TW202330575A - 用於治療及預防冠狀病毒之組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

本文揭露了工程SARS-CoV核酸、基因、肽或蛋白質之免疫原性組成物或產品組合，該等免疫原性組成物或產品組合可用於引發針對SARS-CoV感染或包括SARS-CoV-2及其變體之另一冠狀病毒感染之免疫反應。亦揭露了在受試者體內使用該等免疫原性組成物或產品組合以產生免疫反應及中和針對SARS-CoV或另一冠狀病毒之抗體的方法，該等方法藉由使用核酸初免及多肽加強法來投與該等組成物或組合而進行。

Description

用於治療及預防冠狀病毒之組成物及方法
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2022年4月19日提交之美國臨時專利申請案US 63/332,406及2021年9月29日提交之美國臨時專利申請案US 63/261,808之優先權益，該等申請案特此以全文引用之方式明確併入。 對序列表之引用
本申請案正連同電子格式之序列表一起申請。序列表是以9/26/2022創建之標題為SeqListingSVF007WO.xml且大小為300,146位元之檔案形式提供。電子序列表中之資訊特此以全文引用之方式明確併入。
本揭示案之態樣大體上係關於工程SARS-CoV-2核酸、基因、肽或蛋白質之免疫原性組成物或產品組合，該等免疫原性組成物或產品組合可用於引發針對SARS-CoV-2感染或另一冠狀病毒感染之免疫反應。此免疫反應包括激活細胞毒性免疫細胞及產生針對SARS-CoV-2或另一冠狀病毒(包括其變體)之中和抗體的免疫細胞。本揭示案亦大體上係關於對受試者使用或投與本文所描述之免疫原性組成物或產品組合以產生免疫反應之方法，該等免疫反應包括但不限於產生針對SARS-CoV-2或另一冠狀病毒之中和抗體，例如藉由投與與同源或異源核酸及/或多肽初免及核酸及/或多肽加強法之組成物或組合。
由SARS-CoV-2 (2019-nCoV)病毒引起之COVID-19冠狀病毒大流行已導致人類生命的毀滅性損失、對全球經濟之影響以及對全球公共衛生基礎設施之壓力。儘管針對SARS-CoV-2病毒之人類冠狀病毒免疫療法或疫苗已獲批准，但其長期療效及安全性槪貌仍不清楚。此外，亦出現了SARS-CoV-2病毒之其他變體或突變體，該等變體或突變體中之一些已證明比最初鑑別之毒株更具傳染性或毒性。因而，極需要針對SARS-CoV-2 (包括其變體及其他冠狀病毒)之新治療及預防措施。
加快針對SARS-CoV-2及其他潛在的新冠狀病毒毒株或突變體之治療及疫苗開發至關重要。病毒之基因分析表明，SARS-CoV-2及冠狀病毒之變異最多的組分通常為刺突(S)蛋白，該刺突(S)蛋白包括受體結合結構域(receptor binding domain，RBD)。SARS-CoV-2之RBD與2003年之SARS病毒(SARS-CoV-1)及其他冠狀病毒(Wu A等人「Genome Compositions and Divergence of the Novel Coronavirus (2019-nCoV) Originating in China」 Cell Host Microbe.(2020); 27(3):325-328)具有大約75%的同源性。此表明現有的針對諸如SARS-CoV-1之其他冠狀病毒的免疫療法及疫苗候選物在預防SARS-CoV-2方面無用。世界各地開發之許多針對SARS-CoV-2之疫苗已展示出在預防嚴重併發症及住院方面之有效性，但由於全球供應短缺及配送物流限制，根除SARS-CoV-2病毒受到阻礙，導致變體出現，該等變體中之一些已證明更具傳染性及/或受當前疫苗產品之影響更小。
本文揭露了用作針對SARS-CoV-2之免疫原性組成物的獨特候選物，該等候選物允許快速驗證及大規模生產。本文描述了使用核酸(DNA或RNA)初免及多肽加強投與方案之異源初免-加強免疫法的用途。核酸初免允許在單次劑量後一或兩週內偵測到中和抗體。此是由於與蛋白質/佐劑混合物相比更好的T細胞初免。
在一些實施例中，本文所描述之免疫原性組成物或產品組成物為核酸及/或多肽。在一些實施例中，核酸為DNA或RNA。在一些實施例中，免疫原性組成物或產品組成物意欲向諸如哺乳動物、小鼠、兔、貓、狗、靈長類動物、猴子或人之動物投與，以誘導針對SARS-CoV-2病毒或另一冠狀病毒之免疫原性反應。在一些實施例中，免疫原性反應包括形成活性免疫細胞、基本上由其組成或由其組成，該等活性免疫細胞諸如細胞毒性T細胞或產生針對SARS-CoV-2病毒、另一冠狀病毒或病毒之任何抗原、多肽、蛋白質、核酸或基因體組分之不活化抗體的免疫細胞。在一些實施例中，免疫原性組成物或產品組成物意欲向諸如哺乳動物、小鼠、兔、貓、狗、靈長類動物、猴子或人之動物投與，以在動物體內產生針對SARS-CoV-2病毒或另一冠狀病毒，包括SARS-CoV-2之變體的中和抗體。在一些實施例中，向處於感染SARS-CoV-2 (或其變體)風險下或當前未感染SARS-CoV-2 (或其變體)之個體投與免疫原性組成物或產品組成物。在一些實施例中，免疫原性組成物或產品組合提供針對SARS-CoV-2 (或其變體)感染的持久免疫原性保護。
本文所描述之一些替代方案涉及包含以下、基本上由以下組成或由以下組成之核酸：至少一種SARS-CoV-2核酸組分，較佳與編碼IgE前導序列之核酸(例如編碼胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO:44)之核酸)或與SEQ ID NO:43具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性之IgE前導核酸序列連接；以及此類核酸及/或由其編碼之蛋白質作為藥劑，包括治療或抑制SARS-CoV-2感染之藥劑之用途。在一些實施例中，SARS-CoV-2包括野生型毒株或其變體。
在一些替代方案中，核酸或多肽亦可包含至少一個自催化肽裂解位點。在一些替代方案中，至少一個自催化肽裂解位點為P2A自催化肽裂解位點。在一些替代方案中，至少一種SARS-CoV-2核酸組分或至少一種SARS-CoV-2多肽組分由至少一個自催化肽裂解位點間隔開。
