CN110698556A - 一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺 - Google Patents

一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺，对丝素蛋白进行酶解处理后形成小分子丝素蛋白，引入淀粉并酶解，淀粉酶解后产生粘性小分子物质，粘附于小分子丝素蛋白表面，结合乙醇的诱导作用、聚乙二醇二缩水甘油醚的交联作用以及冻融作用，使得产品尺寸呈纳米级，可透皮吸收，美容效果佳。本发明为冻干粉产品，高活性，方便使用。

Description

一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺
技术领域
本发明涉及美容产品技术领域，特别地，涉及一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺。
背景技术
人体皮肤承受着来自外界的紫外线、雾霾等伤害，而且随着人类生活环境的不断恶化和生活节奏的不断加快，环境污染和生活压力等都会对人体皮肤带来很多问题，比如：皮肤干燥、色斑、暗疮、皱纹、皮肤敏感等。另外，由于人们对生活品质的需求也较以往有很大提高，故对美容需求也越来越高。随着整体健康观念的形成和对更高生活品质的追求，中国美容业的发展近年来快速提升，每年以超过20％的速度增长，已为全球第三大市场，行业前景广阔。
蚕丝是天然的蛋白质纤维，其中含有70％左右的丝素，而丝素中蛋白质丰富。丝素蛋白，就是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，含量约占蚕丝的70％～80％，含有18种氨基酸，其中含有的亮氨酸可加速细胞的新陈代谢，丝氨酸、苏氨酸可延缓皮肤老化，色氨酸、酪氨酸能吸收紫外线，可以说是美容产品的一种良好选择。
专利CN103923200A公开了一种大分子量丝素蛋白冻干粉，是将蚕丝通过脱胶、溴化锂溶解、透析、离心、高温高压灭菌以及冷冻干燥后得到的粉末，该产品的平均分子量大于10万道尔顿，纯化后以50-300nm的颗粒状存在于溶液中，分子结构为无规卷曲状和α-螺旋状，主要用于临床中的组织修复。
倘若要将其应用于美容，通常认为分子量大于500道尔顿的物质不易通过角质层，这类大分子量产品只能停留于皮肤表面，短暂解决皮肤表面的问题，无法直达皮肤深层，不能从根本上改善皮肤问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺，以解决大分子量丝素蛋白无法透皮吸收、美容效果有限的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺，具体步骤如下：
(1)先提取丝素蛋白，得到丝素蛋白溶液；
(2)然后加入弹性蛋白酶实现对丝素蛋白的酶解，加入淀粉，超声波振荡均匀，再加入β-淀粉酶和普鲁兰酶实现对淀粉的酶解，过滤，得混合液；
(3)接着边搅拌边将混合液缓慢滴加至乙醇中，滴加完毕后加入聚乙二醇二缩水甘油醚，50～55℃反应70～80分钟；
(4)冻融处理，灭菌，冷冻干燥，包装，即得所述的一种丝素蛋白冻干粉。
优选的，步骤(1)的具体方法是：先将蚕丝进行脱胶处理，然后进行水解，即得所述的丝素蛋白溶液。
进一步优选的，所述蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝或天蚕丝。
进一步优选的，脱胶处理的具体方法是：将蚕丝浸泡于4～6倍重量的质量浓度0.05～0.1％碳酸钠水溶液中，边搅拌边煮沸处理30～40分钟，重复3～4次，捞出后用去离子水洗涤2～3次即可。
进一步优选的，水解的具体方法是：将脱胶处理后的蚕丝浸泡于3～5倍重量的质量浓度1～1.2％的氯化钾溶液中，在130～140℃和0.5～0.6MPa条件下处理2～3小时。
优选的，步骤(2)中，向丝素蛋白溶液中加入8～10U弹性蛋白酶，25～30℃反应5～8小时，灭酶，即可实现对丝素蛋白的酶解。
优选的，步骤(2)中，所述淀粉为木薯淀粉，应进行预处理，具体方法是：将木薯淀粉加入3～4倍重量的水中制成淀粉浆，调整其pH＝6～6.5，于120～130℃焙烧10～15分钟，自然冷却至室温(25℃)，然后冰盐浴冷却至0℃以下，并保持此温度范围直至投料。
