имплантации в течение адекватного конкретным целям периода времени (Отиту & Моопеу, 24 ВютаК 4337-51 (2003).
Для образования гидрогелей используется множество таких синтетических материалов, как полиэтилен оксид (РЕО), поливиниловый спирт (ΡνΑ), полиакриловая кислота (РАА), сополимер полипропилен фумарата и этиленгликоля (Р(РЕ-СО-ЕО)), и такие вещества природного происхождения, как агароза,
- 3 019118 альгинат, хитозан, коллаген, фибрин, желатин и гиалуроновая кислота (НА). Желатинизация происходит, когда полимерные цепи сшиваются, химически или физически, в сети, что инициируется химическими реагентами (к примеру, кросс-линкерами) либо физическими стимуляторами (к примеру, рН и/или температура). Гидрогели, образованные синтетическими полимерами, предлагают преимущества в желатинизации и свойствах геля, которые контролируемы и воспроизводимы путем использования конкретных молекулярных весов, блочных структур и способа образования поперечных сшивок. Как правило, желатинизация природных полимеров в меньшей степени поддается контролю, хотя имеется тенденция к их использованию в качестве носителей клеток и биоактивных молекул для тканевой инженерии и имплантируемых медицинских устройств, так как их макромолекулярные свойства в большей степени схожи с таковыми внеклеточного матрикса, а продукты деградации не токсичны (Ьее е! а1., 221 1п!'1 1. Рйагша. 122 (2001); 81шЙ5гой е! а1., 8 ТгепФ Вю!есй. 71-78 (1990).
Среди биоматериалов природного происхождения белок фиброина шелка, самоорганизующийся структурный белок в природных нитях тутового шелкопряда, изучался из-за его прекрасных механических показателей, биосовместимости, контролируемых скоростей деградации и индуцируемого формирования кристаллической структуры сетей β-слоев (А1!тап е! а1., 24 Вютак. 401-16 (2003); Лп & Кар1ап, 424 №11 иге 1057-61 (2003); Ногап е! а1., 26 Вютак. 3385-93 (2005); К1т е! а1., 26 Вютак. 2775-85 (2005); кЫйа е! а1., 23 Масгото1еси1е8 88-94 (1990); №1/агоу е! а1., 5 Вютасгото1еси1е8 718-26 (2004)). Фиброин шелка производился как материал с различными формальными параметрами, включая пленки, трехмерный пористый матрикс, электроформованные волокна и микросферические частицы для целей тканевой инженерии и контролируемого высвобождения лекарственных препаратов (Лп е! а1., 5 Вютасгото1еси1е8 711-7 (2004); Лп е! а1., 3 Вютасгото1еси1е8, 1233-39 (2002); Ншо е! а1., 266 1. СоЛоИ 1п!ег£асе 8сь 68-73 (2003); Азпд е! а1., 117 1. СопЛо1 Ке1еа8е, 360-70 (2007)).
В природе водный раствор фиброина шелка производится в заднем отделе железы шелкопряда и затем хранится в среднем отделе в концентрации вплоть до 30% (вес./об.), при этом имеет высокое содержание случайных спиралей или альфа-спиральных структур. В процессе вытягивания нити на воздух, высокая сила трения и продольный поток вызывают самоорганизацию и структурный переход к структуре β-слоев, что ведет к образованию твердых нитей (Уо11га!Ь & Кшдй!, 410 Ыа!иге, 541-48 (2001)). Присутствие ионов металла и изменения рН в различных отделах железы влияет на этот переход (СНеп е! а1., 3 Вютасгото1еси1е8 644-8 (2002); 2йои е! а1., 109 1. Рйук. СНет. В 16937-45 (2005); Экко е! а1., 5 Вютасгото1еси1е8 704-10 (2004); Тепу е! а1., 5 Вютасгото1еси1е5 768-72 (2004)). 1п уйго водные растворы очищенного фиброина шелка претерпевают самоорганизацию в структуры (3-слоев и формируют гидрогели. На этот переход золь-гель оказывают влияние температура, рН и ионная сила (^апд е! а1., 36 1п!'1 1. Вю1. Масгото1. 66-70 (2005); К1т е! а1., 5 Вютасгото1еси1е8 786-92 (2004); Макито!о е! а1., 110 1. Р11У5. СНет. В 21630-38 (2006)). Предел прочности на сжатие и модуль гидрогелей шелка повышаются с увеличением концентрации фиброина шелка и температуры (К1т е! а1., 2004).
Гидрогели фиброина шелка представляют интерес для многих биомедицинских целей. Например, гидрогели фиброина применялись в качестве костных заменителей для лечения дефектов губчатой кости критических размеров в дистальной части бедра кролика, где гели шелка демонстрировали лучшее восстановление кости, чем сополимер (О.Ь лактид-гликолид), взятый в качестве контроля (Иш е! а1., 26 Вютак. 3527-36 (2005)).
Для многих областей применения клеточной терапии желатинизация должна быть индуцирована в относительно мягких условиях в относительно короткий промежуток времени (в течение часов). Если не рассматривать нефизиологические воздействия (такие как низкий рН, высокая температура, добавки), время желатинизации шелка может оказаться чрезмерно продолжительным в отсутствие химических модификаций природного белка фиброина шелка. Для концентраций фиброина шелка от 0,6 до 15% (вес./об.) время перехода золь-гель занимало от дней до недель при комнатной температуре или 37°С (К1т е! а1., 2004; Макито!о е! а1., 2006; Ига е! а1., 2005)). Добавление солей в концентрациях, превышающих физиологические уровни, незначительно изменяет кинетику желатинизации (К1т е! а1., 2004). Снижение рН (рН<5) или повышение температуры (>60°С) могло уменьшить время желатинизации до нескольких часов (К1т е! а1., 2004; Иш е! а1., 2005; Мойа е! а1., 15 1. Вюта!ег. 8сь Ро1утег. Ейи. 851-64 (2004)), но эти условия потенциально изменяют клеточную функцию и влияют на выживаемость клеток.
В настоящем изобретении новейшие способы улучшения технологии и контроля желатинизации фиброина шелка усовершенствованы посредством обработки ультразвуком. Более конкретно, представлен новый способ, основанный на обработке ультразвуком, что улучшает переход золь-гель контролируемым во времени образом. Механически, процедура индуцирует физическую сшивку β-слоев путем изменения гидрофобной гидратации белковых цепей фиброина. Способ позволяет добавлять клетки после обработки ультразвуком, за которой следует быстрая желатинизация. Время желатинизации может регулироваться от минут до часов путем выбора параметров обработки ультразвуком (выходная мощность и длительность) и концентраций фиброина шелка. Далее, способ обусловливает корректировку эффектов рН и концентрации соли на процесс желатинизации; динамические структурные изменения шелка после желатинизации; и поведение инкапсулированных клеток, таких, как мезенхимальные ство
- 4 019118 ловые клетки костного мозга человека (ЬМ8Ск), в гелях шелка.
В соответствии с настоящим изобретением может использоваться любой тип фиброина шелка. Фиброин шелка, производимый шелкопрядами, такими как ВотЬух топ, является наиболее распространенным и представляет собой экологически чистый, возобновляемый ресурс. Натуральные коконы шелкопряда являются коммерчески доступными. Существует, однако, множество видов шелка, включая шелк золотого кругопряда (№р11ба с1ау1рек), трансгенные шелка, генно-инженерные шелка и их варианты, которые могут быть использованы в качестве альтернативы. Водный раствор фиброина шелка может быть получен из коконов шелкопряда с применением техник, известных в данной области. Подходящие методики получения раствора фиброина шелка раскрыты, например, в ^0/2005/012606. К примеру, шелк, используемый в биополимерах шелка, может быть получен путем экстракции серицина из коконов В. топ.
Значимая желатинизация обычно происходит в течение 24 ч после обработки ультразвуком. Например, гель фиброина шелка образуется менее чем через четыре часа после обработки ультразвуком, к примеру, в течение 2 ч после обработки ультразвуком. В предпочтительном варианте воплощения фиброин шелка подвергается желатинизации в период времени от примерно 5 мин до примерно 2 ч после обработки ультразвуком. Таким образом, в зависимости от потребностей, время желатинизации может занимать от минут до часов, с учетом параметров обработки ультразвуком, используемых для изготовления раствора.
Процедуры обработки ультразвуком известны в данной области техники. Для целей настоящего приложения, термины ультрасоникация и обработка ультразвуком используются как взаимозаменяемые и имеют одно значение. Обработка ультразвуком может осуществляться любыми способами, известными в данной области техники, которые применимы к обработке ультразвуком фиброина шелка. Обработка ультразвуком может предусматривать однократную обработку ультразвуком фиброина шелка, либо включать в себя множество отдельных воздействий. Обработка ультразвуком изучалась в контексте структурных изменений белка (Меше1 е! а1., 71 1. Вютеб. Ма1ег. Век. А 25-34 (2004); Меше1 е! а1., 88 Вю1есЬио1. Вюеид. 379-91 (2004)), и применялась для получения больших зон фазовых границ жидкость-газ, эффектов локального нагрева, механического/сдвигового напряжения и реакций свободных радикалов. В отличие от этого, в других исследованиях, связанных с желатинизацией белков, собранные белковые нано-волокна в геле дробились на более мелкие фрагменты при ультразвуковом воздействии (Ниид е! а1., 32 Аии. Вютеб. Еид. 35-49 (2004)). В контексте золь-гель перехода для полимеров, обработка ультразвуком обычно использовалась для разрушения сетевых сшивок в геле и разжижения гидрогелей. Настоящее изобретение обусловливает новое применение обработки ультразвуком для стимуляции золь-гель перехода для шелка.
Обработка ультразвуком должна длиться в течение периода времени, достаточного для инициации процесса желатинизации, но не такого долгого, чтобы нарушались механические свойства гидрогеля. Обычно, обработка ультразвуком может длиться от примерно 5 с до примерно 60 с, в зависимости от количества используемого фиброина шелка, концентрации раствора и других факторов, определяемых специалистами в данной области техники. Например, обработка ультразвуком длится от примерно 15 с до примерно 45 с. Желатинизация обычно начинается в начале обработки ультразвуком и продолжается после окончания процедуры.
Обработка ультразвуком может включать другие виды воздействия, способствующие процессу желатинизации. Например, обработка может включать эффекты солевого раствора. Растворы солей известны в данной области техники как фактор, способствующий индукции желатинизации. Могут применяться обычные солевые растворы, содержащие ионы калия, кальция, натрия, магния, меди и/или цинка. Наличие калия в растворе соли может быть предпочтительно в данном контексте.
Обработка также включает регулирование рН водного раствора фиброина. Как известно в данной области техники, доведение рН водного раствора может способствовать индукции желатинизации. Более конкретно, эффективной может быть корректировка рН до более высоких или низких значений. Так, например, может применяться водный раствор с рН около рН 4 или ниже, либо примерно рН 7,5 или выше.
Особенно эффективным оказывается использование солевого раствора калия в низких концентрациях и с низким рН. Предпочтительный вариант осуществления изобретения ориентирован на использование соли калия, где концентрация соли менее 100 ммоль/л, а рН раствора около рН 4 или ниже.
Изобретение также предусматривает способ регулирования времени желатинизации фиброина шелка путем обработки раствора фиброина шелка ультразвуком в течение периода времени, достаточного для инициации желатинизации, при условии, что желатинизация займет не более примерно 2 ч. Обработка ультразвуком приводит к взаимодействиям между цепями фиброина шелка. Предпочтительный вариант осуществления предусматривает способ регулирования времени желатинизации таким образом, что фиброин шелка подвергается желатинизациии в течение временного промежутка от примерно пяти минут до примерно 2 ч после процедуры обработки ультразвуком.
