CN104936979B

CN104936979B - 多肽颗粒及其制造方法

Info

Publication number: CN104936979B
Application number: CN201480005727.7A
Authority: CN
Inventors: 大泽利昭; 森田启介
Original assignee: Spiber Inc
Current assignee: Spiber Inc
Priority date: 2013-04-25
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2034-04-18
Also published as: US20150376247A1; EP2990414A1; EP2990414B1; CN104936979A; US9732125B2; JP5823079B2; JPWO2014175179A1; WO2014175179A1; EP2990414A4

Abstract

本发明提供一种多肽颗粒，为来自蛛丝蛋白质的多肽颗粒，其中，所述颗粒的平均粒径为1000nm以下。本发明提供一种多肽颗粒的制造方法，使所述多肽溶解于选自由DMSO、DMF或它们中添加有无机盐的溶剂构成的组中的至少一种的溶剂中，得到多肽的溶液的溶液生成工序；通过将所述溶液生成工序中生成的溶液替换为水溶性溶剂而得到多肽的水溶液的工序；和对所述多肽的水溶液进行干燥的工序。由此，可以提供使多肽颗粒的特性明确，并且对生物体的应用优异，可对化妆品等应用的多肽颗粒及其制造方法。

Description

多肽颗粒及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种来自蛛丝蛋白质的多肽颗粒(粒子)及其制造方法。

背景技术

探讨了多肽对生物体材料的应用。在专利文献1中提出了一种将丝素蛋白溶解于聚乙二醇等的吸湿聚合物的水凝胶、薄膜、海绵状泡沫。在专利文献2中公开有一种以蜘蛛丝为原料、进行光交联的凝集体。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特表2007-515391号公报

专利文献2:日本特表2008-506409号公报

发明内容

发明所要解决的课题

但是，现有法中所提出的溶剂的尿素水溶液，其溶解蛛丝蛋白质的力弱，胍水溶液或六氟异丙醇(HFIP)等价格昂贵，且溶剂残存时，难以适用于生物体成为问题。另外，关于现有的丝素蛋白的粒体，其特性尚不明确。

本发明为了解决上述现有的问题，提供一种对生物体的应用优异的多肽颗粒及其制造方法，另外，本发明还要以使来自蛛丝蛋白质的多肽颗粒的特性明确为解决课题。

用于解决课题的技术方案

本发明提供一种多肽颗粒，来自蛛丝蛋白质，其特征在于，所述多肽含有水溶性多肽，平均粒径为1000nm以下。予以说明，在此所说的水溶性多肽包含完全溶解于水溶性溶剂的物质、或分散于水溶性溶剂中并实质上为溶解状态的物质。

本发明提供一种多肽颗粒的制造方法，其特征在于，包括：使来自蛛丝蛋白质的多肽溶解于由下述(A)～(C)构成的组中的至少一种溶解用溶剂中而得到多肽的溶液的溶液生成工序；通过将所述溶液生成工序中生成的溶液替换为水溶性溶剂而得到多肽的水溶液的工序；和对所述多肽的水溶液进行干燥的工序。

(A)二甲基亚砜、

(B)在二甲基亚砜中加入有无机盐的溶液、

(C)在N,N-二甲基甲酰胺中加入有无机盐的溶液。

予以说明，在此所说的多肽的水溶液包含多肽完全溶解的物质、多肽的微粒子分散而实质上具有水溶液的形态的物质这两方。下面，以同一意思使用。另外，在此所说的“使多肽溶解于溶解用溶剂”包含使多肽完全溶解于溶解用溶剂、和通过使多肽的微粒分散于溶解用溶剂中而成为使多肽的微粒实质上溶解于溶解用溶剂的形态这两者。以下，在相同的意义中使用。

发明效果

本发明在制作多肽溶液时使用特定的溶剂，通过替换为水溶性溶剂而取得多肽凝胶并进行干燥，由此可以制造几乎不含有残存溶剂或残存溶液非常少的多肽颗粒。另外，本发明的多肽颗粒由于平均粒径非常小，所以相较于平均粒径大的颗粒，例如可更大量地附着于药剂或香料等规定的基材表面上。因此，在本发明的多肽颗粒中，在附着于药剂或香料等基材表面上时，即使一个个粒子的基材表面上的分解速度或从基材表面上的脱离速度与大的平均粒径的粒子相同，也能够高效地减缓基材表面的露出。而且，作为其结果，发挥可以使药剂或香料的效果缓慢释放的优异的特性。