在一些替代方案中，本文所描述之核酸或多肽可編碼或包含CC40.8表位，該表位為在冠狀病毒中刺突蛋白中保守的表位。在一些替代方案中，本文所描述之多肽包含針對表示為SEQ ID NO:91之SARS-CoV-2之CC40.8表位的胺基酸序列或與SEQ ID NO:91具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一些替代方案中，本文所描述之核酸編碼針對表示為SEQ ID NO:91之SARS-CoV-2之CC40.8表位的胺基酸序列或編碼與SEQ ID NO:91具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之胺基酸序列。在一些替代方案中，編碼針對SARS-CoV-2之CC40.8表位的核酸表示為SEQ ID NO:90或為編碼針對SARS-CoV-2之CC40.8表位的表示為與SEQ ID NO:90具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸。
在一些替代方案中，在上文所提及之核酸或多肽中提供了至少一種D型肝炎抗原(HDAg)毒株序列，諸如選自HDAg基因型1A、HDAg基因型1B、HDAg基因型2A或HDAg基因型2B或其任何組合之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種HDAg毒株序列。在一些替代方案中，在其提及之核酸或多肽中提供了四種HDAg毒株序列。在一些替代方案中，四種HDAg毒株序列包含HDAg基因型1A、HDAg基因型1B、HDAg基因型2A及HDAg基因型2B之各一個拷貝。在一些替代方案中，核酸或多肽中存在少於四種HDAg毒株序列。在一些替代方案中，HDAg毒株序列串聯於核酸或多肽中。在一些替代方案中，HDAg毒株序列由自催化肽裂解位點間隔開。在一些替代方案中，HDAg毒株序列為串聯的，不具有接頭、具有至少1個核苷酸或胺基酸之接頭，或在其間無自催化肽裂解位點。在一些替代方案中，SARS-CoV-2或其他冠狀病毒序列位於HDAg毒株序列之上游或下游。在一些替代方案中，SARS-CoV-2或其他冠狀病毒序列與具有自催化肽裂解位點之HDAg毒株序列分離。在一些替代方案中，自催化肽裂解位點為P2A自催化肽裂解位點。在一些替代方案中，構築體SVF-8 (OC-8)及SVF-9 (OC-9)包含HDAg毒株序列、基本上由其組成或由其組成。
在一些替代方案中，至少一種SARS-CoV-2核酸組分包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：S蛋白序列、RBD序列、M蛋白序列、NP蛋白序列、E蛋白序列或HE蛋白序列。在一些替代方案中，發現至少一種SARS-CoV-2核酸組分為野生型序列。一些替代方案涉及核酸及其用途，其中核酸與SEQ ID NO:1-12、77或80中之任一或多者共有或包含至少50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性或與SEQ ID NO:1-12、77或80中之任一或多者的序列一致性之量在由上述百分比中之任兩個界定之範圍內。在一些替代方案中，預期包含在本文所描述之組成物及用途中之至少一種SARS-CoV-2核酸組分為上述野生型序列之人密碼子優化序列。在一些替代方案中，例如，核酸與SEQ ID NO:13-24、39-40、57-63、71、73、75、78、81、84、86、88、92、94、96或98中之任一或多者共有或包含50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性或與SEQ ID NO:13-24、39-40、57-63、71、73、75、78、81、84、86、88、92、94、96或98中之任一或多者的序列一致性之量在由上述百分比中之任兩個界定之範圍內。在一些替代方案中，上文所提及之核酸用於預防、治療或抑制受試者，諸如哺乳動物，較佳人類之SARS-CoV-2感染。因此，一些替代方案包括將與SEQ ID NO:1-24、39-40、57-63、71、73、75、78、81、84、86、88、92、94、96或98中之任一或多者具有至少50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性或與SEQ ID NO:1-24、39-40、57-63、71、73、75、78、81、84、86、88、92、94、96或98中之任一或多者的序列一致性之量在由上述百分比中之任兩個界定之範圍內的核酸用作藥劑，諸如用於預防、治療、改善或抑制受試者，諸如哺乳動物，較佳人類之SARS-CoV-2感染，該受試者可視情況選擇或鑑定以接受用於預防、治療、改善或抑制SARS-CoV-2感染之藥劑。可藉由臨床評價或診斷評價或兩者來選擇或鑑定此類受試者。在一些實施例中，SARS-CoV-2包括野生型毒株或其變體。
本文所提供之一些替代方案涉及包含至少一種SARS-CoV-2多肽組分、基本上由其組成或由其組成之多肽。在一些替代方案中，至少一種SARS-CoV-2多肽組分包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：S蛋白序列、RBD序列、M蛋白序列、NP蛋白序列、E蛋白序列或HE蛋白序列。在一些替代方案中，可提供於本文所描述之組成物或方法中之多肽與SEQ ID NO:25-36、41-42、64-70、72、74、76、79、82、85、87、89、93、95、97或99中之任一或多者共有或包含至少50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性或與SEQ ID NO:25-36、41-42、64-70、72、74、76、79、82、85、87、89、93、95、97或99中之任一或多者的序列一致性之量在由上述百分比中之任兩個界定之範圍內。在一些替代方案中，多肽用作藥劑，諸如用於預防、治療或抑制受試者，諸如哺乳動物，較佳人類之SARS-CoV-2，該受試者可視情況選擇或鑑定以接受用於預防、治療、改善或抑制SARS-CoV-2感染之藥劑。可藉由臨床評價或診斷評價或兩者來選擇或鑑定此類受試者。在一些實施例中，多肽是自上文所提及之野生型或密碼子優化序列轉譯而來。在一些實施例中，多肽為重組表現的。在一些實施例中，多肽在哺乳動物、細菌、酵母、昆蟲或無細胞系統中重組表現。因此，一些替代方案包括將與SEQ ID NO:25-36、41-42、64-70、72、74、76、79、82、85、87、89、93、95、97或99中之任一或多者具有至少50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性或與SEQ ID NO:25-36、41-42、64-70、72、74、76、79、82、85、87、89、93、95、97或99中之任一或多者的序列一致性之量在由上述百分比中之任兩個界定之範圍內的多肽用作藥劑，諸如用於預防、治療、改善或抑制受試者，諸如哺乳動物，較佳人類之SARS-CoV-2感染，該受試者可視情況選擇或鑑定以接受用於預防、治療、改善或抑制SARS-CoV-2感染之藥劑。在一些實施例中，SARS-CoV-2包括野生型毒株或其變體。
