RU2692578C1 - Имплантат для регенерации костной ткани и способ его получения - Google Patents
Имплантат для регенерации костной ткани и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2692578C1 RU2692578C1 RU2017147018A RU2017147018A RU2692578C1 RU 2692578 C1 RU2692578 C1 RU 2692578C1 RU 2017147018 A RU2017147018 A RU 2017147018A RU 2017147018 A RU2017147018 A RU 2017147018A RU 2692578 C1 RU2692578 C1 RU 2692578C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- implant
- scaffold
- composite
- fibroin
- bone
- Prior art date
Links
- 239000007943 implant Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 title claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 5
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 40
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims abstract description 30
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 17
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 25
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 13
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 13
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 17
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 17
- 230000006835 compression Effects 0.000 abstract description 6
- 238000007906 compression Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000035876 healing Effects 0.000 abstract description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009646 cryomilling Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 abstract description 2
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 abstract 5
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 abstract 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 9
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000316 bone substitute Substances 0.000 description 4
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 4
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 4
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 3
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 3
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 2
- 230000000278 osteoconductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane-2,5-dione Chemical compound O=C1COC(=O)CO1 RKDVKSZUMVYZHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 208000017234 Bone cyst Diseases 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010013296 Sericins Proteins 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010049514 Traumatic fracture Diseases 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037180 bone health Effects 0.000 description 1
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 210000003275 diaphysis Anatomy 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000001564 haversian system Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002706 hydrostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010883 osseointegration Methods 0.000 description 1
- 230000004820 osteoconduction Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000016515 regulation of signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 108010064995 silkworm fibroin Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000036448 vitalisation Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 150000003755 zirconium compounds Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/28—Bones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/24—Dialysis ; Membrane extraction
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B02—CRUSHING, PULVERISING, OR DISINTEGRATING; PREPARATORY TREATMENT OF GRAIN FOR MILLING
- B02C—CRUSHING, PULVERISING, OR DISINTEGRATING IN GENERAL; MILLING GRAIN
- B02C19/00—Other disintegrating devices or methods
- B02C19/18—Use of auxiliary physical effects, e.g. ultrasonics, irradiation, for disintegrating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K23/00—Use of substances as emulsifying, wetting, dispersing, or foam-producing agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к медицине. Имплантат для регенерации костной ткани состоит из композитных микрочастиц, характеризующихся пористой структурой с размером пор от 10 до 85 мкм, содержанием фиброина шелка от 65 до 75 мас.%, содержанием желатина от 25 до 35 мас.%, а также показателем модуля Юнга на сжатие в дегидратированном состоянии 83±1 МПа, во влажном - 590±60 кПа. Способ получения имплантата включает следующие стадии: подготовку водного раствора фиброина, подготовку водного раствора желатина, формирование композитного скаффолда, криоизмельчение скаффолда, полученного на стадии формирования композитного скаффолда, и осаждение композитных микрочастиц, полученных на стадии криоизмельчения скаффолда. Подготовку водного раствора фиброина шелка осуществляют путем растворения фиброина из расчета 100-150 мг/мл в смеси CaCl:CHOH:HO при молярном соотношении компонентов смеси 1:2:8 в течение 5-7 часов при нагревании до 70°С±5°С и последующего диализа против воды, центрифугирования при 13400 g в течение 10 мин и доведения полученного раствора водой до концентрации 20-30 мг/мл. Подготовку водного раствора желатина осуществляют путем растворения сухого желатина в воде из расчета 20-30 мг/мл. Формирование композитного скаффолда осуществляют путем заморозки в течение 6-8 суток при температуре -(18-25)°С смеси растворов, полученных на стадиях подготовки водного раствора фиброина шелка и подготовки водного раствора желатина, в объемном соотношении 7:3 и 0,8-1,2 об.% диметилсульфоксида (ДМСО) с последующей разморозкой и обработкой 96%-ным этанолом, что обеспечивает формирование β-складчатой структуры, затем скаффолды замораживают в дистиллированной воде. Криоизмельчение скаффолда, полученного на стадии формирования композитного скаффолда, осуществляют в 70%-ном этаноле с использованием диспергатора, осуществляют последующую сортировку полученных фрагментов скаффолда с получением композитных микрочастиц размером 100-250 мкм. Осаждение композитных микрочастиц, полученных на стадии криоизмельчения скаффолда, из суспензии в 70%-ном этаноле осуществляют при 13000-18000 g в течение 30-40 мин с последующим высушиванием при 50-55°С в течение не менее 2 суток для формирования имплантата для регенерации костной ткани. Изобретения обеспечивают упрощение технологии получения имплантата в сочетании с улучшением механических характеристик получаемого имплантата, в частности модуля Юнга при измерении на сжатие, повышением его остеиндуктивных свойств, что способствует ускорению заживления и регенерации костной ткани. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 6 ил.
Description
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к области создания биорезорбируемых, биосовместимых имплантатов на основе фиброина шелка Bombyx mori и желатина, и предназначено для ускорения восстановления и регенерации костной ткани.
