CN102344686A - 一种以聚乙烯醇为稳定剂的丝素蛋白纳米颗粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以聚乙烯醇为稳定剂的丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，制备工艺流程为：1）将从蚕丝中提取的丝素蛋白制成重量体积百分比为5～8％的丝素蛋白溶液；2）在丝素蛋白溶液中添加聚乙烯醇溶液，得到共混液；3）将共混液滴加入可溶于水并可诱导所述丝素蛋白beta－折叠化的有机溶剂中，之后再持续搅拌1～6小时，得到丝素蛋白纳米颗粒溶液；4）将丝素蛋白纳米颗粒溶液进一步纯化和富集，得到均匀的丝素蛋白纳米颗粒；5）将得到的丝素蛋白纳米颗粒保存。通过本发明的制备方法可制得颗粒大小均匀，稳定，产率高的丝素蛋白纳米颗粒，适合大规模生产并广泛应用于药物缓释，骨关节生物润滑剂，整容，美容，组织修复等多个领域。

Description

一种以聚乙烯醇为稳定剂的丝素蛋白纳米颗粒的制备方法

技术领域

本发明涉及一种以聚乙烯醇为稳定剂的丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，属于新型生物材料领域。

背景技术

来源于家蚕蚕茧中的丝素纤维作为手术缝合线已经在临床中应用了数十年。从蚕茧中提取再生的丝素蛋白(Fibroin)溶液可以通过简单的制备方法，在不需要添加辅助剂及有机溶剂的情况下制成多种形态的生物材料，如多孔海绵状支架，薄膜，凝胶，微米及纳米颗粒等。相比胶原蛋白及聚酯共聚物等传统的生物材料，由丝素蛋白制成的生物材料具有机械强度高，降解速度可控，生物相容性好以及免疫原性和炎症反应低，安全可靠等优点，因而在骨，软骨等组织工程领域，酶固定化和生物传感器领域，及药物缓释领域中正被广泛地研究应用。需要指出的是在早期应用丝素纤维作为手术缝合线时观察到的炎症反应是由于纤维外层包裹的胶体状丝胶(sericin)没有除尽，而不是丝素蛋白纤维本身的问题。丝素蛋白本身独特的分子结构决定了其材料性质：溶液状态的丝素蛋白呈无规卷曲的二级结构，但随着环境条件的改变，如温度，酸碱度，离子强度，干燥速度等，其疏水区的二级结构自发地向beta-折叠方向转化，最高可达到超过50％的含量。分子内形成的beta-折叠结构表现在最终的材料中即为高度的晶体结构。通过控制材料内的晶体含量即可控制材料的机械强度，降解速率，药物的包裹和释放速率等。

丝素蛋白纳米(100～1000纳米)颗粒的制备在国内和国外都有报道，其制备方法多种多样，可以简单地被归纳为两大类，即化学方法和物理方法，其用途主要是作为治疗药物的载体起到稳定和靶向治疗的作用。下面是这些制备方法的简要介绍。

化学方法制备丝素蛋白纳米颗粒：

(1)有机溶剂法。将重组丝素蛋白溶液(5％)快速地滴加到70％(V/V)水可溶的有机溶剂中，例如，丙酮，丙醇，异丙醇，乙醇，甲醇等，随后经过离心沉淀和水洗得到丝素蛋白纳米颗粒。其中，由丙酮溶液制成的纳米颗粒最为均匀(35～125纳米)和稳定。由甲醇和乙醇溶液制成的颗粒大小不均匀并且会快速不可逆地聚集成团块状的沉淀物。另外一种相似的制备方法是将2％的重组丝素蛋白溶液逐滴地加入到等体积的二甲基亚砜溶液中，然后经过离心和洗脱得到大小为150～170纳米的丝素蛋白纳米颗粒。这两种制备方法的优点为制备过程简单，缺点为其所使用的有机溶剂如丙酮和二甲基亚砜具有较强的毒性，很难从后续的纯化步骤中完全去除，因而给产品的医学临床应用带来困难。此外，利用向低浓度(3％)的丝素蛋白溶液中添加一定量(总体积的25～30％)的乙醇溶液，并将混合液在-20至-40℃下冷冻之后溶解的方法可以制备大小为200～300纳米的丝素蛋白颗粒。这种方法的缺点为制备的纳米颗粒产率较低，最终得到的溶液中含有大量的丝素蛋白分子单体及不规则聚集物，并且丝素蛋白的beta-折叠化含量较低，因而制成的纳米颗粒不稳定，易聚集和降解。