在一些替代方案中，免疫原性組成物或產品組成物包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：上文所描述之核酸(例如SEQ ID NO:1-24、39-40、57-63、71、73、75、77-78、80-81、84、86、88、92、94、96或98中之任一或多者，或與其具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列)及上文所描述之多肽(例如SEQ ID NO:25-36、41-42、64-70、72、74、76、79、82、85、87、89、93、95、97或99中之任一或多者，或與其具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列)。在一些替代方案中，將免疫原性組成物或產品組成物以異源初免-加強法向受試者投與。在一些替代方案中，初免劑量包含核酸且加強劑量包含多肽。在一些替代方案中，初免劑量包含上述多肽中之任一或多者且加強劑量包含上述核酸中之任一或多者。在一些替代方案中，將免疫原性組成物或產品組成物以同源初免-加強法向受試者投與。在一些替代方案中，初免劑量包含上述核酸中之任一或多者且加強劑量包含相同的核酸或不同的核酸。在一些替代方案中，初免劑量包含上述多肽中之任一或多者且加強劑量包含相同的多肽或不同的多肽。在一些替代方案中，免疫原性組成物或產品組成物進一步包含佐劑。在一些實施例中，佐劑為Matrix-M、alum及/或QS21。在一些替代方案中，核酸提供為重組載體。在一些替代方案中，重組載體為pVAX1。在一些替代方案中，免疫原性組成物或產品組成物用於預防、治療或抑制受試者，諸如哺乳動物，較佳人類之SARS-CoV-2，該受試者可視情況選擇或鑑定以接受用於預防、治療、改善或抑制SARS-CoV-2感染之藥劑。可藉由臨床評價或診斷評價或兩者來選擇或鑑定此類受試者。在一些實施例中，SARS-CoV-2包括野生型毒株或其變體。
本文所描述之一些替代方案涉及使用上文所描述之免疫原性組成物、產品組成物、核酸或多肽(例如SEQ ID NO:1-36、39-42、57-89或92-99中之任一或多者，或與其具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列)在受試者，較佳人體中產生免疫反應之方法。在一些替代方案中，方法包括異源初免-加強法。在一些替代方案中，向受試者投與至少一劑初免劑量且向受試者投與至少一劑加強劑量。在一些替代方案中，至少一劑初免劑量為核酸。在一些替代方案中，至少一劑加強劑量為多肽。在一些替代方案中，至少一劑加強劑量包含佐劑，諸如Matrix-M、alum及/或QS21。在一些替代方案中，至少一劑加強劑量是在投與該至少一劑初免劑量後至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或數週或在由上述時間點中之任兩者所界定之時間範圍內投與。在一些替代方案中，方法包括同源初免-加強法。在一些替代方案中，方法進一步包括投與抗病毒療法(諸如地塞米松、法匹拉韋(favipiravir)、法維拉韋(favilavir)、瑞德西韋、托珠單抗、加利西韋(galidesivir)、薩瑞魯單抗(sarilumab)、洛匹那韋(lopinavir)、利托那韋(ritonavir)、達蘆那韋(darunavir)、利巴韋林(ribavirin)、干擾素-α、聚乙二醇化干擾素-α、干擾素α-2b、恢復期血清、AT-100或TJM2)或幹細胞療法或其任何組合。
額外替代方案涉及包括本文所描述之組成物中之一或多者的注射裝置，該等組成物諸如SEQ ID NO:1-36、39-42、57-89或92-99中之任一或多者或與其具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列中所示之核酸或多肽中之任一或多者。此類注射裝置可包括單次劑量的此類核酸或多肽，且此類注射裝置可具有經組態以增強核酸或多肽或兩者之遞送的改進的針頭。此類注射裝置可在具有或不具有電穿孔之情況下使用。預期可包括SEQ ID NO:1-36、39-42、57-89或92-99 (或與其具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列)之核酸或多肽中之任一或多者之注射裝置描述於美國專利申請公開案第2016/0235928號；PCT申請公開案第WO2014064534號；美國專利第6,610,044號；第6,132,419號；第6,379,966號；第6,897,068號；第7,015,040號；第7,214,369號；第7,473,419號；及第7,589,059號中，所有該等文獻均特此以全文引用之方式明確併入。
本發明之一些態樣是關於以下編號的替代方案：
1. 一種包含至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列的核酸，其中該至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列包含： i) 一或多種編碼SARS-CoV-2刺突受體結合結構域(RBD)多肽之核酸序列； ii) 編碼SARS-CoV-2核衣殼蛋白(NP)多肽之核酸序列； iii) 編碼SARS-CoV-2膜(M)多肽之核酸序列； iv) 編碼D型肝炎抗原(HDAg)多肽之核酸序列； v) 編碼自催化多肽裂解位點之核酸序列； vi) 編碼IgE前導多肽之核酸序列； vii) 編碼SARS-CoV-2刺突(S)多肽之核酸序列；或 viii) 編碼CC40.8表位之核酸序列； 或其任何組合。