Уровень техники
Существует ряд травм и заболеваний, например, травматические переломы, переломы, требующие скрепления отломков, костные кисты, критические дефекты костей, ослабление на границе кости и протеза, злокачественные опухоли и т.д., требующих восстановления части кости или нескольких костей, а также замены целой кости или нескольких костей. Традиционные методы восстановления костной ткани предполагают использование аутотрансплантатов - трансплантацию собственных тканей пациента, взятых из здорового участка, или аллотрансплантатов - трансплантацию тканей или органа, взятых от донора. При этом предпочтение отдается аутотрансплантатам, несмотря на высокую стоимость такой процедуры и дополнительное травмирование пациента, дополнительный риск инфицирования, повреждение нервов, большую потерю крови и, как следствие, необходимость переливания крови, сопровождающуюся дополнительными рисками для пациента. Кроме того, существуют ограничения в максимальном объеме тканей, который можно взять у пациента в качестве аутотрансплантатов. Аллотрансплантаты также обладают рядом недостатков, в том числе низким качеством тканей, обусловленным забором донорского материала у трупов, риском заражения ВИЧ или гепатитом, иммуногенностью и т.д.
Недостатки аутотрансплантатов и аллотрансплантатов стимулировали поиск новых подходящих материалов - костных заменителей, которые могли бы использоваться в качестве альтернативы при восстановлении костной ткани. Параллельно развивается три основных направления создания костных имплантатов. Первое - костные заменители, основанные на биоматериалах, соответствующих физическим свойствам замещаемой ткани, при этом сохраняющих инертность по отношению к тканевой микросреде. К таким материалам относятся металлы, например, нержавеющая сталь, титан и сплавы, керамика на основе соединений алюминия и циркония, и полимеры, такие как силикон, полипропилен и полиметилметакрилат. Такие материалы вызывают неспецифический иммунный ответ по причине своей низкой биосовместимости.
Второе направление - разработка костных заменителей с одной стороны с учетом необходимости избегания неспецифического иммунного ответа, с другой - наличия биологически активных поверхностей, которые бы вызывали определенную биологическую реакцию (например, остеокондукцию), чтобы избежать образования волокнистого слоя и улучшить остеоинтеграцию. Общая стратегия заключается в модификации биоматериалов, используемых в первом направлении, путем нанесения покрытий, которые обладают биологической активностью и способны к биодеградации. Такая биоактивность обеспечивается поверхностными химическими реакциями, которые либо направлены на минерализацию посредством гетерогенной кристаллизации гидроксиапатитов, либо покрытием поверхности биоматериала биоактивной керамикой, такой как гидроксиапатиты, β-трикальцийфосфат β-ТСР) или биологически активное стекло. Другой тип костных имплантатов сконструирован таким образом, что скорость его деградации соответствует скорости заживления травмированный костной ткани. Это биоматериалы на основе натуральных или синтетических полимеров, обеспечивающих контролируемое химическое разложение в физиологических условиях до инертных продуктов, которые могут рассасываться в организме. Примеры синтетических полимеров включают полилактид, поли(ε-капролактон) и полигликолид; среди природных полимеров - хитозан и гиалуроновая кислота [M. Navarro, A. Michiardi, O. 
and J.A. Planell. Biomaterials in orthopaedics // J.R. Soc. Interface. 2008. V. 5 (27). P. 1137-1158]. Механические и остеокондуктивные свойства этих полимеров могут быть улучшены путем формирования композитов с биоактивной керамикой. Другой альтернативой для улучшения полимеров является их химическая модификация путем присоединения остеоиндуктивных биомолекул.
Третье направление - костные заменители, максимально приближенные к стандартам аутотрансплантатов, которые создаются на основе биоматериалов, способных индуцировать специфические клеточные ответы на молекулярном уровне, посредством введения биоактивных компонентов и способности к биологическому разложению. Данный тип костных трансплантатов предназначен для усиления регенерации кости путем включения клеток-предшественников костной ткани, а также факторов роста, чтобы стимулировать клетки на матриксе, сконструированном из различных природных или синтетических биоматериалов, или их комбинации, которые создают необходимую поддержку и достаточную васкуляризацию, чтобы обеспечить доступ питательных веществ для поддержания процесса регенерации [A.R. Amini, C.T. Laurencin and S.P. Nukavarapu. Bone tissue engineering: recent advances and challenges // Crit. Rev. Biomed. Eng. 2012. V. 40 (5). Р. 363-408]. В этом случае процесс регенерации костной ткани является остеокондуктивным, поскольку мезенхимальные стволовые клетки стимулируются к дифференцировке в преостеобласты, и процесс зависит от условий микросреды.
