TWI687442B - 瘧疾疫苗 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種包括多肽及至少一種瘧疾抗原之粒子,以及包括該粒子之組成物或疫苗、其醫藥用途,特別是用於預防或治療瘧疾的感染。
Description
本發明係關於包括多肽及至少一種瘧疾抗原之粒子,以及包括該粒子之組成物或疫苗、其醫藥用途,特別是用於預防或治療瘧疾。
瘧疾係世界上最流行且嚴重的傳染病之一,每年大約有2億5千萬個病例及1百萬人死亡(WHO,2009)。死亡主要發生於五歲以下兒童及懷孕婦女。每45秒就有一名非洲兒童死於瘧疾。此疾病係透過受感染之蚊類而在人與人之間傳播,故以往的根除工作係涉及大規模的驅蟲活動。此類根除工作在美國東南部是成功的,然而,舉例而言,在大部分低開發熱帶國家卻是失敗的。目前的工作係涉及蚊帳的配給,特別是經殺蟲劑浸漬的蚊帳,藉以預防夜晚蚊子叮咬。然而,殺蟲劑及用於預防與治療兩者之抗瘧疾藥物的抗藥性卻快速增加。因此,為了保護數百萬人免於死亡,對於瘧疾疫苗的需求係極為必要的(http://www.globalvaccines.org/content/malaria+vaccine+program/19614)。
由惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)所造
成的瘧疾仍然存在重大的公共衛生威脅,尤其是在非洲兒童及懷孕婦女之中。有效的瘧疾疫苗將會是降低疾病負荷的有價值工具,且對於在世界上的若干地區消除瘧疾能有所貢獻。目前的瘧疾疫苗候選者係針對寄生蟲生命週期中的人與蚊子階段,但迄今為止,相對較少蛋白質曾被研究用於有潛力疫苗的發展。
最先進的疫苗候選者,RTS,S,於第II期臨
床試驗中賦予部分保護作用以對抗瘧疾,且其目前正於非洲進行第III期試驗評估(The Journal of Clinical Investigation 120(12)4168-4178,2010)。
CSP係子孢子(sporozoite)最主要的表面抗
原。CSP係由鍵結於硫酸肝素蛋白多醣之N端區(RI)、包含四胺基酸(NPNA)重複之中間區及包含類血小板反應蛋白域(thrombospondin-like domain)之GPI錨定C端區(RII)所構成。包含在RTS,S疫苗之CSP區域包括最後16個NPNA重複及整個側翼(franking)C端。HBsAG粒子係用作RTS,S之基質載劑,該HBsAG粒子有25%係稠合至CSP區段(The Journal of Clinical Investigation 120(12)4168-4178,2010)。
於一系列RTS,S第II期臨床試驗中,經
RTS,S免疫之30%至50%未接觸過瘧疾之成人係受保護,藉以對抗受同源的惡性瘧原蟲純株感染之蚊類的攻擊。於甘比亞及肯亞之第II期田間試驗中,RTS,S賦予大約35%成人短暫的保護作用以對抗瘧疾感染,儘管來自肯亞之試驗結果並未達到統計上的顯著差異。於莫三比克、坦尚尼
亞及肯亞進行之第II期試驗中,經RTS,S免疫之大約30%至50%兒童及嬰兒係受保護而免於臨床性瘧疾,然而,保護作用普遍短暫(The Journal of Clinical Investigation 120(12)4168-4178,2010)。關鍵且大規模之第III期試驗結果於2012年11月9日線上公開在新英格蘭醫學期刊(NEJM),該結果顯示RTS,S瘧疾疫苗候選者有助於保護非洲嬰兒對抗瘧疾。當相較於以對照組疫苗免疫時,經RTS,S疫苗免疫之嬰兒(第一次疫苗免疫時為6至12週大)具有臨床性瘧疾及重症瘧疾兩者之事件少了三分之一,且對於注射具有相似的反應。
目前並無對抗瘧疾之獲得許可的疫苗。對於高效瘧疾疫苗仍有強烈渴望。
類病毒粒子(VLPs)係多蛋白結構,其模擬真實病毒之組織及構造,但缺少病毒之基因體,有潛力產生較安全且較便宜的疫苗候選者。目前世界各地有少數已商業化之預防性VLP系疫苗:葛蘭素克史藥廠(GlaxoSmithKline)之Engerix®(B型肝炎病毒)及Cervarix®(人類乳突病毒),以及默克藥廠(Merck and Co.,Inc.)之Recombivax HB®(B型肝炎病毒)及Gardasil®(人類乳突病毒)即為若干實例。其他VLP系疫苗候選者則於臨床試驗中或正進行臨床前評估,例如流感病毒、小病毒(parvovirus)、諾瓦克(Norwalk)及各種嵌合VLP。許多其他候選者則仍侷限於小規模之基礎研究,儘管它們於臨床前測試係成功者。大規模VLP製造之意涵於程序控制、監控
及最適化之內容中討論,順應地辨認及討論主要上下游技術之挑戰。伴隨臨床試驗之最新結果及以嵌合VLP為主之醫療或預防性疫苗免疫用技術之最近發展,簡要地介紹成功之VLP系疫苗的大轟動(Expert Rev.Vaccines 9(10),1149-1176,2010)。
自從基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,
CHIKV)2004年於肯亞再度出現以來,此α病毒已在非洲、歐洲及亞洲感染數百萬人。於缺乏疫苗或抗病毒療法下,此疾病之嚴重性及流行性病毒之蔓延造成嚴重之公共衛生威脅。據報導,流行性基孔肯雅病毒之VLP疫苗保護非人類靈長類動物對抗感染(Nat Med.2010 March;16(3):334-338)。美國專利公開案第2012/0003266號揭示包含一種或多種基孔肯雅病毒結構多肽之類病毒粒子(VLP),其有利於調配針對感染或其至少一種症狀誘發免疫力之基孔肯雅疫苗或抗原組成物。WO2012/106356揭示經修飾之α病毒或黃病毒之類病毒粒子(VLP)及用於提高經修飾之VLPs產量之方法,藉以用於預防或治療α病毒及黃病毒媒介型疾病。(此等引用文獻係以參照方式併入本文)。
於第一態樣中,本發明提供能自組裝之粒
子,其包括多肽及至少一種瘧疾抗原,其中,該多肽包括至少一個第一附著位,且該至少一種瘧疾抗原包括至少一個第二附著位;且其中,該多肽及該瘧疾抗原係透過該至少一個第一附著位及至少一個第二附著位連接。
於第二態樣中,本發明提供核酸分子,其係經設計而用於表現本發明第一態樣中所提供之粒子。
於第三態樣中,本發明提供組成物或疫苗,包括本發明第一態樣中所提供之粒子及/或本發明第二態樣中所提供之核酸分子。
於第四態樣中,本發明提供製造抗體的方法,包括使本發明第一態樣中所提供之粒子及/或本發明第二態樣中所提供之核酸分子與哺乳動物接觸。
於第五態樣中,本發明提供於哺乳動物中之免疫調節的方法、治療瘧疾的方法、誘發及/或提升對抗瘧疾抗原之免疫反應的方法,包括投予本發明第三態樣中所提供之組成物至哺乳動物。
於第六態樣中,本發明提供對抗造成瘧疾之病原體的被動免疫方法,包括投予本發明第四態樣中所提供之抗體至哺乳動物。
於第七態樣中,本發明提供於巨噬細胞上呈現抗原的方法,包括使本發明第一態樣中所提供之粒子及/或本發明第二態樣中所提供之核酸分子與哺乳動物接觸。
於第八態樣中,本發明提供製造本發明第一態樣中所提供之粒子的方法,包括製備經設計而用於表現該粒子之載體;培養經該載體轉染之細胞而表現該粒子;以及回收該粒子。
第1圖顯示pVLP74_15(VLP_CHI 532 NPNAx6)載體。
第2圖顯示pVLP78_15(VLP_CHI 532 NPNAx25)載體。
第3圖顯示pVLP74_25(VLP_VEEV 519 NPNAx6)載體。
第4圖顯示各個猴子經瘧疾VLPs免疫之兩週後,其等血清誘發抗CSP抗體之高力價(titer)。
第5圖顯示第4圖所顯示之數據的平均值及SD。
第6圖顯示CHIKV VLP與VEEV VLP組合免疫於誘發對抗CSP抗體之影響。於此圖中,Adj係指佐劑。
第7圖顯示投予未與瘧疾抗原融合之VLP對於誘發抗CSP抗體之影響。於此圖中,4w、6w、10w及14w分別係指免疫後4週、免疫後6週、免疫後10週及免疫後14週。
第8圖顯示投予與瘧疾抗原融合之VLP對於誘發抗CSP抗體之影響。於此圖中,4w、6w、10w及14w分別係指免疫後4週、免疫後6週、免疫後10週及免疫後14週。
第9圖顯示投予與瘧疾抗原融合之VLP及佐劑對於誘發抗CSP抗體之影響。於此圖中,4w、6w、10w及14w分別係指免疫後4週、免疫後6週、免疫後10週及免疫後14週。
第10圖顯示實驗流程圖。
第11圖顯示透過PCR的方式偵測18S瘧疾DNA。
(1)包含多肽及至少一種瘧疾抗原之粒子
於第一態樣中,本發明提供能自組裝之粒子,包括多肽及至少一種瘧疾抗原,其中,該多肽包括至少一個第一附著位,且該至少一種瘧疾抗原包括至少一個第二附著位;且其中,該多肽及該瘧疾抗原係透過該至少一個第一附著位及至少一個第二附著位連接。
如本文使用,「能自組裝之粒子」係指藉由至少一個自發性組裝之成分而形成之粒子。該成分可為多肽或非胜肽化合物。於一具體實施例中,「能自組裝之粒子」可為包括或由至少一種多肽所組成之粒子。該至少一種多肽係由一種或多種胜肽所組成。於一具體實施例中,該粒子具有直徑為至少10nm,舉例而言,至少20nm,較佳為至少50nm。於一具體實施例中,該粒子之分子量為自100kDa至100,000kDa,較佳為自400kDa至30,000kDa。
用於本發明之多肽可為自發性組裝。該多肽可為病毒結構多肽。因此,本發明所提供之粒子可為類病毒粒子。
病毒結構多肽可為天然存在之病毒多肽或其經修飾之多肽。於一具體實施例中,經修飾之多肽具有與包含殼體及外膜蛋白之天然存在之病毒結構多肽的胺基酸序列一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。於一具體實施例中,經修飾之多肽為包含殼體及外膜蛋白之天然存在之病毒結構多肽之突變體,該突變體中最多10%胺基酸係經刪除、取代及/或添加。
於一具體實施例中,用於本發明之病毒結
構多肽係包括殼體及/或外膜蛋白或其片段或由其等所組成。舉例而言,用於本發明之病毒結構多肽係包括殼體及E2及E1或由其等所組成。抗原可為插入至E2中。於一具體實施例中,本發明第一態樣中所提供之粒子可藉由組裝240個殼體、240個E1蛋白及240個E2蛋白而形成,其中,瘧疾抗原係插入至每一E2蛋白中。
