CN1243059C - 纳米丝素颗粒的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用蚕丝制造纳米丝素颗粒的方法。将水溶性丝素蛋白溶液与过量的有机溶剂混合，引起丝素分子结构快速β化，形成结晶微粒，去除有机溶剂，再经分散处理后获得高纯的结晶性纳米级丝素颗粒。它呈球形、不溶于水、平均粒度30～60nm、呈β-折叠结构、结晶度18～25%，约为天然纤维的一半，对人体无毒、无害、无免疫反应，具有优良的生物相容性，能有效阻挡紫外线辐射，细菌在纳米丝素水溶液中无法正常生长与增殖，可广泛应用于化妆品、护肤品、合成材料、表面改性材料以及酶、多肽和药物的缓释载体等。

Description

纳米丝素颗粒的制造方法
                         技术领域
本发明涉及天然高分子材料加工领域，特别涉及一种用蚕丝制造纳米丝素颗粒的方法。
                         背景技术
家蚕生产的丝素是一种天然的高分子蛋白，分子量高达370kDa，由于这种蛋白质具有良好的生物相容性，对人体无毒、无害、无免疫性，长期以来一直用作医用手术缝合线。近年来。对丝素进行在人工皮肤、化妆品和营养食品原料或作为固定化细胞、酶和抗体的载体等方面的开发利用备受关注。其中丝素粉末的制造及其应用开发十分活跃，主要是通过物理或化学方法制备丝素粉末。目前，丝素粉末主要有分二大类，一类是分子量范围大小不等的水溶性丝素粉末，应用于营养食品、表面活性剂、保健品、医用材料等领域；第二类是不溶于水的结晶性丝素粉末，广泛应用于化妆品、护肤品、涂料、工业资料、合成材料、打印墨水等领域。在实际应用中，结晶性粉末占丝素粉末总量的70～80％。
结晶性丝素粉末的制备大都是通过诱导水溶性丝素蛋白凝聚、干燥、粉碎的方法或者直接将丝素纤维反复机械粉碎方法制成不溶于水的丝素粉末。前者主要是通过蚕丝的脱胶制成丝素纤维，然后制成水溶性丝素溶液，再用化学或物理的方法诱导丝素蛋白凝聚。如将单羟基、二羟基或三羟基脂肪醇以0.01～1.5∶1体积比与丝素溶液混合，使丝素蛋白发生凝聚成凝胶，然后脱水、干燥、机械粉碎制成粉末，再经50℃饱和蒸气湿热处理，制成结晶性丝素粉末，其中50％以上丝素粉末呈β-折叠构造、不溶于热水(日本专利，特开昭55-66929；美国专利，US4233211)。通过盐析、超声波、充气和高速搅拌或调节等电点等方法诱导丝素凝聚，制成与上述类似特性的丝素粉末(日本专利，特开昭55-139427；美国专利，US4233212)。将丝素溶液通电诱导丝素蛋白凝聚或沉淀，然后干燥粉碎制成丝素粉末(日本专利，特开平4-263611)。先将丝素溶液蒸发失水成膜，随后高温高压处理制成水不溶性丝素成形物，这种成形物也可机械粉碎制成丝素粉末(日本专利，特开平04-264137)。以上这些方法的制备丝素粉末由于颗粒大、粒径范围大、结晶度不一，有些制备成本偏高，在商业生产上没有得到大量应用。所以，又开发了丝素纤维直接进行机械粉碎的方法。将脱胶后的丝素纤维浸在水中置于容器内，加热加压处理或加热加压膨化处理后，再干燥、机械粉碎，可制成30～50μm丝素粉末(日本专利，特开昭58-046097、58-045232)。直接对丝纤维机械粉碎制成100～250μm粉末，再与树脂、助粘剂和水混合用于表面被覆(日本专利，特开平06-306772)。