В дополнение к биохимическим факторам роста экзогенное механическое воздействие влияет на микросреду костной ткани, а также является важным компонентом в поддержания здоровья костей и гомеостаза. Такое механическое воздействие преобразуется в биохимические сигналы, которые затем интегрируются в систему клеточных ответов посредством механотрансдукции. Костную ткань можно рассматривать как клеточную сеть, где остеоциты служат сенсорными клетками, ответственными за механотрансдукцию, а остеобласты и остеокласты являются эффекторными клетками. Текущая парадигма механотрансдукции утверждает, что нагрузки, приложенные к целой кости, вызывают пульсирующий ток жидкости через канальцы остеоцитов. Остеоциты способны ощущать напряжение сдвига, порожденного этим током, а затем продуцировать сигнальные молекулы, которые регулируют ремоделирование кости за счет остеокластов и остеобластов. Хотя точная последовательность событий и комплекс сигналов, участвующих в процессе механотрансдукции, не вполне ясны, известно, что механическое напряжение и пульсирующий ток жидкости индуцируют синтез сигнальных молекул остеоцитами. Считается, что эффекты механической нагрузки на механическую деформацию и пульсирующий ток жидкости, индуцируемый в костных клетках, возникает в результате растяжения из-за гидростатического давления и сжатия/расслабления внеклеточного матрикса, а напряжение сдвига - за счет тока жидкости [W.R. Thompson, C.T. Rubin and J. Rubin. Mechanical regulation of signaling pathways in bone // Gene. 2012. V. 503 (2). P. 179-193]. Кости в естественных условиях генерируют все эти силы одновременно, так что волны, создаваемые давлением, не могут быть отделены от эффектов напряжения сдвига жидкости или деформации клеток. Это представляет интерес для инженерии костной ткани, чтобы использовать эти сжимающие или растягивающие механизмы для механической стимуляции трехмерных каркасов, содержащих клетки-предшественники костной ткани, что способствует образованию костной матрицы перед имплантацией [A.B. Yeatts, D.T. Choquette and J.P. Fisher. Bioreactors to influence stem cell fate: augmentation of mesenchymal stem cell signaling pathways via dynamic culture systems // Biochim. Biophys. Acta. 2013. V. 1830 (2). Р. 2470-2480].
Механические свойства кости зависят от масштаба и структурного уровня. Например, модуль Юнга при больших растяжениях кортикальных фрагментов бедренной кости человека (размер до 15 мм) находится в диапазоне от 14 до 20 ГПа (макроструктурная организация) [Reilly D. The elastic modulus for bone / D. Reilly, A. Burstein, V. Frankel // J. Biomech. - 1974]. В то же время модуль Юнга на изгиб из диафиза задней стороны большеберцовой кости (размер 100 мкм) показал 5.4 ГПа (микроструктурная организация) [Choi K. The elastic moduli of human subchondral, trabecular, and cortical bone tissue and the size-dependency of cortical bone modulus / K. Choi, J.L. Kuhn, M.J. Ciarelli, S.A. Goldstein // J. Biomech. - 1990. - T. 23 - №11 - 1103-1113]. Однако неясно, является ли причиной этого различия методов измерения или влияния микроструктуры. Модуль Юнга остеонов большеберцовой кости, измеренный с помощью наноиндентации, составляет примерно 22 ГПа, что близко к значениям модуля Юнга макроструктуры [Rho J.Y. Mechanical properties and the hierarchical structure of bone / J. Y. Rho, L. Kuhn-Spearing, P. Zioupos // Med. Eng. Phys. - 1998. - T. 20 - №2 - 92-102]. Таким образом, изучение механических свойств кости необходимо производить на разных уровнях организации внутри костного материала.
Механические свойства субстрата оказывают существенное влияние на эукариотические клетки. Для нормального развития клеток и, соответственно, тканей субстрат должен отвечать определенным требованиям, одно из которых - это способность поддерживать клеточную адгезию. Такие важные процессы как пролиферация, дифференцировка клеток, их миграция и даже выживаемость в той или иной степени зависят от наличия и поддержания контактов клеток с субстратом. Поэтому механические свойства имплантатов, используемых в регенеративной медицине, являются их важной характеристикой, стоящей в одном ряду с отсутствием токсичности, кинетикой биодеградации и т.д. Таким образом, изделия, предназначенные для ускорения заживления и регенерации костной ткани, должны обладать определенным набором механических свойств, в первую очередь, это модуль Юнга, который показывает способность материала (в общем случае - изделия) сопротивляться механической нагрузке.
В тканевой инженерии и, в частности, в инженерии костной ткани, важную роль играют биодеградируемые полимеры. По сравнению с неорганическими материалами, полимеры более эластичны и часто проще поддаются обработке. На основе полимеров могут быть получены трехмерные пористые структуры, которые обеспечивают проникновение клеток в глубину имплантата и хорошо имитируют губчатую кость. Путем вариации мономерного состава полимеров и количества межмолекулярных сшивок можно тонко оптимизировать механические свойства и время деградации имплантатов.
Таким образом, при разработке изделий для восстановления костей необходимо подобрать материал так, чтобы по своим механическим свойствам он был близок к материалу кости. При этом кость имеет сложную многоуровневую структуру, и каждому уровню соответствует свой набор механических характеристик. Чем меньше размер структурных элементов кости, тем сложнее для измерения становятся их механические свойства. Для восстановления костей используют неорганические материалы, полимеры и композиты. Неорганические материалы обычно сравнительно жесткие и хрупкие, полимеры сравнительно мягкие, эластичные и относительно быстро деградируют. Композиты могут наиболее точно сымитировать кость, т.к. их структуру и состав можно наиболее гибко и тонко оптимизировать.
Активные разработки заменителей костной ткани на основе биополимеров, в том числе структурных белков шелка, подтверждаются множеством патентных документов, среди которых наиболее близкие решения раскрыты в следующих документах.
Из уровня техники известно изобретение KR 100762928 (В1), где описано использование нетканых волокон из фиброина, которые могут содержать керамику. Материал может быть использован для регенерации костной ткани.
Однако, материал предназначен только для направления регенерации костной ткани и не предназначен для использования в качестве несущего на себе нагрузку материала для регенерации кости.