Кроме того, для регулирования времени желатинизации могут применяться различные другие факторы. Например, время желатинизации может регулироваться изменением таких параметров, как амплитуда обработки ультразвуком и концентрация раствора фиброина шелка. Например, амплитуда находит
- 5 019118 ся в пределах от примерно 25% до примерно 35% выходной мощности (обычно от 7 до 10 Вт), а концентрация фиброина шелка находится в пределах от примерно 10% до примерно 15% (вес./об.). В следующем варианте осуществления изобретения, амплитуда находится в пределах от примерно 25% до примерно 55% выходной мощности (обычно, от 7 до 21 Вт), а концентрация фиброина шелка находится в пределах от примерно 5% до примерно 10% (вес./об.). Специалисты в данной области техники, опираясь на представленную патентную заявку, способны варьировать амплитуду обработки ультразвуком и концентрацию раствора фиброина шелка для достижения требуемой степени желатинизации и требуемого периода времени, за который происходит желатинизация.
Также, время желатинизации может регулироваться путем добавления солевого раствора и подбора концентрации раствора фиброина шелка и концентрации солевого раствора. Солевой раствор может включать ионы калия, но также возможно использование других солевых растворов. В конкретном варианте осуществления изобретения концентрация фиброина шелка составляет 4% (вес./об.) или ниже, а концентрация раствора соли калия находится в пределах от 20 до 100 ммоль/л.
Кроме того, время желатинизации может регулироваться подбором концентрации и рН солевого раствора, особенно если солевой раствор содержит ионы калия. В конкретном варианте осуществления изобретения солевой раствор представляет собой раствор соли калия с рН примерно рН 4 или ниже. Например, раствор соли калия имеет концентрацию от 20 до 100 ммоль/л.
Изобретение также относится к способу инкапсуляции не менее одного компонента в фиброин шелка. Способ включает в себя (а) подвергание раствора фиброина шелка обработке ультразвуком в течение периода времени, достаточного для инициации желатинизации; и (Ь) введение компонента в фиброин шелка до того, как в растворе фиброина шелка произойдет существенная желатинизация, тем самым образуя инкапсулированный в фиброин шелка компонент. Компонент может быть введен в раствор фиброина шелка до, во время, или после обработки ультразвуком.
Компонент может представлять собой любой материал, способный к инкапсуляции в гель фиброина шелка. Например, компонент может являться лечебным средством, таким как малые молекулы и препараты, либо биологическим материалом, таким как клетки (включая стволовые клетки), белки, пептиды, нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК, миРНК), пептид - нуклеиновые кислоты, аптамеры, антитела, гормоны, ростовые факторы, цитокины или ферменты. Инкапсуляция лечебных средств или биологического материала необходима, поскольку инкапсулированный продукт может применяться в биомедицинских целях.
При инкапсуляции лечебного средств препарат может быть введен в раствор фиброина шелка до, во время или после обработки ультразвуком, так как на большинстве лечебных препаратов обработка ультразвуком не сказывается отрицательным образом. С другой стороны, при инкапсуляции биологического материала обработка ультразвуком может негативно сказаться на биологическом материале, который, как правило, не должен быть введен в раствор фиброина шелка до окончания обработки ультразвуком. Возможно, эта мера не необходима для всех биологических материалов, но известно, что обработка ультразвуком повреждает или разрушает живые клетки, так что можно проявить предусмотрительность.
В случае, когда компонент вводится после обработки ультразвуком, могут быть подобраны такие условия обработки ультразвуком, что желатинизация занимает некоторый период времени после обработки ультразвуком. Если желатинизация происходит во время обработки ультразвуком или сразу после ее окончания, времени может оказаться недостаточно для введения лечебного средства в раствор фиброина шелка. Например, в случае, когда компонент вводится после обработки ультразвуком, фиброин шелка подвергается желатинизации в период времени от примерно 5 мин до примерно 2 ч после обработки ультразвуком.
Если компонент вводится до или во время обработки ультразвуком, желатинизация может происходить в течение обработки ультразвуком, сразу после либо в период времени по окончании обработки ультразвуком. Следовательно, если компонент вводится до или во время обработки ультразвуком, фиброин шелка может подвергаться желатинизации в пределах примерно 2 ч после обработки ультразвуком.
При введении в фиброин шелка лечебных средств или биологического материала также наряду с компонентом могут добавляться другие вещества, известные в данной области техники. К примеру, может возникнуть необходимость в добавлении веществ, которые способствуют росту компонента (для биологических материалов), содействуют функциональным свойствам компонента после его высвобождения из инкапсулирующего материала, или повышают выживаемость компонента или сдерживают его действие в период инкапсуляции. Вещества, известные как способствующие клеточному росту, включают среды для роста клеток, такие как модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (ΌΜΕΜ), эмбриональная бычья сыворотка (ЕВ8), незаменимые аминокислоты и антибиотики, и ростовые и морфогенетические факторы, такие как фактор роста фибробластов (ЕСЕ), трансформирующие ростовые факторы (ТСЕ§), фактор роста эндотелия сосудов (УЕСЕ), эпидермальный фактор роста (ЕСЕ), инсулиноподобный фактор роста (1СЕ-1), костные морфогенетические белки (ВМР§), факторы роста нервов и родственные белки. Дополнительные факультативные средства для доставки посредством гелей включают ДНК, миРНК, антисмысловые РНК, плазмиды, липосомы и родственные системы доставки генетических материалов; пептиды и белки, активирующие клеточные сигнальные каскады; пептиды и белки,
- 6 019118 способствующие минерализации или подобным клеточным событиям; адгезионные пептиды и белки для улучшения характеристик поверхностей раздела гель-ткань; антимикробные пептиды и белки и родственные соединения.
Лечебные средства или биологический материал, инкапсулированные в фиброин шелка, являются пригодными для применения в устройствах биодоставки. Технологии применения фиброина шелка в качестве устройства для биодоставки известны специалистам в данной области техники.
Структура гидрогеля фиброина шелка делает возможным наличие у средства биодоставки свойств контролируемого высвобождения. Контролируемое высвобождение позволяет осуществить предписанное дозирование во времени, с регулируемыми кинетиками высвобождения. В некоторых случаях доставка лечебных препаратов или биологического материала продолжается до мест, где необходимо лечение, например, дольше нескольких недель. Контролируемое во времени высвобождение, например, в течение нескольких дней или недель, или дольше, дает возможность продолжительной доставки лечебного средства или биологического материала для достижения целесообразных режимов лечения. Средство контролируемой доставки является эффективным, так как оно защищает лечебный препарат или биологический материал от деградации ίη νίνο в жидкостях тела и ткани, например, путем расщепления протеазами.
Далее, рассматривая способ индукции образования геля шелка с применением обработки ультразвуком, образцы водного раствора фиброина шелка объема 0,5 мл в концентрациях 1, 2, 6, 20% (вес./об.) обрабатывались ультразвуком, как описано ниже. Если поддерживать выходную мощность неизменной (амплитуда 20%), время желатинизации фиброина шелка снижалось с увеличением времени обработки ультразвуком (фиг. 1). Для каждого шага увеличения концентрации шелка от 1 до 6% (вес./об.), время желатинизации снижалось значительно (р 0,01 между *образцами на фиг. 1). Образец с концентрацией 20% (вес./об.) имел близкое или даже более продолжительное время желатинизации по сравнению с образцом 6% (вес./об.) (фиг. 1). Такой реультат для образца с концентрацией шелка 20% имеет место, скорее всего, вследствие высокой вязкости раствора, при которой ультразвуковые волны не могут эффективно распространяться в растворе. Если использовалась выходная мощность амплитуды свыше 30%, обработка ультразвуком приводила к образованию густой пены, и фиброин шелка не формировал гомогенного геля.
Это вспенивание не наблюдалось, если объем образца для обработки ультразвуком был повышен до 5 мл, даже при таких высоких значениях мощности как амплитуда 55%. Однако когда растворы с более высокими концентрациями шелка подвергались воздействию ультразвуком в объемах свыше 5 мл, происходила неравномерная желатинизация. Для оптимизации условий обработки ультразвуком и определений характеристик геля (рН, эффект солей и измерение кругового дихроизма (СО)) использовались малые объемы раствора шелка (без автоклавирования), а стерилизованные автоклавированием образцы растворов шелка были использованы для изучения механических свойств, деградации и инкапсуляции клеток. Примечательно, что, в сравнении с исходными растворами, автоклавирование не изменяет значительно использованные параметры обработки ультразвуком и связанные с ними времена желатинизации, предполагая, что после автоклавирования белок фиброина шелка сохраняет важнейшие свойства своей исходной структуры в растворе и способность к структурному переходу в форму β-слоев при формировании геля. Структурные изменения вследствие автоклавирования могут быть исследованы в дальнейшем, но этот аспект обусловливает упрощение производства фармацевтических продуктов в промышленных масштабах.
Как показывают наблюдаемые изменения при измерении СО, в процессе желатинизации фиброина шелка переход золь-гель был связан с увеличением частоты образования структур β-слоев (фиг. 2А). После обработки ультразвуком наблюдалось быстрое образование структур β-слоев, за которым следовал медленный переход, как показано по увеличению эллиптичности при 217 нм (фиг. 2В). Желатинизация фиброина шелка происходила в этой точке перехода, где начальное быстрое образование структур βслоев замедлялось. Этот переход согласуется с ранее предпринятыми исследованиями (Ма18ито1о с1 а1., 2006), что предполагает возможное участие схожих механизмов. Образование структур β-слоев происходит в результате изменения гидрофобных взаимодействий и последующего образования поперечных сшивок. За этапом инициации следуют медленная организация цепей и образование сети геля за период времени, относительно длительный по сравнению с изначальными изменениями, провоцируемыми обработкой ультразвуком. Этот двухэтапный механизм желатинизации шелка схематически изображен на фиг. 2С.
Изученные параметры, способные влиять на скорость желатинизации, могут быть рассмотрены как способ перечислить основные этапы природного процесса формирования волокна у шелкопряда. Ключевые параметры обработки включают эффекты обработки ультразвуком, как имитатора повышенной силы сдвига, имеющей место в переднем отделе железы шелкопряда, тип и концентрации катионов и рН.
Принято, что при обработке ультразвуком механическая вибрация вызывает образование и оседание пузырьков. В результате такой кавитации среда может подвергаться экстремальным локальным эффектам: нагрев (10000 К), высокое давление (200 бар) и высокая скорость деформации (107 с-1) (Раи1и88е
- 7 019118 & ЗуЬезша, 44 I. Ро1ут. 8с1.-Ро1ут. С1ет. 5445-53 (2006); Кеттеге е1 а1., 290 Масгото1. Ма1ег, Епд. 30210 (2005). Эти физические явления эксплуатировались в различных целях, включая самоорганизацию и желатинизацию сополимера Ν-изопропилакриламида/акриловой кислоты (8еИа е1 а1., 90 I. Арр1. Ро1ут. 8с1. 2449-52 (2003)), органических жидкостей с металлированными пептидами (Ео/ак! 119 Апдете С1ет. 2913-15 (2007)) и синтетических самоорганизующихся пептидов (Уоко1 е1 а1., 102 Ргос №11 Асаб 8с1 И8А 8414-19 (2005)). Помимо пептидов, такие белки, как сывороточный альбумин человека и миоглобин, исследовались с применением обработки ультразвуком как средством охарактеризовать агрегацию и самоорганизацию, связанные с болезненным состоянием (81а11юри1о5 е1 а1., 13 Рго1еш 8ск 3017-27 (2004); Ма8оп & Ре1ег8, РВАСТ1САЬ 8О№ОСНЕМ: И8Е8 & АРРЬ. кП'НЛ80к№Э (2п6 еб., СЫсйе81ег, \УеМ Зиззех, ик (2002)).