(2)盐析法。将稀释的浓度为0.025％的重组丝素蛋白溶液加入到5倍体积的1.25M的磷酸钾溶液中，经一定时间的孵育后离心得到大小为500纳米左右的丝素蛋白纳米颗粒。此制备方法的优点为不使用任何有机溶剂，缺点为颗粒较大(0.5～2微米)，相比有机溶剂法形成的beta-折叠结构较低，因而颗粒的稳定性较差，降解速率较高。此外，由于制备中使用的丝素蛋白的起始浓度较低，因而降低了制备的效率，产率较低。

(3)聚乙烯醇相分离法。将浓度为5％的丝素蛋白溶液与2～4倍体积的5％聚乙烯醇溶液混合，混合液经15～30秒短时间的超声震荡处理后或者冷冻干燥或者空气干燥，再将得到的干燥样品溶于水，经离心去除聚乙烯醇，得到沉淀的丝素蛋白纳米颗粒。此制备方法的优点为不使用任何有机溶剂，丝素蛋白的起始浓度高，产率较高，缺点为制成的颗粒较大(0.4～2微米)，相比有机溶剂法形成的beta-折叠结构较低，因而颗粒的稳定性较差，降解速率较高。

物理方法制备丝素蛋白纳米颗粒：

(4)毛细管打印法(capillary～microdot technique)。将稀释的浓度为0.1％的丝素蛋白溶液通过特殊的毛细管打印技术在玻璃板表面形成纳米液滴，随后经干燥和甲醇处理后得到不溶于水的100纳米以下的丝素蛋白纳米颗粒。此方法的优点为制成的纳米颗粒大小均一，不需使用大量的有毒有机溶剂，缺点为需要特殊设备，产率低，难以大规模生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以聚乙烯醇为稳定剂的丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，所述方法能制得大小均一，稳定的丝素蛋白纳米颗粒，可应用于药物缓释，骨关节生物润滑剂，整容，美容，组织修复等多个领域。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种以聚乙烯醇为稳定剂的丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，具体制备工艺流程为：

1)将从蚕丝中提取的丝素蛋白制成重量体积百分比为5～8％的丝素蛋白溶液；

2)在制得的上述丝素蛋白溶液中添加与所述丝素蛋白溶液重量比为1∶1～1∶5的聚乙烯醇溶液，得到共混液；

3)将上述共混液滴加入与所述共混液体积比为1∶4～1∶10的不断搅拌的可溶于水并可诱导所述丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂中，之后再持续搅拌1～6小时，得到丝素蛋白纳米颗粒溶液；

4)将上述得到的丝素蛋白纳米颗粒溶液通过硫酸铵盐析沉淀法或自然挥发及离心法进一步纯化和富集，得到均匀的丝素蛋白纳米颗粒；

5)将上述得到的丝素蛋白纳米颗粒在2～6℃的条件下以溶液状态或在20～30℃的条件下以冻干粉形态保存。

本发明的有益效果是：在所述方法中添加了一定量的聚乙烯醇。聚乙烯醇作为乳化剂附着在通过分子自组装形成的丝素蛋白纳米颗粒表面，防止纳米颗粒之间的进一步聚集和融合，最终得到大小均一的丝素蛋白纳米颗粒。通过控制加入的聚乙烯醇量，即丝素蛋白和聚乙烯醇之间的比例，可以在一定的范围内控制所形成的丝素蛋白纳米颗粒的大小。相反，如果将不添加聚乙烯醇的丝素蛋白溶液直接滴加入可溶于水并可诱导所述丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂中，由于分子之间的疏水作用力，丝素蛋白会马上聚集形成团块状的沉淀物，而不能形成纳米颗粒。

因此，使用聚乙烯醇作为乳化剂可以促进并稳定所形成的丝素蛋白纳米颗粒。制备的纳米颗粒大小可以控制。通过调节丝素蛋白和聚乙烯醇的比例和浓度可以对丝素蛋白颗粒的大小进行控制。

另外，本制备工艺可以在无毒，低能耗，低污染的条件下实现丝素蛋白纳米颗粒的大规模生产。制备工艺中使用饱和硫酸铵盐析及低速离心方法纯化丝素蛋白纳米颗粒，可以免除向空气中挥发甲醇或乙醇，免除高能耗的超速离心步骤。离心后收集的含有甲醇和聚乙烯醇的上清液可以回收再利用。整个制备和纯化过程不需要特殊的，昂贵的设备，因而有利于大规模生产。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，所述聚乙烯醇溶液由分子量为30000～186000道尔顿，水解度为87～90％的聚乙烯醇溶于水制得。

进一步，所述溶于水并诱导所述丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基酰胺或二甲基亚砜。

进一步，所述溶于水并诱导所述丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂为甲醇或乙醇溶液。

采用上述进一步方案的有益效果是：甲醇和乙醇是诱导丝素蛋白形成β-折叠结构的最有效的溶剂。本发明中使用甲醇或乙醇溶液作为分散介质可以有效地分离形成的丝素蛋白纳米颗粒，防止其聚合，最终形成大小均一稳定的丝素蛋白纳米颗粒。

甲醇和乙醇通常被用来诱导丝素蛋白beta-折叠结构的形成。其效率要高于其他的处理方法(如盐析，pH，高温，水饱和等)，即形成beta-折叠结构所需的时间较短，程度较高。丝素蛋白分子所形成的beta-折叠结构直接决定了材料的结晶度，水不溶性，机械强度，降解速率，生物相容性及药物包裹和释放速率等。

甲醇和乙醇溶液可以通过挥发去除，在环境中很快分解为水和二氧化碳，在制备的丝素蛋白纳米颗粒中即使有微量的残留也不会对人体和环境产生危害。因此，整个制备工艺简单，无毒，适合大规模生产。

很多药物，香味剂，有机肥料等化学合成分子可以溶于甲醇和乙醇。如果在制备纳米颗粒的过程中将这些分子加入到甲醇或乙醇溶液中，这些分子会被均匀地包裹在形成的丝素蛋白纳米颗粒中，并在随后的医学，工业和农业等领域的应用中通过较长的时间释放到周围的环境中，达到缓释的效果。另一方面，丝素蛋白材料基质对这些包裹的分子起到稳定的作用，在长时间的运输和保存过程中防止其结构和性质的改变。

进一步，所述共混液滴加入所述有机溶液的速度为0.5～1毫升/每分钟。

进一步，在步骤3)中所述不断搅拌的有机溶剂的搅拌速度为400～600rpm，所述再持续搅拌的搅拌速度为100～200rpm。

进一步，在步骤4)中所述均匀的纳米颗粒大小为100～200纳米。

进一步，在步骤4)中所述硫酸铵盐析沉淀法的具体步骤为：

a.向纳米颗粒溶液中滴加入硫酸铵饱和溶液至所述纳米颗粒溶液总体积的10～20％，之后以100～200rpm的速度持续搅拌10～30分钟，得到有白色絮状沉淀的悬浮液；

b.将所述悬浮液置于离心管中，在20～30℃条件下以500～5000g的离心力离心20～40分钟；

c.离心后去掉含有溶于水并诱导所述丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂及聚乙烯醇的上清液，将沉淀物置于通风橱内，在20～30℃条件下干燥15～24小时。

采用上述进一步方案的有益效果是：本发明中利用丝素蛋白纳米颗粒的蛋白质属性，通过向纳米颗粒悬浮液中加入少量的饱和硫酸铵溶液一次性地去除制备过程中添加的甲醇(或乙醇)以及聚乙烯醇，得到纯净的丝素蛋白纳米颗粒。

进一步，所述自然挥发及离心法的具体步骤为：

a.将所述得到的均匀的纳米颗粒溶液置于平皿中并置于通风橱内干燥15～24小时，去除所述溶于水并诱导丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂，得到含有丝素蛋白和聚乙烯醇的薄膜。

b.将所述薄膜溶解于起始共混液10倍体积的水中，通过震荡悬浮得到白色的悬浊液；

c.将所述悬浊液置于离心管中，在20～30℃条件下以100000～300000g的离心力离心，去掉含有聚乙烯醇的上清液，得到丝素蛋白纳米颗粒。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

1)将从蚕丝中提取的丝素蛋白制成重量体积百分比为5％的丝素蛋白溶液；

2)在制得的上述丝素蛋白溶液中添加与所述丝素蛋白溶液重量比为1∶1的聚乙烯醇溶液，得到共混液，所述聚乙烯醇溶液由平均分子量为30000道尔顿，水解度为98％的聚乙烯醇溶于水制得；

3)将上述共混液以0.5毫升/每分钟的速度滴加入与所述共混液体积比为1∶4的以400rpm的速度搅拌的甲醇溶液中，之后再以100rpm的速度持续搅拌1小时，得到均匀的丝素蛋白纳米颗粒溶液；

4)将上述得到的均匀的丝素蛋白纳米颗粒溶液通过硫酸铵盐析沉淀法或自然挥发及离心法进一步纯化和富集，得到大小为100纳米的均匀的丝素蛋白纳米颗粒；

所述硫酸铵盐析沉淀法的具体步骤为：

a.向纳米颗粒溶液中滴加入硫酸铵饱和溶液至所述纳米颗粒溶液总体积的10％，之后以100rpm的速度持续搅拌10分钟，得到有白色絮状沉淀的悬浮液；

b.将所述悬浮液置于离心管中，在20℃条件下以500g的离心力离心20分钟；

c.离心后去掉含有溶于水并诱导所述丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂及聚乙烯醇的上清液，将沉淀物置于通风橱内，在20℃条件下干燥15小时。

所述自然挥发及离心法的具体步骤为：

a.将所述得到的均匀的纳米颗粒溶液置于平皿中并置于通风橱内干燥15小时，去除所述溶于水并诱导丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂，得到含有丝素蛋白和聚乙烯醇的薄膜。

b.将所述薄膜溶解于起始共混液10倍体积的水中，通过震荡悬浮得到白色的悬浊液；

c.将所述悬浊液置于离心管中，在20℃条件下以100000g的速度离心，去掉含有聚乙烯醇的上清液，得到丝素蛋白纳米颗粒。

5)将上述得到的丝素蛋白纳米颗粒在4℃的条件下以溶液状态保存。

实施例2

1)将从蚕丝中提取的丝素蛋白制成重量体积百分比为8％的丝素蛋白溶液；

2)在制得的上述丝素蛋白溶液中添加与所述丝素蛋白溶液重量比为1∶5的聚乙烯醇溶液，得到共混液，所述聚乙烯醇溶液由平均分子量为180000道尔顿，水解度为87％的聚乙烯醇溶于水制得；

3)将上述共混液以1毫升/每分钟的速度滴加入与所述共混液体积比为1∶10的以600rpm的速度搅拌的乙醇中，之后再以200rpm的速度持续搅拌6小时，得到均匀的丝素蛋白纳米颗粒溶液；

4)将上述得到的均匀的丝素蛋白纳米颗粒溶液通过硫酸铵盐析沉淀法或自然挥发及离心法进一步纯化和富集，得到大小为200纳米的均匀的丝素蛋白纳米颗粒；

所述硫酸铵盐析沉淀法的具体步骤为：

a.向纳米颗粒溶液中滴加入硫酸铵饱和溶液至所述纳米颗粒溶液总体积的20％，之后以200rpm的速度持续搅拌30分钟，得到有白色絮状沉淀的悬浮液；

b.将所述悬浮液置于离心管中，在30℃条件下以5000g的离心力离心40分钟；

c.离心后去掉含有溶于水并诱导所述丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂及聚乙烯醇的上清液，将沉淀物置于通风橱内，在30℃条件下干燥24小时。

所述自然挥发及离心法的具体步骤为：

a.将所述得到的均匀的纳米颗粒溶液置于平皿中并置于通风橱内干燥24小时，去除所述溶于水并诱导丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂，得到含有丝素蛋白和聚乙烯醇的薄膜。

b.将所述薄膜溶解于起始共混液10倍体积的水中，通过震荡悬浮得到白色的悬浊液；

c.将所述悬浊液置于离心管中，在30℃条件下以300000g的速度离心，去掉含有聚乙烯醇的上清液，得到丝素蛋白纳米颗粒。

5)将上述得到的丝素蛋白纳米颗粒在25℃的条件下以冻干粉形态保存。

实施例3

1)将从蚕丝中提取的丝素蛋白制成重量体积百分比为7％的丝素蛋白溶液；

2)在制得的上述丝素蛋白溶液中添加与所述丝素蛋白溶液重量比为1∶4的聚乙烯醇溶液，得到共混液，所述聚乙烯醇溶液由平均分子量为100000道尔顿，水解度为89％的聚乙烯醇溶于水制得；

3)将上述共混液以0.8毫升/每分钟的速度滴加入与所述共混液体积比为1∶7的以500rpm的速度搅拌的甲醇中，之后再以150rpm的速度持续搅拌4小时，得到均匀的丝素蛋白纳米颗粒溶液；