Известно техническое решение по международной заявке на получение патента на изобретение WO 2005012606 (А2), где раскрыто использование раствора фиброина, сконцентрированного обратным диализом, против гигроскопичного полимера для получения губчатой структуры с использованием частиц соли и/или путем пропускания газа через раствор, а также раскрыты пористые фиброиновые губки, которые могут содержать соответствующие сигнальные факторы, включая костный морфогенный белок, в том числе витализированный стромальными клетками. В одном аспекте осуществления данного изобретения трехмерный пористый шелковый каркас сам (без дополнительной витализации) может быть имплантирован in vivo и служить заменителем костной ткани.
Однако материал не обеспечивает несущую нагрузку во время имплантации.
В патентных документах WO 2004108180 A1, WO 2008099190 А2 раскрыт стимулирующий костные клетки синтетический заменитель костного трансплантата для заполнения костных дефектов, не требующих стабилизации костной структуры, выполненный из полилактогликолида. Высокая пористость обеспечивает приток жидкости и питательных веществ, а также возможность миграции клеток к месту регенерации. Основным недостатком полилактогликолида как материала является локальное закисление продуктами его распада - молочной и гликолевых кислот, вследствие чего развивается асептическое воспаление и замедляются процессы остеогенеза. Предлагаемое изобретение лишено вышеуказанного недостатка.
На основе сополимера лактида и гликолида выполнен и многофункциональный биодеградируемый композит, применяемый в частности для регенерации костной ткани (см. патент ЕР 1646410 В1). Данный композит может быть произведен в форме кости, хряща или мягкой ткани. В состав композита может быть включен активный агент, стимулирующий регенерацию ткани. Достоинством данного продукта, присущим также предлагаемому изобретению, является возможность включения в имплантат активных агентов. Недостатком, как было указано выше, является использование полилактогликолида, ухудшающего биосовместимость полученного продукта.
Еще один патент раскрывает способ получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения (RU 2396342). Изобретение относится к способу получения трехмерных матриц для тканеподобных структур из клеток животного происхождения. Данный способ предусматривает ковалентное связывание гистонов с поверхностью предварительно активированных биосовместимых полимерных микросфер из кристаллизованного декстрана. Затем проводят осаждение центрифугированием микросфер с ковалентно связанными гистонами. Полученный слой микросфер на поверхности субстрата с нанесенными на него клетками используют в качестве основы для получения тканеподобных клеточных структур. Известное изобретение обладает одним существенным недостатком, а именно модификация проводится природными катионными белками - гистонами из ткани тимуса телят, что повышает риск возникновения инфекционных заболеваний и/или иммунной реакции организма в ответ на трансплантацию и, как следствие, отторжение имплантата.
Раскрытие изобретения
Задачей заявляемой группы технических решений является необходимость создания биосовместимого биорезорбируемого имплантата для регенерации костной ткана, обеспечивающего ускорение восстановления и регенерации костной ткани без введения дополнительных компонентов и химической модификации в фиброин-желатиновые скаффолды.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в упрощении технологии получения имплантата в сочетании с улучшением механических характеристик получаемого имплантата, в частности, модуля Юнга при измерении на сжатие, повышением его остеиндуктивных свойств, что способствует ускорению заживления и регенерации костной ткани.
Заявляемый имплантат и способ его получения также характеризуются невысокой стоимостью сырья, что в сочетании с уникальными свойствами имплантата, обусловленными улучшенными показателями модуля Юнга по сравнению с фиброин-желатиновыми скаффолдами, на основе которых сформирован имплантат, позволит создать доступный конкурентоспособный продукт и занять лидирующие позиции в данной области, т.к. изделия на основе фиброина превосходят по биосовместимости существующие на рынке имплантаты для регенерации костной ткани, которые представлены в основном ксеноматериалами и изделиями из полилактогликолидов. Кроме того, важным техническим результатом, достигаемым заявляемой группой изобретений, является усиление стимуляции остеогенеза в отсутствии каких-либо индукторов, что подтверждается стимуляцией дифференцировки остеобластоподобных клеток MG-63 при культивировании на поверхности имплантата.
Поставленная задача решается тем, что заявляемый имплантат для регенерации костной ткани, характеризуется пористой структурой с размером пор от 10 до 85 мкм, содержанием фиброина шелка от 65 до 75 мас. %, содержанием желатина от 25 до 35 мас. %, и имеет значение модуля Юнга на сжатие в дегидратированном состоянии 83±1 МПа, во влажном - 590±60 кПа. Поставленная задача решается также тем, что способ получения имплантата для регенерации костной ткани, включает следующие стадии:
а) подготовку водного раствора фиброина шелка путем растворения фиброина из расчета 100-150 мг/мл в смеси CaCl2:C2H5OH:H2O при молярном соотношении компонентов смеси в течение 5-7 часов при нагревании до 70°С±5°С и последующего диализа против воды, доведение полученного раствора водой до концентрации 20-30 мг/мл;
б) подготовку водного раствора желатина путем растворения сухого желатина в воде из расчета 20-30 мг/мл;
в) формирование композитного скаффолда путем заморозки в течение 6-8 суток при температуре - 18-25°С смеси растворов, полученных на стадиях а) и б), в объемном соотношении 7:3 и 0,8-1,2 об% диметилсульфоксида (ДМСО) с последующей разморозкой и обработкой 96%-ным этанолом, что обеспечивает формирования β - складчатой структуры;
г) криоизмельчение скаффолда, полученного на стадии в), в 70%-ном этаноле с использованием диспергатора, и последующую сортировку полученных фрагментов скаффолда с получением композитных микрочастиц размером 50-500 мкм;
д) осаждение композитных микрочастиц, полученных на стадии г), из суспензии в 70%-ном этаноле при 13000-18000 g в течение 30-40 минут с последующим высушиванием при 50-55°С в течение не менее 2 суток для формирования имплантата для регенерации костной ткани.