Учитывая широту спектра поведения полимерных систем в ответ на обработку ультразвуком, скорее всего, несколько физических факторов связаны с обработкой ультразвуком, включая локальные повышения температуры, механическая/сила трения и увеличение поверхностей раздела водной и воздушной фаз влияют на процесс быстрой желатинизации фиброина шелка. В особенности, изменения гидрофобной гидратации, вызванные обработкой ультразвуком, могут приводить к усиленному образованию физических поперечных сшивок, таких как начальное взаимодействие цепей, связанное с образованием β-слоев. В настоящем исследовании в течение процедуры обработки ультразвуком температура раствора повышалась от комнатной до 40-71°С на короткий период времени (5-6 мин), что отражает временный пик локальной температуры. В прошлом исследовании процесс желатинизации без обработки ультразвуком требовал нескольких дней, если грубый образец выдерживался при 60°С (К1т е1 а1., 2004). Следовательно, локальные температурные эффекты, вероятно, вносят вклад в повышение кинетики желатинизации, но не только ответственны за обнаруженные кратковременные ответные реакции. Локализованная динамика цепей и изменения в статусе гидратации гидрофобных цепей, на которые оказывает влияние временное повышение теипературы, вероятно, ответственны за образование гидрофобных физических поперечных сшивок.
Уникальные особенности последовательности гидрофобных блоков в белковых цепочках фиброина шелка особенно удобны для данного типа технологий из-за критической роли воды в регулировании взаимодействий внутри и между цепями (Лп е1 а1., 2003). Возможно, было бы полезно распространить данную технологию на другие биополимерные системы для определения вклада химии цепей в процесс сборки цепей, контролируемой обработкой ультразвуком. Были опубликованы данные по деградации коллагена, связанной с обработкой ультразвуком, как способу фрагментации цепей для облегчения исследований повторной сборки (С1гаи6-СиШе & Веззеаи, 113 I. 81гис1. Вю1. 99-106 (1994)). Следует заметить, что в настоящем изобретении способ обработки не приводит к значительной деградации цепей вследствие кратковременности обработки ультразвуком, что показано анализом разделения фрагментов в полнакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.
Перед обработкой ультразвуком водные растворы фиброина шелка были дополнены ионами К+ и Са2+ до различных физиологически приемлемых концентраций. Как показано на фиг. 3А, при низких концентрациях К+ (20-50 ммоль/л), время желатинизации значительно снижается с повышением концентрации К+ (р<0,05 между *образцами). Однако при высоких концентрациях К+ (100-200 ммоль/л), желатинизация подавлялась (фиг. 3А). Эти результаты были получены при концентрациях фиброина шелка от 0,5 до 8% (вес./об.). Для растворов с концентрацией фиброина шелка свыше 8%, не наблюдалось никакого эффекта соли, так как желатинизация происходила быстро во всех образцах (<2 мин). По сравнению с К+, Са2+ в тех же концентрациях индуцирует более медленный процесс желатинизации фиброина шелка (сравните фиг. 3А и 3В). Когда концентрации Са2+ были увеличены от 20 до 200 ммоль/л, время желатинизации фиброина шелка значительно снизилось (р<0,05 между *образцами на фиг. 3В). В отличие от этого, в предыдущей работе (К1т е1 а1., 2004) Са2+ способствовал желатинизации фиброина шелка, тогда как К+ не оказывал эффекта - результат, отличающийся от результатов, полученных способом настоящего изобретения.
Величина рН водного раствора фиброина шелка была подобрана перед обработкой ультразвуком с целью определения влияния рН на процесс желатинизации. Как снижение, так и повышение рН стимулировало желатинизацию (р<0,05 между *образцами на фиг. 3С). Эффект более низкого рН (рН<4) был более выраженным, чем эффект высокого рН (рН>9), при индукции желатинизации (р<0,05 между 0 образцами на фиг. 3С), что соотносится с предыдущими исследованиями (К1т е1 а1., 2004; Ма18ито1о е1 а1., 2006).
Кривые зависимости деформации гелей от напряжения, полученные по результатам определения механических свойств, демонстрировали линейную зависимость перед выходом на плато, предполагая, что гели имеют большие (~5-10% деформация), вероятно, вязко-упругие характеристики, после чего образование трещин индуцирует необратимые повреждения. Гели, изготовленные в данном исследовании, проявляли сходство с гелями, исследованными в предшествующей работе (К1т е1 а1., 2004), в том, что соответствующие концентрации фиброина шелка дают схожие значения величин как по устойчивости к деформации (фиг. 4А), так и по традиционному модулю упругости (фиг. 4В). Оба показателя, как оказалось, положительно коррелируют с концентрацией шелка в геле. При анализе, различия в концентра
- 8 019118 ции фиброина шелка (вес./об.) оказались более существенным определяющим фактором для конечных механических свойств гидрогеля, чем различия, вызванные изменением условий обработки ультразвуком (фиг. 4А и 4В). Подобным образом, значения равновесного модуля оказались положительно коррелирующими с концентрацией шелка в геле (фиг. 4С).
Высококонцентрированные, быстро формирующиеся гидрогели шелка показали лучшие механические свойства (табл. 1), если сравнивать с другими деградируемыми гидрогелями, инкапсулирующими клетки, такими как альгинатный гель, агарозный гель, гель, образованный поперечным сшиванием полиэтиленгликоля, фибриноген и другие системы (А1тапу & 8е11к1аг 26(15) Вюта!к. 4023-29 (2005); Коид е! а1., 24(22) Вюта18. 4023-29 (2003); Ниид е! а1., 2004; Вгуаи! е! а1., 86(7) Вю!есйио1 Вюеид 747-55 (2004); Каид е! а1., 77(2) 1. Вютей. Ма!ег. Век. А 331-39 (2006); ВоМеу е! а1., 20(1) Вюта!к. 45-53 (1999); Вгойег1ск е! а1., 72 1. Вютей. Ма!ег. Век. В-Арр1 Вюта!ег. 37-42 (2004); 2йаид е! а1., 15 1. Ма!ег. 8ск Ма!ег. Мей. 865-75 (2004)). Данные собирались на основе сходств между инкапсуляцией клеток и протоколов механических испытаний, в которых определялись значений любого из параметров традиционного или равновесного модуля.
Таблица 1. Сравнение механических свойств систем гелей из деградируемых полимеров, применяемых для инкапсуляции клеток
Вещество Традиционный модуль упругости (кПа) Список литературы
Гидрогели на основе шелка 369-1712 Иапд еб а1., 29 В1ошабз. 1054-64 (2007)
фибриноген и сополимер фибриноген-ПЭГа 0,02-4 А1тапу & ЗеЫкбаг, 2005
Поли(1,8октандиол цитрат) (РОС) 10,4 Капд еб а1., 2006
Сополимер ПЭГ диметакрилат РЬА (фотосшивка) 60-500 Вгуапб еб а1., 2004
желатин 0, 18 Кои1еу еб а1., 1999
Кросс-сшитые желатин, 8,13 Кои1еу еб а1., 1999
глютаральдегид
Оех-ΑΙ/ΡΝΙΡΑΆιη 5,4-27,7 2Капд еб а1., 2004
Альгинат (кальциевый метод кросс-сшивки)ά -25-125 ЗтпхбИ & Моопеу, 2003
вещество Равновесный модуль (кПа) Список литературы
Гидрогели шелка 63-441 Напд еб а1., 29 В1отаб5. 1054-64
Агароза (конечная концентрация 2 процента) -15 Нипд еб а1., 2004
а 5 мм диаметрх5 мм высота. Скорость деформации 1,5 мм/мин, модуль на основе средней величины наклона нижней части кривой напряжение-деформация (<15%).
ь 6 мм диаметрх2,4 мм высота. Скорость деформации 2 мм/мин, модуль на основе средней величины наклона начального участка кривой напряжение-деформация.
с 5 мм диаметрх 1 мм высота. Регулируемая нагрузкой скорость деформации 4 0-100 Мн/мин.
й 12,5 мм диаметрх 1,5 мм высота. Регулируемая нагрузкой скорость деформации 25 Мн/мин, эквивалент модуля Юнга по абсолютной величине наклона, полученного между силой начальной предварительной нагрузки 0,01 до 0,25 Н.
е 6 мм диаметр. Скорость деформации 0,5 мм/мин, модуль на основе средней величины наклона нижней части кривой напряжение-деформация.
- 9 019118 г 12,7 мм диаметрх2 мм высота. Скорость деформации 1 мм/мин. Модули упругости были получены по наклону кривой напряжение-деформация, в пределах первых 10% значений по шкале деформации. Равновесный модуль подсчитан, исходя из равновесного состояния напряжения и начальной площади сечения при деформации 10%.
Ранее изучалась ферментативная деградация (протеаза XIV) пленок фиброина шелка, твердых пористых платформ и нитей фиброина шелка (Ногап с1 а1., 2005; йш с1 а1., 2005; Ли с1 а1., 2005). При использовании той же концентрации протеазы (5 ед./мл), все гидрогели фиброина шелка быстро деградировали, с потерей около 80% массы в первые 4 дня, причем скорость деградации после этого значительно падала (фиг. 5). Деградация гидрогелей зависела от концентрации фиброина шелка. При повышении концентрации от 4 до 12% (вес./об.), время деградации, за которое теряется 50% массы, увеличилось от 1,5 дней до 3 дней (фиг. 5). Контрольные образцы, гидрогели фиброина шелка, инкубированные в фосфатно-солевом буферном растворе вместо протеаз, были стабильны в период инкубации (фиг. 5). Быстрая деградация (в течение дней) гидрогелей шелка вследствие протеолитических процессов может пригодиться для некоторых приложений, таких как в случаях заживления раны или быстрой доставки медикаментов. Однако следует заметить, что времена протеолитической деградации, обсуждаемые в данном тексте, соответствуют параметрам для системы ίη νίίτο; тогда как ίη νίνο время полу-жизни, как правило, длиннее, а временные рамки будут зависеть от типа ткани.
кМЗС'к успешно инкапсулировались в ряде систем гидрогелей, таких как полиэтилен гликоль, агароза, коллаген и альгинат, из-за потенциала этих клеток для репарации ткани или регенерации и долговременного высвобождения медикамента (см. МШс1тап е1 а1., 24 Майтх Βίο1. 208-18 (2005); Нийе1таи е1 а1., 27 Вюта1к.1377-86 (2006); Маиск е1 а1., 14 ОХеоаййг. СагШаде 179-89 (2006); Ье^ик & Наитии, 11 Т188ие Еид. 1015-22 (2005); Мащтйат е1 а1., 185 1. Се11 Ркукюк 98-106 (2000); Βοίκοη, 27 Тгеийк Ркагтасок Зс1. 652-58 (2006)). Гидрогели шелка с концентрацией белка менее 4% (вес./об.) трудно поддаются манипуляциям вследствие физических ограничений. Следовательно, для инкапсуляции кМЗС использовались гидрогели с концентрациями фиброина шелка 4, 8 и 12% (вес./об.). При всех трех концентрациях геля клетки сохраняли свою исходную округлую форму и гомогенное распространение в первый день. На шестой день некоторые клетки обнаруживали дефекты в 12% геле, и изменялась клеточная морфология. На двадцать первый день клетки в 4% геле оставались в неизмененном состоянии, по сравнению с днем первым, тогда как клетки в 8 и 12% гелях были в значительной степени деформированы и слипались. Гистологический анализ выявил, что кМЗСк внутри матрикса 4% геля сохраняют округлую форму и не агрегируют в период исследования, тогда как клетки возле поверхности гелей вырастали за пределы геля и изменяли морфологию от округлых до веретено-подобных, начиная с шестого дня. Все кМЗСк, веретено-подобные возле поверхности геля или округлые инкапсулированные в толще геля, были живы, как показано по свечению зеленой флуоресценции методом анализа выживаемости клеток. Следовательно, кМЗСк поддерживают свою активность и функцию в системе 4% гидрогеля шелка не менее двадцати одного дня. Однако кМЗСк в 8 и 12% гелях значительно меняют морфологию и многие из них умирают, слипаются и/или растворяются, как видно по образованию пустот на изображениях гистологических препаратов, при этом наблюдается очень малое количество зеленых флуоресцирующих точек при анализе выживаемости клеток. Контрольный гель шелка, не содержавший инкапсулированных клеток, демонстрировал сильный фон красной флуоресценции, который маскировал красную флуоресценцию от мертвых клеток при анализе выживаемости клеток.