优选的，步骤(2)中，超声波振荡均匀后，加热至60～70℃，糊化处理30～40分钟，冷却至52～56℃，加入8～10Uβ-淀粉酶和5～8U普鲁兰酶，反应10～12小时，灭酶即可。
优选的，步骤(3)中，混合液的滴加时间为50～70分钟。
优选的，步骤(3)中，混合液、乙醇、聚乙二醇二缩水甘油醚的体积比为1：3～4：0.4～0.5。
优选的，步骤(4)中，冻融处理的具体方法是：先在-10～-5℃条件下冷冻处理8～10小时，然后室温(25℃)融化解冻，离心去除不溶物。
优选的，步骤(4)中，灭菌的工艺条件为：121℃和0.1MPa条件下处理30～40分钟。
优选的，步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先在-20～-25℃冷冻8～10小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至30～33℃，保温8～10小时。
优选的，步骤(4)中，包装的具体方法是：利用10mL规格的西林瓶进行分装，压盖密封。
利用上述制备方法得到的一种丝素蛋白冻干粉。
本发明具有以下有益效果：
本发明对丝素蛋白进行酶解处理后形成小分子丝素蛋白，引入淀粉并酶解，淀粉酶解后产生粘性小分子物质，粘附于小分子丝素蛋白表面，结合乙醇的诱导作用、聚乙二醇二缩水甘油醚的交联作用以及冻融作用，使得产品尺寸呈纳米级，可透皮吸收，美容效果佳。本发明为冻干粉产品，高活性，方便使用。具体分析如下：
1、将弹性蛋白酶加入丝素蛋白溶液中实现对丝素蛋白的降解，加入淀粉，超声波振荡均匀，使得小分子丝素蛋白包裹于大分子淀粉中。β-淀粉酶，对于像直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖，作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α－1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精；普鲁兰酶水解支链淀粉或糖原的α-1，6-糖苷键，生成长短不一的直链淀粉(糊精)，因此，β-淀粉酶一方面作用于直链，另一方面促进普鲁兰酶对支链的降解，两者共同作用生成粘性的小分子物质，并顺势粘附于小分子丝素蛋白的表面。该粘附作用可以促进小分子丝素蛋白之间的分离，促进纳米级丝素蛋白的形成。
为了促进纳米级丝素蛋白的形成，丝素蛋白和淀粉的酶解顺序不可颠倒，倘若先对淀粉酶解，无法实现对丝素蛋白的粘附，也就很难获得纳米级产品。
2、混合液滴加至乙醇中，在微观上乙醇呈现过量的状态，乙醇包围着表面粘附小分子淀粉酶解产物的小分子丝素蛋白，乙醇中的羟基与丝素蛋白的氨基、羧酸形成氢键，促进β-折叠结构，使得纳米颗粒尺寸继续缩小。小分子淀粉酶解产物也可与乙醇形成氢键，形成外围氢键，外围氢键的直线方向性进一步压缩了β-折叠结构，使得纳米颗粒进一步缩小。
之所以选择乙醇而非甲醇等含有羟基的物质，是因为后续加入的聚乙二醇二缩水甘油醚溶于乙醇，溶剂的选择有利于后续反应的实现。
3、聚乙二醇二缩水甘油醚两端的环氧基团与丝素蛋白中的苯羟基、氨基以及亚氨基等反应，引入大量醚键，改善脂溶性，由于皮肤细胞间隙充满了如神经酰胺的脂质，故脂溶性的改善更加有利于通过细胞间隙，实现皮肤吸收。
4、冻融处理即先冷冻再解冻，冷冻时由外至内形成冰晶，解冻时冰晶融化为水，伴随着冰晶的形成和融化，会对纳米颗粒的表面造成破坏，增加表面积，有利于前述聚乙二醇二缩水甘油醚修饰后所引入醚键与皮肤之间的充分接触，进一步促进皮肤吸收。也正是冻融处理形成了无数微孔，可促进产品与溶媒混合后迅速复溶。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
说明书附图
图1为实施例1所得冻干粉的扫描电镜图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例1：
一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺，具体步骤如下：