4)将上述得到的均匀的丝素蛋白纳米颗粒溶液通过硫酸铵盐析沉淀法或自然挥发及离心法进一步纯化和富集，得到大小为150纳米的均匀的丝素蛋白纳米颗粒；

所述硫酸铵盐析沉淀法的具体步骤为：

a.向纳米颗粒溶液中滴加入硫酸铵饱和溶液至所述纳米颗粒溶液总体积的15％，之后以150rpm的速度持续搅拌20分钟，得到有白色絮状沉淀的悬浮液；

b.将所述悬浮液置于离心管中，在20℃条件下以3000g的离心力离心30分钟；

c.离心后去掉含有溶于水并诱导所述丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂及聚乙烯醇的上清液，将沉淀物置于通风橱内，在20℃条件下干燥20小时。

所述自然挥发及离心法的具体步骤为：

a.将所述得到的均匀的纳米颗粒溶液置于平皿中并置于通风橱内干燥20小时，去除所述溶于水并诱导丝素蛋白beta-折叠化的有机溶剂，得到含有丝素蛋白和聚乙烯醇的薄膜。

b.将所述薄膜溶解于起始共混液10倍体积的水中，通过震荡悬浮得到白色的悬浊液；

c.将所述悬浊液置于离心管中，在20℃条件下以200000g的速度离心，去掉含有聚乙烯醇的上清液，得到丝素蛋白纳米颗粒。

5)将上述得到的丝素蛋白纳米颗粒在6℃的条件下以溶液状态保存。

实施例4

不同制备方法制备的丝素蛋白纳米颗粒性质的比较

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种以聚乙烯醇为稳定剂的丝素蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法的制备工艺流程为：

    1） 将从蚕丝中提取的丝素蛋白制成重量体积百分比为5～8％的丝素蛋白溶液；

2）在制得的上述丝素蛋白溶液中添加与所述丝素蛋白溶液重量比为1:1～1:5的聚乙烯醇溶液，得到共混液；

3）将上述共混液滴加入与所述共混液体积比为1：4～1：10的可溶于水并可诱导所述丝素蛋白beta－折叠化的有机溶剂中，混合过程中不断搅拌的，混合之后再持续搅拌1～6小时,得到丝素蛋白纳米颗粒溶液；

4）将上述得到的丝素蛋白纳米颗粒溶液通过硫酸铵盐析沉淀法或自然挥发及离心法进一步纯化和富集，得到均匀的丝素蛋白纳米颗粒；

5）将上述得到的丝素蛋白纳米颗粒在2～6℃的条件下以溶液状态或在20～30℃的条件下以冻干粉形态保存。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇溶液由分子量为30000～186000道尔顿、水解度为87～90％的聚乙烯醇溶于水制得。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶于水并诱导所述丝素蛋白beta－折叠化的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基酰胺或二甲基亚砜。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述共混液滴加入所述有机溶液的速度为0.5～1 毫升/每分钟。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤3）中所述混合时不断搅拌的速度为400～600rpm，所述再持续搅拌的搅拌速度为100～200rpm。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤4）中所述均匀的纳米颗粒大小为100～200 纳米。

7.根据权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，在步骤4）中所述硫酸铵盐析沉淀法的具体步骤为：

    a. 向纳米颗粒溶液中滴加入硫酸铵饱和溶液至所述纳米颗粒溶液总体积的10～20％，之后以100～200rpm 的速度持续搅拌10～30分钟，得到有白色絮状沉淀的悬浮液；

b. 将所述悬浮液置于离心管中，在20～30℃条件下以500～5000g的离心力离心20～40分钟；

c. 离心后去掉含有溶于水并诱导所述丝素蛋白beta－折叠化的有机溶剂及聚乙烯醇的上清液，将沉淀物置于通风橱内，在20～30℃条件下干燥15～24小时。

8.根据权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述自然挥发及离心法的具体步骤为：

a. 将所述得到的均匀的纳米颗粒溶液置于器皿中并置于通风橱内干燥15～24小时，使得所述溶于水并诱导丝素蛋白beta－折叠化的有机溶剂自然挥发，得到含有丝素蛋白和聚乙烯醇的薄膜；

b. 将所述薄膜溶解于权利要求1至6任一项所述的起始共混液10倍体积的水中，通过震荡悬浮得到白色的悬浊液；

c. 将所述悬浊液置于离心管中，在20～30℃条件下以100000～300000 g的离心力离心，去掉含有聚乙烯醇的上清液，得到丝素蛋白纳米颗粒。