Данные наблюдения и заключения далее были подтверждены количественным анализом ДНК (анализ с использованием красителя Р^Стеен) (фиг. 6). Клетки заметно пролиферировали дольше первых шести дней во всех трех гидрогелях (р<0,05 между *образцами на фиг. 6). Касательно 4% геля, количество клеток перестало возрастать после шести дней, указывая на то, что достигнута максимальная вместимость геля для пролиферации клеток. Похожее явление наблюдалось в других системах гидрогелей, таких как ПЭГ и альгинатный гель (ШШетап е1 а1., 2006; Ватй1 е1 а1., 207 Ехр. Се11 Век. 449-54 (1993)). Что касается 8 и 12% гелей, то количество клеток в них снижалось через шесть дней, что согласуется с микроскопическим исследованием, гистологическими наблюдениями и результатами анализа выживаемости клеток. Потеря активности в гелях повышенной концентрации, вероятно, происходит вследствие ограничения обмена вещества, но также может быть следствием механических помех, сопутствующих высоким концентрациям геля. Возможность того, что гели шелка токсичны для клеток кМЗСк, исключена, так как кМЗСк, растущие на поверхности гелей шелка 4, 8 и 12% имели те же скорости роста, что и клетки, растущие в контрольной культуральной чашке, и клеточная морфология (форма веретена) была похожа для всех групп. Оптимизация условий стабилизации гелей низких концентраций (1 и 2%) может быть разработана следом за идеей, предложенной в данном тексте, а скорости диффузии кислорода и питательных веществ через гели шелка различной концентрации могут быть изучены подробно.
В данном тексте приведен новый метод, основанный на обработке ультразвуком, что делает возможным быстрое формирование гидрогелей фиброина шелка. Желатинизация может быть вызвана в период от минут до часов, в зависимости от таких параметров обработки ультразвуком, как выходная мощность и длительность. Желатинизация сопровождалась образованием структур β-слоев, вследствие изме
- 10 019118 нения гидрофобной гидратации. Низкие концентрации К+ и низкий рН повышают скорость желатинизации, тогда как присутствие Са2+ и высокие концентрации К+ предотвращают желатинизацию. Гидрогели фиброина шелка обладают механическими свойствами, превосходящими таковые для других систем, описанных ранее, в промежутке 369-1712 кПа, судя по модулю упругости при сжатии. Механическая прочность геля возрастает с повышением концентрации раствора фиброина шелка. Гидрогели с 4% (вес./об.) содержанием фиброина шелка были пригодны к инкапсуляции ЬМ8Ск; клетки в течение недель сохраняли жизнеспособность и пролиферацию в статичных условиях культивировния.
Далее настоящее изобретение будет охарактеризовано следующими примерами, которые предусмотрены как примерные варианты осуществления изобретения.
Примеры
Пример 1. Растворы фиброина шелка.
Исходные водные растворы фиброина шелка были приготовлены, как описано ранее (8ойа е! а1., 54
1. Вюшеб. Ма1ет. Век. 139-48 (2001)). Вкратце, коконы В. шоп варились 40 мин в водном растворе 0,02 М карбоната натрия и затем были тщательно промыты чистой водой. После высушивания экстрагированный фиброин шелка растворяли в 9,3 М растворе МВт при 60°С в течение 4 ч, в результате получали 20% (вес./об.) раствор. Для удаления соли этот раствор подвергался диализу против дистиллированной воды с использованием кассет для диализа 81|бе-а-Ьухег (МХУС’О 3,500, Йетсе, ВоскГогб. 1Ь) в течение двух дней. После диализа раствор был оптически прозрачным, он центрифугировался для удаления малых количеств агрегатов шелка, которые образовывались в процессе выделения, обычно от загрязнений из окружающей среды, которые присутствуют на коконах. Конечная концентрация водного раствора фиброина шелка составляля приблизительно 8% вес./об.). Эта концентрация была определена путем взвешивания остатка твердого вещества из известного объема раствора, после высушивания. Растворы шелка с более низкими концентрациями были приготовлены путем разведения 8% раствора водой. Для получения раствора шелка с высокой концентрацией 8% раствор в кассетах для диализа 8Кбе-а-Ьу/ег (МХУС’О 3,500, Йетсе) подвергался диализу против 10% (вес./об.) раствора ПЭГ (10000 г/моль) при комнатной температуре не менее 24 ч (Ли & Кар1ап, 2003; К1ш е! а1., 2004). Объем доводился водой до достижения нужной концентрации. Все растворы хранились при 4°С перед использованием.
Пример 2. Растворы шелка с различными концентрациями соли и рН.
Для того чтобы определить, какое влияние оказывает концентрация соли на желатинизацию шелка, к растворам шелка добавлялись исходные 1 М растворы КС1 и СаС12 до достижения конечных концентраций соли от 20 до 200 ммоль/л. Для определения влияния рН раствора на желатинизацию, растворы шелка титровались 1 М растворами НС1 или ИаОН, а значение рН отслеживалось с помощью рН-метра.
Пример 3. Подбор условий желатинизации шелка.
Для определения желатинизации шелка при различных условиях обработки ультразвуком 0,5 мл водного раствора шелка в пробирке ЕррепбогГ объемом 1,5 мл подвергались обработке ультразвуком на ультразвуковом аппарате Вгапкоп 450 (Вгапкоп ИИгакошск Со., ОапЬиту, СТ), который содержал источник электропитания модель 450, конвертор (№ детали 101-135-022), зонд 1/2 дюйма для дезинтеграции с наружной резьбой (№ детали 101-147-037) и конический микрозонд с диаметром 1/8 дюйма (№ детали 101148-062). Выходная мощность варьировалась от 10 до 50% амплитуды (3-21 Вт), а время обработки ультразвуком варьировалось от 5 до 30 с. Для определения влияния солей и рН на процесс желатинизации, аликвоты 0,5 мл растворов щелка, приготовленных как описано выше, обрабатывались ультразвуком при 20% амплитуды (7 Вт) и 15 с. После обработки ультразвуком растворы инкубировались при 37°С, а переход золь-гель отслеживался визуально путем переворачивания пробирки и проверки изменения прозрачности раствора (Ма15ишо1о е! а1.).
Опираясь на предварительные результаты, концентрации фиброина шелка вплоть до 12% (вес./об.) использовались для поддержания низкой вязкости, и 12% раствор желатинизировался быстрее, чем образцы с 8% и 4% растворами. Эти результаты изложены в табл. 2, ниже.
Таблица 2. Время желатинизации водного раствора фиброина шелка после обработки ультразвуком в большом объеме (5-7 мл)
7 Вт, 30 сек 10 Вт, 30 сек 15 Вт, 30 сек 21 Вт, 30 сек
4% (вес/объем) Не образуется рель в течение недели Не образуется гель в течение недели 5 дней 12 часов (1-2 часа после повторной обработки ультразвуком)
- 11 019118
д% (вес/объем) 6 дней 22-24 часа 45-60 мин 15-30 мин
12% (вес/объем) 4 дня 1,5-2 часа 15-30 мин Образование геля в пробирке
Примечание: время желатинизации оценивалось и усреднялось по результатам не менее двух независимых экспериментов.
Пример 4. Круговой дихроизм (СП).
Аликвота 2% водного раствора шелка объемом 0,5 мл подвергалась воздействию ультразвуком при амплитуде 20% (7 Вт) в течение 30 с, и немедленно вносился в многослойную кварцевую ячейку с длиной пробега 0,01 мм (Νονα Вю1ес1г Е1 Са|оп. СА). Измерения СИ проводились с помощью СИ спектрофотометра 1а5со-720 (1а5со Со., 1арап). Все образцы сканировались при 37°С со временем накопления 4 с при скорости 100 нм/мин, усреднялись результаты экспериментов, повторенных 4 раза. Для измерения кинетики образования структур β-слоев шелка в течение 2,5 ч отслеживались изменения эллиптичности при 217 нм, измерения проводились каждые 10 с.
Пример 5. Механические испытания.
Для удовлетворения условиям механического испытания обработкой ультразвуком были приготовлены большие объемы геля шелка. Растворы шелка 4, 8 и 12% (вес./об.) в стеклянных колбах автоклавировались в 20 мин при 121°С. Автоклавированный раствор был дополнен стерильным порошком Модифицированной по методу Дульбеко Среды Игла (ИМЕМ порошок, 1пуйгодеп, СагИЬаб, СА) и бикарбонатом натрия (8щта-А1бпс1г 81. Ьоищ, МО) до концентрации 0,135 г/мл и 0,037 г/мл соответственно. Полученный раствор имел рН 7,4, что было проверено с применением рН-метра. Аликвота раствора объемом 7 мл вносилась в пластиковую пробирку Еа1соп объемом 15 мл и затем обрабатывалась ультразвуком при амплитудах 20, 30, 40% (7, 10, 15 Вт соответственно) в течение 30 с. Шесть мл обработанного ультразвуком раствора добавлялись в малые культуральные чашки (ВИ Еа1соп™, № 35-3001, ВИ Вюкаепсек, Ра1о А11о, СА), которые визуально оценивались в инкубаторе на 37°С с течением времени, с целью сближения параметров клеточной культуры, до тех пор, пока не завершилась желатинизация, что оценивалось по свойству непрозрачности и конденсации на поверхности геля. Затем сразу после желатинизации штамповались пробки диаметром 9,525 мм (2-3 мм в высоту) для механического испытания. Гелевые пробки предварительно помещались в полный раствор ИМЕМ (О1Ьсо/1пуйгодеп) на не менее чем 1 ч перед тестированием.
Все образцы были погружены в ИМЕМ для хранения и испытывались в пределах 24 ч. Образцы оценивались на разрывной машине Инстрон 3366 (Шпуооб, МА), оснащенной плитой для испытания на неограниченное сжатие и датчиком нагрузки 100 Н. Метод удлинения при сжатии был проведен при скорости удлинения 1 мм/мин. Определялись сжимающее напряжение и деформация, и на основе полуавтоматической методики был определен модуль упругости. Диаграмма зависимости деформации от напряжения была разделена на 8 сегментов ниже уровня отсечки напряжения, установленного за пределами начальной линейной области диаграммы. Используя способ подбора кривой методом наименьших квадратов, среди этих восьми сегментов сегмент с наибольшим уклоном кривой был определен как модуль упругости при сжатии для данного образца. Устойчивость к сжимающим нагрузкам определялась с применением метода определения предела текучести. Линия была нарисована параллельно линии модуля, но со смещением длины испытываемой части образца на 0,5%. Соответствующее значение напряжения, при котором смещенная линия пересекает кривую напряжение-деформация, было определено как устойчивость матрикса к сжимающим нагрузкам. Данный анализ проводился согласно модификациям к методу А8ТМ Е451-95.
Для оценки влияния условий обработки ультразвуком на механические рабочие характеристики испытания на неограниченное сжатие были проведены, следуя двум режимам. Во-первых, испытание напряжением до отказа применялось для выявления общепринятой характеристики материала - свойства жесткости, и для обнаружения предела безотказности (А1тапу & 8е11к!аг 26(15) ВютаК 2467-77 (2005); Копд е! а1., 24(22) ВютаК 4023-29 (2003)). Во-вторых, испытание на снятие напряжения использовалось для оценки свойств равновесного модуля, и проводилось на основе тестовых параметров, предложенных Нипд и соавторами (32 Апп. Вюшеб. Епд. 35-49 (2004)). Вместе, эти измерения предоставили возможность широкого сравнения с опубликованными свойствами других деградируемых гидрогелей, применяемых для инкапсуляции клеток. В каждой представленной группе оценивались N=4 образца, они анализировались с помощью разрывной машины Инстрон 3366 (Шпоооб, МА), оснащенной плитой для испытания на неограниченное сжатие и датчиком нагрузки 100 Ньютон, а данные выборки экспортировались с использованием программного обеспечения В1иеНб1 версии 2.0.