Основным преимуществом шелка по сравнению с другими природными биополимерами являются его отличные механические свойства: предел прочности на разрыв шелковой нити тутового шелкопряда Bombyx mori составляет 500 МПа, шелковой нити, очищенной от серицина - 610-690МПа, модуль упругости 5-12 ГПа и 15-17 ГПа и удлинение при разрыве 19% и 4%-16% соответственно. Другие важные преимущества шелка как материала для регенерации тканей: хорошая биосовместимость, возможность получения водных растворов, способность к биологическому разложению, термостабильность, присутствие легкодоступных химических групп для функциональных модификаций, возможность газовой стерилизации и устойчивость к радиации [Yahong Zhao, et al. // J. Biomedical Science and Engineering, 2011, V. 4, P. 397-402].
В предлагаемом изобретении может быть использован фиброин шелка каркасной нити пауков, фиброин шелка тутового шелкопряда и других видов шелкопрядов, фиброин рекомбинантного шелка, а также искусственные аналоги шелка.
Имплантаты, полученные в соответствии с заявляемым изобретением могут применяться для регенерации костной ткани, в частности ретикулофиброзной и пластинчатой.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами.
На фиг. 1 представлен внешний вид заявляемого имплантата для регенерации костной ткани. Линейка 1 мм.
На фиг. 2 представлена структура заявляемого имплантата для регенерации костной ткани. Изображение поперечного среза имплантата, полученное с использованием сканирующей электронной микроскопии.
На фиг. 3А и 3Б представлены зависимости "напряжение-деформация" для образцов имплантатов: сверху - образец в воде, снизу - сухой образец.
На фиг. 4 представлены результаты МТТ-теста, отражающего количество и метаболическую активность клеток, в виде средних значений оптической плотности ± стандартное отклонение, полученные на образцах имплантата и фиброин-желатиновых скаффолдов при культивировании остеобластоподобных клеток MG-63.
На фиг. 5 представлены изображения имплантатов (А, Б) и фиброин-желатиновых скаффолдов (В, Г), окрашенные ализариновым красным на 7 (А, В) и 21 день (Б, Г) культивирования остеобластоподобных клеток MG-63.
Осуществление изобретения
Получение водного раствора фиброина шелка осуществляли с использованием Нитей хирургических нестерильных 100% натуральный шелк, произведенных по ГОСТ 396-84 (Соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 396-84, наличие сертификата соответствия №0302120, гарантии производителя, срок годности, условия хранения по ГОСТ 396-84, сертификат соответствия), при растворении навески в смеси dH2O, кальция хлористого (х.ч., о.с.ч., ГОСТ 450-77; Соответствие упаковки и маркировки ГОСТу 3885-73, наличие гарантии производителя, срок годности, внешний вид) и спирта этилового ректификованного 96%-ного (ГОСТ 5962-67). Фиброин берут в количестве 100-150 мг/мл, обеспечивающем полное растворение в смеси в хлориде кальция, этанола и воды, и получение после диализа раствора с концентрацией не менее 30 мг/мл. Раствор желатина в dH2O готовят таким образом, чтобы получить концентрацию эквивалентную концентрации фиброина в водном растворе. Для получения композита готовили смесь водных растворов полимеров, используя полученный раствор фиброина и водный раствор желатина (ГОСТу 23058-89). Формирование скаффолда для дальнейшего криоизмельчения с целью получения микроносителей проводили путем заморозки смеси водного раствора фиброина и водного раствора желатина с добавлением 1% ДМСО (х.ч., ТУ 2635-114-44493179-08). Криоизмельчение сформированных макрочастиц выполняли с помощью диспергатора. Осаждение микрочастиц проводили в центрифуге для микропробирок Eppendorf 5418R.
Все перечисленные выше процедуры осуществлялись с использованием следующего оборудования: Система очистки воды Elix 70, «Millipore» (Франция, система включает: картридж предварительной очистки Progard TL, картридж обратного осмоса, модуль Elix; производительность 70 л/час при температуре 7-30о С, рабочее давление 0,7-1,0 МПа, 220 В, 50 Гц, габариты (ШГВ): 662×441×733 мм, 56 кг); Резервуар для сбора очищенной воды SDS 200, «Millipore» (Франция, объем 200 л), Весы электронные RV 1502, «OHAUS» (США, (1500,00±0,01) г, 220 В, 50 Гц); Шкаф вытяжной 1200 ШВМкв (Россия, ООО «ЛаМО» макс, мощность подключаемых приборов 3,5 кВт, 220 В, габариты (ШГВ): 1280×750×2400 мм); Холодильник бытовой Атлант МХМ 1707-02 (Минск, Белоруссия, емкость камеры холодильника 175 л, температура от 0°С до 10°С, емкость мороз, камеры 115 л, температура минус 18 до минус 24°С, 220 В, 50 Гц); Диспергатор Bosch MSM 66150 ERGOMIXX (Словения, мощность 600 Вт, 220 В, погружной, турборежим, габариты (ВГШ):210×620×550, вес: 1.15 кг); Центрифуга MiniSpin, «Eppindorf», (Германия, скорость вращения 13 400 об/мин, ротор F-45-12-11, 12×1,5/2 мл, 220 В, 70 Вт, габариты (ВГШ): 122×240×226 мм, 4,3 кг); Баня водяная BWT-U/20, Biosan (Латвия, ванна из н/ж стали объем 20 л. Диапазон регулирования температуры от 30°С до 100°С, точность поддержания температуры ±0,1°С, внутренняя циркуляция, внутр. размеры ванны: 300×320×140 мм, габариты: 345×550×290 мм, 11 кг, 220 В, 50 Гц, 1 кВт), Термостат ТС-1/80, СКТБ (80 л, температура до +60°С, принудительная вентиляция, камера - нержавеющая сталь), Центрифуга для микропробирок Eppendorf 5418R 18×1,5/2 мл, 14000 об/мин, 16873g, с охлаждением, ротор FA-45-18-11, 18×1,5/2 мл.