(1)先提取丝素蛋白，得到丝素蛋白溶液；
(2)然后加入弹性蛋白酶实现对丝素蛋白的酶解，加入淀粉，超声波振荡均匀，再加入β-淀粉酶和普鲁兰酶实现对淀粉的酶解，过滤，得混合液；
(3)接着边搅拌边将混合液缓慢滴加至乙醇中，滴加完毕后加入聚乙二醇二缩水甘油醚，50℃反应80分钟；
(4)冻融处理，灭菌，冷冻干燥，包装，即得所述的一种丝素蛋白冻干粉。
其中，步骤(1)的具体方法是：先将蚕丝进行脱胶处理，然后进行水解，即得所述的丝素蛋白溶液。所述蚕丝为桑蚕丝。脱胶处理的具体方法是：将蚕丝浸泡于4倍重量的质量浓度0.1％碳酸钠水溶液中，边搅拌边煮沸处理30分钟，重复4次，捞出后用去离子水洗涤2次即可。水解的具体方法是：将脱胶处理后的蚕丝浸泡于5倍重量的质量浓度1％的氯化钾溶液中，在140℃和0.5MPa条件下处理3小时。
步骤(2)中，向丝素蛋白溶液中加入8U弹性蛋白酶，30℃反应5小时，灭酶，即可实现对丝素蛋白的酶解。
步骤(2)中，所述淀粉为木薯淀粉，应进行预处理，具体方法是：将木薯淀粉加入4倍重量的水中制成淀粉浆，调整其pH＝6，于130℃焙烧10分钟，自然冷却至室温(25℃)，然后冰盐浴冷却至0℃以下，并保持此温度范围直至投料。
步骤(2)中，超声波振荡均匀后，加热至70℃，糊化处理30分钟，冷却至56℃，加入8Uβ-淀粉酶和8U普鲁兰酶，反应10小时，灭酶即可。
步骤(3)中，混合液的滴加时间为70分钟。混合液、乙醇、聚乙二醇二缩水甘油醚的体积比为1：3：0.5。
步骤(4)中，冻融处理的具体方法是：先在-10℃条件下冷冻处理10小时，然后室温(25℃)融化解冻，离心去除不溶物。
步骤(4)中，灭菌的工艺条件为：121℃和0.1MPa条件下处理30分钟。
步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先在-25℃冷冻8小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至33℃，保温8小时。
利用上述制备方法得到的一种丝素蛋白冻干粉(扫描电镜图见图1)。
实施例2：
一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺，具体步骤如下：
(1)先提取丝素蛋白，得到丝素蛋白溶液；
(2)然后加入弹性蛋白酶实现对丝素蛋白的酶解，加入淀粉，超声波振荡均匀，再加入β-淀粉酶和普鲁兰酶实现对淀粉的酶解，过滤，得混合液；
(3)接着边搅拌边将混合液缓慢滴加至乙醇中，滴加完毕后加入聚乙二醇二缩水甘油醚，55℃反应70分钟；
(4)冻融处理，灭菌，冷冻干燥，包装，即得所述的一种丝素蛋白冻干粉。
其中，步骤(1)的具体方法是：先将蚕丝进行脱胶处理，然后进行水解，即得所述的丝素蛋白溶液。所述蚕丝为柞蚕丝。脱胶处理的具体方法是：将蚕丝浸泡于6倍重量的质量浓度0.05％碳酸钠水溶液中，边搅拌边煮沸处理40分钟，重复3次，捞出后用去离子水洗涤3次即可。水解的具体方法是：将脱胶处理后的蚕丝浸泡于3倍重量的质量浓度1.2％的氯化钾溶液中，在130℃和0.6MPa条件下处理2小时。
步骤(2)中，向丝素蛋白溶液中加入10U弹性蛋白酶，25℃反应8小时，灭酶，即可实现对丝素蛋白的酶解。
步骤(2)中，所述淀粉为木薯淀粉，应进行预处理，具体方法是：将木薯淀粉加入3倍重量的水中制成淀粉浆，调整其pH＝6.5，于120℃焙烧15分钟，自然冷却至室温(25℃)，然后冰盐浴冷却至0℃以下，并保持此温度范围直至投料。
步骤(2)中，超声波振荡均匀后，加热至60℃，糊化处理40分钟，冷却至52℃，加入10Uβ-淀粉酶和5U普鲁兰酶，反应12小时，灭酶即可。
步骤(3)中，混合液的滴加时间为50分钟。混合液、乙醇、聚乙二醇二缩水甘油醚的体积比为1：4：0.4。
步骤(4)中，冻融处理的具体方法是：先在-5℃条件下冷冻处理8小时，然后室温(25℃)融化解冻，离心去除不溶物。
步骤(4)中，灭菌的工艺条件为：121℃和0.1MPa条件下处理40分钟。
步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先在-20℃冷冻10小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至30℃，保温10小时。