予以说明，本发明的颗粒中，形状为大致球状的颗粒适合用作化妆品或涂料的成分等。而且，本发明手法中使用的溶剂为丙烯酸系纤维或聚酰亚胺树脂的制造中使用的溶剂，还具有成本低的优点。

附图说明

图1是本发明实施例1的多肽颗粒的扫描型电子显微镜(SEM)照片(倍率15，000)。

图2是本发明实施例2的多肽颗粒的扫描型电子显微镜(SEM)照片(倍率15，000)。

图3是本发明实施例3的多肽颗粒的扫描型电子显微镜(SEM)照片(倍率15，000)。

具体实施方式

本发明的蛋白质使用来自蛛丝蛋白质的多肽。来自蛛丝蛋白质的多肽只要是来自天然型蛛丝蛋白质或类似的多肽即可，没有特别限定。例如包含天然型蛛丝蛋白质的变异体、类似体或衍生物等。从坚韧性优异的观点出发，上述重组蛛丝蛋白质优选为来自蜘蛛的大壶状腺中产生的大吐丝管牵引丝蛋白质的重组蛛丝蛋白质。作为上述大吐丝管牵引丝蛋白质，可列举来自美国络新妇蛛(Nephila clavipes)的大壶状腺丝蛋白MaSp1或MaSp2、来自十字圆蛛(Araneus diadematus)的ADF3或ADF4等。

上述重组蛛丝蛋白质可以为来自蜘蛛的小壶状腺中所产生的小吐丝管牵引丝的重组蛛丝蛋白质。作为上述小吐丝管牵引丝蛋白质，可列举来自美国络新妇蛛(Nephilaclavipes)的小壶状腺丝蛋白MiSp1或MiSp2。

此外，上述重组蛛丝蛋白质可以为来自蜘蛛的鞭毛状腺(flagelliform gland)中所产生的横丝蛋白质的重组蛛丝蛋白质。作为上述横丝蛋白质，可列举例如来自美国络新妇蛛(Nephila clavipes)的鞭毛状丝蛋白质(flagelliform silk protein)等。

作为来自所述大吐丝管牵引丝蛋白质的多肽，可列举含有式1：REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的单元2个以上、优选4个以上、更优选6个以上的多肽。予以说明，在来自所述大吐丝管牵引丝蛋白质的组多肽中，式(1)：REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的单元可以相同，也可以不同。上述式(1)中，REP1是指聚丙氨酸。在所述REP1中，连续排列的丙氨酸优选为2残基以上，更优选为3残基以上，进一步优选为4残基以上，特别优选为5残基以上。另外，在所述REP1中，连续排列的丙氨酸优选为20残基以下，更优选为16残基以下，进一步优选为14残基以下，特别优选为12残基以下。上述式(1)中，REP2为由10～200残基的氨基酸构成的氨基酸序列，所述氨基酸序列中所含的甘氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸及丙氨酸的总计残基数相对于氨基酸残基数整体为40％以上，优选为50％以上，更优选为60％以上。

在大吐丝管牵引丝中，所述REP1相当于在纤维内形成结晶β片材的结晶区域，所述REP2相当于在纤维内更具有柔软性、且大部分欠缺有规则的结构的无定型区域。而且，所述[REP1-REP2]相当于由结晶区域和无定型区域构成的重复区域(重复序列)，为牵引丝蛋白质的特征的序列。