Ниже приведены примеры конкретного выполнения. Специалисту в данной области техники понятно, что приведенные примеры не ограничивают заявляемую группу изобретений, а призваны показать возможность реализации способа получения имплантата с заявленными характеристиками.
Пример 1.
Получение имплантата для регенерации костной ткани.
Фиброин шелка тутового шелкопряда Bombyx mori растворяют в смеси CaCl2:С2Н5ОН:Н2О (молярное соотношение 1:2:8) в течение 5 часов при температуре 70°С и диализуют против дистиллированной воды, проводя 4 смены диализа. Полученный раствор, содержащий фиброин, центрифугируют 10 минут при 13400 g, определяют концентрацию фиброина в супернатанте по ОД280, доводят концентрацию дистиллированной водой до 20 мг/мл. Желатин растворяют в дистиллированной воде из расчета 20 мг/мл. Смешивают полученные растворы фиброина и желатина в соотношении 7:3, добавляют 1% ДМСО, переносят в форму для формирования скаффолда и замораживают при -20°С 7 дней. В результате получают композитные скаффолды, которые в течение 120 минут обрабатывают 96%-ным этанолом при комнатной температуре.
Полученные композитные скаффолды замораживают в дистиллированной воде, помещают в сосуд с 70% этанолом и криоизмельчают с использованием диспергатора. Полученные фрагменты композитных скаффолдов - микрочастицы, сортируют путем последовательного пропускания через сита с диаметром отверстий 500 мкм, 250 мкм и 100 мкм. Собирают фракцию, прошедшую через сита с диаметром отверстий 500 мкм и 250 мкм и непрошедшую через сито с отверстиями 100 мкм.
Полученную фракцию микрочастиц размером 100-250 мкм переносят в 70%-ный этанол, помещают в центрифужные микропробирки типа Eppendorf объемом 2 мл и центрифугируют при 16 900 g 30 минут. Супернатант отбирают, а осадок помещают на трое суток в термостат на высушивание с принудительной вентиляцией на 50°С. Высушенный образец - имплантат на основе фиброина и желатина, извлекают из пробирки и хранят в сухом виде или 70%-ном этаноле. Полученный имплантат (фиг. 1) представлен пористой структурой с диаметром пор 10-85 мкм (фиг. 2).
Пример 2.
Оценка механических свойств имплантата.
Механические испытания образцов имплантатов проводили на универсальной машине Autograph AGS-10 kNG фирмы Shimadzu (Япония). Сжатие образцов проводилось с линейной скоростью 0,5 мм/мин. Проводились механические испытания сухих образцов и образцов, помещенных в воду. Полного разрушения не происходило в обоих случаях (материал пластичен).
Деформация образцов остеоиндуктивных имплантатов во влажном состоянии (в воде) и в сухом состоянии происходила по-разному (фиг. 3А,Б). При деформации сухого образца наблюдалось характерное плато текучести при напряжении ~6.5 МПа и значениях деформации 20-50%. Модули Юнга для сухого и влажного образцов составили соответственно 83±1 МПа и 590±60 кПа. При этом механические характеристики фиброин-желатиновых скаффолдов, из которых получен имплантат, исследованные ранее, значительно хуже. Так модуль Юнга известных из уровня техники фиброин-желатиновых скаффолдов [Архипова А.Ю. Диссертация на соискание ученой степени канд. биологических наук «Биорезорбируемые скаффолды на основе фиброина шелка для тканевой инженерии и регенеративной медицины». МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, 2016] во влажном состоянии составляет 7,625±0,825 кПа, а в сухом - 175±25 кПа. Таким образом, полученные имплантаты обладают существенным преимуществом в части механических характеристик, в частности, модуля Юнга, перед фиброин-желатиновыми скаффолдами.
Пример 3
Исследование биосовместимости и остеоиндуктивной активности остеобластоподобных клеток MG-63 при культивировании на имплантатах.
Оценку биосовместимости имплантатов проводили с использованием МТТ-теста. Остеобластоподобные клетки MG-63 культивировали в среде ЕМЕМ (Eagle's Minimum Essential Medium) с добавлением 10% сыворотки и 1% NEAA (Non-Essential Amino Acid) в течение 7 дней на образцах заявляемых имплантатов и известных из уровня техники фиброин-желатиновых скаффолдов, из которых получены имплантаты. На 7 день в среду добавляли индукторы остеогенеза: дексаметазон, бета-глицерофосфат и аскорбиновую кислоту. На 7, 14 и 21 дни были проведен МТТ-тест. Для этого в лунки с образцами, содержащие 500 мкл культуральной среды, вносили по 50 мкл 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (МТТ), и инкубировали при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2 в течение 4 часов. Образованные кристаллы формазана растворяли в ДМСО и проводили колориметрические измерения при 540 нм.