用於本發明之病毒結構多肽可衍生自α病
毒或黃病毒。因此,本發明所提供之粒子可為衍生自α病毒或黃病毒之類病毒粒子。α病毒及黃病毒之實例包括,但不限於,奧拉病毒(Aura virus)、巴班肯病毒(Babanki virus)、巴馬森林病毒(Barmah Forest virus,BFV)、貝巴魯病毒(Bebaru virus)、卡巴斯歐病毒(Cabassou virus)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、東方馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus,EEEV)、埃拉特病毒(Eilat virus)、沼澤地病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、蓋塔病毒(Getah virus)、高地J病毒(Highlands J virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、馬亞羅病毒(Mayaro virus)、米池病毒(Me Tri virus)、米德爾堡病毒(Middelburg virus)、莫斯達斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎布病毒(Mucambo virus)、恩杜穆病毒(Ndumu virus)、歐尼恩病毒(O'nyong-nyong virus)、那皮舒納病毒(Pixuna virus)、里奧內格羅病毒(Rio Negro virus)、羅斯河病毒(Ross River virus(RRV))、鮭魚胰腺病病毒(Salmon pancreas disease virus)、西門利啟森林病毒(Semliki Forest virus)、辛
德比斯病毒(Sindbis virus)、南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)、圖那特病毒(Tonate virus)、挫卡拉病毒(Trocara virus)、烏納病毒(Una virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)、西方馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus,WEEV)、瓦塔羅阿病毒(Whataroa virus)、西尼羅河病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus)及黃熱病毒。
瘧疾係人類或其他動物(如老鼠)罹患之疾
病。瘧疾之實例包括,但不限於,瘧原蟲屬(Plasmodium)(P.)所造成的疾病,瘧原蟲屬包括惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲(P.malariae)、卵形瘧原蟲(P.ovale)、間日瘧原蟲(P.vivax)、諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)、伯氏瘧原蟲(P.berghei)、夏氏瘧原蟲(P.chabaudi)及約氏瘧原蟲(P.yoelii)。
如本文使用,術語「瘧疾抗原」係指任何
抗原或其片段。術語「抗原或其片段」係指任何以胜肽為主之序列,其可被免疫系統辨識及/或刺激細胞性免疫反應及/或刺激抗體產生。
根據Scand.J.Immunol.56,327-343,2002,
就整個寄生蟲生命週期而論,本質上存在六個可用於瘧疾疫苗的標的:(1)子孢子;(2)肝階段;(3)裂殖子(merozoite);(4)受感染之紅血球(RBC);(5)寄生蟲毒素;(6)有性階段。
表中總括每一階段辨認之主要候選抗原。
(Scand.J.Immunol.56,327-343,2002)
根據本發明,可使用上述表列之一種或多種抗原,只要其係用以形成寄生蟲。舉例而言,環子孢子蛋白及其片段可用作為抗原。環子孢子蛋白之實例包括,但不限於,由下述胺基酸序列(SEQ ID No.56)所組成之惡性瘧原蟲環子孢子蛋白:Mmrklailsvssflfvealfqeyqcygsssntrvlnelnydnagtnlynelemnyygkqenwyslkknsrslgenddgnnnngdngregkdedkrdgnnedneklrkpkhkklkqpgdgnpdpnanpnvdpnanpnvdpnanpnvdpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnvdpnan
pnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnanpnknnqgngqghnmpndpnrnvdenanannavknnnneepsdkhieqylkkiknsistewspcsvtcgngiqvrikpgsankpkdeldyendiekkickmekcssvfnvvnssiglimvlsflflntr。
於一具體實施例中,瘧疾抗原係惡性瘧原蟲環子孢子蛋白B細胞抗原決定位。惡性瘧原蟲環子孢子蛋白B細胞抗原決定位之實例可為NPNA重複序列,包括(NPNA)4-30(即4xNPNA、5xNPNA、6xNPNA、7xNPNA、8xNPNA、9xNPNA、10xNPNA、11xNPNA、12xNPNA、13xNPNA 14xNPNA、15xNPNA、16xNPNA、17xNPNA、18xNPNA、19xNPNA、20xNPNA、21xNPNA、22xNPNA、23xNPNA、24xNPNA、25xNPNA、26xNPNA、27xNPNA、28xNPNA、29xNPNAor 30xNPNA)。
於一具體實施例中,瘧疾抗原係約氏瘧原蟲環子孢子蛋白B細胞抗原決定位,包括(QGPGAP)3-12。
於一具體實施例中,瘧疾抗原係間日瘧原蟲環子孢子蛋白B細胞抗原決定位,包括(ANGAGNQPG)1-12。
於一具體實施例中,瘧疾抗原係三日瘧原蟲環子孢子蛋白B細胞抗原決定位,包括(NAAG)4-30。
於一具體實施例中,瘧疾抗原係惡性瘧原蟲環子孢子蛋白T細胞抗原決定位。惡性瘧原蟲環子孢子蛋白T細胞抗原決定位之實例可為EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT(SEQ ID No.:44)。
(EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT)1-6亦可用作為瘧疾抗原。
於一具體實施例中,瘧疾抗原係約氏瘧原蟲環子孢子蛋白T細胞抗原決定位,其為YNRNIVNRLLGDALNGPEEK(SEQ ID No.45)。(YNRNIVNRLLGDALNGPEEK)1-6亦可用作為瘧疾抗原。
本發明提供抗原、編碼該抗原之載體及專一性結合至該抗原之抗體(及類抗體分子,包括適體(aptamer)及胜肽),以及該等於預防或治療瘧疾感染之用途(單獨或結合使用),藉以應付一種或多種上述需求。如本文使用,術語「抗體」係指能夠結合抗原決定位或抗原決定區之分子。該術語意欲包括整個抗體及其抗原結合片段,包括單鏈抗體。此類抗體包括人類抗原結合抗體片段,以及包括,但不限於,Fab、Fab'與F(ab')2、Fd、單鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、雙硫鍵連接之Fvs(sdFv)及包含VL域或VH域之片段。抗體可源自任何動物,包括鳥類及哺乳動物。較佳地,抗原係源自哺乳動物,如人類、鼠類、兔、山羊、天竺鼠、駱駝、馬等;或其他合適之動物,如雞。如本文使用,「人類」抗體包括具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的抗體,以及包括自人類免疫球蛋白庫或自轉殖一種或多種人類免疫球蛋白而不表現內源性免疫球蛋白之動物所單離之抗體,舉例而言,如美國專利案第5,939,598所述者,該專利案之揭示內容係以參照方式併入本文。
用於本發明之抗原可為衍生自天然存在之蛋白質之經修飾之多肽。經修飾之多肽可為天然存在之蛋
白質之片段。於一具體實施例中,經修飾之多肽具有與衍生自天然存在之多肽的胺基酸序列一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。於一具體實施例中,衍生之經修飾之多肽為以衍生自天然存在之蛋白質之多肽為基礎之突變體,該突變體中最多10%胺基酸係經刪除、取代及/或添加。
於本發明所提供之粒子中,多肽及抗原可透過至少一個呈現於該多肽之第一附著位與至少一個呈現於該抗原之第二附著位連接。
如本文使用,「第一附著位」及「第二附著位」之各者係指一種以上物質相互連接之位。
於一具體實施例中,多肽及抗原係直接融合。或者,一個或兩個連接基可介於該抗原之N端殘基及該多肽之間,及/或該抗原之C端殘基及該多肽之間。
抗原或多肽可被截斷並以短連接基替換。於若干具體實施例中,抗原或多肽包括一個或多個肽連接基。典型地,連接基係由2至25個胺基酸所組成。通常,其長度為自2至15個胺基酸,惟於特定情況下,可僅為一個,例如單一甘胺酸殘基。
於一具體實施例中,核酸分子係表現於宿主細胞中,使得第一附著位及第二附著位透過肽鍵連接,於該核酸分子中,編碼多肽之多核苷酸係與編碼抗原之多核苷酸基因性融合。於此情形下,多肽及抗原係透過肽鍵連接。關於此具體實施例,第一附著位及/或第二附著位可
自原始多肽或抗原經基因性修飾而來。舉例而言,第一附著位係自多肽經修飾而來,使得多肽透過包含SG、GS、SGG、GGS及SGSG之連接基胜肽與抗原接合。
當多肽與抗原化學性接合時,第一附著位及第二附著位可透過化學交聯劑(其為化合物)連接。