作为含有上述式1：REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的单元2个以上的多肽，可列举例如具有序列号1、序列号2、序列号3及序列号4中的任一序列号所示的氨基酸序列的来自ADF3的重组蛛丝蛋白质。序列号1所示的氨基酸序列相当于在从NCBI数据库中获得的ADF3的部分的氨基酸序列(NCBI的基因库的登录号：AAC47010、GI：1263287)的N末端附加有由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号5)的氨基酸序列的从第1残基至第542残基的氨基酸序列。序列号2所示的氨基酸序列为在N末端附加有由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶(Humanrhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号5)的ADF3的氨基酸序列(NCBI的基因库的登录号：AAC47010、GI：1263287)中，使第1～13号的重复区域以成为大约2倍的方式增加，同时以在第1154号氨基酸残基上终止的方式使翻译变异的氨基酸序列。序列号3所示的氨基酸序列为在从NCBI数据库中获得的ADF3的部分的氨基酸序列(NCBI的基因库的登录号：AAC47010、GI：1263287)的N末端附加有由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号5)的氨基酸序列。序列号4所示的氨基酸序列为在N末端附加有由起始密码子、His10标签及HRV3C蛋白酶(Humanrhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号5)的ADF3的氨基酸序列(NCBI的基因库的登录号：AAC47010、GI：1263287)中，使第1～13号的重复区域以成为大约2倍的方式增加的氨基酸序列。另外，作为含有上述式1：REP1-REP2(1)所示的氨基酸序列的单元2个以上的多肽，可以使用包含在序列号1、序列号2、序列号3及序列号4中的任一序列号所示的氨基酸序列中1个或多个的氨基酸被替换、缺失、插入和/或附加的氨基酸序列、且具有由结晶区域和无定型区域构成的重复区域的多肽。

本发明中，“1个或多个”是指例如1～40个、1～35个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、或1个或数个。另外，本发明中，“1个或数个”是指1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、或1个。

作为来自上述小吐丝管牵引丝蛋白质的重组蛛丝蛋白质，可列举含有式2：REP3(2)所示的氨基酸序列的多肽。在上述式2中，REP3是指由(Gly-Gly-Z)m(Gly-Ala)l(A)r构成的氨基酸序列，Z是指任意一个氨基酸，特别优选为选自由Ala、Tyr及Gln构成的组中的一个氨基酸。另外，m优选为1～4，l优选为0～4，r优选为1～6。

在蛛丝中，小吐丝管牵引丝从蜘蛛的巢穴的中心卷绕成螺旋状，作为巢穴的增强材料使用，或作为包住捕捉的猎获物的丝被利用。已知有与大吐丝管牵引丝相比时，拉伸强度差，但伸缩性高。其认为是因为，在小吐丝管牵引丝中，许多结晶区域由甘氨酸和丙氨酸交替地连结的区域形成，因此，与仅由丙氨酸形成结晶区域的大吐丝管牵引丝相比，结晶区域的氢键容易变弱。

作为来自上述横丝蛋白质的重组蛛丝蛋白质，可列举含有式3：REP4(3)所示的氨基酸序列的多肽。在上述式3中，REP4是指由(Gly-Pro-Gly-Gly-X)n构成的氨基酸序列，X是指任意一个氨基酸，特别优选为选自由Ala、Ser、Tyr及Val构成的组中的一个氨基酸。另外，n表示至少4以上的数字，优选为10以上，更优选为20以上。

在蛛丝中，横丝的重要特征在于不具有结晶区域、具有由无定形区域构成的重复区域。由于在大吐丝管牵引丝等中，具有由结晶区域和无定形区域构成的重复区域，因此，推测为同时具有高的应力和伸缩性。另一方面，关于横丝，与大吐丝管牵引丝相比时，应力差，但具有高伸缩性。其认为是因为，横丝的大部分由无定形区域构成。

所述多肽可以使用在含有编码多肽的基因的表达载体中进行了转化的宿主而制造。基因的制造方法没有特别限制，将编码天然型蛛丝蛋白质的基因从来自蜘蛛的细胞通过聚合酶连锁反应(PCR)等进行扩增而克隆、或化学性地合成。基因的化学的合成方法也没有特别限制，例如，可以以由NCBI的Web数据库等获得的天然型蛛丝蛋白质的氨基酸序列信息为基础，将由AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare Japan株式会社)等自动合成的低聚核甙酸通过PCR等连结而合成。此时，为了容易进行蛋白质的精制或确认，可以合成编码包含在所述的氨基酸序列的N末端附加有由起始密码子及His10标签构成的氨基酸序列的氨基酸序列的蛋白质的基因。作为所述表达载体，可以使用由DNA序列能表达蛋白质的质粒、噬菌体、病毒等。作为所述质粒型表达载体，只要是在宿主细胞内目标基因表达、且自身可以扩增的表达载体即可，没有特别限定。例如使用大肠杆菌Rosetta(DE3)作为宿主的情况下，可以使用pET22b(+)质粒载体、pCold质粒载体等。其中，从蛋白质的生产率的观点出发，优选使用pET22b(+)质粒载体。作为所述宿主，可以使用例如动物细胞、植物细胞、微生物等。