При испытании напряжением до отказа каждый образец сжимался при контролируемой скорости удлинения в 1 мм/мин, достигались нагрузки, начиная с номинального веса тары, и регистрировались высоты образца. Напряжение при сжатии и деформация были определены путем нормализации по геометрии образцов, а традиционный модуль упругости был вычислен как наклон касательной линии, ус
- 12 019118 тановленной в области 5% деформации каждой кривой напряжение-деформация. Предел текучести определялся при смещении линии параллельно касательной к кривой в точке 2% деформации; точка, где касательная пересекала кривую напряжение-деформация, была определена как предел текучести (который совпадает с пределом безотказности). При испытании на снятие напряжения, образцы были погружены в фосфатно-солевой буферный раствор и оставлены под номинальной нагрузкой тары на 200 с. После этого образцы сжимались при скорости 1 мм/с до достижения деформации 10% и выдерживались 20 мин. Равновесный модуль был вычислен путем нормировки снятия напряжения по 10% деформации.
Пример 6. Ферментативная деградация гелей шелка ίη νίίτο.
Пробки геля шелка (диаметр=4 мм; высота=2-3 мм) с концентрацией 4, 8, 12% (вес./об.) были получены, как описано выше, и затем погружены в 1 мл раствора протеазы XIV (81дта-А1бг1сй) в 24луночном планшете. Раствор протеазы был свежеприготовлен путем растворения сухого фермента в фосфатно-солевом буферном растворе до достижения концентрации 5 ед./мл и заменялся на вновь приготовленный раствор каждые 24 ч. Контрольные пробки были погружены в 1 мл фосфатно-солевого буферного раствора, который также заменялся каждые 24 ч. Все образцы инкубировались при 37°С. В дни 1, 2, 3, 4 и 7 четыре пробки промывались водой, протерты тонкой бумагой для удаления излишков воды с поверхности геля, и взвешены.
Пример 7. Высев и культивирование 1ιΜ8ί.'κ в гелях шелка.
Клетки 11М8С5 были выделены из свежего цельного костного мозга, полученного путем аспирации от давших согласие доноров (С1опебс-Ро1ейс8, ΑαΙΚοΓενίΙΙο. ΜΌ), как описано ранее (Мете1 е! а1., 71 1. Вютеб. Ма!ег. Век. А 25-34 (2004); Мете1 е! а1., 88 Вю1есЬпо1. Вюепд. 379-91 (2004)). Культура наращивалась в среде роста, содержащей 90% ΌΜΕΜ, 10% эмбриональной бычьей сыворотки (РВ8), 0,1 ммоль/л незаменимых аминокислот, 100 ед./мл пенициллина, 1000 ед./мл стрептомицина, 0,2% противогрибкового средства фунгизон и 1 нг/мл основного фактора роста фибробластов (ЬРСР). Перед использованием клетки, пересеянные 3-4 раза, собирались с культуральных чашек с помощью обработки трипсином и ресуспендировались в ΌΜΕΜ до получения плотности клеток 5х107 клеток/мл. Пятнадцать мл раствора шелка с концентрациями 4, 8 и 12% (вес./об.) стерилизовались паром (автоклавировались) и к ним добавлялись сухая среда ΌΜΕΜ и бикарбонат натрия, как описано выше. Аликвота объемом 5 мл вносилась в пластиковую пробирку Га1соп на 15 мл, всего для каждой концентрации шелка были использованы две пробирки (контрольная и засеянная клетками). Раствор 4% (вес./об.) шелка (5 мл) был обработан ультразвуком в вытяжном шкафу с ламинарным потоком при 50% амплитуде в течение 30 с, и через 30 мин инкубации раствор был повторно обработан ультразвуком в тех же условиях. После второй обработки ультразвуком раствор охлаждался до комнатной температуры в пределах 5-10 мин, затем добавлялись 50 мл клеточной суспензии и перемешаны с раствором шелка, обработанным ультразвуком, для достижения конечной концентрации 5х105 клеток/мл. Контрольный образец обрабатывался ультразвуком тем же способом, но к нему после обработки ультразвуком вместо клеточной суспензии были добавлены 50 мл ΌΜΕΜ. Аликвоты объемом 1,5 мл смеси были быстро накапаны пипеткой в лунки 12луночного культурального планшета, для каждой группы образцов было приготовлено три лунки. Растворы шелка 8 и 12% (вес./об.) обрабатывались ультразвуком один раз при амплитудах 40% и 30% соответственно в течение 30 с. К раствору шелка добавлялась аликвота суспензии 1ιΜ8ί.' объемом 50 мл, и смесь высевалась, как описано выше. Затем все планшеты инкубировались при 37°С и 5% СО2.
Как только шелк желатинизировался в планшетах в пределах 0,5-2 ч, из гелей штамповались маленькие пробки (диаметр=4 мм; высота=2-3 мм) и помещались в лунки нового 24-луночного планшета. Затем пробки культивировались при 37°С и 5% СО2 в 1 мл среды роста, содержащей 90% ΌΜΕΜ, 10% эмбриональной бычьей сыворотки (РВ8), 0,1 ммоль/л незаменимых аминокислот, 100 ед./мл пенициллина, 1000 ед./мл стрептомицина и 0,2% противогрибкового средства фунгизон. Для микроскопирования были приготовлены клетки ΗΜδΠ инкапсулированные гелями шелка в объеме 0,5 мл, который культивировался при тех же условиях, что описаны выше, в 1 мл той же среды роста в 24-луночных планшетах, а изображения были получены в необходимые временные точки.
Пример 8. Анализ клеток 1ιΜ8ί.'4 инкапсулированных в гели шелка.
Фазово-контрастная микроскопия - на 2, 6, 14 и 21 дни культивирования проводился анализ клеточной морфологии с помощью фазово-контрастной световой микроскопии на приборе (Саг1 2е1кк, 1епа, Сегтапу), оснащенном 8опу Εx^аνе НАЛ 3 ПЗС цветной видеокамерой.
Пролиферация клеток - пролиферация клеток определялась анализом ДНК. Вкратце, в каждой временной точке 4 гелевые пробки из каждой группы промывались фосфатно-солевым буферным раствором рН 7,4, взвешивались (мокрый вес) и измельчались микро-ножницами на льду. Содержание ДНК (N=4) измерялось с использованием красителя Рюобгееп ^окс^ат РгоЬек, Бидеые, ОВ), согласно инструкциям изготовителя. Образцы измерялись флуорометрически при длине волны возбуждения 480 нм и длине волны испускания 528 нм. Содержание ДНК высчитывалось на основе стандартной кривой, полученной тем же способом, и далее нормализовалось по весу мокрого вещества каждой пробки геля.
Выживаемость клеток: выживаемость 1ιΜ8ί.'κ в пробках геля исследовалось методом анализа выживаемости клеток (Μо1еси1а^ РгоЬек, Бидеые, ОВ). Вкратце, по окончании культивирования гелевая пробка
- 13 019118 каждой группы, засеянная клетками ЬМЗСк, промывалась фосфатно-солевым буферным раствором, разрезалась на две половины и инкубировалась в 2 ммоль/л растворе кальцеина АМ (окрашивание живых клеток) и 4 ммоль/л растворе гомодимера этидия (ΕΐΗΌ-1, окрашивание мертвых клеток) в фосфатносолевом буферном растворе в течение 30 мин при 37°С. Изображения поперечного сечения разрезанного геля получены с помощью конфокальной микроскопии на приборе (Βίο-Каб МКС 1024, Нсгси1с5. СА) с программным обеспечением Ьазегайатр 2000 (возбуждение/испускание ~495 нм/~515 нм). Микроснимки глубинной проекции были получены с использованием серий горизонтальных срезов, представленных на различных расстояниях друг от друга (с нарастанием 1-10 мкм), на основе суммарной высоты хорошо определенной клеточной колонии. Были собраны кадровые изображения на различной глубине, и серии микроснимков позже были собраны для получения изображений, компилированных по оси ζ (по аппликате).
Гистология. Гели шелка, засеянные клетками, промывались фосфатно-солевым буферным раствором и фиксировались 10% нейтральным буферным формалином в течение 2 дней перед гистологическим анализом. Образцы дегидратировались путем серий фракционирования этанолом, залиты парафином, и затем получена серия срезов толщиной 5 мм. Для гистологического анализа срезы были освобождены от парафина, регидратированы путем серий фракционирования этанолом и окрашены гематоксилином и эозином (Н&Е).
Пример 9. Статистические данные.
Статистический анализ был проведен с использованием критерия Стьюдента. Различия рассматривались как значимые при рр 0,05 и высоко значимыми при рр 0,01.

Claims (27)

1. Способ желатинизации фиброина шелка, включающий обработку фиброина шелка ультразвуком в течение периода времени от 5 до 60 с для инициации желатинизации, где желатинизация фиброина шелка происходит менее чем за 24 ч после обработки ультразвуком, при этом фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН 7,5 или выше.
2. Способ по п.1, где желатинизация фиброина шелка происходит менее чем за два часа после обработки ультразвуком.
3. Способ по п.1, где фиброин шелка подвергают желатинизации в период времени в интервале от 5 мин до 2 ч после обработки ультразвуком.
4. Способ по п.1, где дополнительно при обработке используют раствор соли.
5. Способ по п.4, где используют раствор соли, содержащий ионы калия, кальция, натрия, магния, меди, цинка или их комбинаций.
6. Способ по п.5, где используют раствор соли калия с концентрацией менее 100 ммоль/л и рН 4 или ниже.
7. Способ регулирования времени желатинизации фиброина шелка путем обработки раствора фиброина шелка ультразвуком в течение периода времени от 5 до 60 с для инициации желатинизации, где фиброин шелка подвергают желатинизации в течение примерно 2 ч, и при этом фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН 7,5 или выше.
8. Способ по п.7, где фиброин шелка подвергают желатинизации в период времени в интервале от 5 мин до 2 ч после обработки ультразвуком.
9. Способ по п.7, где время желатинизации регулируют амплитудой обработки ультразвуком и концентрацией раствора фиброина шелка.
10. Способ по п.7, где дополнительно при обработке используют раствор соли.
11. Способ по п.10, где время желатинизации регулируют концентрацией раствора фиброина шелка и концентрацией раствора соли.
12. Способ по п.11, где концентрация фиброина шелка составляет 4% (весовая концентрация) или ниже, раствор соли содержит ионы калия и концентрация раствора соли калия находится в пределах от 20 до 100 ммоль/л.
13. Способ по п.12, где время желатинизации регулируют концентрацией и рН раствора соли.
14. Способ по п.13, где используют раствор соли калия с концентрацией в пределах от 20 до 100 ммоль/л и рН 4 или ниже.
15. Способ инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка, включающий обработку раствора фиброина шелка ультразвуком в течение периода времени от 5 до 60 с для инициации желатинизации, при этом фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН 7,5 или выше; и введение компонента(ов) в раствор фиброина шелка до того, как произойдет желатинизация для получения компонента, инкапсулированного в фиброин шелка.
16. Способ по п.15, где используют компонент, который является лечебным препаратом и/или биологическим материалом.
- 14 019118
17. Способ по п.16, где используют компонент, который представляет собой по меньшей мере один биологический материал, выбранный из группы, содержащей клетки, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, пептид-нуклеиновые кислоты, аптамеры, антитела, гормоны, ростовые факторы, цитокины, ферменты, антимикробные вещества и их комбинации.
18. Способ по п.17, где в качестве клеток используют стволовые клетки.
19. Способ по п.17, где в фиброин шелка вместе с биологическим материалом вводят среду для роста клеток.