По результатам МТТ-теста (фиг. 4) достоверные отличия в сигнале МТТ выявлены только на 7 день. Это может быть связано с разной площадью поверхности образцов, т.к. пористые фиброин-желатиновые скаффолды имеют более крупные и округлые поры, а, соответственно, и большую площадь поверхности на единицу объема. Также замедление пролиферации может объясняться дифференцировкой клеток и таким образом свидетельствовать о стимуляции дифференцировки остеобластоподобных клеток в отсутствии индукторов остеогенеза.
Оценку остеондуктивной активности имплантатов проводили по выявлению отложений солей кальция на 7 и 21 день культивирования остеобластоподобных клеток MG-63 на образцах имплантатов и фиброин-желатиновых скаффолдов, из которых получены имплантаты. Для определения Са2+ переносили образцы в фосфатно-солевой буфер и трижды промывали их, помещали в деионизованную воду, а затем переносили в 2%-ный раствор ализаринового красного рН 4.3 и инкубировали в темноте в течение 30 минут, после чего образцы отмывали от не связавшегося красителя деионизированной водой. Окрашенные ализариновым красным образцы фотографировали (фиг. 5). На 21 день культивирования остеобластоподобных клеток MG-63 на имплантатах выявляется интенсивное окрашивание ализариновым красным, т.е. поверхность имплантата минерализована культивируемыми на нем клетками, что доказывает остеоиндуктивные свойства разработанных имплантатов и делает их перспективными для применения в качестве средства для ускорения заживления и регенерации костной ткани. При этом интенсивность окрашивания имплантатов ализариновым красным была существенно выше, чем фиброин-желатиновых скаффолдов, что указывает на улучшенные остеоиндуктивные свойства образцов имплантатов по сравнению с фиброин-желатиновыми скаффолдами, что видимо связано с разными механическими характеристиками изделий из одного материала.
Традиционно регуляция механических свойств разрабатываемых изделий для регенеративной медицины и тканевой инженерии предполагает химическую модификацию используемых полимеров или введение в состав имплантата новых компонентов, что не только ухудшает их биосовместимость, но и существенно удорожает и усложняет технологию получения таким имплантатов. Раскрытый в заявляемом изобретении способ формирования имплантата для регенерации костной ткани не предполагает применения дополнительных реагентов и дорогостоящего оборудования, при этом обеспечивает получение биосовместимого остеоиндуктивного материала.
Claims (8)
1. Имплантат для регенерации костной ткани, состоящий из композитных микрочастиц, характеризующихся пористой структурой с размером пор от 10 до 85 мкм, содержанием фиброина шелка от 65 до 75 мас.%, содержанием желатина от 25 до 35 мас.%, а также показателем модуля Юнга на сжатие в дегидратированном состоянии 83±1 МПа, во влажном - 590±60 кПа.
2. Способ получения имплантата по п. 1, включающий следующие стадии:
а) подготовку водного раствора фиброина шелка путем растворения фиброина из расчета 100-150 мг/мл в смеси CaCl2:C2H5OH:H2O при молярном соотношении компонентов смеси 1:2:8 в течение 5-7 часов при нагревании до 70°С±5°С и последующего диализа против воды, центрифугирование при 13400 g в течение 10 мин и доведение полученного раствора водой до концентрации 20-30 мг/мл;
б) подготовку водного раствора желатина путем растворения сухого желатина в воде из расчета 20-30 мг/мл;
в) формирование композитного скаффолда путем заморозки в течение 6-8 суток при температуре -(18-25)°С смеси растворов, полученных на стадиях а) и б), в объемном соотношении 7:3 и 0,8-1,2 об.% диметилсульфоксида (ДМСО) с последующей разморозкой и обработкой 96%-ным этанолом, что обеспечивает формирования β-складчатой структуры; затем скаффолды замораживают в дистиллированной воде;
г) криоизмельчение скаффолда, полученного на стадии в), в 70%-ном этаноле с использованием диспергатора, и последующую сортировку полученных фрагментов скаффолда с получением композитных микрочастиц размером 100-250 мкм;
д) осаждение композитных микрочастиц, полученных на стадии г), из суспензии в 70%-ном этаноле при 13000-18000 g в течение 30-40 минут с последующим высушиванием при 50-55°С в течение не менее 2 суток для формирования имплантата для регенерации костной ткани.