利用上述制备方法得到的一种丝素蛋白冻干粉。
实施例3：
一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺，具体步骤如下：
(1)先提取丝素蛋白，得到丝素蛋白溶液；
(2)然后加入弹性蛋白酶实现对丝素蛋白的酶解，加入淀粉，超声波振荡均匀，再加入β-淀粉酶和普鲁兰酶实现对淀粉的酶解，过滤，得混合液；
(3)接着边搅拌边将混合液缓慢滴加至乙醇中，滴加完毕后加入聚乙二醇二缩水甘油醚，53℃反应75分钟；
(4)冻融处理，灭菌，冷冻干燥，包装，即得所述的一种丝素蛋白冻干粉。
其中，步骤(1)的具体方法是：先将蚕丝进行脱胶处理，然后进行水解，即得所述的丝素蛋白溶液。所述蚕丝为天蚕丝。脱胶处理的具体方法是：将蚕丝浸泡于5倍重量的质量浓度0.08％碳酸钠水溶液中，边搅拌边煮沸处理35分钟，重复3次，捞出后用去离子水洗涤2次即可。水解的具体方法是：将脱胶处理后的蚕丝浸泡于4倍重量的质量浓度1.1％的氯化钾溶液中，在135℃和0.55MPa条件下处理2.5小时。
步骤(2)中，向丝素蛋白溶液中加入9U弹性蛋白酶，28℃反应7小时，灭酶，即可实现对丝素蛋白的酶解。
步骤(2)中，所述淀粉为木薯淀粉，应进行预处理，具体方法是：将木薯淀粉加入3.5倍重量的水中制成淀粉浆，调整其pH＝6，于125℃焙烧12分钟，自然冷却至室温(25℃)，然后冰盐浴冷却至0℃以下，并保持此温度范围直至投料。
步骤(2)中，超声波振荡均匀后，加热至65℃，糊化处理35分钟，冷却至55℃，加入9Uβ-淀粉酶和6U普鲁兰酶，反应11小时，灭酶即可。
步骤(3)中，混合液的滴加时间为60分钟。混合液、乙醇、聚乙二醇二缩水甘油醚的体积比为1：3.5：0.45。
步骤(4)中，冻融处理的具体方法是：先在-8℃条件下冷冻处理9小时，然后室温(25℃)融化解冻，离心去除不溶物。
步骤(4)中，灭菌的工艺条件为：121℃和0.1MPa条件下处理35分钟。
步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先在-22℃冷冻9小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至31℃，保温9小时。
利用上述制备方法得到的一种丝素蛋白冻干粉。
对比例1
将步骤(2)替换为：加入淀粉，超声波振荡均匀，加入β-淀粉酶和普鲁兰酶实现对淀粉的酶解，然后加入弹性蛋白酶实现对丝素蛋白的酶解，过滤，得混合液；其余同实施例1。
对比例2
将步骤(2)中的β-淀粉酶用普鲁兰酶替换；其余同实施例1。
对比例3
将步骤(3)替换为：接着将聚乙二醇二缩水甘油醚加入混合液中，53℃反应75分钟；其余同实施例1。
对比例4
略去步骤(3)中的聚乙二醇二缩水甘油醚；其余同实施例1。
对比例5
略去步骤(4)中的冻融处理；其余同实施例1。
试验例
1、复溶性考察
将实施例1～3和对比例5所得冻干粉加入溶媒(去离子水)进行复溶，结果见表1。
表1.复溶性考察结果
复溶时间(s)
实施例1 22
实施例2 23
实施例3 18
对比例5 35
由表1可知，实施例1～3的冻干粉复溶时间短，对比例5略去步骤(4)中的冻融处理，产品的复溶性明显变差，说明冻融处理形成的孔洞有利于产品复溶性的改善。
2、美容效果考察
任选志愿者90名，年龄30～45岁，随机分为9组，前8组分别使用实施例1～3或对比例1～5的冻干粉产品，最后一组作为对照组，用去离子水替代冻干粉产品；使用方法：将冻干粉复溶于3倍重量的去离子水中，每天早晚各均匀涂抹于脸部，连续使用两周。
对志愿者使用前后的脸部皮肤进行皮肤弹性测试，测试前，志愿者清洁皮肤后，在21±1℃、相对湿度50％±10％环境下稳定至少30分钟。
皮肤弹性测试采用德国CK Cutometer dual MPA580型皮肤弹性测试仪，把探头垂直轻轻接触待测试皮肤区域，以探头顶端弹簧全部缩进为宜，开始测试，直至测试循环时间结束后方可把探头挪开，并盖上探头盖。邻近肌肤取3点测试，最后核算取R2(皮肤弹性参数，越接近于1，皮肤弹性越好)的平均值：R2＝Ua/Uf，其中，Ua为从取消负压到下一次连续测试皮肤表面再加负压时皮肤的恢复值，Uf为有负压时的皮肤最大拉伸量。测试结果见表2。