20. Способ по п.16, где используют компонент, который является лечебным препаратом.
21. Способ по п.15, где желатинизация происходит в течение 2 ч.
22. Способ по п.15, где желатинизация происходит в период времени в интервале от 5 мин до 2 ч.
23. Способ по п.15, где дополнительно при обработке используют раствор соли.
24. Способ инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка, включающий введение компонента(ов) в раствор фиброина шелка, при этом фиброин шелка находится в форме водного раствора с рН 7,5 или выше; и обработку раствора фиброина шелка ультразвуком в течение периода времени от 5 до 60 с для инициации желатинизации с получением компонента, инкапсулированного в фиброин шелка.
25. Способ по п.24, где используют компонент, который является лечебным препаратом.
26. Способ по п.24, где желатинизация происходит в течение примерно 2 ч.
27. Способ по п.24, где желатинизация происходит в период времени в интервале от 5 мин до 2 ч.
EA200971116A 2007-05-29 2008-05-29 Способ желатинизации фиброина шелка и регулирования времени желатинизации, способ инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка (варианты) EA019118B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US94055407P 2007-05-29 2007-05-29
PCT/US2008/065076 WO2008150861A1 (en) 2007-05-29 2008-05-29 Method for silk fibroin gelation using sonication

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200971116A1 EA200971116A1 (ru) 2010-04-30
EA019118B1 true EA019118B1 (ru) 2014-01-30

Family

ID=40094093

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200971116A EA019118B1 (ru) 2007-05-29 2008-05-29 Способ желатинизации фиброина шелка и регулирования времени желатинизации, способ инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка (варианты)

Country Status (20)

Country Link
US (4) US8187616B2 (ru)
EP (1) EP2211876B1 (ru)
JP (2) JP2010529230A (ru)
KR (2) KR20100029217A (ru)
CN (2) CN104013598A (ru)
AU (1) AU2008260156B2 (ru)
BR (1) BRPI0813312A2 (ru)
CA (1) CA2688431C (ru)
CY (1) CY1116090T1 (ru)
DK (1) DK2211876T3 (ru)
EA (1) EA019118B1 (ru)
ES (1) ES2527125T3 (ru)
HK (1) HK1201470A1 (ru)
HR (1) HRP20141265T1 (ru)
IL (1) IL202354A (ru)
MX (1) MX2009012978A (ru)
PL (1) PL2211876T3 (ru)
PT (1) PT2211876E (ru)
SI (1) SI2211876T1 (ru)
WO (1) WO2008150861A1 (ru)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6092337A (ja) * 1983-10-26 1985-05-23 Sekisui Plastics Co Ltd 発泡フエノ−ル樹脂成形物の製造方法
EP1558444B1 (en) * 2002-06-24 2016-09-21 Tufts University Silk biomaterials and methods of use thereof
WO2004062697A2 (en) 2003-01-07 2004-07-29 Tufts University Silk fibroin materials and use thereof
WO2005012606A2 (en) 2003-04-10 2005-02-10 Tufts University Concentrated aqueous silk fibroin solution and use thereof
WO2005000483A1 (en) * 2003-06-06 2005-01-06 Tufts University Method for forming inorganic coatings
KR101368748B1 (ko) 2004-06-04 2014-03-05 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈 인쇄가능한 반도체소자들의 제조 및 조립방법과 장치
EP2101975A2 (en) 2006-11-03 2009-09-23 Trustees of Tufts College Biopolymer sensor and method of manufacturing the same
WO2008127403A2 (en) * 2006-11-03 2008-10-23 Trustees Of Tufts College Biopolymer optofluidic device and method of manufacturing the same
EP2086749B1 (en) 2006-11-03 2013-05-08 Trustees Of Tufts College Nanopatterned biopolymer optical device and method of manufacturing the same
US9102916B2 (en) * 2007-02-27 2015-08-11 Trustees Of Tufts College Tissue-engineered silk organs
KR20100029217A (ko) 2007-05-29 2010-03-16 트러스티즈 오브 터프츠 칼리지 음파 처리를 이용한 실크 피브로인 겔화 방법
JP2011511668A (ja) * 2008-02-07 2011-04-14 トラスティーズ オブ タフツ カレッジ 3次元絹ハイドロキシアパタイト組成物
GB0807868D0 (en) * 2008-04-30 2008-06-04 Knight David P Cartilage repair material and a method for the preparation thereof
JP5727366B2 (ja) * 2008-05-15 2015-06-03 タフツ ユニバーシティー/トラスティーズ オブ タフツ カレッジ 絹ポリマーに基づくアデノシン放出:てんかんに対する潜在的治療能力
US8501172B2 (en) 2008-09-26 2013-08-06 Trustees Of Tufts College pH-induced silk gels and uses thereof
US8886334B2 (en) 2008-10-07 2014-11-11 Mc10, Inc. Systems, methods, and devices using stretchable or flexible electronics for medical applications
US8372726B2 (en) 2008-10-07 2013-02-12 Mc10, Inc. Methods and applications of non-planar imaging arrays
US8097926B2 (en) 2008-10-07 2012-01-17 Mc10, Inc. Systems, methods, and devices having stretchable integrated circuitry for sensing and delivering therapy
EP2349440B1 (en) 2008-10-07 2019-08-21 Mc10, Inc. Catheter balloon having stretchable integrated circuitry and sensor array
US8389862B2 (en) 2008-10-07 2013-03-05 Mc10, Inc. Extremely stretchable electronics
CA2739487A1 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 Trustees Of Tufts College Modified silk films containing glycerol
EP2403551A4 (en) * 2009-03-04 2014-02-26 Tufts College FIBROIN SILK SYSTEMS FOR ANTIBIOTIC DELIVERY
US20120070427A1 (en) 2009-06-01 2012-03-22 Trustees Of Tufts College Vortex-induced silk fibroin gelation for encapsulation and delivery
WO2011008842A2 (en) 2009-07-14 2011-01-20 Trustees Of Tufts College Electrospun silk material systems for wound healing
JP5692611B2 (ja) * 2009-07-31 2015-04-01 カウンシィル オブ サイアンティフィック アンド インダストリアル リサーチ 再生フィブロインの促進されたゲル化
EP2483460B1 (en) * 2009-09-28 2015-09-02 Trustees Of Tufts College Method to prepare drawn silk egel fibers
JP5730317B2 (ja) 2009-09-29 2015-06-10 タフツ ユニバーシティー/トラスティーズ オブ タフツ カレッジ 絹ナノスフェアおよび絹マイクロスフェアならびにこれらを作製する方法
WO2011041727A1 (en) 2009-10-01 2011-04-07 Mc10, Inc. Protective cases with integrated electronics
US9936574B2 (en) 2009-12-16 2018-04-03 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Waterproof stretchable optoelectronics
EP2513953B1 (en) 2009-12-16 2017-10-18 The Board of Trustees of the University of Illionis Electrophysiology using conformal electronics
US10441185B2 (en) 2009-12-16 2019-10-15 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Flexible and stretchable electronic systems for epidermal electronics
US9603971B2 (en) 2010-03-05 2017-03-28 Trustees Of Tufts College Silk-based ionomeric compositions
JP5751728B2 (ja) 2010-03-17 2015-07-22 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ イリノイ 生体吸収性基板上の埋め込み型バイオメディカルデバイス
US9603243B2 (en) 2010-04-12 2017-03-21 Tufts University Silk electronic components
US9566365B2 (en) 2010-09-01 2017-02-14 Trustees Of Tufts College Silk fibroin and polyethylene glycol-based biomaterials
CN103328034A (zh) 2010-09-03 2013-09-25 塔夫茨大学/塔夫茨学院信托人 掺杂有等离子体纳米颗粒的丝材
EP2622663A4 (en) 2010-09-27 2014-12-24 Tufts University Trustees Of Tufts College PIEZOELECTRIC MATERIALS ON SILK BASE
WO2012054582A2 (en) 2010-10-19 2012-04-26 Trustees Of Tufts College Silk fibroin-based microneedles and methods of making the same
JP2012171124A (ja) * 2011-02-18 2012-09-10 Sekisui Chem Co Ltd 製管用部材、及び既設管の更生方法
WO2012145652A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Trustees Of Tufts College Dynamic silk coatings for implantable devices
AU2012245198B2 (en) 2011-04-21 2017-07-13 Trustees Of Tufts College Compositions and methods for stabilization of active agents
WO2012158709A1 (en) 2011-05-16 2012-11-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Thermally managed led arrays assembled by printing
JP2014523633A (ja) 2011-05-27 2014-09-11 エムシー10 インコーポレイテッド 電子的、光学的、且つ/又は機械的装置及びシステム並びにこれらの装置及びシステムを製造する方法
US8934965B2 (en) 2011-06-03 2015-01-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Conformable actively multiplexed high-density surface electrode array for brain interfacing
WO2013103424A2 (en) * 2011-10-11 2013-07-11 Tufts University Silk-based multifunctional biomedical platform
US20140370094A1 (en) 2011-11-08 2014-12-18 Tufts University Silk-based scaffold platform for engineering tissue constructs
WO2013071107A1 (en) 2011-11-09 2013-05-16 Trustees Of Tufts College Injectable silk fibroin particles and uses thereof
CA2890372A1 (en) 2011-11-09 2013-05-16 Trustees Of Tufts College Injectable silk fibroin foams and uses thereof
CN108389893A (zh) 2011-12-01 2018-08-10 伊利诺伊大学评议会 经设计以经历可编程转变的瞬态器件
US10126467B2 (en) 2011-12-05 2018-11-13 Tufts University Signal enhancement by silk photonic crystals
EP2797641B1 (en) 2011-12-29 2019-07-10 Trustees Of Tufts College Functionalization of biomaterials to control regeneration and inflammation responses
ES2856873T3 (es) 2012-02-06 2021-09-28 Childrens Medical Center Biomaterial multicapa para la regeneración de tejidos y la cicatrización de las heridas
WO2013126799A1 (en) * 2012-02-22 2013-08-29 Trustees Of Tufts College Compositions and methods for ocular delivery of a therapeutic agent
JP2015510818A (ja) 2012-03-20 2015-04-13 トラスティーズ オブ タフツ カレッジ 薬物送達のための絹リザーバー
EP2830492B1 (en) 2012-03-30 2021-05-19 The Board of Trustees of the University of Illinois Appendage mountable electronic devices conformable to surfaces and method of making the same
US9925301B2 (en) 2012-04-06 2018-03-27 Trustees Of Tufts College Methods of producing and using silk microfibers
WO2013155404A1 (en) 2012-04-13 2013-10-17 Trustees Of Tufts College Methods and compositions for preparing a silk microsphere
EP2841108A4 (en) 2012-04-25 2015-11-25 Tufts College SILK MICROSPHERES AND SURFACE LUBRICATION METHODS
US10034945B2 (en) 2012-07-13 2018-07-31 Trustees Of Tufts College Silk powder compaction for production of constructs with high mechanical strength and stiffness
EP2872115A4 (en) * 2012-07-13 2016-04-06 Univ Tufts Encapsulation of immiscible phases in silk fibroin biomaterials
EP2712955A1 (en) * 2012-09-27 2014-04-02 Ludwig Boltzmann Gesellschaft GmbH Product made of silk
US9171794B2 (en) 2012-10-09 2015-10-27 Mc10, Inc. Embedding thin chips in polymer
AU2013329077A1 (en) * 2012-10-11 2015-04-23 Tufts University Compositions and methods for sustained delivery of glucagon-like peptide (GLP-1) receptor agonist therapeutics
WO2014085725A1 (en) 2012-11-27 2014-06-05 Tufts University Biopolymer-based inks and use thereof