丝素纤维经干式、球磨式和气流式三步碾磨粉碎(日本专利，特开平6-339924；欧洲专利，EP0875523)或经碱性溶液处理降低纤维强度后进行多级粉碎(日本专利，特开平08-198970，美国专利US5853764，中国专利CN1150438；特开2001-048989)制成粒径10μm或3μm结晶性丝素粉末。或将丝素先经95℃处理后进行机械粉碎，接着加水进行水磨粉碎制成1～200μm丝素粉末(日本专利，特开平11-100510)或加入有机溶剂进行湿式粉碎(日本专利，特开平1-293142)制成6μm丝素粉末。先将丝素进行辐射处理降低强度后进行球磨粉碎(Hidefumi Takeshita，Kazushige Ishida，Youichi Kamiishi，Fumio Yoshii，Tamikazu Kume，Macromol.Mater.Eng.2000，283，126-131)，还可以将丝素纤维直接用高温高压处理直接降解制成小分子丝素粉末(Gyung-Don Kang，Ki-Hoon Lee，Bong-Seob Shin，Joong-Hee Nahm，Journal of Applied Polymer Science.85，2890-2895，2002)。这些机械粉碎的方法制成1～100μm不等的结晶性超细丝素粉，在化妆品、护肤品、表面改性材料、高分子合成材料、高吸水材料、涂料和打印墨水等方面有广泛的应用。上述现有制造丝素粉末的方法，由于大都采用的是机械粉碎技术，很难制成超微米级丝素颗粒。因此，存在着结晶性丝素颗粒大、形状各异、粒度分布范围宽、颗粒表面活性和在溶液中分散性差等不足，应用范围受到一定的限制。
                    技术方案
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种无化学有害物质且简单、有效的结晶性纳米丝素颗粒的制造方法。
实现本发明目的的技术方案是：丝素纳米颗粒的制造方法，将水溶性丝素溶液与有机溶剂混合，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇或丙酮，丝素分子量≤200kDa，所述的丝素溶液浓度为0.1～20％，丝素溶液与有机溶剂的体积比为1∶2.3以上，工作环境温度在5～50℃，形成乳白色的球形微粒分散在有机溶剂体系中，得到纳米丝素颗粒混合液或悬浮液，再去除其中的有机溶剂，得到结晶性丝素纳米颗粒悬浮液或丝素纳米粉末。
上述技术方案中所述的水溶性丝素包括由家蚕丝或野蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝、蜘蛛丝脱胶精制或纯化而成，或者由基因工程生产的类蚕丝丝素蛋白纯化而成。
对纳米丝素颗粒的有机溶剂混合液或悬浮液进行反复离心脱水处理，或进行反复过滤、清洗处理，直至完全去除有机溶剂。
对获得的丝素纳米颗粒加入纯水或水溶液后进行超声处理1～10min，制成纳米丝素液。
对获得的丝素纳米颗粒的有机溶剂混合液或悬浮液进行真空冷冻干燥，制成纳米丝素粉末。
按上述技术方案制备得到的丝素颗粒呈球形、不溶于水、平均粒度为30～60nm、结构呈β-折叠、结晶度为18～25％的丝素纳米颗粒。
与现有技术相比，本发明的优点是：
1.由于丝素与过量的质子型有机溶剂或极性非质子型有机溶剂混合后，可溶性的丝素分子从无规卷曲和α-螺旋结构瞬间转化为不溶性的反向平行β-折叠结构。因此，得到的丝素颗粒平均60nm左右，电子显微镜观察呈球形，结构紧密、结晶度高达15～20％、性能稳定、不易被蛋白酶分解，具有强力阻挡紫外辐射的功能。