2. 如替代方案1所述之核酸，其中該RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者來源於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)或SARS-CoV-2變體，視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
3. 如替代方案1或2所述之核酸，其中該RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者包含相對於該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
4. 如替代方案1至3中任一項所述之核酸，其中該RBD多肽包含相對於該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
5. 如替代方案1至4中任一項所述之核酸，其中參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之一或多種核酸序列中之每一者包含對應於K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
6. 如替代方案1至5中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之每一者包含對應於K417、N439、L452、T478、E484或N501的一或多個突變，或無此等突變。
7. 如替代方案1至6中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於N439及N501的突變。
8. 如替代方案1至7中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417、E484及N501的突變。
9. 如替代方案1至8中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於L452及T478的突變。
10. 如替代方案1至9中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。
11. 如替代方案1至10中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417、N439、L452、T478、E484或N501的突變。
12. 如替代方案1至11中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417N、N439K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。
13. 如替代方案1至12中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。
14. 如替代方案1至13中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的一或多個突變。
15. 如替代方案1至14中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。
16. 如替代方案1至15中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
17. 如替代方案1至16中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
18. 如替代方案1至15中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
19. 如替代方案1至16中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
20. 如替代方案1至19中任一項所述之核酸，其中該核酸包含編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列。
21. 如替代方案20所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列各自包含對應於K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
22. 如替代方案20或21所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列各自包含對應於K417、N439、L452、T478、E484或N501的一或多個突變，或無此等突變。
23. 如替代方案20至22中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於N439及N501的突變。
24. 如替代方案20至23中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於K417、E484及N501的突變。
25. 如替代方案20至24中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於L452及T478的突變。
26. 如替代方案20至25中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於K417、N439、L452、T478及N501的突變。
27. 如替代方案20至26中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。
28. 如替代方案20至27中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的突變。
29. 如替代方案20至28中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。