US11376329B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Trustees Of Tufts College Low molecular weight silk compositions and stabilizing silk compositions
WO2014144971A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Tufts University Silk water lithography
KR20230021768A (ko) 2013-03-15 2023-02-14 트러스티즈 오브 터프츠 칼리지 저분자량 실크 조성물 및 안정화 실크 조성물
WO2014197093A2 (en) 2013-03-15 2014-12-11 Tufts University All water-based nanopatterning
WO2014176458A2 (en) 2013-04-24 2014-10-30 Trustees Of Tufts College Bioresorbable biopolymer anastomosis devices
WO2015023798A1 (en) * 2013-08-13 2015-02-19 Lewis, Randolph, V. Synthetic spider silk protein compositions and methods
JP6775751B2 (ja) * 2013-09-30 2020-10-28 エボルブド バイ ネイチャー, インコーポレイテッド 絹タンパク質断片組成物及びそれから製造された物品
WO2015054125A1 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Trustees Of Tufts College Tunable covalently crosslinked hydrogels and methods of making the same
US10513802B2 (en) 2013-11-08 2019-12-24 Tufts University Peptide-based nanofibrillar materials
ES2781114T3 (es) 2014-08-20 2020-08-28 Silk Tech Ltd Composición proteica derivada de fibroína
CA2969563A1 (en) 2014-12-02 2016-06-09 Silk Therapeutics, Inc. Silk performance apparel and products and methods of preparing the same
US10874742B2 (en) 2015-03-12 2020-12-29 Tufts University Shape memory silk materials
KR20180033468A (ko) 2015-06-01 2018-04-03 더 보드 오브 트러스티즈 오브 더 유니버시티 오브 일리노이 무선 전력 및 근거리 통신기능을 갖는 소형화된 전자 시스템
AU2016270805A1 (en) 2015-06-01 2017-12-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Alternative approach to UV sensing
CN108135975A (zh) 2015-07-14 2018-06-08 丝绸医疗公司 丝性能服装和产品及其制备方法
US10925543B2 (en) 2015-11-11 2021-02-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Bioresorbable silicon electronics for transient implants
US11833272B2 (en) 2015-12-17 2023-12-05 Trustees Of Tufts College Silk-fibroin hydrogels, methods of forming, and uses thereof
US20190002644A1 (en) * 2015-12-25 2019-01-03 Spiber Inc. Method for Producing Polymer Aggregate
RU2616509C1 (ru) * 2015-12-31 2017-04-17 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ нейропротекции в эксперименте
RU2614694C1 (ru) * 2015-12-31 2017-03-28 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Средство, обладающее нейропротекторными свойствами в эксперименте и способ его получения
EP3414318A1 (en) * 2016-02-12 2018-12-19 Spiber Technologies AB Integrated cells
US10864299B2 (en) 2016-04-29 2020-12-15 Trustees Of Tufts College Artificial silk based innervated cornea
WO2017192227A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Trustees Of Tufts College Silk nanofibrils and uses thereof
WO2018006037A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Trustees Of Tufts College Innervated artificial skin
US11248313B2 (en) 2016-08-01 2022-02-15 Trustees Of Tufts College Biomimetic mechanical tension driven fabrication of nanofibrillar architecture
US11242367B2 (en) 2016-08-12 2022-02-08 Silk Technologies, Ltd. Silk-derived protein for treating inflammation
US11617815B2 (en) 2016-10-31 2023-04-04 Sofregen Medical, Inc. Compositions comprising silk fibroin particles and uses thereof
US11390988B2 (en) 2017-09-27 2022-07-19 Evolved By Nature, Inc. Silk coated fabrics and products and methods of preparing the same
KR102017948B1 (ko) 2017-10-30 2019-09-03 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 콜라겐 및 실크 피브로인을 포함하는 세포 캡슐화용 복합 하이드로겔 및 이의 제조방법
CN107892755B (zh) 2017-11-17 2019-04-02 苏州大学 一种生理条件下蚕丝蛋白溶液快速凝胶化的方法
RU2692578C1 (ru) * 2017-12-29 2019-06-25 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Имплантат для регенерации костной ткани и способ его получения
US20210052822A1 (en) * 2018-03-22 2021-02-25 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Glucose responsive composite gel composition, method for producing same, insulin delivery microneedle including said glucose responsive composite gel composition, and production method thereof
CA3096036A1 (en) 2018-04-03 2019-10-10 Vaxess Technologies, Inc. Microneedle comprising silk fibroin applied to a dissolvable base
CN110066418B (zh) * 2019-04-16 2021-08-31 苏州大学 一种活性丝素多孔材料或活性丝素膜及其制备方法
CN110150672A (zh) * 2019-06-03 2019-08-23 武汉轻工大学 硒补充剂及其制备方法
US11738174B2 (en) 2019-10-15 2023-08-29 Sofregen Medical, Inc. Delivery devices for delivering and methods of delivering compositions
CN112322609A (zh) * 2020-11-25 2021-02-05 苏州大学 一种基于丝素蛋白的微藻固定化方法
CN112957521B (zh) * 2021-04-01 2022-06-10 浙江理工大学 一种载青蒿素脂质体的海藻酸盐-丝素蛋白复合水凝胶的制备方法
CN113842505A (zh) * 2021-09-13 2021-12-28 南通大学 用于神经修复的多孔双网络纳米导电水凝胶神经支架的制备方法
CN114958009B (zh) * 2022-05-24 2024-01-16 浙江理工大学 一种蚕丝基高强度离子凝胶柔性传感材料的制备方法
WO2023250117A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Vaxess Technologies, Inc. Applicator for medicament patch
CN115260531B (zh) * 2022-08-04 2024-03-22 重庆科技学院 一种可自卷曲双层水凝胶片的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4325741A (en) * 1979-09-20 1982-04-20 Kanebo, Ltd. Fibroin-coated pigment and processes for producing same
US20050260706A1 (en) * 2002-06-24 2005-11-24 Tufts University Silk biomaterials and methods of use thereof

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL29013C (ru) 1929-12-23
US3424164A (en) 1966-05-20 1969-01-28 Ethicon Inc Silk suture
JPS5838449B2 (ja) 1979-04-17 1983-08-23 カネボウ株式会社 微粉末状絹フィプロインの製造法
JPS56163658A (en) * 1980-05-21 1981-12-16 Kanebo Ltd Manufacture of solid aromatic
JPS56166235A (en) 1980-05-24 1981-12-21 Kanebo Ltd Hydrophilic porous body and its preparation
JPS5765155A (en) 1980-10-09 1982-04-20 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of powdery protein of soybean
JPS5838449A (ja) 1981-08-31 1983-03-05 Matsushita Electronics Corp 高圧ナトリウムランプ装置
JPS60142259A (ja) 1983-12-29 1985-07-27 Kanebo Ltd 固定化抗体
JPS60259677A (ja) 1984-05-31 1985-12-21 水島 繁三郎 動物蛋白吸着再生繊維からなる原糸、織物、編物及びその製造方法
US4798722A (en) 1986-11-12 1989-01-17 Zotos International, Inc. Permanent waving composition
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
JPS63190604A (ja) 1987-02-03 1988-08-08 Agency Of Ind Science & Technol 新規の水−アルコ−ル分離膜
US5606019A (en) 1987-10-29 1997-02-25 Protien Polymer Technologies, Inc. Synthetic protein as implantables
JPH0694518B2 (ja) 1987-11-02 1994-11-24 工業技術院長 絹フィブロイン多孔質体の製造方法
GB8800078D0 (en) 1988-01-05 1988-02-10 Ciba Geigy Ag Novel antibodies
JPH0284503A (ja) * 1988-09-20 1990-03-26 Agency Of Ind Science & Technol 絹フィブロインの凝固方法
JPH0296512A (ja) 1988-09-29 1990-04-09 Seiwa Kasei:Kk パーマネントウェーブ用第一剤
US5290494A (en) 1990-03-05 1994-03-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Process of making a resorbable implantation device
US5989894A (en) 1990-04-20 1999-11-23 University Of Wyoming Isolated DNA coding for spider silk protein, a replicable vector and a transformed cell containing the DNA
GB2245279B (en) 1990-06-20 1993-04-07 Unilever Plc Shampoo composition
JP2854687B2 (ja) * 1990-07-30 1999-02-03 鐘紡株式会社 染色絹フィブロイン粉末の製造法
JPH04263611A (ja) 1991-02-16 1992-09-18 Pola Chem Ind Inc 水不溶性固形フィブロイン成形物及びその製造法
JPH0543600A (ja) 1991-08-08 1993-02-23 Kanebo Ltd 抗体または抗原固定化絹フイブロイン膜および免疫測定用センサー
JPH05163132A (ja) 1991-12-13 1993-06-29 Kanebo Ltd 皮膚化粧料
JPH0694518A (ja) 1992-09-10 1994-04-05 Toshiba Lighting & Technol Corp 日照センサ
JPH06346314A (ja) 1993-06-02 1994-12-20 Toyobo Co Ltd 再生絹フィブロイン繊維およびその製造方法
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
JPH08295697A (ja) 1995-04-26 1996-11-12 Kanebo Ltd 高濃度絹フィブロイン水溶液の製造方法
JPH1036676A (ja) 1996-07-26 1998-02-10 Kanebo Ltd タンパク質水溶液の濃縮方法
KR100431659B1 (ko) 1997-06-18 2004-05-17 독립행정법인농업생물자원연구소 견 피브로인 및 견 세리신을 주성분으로 하는 창상피복재 및 그의 제조방법
WO1999001089A1 (en) 1997-07-01 1999-01-14 Brown University Research Foundation Implantable prosthetic devices coated with bioactive molecules
DE19732046A1 (de) 1997-07-25 1999-01-28 Abb Patent Gmbh Prozeßdiagnosesystem und Verfahren zur Diagnose von Vorgängen und Zuständen eines technischen Prozesses
US6123819A (en) 1997-11-12 2000-09-26 Protiveris, Inc. Nanoelectrode arrays
US5994099A (en) 1997-12-31 1999-11-30 The University Of Wyoming Extremely elastic spider silk protein and DNA coding therefor
WO1999045964A1 (en) 1998-03-12 1999-09-16 Shearwater Polymers, Incorporated Poly(ethylene glycol) derivatives with proximal reactive groups
US6110590A (en) 1998-04-15 2000-08-29 The University Of Akron Synthetically spun silk nanofibers and a process for making the same
US7662409B2 (en) 1998-09-25 2010-02-16 Gel-Del Technologies, Inc. Protein matrix materials, devices and methods of making and using thereof
US20030007991A1 (en) 1998-09-25 2003-01-09 Masters David B. Devices including protein matrix materials and methods of making and using thereof
JP2000202484A (ja) 1999-01-13 2000-07-25 Fuji Electric Co Ltd 有機性汚水の生物処理方法
US6592623B1 (en) 1999-08-31 2003-07-15 Virginia Commonwealth University Intellectual Property Foundation Engineered muscle
JP3151665B2 (ja) 1999-03-23 2001-04-03 農林水産省蚕糸・昆虫農業技術研究所長 生体高分子/ポリアリルアミン複合体およびその製造方法
JP2000342902A (ja) 1999-06-07 2000-12-12 Ube Gosei Kogyo Kk 潮解を遅くした潮解性無機塩結晶の製造方法及び反応装置
WO2001036531A1 (fr) 1999-11-15 2001-05-25 Zaidan-Houjin Ueda Sen-I Kagaku Shinkoukai Materiau polymere moleculairement composite en fibroine/cellulose et procede de production de ce materiau
CA2398635A1 (en) 2000-02-03 2001-08-09 Nexia Biotechnologies, Inc. Surgical sutures containing spider silk
IT1316885B1 (it) 2000-10-02 2003-05-13 Consorzio Per Gli Studi Uni Procedimento per la preparazione di un tessuto non tessuto in fibroinadi seta.
JP2002128691A (ja) 2000-10-24 2002-05-09 National Institute Of Agrobiological Sciences セリシン含有素材、その製造方法およびその使用方法
US7265186B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Nektar Therapeutics Al, Corporation Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US20030183978A1 (en) 2001-03-14 2003-10-02 Tetsuo Asakura Method of producing fiber and film of silk and silk-like material
ITVR20010098A1 (it) 2001-09-11 2003-03-11 Consorzio Per Gli Studi Uni Procedimento per l'ottenimento di idrogeli di fibroina di seta.