另外，所述多肽中包含在将所述溶液生成工序中生成的溶液替换为水溶性溶剂时完全溶解于水溶性溶剂中的水溶性的物质、或分散于水溶性溶剂中而实质上成为溶解状态的物质。予以说明，不管多肽的特性，例如如果降低所述溶液生成工序中生成的溶液中的多肽浓度，则可以得到由水溶性溶剂替换该溶液时多肽分散了的多肽的实质的水溶液。另外，这种多肽的分散即使在从低温状态提高温度至高温状态时也会发生。总之，就多肽颗粒而言，作为多肽，包含在将所述溶液生成工序中生成的溶液替换为水溶性溶剂时溶解于水溶性溶剂、或例如作为纳米尺寸的微粒分散并实质上成为水溶液的多肽。

本发明的多肽颗粒的平均粒径为1000nm以下。优选的下限值为246nm。如果在所述范围，则不仅滑动性良好，而且也可以实现过滤，在成本方面有利。如果平均粒径超过1000nm，则比表面积有降低的趋势。如果平均粒径低于246nm，则过滤有变得困难的趋势。所述多肽颗粒的形状优选为球状。如果为球状，则可以最密地充填，滑动性也良好，作为化妆品或涂料的成分适合。

本发明的多肽颗粒通过如下工序来得到，即，使来自蛛丝蛋白质的多肽溶解于选自由下述(A)～(C)构成的组中的至少一种溶解用溶剂而得到多肽的溶液的溶液生成工序；通过将所述溶液生成工序中生成的溶液替换为水溶性溶剂而得到多肽的水溶液的工序；和将所述多肽的水溶液进行干燥的工序。

(A)二甲基亚砜

(B)在二甲基亚砜中加入有无机盐的溶液

(C)在N,N-二甲基甲酰胺中加入有无机盐的溶液

也可以使得到的多肽颗粒的内部存在选自由二甲基亚砜及N,N-二甲基甲酰胺构成的组中的至少一种。所述溶解用溶剂的存在量没有特别限定，为在将所述溶液生成工序中所生成的溶液替换为所述水溶性溶剂之后无意地残存的程度的量。

溶解用溶剂除所述(A)～(C)所示的物质之外，可以含有醇和/或水。所述溶解用溶剂为极性溶剂，具有容易吸收空气中的水分的性质，因此，通常所出售的溶剂也有含有数％水的情况。可以含有该程度的水或醇。但是，作为溶解用溶剂起作用的是所述(A)～(C)所示的物质。

所述水溶性溶剂是指含有水的溶剂，可列举例如水、水溶性缓冲液、生理食盐水等。从对人体的适应性高的观点出发，所述水溶性溶剂优选为水。作为所述水，没有特别限定，可以使用纯水、蒸馏水、超纯水等。

本发明中，作为溶剂，使用含有作为极性溶剂的DMSO和/或DMF的溶剂。DMSO为熔点18.4℃、沸点189℃，DMF为熔点-61℃、沸点153℃，与现有法中所使用的六氟异丙醇(HFIP)的沸点59℃、六氟丙酮(HFAc)的沸点-26.5℃相比时，沸点相当高，溶解性也相应地良好。另外，DMSO及DMF一般在工业领域中也作为丙烯酸纤维的聚合、纺丝液使用，也作为聚酰亚胺的聚合溶剂使用，因此，为成本也廉价且也确认安全性的物质。

在DMSO或DMF中加入无机盐时，介质的溶解度进一步提高。作为无机盐，为选自碱金属卤化物(例如LiCl、LiBr等)、碱土金属卤化物(例如CaCl₂)、碱土金属硝酸盐(例如Ca(NO₃)₂等)、硫代氰酸钠(例如NaSCN等)中的至少一种。将溶解成分设为100质量％时，无机盐的比例优选0.1～20质量％的范围。