30. 如替代方案20至29中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的突變。
31. 如替代方案20至30中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
32. 如替代方案20至31中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的突變。
33. 如替代方案20至32中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
34. 如替代方案20至33中任一項所述之核酸，其中編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列包含1)一種編碼來自該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之該RBD多肽的核酸，2)一種具有對應於N439及N501之突變的核酸，以及3)一種具有對應於K417、E484及N501之突變的核酸。
35. 如替代方案20至33中任一項所述之核酸，其中編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列包含1)一種編碼來自該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之該RBD多肽的核酸，2)一種具有對應於K417、N439、L452、T478及N501之突變的核酸，以及3)一種具有對應於K417、E484及N501之突變的核酸。
36. 如替代方案20至33中任一項所述之核酸，其中編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列包含1)一種具有對SARS應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505之突變的核酸，2)一種具有對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505之突變的核酸，以及3)一種具有對應於K417、L452或T478之突變的核酸。
37. 如替代方案20至33中任一項所述之核酸，其中編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列包含1)一種具有對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505之突變的核酸，2)一種具有對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505之突變的核酸，以及3)一種具有對應於N501之突變的核酸。
38. 如替代方案1至37中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之每一者包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
39. 如替代方案1至38中任一項所述之核酸，其中該核酸包含編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列及編碼NP多肽之該核酸序列。
40. 如替代方案39所述之核酸，其中該核酸進一步包含編碼IgE前導多肽之該核酸序列。
41. 如替代方案40所述之核酸，其中該核酸基本上由以下組成：編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列、編碼該NP多肽之該核酸序列及編碼該IgE前導多肽之該核酸序列。
42. 如替代方案41所述之核酸，其中該核酸編碼與SEQ ID NO:79、87、93或95具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
43. 如替代方案41或42所述之核酸，其中該核酸與SEQ ID NO:77、78、86、92或94共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
44. 如替代方案40所述之核酸，其中該核酸進一步包含編碼該自催化多肽裂解位點之該核酸序列，視情況其中該自催化多肽裂解位點為P2A自催化多肽裂解位點。
45. 如替代方案44所述之核酸，其中該核酸基本上由以下組成：編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列、編碼該NP多肽之該核酸序列、編碼該IgE前導多肽之該核酸序列及編碼該自催化多肽裂解位點之該核酸序列。
46. 如替代方案45所述之核酸，其中該核酸編碼與SEQ ID NO:82或89具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
47. 如替代方案45或46所述之核酸，其中該核酸與SEQ ID NO:80、81或88共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
48. 如替代方案44所述之核酸，其中該核酸進一步包含編碼該M多肽之該核酸序列。
49. 如替代方案48所述之核酸，其中該核酸基本上由以下組成：編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列、編碼該NP多肽之該核酸序列、編碼該IgE前導多肽之該核酸序列、編碼該自催化多肽裂解位點之該核酸序列及編碼該M多肽之該核酸序列。
50. 如替代方案49所述之核酸，其中該核酸編碼與SEQ ID NO:85具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
51. 如替代方案49或50所述之核酸，其中該核酸與SEQ ID NO:84共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
52 .如替代方案40所述之核酸，其中該核酸進一步包含編碼CC40.8表位之核酸序列。