2.在制造过程中不使用有毒的化学试剂，因此，得到的纳米丝素对人体无毒、无害、无免疫反应，并且具有良好的生物相容性，是一种绿色环保产品。
3.制造工艺简单，成本低、效益高，具有广阔的市场前景。
                        附图说明
图1是按本发明实施例1方法得到的纳米丝素颗粒的紫外吸收光谱；
图2是按本发明实施例1方法得到的纳米丝素颗粒的荧光发射光谱；
图3是按本发明实施例1方法得到的纳米丝素颗粒的红外吸收光谱；
图4是按本发明实施例1方法得到的纳米丝素颗粒的13C CP/MAS核磁共振图谱；
图5是按本发明实施例1方法得到的纳米丝素颗粒的X-射线衍射图谱；
图6是按本发明实施例1方法得到的纳米丝素颗粒的DSC热分析曲线；
图7是按本发明实施例1方法得到的纳米丝素颗粒的透射电镜图；
图8是按本发明实施例1方法得到的纳米丝素颗粒的扫描电镜图；
图9是按本发明实施例1方法得到的纳米丝素颗粒的原子力显微镜图；
图10是按本发明实施例1方法得到的纳米丝素颗粒的粒度分布图；
图11是本发明实施例6方法得到的柞蚕丝素纳米颗粒电子扫描电镜图；
图12是按本发明实施例6方法得到的柞蚕丝素纳米颗粒的X-射线衍射图谱；
图13是按本发明实施例7方法得到的蓖麻蚕丝素纳米颗粒的电子扫描电镜图；
图14是按本发明实施例7方法得到的蓖麻蚕丝素纳米颗粒的X-射线衍射图谱。
                      具体实施方式
实施例1：
取在蚕桑、种茧生产和缫丝、纺织生产中的种茧、茧衣、废丝或废绸布等清洗后，加入30倍量的0.5％碳酸钠水溶液或其它碱性溶液或者加入表面活性剂等进行煮沸1小时，换液1次，再煮沸1小时，确保将丝胶全部脱除。脱除丝胶的丝素纤维经反复用水冲洗后经105℃烘干备用。
取上述脱除丝胶的家蚕丝素纤维与20倍量(W/V)9M溴化锂水溶液或者是溴化锂甲醇水三元混合溶剂混合，在50℃溶解5小时；或者是将丝素纤维与20倍量(W/V)氯化钙/乙醇/水三元混合溶剂(摩尔比1∶2∶8)混合，在70℃溶解2小时；或者是将上述丝素纤维溶解在其它浓盐溶液、铜铵溶液或有机溶剂中。将上述获得的各种丝素溶解液进行透析、脱盐、纯化，制成水溶性丝素溶液。接着，利用截留分子量50kDa的超滤装置对丝素溶液进行超滤，由此获得分子量50kDa的丝素溶液，其浓度为0.5～15％，最好是浓缩或稀释成2.5％左右的水溶性丝素溶液。
取上述纯化的水溶性丝素溶液，在≥5℃的环境条件下，最好是在25℃环境条件下，以1∶2.3以上的体积比与丙酮(即丙酮加入量为最终体积70％以上)混合，使丝素蛋白快速变性成超微颗粒悬浮在有机溶剂中，用15000rpm离心，去除上清液后加水搅匀，再离心，如此反复操作，直至去除丙酮为止。上述的丝素有机溶剂悬浮液也可以通过定性滤纸过滤，用水反复冲洗，再过滤的方法去除丙酮。将上述纯化获得的丝素加入水或水溶液后，经10min超声处理后，纳米丝素颗粒能很好地分散在水或水溶液中不易沉淀。由此制备的纳米丝素颗粒在30～100nm之间，平均粒度60nm左右，结晶度为天然丝素纤维的一半。
在上述超声处理前或后的丝素沉淀物或过滤物经过真空冷冻干燥，可直接制成纳米丝素粉末，但这种纳米丝素因失水干燥会发生团聚现象，其颗粒分布范围会大于100nm，平均粒度大于60nm。
参见附图1，在丝素纳米颗粒的紫外吸收光谱图中，虚线表示的吸收曲线是浓度为1.80mg/ml水溶性丝素溶液在日立U-3000可见紫外分光光度计上的紫外吸收光谱，在275nm处有最大吸收峰。当丝素纳米化(纳米丝素含量0.80mg/ml)后，此典型的最大吸收峰基本消失，出现了图中实线部分的紫外吸收光谱，其浓度较前者低20倍之多。