US20030068446A1 (en) 2001-10-02 2003-04-10 Northwestern University Protein and peptide nanoarrays
GB0126118D0 (en) 2001-10-31 2002-01-02 Vollrath Friedrich W L Precursor feedstock for forming filaments
US6902932B2 (en) 2001-11-16 2005-06-07 Tissue Regeneration, Inc. Helically organized silk fibroin fiber bundles for matrices in tissue engineering
DE10297527B4 (de) 2001-12-07 2013-10-31 Lumileds Lighting U.S., Llc Kompaktes Beleuchtungssystem und Anzeigeeinrichtung
JP3803962B2 (ja) 2001-12-28 2006-08-02 独立行政法人科学技術振興機構 絹タンパク質フィルムとその製造方法
US7057023B2 (en) 2002-01-11 2006-06-06 Nexia Biotechnologies Inc. Methods and apparatus for spinning spider silk protein
JP3772207B2 (ja) 2002-06-19 2006-05-10 独立行政法人農業生物資源研究所 生分解性生体高分子材料、その製造方法、およびこの高分子材料からなる機能性素材
CA2504327C (en) 2002-11-01 2012-01-03 Trustees Of Tufts College Templated native silk smectic gels
WO2004062697A2 (en) 2003-01-07 2004-07-29 Tufts University Silk fibroin materials and use thereof
WO2005012606A2 (en) 2003-04-10 2005-02-10 Tufts University Concentrated aqueous silk fibroin solution and use thereof
WO2005000483A1 (en) 2003-06-06 2005-01-06 Tufts University Method for forming inorganic coatings
CN1243059C (zh) * 2004-03-04 2006-02-22 苏州大学 纳米丝素颗粒的制造方法
US8178656B2 (en) 2004-06-11 2012-05-15 Trustees Of Tufts College Silk-based drug delivery system
JP4896017B2 (ja) 2004-07-31 2012-03-14 バイオグランド シーオー エル ティー ディー 脳疾患または頭脳機能改善のための組成物
WO2006042287A2 (en) 2004-10-12 2006-04-20 Trustees Of Tufts College Method for producing biomaterial scaffolds
US7960509B2 (en) 2005-01-14 2011-06-14 Trustees Of Tufts College Fibrous protein fusions and use thereof in the formation of advanced organic/inorganic composite materials
US9290579B2 (en) 2005-04-20 2016-03-22 Trustees Of Tufts College Covalently immobilized protein gradients in three-dimensional porous scaffolds
EP1915436B1 (en) 2005-08-02 2011-09-28 Trustees Of Tufts College Methods for stepwise deposition of silk fibroin coatings
GB0516846D0 (en) 2005-08-17 2005-09-21 Knight David P Meniscal repair device
US20080058400A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Fujifilm Corporation Skin external preparation
US20100028451A1 (en) 2006-09-26 2010-02-04 Trustees Of Tufts College Silk microspheres for encapsulation and controlled release
US20110121485A1 (en) 2006-10-30 2011-05-26 Spintec Engineering Gmbh Method and apparatus for the manufacture of a fiber
GB2443401A (en) 2006-10-30 2008-05-07 Spin'tec Engineering Gmbh Producing fibres by extruding onto a treatment device
PL2089343T3 (pl) 2006-10-31 2011-12-30 Baseclick Gmbh Reakcja chemiczna typu click do wytwarzania cząsteczek reporterowych
EP2101975A2 (en) 2006-11-03 2009-09-23 Trustees of Tufts College Biopolymer sensor and method of manufacturing the same
WO2008127405A2 (en) 2006-11-03 2008-10-23 Trustees Of Tufts College Microfluidic device with a cylindrical microchannel and a method for fabricating same
EP2086749B1 (en) 2006-11-03 2013-05-08 Trustees Of Tufts College Nanopatterned biopolymer optical device and method of manufacturing the same
WO2008127403A2 (en) 2006-11-03 2008-10-23 Trustees Of Tufts College Biopolymer optofluidic device and method of manufacturing the same
WO2008118211A2 (en) 2006-11-03 2008-10-02 Trustees Of Tufts College Biopolymer photonic crystals and method of manufacturing the same
JP5163132B2 (ja) 2007-02-16 2013-03-13 ソニー株式会社 光ピックアップ装置、光ディスク装置、対物レンズの設計方法、光ピックアップ装置の設計方法、及び、光ディスク装置の設計方法
US9102916B2 (en) 2007-02-27 2015-08-11 Trustees Of Tufts College Tissue-engineered silk organs
BRPI0721462A2 (pt) 2007-03-23 2013-01-08 Thomson Licensing sistema e mÉtodo para classificaÇço de regiço de imagens em 2d para conversço de 2d para 3d
KR20100029217A (ko) 2007-05-29 2010-03-16 트러스티즈 오브 터프츠 칼리지 음파 처리를 이용한 실크 피브로인 겔화 방법
US9808557B2 (en) 2007-08-10 2017-11-07 Trustees Of Tufts College Tubular silk compositions and methods of use thereof
EP2206017B1 (en) 2007-11-05 2019-02-20 Trustees Of Tufts College Fabrication of silk fibroin photonic structures by nanocontact imprinting
JP2011511668A (ja) 2008-02-07 2011-04-14 トラスティーズ オブ タフツ カレッジ 3次元絹ハイドロキシアパタイト組成物
US8206774B2 (en) 2008-03-13 2012-06-26 Trustees Of Tufts College Diazonium salt modification of silk polymer
WO2009126689A2 (en) 2008-04-08 2009-10-15 Trustees Of Tufts College System and method for making biomaterial structures
JP5727366B2 (ja) 2008-05-15 2015-06-03 タフツ ユニバーシティー/トラスティーズ オブ タフツ カレッジ 絹ポリマーに基づくアデノシン放出:てんかんに対する潜在的治療能力
US20090297588A1 (en) 2008-05-28 2009-12-03 Spin'tec Engineering Gmbh Antibiotic dressing for the treatment of infected wounds
WO2009155397A2 (en) 2008-06-18 2009-12-23 Trustees Of Tufts College Edible holographic silk products
GB2461125A (en) 2008-06-25 2009-12-30 Spintec Engineering Gmbh A silk membrane for bone graft material
US8501172B2 (en) 2008-09-26 2013-08-06 Trustees Of Tufts College pH-induced silk gels and uses thereof
GB2464348A (en) 2008-10-17 2010-04-21 Spintec Engineering Gmbh Applying a liquid protein onto a permeable surface, and silk mono-filament having specific properties
EP2191867A1 (en) 2008-11-27 2010-06-02 KPSS-Kao Professional Salon Services GmbH Bleaching/Highlighting composition
EP2253336A1 (en) 2009-05-15 2010-11-24 Spintec Engineering GmbH A silk medical device with antimicrobial properties and a method of manufacture thereof
CA2805403A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Trustees Of Tufts College Bioengineered silk protein-based nucleic acid delivery systems
KR101317420B1 (ko) 2010-03-11 2013-10-10 한국과학기술원 고분자량의 재조합 실크 또는 실크 유사 단백질 및 이를 이용하여 제조된 마이크로 또는 나노 크기의 거미줄 또는 거미줄 유사 섬유
JP6094518B2 (ja) * 2014-03-24 2017-03-15 株式会社富士通ゼネラル ヒートポンプ式暖房給湯装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4325741A (en) * 1979-09-20 1982-04-20 Kanebo, Ltd. Fibroin-coated pigment and processes for producing same
US20050260706A1 (en) * 2002-06-24 2005-11-24 Tufts University Silk biomaterials and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20140303346A1 (en) 2014-10-09
MX2009012978A (es) 2010-02-24
AU2008260156B2 (en) 2013-10-31
EP2211876A1 (en) 2010-08-04
WO2008150861A1 (en) 2008-12-11
AU2008260156A1 (en) 2008-12-11
KR20100029217A (ko) 2010-03-16
KR20150091421A (ko) 2015-08-10
IL202354A (en) 2016-11-30
CA2688431C (en) 2016-07-05
JP6091540B2 (ja) 2017-03-08
ES2527125T3 (es) 2015-01-20
PL2211876T3 (pl) 2015-05-29
CA2688431A1 (en) 2008-12-11
CN104013598A (zh) 2014-09-03
IL202354A0 (en) 2010-06-30
JP2015145500A (ja) 2015-08-13
EP2211876B1 (en) 2014-10-01
CY1116090T1 (el) 2017-02-08
US9254333B2 (en) 2016-02-09
EP2211876A4 (en) 2011-03-09
US8187616B2 (en) 2012-05-29
JP2010529230A (ja) 2010-08-26
PT2211876E (pt) 2015-01-14
BRPI0813312A2 (pt) 2014-12-23
CN101772348A (zh) 2010-07-07
US20100178304A1 (en) 2010-07-15
DK2211876T3 (en) 2015-01-12
CN101772348B (zh) 2014-07-16
KR101839659B1 (ko) 2018-03-16
EA200971116A1 (ru) 2010-04-30
HRP20141265T1 (hr) 2015-04-10
US20150258199A1 (en) 2015-09-17
US8722067B2 (en) 2014-05-13
SI2211876T1 (sl) 2015-06-30
US20130060008A1 (en) 2013-03-07
HK1201470A1 (en) 2015-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA019118B1 (ru) Способ желатинизации фиброина шелка и регулирования времени желатинизации, способ инкапсуляции по меньшей мере одного компонента в фиброин шелка (варианты)
Yan et al. Enhanced osteogenesis of bone marrow‐derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair
Wang et al. Culturing fibroblasts in 3D human hair keratin hydrogels
Stoppel et al. Elastic, silk‐cardiac extracellular matrix hydrogels exhibit time‐dependent stiffening that modulates cardiac fibroblast response
Fu et al. Decellularization of porcine skeletal muscle extracellular matrix for the formulation of a matrix hydrogel: a preliminary study
Zeugolis et al. Engineering extruded collagen fibers for biomedical applications
JP7340194B2 (ja) 細胞外マトリックス含有組成物、三次元組織体形成用仮足場材及び三次元組織体形成剤並びに三次元組織体から細胞を回収する方法
Dobre et al. A hydrogel platform that incorporates laminin isoforms for efficient presentation of growth factors–neural growth and osteogenesis
Montero et al. Contraction of fibrin‐derived matrices and its implications for in vitro human skin bioengineering
Luong et al. Drying and storage effects on poly (ethylene glycol) hydrogel mechanical properties and bioactivity
Afghah et al. 3D fiber reinforced hydrogel scaffolds by melt electrowriting and gel casting as a hybrid design for wound healing
Lai Influence of solvent composition on the performance of carbodiimide cross-linked gelatin carriers for retinal sheet delivery
RU2577974C2 (ru) Способ имплантации биологического материала в организм
Wen et al. Biodegradable cell‐laden starch foams for the rapid fabrication of 3D tissue constructs and the application in neural tissue engineering
AU2014200398B2 (en) Method for silk fibroin gelation using sonication
Bashiri et al. Generation of Haploid Spermatids on Silk Fibroin‐Alginate‐Laminin‐Based Porous 3D Scaffolds
US20230112573A1 (en) Biomaterials and related methods and kits
Li et al. Injectable and Microporous Microgel‐Fiber Granular Hydrogel Loaded with Bioglass and siRNA for Promoting Diabetic Wound Healing
GOCZKOWSKI Conception et élaboration de matériaux à biodégradabilité contrôlée pour la médecine régénérative
Fathi Achachelouei Growth factor loaded silk fibroin/PEGDMA hydrogels for articular cartilage tissue engineering
Busby Manipulating the mechanical strength and biological stability of collagen-based scaffolds for tissue engineering

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU