CN104013598A - 利用超声处理使丝纤蛋白凝胶化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种通过超声处理快速形成丝纤蛋白凝胶化的方法。在适当的条件下，在超声处理之后两个小时内控制凝胶化发生。可将包括活细胞在内的生物材料或治疗剂包封于本方法所制备的水凝胶中，并用作递送载体。

Description

利用超声处理使丝纤蛋白凝胶化的方法

本申请是申请日为2008年5月29日、发明名称为“利用超声处理使丝纤蛋白凝胶化的方法”的申请号为200880100926.0的专利申请的分案申请。

本发明是在美国国立健康研究院(National Institutes ofHealth)资助的组织工程研究中心基金号为P41EB002520的联邦政府的支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。

相关申请

本发明涉及2007年5月29日递交的标题为“Method for Silk FibroinGelation Using Sonication”的美国临时专利申请60/940,554，并要求其优先权，将其并入本文作为参考。

技术领域

本发明提供了通过超声处理快速形成丝纤蛋白凝胶化的方法。由本方法形成的水凝胶是有用的，例如用作生物递送载体(biodelivery vehicles)。

背景技术

生物相容且可生物降解的聚合物水凝胶是递送用于例如在组织工程和受控药物释放中的生物医学应用的生物活性分子和细胞的有用载体。纯化的天然丝纤蛋白从水溶液中形成富含β-折叠的交联水凝胶结构，其方法的细节和凝胶特性受环境参数的影响。对于天然丝纤蛋白水溶液而言，上述的胶凝时间经常需要几天到几周，高温和低pH是造成凝胶化动力学增进的原因。那些条件虽然适于结合某些生物活性分子，但对于活化细胞和不稳定的生物活性分子的结合可能过于缓慢。

因此，在现有技术中需要一种在温和的生理条件下快速形成丝纤蛋白凝胶化的方法。

发明内容

本发明涉及一种快速形成丝纤蛋白凝胶化的方法。本方法将丝纤蛋白进行处理，所述处理包括超声处理足够长的一段时间以起始凝胶化。例如在特定条件下，凝胶化发生在超声处理的24小时内。

本发明的实施方式还涉及一种控制丝纤蛋白胶凝时间的方法，所述方法通过将丝纤蛋白溶液进行超声处理足够长的一段时间以起始凝胶化。在一个实施例中，所述胶凝时间少于两个小时。

另一个实施方式涉及一种在丝纤蛋白中包封药剂的方法。所述方法包括：将丝纤蛋白溶液进行超声处理足够长的一段时间以起始凝胶化，并在所述丝纤蛋白溶液中发生实质上的凝胶化之前，将所述药剂引入所述丝纤蛋白溶液，从而形成丝纤蛋白包封的药剂。或者，可在超声处理之前，将药剂加入丝纤蛋白中。所述药剂可为治疗剂(例如药物)或生物材料(例如细胞)。例如，在超声处理之后，将源自人骨髓的间充质干细胞(hMSC)成功地结合到丝纤蛋白水凝胶中，随后快速凝胶化并保持细胞功能。

由本发明方法产生的水凝胶显示了良好的机械性能和蛋白水解降解表现。例如，超声处理4％、8％和12％(w/v)的丝纤蛋白溶液，随后加入hMSC，在0.5小时到2小时内发生凝胶化。所述细胞在4％的凝胶中生长并增殖超过二十一天。另外，可使用低浓度的K⁺和低pH来促进凝胶化。

附图说明

图1描述了在各种超声处理条件下的丝纤蛋白(SF)凝胶化。使用0.5ml水溶液，以20％振幅进行超声处理，并且将超声处理时间由5秒变化到30秒。数值是每组至少N=3个样品的平均值±标准偏差。*各组之间具有显著性差异(Student t-检验，p<0.01)。

图2A-2C描述了在凝胶化过程中，丝β-折叠结构的动力学形成。图2A显示在超声处理120分钟之后，对超声处理后的2％(w/v)丝纤蛋白水溶液每8分钟进行波长扫描来进行圆二色性(CD)测定。图2B显示在217nm处(β-折叠结构的峰值)记录的椭圆率随时间增加的图。图2C是丝凝胶化机理的示意图。凝胶化过程包含两个动力学步骤：(a)在短时间内，结构由无规卷曲变为具有一些链间物理交联的β-折叠；(b)β-折叠结构延伸，形成大量的链间β-折叠交联连接，然后在相对长时间内，分子组织成凝胶网状物。

图3A-3C显示盐和pH对丝纤蛋白凝胶化的影响。在超声处理之前，将K⁺(图3A)和Ca²⁺(图3B)补充到各种浓度的溶液中至最终浓度20mM至200mM。图3C显示在超声处理之前调节丝纤蛋白水溶液pH的效果。将所有样品以20％振幅进行超声处理15秒。数值为每组至少N=3个样品的平均值±标准偏差。*，◇在各组之间存在显著性差异(Student t-检验，p<0.05)。

图4A-4C显示对丝纤蛋白水凝胶机械性能进行分析的图表。图4A描述了在30Amp、40Amp或50Amp的条件下，在4％、8％和12％的不同浓度时(X轴)，丝纤蛋白凝胶的屈服强度(kPa)(Y轴)。图4B描述了在30Amp、40Amp或50Amp的条件下，在4％、8％和12％的不同浓度时(X轴)，丝纤蛋白凝胶的传统弹性模量(kPa)(Y轴)。图4C描述了在4％、8％和12％的不同浓度时(X轴)，丝纤蛋白凝胶的平衡模量(kPa)(Y轴)。

图5描述了丝纤蛋白水凝胶的酶促降解。通过超声处理制备4％、8％以及12％(w/v)的水凝胶，并且浸于pH7.4的PBS(对照)或蛋白酶XIV的PBS溶液(5U/ml)中七天。通过在每个时间点上将凝胶块的湿重与原来的湿重进行比较来确定剩余量。数值为至少N=4个样品的平均值±标准偏差。

图6用图形描述包封在丝纤蛋白水凝胶中的hMSC的DNA定量结果。用PicoGreen试验分析每个凝胶组中的DNA含量，而用每个凝胶块的湿重来使结果归一化。数值为至少N=4个样品的平均值±标准偏差。*在各组之间存在显著性差异(Student t-检验，p<0.05)。

具体实施方式

应当理解本发明并不局限于本文所描述的特定的工艺、方案和试剂等，并且上述这些都可以改变。本文所使用的术语其目的仅仅在于描述特定的实施方式，并不意味着对本发明范围的限定，而本发明的范围仅仅通过权利要求书进行限定。

在本文及权利要求书中所用的单数形式也包含复数的含义，反之亦然，除非文中另行明确指出。除了在操作实施例中或另外指出的情况以外，本文用以表示组分或反应条件的量的所有数值在一切情况下都应理解为由术语“大约”所限定。

出于描述和公开的目的，在此以引用的方式清楚地将本发明指明的所有专利和其他出版物并入，例如，在此类出版物中描述的、可用于本发明的方法学。提供此类出版物仅仅是因为它们的公开早于本申请的申请日。在这点上，不应将任何事物视为发明人无权根据在先发明或因任何其他原因使本发明的内容早于这些公开内容的认定。所有关于日期的陈述或关于此类文件内容的表达均基于申请人可得的信息，不构成对此类文件的日期或内容的正确性的任何认定。

除非另有定义，本文所用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然在本发明的实际操作或测试中可使用任何已知的方法、装置和原料，但是在这方面本文仍对所述方法、装置和原料进行了描述。

本发明涉及一种快速形成丝纤蛋白凝胶化的方法。本方法对丝纤蛋白进行处理的方式包括超声处理足够长的一段时间以起始凝胶化。本方法提供了基于超声处理的、以暂时可控的方式加速溶胶-凝胶转换的方法。根据使用的超声处理参数(能量输出、持续时间等)和生理学相应条件下的丝纤蛋白浓度，可以将胶凝时间控制在几分钟到几小时的范围。在超声处理之后，对应于凝胶化，丝纤蛋白经历了由无规卷曲到β-折叠的快速结构变化。可以在超声处理之前、期间或之后加入药剂例如治疗剂或生物制剂，并且在凝胶化时进行包封。因此本发明提供了用于各种生物医学应用的方法，例如细胞的包封对时间敏感的那些应用。

由于水凝胶具有通常大于30％的高水含量(Park&Lakes，BIOMATS：INTRO.(第2版)，Plenum出版社，纽约，1992年)，其被认为是细胞和生物活性分子包封和递送的有用支架(scaffolds)，例如用于组织工程和细胞治疗应用。用于此类应用的水凝胶具有与某些组织和细胞外基质(ECM)相似的机械性能和结构性质，因此可将其植入用于组织修复或治疗因子的局部释放。为了包封和递送细胞，优选所形成水凝胶应具有下列性质：不破坏细胞、对于细胞和周边组织无毒、具有生物相容性、具有适当的物质运送能力以允许营养素和代谢物的扩散、具有充分的机械完整性和强度以承受与植入相关的操作、具有可控制的使用期限、并且应当根据应用情况在植入之后的合理时间内保持凝胶的体积(Drury&Mooney，24Biomats.4337-51(2003))。

已经将各种合成材料，例如聚环氧乙烷(PEO)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸(PAA)、聚富马酸丙二醇酯-乙二醇共聚物(P(PF-co-EG))以及天然来源的材料，例如琼脂糖、藻酸盐/酯、壳聚糖、胶原、纤维蛋白、明胶和透明质酸(HA)用于形成水凝胶。当聚合物链由化学试剂(例如交联剂)或物理刺激(例如pH和/或温度)引发，以化学方式或物理方式交联成网状物时，则发生凝胶化。通过利用特定的分子量、嵌段结构(block structure)和交联模式，由合成的聚合物形成的水凝胶提供了可控且可重现的凝胶化作用和凝胶性质的有利效果。天然来源的聚合物由于其大分子特性更接近于细胞外基质并且降解产物无毒，因而倾向于将这些聚合物作为细胞和生物活性分子的载体用于组织工程和植入式医疗器械(Lee等人，221，Int'l J.Pharma.1-22(2001)；等人，8TrendsBiotech.71-78(1990))，但通常这些聚合物的凝胶化可控性较低。

在天然来源的生物材料中，已经对天然蚕纤维中的白组装结构蛋白——丝纤蛋白进行了研究，这是由于其具有优良的机械性能、生物相容性、可控的降解速度并且可导致结晶β-折叠结构网状物的形成(Altman等人，24Biomats.401-16(2003)；Jin&Kaplan，424Nature1057-61(2003)；Horan等人，26Biomats.3385-93(2005)；Kim等人，26Biomats.2775-85(2005)；Ishida等人，23Macromolecules88-94(1990)；Nazarov等人，5Biomacromolecules718-26(2004))。已经将丝纤蛋白制成各种用于组织工程和药物控制释放应用的材料形式，包括薄膜、三维多孔支架、静电纺丝纤维和微球体(Jin等人，5Biomacromolecules711-7(2004)；Jin等人，3Biomacro-molecules，1233-39(2002)；Hino等人，266J.ColloidInterface Sci.68-73(2003)；Wang等人，117J.Control Release，360-70(2007))。同时参见美国专利申请序列号11/020,650；序列号10/541,182；序列号11/407,373；以及序列号11/664,234；PCT/US07/020789；PCT/US08/55072。

在自然界中，丝纤蛋白水溶液产生于蚕的腺体后部并储存在中部直至浓度为30％(w/v)，丝纤蛋白水溶液包含高含量的无规卷曲或α-螺旋结构。在纤维进入空气中纺丝时，高剪切力和拉伸流动诱导了自组装和向β-折叠结构的结构转变，实现固体纤维的形成(Vollrath&Knight，410Nature，541-48(2001))。在腺体的不同部位中存在的金属离子和pH的改变影响了这种转变(Chen等人，3Biomacromolecules644-8(2002)；Zhou等人，109J.Phys.Chem.B16937-45(2005)；Dicko等人，5Biomacromolecules704-10(2004)；Terry等人，5Biomacromolecules768-72(2004))。在体外，纯化的丝纤蛋白水溶液经过自组装形成β-折叠结构并形成水凝胶。该溶胶-凝胶转换受到温度、pH和离子强度的影响(Wang等人，36Int'l J.Biol.Macromol.66-70(2005)；Kim等人，5Biomacromolecules786-92(2004)；Matsumoto等人，110J.Phys.Chem.B21630-38(2006))。丝水凝胶(silk hydrogel)的压缩强度和压缩模量随着丝纤蛋白浓度和温度的增加而增加(Kim等人，2004)。

丝纤蛋白水凝胶在许多生物医学应用方面令人关注。例如，丝纤蛋白水凝胶被用作骨填充生物材料来治愈兔股骨远端临界尺寸的多孔缺损，其中丝凝胶(silk gel)显示出比聚(D，L-丙交酯-乙交酯)对照材料具有更好的骨骼治愈效果(Fini等人，26Biomats.3527-36(2005))。

就许多基于细胞的应用而言，必须在相对短的时间内(几小时内)在温和条件下诱导凝胶化。但是，除非在对天然丝纤蛋白没有化学修饰的情况下考虑非生理学处理(例如低pH、高温、添加剂)，否则胶凝时间可能会过长。对于从0.6％到15％(w/v)的丝纤蛋白浓度而言，在室温或37℃下，溶胶-凝胶转换需要几天到几周(Kim等人，2004；Matsumoto等人，2006；Fini等人，2005)。将盐加到生理学水平以上并不会明显改变凝胶化动力学(Kim等人，2004)。较低pH(pH<5)或提高温度(>60℃)可以将胶凝时间减少到几个小时(Kim等人，2004；Fini等人，2005；Motta等人，15J.Biomater.Sci.Polymer.Edu.851-64(2004))，但是这些条件可能会潜在地改变细胞功能并影响细胞生存能力。

在本发明中，通过超声处理实现了用来加速过程并控制丝纤蛋白凝胶化的新方法。更具体地说，本发明提出了一种基于超声处理的、以暂时可控的方式来加速溶胶-凝胶转换的新方法。该方法以机械方式通过丝纤蛋白链的疏水水合作用的改变诱导β-折叠的物理交联。这容许在超声处理之后添加细胞，继之以快速凝胶化。可根据使用的超声处理参数(能量输出和持续时间)以及丝纤蛋白浓度，将胶凝时间控制为几分钟到几小时。本方法进一步提供了：控制pH和盐浓度对凝胶化的影响；在凝胶化之后丝状结构的动力学变化以及包封细胞(例如源自人骨髓的间充质干细胞(hMSC))在丝凝胶中的行为。

可根据本发明使用任何种类的丝纤蛋白。由蚕(例如家蚕(Bombyxmori))产生的丝纤蛋白是最普遍的，并表现为环保的、可更新的来源。有机的蚕茧可在市面上购得。然而，存在许多可替代使用的不同的丝，包括蜘蛛丝、转基因丝、遗传工程丝及其变体。利用本领域已知的技术可由蚕茧制备丝纤蛋白水溶液。在例如美国专利申请序列号11/247,358；WO/2005/012606以及PCT/US07/83605中公开了制备丝纤蛋白溶液的适当方法。例如，可通过从家蚕(B.mori)的茧中提取丝胶来获得在丝生物聚合物中使用的丝。

实质上的凝胶化通常发生在超声处理之后二十四小时之内。例如，在超声处理之后不足四小时(例如在超声处理之后两小时之内)形成丝纤蛋白凝胶。在特定的实施方式中，丝纤蛋白在超声处理之后大约五分钟到大约两个小时的时间范围内发生凝胶化。因此，根据需要，基于溶液制备中使用的超声处理，胶凝时间可从几分钟到几小时。

超声处理在本领域是已知的。就本申请的目的而言，术语“超声处理(ultrasonication)”和“超声(sonication)”可交换使用，并具有相同的含义。可以按照本领域已知的对丝纤蛋白进行超声处理的任何方式进行超声处理。所述超声处理可包括将丝纤蛋白进行超声处理一次，或可包括多次分别处理。已经在蛋白结构变化的范围内研究了超声处理(Meinel等人，71J.Biomed.Mater.Res.A25-34(2004)；Meinel等人，88Biotechnol.Bioeng.379-91(2004))并已经用于产生大的液-气界面、局部热效应、机械应力/剪切应力以及自由基反应。相比之下，在关于肽凝胶化的其它研究中，通过超声处理将凝胶中已组装的肽纳米纤维碎裂成更小的片段(Hung等人，32Ann.Biomed.Eng.35-49(2004))。在聚合物溶胶-凝胶转换方面，一般使用超声处理打碎凝胶网状物并重新溶解水凝胶。本发明提供了将超声处理用于诱导丝的溶胶-凝胶转换的新用途。

所述超声处理持续的时间应足以起始凝胶化过程，但是为了兼顾水凝胶的机械性能又不应持续太长时间。根据使用丝纤蛋白的量、溶液的浓度以及本领域普通技术人员已知的其它因素，所述超声处理一般可持续大约5秒到大约60秒。例如，所述超声处理持续大约15秒到大约45秒。凝胶化一般从超声处理起始开始，并在处理结束之后继续进行。

所述超声处理可包括有助于凝胶化过程的其它处理。例如，所述处理可包括盐溶液。本领域已知盐溶液可有助于诱导凝胶化。可使用包含钾、钙、钠、镁、铜和/或锌离子的代表性盐溶液。在这方面，钾在盐溶液中较为有利。

所述处理还可包括调节丝纤蛋白水溶液的pH。如本领域已知的那样，调节水溶液的pH可有助于诱导胶凝化。调节pH至更高或更低可以起效。因此，例如，可使用具有大约pH4或更低，或者大约pH7.5或更高的水溶液。

特别地，利用低浓度和低pH的钾盐溶液常常是有效的。特定的实施方式是利用盐浓度小于100mM并且该溶液pH约为4或更低的钾盐。

本发明还提供了一种控制丝纤蛋白胶凝时间的方法，所述方法在使凝胶化发生于约两小时内的条件下，通过将丝纤蛋白溶液进行超声处理足够长的一段时间以起始凝胶化。超声处理过程引起丝纤蛋白链之间的相互作用。特定的实施方式提供了一种控制胶凝时间的方法，以使丝纤蛋白在超声处理之后在大约五分钟到大约两个小时的时间范围内经历凝胶化。

另外，各种其它因素可用于控制胶凝时间。例如，可通过超声处理的振幅和丝纤蛋白溶液的浓度控制胶凝时间。例如，振幅的范围为从大约25％到大约35％功率输出(通常为7瓦特到10瓦特)，而丝纤蛋白浓度的范围为从大约10％到大约15％(w/v)。在另一个实施方式中，振幅的范围为从大约25％到大约55％功率输出(通常为7瓦特到21瓦特)，而丝纤蛋白浓度的范围为从大约5％到大约10％(w/v)。本领域的普通技术人员根据本申请有能力改变超声处理的振幅和丝纤蛋白溶液的浓度来获得希望的凝胶化水平和希望的发生凝胶化的时间范围。

还可通过加入盐溶液和调节丝纤蛋白溶液的浓度以及盐溶液的浓度来控制胶凝时间。所述盐溶液可包含钾离子，但也可使用其它盐溶液。在特定的实施方式中，所述丝纤蛋白的浓度为4％(w/v)或更低，而所述钾盐溶液的浓度范围为20mM到100mM。

另外，可通过调节盐溶液的浓度和pH来控制胶凝时间，特别是当盐溶液包含钾离子时更是如此。在特定的实施方式中，所述盐溶液为pH大约为4或更低的钾盐溶液。例如，所述钾盐溶液具有20mM到100mM的浓度。

本发明还涉及一种在丝纤蛋白中包封至少一种药剂的方法。所述方法包括：(a)将丝纤蛋白溶液进行超声处理一段时间以起始凝胶化；以及(b)在所述丝纤蛋白溶液中发生实质上的凝胶化之前，将所述药剂引入所述丝纤蛋白溶液，从而形成丝纤蛋白包封的药剂。可在超声处理之前、期间或之后将药剂引入丝纤蛋白溶液。

所述药剂可表示能被包封进丝纤蛋白凝胶的任何物质。例如，所述药剂可为治疗剂，例如小分子和药物；或生物材料，例如细胞(包括干细胞)、蛋白、肽、核酸(DNA、RNA、siRNA)、肽核酸(PNA)、适配子、抗体、激素、生长因子、细胞因子或酶。因为包封产物可用于生物医学用途，所以人们希望对治疗剂或生物材料进行包封。

如果治疗剂被包封，由于超声处理对于大多数治疗剂不会产生不利影响，可在超声处理之前、期间或之后将治疗剂引入丝纤蛋白溶液。另一方面，如果生物材料被包封，由于超声处理可对所述生物材料产生不利影响，通常直到超声处理后才将其引入丝纤蛋白溶液。这并非对于所有生物材料都是必需的，但已知超声处理可损害或破坏活细胞，所以应加以注意。

在超声处理之后引入药剂的情况下，可调节超声处理的条件以使凝胶化在超声处理之后一段时间发生。如果在超声处理期间或其后立即发生凝胶化，则用来将药剂引入丝纤蛋白溶液的时间可能会不足。例如，在超声处理之后引入药剂的情况下，在超声处理之后大约五分钟到大约两个小时的时间范围内，使所述丝纤蛋白经历凝胶化。

如果在超声处理之前或期间引入药剂，则可以在超声处理期间、其后立即或超声处理后一段时间发生凝胶化。所以，当在超声处理之前或期间引入药剂时，可使丝纤蛋白在超声处理之后大约两个小时内经历凝胶化。

当将治疗剂或生物材料引入丝纤蛋白时，还可随所述药剂加入本领域已知的其它材料。例如，可能希望加入的材料具有下列作用：促进药剂的生长(就生物材料而言)；在药剂从包封中释放之后，促进药剂的功能；或增加药剂在包封期间存活或保持其功效的能力。促进细胞生长的已知材料包括细胞生长培养基，例如Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)；非必需氨基酸和抗生素；以及生长因子和形态发生因子，例如成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF-I)、骨形态发生生长因子(BMP)、神经生长因子，并且可以使用相关蛋白。用于通过凝胶递送的另外的选择包括：DNA、siRNA、反义、质粒、脂质体和用于递送遗传物质的相关体系；激活细胞信号级联的肽和蛋白；促进来自细胞的矿化作用或相关事件的肽和蛋白；用于改进凝胶-组织界面的粘附肽和蛋白；抗菌肽；以及蛋白及相关化合物。

丝纤蛋白包封的治疗剂或生物材料适合于生物递送装置。使用丝纤蛋白作为生物递送装置的技术见于例如美国专利申请序列号No.10/541,182；No.11/628,930；No.11/664,234；No.11/407,373；PCT/US207/020789；PCT/US08/55072。

丝纤蛋白水凝胶结构使生物递送载体能够进行可控释放。可控释放以控释动力学使得剂量的给予随时间变化。在某些情况下，持续(例如超过几个星期)将治疗剂或生物材料递送到需要处理的部位。随着时间的可控释放(例如超过几天或几星期或更久)容许治疗剂或生物材料持续递送来获得更好的治疗。可控递送载体是有利的，因为其保护了治疗剂或生物材料在体液和组织中在体内不被例如蛋白酶降解。

进一步关于利用超声处理诱导丝凝胶形成的方法，按下文描述的方式超声处理0.5mL的1％、2％、6％和20％(w/v)的丝纤蛋白水溶液样品。当功率输出保持恒定(20％振幅)时，丝纤蛋白胶凝时间随超声处理时间增加而缩短(图1)。对于丝浓度从1％到6％(w/v)的每次增加，胶凝时间显著缩短(在图1的*样品之间，p<0.01)。20％(w/v)的样品与6％(w/v)的样品相比具有类似甚至更长的胶凝时间(图1)。20％样品的这一结果很可能是由于溶液具有高粘性因而在该溶液中超声波不能有效地传播。当使用高于30％振幅的功率输出时，超声处理产生稠密的泡沫，丝纤蛋白不能以均相方式胶凝。

当超声处理的体积增加到5ml时，即使在高达55％振幅的功率水平上也观察不到该泡沫。然而，当在体积超过5ml的情况下，对高浓度进行超声处理时，会发生非均相凝胶化。将小体积的丝溶液(silk solution)(未经高压灭菌)用于超声处理的优化和胶凝的性质表征(pH、盐效应和圆二色性测定)，而将高压灭菌的丝溶液用于机械性、降解和细胞包封的研究。有趣的是，与原始溶液相比，高压灭菌并未显著地改变所使用的超声处理参数和相关的胶凝时间，表明丝纤蛋白保持了其原始溶液状态结构的重要特征，并在高压灭菌之后保持了在形成胶凝中将结构转变为β-折叠状态的能力。可进一步研究由于高压灭菌处理产生的结构变化，而这方面的研究为药剂大规模制备提供了便利。

在丝纤蛋白凝胶化期间，通过在圆二色性测定中观察到的变化，将溶胶-凝胶转换与β-折叠形成的增加联系起来(图2A)。基于椭圆率在217nm处的增加(图2B)，观察到在超声处理之后β-折叠结构的迅速形成，随后更为缓慢转换。在该转换点上发生了丝纤蛋白凝胶化，而β-折叠结构起初的迅速形成则减慢。该转换与以前进行的研究(Matsumoto等人，2006)一致，表明可涉及相类似的机理。β-折叠结构的形成源于改变的疏水相互作用及随后的物理交联。该起始步骤后，在与初始超声处理诱导的变化相比相对长的时间内，为较缓慢的链的组织以及凝胶网状物的形成。将这一包括两个步骤的丝凝胶化机制示意性地描述于图2C中。

可将所研究的影响凝胶化速率的参数看作一种概括天然的蚕纺丝过程的方法。关键的处理参数包括超声处理效应，其作为模拟在蚕的腺体前部经历的剪切力增加；阳离子类型和浓度；以及pH。

人们公认在超声处理中，机械振动导致泡沫的形成和破裂。作为这一空化作用(cavitation)的结果，培养基可经历极端的局部效应：高温(10,000K)、高压(200bar)和高应变率(10⁷s^-1)(Paulusse&Siibesma，44J.Polym.Sci.-Polym.Chem.5445-53(2006)；Kemmere等人，290Macromol.Mater.Eng.302-10(2005))。在各种应用中已经利用了这些物理现象，所述应用包括：N-异丙基丙烯酰胺/丙烯酸共聚物的自组装和凝胶化(Seida等人，90J.Appl.Polym.Sci.2449-52(2003))、含有金属化(metalated)肽的有机流体(Isozaki，119Angew Chem.2913-15(2007))以及合成的自组装肽(Yokoi等人，102Proc Nat Acad Sci USA8414-19(2005))。除了肽以外，已经利用超声处理研究了蛋白质例如人血清白蛋白和肌红蛋白，其中将超声处理作为表征与疾病状态相关的聚合和自组装的方法(Stathopulos等人，13Protein Sci.3017-27(2004)；Mason&Peters，PRACTICAL SONOCHEM：USES&APPL.ULTRASOUND(第2版，齐切斯特，西萨塞克斯郡，英国(2002))。

考虑到聚合物体系响应超声处理的行为幅度，很可能一些与超声处理相关的物理因素(包括局部温度提高、机械力/剪切力、以及增加的气-液界面)影响了丝纤蛋白快速凝胶化的过程。特别地，超声处理诱导的疏水水合作用方面的变化将引起物理交联(例如与β-折叠形成相关的初始链相互作用)的加速形成。在本研究中，在超声处理期间，溶液温度在短时间内(5分钟-6分钟)从室温增加到40℃-71℃，其表现在局部温度上瞬时尖峰。在过去的研究中，当本体样品维持在60℃且无超声处理时，凝胶化需要几天的时间(Kim等人，2004)。因此，局部温度的影响可能有助于增进凝胶化动力学，但这不仅仅是造成所观察到的短时响应的原因。受瞬时温度增加的影响，疏水链的局部的链动力学和水合状态上的变化可能是形成疏水性物理交联的原因。

由于在链内和链间相互作用的调控下水所发挥的关键作用，丝纤蛋白链中独特的疏水性嵌段序列(block sequence)特征特别适合于这类技术(Jin等人，2003)。这对于将该技术延伸到其它生物聚合物体系来测定链化学对链组装的超声处理调控过程的影响可能是有用的。已经报道了与超声处理有关的胶原降解作为将链打碎为片段以促进重组装研究的方法(Giraud-Guille&Besseau，113J.Struct.Biol.99-106(1994))。应当注意到，由于使用了基于SDS-PAGE分析的短时间超声处理过程，本方法不会导致显著的链降解。

在超声处理之前，向丝纤蛋白水溶液补充K⁺和Ca²⁺至各种生理学相应的浓度。如图3A所示，在低K⁺浓度(20mM-50mM)下，胶凝时间随K⁺浓度增加而显著缩短(在*样品之间，p<0.05)。然而，在高K⁺浓度(100mM-200mM)下，凝胶化被抑制(图3A)。丝纤蛋白浓度在0.5％到8％(w/v)的范围内，观察到了这些结果。超过8％时，因为在所有样品中凝胶化都很快地发生(<2分钟)，所以观察不到盐效应。与K⁺相比，具有相同浓度的Ca²⁺诱导的丝纤蛋白凝胶化要慢一些(比较图3A和3B)。当Ca²⁺浓度从20mM增加到200mM时，丝纤蛋白胶凝时间显著增长(在图3B的*样品之间，p<0.05)。相反，在此前的研究成果中，Ca²⁺促进了丝纤蛋白凝胶化而K⁺则没有效果(Kim等人，2004)，这是与本方法观察相比所不同的结果。

在超声处理之前，为了测定对凝胶化的影响，调节丝纤蛋白水溶液的pH。降低或升高pH促进了凝胶化(在图3C的*样品之间，p<0.05)。与此前的研究(Kim等人，2004；Matsumoto等人，2006)一致，在诱导凝胶化方面，低pH(pH<4)的效果要比高pH(pH>9)更显著(在图3C的◇样品之间，p<0.05)。

由机械测试得到的应力-应变曲线在平坦区域之前显示出线性，表明所述凝胶具有较大(～5％-10％应变)且可能的粘弹性特征，之后由裂缝形成而诱导永久性损伤。本研究中制备的凝胶与此前的研究成果中研究的凝胶表现相似(Kim等人，2004)，其中，相应的丝纤蛋白浓度在屈服强度(图4A)和“传统的”弹性模量(图4B)上得到相似的数值。这两个量度看起来都与丝凝胶浓度正相关。通过检验，丝纤蛋白浓度(w/v)上的差异是最终水凝胶机械性能的更重要的决定因素，而非由于超声处理条件的变化(图4A和4B)。同样，平衡模量值看起来与丝凝胶浓度正相关(图4C)。

当与其它可降解的包封有细胞的水凝胶例如藻酸盐/酯、琼脂糖、聚乙二醇交联凝胶、纤维蛋白原及其它体系(Almany&Seliktar26(15)Biomats.4023-29(2005)；Kong等人，24(22)Biomats.4023-29(2003)；Hung等人，2004；Bryant等人，86(7)Biotechnol Bioeng747-55(2004)；Kang等人，77(2)J.Biomed.Mater.Res.A331-39(2006)；Rowley等人，20(1)Biomats.45-53(1999)；Broderick等人，72J.Biomed.Mater.Res.B-Appl Biomater.37-42(2004)；Zhang等人，15J.Mater.Sci.Mater.Med.865-75(2004))相比时，高浓度、快速形成的丝水凝胶显示出了优良的机械性能(表1)。基于细胞包封和机械性能试验方案的相似性收集数据，其中测定了“传统”的模量或平衡模量的数值。

表1.由用于细胞包封的可降解聚合物制得的凝胶体系机械性能的比较

^a5mm直径×5mm高度。1.5mm/min的形变速率，模量基于应力-应变曲线的较低部分的平均斜率。

^b6mm直径×2.4mm高度。2mm/min的形变速率，模量基于应力-应变曲线的初始部分的平均斜率。

^c5mm直径×1mm高度。40-100mN/min的负载控制形变速率。

^d12.5mm直径×1.5mm高度。25mN/min的负载控制形变速率。杨氏模量等于在初始预加载力0.01N到0.25N之间所获得的斜率的绝对值。

^e6mm直径。0.5mm/min的形变速率，模量基于应力-应变曲线的较低部分的平均斜率。^f12.7mm直径×2mm高度。1mm/min的形变速率。弹性模量从应力-应变曲线的斜率中获得，其限于第一个10％的应力。

^g由在10％应力的平衡应力和初始横截面积来计算平衡模量。

此前已经对丝纤蛋白薄膜、多孔固体支架和丝纤蛋白纱(silk fibroinyarn)的酶(蛋白酶XIV)降解进行了研究(Horan等人，2005；Kim等人，2005；Jin等人，2005)。利用相同浓度的蛋白酶(5U/mL)，所有的丝纤蛋白水凝胶都显示出快速降解，在第一个四天内有大约80％的质量损失，然后降解速率变慢很多(图5)。水凝胶的降解具有丝纤蛋白浓度依赖性。当浓度从4％增加到12％(w/v)时，达到50％质量损失的降解时间从1.5天增加到3天(图5)。对照样品(以PBS代替蛋白酶培养的丝纤蛋白水凝胶)在培养期内是稳定的(图5)。由于蛋白水解过程引起的丝水凝胶的快速降解(在几天之内)可能适于一些应用，例如在伤口愈合的情况或快速药物递送中。然而，应当指出本文所述的蛋白水解降解时间为体外降解时间，相比之下，体内生存期通常更长，并且所述时间范围具有组织特异性。

已经成功地将hMSC包封于各种水凝胶体系中，例如聚乙二醇、琼脂糖、胶原和藻酸盐/酯，因为这些细胞对于组织修复或再生以及长期的药物释放具有潜力(参见Nuttelman等人，24Matrix Biol.208-18(2005)；Nuttelman等人，27Biomats.1377-86(2006)；Mauck等人，14Osteoarthr.Cartilage179-89(2006)；Lewus&Nauman，11Tissue Eng.1015-22(2005)；M ajumdar等人，185J.Cell Physiol.98-106(2000)；Boison，27TrendsPharmacol.Sci.652-58(2006))。少于4％(w/v)蛋白质的丝水凝胶由于物理局限性而难以操作。所以，将4％、8％和12％(w/v)丝纤蛋白的水凝胶用于hMSC包封。在上述所有三个凝胶浓度中，细胞在第一天保持其原来的圆形并均匀分布。在第六天，在12％的凝胶中，一些细胞出现缺损，并且细胞形态发生改变。在第二十一天，在4％的凝胶中，细胞与第一天相比无变化，而在8％和12％的凝胶中，细胞在很大程度上发生变形并聚集。组织学分析显示，在4％凝胶基质内的hMSC保持圆形，并且在研究期间未发生聚集；而那些接近凝胶表面的hMSC从凝胶中长出来，并从第六天开始，形态由圆形转变为纺锤状。所有的hMSC，无论是接近凝胶表面的纺锤状，还是在凝胶中包封的圆形，在存活-死亡测试(live-dead assay)中的绿色荧光来看都是活细胞。所以，hMSC在4％丝水凝胶体系中保持其活性和功能至少持续二十一天。然而，从组织学图像中的空穴和存活-死亡测试中几乎没有绿色荧光斑点来看，在8％和12％凝胶中，hMSC在很大程度上发生形态改变，并且其中很多的细胞发生死亡、聚集和/或溶解。在存活-死亡测试中，未包封细胞的对照丝凝胶显示出强烈的红色荧光本底，掩蔽了来自死细胞的红色荧光。

这些观察和结论得到DNA定量试验(PicoGreen分析)的进一步支持(图6)。第一个6天内，细胞在上述所有三种水凝胶中都得到显著地增殖(在图6中的*样品之间，p<0.05)。就4％的凝胶而言，在六天之后细胞数目停止增加，这表明已经达到了细胞增殖的最大凝胶容量。在其它的水凝胶体系(例如PEG和藻酸盐/酯)中也观察到了相似的现象(Nuttleman等人，2006；Ramdi等人，207Exp.Cell Res.449-54(1993))。就8％和12％的凝胶而言，在六天之后细胞数目减少，这与显微观察、组织学观察和存活-死亡观察相一致。在高浓度凝胶中活性的损失可能是由于物质运送限制，也可能是由于在这些较高凝胶浓度时施加的机械限制。可以排除凝胶对于hMSC有毒的可能性，因为在4％、8％和12％丝凝胶的顶部生长的hMSC具有与在对照细胞培养皿上生长的hMSC相似的生长速度，并且在所有组之间细胞形态(纺锤形)都是相似的。可通过本文提供的教导探索使较低凝胶浓度(1％和2％)稳定的最优化条件，并可通过各种浓度的丝凝胶详细研究氧和营养物的扩散速率。

本文提供了一种基于超声作用的、允许丝纤蛋白水凝胶迅速形成的新方法。凝胶化可在几分钟到几小时内得以诱导，这取决于超声功率输出和持续时间。由于疏水水合作用的变化，凝胶化伴随着β-折叠结构的形成。低浓度的K⁺和低pH可加快凝胶化速率，而Ca²⁺的存在和高浓度的K⁺则抑制凝胶化。压缩模量在369-1712kPa范围内时，丝纤蛋白水凝胶具有优于以往报道的机械性能。凝胶机械强度随丝纤蛋白溶液浓度的增加而增加。4％(w/v)的丝纤蛋白水凝胶适合于封装hMSC；在静置培养条件下，细胞可在几周内保持生存和增殖能力。

本发明进一步以下列实施例为特征，并将其作为实施方式的示例。

实施例

实施例1.丝纤蛋白溶液

如前所述制备丝纤蛋白储备水溶液(Sofia等人，54J.Biomed.Mater.Res.139-48(2001))。简要来说，将家蚕(B.mori)的茧在0.02M碳酸钠水溶液中煮沸40分钟，然后用纯水彻底冲洗。在干燥后，将提取的丝纤蛋白于60℃在9.3M的LiBr溶液中溶解4小时，产生20％(w/v)溶液。利用Slide-a-Lyzer透析盒(MWCO3,500，Pierce，罗克福德，伊利诺斯州)将该溶液用蒸馏水透析两天以除去盐分。该溶液在透析之后是在光学上清澈的，然后将其离心以除去在处理过程中形成的少量丝聚集物，所述丝聚集物通常来自于茧上存在的环境污染物。丝纤蛋白水溶液的终浓度为大约8％(w/v)。该浓度通过对干燥后已知体积溶液的残留固体进行称重来测量。通过用水稀释8％的溶液来制备低浓度的丝溶液。为了获得高浓度的丝溶液，将8％的溶液在室温下用10％(w/v)PEG(10,000g/mol)溶液在Slide-a-Lyzer透析盒(MWCO3,500，Pierce)中透析至少24小时(Jin&Kaplan，2003；Kim等人，2004)。用水将体积调整至所需浓度。在使用前所有溶液都在4℃下储存。

实施例2.具有各种盐浓度和pH的丝溶液

为了测定盐浓度对于丝凝胶化的作用，将1M的KCl和CaCl₂储备液加入丝溶液至20mM到200mM的最终盐浓度。为了测定pH对于凝胶化的作用，用1M的HCl或NaOH溶液滴定丝溶液，并用pH计监测pH。

实施例3.筛选丝凝胶化条件

为了在各种超声处理条件下测定丝凝胶化，用Branson450超声发生器(Branson超声波公司(Branson Ultrasonics Co.)，丹伯里，康涅狄格州)在1.5ml Eppendorf管中，对0.5ml丝(水)溶液进行超声处理，所述超声发生器由以下部件组成：Model450电源、变压器(部件号101-135-022)、1/2"外螺纹破碎仪探头(Disruptor Horn)(部件号101-147-037)以及1/8"直径的锥形微探头(Microtip)(部件号101-148-062)。功率输出的变化为10％至50％振幅(3瓦特-21瓦特)，并且超声处理时间的变化为5秒至30秒。为了测定盐和pH对于凝胶化的影响，以20％振幅(7瓦特)对上述制备的0.5ml丝溶液超声处理15秒。在超声处理之后于37℃下培养溶液，然后通过翻转管并检验溶液的不透明度变化来肉眼监控溶胶-凝胶转换(Matsumoto等人)。

根据初步结果，使用达到12％(w/v)的丝纤蛋白浓度来保持低粘度，并且12％的溶液比8％和4％的样品胶凝得更快。这些结果列于下表2。

表2.超声处理后大体积(5ml-7ml)丝纤蛋白水溶液的胶凝时间

注：根据至少两个独立的试验来估计并平均得到胶凝时间。

实施例4.圆二色性(CD)

以20％振幅(7瓦特)超声处理0.5ml的2％丝(水)溶液30秒，然后立即装入光路长度0.01mm的复合式石英池(sandwich quartz cell)(Nova Biotech，El Caion，加州)。用Jasco-720圆二色性分光光度计(Jasco公司，日本)进行圆二色性测定。在37℃下以100nm/min的速率用4秒累积时间扫描所有样品，然后由四个重复的试验平均得到结果。对于丝β-折叠结构形成的动力学测定，在2.5小时中以每10秒采样一次来监控217nm处的椭圆率变化。

实施例5.机械试验

用超声处理制备大体积的丝凝胶以进行机械测试。在121℃下，在玻璃烧瓶中将4％、8％和12％(w/v)的丝溶液高压灭菌20分钟。向高压灭菌后的溶液中补充无菌Dulbecco改进的Eagle培养基粉末(DMEM粉末，Invitrogen，卡尔斯巴德，加州)和碳酸氢钠(Sigma-Aldrich，圣路易，密苏里州)分别达到0.135g/ml和0.037g/ml的浓度。所得到的溶液pH经pH计测定为pH7.4。将7ml等分的溶液加入15ml的Falcon塑料管中，然后以20％、30％、40％振幅(分别为7瓦特、10瓦特、15瓦特)超声处理30秒。将6ml超声处理后的溶液加入小培养皿(BD Falcon^TM，No.35-3001，BD Biosciences，Palo Alto，加州)中，在37℃恒温箱中肉眼监控该培养皿以便估计细胞培养参数，直到基于不透明特征和凝胶表面上的凝聚作用达到完全凝胶化为止。接下来，在胶凝之后，立即将直径9.525mm的块(高度2mm-3mm)冲压出来用于机械测试。在测试前将凝胶块在DMEM全溶液(Gibco/Invitrogen)中预处理超过1小时。

将所有样品浸在DMEM中储存，并在24小时内测试。在装配有无侧限压缩台板和100N载荷传感器的3366Instron装置(Norwood，马萨诸塞州)上进行评价。以1mm/min的拉伸速率来进行压缩拉伸方法。基于半自动技术来测定压缩应力和压缩应变并计算弹性模量。除曲线图初始的线性部分外，将应力-应变曲线低于切断应力(cut-off stress)水平下分成八段。利用最小二乘法拟合，将这八段中的最高斜率定义为样品的压缩模量。利用偏置屈服(offset-yield)的方法测定压缩强度。作出与模量线平行的线，但偏移样品标距(gauge length)的0.5％。将应力-应变曲线与偏置线交叉处对应的应力值定义为所述支架的压缩强度。根据基于ASTM方法F451-95的改进进行该测试。

进行两个无侧限压缩试验方案来评价超声处理条件对于机械性能的影响。首先，将断裂应变测试(strain-to-failure test)用于获得传统材料的劲度性质，并观察到断裂响应(Almany&Seliktar26(15)Biomats.2467-77(2005)；Kong等人，24(22)Biomats.4023-29(2003))。其次，根据Hung等人的试验参数，将应力松弛测试(stress relaxation test)用于评价平衡模量特性(32Ann.Biomed.Eng.35-49(2004))。这些测定共同为针对用于细胞包封的其它可降解水凝胶的已公开特性提供了宽泛的比较。对于记录的每个组评价N=4的样品，并在装配有无侧限压缩台板和100N载荷传感器的3366Instron装置(Norwood，麻省)上进行测试，利用Bluehill软件2.0版导出样品数据。

对于断裂应变测试，以1mm/min的拉伸控制速率将每个样品压缩，在达到额定自重负载(nominal tare load)并记录样品高度后开始测试。通过样品几何学的归一化来测定压缩应力和压缩应变，并且以在每个应力-应变曲线的5％应变部分上建立的切线的斜率来计算“传统的”弹性模量。通过将2％应变的切线的平行线进行偏移来测定屈服强度；将应力/应变响应与偏置线的交点定义为屈服强度(其与断裂起始相一致)。就应力松弛测试而言，将样品浸在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并在额定自重负载下保留200秒。此后，将样品以1mm/s进行压缩直至10％应变为止，保持20分钟。通过将10％应变下的松弛应力归一化来计算平衡模量。

实施例6.丝凝胶的体外酶促降解

如上所述制备的4％、8％、12％(w/v)的丝凝胶块(直径=4mm；高度=2mm-3mm)，然后在24孔板中将其浸于1mL蛋白酶XIV(Sigma-Aldrich)溶液。通过将酶粉溶解于PBS中达到5U/mL的浓度来制备新鲜的蛋白酶溶液，并每24小时用新配制的溶液进行替换。将对照块浸于1mL的PBS，也每24小时进行更新。在37℃下培养所有样品。在第1、2、3、4和7天，用水冲洗四个块，用棉纸擦拭以除去凝胶表面上的多余水分并称重。