参见附图2，水溶性丝素溶液和纳米丝素颗粒水中悬浮液在日立荧光分光光度计(F-4500FL Spectrophotometer)上测度的荧光发射光谱，测定条件：激发波长290nm，激发狭缝10.0nm，发射狭缝5.0nm，扫描速度240nm/min，灵敏度0.5s。从图中可以发现丝素纳米化以后，荧光发射光谱发生蓝移10nm左右。
参见附图3，水溶性丝素溶液冻干粉和纳米丝素冻干粉少许用KBr压片制样，在Magna 550红外分光光度计(Nicolet Instrument Corp.USA)上进行测定，扫描范围为4000～200cm-1。图中水溶性丝素的红外吸收光谱(2F曲线所示)是属于无规卷曲和α-缓螺旋或称曲柄形结构(Silk I)特征，4条谱带分别为1654.8(酰胺I)，1554.1(酰胺II)，1242.1(酰胺III)和669.3(酰胺V)。当丝素纳米化后其吸收带(2NF曲线所示)发生位移，出现了反向平行β-折叠(Silk II)的构造，即1635.8(酰胺I)，1520(酰胺II)，1265(酰胺III)和682.9(酰胺V)
参见附图4，水溶性丝素溶液冻干粉和纳米丝素冻干粉的13C CP/MAS(BL7)核磁共振谱(400.13MHz)，在水溶性丝素13C CP/MAS核磁共振图谱(3F曲线所示)中Gly，Ala，Ser残基的13C信号能很好的分辨出来。Ala残基的Cβ、Cα碳信号分别为16.97和50.67ppm；Ser残基的Cβ碳信号为61.31ppm；而Gly残基的Cα碳信号为50.67ppm；当丝素纳米化后(3NF曲线所示)，这些氨基酸残基的13C碳信号发生了明显的化学位移，Ala残基的Cβ、Cα碳信号分别为20.16和49.25ppm；Ser残基的Cα、Cβ碳信号分别为54.52和62.19ppm。这是明显的丝素反向平行β-折叠(Silk II)的构造。
参见附图5，在MERCURY CCD-AFC8型CCD单晶X-射线衍射仪(日本理学电机株式会社)进行丝素样品分析，管电压为4.0kV，管电流为35mA，扫描速度2°/min，Ni滤波。从2θ＝5°～45°进行扫描，得到天然丝素纤维(F曲线所示)、水溶性丝素冻干粉(C曲线所示)和纳米丝素冻干粉(NF曲线所示)的X-射线衍射图谱。水溶性丝素冻干粉可确认为完全无定形结构，其散射峰的峰顶为2θ＝20.3°。而丝素纳米化后，同样经真空干燥后获得的粉末样品，在2θ为9.5°、20.0°和24.0°有Silk II衍射峰出现，说明在纳米化过程中丝素分子构象发生转化，其分子的整列度、有序性提高，从而提高了结晶度，丝素分子构象由无规卷曲向Silk II转化，其结晶度为18.9％。天然丝素纤维切成极短纤维的样品后经X-射线衍射分析的衍射曲线，在2θ为9.5°、和24.5°有Silk II衍射峰出现，其结晶度为38.7％。
参见附图6，天然丝素纤维、水溶性丝素和丝素纳米冻干粉在杜邦热分析仪(2960 SDT V3.OF)测定的DSC热分析曲线。测定方法：to600@10K/min。
参见附图7，纳米丝素冻干粉在日立H600A-II透射电子显微镜上放大1万倍情况下，纳米丝素颗粒的形貌与大小情况。
参见附图8，纳米丝素冻干粉在日立S-570扫描电镜上放大1万倍情况下，纳米丝素颗粒的外貌呈球状。由于制备粉末时经过冷冻干燥，发生团聚现象，所以许多小的纳米颗粒聚集成较大的球形体。
参见附图9，在Nanoscope II原子力显微镜(Digital Instruments，CA)上测定的纳米丝素颗粒的原子力显微镜图，丝素颗粒分布在30～50nm之间，平均40nm左右。
参见附图10，吸取一定量纳米丝素液用水稀释，超声处理后直接放入样品杯，在Zetasizer 3000HSa激光粒度仪(Malvern Instruments Ltd，MalvernUK)上测定颗粒粒度分布情况。丝素颗粒分布在30～100nm之间，平均60nm左右。
用上述实施例方法制备的丝素纳米颗粒配制成水溶液，与普通细菌培养液(牛肉膏蛋白胨培养基)进行细菌培养对比试验。普通细菌培养液成分为蛋白胨10克，牛肉膏3.0克，NaCl 5.0克，用去离子水定容至1000ml，pH值为7.0～7.2。按要求配制好的培养液装入试管，每管5ml，1.05kg/cm2，121.3℃蒸汽灭菌20分钟。
革兰氏阳性菌枯草杆菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌用普通细菌培养液37℃振动培养18～20h后取0.1ml培养液加入5ml无菌水配成菌悬液备用。实验共分成2组，一组为对照区，用上述正常的牛肉膏蛋白胨培养基培养2种细菌，另一组培养液为等体积的丝素纳米颗粒水溶液，其纳米丝素含量为1.0mg/ml。每一个试验组设试验区2个(分别接2种菌)，每区样品重复3次，每个样品重复3次。分别以不接菌牛肉膏蛋白胨培养液和丝素纳米颗粒悬浮液作空白实验。灭菌后的培养液或丝素纳米颗粒液在无菌条件下，用无菌的移液器取试验用菌悬液定量加入试管进行接种，接种大肠杆菌和枯草杆菌的培养液36℃振荡培养24小时。用U-3000分光光度计测定各种样品在560nm的吸光度值。表1所示是细菌在标准培养基中的生长与增殖，表2所示是细菌在纳米丝素水溶液(纳米丝素浓度：0.1mg/ml)中的生长与增殖，参见表1和表2，培养试验对比结果表明，在普通细菌培养液中，大肠杆菌和枯草杆菌的生长一增殖正常；在纳米丝素水溶液中，这些细菌完全不能正常生长与增殖。
用三硝基苯磺酸法(TNBS)测定由上述实施例提供的家蚕水溶性丝素或家蚕丝素纳米颗粒表面的ε-氨基数量(A.F.S.A.Habeeb，Determination offree amino groups in protein by trinitrobenzenesulfonic acid，Analytical Biochemistry 14，328-336，1966)。取1mL浓度为0.5mg/mL水溶性丝素蛋白溶液或等量的纳米丝素颗粒悬浮液，加入1mL 4％碳酸氢钠溶液(pH8.5)和1mL 10％十二烷基磺酸钠溶液，静止20min，再加入1mL 0.1％TNBS(2，4，6-三硝基苯磺酸)溶液，40℃保温2h，以0.5mL 1mL/L盐酸终止反应。在日立U-3000可见紫外分光光度计上用325nm测定吸光度值，修饰前后等浓度的蛋白溶液与纳米颗粒悬浮液的吸光度值之比即为残留ε-氨基百分数。结果表明，纳米丝素颗粒表面存在的ε-氨基数量约为水溶性丝素一半。
实施例2：
水溶性丝素溶液的制备与实施例1制备方法相同，将2.5％的水溶性丝素溶液，在≥5℃的环境条件下，最好是在25℃环境条件下，以1∶2.3以上的体积比与甲醇(即甲醇加入量为最终体积70％以上)混合，使丝素蛋白快速变性成超微颗粒悬浮在有机溶剂中，用15000rpm离心，去除上清液后加水搅匀，再离心，如此反复操作，直至去除甲醇为止。上述的丝素有机溶剂悬浮液也可以通过定性滤纸过滤，用水反复冲洗，再过滤的方法去除甲醇。将上述纯化获得的丝素加入水或水溶液后，经10min超声处理后，纳米丝素颗粒能很好地分散在水或水溶液中。但用甲醇制备的纳米丝素颗粒易凝聚下沉，其余性能与丙酮制备的纳米丝素相仿。
实施例3：
水溶性丝素溶液的制备与实施例1制备方法相同，将2.5％的水溶性丝素溶液，在≥5℃的环境条件下，最好是在25℃环境条件下，以1∶2.3以上的体积比与乙醇(即乙醇加入量为最终体积70％以上)混合，使丝素蛋白快速变性成超微颗粒悬浮在有机溶剂中，用15000rpm离心，去除上清液后加水搅匀，再离心，如此反复操作，直至去除丙酮为止。上述的丝素有机溶剂悬浮液也可以通过定性滤纸过滤，用水反复冲洗，再过滤的方法去除乙醇。将上述纯化获得的丝素加入水或水溶液后，经10min超声处理后，纳米丝素颗粒能很好地分散在水或水溶液中不易沉淀。其性能与丙酮制备的纳米丝素相仿。
实施例4：
水溶性丝素溶液的制备与实施例1制备方法相同，将2.5％的水溶性丝素溶液，在≥5℃的环境条件下，最好是在25℃环境条件下，以1∶2.3以上的体积比与异丙醇(即异丙醇加入量为最终体积70％以上)混合，使丝素蛋白快速变性成超微颗粒悬浮在有机溶剂中，用15000rpm离心，去除上清液后加水搅匀，再离心，如此反复操作，直至去除丙酮为止。上述的丝素有机溶剂悬浮液也可以通过定性滤纸过滤，用水反复冲洗，再过滤的方法去除异丙醇。将上述纯化获得的丝素加入水或水溶液后，经10min超声处理后，纳米丝素颗粒能很好地分散在水或水溶液中不易沉淀。其性能与丙酮制备的纳米丝素相仿。
实施例5：
水溶性丝素溶液的制备与实施例1制备方法相同，将2.5％的水溶性丝素溶液，在≥5℃的环境条件下，最好是在25℃环境条件下，以1∶2.3以上的体积比与四氢呋喃(即四氢呋喃加入量为最终体积70％以上)混合，使丝素蛋白快速变性成超微颗粒悬浮在有机溶剂中，用15000rpm离心，去除上清液后加水搅匀，再离心，如此反复操作，直至去除四氢呋喃为止。上述的丝素有机溶剂悬浮液也可以通过定性滤纸过滤，用水反复冲洗，再过滤的方法去除四氢呋喃。将上述纯化获得的丝素加入水或水溶液后，经10min超声处理后，纳米丝素颗粒能很好地分散在水或水溶液中不易沉淀。其性能与丙酮制备的纳米丝素相仿。
实施例6：
取柞蚕种茧、茧衣或柞蚕废丝或废绸布等清洗后，加入30倍量的0.5％碳酸钠水溶液或其它碱性溶液或者加入表面活性剂等进行煮沸1小时，再换液1次，再煮沸1小时，确保将丝胶全部脱除。脱除丝胶的丝素纤维经反复用水冲洗后烘干备用。
取上述脱除丝胶的柞蚕丝素纤维与20倍量(W/V)的7M硝酸钙水溶液混合，在80℃以上溶解2小时；将溶解后的柞蚕丝素液用水透析、脱盐、纯化，制成水溶性柞蚕丝素溶液。接着，利用截留分子量50kDa的超滤装置对丝素溶液进行超滤，由此获得分子量≤50kDa丝素溶液，其浓度为0.5～15％，最好是浓缩或稀释成2.5％水溶性丝素溶液。
将2.5％的水溶性柞蚕丝素溶液，在≥5℃的环境条件下，最好是在25℃环境条件下，以1∶2.3以上的体积比与丙酮(即丙酮加入量为最终体积70％以上)混合，使柞蚕丝素蛋白快速变性成超微颗粒悬浮在有机溶剂中，用15000rpm离心，去除上清液后加水搅匀，再离心，如此反复操作，直至去除丙酮为止。上述的丝素有机溶剂悬浮液也可以通过定性滤纸过滤，用水反复冲洗，再过滤的方法去除丙酮。将上述纯化获得的丝素加入水或水溶液后，经10min超声处理后，纳米丝素颗粒能分散在水或水溶液中，但因颗粒较大，易团聚沉淀。
参见附图11，用柞蚕丝素制备的纳米颗粒悬浮液在日立S-570扫描电镜上放大1万倍情况下丝素颗粒外貌。用丙酮制备的柞蚕丝素颗粒其平均粒度较家蚕纳米丝素颗粒大，分布范围在150～350nm之间。
参见附图12，在MERCURY CCD-AFC8型CCD单晶X-射线衍射仪(日本理学电机株式会社)进行丝素样品分析，管电压为4.0kV，管电流为35mA，扫描速度2°/min，Ni滤波。从2θ＝5°～45°进行扫描，得到水溶性丝素冻干粉和纳米丝素冻干粉的X-射线衍射图谱。
实施例7：
取蓖麻蚕种茧、茧衣或柞蚕废丝或废绸布等清洗后，加入30倍量的0.5％碳酸钠水溶液或其它碱性溶液或者加入表面活性剂等进行煮沸1小时，再换液1次，再煮沸1小时，确保将丝胶全部脱除。脱除丝胶的丝素纤维经反复用水冲洗后烘干备用。
取上述脱除丝胶的蓖麻蚕丝素纤维与20倍量(W/V)的7M硝酸钙水溶液混合，在80℃溶解2小时；将溶解后的蓖麻蚕丝素液用水透析、脱盐、纯化，制成水溶性蓖麻蚕丝素溶液。接着，利用截留分子量50kDa的超滤装置对丝素溶液进行超滤，由此获得分子量50kDa的丝素溶液，其浓度为0.5～15％，最好是浓缩或稀释成2.5％水溶性丝素溶液。
将2.5％的水溶性蓖麻蚕丝素溶液，在≥5℃的环境条件下，最好是在25℃环境条件下，以1∶2.3以上的体积比与乙腈(即乙腈加入量为最终体积70％以上)混合，使蓖麻蚕丝素蛋白快速变性成超微颗粒悬浮在有机溶剂中，用15000rpm离心，去除上清液后加水搅匀，再离心，如此反复操作，直至去除乙腈为止。上述的丝素有机溶剂悬浮液也可以通过定性滤纸过滤，用水反复冲洗，再过滤的方法去除乙腈。将上述纯化获得的丝素加入水或水溶液后，经10min超声处理后，纳米丝素颗粒能很好地分散在水或水溶液中，但因颗粒较大，易团聚沉淀。
参见附图13，用蓖麻蚕丝素制备的纳米颗粒悬浮液在日立S-570扫描电镜上放大1万倍情况下丝素颗粒外貌。用乙腈制备的蓖麻蚕丝素颗粒其平均粒度较柞蚕纳米丝素颗粒大，分布范围在200～450nm之间。
参见附图14，在MERCURY CCD-AFC8型CCD单晶X-射线衍射仪(日本理学电机株式会社)进行丝素样品分析，管电压为4.0kV，管电流为35mA，扫描速度2°/min，Ni滤波。从2θ＝5°～45°进行扫描，得到蓖麻蚕丝素纤维、水溶性丝素冻干粉和纳米丝素冻干粉的X-射线衍射图谱。
我国是产丝大国，在蚕桑生产和缫丝、精练、印染和纺织加工过程中有大量的种茧、茧衣和废丝、废绸布等可利用。本发明主要是利用蚕茧生产和丝加工过程中废料制造纳米丝素，其平均粒径30～60nm，结晶度约为天然纤维的一半(18～25％)，纳米丝素颗粒表面存在的ε-氨基数量约为水溶性丝素一半。这种纳米丝素具有良好的生物相容性，对人体无毒、无害、无免疫性，不易被蛋白酶水解。这种不溶于水的结晶性纳米丝素颗粒由于粒径小，分散性好，具有强力阻挡紫外辐射的功能，可制成各种化妆品、护肤品、特别是防晒膏等；也可以与其它树脂和助粘剂混合制成表面的改性材料、被覆材料、涂料等；可以与其它高分子材料制成新的合成材料，制作人体生物医学材料等；可以与各种染料结合制成天然色素材料用于化妆品、颜料、打印墨水等。这种颗粒生物相容性好、比表面大，性能活泼，表面有许多活性基团如羟基、氨基等，可偶联的生物分子容量大，可作为生物连接物的载体与酶、多肽、药物等结合，由于纳米微粒比血红细胞还小许多，可以在血液中自由运行，因而可作为针剂在疾病诊断和治疗中发挥独特作用。
表1.