3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что осаждение микрочастиц из суспензии в 70%-ном этаноле проводят при 16900 g в течение 30 минут.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017147018A RU2692578C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Имплантат для регенерации костной ткани и способ его получения |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017147018A RU2692578C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Имплантат для регенерации костной ткани и способ его получения |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2692578C1 true RU2692578C1 (ru) | 2019-06-25 |
Family
ID=67038312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017147018A RU2692578C1 (ru) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | Имплантат для регенерации костной ткани и способ его получения |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2692578C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008150861A1 (en) * | 2007-05-29 | 2008-12-11 | Trustees Of Tufts College | Method for silk fibroin gelation using sonication |
| RU2563992C2 (ru) * | 2013-08-12 | 2015-09-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Композитные матриксы на основе фиброина шелка, желатина и гидроксиапатита для регенерации костной ткани |
-
2017
- 2017-12-29 RU RU2017147018A patent/RU2692578C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008150861A1 (en) * | 2007-05-29 | 2008-12-11 | Trustees Of Tufts College | Method for silk fibroin gelation using sonication |
| RU2563992C2 (ru) * | 2013-08-12 | 2015-09-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Композитные матриксы на основе фиброина шелка, желатина и гидроксиапатита для регенерации костной ткани |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Bhawal U.K. Effect of the surface morphology of silk fibroin scaffolds for bone regeneration// Biomed Mater Eng. 2016 Sep 28;27(4):413-424, реф. PubMed. * |
| Chao S.C. et al. Preparation and characterization of gelatin-hydroxyapatite composite microspheres for hard tissue repair// Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2015 Dec 1;57:113-22, реф. PubMed. * |
| Агапов И.И. и др. Трехмерный матрикс из рекомбинантного белка паутины для тканевой инженерии// Доклады Академии наук, 2009, 1(426), с.115-118. * |
| Котлярова М.С. и др. Индукция остеогенной дифференцировки остеобластоподобных клеток MG-63 при культивировании в трехмерных условиях на фиброиновых микроносителях// Вестник Моск. университета, 2016, 4, с. 34-40. * |
| Котлярова М.С. и др. Индукция остеогенной дифференцировки остеобластоподобных клеток MG-63 при культивировании в трехмерных условиях на фиброиновых микроносителях// Вестник Моск. университета, 2016, 4, с. 34-40. Агапов И.И. и др. Трехмерный матрикс из рекомбинантного белка паутины для тканевой инженерии// Доклады Академии наук, 2009, 1(426), с.115-118. Chao S.C. et al. Preparation and characterization of gelatin-hydroxyapatite composite microspheres for hard tissue repair// Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2015 Dec 1;57:113-22, реф. PubMed. Bhawal U.K. Effect of the surface morphology of silk fibroin scaffolds for bone regeneration// Biomed Mater Eng. 2016 Sep 28;27(4):413-424, реф. PubMed. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhang et al. | Effect of microporosity on scaffolds for bone tissue engineering | |
| Aravamudhan et al. | Cellulose and collagen derived micro-nano structured scaffolds for bone tissue engineering | |
| Huang et al. | Modification and evaluation of micro-nano structured porous bacterial cellulose scaffold for bone tissue engineering | |
| Misra et al. | Polyhydroxyalkanoate (PHA)/inorganic phase composites for tissue engineering applications | |
| Qi et al. | Bioactivity assessment of PLLA/PCL/HAP electrospun nanofibrous scaffolds for bone tissue engineering | |
| JP5881669B2 (ja) | コラーゲン／ヒドロキシアパタイト複合骨格及びその生成方法 | |
| Roohani-Esfahani et al. | Effect of self-assembled nanofibrous silk/polycaprolactone layer on the osteoconductivity and mechanical properties of biphasic calcium phosphate scaffolds | |
| Guo et al. | Restoration of critical-size defects in the rabbit mandible using porous nanohydroxyapatite-polyamide scaffolds | |
| Mohajeri et al. | Proliferation and differentiation of mesenchymal stem cell on collagen sponge reinforced with polypropylene/polyethylene terephthalate blend fibers | |
| US20100310623A1 (en) | Synergetic functionalized spiral-in-tubular bone scaffolds | |
| Sultana | Mechanical and biological properties of scaffold materials | |
| Scott et al. | Advances in bionanomaterials for bone tissue engineering | |
| KR101105285B1 (ko) | 다공성 마이크로스피어 및 이의 제조방법 | |
| Zhao et al. | In vitro biomimetic construction of hydroxyapatite–porcine acellular dermal matrix composite scaffold for MC3T3-E1 preosteoblast culture | |
| Park et al. | Development and characterization of reinforced poly (L-lactide) scaffolds for bone tissue engineering | |
| Zhu et al. | 3D-printed porous titanium changed femoral head repair growth patterns: osteogenesis and vascularisation in porous titanium | |
| Li et al. | Synthesis and evaluation of BMMSC-seeded BMP-6/nHAG/GMS scaffolds for bone regeneration | |
| Yan et al. | An interference screw made using a silk fibroin-based bulk material with high content of hydroxyapatite for anterior cruciate ligament reconstruction in a rabbit model | |
| RU2692578C1 (ru) | Имплантат для регенерации костной ткани и способ его получения | |
| CN110038167B (zh) | 一种仿生糖基化矿化胶原/糖基化壳聚糖/plga复合骨组织工程支架及其制备方法 | |
| Gupta et al. | Highly controlled robotic customized gel functionalization on 3D printed PCL framework for bone tissue engineering | |
| Neshati et al. | Evaluating the biodegradability of Gelatin/Siloxane/Hydroxyapatite (GS-Hyd) complex in vivo and its ability for adhesion and proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells | |
| CN110624129B (zh) | 一种耐溶蚀的骨诱导性丝素蛋白/羟基磷灰石/氧化镁凝胶海绵及制备方法 | |
| Kotliarova et al. | Bioresorbable scaffolds based on fibroin for bone tissue regeneration | |
| Yadav et al. | Composites based on bioderived polymers: Potential role in tissue engineering: Vol VI: Resorbable polymer fibers |