表2.皮肤弹性考察
由表2可知，与对照组相比，实施例1～3的冻干粉产品可明显改善皮肤弹性，使用两周即可见效。对比例1将步骤(2)替换为：加入淀粉，超声波振荡均匀，加入β-淀粉酶和普鲁兰酶实现对淀粉的酶解，然后加入弹性蛋白酶实现对丝素蛋白的酶解，过滤，得混合液；先对淀粉酶解，无法实现对丝素蛋白的粘附，也就很难获得纳米级产品，产品对皮肤弹性的改善效果明显变差。对比例2将步骤(2)中的β-淀粉酶用普鲁兰酶替换，单凭普鲁兰酶的作用，对淀粉支链的降解作用有限，影响粘性小分子物质的形成，进而影响纳米级丝素蛋白的形成，产品对皮肤弹性的改善效果明显变差。对比例3将步骤(3)替换为：接着将聚乙二醇二缩水甘油醚加入混合液中，53℃反应75分钟；略去乙醇，一方面不利于纳米颗粒的尺寸缩小，另一方面不利于反应的进行，脂溶性变差，皮肤吸收变差，对皮肤弹性的改善效果变差。对比例4略去步骤(3)中的聚乙二醇二缩水甘油醚，产品脂溶性明显变差，皮肤吸收明显变差，对皮肤弹性的改善效果明显变差。对比例5略去步骤(4)中的冻融处理，减弱了与皮肤之间的充分接触，影响皮肤吸收，对皮肤弹性的改善效果明显变差。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种丝素蛋白冻干粉的制备工艺，其特征在于，具体步骤如下：
(1)先提取丝素蛋白，得到丝素蛋白溶液；
(2)然后加入弹性蛋白酶实现对丝素蛋白的酶解，加入淀粉，超声波振荡均匀，再加入β-淀粉酶和普鲁兰酶实现对淀粉的酶解，过滤，得混合液；
(3)接着边搅拌边将混合液缓慢滴加至乙醇中，滴加完毕后加入聚乙二醇二缩水甘油醚，50～55℃反应70～80分钟；
(4)冻融处理，灭菌，冷冻干燥，包装，即得所述的一种丝素蛋白冻干粉。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：先将蚕丝进行脱胶处理，然后进行水解，即得所述的丝素蛋白溶液。
3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(2)中，向丝素蛋白溶液中加入8～10U弹性蛋白酶，25～30℃反应5～8小时，灭酶，即可实现对丝素蛋白的酶解。
4.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(2)中，所述淀粉为木薯淀粉，应进行预处理，具体方法是：将木薯淀粉加入3～4倍重量的水中制成淀粉浆，调整其pH＝6～6.5，于120～130℃焙烧10～15分钟，自然冷却至室温(25℃)，然后冰盐浴冷却至0℃以下，并保持此温度范围直至投料。
5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(2)中，超声波振荡均匀后，加热至60～70℃，糊化处理30～40分钟，冷却至52～56℃，加入8～10Uβ-淀粉酶和5～8U普鲁兰酶，反应10～12小时，灭酶即可。
6.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(3)中，混合液的滴加时间为50～70分钟。
7.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(3)中，混合液、乙醇、聚乙二醇二缩水甘油醚的体积比为1：3～4：0.4～0.5。
8.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(4)中，冻融处理的具体方法是：先在-10～-5℃条件下冷冻处理8～10小时，然后室温融化解冻，离心去除不溶物。
9.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤(4)中，冷冻干燥的工艺条件为：先在-20～-25℃冷冻8～10小时，然后抽真空至5Pa以下，维持真空度不变，升温至30～33℃，保温8～10小时。
10.利用权利要求1～9中任一项所述制备方法得到的一种丝素蛋白冻干粉。
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