  培养时间(天数)                 大肠杆菌                 枯草杆菌
  1   2   3   平均值±SD   1   2   3   平均值±SD
  0591530   0.2940.6320.9081.2661.277   0.3740.5940.7270.9981.215   0.3330.6500.9390.9551.398   0.334±0.0400.625±0.0290.858±0.1341.069±0.1691.297±0.093   0.6351.2251.3061.2631.434   0.5931.2041.5571.4451.556   0.4861.1691.4541.5181.546   0.571±0.0761.199±0.0281.439±0.1261.409±0.1311.512±0.068
表2.
  培养时间(天数)                 大肠杆菌                  枯草杆菌
  1   2   3   平均±SD   1   2   3   平均±SD
  0481530   0.0010.0450.0340.0360.034   0.0040.0440.0460.0320.029   0.0080.0590.0410.0420.021   0.004±0.0030.049±0.0080.040±0.0060.037±0.0030.024±0.007   0.0030.0340.0190.0170.015   0.0010.0310.0100.0190.012   0.0040.0440.0260.0120.009   0.003±0.0020.036±0.0070.018±0.0080.016±0.0040.012±0.003

Claims (6)

1.纳米丝素颗粒的制造方法，其特征在于：水溶性丝素溶液与有机溶剂混合，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇或丙酮，丝素分子量≤200kDa，所述的丝素溶液浓度为0.1～20％，丝素溶液与有机溶剂的体积比为1∶2.3以上，工作环境温度在5～50℃，形成乳白色的球形微粒分散在有机溶剂体系中，得到纳米丝素颗粒混合液或悬浮液，再去除其中的有机溶剂，得到结晶性丝素纳米颗粒悬浮液或丝素纳米粉末。
2.根据权利要求1所述的纳米丝素颗粒的制造方法，其特征在于：所述的水溶性丝素包括由家蚕丝或野蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝、蜘蛛丝脱胶精制或纯化而成，或者由基因工程生产的类蚕丝丝素蛋白纯化而成。
3.根据权利要求1所述的纳米丝素颗粒的制造方法，其特征在于：对纳米丝素颗粒的有机溶剂混合液或悬浮液进行反复离心脱水处理，直至完全去除有机溶剂。
4.根据权利要求1所述的纳米丝素颗粒的制造方法，其特征在于：对纳米丝素颗粒的有机溶剂混合液或悬浮液进行反复过滤、清洗处理，直至完全去除有机溶剂。
5.根据权利要求1所述的纳米丝素颗粒的制造方法，其特征在于：对获得的丝素纳米颗粒加入纯水或水溶液后进行超声处理1～10min，制成纳米丝素液。
6.根据权利要求1所述的纳米丝素颗粒的制造方法，其特征在于：对获得的丝素纳米颗粒的有机溶剂混合液或悬浮液进行真空冷冻干燥，制成纳米丝素粉末。
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