所述多肽的水溶液是将溶剂替换为水溶性溶剂而生成的。而且，替换为水溶性溶剂的工序优选将溶解于溶剂的多肽溶液放入透析膜内，浸渍于水溶性溶剂中，更换1次以上水溶性溶剂的方法。具体而言，将溶剂替换为水溶性溶剂的工序优选将溶液生成工序后的溶液放入透析膜中，在所述溶液的100倍以上的水溶性溶剂(1次所用的分量)中静置3小时，重复该水溶性溶剂替换总计3次以上。关于透析膜，只要是不透过溶液中的多肽的尺寸即可，例如可以使用纤维素透析膜等。如果重复水溶性溶剂替换，则可以使溶剂接近于零。在脱溶剂工序的后半，可以不使用透析膜。

水溶性溶剂替换工序后的多肽中的溶剂：二甲基亚砜(DMSO)或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的残量可以利用核磁共振分光装置(NMR)来测定。作为内部标准，可以使用1,2-二氯乙烷-甲酸溶液。

在干燥工序中，优选使用真空冷冻干燥。真空冷冻干燥时的真空度优选为200帕斯卡(Pa)以下，进一步优选为150帕斯卡以下，更优选为100帕斯卡以下。通过真空干燥将水分从多肽中蒸发，通过该蒸发潜热而温度下降，成为冻结状态。真空冷冻干燥时的多肽的温度优选为70℃以下，进一步优选为60℃以下，更优选为50℃以下。予以说明，在真空冷冻干燥之前，可以在-10～-45℃的温度下预冻结10～36小时左右。冻结干燥后的水分率优选为5.0％以下，进一步优选为3.0％以下。

实施例

以下，使用实施例进一步具体地说明本发明。予以说明，本发明并不限定于下述的实施例。对使用水作为水溶性溶剂的例子进行说明。

＜各测定方法＞

(1)溶剂残量测定

作为内部标准，准备1,2-二氯乙烷-甲酸溶液浓度3,100ppm(0.00310mg/ml)。将蛋白质溶液(在10ml的甲酸中溶解有0.1g的多肽颗粒的溶液)500μl和内部标准溶液500μl进行混合。进而，将用于H-NMR测定的乙腈氘代溶剂加入同量程度并稀释为约2倍，进行了H-NMR测定(NMR的机种：JEOL社JNM-ECX 100)。将内部标准试样1,2-二氯乙烷的H-NMR积分强度和DMSO的H-NMR积分强度进行比较。就标准曲线的制作而言，制作3ppm～3000ppm的DMSO-甲酸溶液，按照上述协议制作标准曲线。由与标准曲线的比较求出蛋白质溶液中的DMSO浓度。DMSO浓度测定使用JEOL社制、核磁共振装置(NMR)。

(2)粘度

使用KEM社制、EMS装置。

(3)平均粒径

观察扫描型电子显微镜(SEM)照片(倍率15，000)，求得100个粒子的平均值。

(实施例1)

1.多肽的准备

＜ADF3Kai-NN的基因的合成＞

由NCBI的Web数据库(NCBI登录号：AAC47010、GI：1263287)取得作为十字园蛛的2个主要的牵引丝蛋白质的一个的ADF3的部分的氨基酸序列，在同序列的N末端附加由起始密码子和His10标签及HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号5)，合成编码由从该序列的N末端的第1残基至第542残基的氨基酸序列(序列号1)构成的多肽(ADF3Kai-NN)的基因。其结果，取得导入有由序列号6所示的碱基序列构成的ADF3Kai-NN的基因的pUC57载体(在基因的5’末端正上游具有Nde I位点，及在5’末端正下游具有Xba I位点)。其后，将同基因用Nde I及EcoR I进行限制酶处理，在pET22b(+)表达载体中重组，得到导入有ADF3Kai-NN的基因的pET22b(+)载体。

＜蛋白质的表达＞

将含有上述中得到的ADF3Kai-NN的基因序列的pET22b(+)表达载体转化成大肠杆菌Rosetta(DE3)。将得到的单菌落在含有氨比西林的2mL的LB培养基中培养15小时后，将该培养液1.4ml添加于含有氨比西林的140mL的LB培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养至培养液的OD₆₀₀成为3.5。接着，将OD₆₀₀为3.5的培养液与50％葡萄糖140mL一起加入含有氨比西林的7L的2×YT培养基中，进一步培养至OD₆₀₀成为4.0。其后，在得到的OD₆₀₀为4.0的培养液中添加异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)，以使终浓度成为0.5mM，诱导蛋白质表达。在添加IPTG后经过2小时的时刻，将培养液进行离心分离，回收菌体。使由添加IPTG前和添加IPTG后的培养液制备的蛋白质溶液在聚丙烯酰胺凝胶中泳动，结果，依赖于添加IPTG而观察目标尺寸(约47.6kDa)的带，确认目标的蛋白质(ADF3Kai-NN)表达。