53. 如替代方案52所述之核酸，其中該核酸基本上由以下組成：編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列、編碼該NP多肽之該核酸序列、編碼該IgE前導多肽之該核酸序列及編碼該CC40.8表位之該核酸序列。
54. 如替代方案53所述之核酸，其中該核酸編碼與SEQ ID NO:97或99具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
55. 如替代方案53或54所述之核酸，其中該核酸與SEQ ID NO:96或98共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
56. 一種包含至少一種SARS-CoV-2多肽之多肽，其中該SARS-CoV-2多肽包含： i) 一或多種SARS-CoV-2刺突受體結合結構域(RBD)多肽序列； ii) SARS-CoV-2核衣殼蛋白(NP)多肽序列； iii) SARS-CoV-2膜蛋白(M)多肽序列； iv) D型肝炎抗原(HDAg)多肽序列； v) 自催化裂解位點序列； vi) IgE前導多肽序列；或 vii) SARS-CoV-2刺突(S)多肽序列；或 viii) CC40.8表位； 或其任何組合。
57. 如替代方案56所述之多肽，其中該RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者來源於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)或SARS-CoV-2變體，視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
58. 如替代方案56或57所述之多肽，其中該RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者包含相對於該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
59. 如替代方案56至58中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽中之每一者包含相對於該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
60. 如替代方案56至59中任一項所述之核酸，其中參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之每一者包含K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505處之一或多個突變，或無此等突變。
61. 如替代方案56至60中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之每一者包含K417、N439、L452、T478、E484或N501處之一或多個突變，或無此等突變。
62. 如替代方案56至61中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之N439及N501處之突變。
63. 如替代方案56至62中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之K417、E484及N501處之突變。
64. 如替代方案56至63中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之L452及T478的突變。
65. 如替代方案56至64中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之L452R或T478K的一或多個突變。
66. 如替代方案56至65中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之K417、N439、L452、T478、E484或N501的一或多個突變。
67. 如替代方案56至66中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之K417N、N439K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。
68. 如替代方案56至67中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變。
69. 如替代方案56至68中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的一或多個突變。
70. 如替代方案56至69中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。
71. 如替代方案56至70中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
72. 如替代方案56至71中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
73. 如替代方案56至72中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
74. 如替代方案56至73中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
75. 如替代方案56至74中任一項所述之多肽，其中該多肽包含三種串聯RBD多肽序列。
76. 如替代方案75所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列各自包含K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505處之一或多個突變，或無此等突變。
77. 如替代方案75或76所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列各自包含參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之K417、N439、L452、T478、E484或N501處之一或多個突變，或無此等突變。