交聯劑之實例包括,但不限於,SMPH、磺基-MBS、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-SIAB、磺基-SMPB、磺基-SMCC、SVSB、SIA及其他可購自皮爾斯化學公司(Pierce Chemical Company)之交聯劑。
於一具體實施例中,本發明所提供之粒子包括連接至抗原之多肽,其中,當抗原之N端殘基與C端殘基之間之空間距離以該抗原或含有該抗原之天然存在之蛋白質或其經修飾之蛋白質的晶體測定時,該距離為30Å或以下。
用於本發明之抗原可由本領域具通常知識者設計。舉例而言,用於本發明之抗原可為天然存在之蛋白質或其片段。或者,用於本發明之抗原可自天然存在之蛋白質或其片段經修飾而來。本領域具通常知識者可設計抗原,使得當抗原之N端殘基與C端殘基之間之空間距離以該抗原或含有該抗原之天然存在之蛋白質或其經修飾之蛋白質的晶體測定時,該距離為30Å或以下。舉例而言,用於本發明所提供之粒子之抗原可使用包括PyMOL(如PyMOL v0.99:http:/www.pymol.org)之免費軟體設計。於一具體實施例中,抗原之N端殘基與C端殘基之間之空間距
離為30Å(埃)或以下、20Å或以下、或10Å或以下(如自5Å至15Å、自5Å至12Å、自5Å至11Å、自5Å至10Å、自5Å至8Å、自8Å至15Å、自8Å至13Å、自8Å至12Å、自8Å至11Å、自9Å至12Å、自9Å至11Å、自9Å至10Å、或自10Å至11Å)。
類基孔肯雅病毒粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子
於一具體實施例中,本發明提供包含基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之結構多肽及至少一種瘧疾抗原之類基孔肯雅病毒粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子,其中,該基孔肯雅病毒結構多肽或該委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽包括至少一個第一附著位,且該至少一種瘧疾抗原包括至少一個第二附著位;且其中,該基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之結構多肽及該至少一種瘧疾抗原係透過該至少一個第一附著位及至少一個第二附著位連接。
於一具體實施例中,當瘧疾抗原之N端殘基與C端殘基之間之空間距離以該瘧疾抗原或含有該瘧疾抗原之天然存在之蛋白質或其經修飾之蛋白質的晶體測定時,該距離為30Å或以下、25Å或以下、20Å或以下、15Å或以下、14Å或以下、13Å或以下、12Å或以下、11Å或以下、10Å或以下、9Å或以下、或8Å或以下(如自5Å至15Å、自5Å至12Å、自5Å至11Å、自5Å至10Å、自5Å至8Å、自8Å至15Å、自8Å至13Å、自8Å至12Å、自8Å至11Å、自9Å至12Å、自9Å至11Å、
自9Å至10Å、或自10Å至11Å)。
於一具體實施例中,瘧疾抗原係以化學交聯或作為經基因工程製造之融合蛋白的方式連接至基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之結構多肽。
用於本發明之基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之結構多肽可包括基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之外膜蛋白及/或殼體。
基孔肯雅病毒之實例包括,但不限於,37997及LR2006 ORY-1病毒株。
委內瑞拉馬腦炎病毒之實例包括,但不限於,TC-83。
用於本發明之基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之結構多肽可為天然存在之病毒結構多肽或其經修飾之多肽。經修飾之多肽可為天然存在之病毒結構多肽之片段。於一具體實施例中,經修飾之多肽具有與天然存在之病毒殼體及/或外膜蛋白的胺基酸序列一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。於一具體實施例中,經修飾之多肽為天然存在之殼體及/或外膜蛋白之突變體,該突變體中最多10%胺基酸係經刪除、取代及/或添加。舉例而言,K64A或K64N突變可引入用於本發明之委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽之殼體中。
基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之結構多肽可包括殼體、E2及E1或由其等所組成。
基孔肯雅病毒結構多肽之實例包括,但不限於,基孔肯雅病毒株37997之殼體-E2-E1,以及基孔肯
雅病毒株LR2006 ORY-1之殼體-E2-E1。
委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽之實例包括,但不限於,委內瑞拉馬腦炎病毒株TC-83之殼體-E2-E1。
於一具體實施例中,第一附著位包括胺基,較佳為離胺酸殘基之胺基。於一具體實施例中,第二
附著位包括巰基,較佳為半胱胺酸之巰基。
於一具體實施例中,兩種以上物質(如抗原與基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽)透過第一附著位或第二附著位之接合係使用化學交聯劑而達成。交聯劑之實例包括,但不限於,SMPH、磺基-MBS、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-SIAB、磺基-SMPB、磺基-SMCC、SVSB、SIA及其他可購自皮爾斯化學公司之交聯劑。
根據本發明,可提供包含基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽及抗原之類基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒粒子,其中,該基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽及該抗原係表現為融合蛋白。
於一具體實施例中,抗原可與基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之結構多肽之任何位置融合。舉例而言,抗原可直接或間接連接至基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之結構多肽之N端或C端;或抗原可插入至基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之結構蛋白中。
於一具體實施例中,至少一種抗原係插入至基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之結構蛋白之E2中。舉例而言,就基孔肯雅病毒結構蛋白而言,至少一種抗原係插入至SEQ ID Nos.1或2之殘基519及520之間(即SEQ ID Nos.1或2之519位置之G及520位置之Q之間);SEQ ID Nos.1或2之殘基530及531之間(即SEQ ID Nos.1或2之530位置之G及531位置之S之間);SEQ ID Nos.1或2之殘基531及532之間(即SEQ ID Nos.1或2之531位
置之S及532位置之N之間);SEQ ID Nos.1或2之殘基529及530之間(即SEQ ID Nos.1或2之529位置之G及530位置之G之間);或SEQ ID Nos.1或2之殘基510及511之間(即SEQ ID Nos.1或2之510位置之S及511位置之G之間);或SEQ ID Nos.1或2之殘基511及512之間(即SEQ ID Nos.1或2之511位置之G及512位置之N之間);SEQ ID Nos.1或2之殘基509及510之間(即SEQ ID Nos.1或2之509位置之Q及510位置之S之間)。
舉例而言,就委內瑞拉馬腦炎病毒結構蛋
白而言,至少一種抗原係插入至SEQ ID No.3之殘基517及518之間(即SEQ ID No.3之517位置之G及518位置之S之間);SEQ ID No.3之殘基518及519之間(即SEQ ID No.3之518位置之S及519位置之S之間);SEQ ID No.3之殘基519及520之間(即SEQ ID No.3之519位置之S及520位置之V之間);SEQ ID No.3之殘基515及516之間(即SEQ ID No.3之515位置之L及516位置之S之間);SEQ ID No.3之殘基516及517之間(即SEQ ID No.3之516位置之S及517位置之G之間);SEQ ID No.3之殘基536及537之間(即SEQ ID No.3之536位置之C及537位置之G之間);SEQ ID No.3之殘基537及538之間(即SEQ ID No.3之537位置之G及538位置之G之間);SEQ ID No.3之殘基538及539之間(即SEQ ID No.3之538位置之G及539位置之T之間)。
融合蛋白可使用本領域之習知技術來表現。多種表現系統可用於表現融合蛋白。舉例而言,融合
蛋白可於293細胞、Sf9細胞或大腸桿菌中表現。
衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉
馬腦炎病毒(VEEV)之多肽可為天然存在之病毒多肽或其經修飾之多肽。此外,衍生自瘧疾抗原之多肽可為天然存在之多肽或天然存在之多肽經修飾之多肽或天然存在之多肽之片段或經修飾之胜肽。經修飾之多肽可為天然存在之病毒結構多肽之片段。
於一具體實施例中,衍生自瘧疾抗原之經