＜精制＞

(1)在离心管(1000ml)中添加表达ADF3Kai-NN的蛋白质的大肠杆菌的菌体约50g和缓冲液AI(20mMTris-HCl、pH7.4)300ml，用混合机(IKA社制“T18basic ULTRA-TURRAX”、水平2)使菌体分散之后，用离心分离机(Kubota社制的“Model 7000”)离心分离(11,000g、10分钟、室温)，舍弃上清液。

(2)在通过离心分离得到的沉淀物(菌体)中添加300ml缓冲液AI和0.1M的PMSF(用异丙醇溶解)3ml，用所述IKA社制的混合机(水平2)分散3分钟。其后，使用高压均质机(GEANiro Saovi社制的“Panda Plus 2000”)将菌体重复破碎3次。

(3)将破碎的用所述Kubota社制的离心分离机进行离心分离(11，000×g、30分钟、室温)。

(4)在通过离心分离得到的上清液(可溶性组分的蛋白质)中添加Ni琼脂糖(50％浆料、GE Healthcare社制、型号“17-5318-02”)，用搅拌器搅拌60分钟。之后，用所述Kubota社制的离心分离机进行离心分离(500×g、5分钟、室温)，除去上清液。将上述Ni琼脂糖充填到空的柱(GE Healthcare社制、型号“17-0435-01”)中，用缓冲液AI清洗，使用溶出缓冲液(50mM Tris、50mM NaCl、300mM咪唑、pH7.5)溶出ADF3Ka i-NN的蛋白质。

(5)将得到的溶出液使用超滤膜(Millipore社制的“Amicon Ultra”)进行脱盐。之后，将得到的溶液冻结干燥，由此除去水分，回收冻结干燥粉末。得到的冻结干燥粉末中的目标蛋白质ADF3Kai-NN(约47.6kDa)的精制度通过使用Image Lab(Bio-RADLaboratories、Inc)对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Oriole染色)的结果进行图像解析来确认。其结果，ADF3Kai-NN的精制度为约69.1％。

2.溶液的调整

将蛛丝蛋白质(ADF3Kai-NN)的粉末0.5g放入DMSO(含有1M的LiCl)10ml中，在80℃下使其溶解30分钟。其后，将溶液放入透析管(三光纯药株式会社纤维素管36/32)中。

3.水替换

将所述透析管放入用3升的纯水充满的烧杯中。其后静置3小时之后，更换水，进行总计6次该操作。由此，几乎全部的DMSO替换为水，同时，得到多肽溶解或分散的水溶液。

4.真空冷冻干燥

将所述多肽的水溶液利用冻结干燥机(东京理化器械制的“FDU-1200”)、在14Pa、-45℃的条件下冻结干燥15小时。

5.结果

(1)溶剂残量测定

通过测定得到的溶剂残量相对于多肽颗粒100g为0.13g。

(2)平均粒径

平均粒径为435nm。另外，观察中的最小值为177nm，最大值为800nm。

(3)得到的多肽颗粒如图1所示。

(实施例2)

掺杂剂(dope)相对于蛋白质0.3g加入DMSO(无盐)30ml，制成10mg/ml，除此之外，与实施例1同样地进行实验。结果如下。

(1)平均粒径

平均粒径为478nm。另外，观察中的最小值为200nm，最大值为911nm。

(2)得到的多肽颗粒如图2所示。

(实施例3)

掺杂剂相对于蛋白质0.3g加入DMF：30ml和1M的LiCl，制成10mg/ml，除此之外，与实施例1同样地进行实验。结果如下。

(1)平均粒径

平均粒径为246nm。另外，观察中的最小值为133nm，最大值为422nm。

(2)得到的多肽颗粒如图3所示。

予以说明，在上述实施例1～3中，在替换工序中使用水，但用其它水溶性溶剂也可得到同样的效果。

工业上的可利用性

本发明的多肽颗粒作为化妆品或掺杂剂的成分等是有用的。

序列号1～5 氨基酸序列

序列号6 碱基序列