实施例7.在丝凝胶中的hMSC接种和培养

如前所述，从来自获准的(consenting)供体(Clonetic-Poietics，Walkersville，MD)的新鲜全骨髓吸出物中分离hMSC(Meinel等人，71J.Biomed.Mater.Res.A25-34(2004)；Meinel等人，88Biotechnol.Bioeng.379-91(2004))，并在包含90％的DMEM、10％胎牛血清(FBS)、0.1mM非必需氨基酸、100U/mL青霉素、1000U/mL链霉素、0.2％两性霉素B抗真菌剂(fungizone antimycotic)和1ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的生长培养基中扩展培养。在使用前，从培养瓶中将通道3-4细胞进行胰蛋白酶化，并重悬于DMEM中获得5×10⁷细胞/mL的细胞密度。将15mL的4％、8％和12％(w/v)的丝溶液进行蒸汽灭菌(高压灭菌)，并用上述的DMEM粉和碳酸氢钠进行补充。将5mL的等分加入15-mL Falcon塑料管中，并对于每个丝浓度共制备两个管(对照和所接种的细胞)。在层流净化罩中以50％振幅超声处理4％(w/v)丝溶液(5mL)30秒，并在30分钟培养后在同样条件下再次超声处理。在第二次超声处理后，在5分钟-10分钟内将溶液冷却至室温，然后加入50mL细胞悬浮液，并与超声处理过的丝溶液混合至5×10⁵细胞/mL的终浓度。除了在超声处理之后加入50mL的DMEM代替细胞悬浮液，以同样的方式超声处理对照样品。将1.5mL混合物的等分快速移液至12孔细胞培养板中，其对于每个样品组共准备三个孔。以40％和30％振幅分别将8％和12％(w/v)溶液用30秒的时间超声处理一次。加入50ml等分的hMSC悬浮液，并如上所述将混合物铺板。然后在37℃和5％的C02下培养所有培养板。

当所述培养板中的丝在0.5小时-2小时内发生凝胶时，从凝胶上冲压出小块(直径=4mm；高度=2-3mm)，并置于新的24孔板的孔中。然后在37℃和5％的C02下，将小块在包含90％的DMEM、10％的FBS、0.1mM非必需氨基酸、100U/mL青霉素、1000U/mL链霉素、0.2％两性霉素B抗真菌剂的1mL生长培养基中进行培养。就显微图像而言，在24孔板中制备具有体积为0.5mL的包封有hMSC的丝凝胶，并在1mL相同生长培养基和与上述相同的条件下培养，并且在需要的时间点拍摄图像。

实施例8.包封于丝凝胶中的hMSC的分析

相差显微技术-在培养的第2、6、14和21天，通过装配有索尼ExwaveHAD3CCD彩色摄像机的相差光学显微镜(Carl Zeiss，耶拿，德国)监测细胞形态。

细胞增殖-用DNA测试对细胞增殖进行评价。简言之，在每个时间点上，将每组的4个凝胶块用pH7.4的PBS冲洗并称重(湿重)，然后在冰中用显微手术剪来切碎。按照制造商的说明书，利用PicoGreen试验(Molecular Probes，Eugene，OR)测定DNA含量(N=4)。以480nm的激发波长和528nm的发射波长利用荧光测定法测定样品。根据在相同试验中获得的标准曲线计算DNA含量，并进一步用每个凝胶块的湿重来进行归一化。

细胞生存能力：用存活-死亡测试(Molecular Probes，Eugene，OR)检验hMSC在凝胶块中的生存能力。简言之，在培养末期，用PBS冲洗接种有hMSC的每组凝胶块，切成两个等分，并在37℃下于处于PBS中的2mM钙黄绿素AM(染色活细胞)和4mM乙锭均二聚体(EthD-1，染色死细胞)内培养30分钟。用带有Lasersharp2000软件(激发/发射～495nm/～515nm)的共焦点显微镜(Bio-Rad MRC1024，Hercules，CA)对所切凝胶的横截面进行拍照。从一系列水平断面中获得深度投影显微照片，其根据清晰的细胞群的总高度在彼此不同的距离上拍照(1μm-10μm增量)。获取各种深度的静止图像，并且随后将一系列显微照片组合成“Z轴叠加(z-stacked)”编辑的图像。

组织学：将接种过细胞的丝凝胶用PBS进行冲洗，并在组织学分析之前于10％中性缓冲福尔马林中固定2天。通过一系列梯度的乙醇将样品脱水并包埋在石蜡中，然后以5mm厚度切片。对于组织学评价，将切片除去石蜡，通过一系列梯度的乙醇再水化，然后用苏木精和曙红(H&E)进行染色。

实施例9.统计

利用Student t-检验来进行统计学分析。当pp0.05时，认为具有显著性差异；当pp0.01时，认为具有高度显著性差异。

Claims (7)

1.一种在丝纤蛋白中包封至少一种药剂的方法，所述方法包括：

a.将所述药剂引入丝纤蛋白溶液；以及

b.将丝纤蛋白溶液进行超声处理以起始凝胶化，其中，所述超声的功率为3-21瓦特；并且其中，在所述超声处理后不超过24小时形成实质上的丝纤蛋白凝胶化，

c.从而形成丝纤蛋白包封的药剂。

2.一种在丝纤蛋白中包封至少一种药剂的方法，所述方法包括：

a.将丝纤蛋白溶液进行超声处理以起始凝胶化，其中，所述超声的功率为3-21瓦特；以及

b.在所述丝纤蛋白溶液中发生实质上的凝胶化之前，将所述药剂引入所述丝纤蛋白溶液，

c.从而形成丝纤蛋白包封的药剂。

3.一种控制丝纤蛋白胶凝时间的方法，所述方法通过将丝纤蛋白溶液进行超声处理以起始凝胶化，其中，所述超声的功率为3-21瓦特；并且其中，在所述超声处理后不超过24小时形成实质上的丝纤蛋白凝胶化。

4.一种快速形成丝纤蛋白凝胶化的方法，所述方法包括将丝纤蛋白进行处理，所述处理包括超声处理以起始凝胶化，其中，所述超声的功率为3-21瓦特；并且其中，在所述超声处理后不超过24小时形成实质上的丝纤蛋白凝胶化。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，在所述超声处理后不超过2小时形成实质上的丝纤蛋白凝胶化。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，实质上的凝胶化发生在五分钟到两个小时的时间范围内。

7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述起始凝胶化的时间为5秒-60秒。