修飾之多肽具有與天然存在之多肽的胺基酸序列一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。於一具體實施例中,衍生自瘧疾抗原之經修飾之胜肽為天然存在之多肽之突變體,該突變體中最多10%胺基酸係經刪除、取代及/或添加。
當衍生自病毒之多肽與衍生自抗原之多肽
接合時,可使用包含SG、GS、SGG、GGS、SGSG及TRGGS之連接基胜肽。衍生自病毒之多肽(下文稱為「PFV」)與衍生自抗原之多肽(下文稱為「PFA」)接合之實例包括,但不限於,PFV-SG-PFA-GS-PFV、PFV-SG-PFA-GGS-PFV、PFV-SSG-PFA-GS-PFV、PFV-SGG-PFA-GGS-PFV、PFV-SGSG-PFA-GS-PFV及PFA-SGG-PFA-TRGGS-PFV。
於一具體實施例中,本發明提供類病毒粒
子,其包括衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之多肽與衍生自瘧疾抗原之多肽之融合蛋白,其中,該類病毒粒子係藉由將含有核酸分子之表現載
體轉染至哺乳動物細胞(如293F細胞)中而製備,該核酸分子係對應至SEQ ID Nos.28、31、34、37、39、41或43所示之胺基酸序列。關於此具體實施例,經修飾之融合蛋白亦可用於本發明所提供之類病毒粒子,該經修飾之融合蛋白可藉由將含有核酸分子之表現載體轉染至哺乳動物細胞(如293F細胞)中而製備,該核酸分子係對應至具有與SEQ ID Nos.28、31、34、37、39、41或43之胺基酸序列一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%之胺基酸序列。
於一具體實施例中,本發明提供包括下列
各者或由其等所組成之類病毒粒子:一個或多個基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之殼體;一個或多個基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E1;以及一個或多個基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2,其中,瘧疾抗原係插入至基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2中。舉例而言,本發明提供包括或由下列各者所組成之類病毒粒子:240個基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之殼體;240個基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E1;以及240個基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2,其中,瘧疾抗原係插入至基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之各E2中。
於此具體實施例中,經抗原插入之E2可由
SEQ ID No.50所示之胺基酸序列所組成;E1可由SEQ ID No.51所示之胺基酸序列所組成;且殼體可由SEQ ID No.52所示之胺基酸序列所組成;或經抗原插入之E2可由SEQ ID No.53所示之胺基酸序列所組成;E1可由SEQ ID No.54所示之胺基酸序列所組成;且殼體可由SEQ ID No.55所示之胺基酸序列所組成。
再者,關於此具體實施例,經修飾之基孔
肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之殼體;經修飾之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E1;以及經修飾之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2亦可用於類病毒粒子。舉例而言,經修飾之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之殼體可具有與SEQ ID No.52或55所示之胺基酸序列的胺基酸序列一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%;經修飾之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E1可具有與SEQ ID No.51或54所示之胺基酸序列的胺基酸序列一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%;及/或經修飾之基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2可具有與SEQ ID No.50或53所示之胺基酸序列的胺基酸序列一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。又,經修飾之殼體、E1或E2可為由SEQ ID No.52或55所示之胺基酸序列所組成之殼體;由SEQ ID No.51或54所示之胺基酸序列所組成之E1;及/或由SEQ ID No.50
或53所示之胺基酸序列所組成之E2之突變體,該突變體中最多10%胺基酸係經刪除、取代及/或添加。
於第二態樣中,本發明提供核酸分子,其係經設計而用於表現如本發明第一態樣中所提供之粒子。
於一具體實施利中,本發明提供核酸分子,包括編碼如上所述之基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子之核苷酸序列。
編碼基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子之核苷酸序列之實例包括,但不限於,編碼基孔肯雅病毒株37997之外膜的核苷酸序列、編碼基孔肯雅病毒株37997之殼體-外膜的核苷酸序列、編碼基孔肯雅病毒株LR2006 OPY-1之外膜的核苷酸序列、編碼基孔肯雅病毒株LR2006 OPY-1之殼體-外膜的核苷酸序列、編碼委內瑞拉馬腦炎病毒TC-83之外膜的核苷酸序列及編碼基孔委內瑞拉馬腦炎病毒TC-83之殼體-外膜的核苷酸序列。
於一具體實施例中,本發明提供包括如上所述之核酸分子之載體,其中,該載體視需要包括表現調控序列,其可操作地連接至該核酸分子。
表現調控序列之實例包括,但不限於,啟動子,例如CMV啟動子、λ噬菌體PL啟動子、大腸桿菌lac、phoA與tac啟動子、SV40早期與晚期啟動子及反轉錄病毒LTR之啟動子。
於此具體實施例中,包括如上所述之可操作地連接至核酸分子之表現調控序列的載體可用作為表現載體,用於製備本發明第一態樣中所提供之粒子。
表現載體可藉由本領域具通常知識者根據WO/2012/006180製備,該專利案之全部內容係以參照方式併入本文。
可用於表現包含衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)之多肽與衍生自瘧疾抗原之多肽的融合蛋白之類病毒粒子的載體之實例包括下列所示之載體:含有CHIKV VLP多核苷酸(SEQ ID No.13;其對應至SEQ ID No.14所示之胺基酸序列)之VLP_CHI 512載體(SEQ ID No.8);以及含有CHIKV VLP多核苷酸(SEQ ID No.15;其對應至SEQ ID
No.16所示之胺基酸序列)之VLP_CHI 532載體(SEQ ID No.9)。
表現載體可藉由本領域具通常知識者根據US2012/0003266製備,該專利案之全部內容係以參照方式併入本文。
可用於表現包含衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之多肽與衍生自瘧疾抗原之多肽的融合蛋白之類病毒粒子的載體之實例包括下列所示之載體:含有VEEV VLP多核苷酸(SEQ ID No.17;其對應至SEQ ID No.18所示之胺基酸序列)之VLP_VEEV VLP 518載體(SEQ ID No.10);含有VEEV VLP多核苷酸(SEQ ID No.19;其對應至SEQ ID No.20所示之胺基酸序列)之VLP_VEEV VLP 519載體(SEQ ID No.11);以及含有VEEV VLP多核苷酸(SEQ ID No.21;其對應至SEQ ID No.22所示之胺基酸序列)之VLP_VEEV VLP 538載體(SEQ ID No.12)。
於一具體實施例中,本發明提供核酸分子,其係經設計而用於表現包含衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之多肽與衍生自瘧疾抗原之多肽的融合蛋白之類病毒粒子,該核酸分子係由SEQ ID Nos.26-27、29-30、32-33、35-36、38、40或42所示之核苷酸序列所組成。
於一具體實施例中,本發明提供核酸分子,其係自具有SEQ ID Nos.26-27、29-30、32-33、35-36、38、40或42之任一者所示核苷酸序列之核酸分子經修飾
而來。經修飾之核酸分子可具有與具有SEQ ID Nos.26-27、29-30、32-33、35-36、38、40或42之任一者所示之核苷酸序列之核酸分子的核苷酸序列一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。又,經修飾之核酸分子可為具有SEQ ID Nos.26-27、29-30、32-33、35-36、38、40或42之任一者所示之核苷酸序列之核酸分子之突變體,該突變體中最多10%胺基酸係經刪除、取代及/或添加。
於第三態樣中,本發明提供組成物或疫苗,其包括本發明第一態樣中所提供之粒子及/或本發明第二態樣中所提供之核酸分子。
於一具體實施例中,本發明提供組成物或疫苗,包括如上所述之α病毒或黃病毒之類病毒粒子(如類基孔肯雅病毒粒子或類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子)或如上所述之核酸分子。α病毒或黃病毒之類病毒粒子之含量及核酸分子之含量可為0.00001至1w/w%。
本發明第一態樣中所提供之粒子(如CHIKV VLP或VEEV VLP)之劑量可為1至500μg/天。
一種或多種瘧疾抗原可用於本發明第三態樣中所提供之一種組成物或一種疫苗。
組成物或疫苗可進一步包括醫藥上可接受之載劑及/或佐劑。佐劑之實例包括,但不限於,鋁鹽、氫
氧化鈉、佛朗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)、佛朗氏不完全佐劑及李畢溶液(Ribi solution)(Sigma Adjuvant system,Sigma-Aldrich)。本發明第三態樣中所提供之組成物或疫苗可包含緩衝劑,例如磷酸氫二鈉水合物、磷酸二氫鈉及氯化鈉;以及防腐劑,例如硫柳汞。於一具體實施例中,組成物或疫苗為水溶液,包含0.001至1w/w%本發明第一態樣中所提供之粒子(如CHIKV VLP或VEEV VLP)、1至10w/w%緩衝劑、0.01至1w/w%佐劑及0.00001至0.001w/w%防腐劑。
本領域具通常知識者可使用習知技術製備
醫藥組成物或疫苗。舉例而言,本發明第一態樣中所提供之粒子係與具有生理pH(如pH 5至9、pH 7)之緩衝溶液混合,藉以製備本發明第三態樣中所提供之醫藥組成物或疫苗。
本發明之醫藥組成物可包含單一活性成分
或兩種或更多種活性成分之組合,只要彼等不違反本發明之目的即可。舉例而言,下列各者可用於組合治療:細胞激素包括趨化介素、細胞激素之抗體,例如抗TNF抗體(如英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab))、抗VEGF抗體(如貝伐單抗(bevacizumab)及蘭尼單抗(ranibizumab))、細胞激素受體拮抗劑,例如抗HER2抗體(如曲妥珠單抗(Trastuzumab))、抗EGF受體抗體(如西妥珠單抗(Cetuximab)、抗VEGF適體(如哌加他尼(Pegaptanib))及免疫調節劑,例如環孢靈(cyclosporine)、他克莫司
(tacrolimus)、烏苯美司(ubenimex)。
於多種活性成分組合中,彼等各個含量可考慮其治療效果及安全性而適當增加或減少。
本文使用之術語「瘧疾抗原」係指將二種或更多種活性成分呈單一實體或劑量形式同時投予病患,或於無特定時間限制下,二者呈分開之實體同時或相繼投予病患;其中,此類投予較佳為同時於體內提供兩種成分之治療有效量。
於一具體實施例中,組成物為含有DNA疫苗之疫苗組成物。於一具體實施例中,本發明所提供之DNA疫苗包括含有寡核苷酸之CpG。
本發明第三態樣中所提供之組成物或疫苗可投予一次或多次。當本發明第三態樣中所提供之組成物或疫苗係投予多於一次時,每一投予可使用不同的本發明第一態樣中所提供之粒子(如CHIKV VLP或VEEV VLP)。於一具體實施例中,係採用下述組合:使用本發明第一態樣中所提供之CHIKV VLP之免疫與使用本發明第一態樣中所提供之VEEV VLP之免疫。舉例而言,本發明第一態樣中所提供之CHIKV VLP可用於第一次免疫,而本發明第一態樣中所提供之VEEV VLP可用於第二次免疫;或本發明第一態樣中所提供VEEV VLP可用於第一次免疫,而本發明第一態樣中所提供之CHIKV VLP可用於第二次免疫。
本領域具通常知識者可測定本發明第三態樣中所提供之組成物或疫苗之免疫時機。舉例而言,第二
次免疫係於第一次免疫後1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週進行。
於一具體實施例中,本發明提供套組,包括
(a)疫苗組成物,其包含本發明第一態樣中所提供之粒子;以及(b)另一疫苗組成物,其包含本發明第一態樣中所提供之粒子,其中,包含在(a)之粒子與包含在(b)之粒子為不同之類病毒粒子。於此具體實施例中,包含在(a)之粒子可為類基孔肯雅病毒粒子,而包含在(b)之粒子可為類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子。
於一具體實施例中,本發明提供套組,包括
(a)疫苗組成物,其包含本發明第一態樣中所提供之粒子;以及(b)另一疫苗組成物,其包含本發明第一態樣中所提供之粒子;一種或多種疫苗組成物,每一疫苗組成物包含本發明第一態樣中所提供之粒子,其中,(a)係用於初始免疫作用(priming immunization),而(b)及(c)係用於追加免疫作用(boosting immunization),且包含在(a)之粒子與包含在(b)之粒子為不同之類病毒粒子;而包含在(c)之粒子與包含在(a)及(b)之粒
子不同,或與包含在(a)或(b)之粒子相同。
包含上述套組之各個疫苗組成物可同時、分開或相繼地投予。
本發明第一態樣中所提供之α病毒或黃病毒之類病毒粒子(如基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒)或本發明第二態樣中所提供之核酸分子可用於本發明第三態樣中所提供之組成物及疫苗。
舉例而言,基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子包括或由下列各者所組成:一個或多個(如240個)基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之殼體;一個或多個(如240個)基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E1;以及一個或多個(如240個)基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2,其中,瘧疾抗原係插入至基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之E2中,該基孔肯雅或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子可用於製備本發明第三態樣中所提供之組成物或疫苗。經抗原插入之E2可由SEQ ID No.50所示之胺基酸序列所組成;E1可由SEQ ID No.51所示之胺基酸序列所組成;以及殼體可由SEQ ID No.52所示之胺基酸序列所組成;或經抗原插入之E2可由SEQ ID No.53所示之胺基酸序列所組成;E1可由SEQ ID No.54所示之胺基酸序列所組成;以及殼體可由SEQ ID No.55所示之胺基酸序列所組成。
本發明第三態樣中所提供之組成物或疫苗
可經肌內注射(i.m.)、皮內注射(i.c.)、皮下注射(s.c.)、真皮內注射(i.d.)或腹膜內注射(i.p.)投予至哺乳動物(如人類)中。
本發明第三態樣中所提供之組成物或疫苗可用於治療或預防瘧疾。
因此,本發明亦提供用於製作治療或預防瘧疾的醫藥組成物或疫苗之本發明第一態樣中所提供之α病毒或黃病毒之類病毒粒子(如基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒)或本發明第二態樣中所提供之核酸分子。
(4)製造抗體的方法、免疫調節的方法、治療瘧疾的方法、於哺乳動物中誘發及/或提升對抗瘧疾抗原之免疫反應的方法、被動免疫方法、於巨噬細胞上呈現抗原的方法及製造粒子的方法
於第四態樣中,本發明提供製造抗體的方法,包括使本發明第一態樣中所提供之粒子及/或本發明第二態樣中所提供之核酸分子與哺乳動物接觸。
本發明第四態樣中所製造之抗體可使用習知技術予以人源化。因此,於一具體實施例中,本發明第四態樣中所提供之方法進一步包括使非人類哺乳動物所製造之抗體人源化之步驟。
本發明第一態樣中所提供之粒子及/或本發明第二態樣中所提供之核酸分子可直接投予至病患、至受影響之器官或全身;或離體施用至衍生自病患或人類細胞
株之細胞,隨後將其投予至病患;或體外使用而從衍生自病患之免疫細胞,例如B細胞及T細胞挑選亞族群,然後將其再投予至病患。
根據本發明,類病毒粒子可應用於免疫療法。
於第五態樣中,本發明提供免疫調節的方法、治療瘧疾的方法、於哺乳動物中誘發及/或提升對抗瘧疾抗原之免疫反應的方法,包括投予本發明第三態樣中所提供之組成物至哺乳動物。
於第六態樣中,本發明提供對抗造成瘧疾之病原體的被動免疫方法,包括投予本發明第四態樣中所提供之抗體至哺乳動物。
於第七態樣中,本發明提供於巨噬細胞上呈現抗原的方法,包括使本發明第一態樣中所提供之粒子及/或本發明第二態樣中所提供之核酸分子與哺乳動物接觸。
於第八態樣中,本發明提供製造本發明第一態樣中所提供之粒子的方法,包括製備經設計而用於表現該粒子之載體;培養經該載體轉染之細胞而表現該粒子;以及回收該粒子。
哺乳動物之實例包括,但不限於,人類。
於一具體實施例中,本發明提供製造對抗瘧疾抗原之抗體的方法,包括使如上所述之基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子及/或如上所述之核
酸分子與哺乳動物接觸。所製造之抗體可為能專一性結合至包含在基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子之瘧疾抗原或經核酸分子編碼之瘧疾抗原。本發明之製造抗體的方法有利於製造對抗瘧疾抗原之單株或多株抗體。
於一具體實施例中,根據本發明之製造抗體的方法所獲得之對抗瘧疾抗原之抗體可用於被動免疫。被動免疫方法可包括投予該經獲得之抗體至哺乳動物。
於一較佳具體實施例中,本發明所提供之免疫調節係在哺乳動物中誘發及/或提升對抗瘧疾抗原之免疫反應。因此,於一具體實施例中,本發明提供在哺乳動物中誘發及/或提升對抗瘧疾抗原之免疫反應的方法,包括投予有效量之如上所述之組成物至該哺乳動物。
給定被基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒連同基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之異常巨大分子感染之病患症狀,此VLP可有效且高效地瞄準巨噬細胞及其組成物,例如細胞激素及免疫調節化合物。
於一態樣中,本發明提供於巨噬細胞上呈現抗原的方法,包括投予如上所述之基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子及/或如上所述之核酸分子至哺乳動物。本發明所提供之基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子係良好地瞄準巨噬細胞。於一具體實施例中,本發明所提供之基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子係至少一種抗原至巨噬細胞的傳送系
統,該抗原係包含在基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子。
於一具體實施例中,本發明提供製造本發明第一態樣中所提供之基孔肯雅病毒或委內瑞拉馬腦炎病毒之類病毒粒子的方法,包括製備經設計而用於表現該粒子之載體;培養經該載體轉染之細胞而表現該粒子;以及回收該粒子。於此具體實施例中,可使用習知方法進行轉染。用於轉染之細胞可為293細胞。回收VLP可包括以載體轉染細胞後,收集條件培養基,並可進一步包括使用超速離心法從條件培養基純化VLP。
茲參照下述實施例詳細說明本發明,然而,不擬對本發明之範圍構成限制。
使用下述瘧疾CSP1蛋白之多核苷酸。N端連接基為SGG而C端連接基為GGS。
VLP74(NPNA胺基酸序列之6重複)
Sggnpnanpnanpnanpnanpnanpnaggs(SEQ ID No.:46)
(Tccggaggaaacccgaatgccaatcccaacgcgaaccccaatgctaacccaaatgccaacccaaacgccaaccccaacgctggtggatcc)(SEQ ID No.:47)
VLP78(NPNA胺基酸序列之25重複)
各個多核苷酸係插入至編碼SEQ ID Nos.:15或16(SEQ ID Nos.:1或2)之531位置之Ser及532位置之Asn的密碼子之間,藉以建構用於表現類基孔肯雅病毒粒子之質體(下文稱為CHIKV-VLP74或78),該經修飾之VLP74或78衍生胜肽係插入至基孔肯雅病毒結構多肽之E2。
293F細胞(Lifetechnology公司)係使用PEI(GE Healthcare)或GeneX(ATCC)轉染質體。轉染後4天,收集條件培養基且於3000rpm離心15分鐘以將其與細胞分離。使用0.45μm過濾器過濾上清液,藉以獲得類病毒粒子。使用TFF管柱濃縮類病毒粒子,並使用QXL管柱(GE Healthcare)純化,藉以獲得經純化之類病毒粒子。以類病毒粒子使動物免疫時,該經純化之類病毒粒子係進一步使用旋轉管柱(分子量篩截:100kDa)濃縮,藉以製備用於免
疫之類病毒粒子。
藉由使用CHIKV專一性抗體(ATCC:VR-1241AF)及VLP74或78專一性抗體之西方墨點轉漬法驗證包含VLP74或78且經基孔肯雅病毒結構多肽接合之VLP之表現。
使用與實施例1所使用之相同的瘧疾CSP1蛋白(VLP74及VLP78)多核苷酸。N端連接基為SGG而C端連接基為GGS。
各個多核苷酸係插入至編碼SEQ ID Nos.:19或20(SEQ ID No.:3)之518位置之Ser及519位置之Ser的密碼子之間,藉以建構用於表現類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子之質體(下文稱為VEEV-VLP74或78),該經修飾之VLP74或78衍生胜肽係插入至委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽之E2。
293F細胞(Lifetechnology公司)係使用PEI(GE Healthcare)或GeneX(ATCC)轉染質體。轉染後4天,收集條件培養液且於3000rpm離心15分鐘以將其與細胞分離。使用0.45μm過濾器過濾上清液,藉以獲得類病毒粒子。使用TFF管柱濃縮類病毒粒子,並使用QXL管柱(GE Healthcare)純化,藉以獲得經純化之類病毒粒子。以類病毒粒子使動物免疫時,該經純化之類病毒粒子係進一步使
用旋轉管柱(分子量篩截:100kDa)濃縮,藉以製備用於免疫之類病毒粒子。
藉由使用VEEV專一性抗體及VLP74或78專一性抗體之西方墨點轉漬法驗證包含VLP74或78且經委內瑞拉馬腦炎病毒結構多肽接合之VLP之表現。
經由肌內注射使猴子於第0週以x25-CHI(80ug)及於第3週以含有或不含佐劑(Sigma Adjuvant system,Sigma,S6322)之x6-VEE(80ug)使其免疫。x25-CHI係指CHIKV VLP粒子(VLP78_15)中瘧疾CSP重複胺基酸NPNA 25次。x6-VEE係指VEEV VLP粒子(VLP74_25)中瘧疾CSP重複胺基酸NPNA 6次。於第一次免疫後2及5週抽取血液。
將96孔ELISA盤之每一孔以內含50ng之重組環子孢子蛋白(rCSP)(試劑蛋白,ATG-422)之100ul PBS緩衝液塗覆。培育該盤2小時後,以含有0.05%聚山梨醇酯(Tween)-20之TBS緩衝液清洗三次,並以含有0.05% Tween-20與5%奶粉之TBS緩衝液阻斷。將來自猴子之經加熱去活化且經稀釋之血清加入至該阻斷緩衝液,並於室溫培育1小時。經三次清洗後,加入1:4000稀釋之經過氧化氫酶標記的山羊抗人類IgG或抗老鼠IgG,並於室溫培育1小時。經三次清洗後,加入用於顯影之過氧化氫酶受質,並於室溫培育10分鐘,再加入2N H2SO4終止顯影。使用Gen5(BioTek)及GraphPad Prism6(GraphPad software
Inc)分析數據。
免疫原性顯示於第4至6圖。
於所有經瘧疾VLPs免疫之猴子之血清中發現對抗CSP抗體之誘發(參見第4圖)。表示對抗CSP抗體力價之平均OD值顯示於第5圖。第5圖顯示來自經免疫之猴子的血清誘發對抗CSP抗體之高力價。
如第6圖所示,相較於當初始免疫作用及追加免疫作用兩者只使用包含NPNA之CHIKV VLP粒子時,當初始免疫作用及追加免疫作用分別使用包含NPNA之CHIKV VLP粒子及包含NPNA之VEEV VLP粒子時,達成對抗CSP抗體之高力價。此外,第6圖顯示佐劑的使用進一步提升對抗CSP抗體之力價。再者,第6圖顯示,相較於投予6重複之NPNA,投予25重複之NPNA誘發較高的對抗CSP抗體力價。
於WRAIR瘧疾血清學實驗室之瘧疾疫苗部門中,藉由ELISA測量來自以x25-CHI(80ug)於第0週及不含佐劑之x6-VEE(80ug)於第3週免疫之猴子之血清中的抗Pf CSP抗體力價。於WRAIR瘧疾血清學實驗室之瘧疾疫苗部門所進行的ELISA中,將孔盤以CSPrp((NPNA)6胜肽)[0.2μg/μL](供應商:Eurogentec EP070034)及作為二級抗體之山羊α-人類IgG(KPL/074-1002LOT# 120714)塗覆。藉由產生1.0 OD(414nm)之稀釋因數測定最後的力價。
結果相較於第一次免疫,來自經第二次免疫後之猴子之血清中的抗Pf CSP抗體力價係經提升的(參
見表2)。相較於以RTS,S(葛蘭素克史藥廠)免疫後之猴子之血清中的抗Pf CSP抗體力價,以x25-CHI(80ug)及缺乏佐劑之x6-VEE(80ug)免疫後之猴子之血清中的抗Pf CSP抗體力價被視為係較高的,即使RTS,S(葛蘭素克史藥廠)含有佐劑。
經由肌內注射使小鼠於第0週以10ug之VLP78_15、於第3週以10ug之VLP74_2及於第6週以含有或不含佐劑(Sigma Adjuvant system,Sigma,S6322)之10ug之VLP78_15使其免疫。
於WRAIR瘧疾血清學實驗室之瘧疾疫苗部門中,藉由ELISA測量來自經免疫小鼠之血清中的抗Pf
CSP抗體力價,其中,將孔盤以CSPrp((NPNA)6胜肽)[0.2μg/μL](供應商:Eurogentec EP070034)及作為二級抗體之山羊α-老鼠IgG(KPL/074-1806 LOT# 100737)塗覆,藉以測定血清中的抗體。
藉由產生1.0OD(414nm)之稀釋因數測定最後的力價。
免疫原性顯示於表3及表4。
表3及表4顯示以類病毒粒子免疫三次後達成對抗CSP抗體之高力價。此外,表3及表4顯示佐劑的使用進一步提升對抗CSP抗體之力價。
QNS=不足以測得之量
使用見於齧齒類瘧疾CSP(約氏瘧原蟲CSP)之QGPGAP作為抗原。6x QGPGAP係插入至CHIKV VLP。經由肌內注射使小鼠於第0週及第8週以含有或不含佐劑Ribi之CHIKV VLP兩次(每隻小鼠20ug VLP)使其免疫。
於第一次免疫後4、6、10及14週驗證免疫原性。藉由ELISA測量抗約氏瘧原蟲CSP抗體。除了孔盤係以0.1ng/μl之約氏瘧原蟲CSP重複序列胜肽塗覆之外,此ELISA係以與實施例3所述之ELISA相同之方式進行。二級抗體為抗老鼠IgG HRP(Cell signal,#7076S)。結果顯示於第7至9圖。
第7至9圖顯示經肌內注射投予包含6XQGPGAP之CHIKV VLP達成對抗CSP抗體之高力價。此外,第7至9圖顯示佐劑的使用進一步提升對抗CSP抗體之力價。
6x QGPGAP係插入至CHIKV VLP。經由肌內注射使小鼠(n=5)於第0週及第8週以含有或不含佐劑Ribi之CHIKV VLP兩次(每隻小鼠20ug VLP)使其免疫(參見第10圖)。於第17週進行齧齒類瘧疾:約氏瘧原蟲-挑戰(i.v.)(參見第10圖)。
藉由PCR驗證瘧疾感染。於攻擊後第6天,純化來自小鼠血液之基因組DNA。藉由PCR放大18S瘧疾DNA。第11圖顯示PCR的結果,其結果指出5隻對照小鼠(注射PBS)皆感染瘧疾;5隻經對照VLP免疫之小鼠皆感染瘧疾;5隻經以包含6x QGPGAP之CHIKV VLP免疫之小鼠中,2隻小鼠感染瘧疾,而3隻小鼠未感染瘧疾;以及5隻經以包含6x QGPGAP與佐劑Ribi之CHIKV VLP免疫之小鼠中,1隻小鼠感染瘧疾,而4隻小鼠未感染瘧疾。
根據實施例1製備包含6x或25x NPNA之類基孔肯雅病毒(CHIKV)粒子,並根據實施例2製備包含6x NPNA之類委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)粒子。為製備疫苗組成物,將每一經製備之粒子與1ml,pH 7.2,不含內毒素之蔗糖磷酸溶液(Teknova,SP buffer)混合。
<110> VLP醫療股份有限公司(VLP THERAPEUTICS,LLC)
<120> 瘧疾疫苗
<130> 568951
<160> 56
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 基孔肯雅病毒
<210> 3
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<212> PRT
<213> 委內瑞拉馬腦炎病毒
<210> 4
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<212> DNA
<213> 基孔肯雅病毒
<210> 5
<211> 2964
<212> DNA
<213> 基孔肯雅病毒
<210> 6
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<212> DNA
<213> 基孔肯雅病毒
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<211> 3747
<212> DNA
<213> 基孔肯雅病毒
<210> 8
<211> 8404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_CHI512載體
<210> 9
<211> 8410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_CHI 532載體
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<211> 8431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_VEEV VLP 518載體
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<211> 8431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_VEEV VLP 519載體
<210> 12
<211> 8431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_VEEV VLP 538載體
<210> 13
<211> 3750
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_CHI 512載體-CHIKV VLP
<210> 14
<211> 1250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_CHI 512載體-CHIKV VLP
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_CHI 532載體-CHIKV VLP
<210> 16
<211> 1252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_CHI 532載體-CHIKV VLP
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_VEEV VLP 518載體-VEEV VLP
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<211> 3777
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_VEEV VLP 519載體-VEEV VLP
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<211> 1259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_VEEV VLP 519載體-VEEV VLP
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_VEEV VLP 538載體-VEEV VLP
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_VEEV VLP 538載體-VEEV VLP
<210> 23
<211> 8416
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_CHI 520載體
<210> 24
<211> 3762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_CHI 520載體插件
<210> 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP_CHI 520載體
<210> 26
<211> 8485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74_11(CHI VLP 532_NPNAx6)全部序列
<210> 27
<211> 3831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 僅VLP74_11(CHI VLP 532 NPNAx6)CHIKV-NPNAx6序列
<210> 28
<211> 1277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74_11(CHI VLP 532 NPNAx6)胺基酸序列
<210> 29
<211> 8713
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP78_11(CHI VLP 532 NPNAx25)全部序列
<210> 30
<211> 4059
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 僅VLP78_11(CHI VLP 532 NPNAx25)CHIKV-NPNAx25序列
<210> 31
<211> 1353
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP78_11(CHI VLP 532 NPNAx25)胺基酸序列
<210> 32
<211> 8737
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP78_21(VEEV VLP 519 NPNAx25)全部序列
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 僅VLP78_21(VEEV VLP 519 NPNAx25)VEEV-NPNAx25序列
<210> 34
<211> 1361
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP78_21(VEEV VLP 519 NPNAx25)胺基酸序列
<210> 35
<211> 8509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74_21(VEEV VLP 519 NPNAx6)全部序列
<210> 36
<211> 3858
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 僅VLP74_21(VEEV VLP 519 NPNAx6)VEEV-NPNAx6序列
<210> 37
<211> 1285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74_21(VEEV VLP 519 NPNAx6)胺基酸序列
<210> 38
<211> 7305
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74_15(CHI VLP 532 NPNAx6)全部序列
<210> 39
<211> 1277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74_15(CHI VLP 532 NPNAx6)胺基酸序列
<210> 40
<211> 7533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP78_15(CHI VLP 532 NPNAx25)全部序列
<210> 41
<211> 1353
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP78_15(CHI VLP 532 NPNAx25)胺基酸序列
<210> 42
<211> 7329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74_25(VEEV VLP 519 NPNAx6)全部序列
<210> 43
<211> 1285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74_25(VEEV VLP 519 NPNAx6)胺基酸序列
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)
<210> 45
<211> 20
<212> PRT
<213> 約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii)
<210> 46
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74插件
<210> 47
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74插件
<210> 48
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP78插件
<210> 49
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VLP74插件
<210> 50
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CHIKV E2-74融合蛋白
<210> 51
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CHIKV E1
<210> 52
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CHIKV殼體
<210> 53
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEEV E2-74融合蛋白
<210> 54
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEEV E1
<210> 55
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEEV殼體
<210> 56
<211> 414
<212> PRT
<213> 惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)
Claims (25)
- 一種類病毒粒子,包括病毒結構多肽及至少一種瘧疾抗原,其中,該病毒結構多肽係衍生自基孔肯雅病毒(CHIKV)或委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之多肽,其中,該病毒結構多肽包括外膜蛋白,該至少一種瘧疾抗原係插入至該外膜蛋白,其中,該至少一種瘧疾抗原為:含有(NPNA)n之抗原,其中n為4至30;及/或含有(EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT)y之抗原,其中y為1至6;及其中,該至少一種瘧疾抗原係插入至SEQ ID No.1或2之殘基509-510、510-511、511-512、519-520、529-530、530-531或531-532之間,或插入至SEQ ID No.3之殘基515-516、516-517、517-518、518-519、519-520、536-537、537-538或538-539之間,其中,該至少一種瘧疾抗原及該病毒結構多肽係表現為融合蛋白。
- 如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子,其中,該病毒結構多肽包括殼體及/或外膜蛋白E1及E2。
- 如申請專利範圍第2項所述之類病毒粒子,其中,該至少一種瘧疾抗原係插入至該外膜蛋白之E2中。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之類病毒粒子,其中,該粒子包括經抗原插入之外膜蛋白E2、外膜蛋白E1及殼體。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之類病毒粒子,其中,該粒子係由一個或多個經抗原插入之外膜蛋白E2、一個或多個外膜蛋白E1及一個或多個殼體所 組成之類基孔肯雅病毒粒子;以及其中,該經抗原插入之外膜蛋白E2係由SEQ ID No.50所示之胺基酸序列所組成;該外膜蛋白E1係由SEQ ID No.51所示之胺基酸序列所組成;且該殼體係由SEQ ID No.52所示之胺基酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之類病毒粒子,其中,該粒子係由一個或多個經抗原插入之外膜蛋白E2、一個或多個外膜蛋白E1及一個或多個殼體所組成之類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子;以及其中,該經抗原插入之外膜蛋白E2係由SEQ ID No.53所示之胺基酸序列所組成;該外膜蛋白E1係由SEQ ID No.54所示之胺基酸序列所組成;且該殼體係由SEQ ID No.55所示之胺基酸序列所組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之類病毒粒子,其中,一個或二個連接基介於該抗原之N端殘基及該多肽之間,及/或該抗原之C端殘基及該多肽之間。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之類病毒粒子,其中,該至少一種瘧疾抗原係插入至SEQ ID Nos.1或2之殘基531及532之間,或SEQ ID No.3之殘基518及519之間。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之類病毒粒子,其中,含有該融合蛋白之該類病毒粒子係藉由將核酸分子轉染至哺乳動物細胞中而表現,其中,該核酸分子係對應至SEQ ID Nos.28、31、34、37、39、41 或43所示之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之類病毒粒子,其中,含有該融合蛋白之該類病毒粒子係藉由將核酸分子轉染至哺乳動物細胞中而表現,其中,該核酸分子係對應至具有與SEQ ID Nos.28、31、34、37、39、41或43所示之胺基酸序列之序列一致性為90%或以上之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之類病毒粒子,其中,該至少一種瘧疾抗原係衍生自環子孢子蛋白之片段。
- 一種經分離之核酸分子,包括用於表現如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之類病毒粒子之核苷酸序列。
- 一種經分離之核酸分子,係由SEQ ID Nos.26-27、29-30、32-33、35-36、38、40或42所示之核苷酸序列所組成。
- 一種經分離之核酸分子,係由具有與SEQ ID Nos.26-27、29-30、32-33、35-36、38、40或42所示之核苷酸序列編碼之序列一致性為90%或以上之核苷酸序列所組成。
- 一種載體,包括如申請專利範圍第12至14項中任一項所述之核酸分子,其中,該載體視需要包括表現調控序列,其可操作地連接至該核酸分子。
- 一種組成物,包括如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之類病毒粒子及/或如申請專利範圍第12至14 項中任一項所述之核酸分子。
- 一種醫藥組成物,包括:(a)如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之類病毒粒子及/或如申請專利範圍第12至14項中任一項所述之核酸分子;以及(b)醫藥上可接受之載劑。
- 一種疫苗組成物,包括如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之類病毒粒子。
- 一種DNA疫苗組成物,包括如申請專利範圍第12至14項中任一項所述之核酸分子。
- 一種製造如申請專利範圍第1至11項所述之類病毒粒子的方法,包括製備經設計成用於表現該類病毒粒子之載體;培養經該載體轉染之細胞而表現該類病毒粒子;以及回收該類病毒粒子。
- 如申請專利範圍第18項所述之疫苗組成物,係用於預防或治療瘧疾,其係包括複數個瘧疾衍生抗原。
- 一種套組,包括(a)疫苗組成物,其包含如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之類病毒粒子;以及(b)另一疫苗組成物,其包含如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之類病毒粒子;其中,包含在(a)之類病毒粒子係為與包含在(b)之類病毒粒子不同之類病毒粒子。
- 如申請專利範圍第22項所述之套組,其中,包含在(a) 之類病毒粒子係類基孔肯雅病毒粒子,而包含在(b)之類病毒粒子係類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子,或包含在(a)之類病毒粒子係類委內瑞拉馬腦炎病毒粒子,而包含在(b)之類病毒粒子係類基孔肯雅病毒粒子。
- 如申請專利範圍第22或23項所述之套組,進一步包括(c)一種或多種疫苗組成物,各疫苗組成物包括如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之類病毒粒子,其中,(a)係用於初始免疫作用,而(b)及(c)係用於追加免疫作用,且包含在(c)之類病毒粒子與包含在(a)及(b)之類病毒粒子不同,或與包含在(a)或(b)之類病毒粒子相同。
- 如申請專利範圍第22至23項中任一項所述之套組,其中,各別疫苗組成物係同時、分開或相繼地投予。
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