78. 如替代方案75至77中任一項所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之N439及N501處之突變。
79. 如替代方案75至78中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含K417、E484及N501處之突變。
80. 如替代方案75至79中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含對應於L452及T478的突變。
81. 如替代方案75至80中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417、N439、L452、T478及N501的突變。
82. 如替代方案75至81中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之每一者包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。
83. 如替代方案75至82中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的突變。
84. 如替代方案75至83中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之每一者包含K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。
85. 如替代方案75至84中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的突變。
86. 如替代方案75至85中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之每一者包含G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
87. 如替代方案75至86中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的突變。
88. 如替代方案75至87中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之每一者包含G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
89. 如替代方案75至88中任一項所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列包含1)一種對應於來自該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之該RBD多肽的RBD多肽，2)一種具有N439及N501處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有K417、E484及N501處之突變的RBD多肽。
90. 如替代方案75至89中任一項所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列包含1)一種對應於來自該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之該RBD多肽的RBD多肽，2)一種具有K417、N439、L452、T478及N501處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有K417、E484及N501處之突變的RBD多肽。
91. 如替代方案75至90中任一項所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列包含1)一種具有G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，2)一種具有G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有K417、L452或T478處之突變的RBD多肽。
92. 如替代方案75至91中任一項所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列包含1)一種具有G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，2)一種具有G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有N501處之突變的RBD多肽。
93. 如替代方案75至92中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之每一者包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525處之一或多個突變，或無此等突變。
94. 如替代方案75至93中任一項所述之多肽，其中該多肽包含該一或多種RBD多肽序列及該NP多肽序列。
95. 如替代方案94所述之多肽，其中該多肽進一步包含該IgE前導多肽序列。
96. 如替代方案95所述之多肽，其中該多肽基本上由以下組成：該一或多種RBD多肽序列、該NP多肽序列及該IgE前導多肽序列。
97. 如替代方案96所述之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:79、87、93或95具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
98. 如替代方案96或97所述之多肽，其中該多肽由與SEQ ID NO:77、78、86、92或94具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸編碼，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
99. 如替代方案95所述之多肽，其中該多肽進一步包含該自催化多肽裂解位點序列，視情況其中該自催化多肽裂解位點序列為P2A自催化多肽裂解位點序列。
100. 如替代方案99所述之多肽，其中該多肽基本上由以下組成：該一或多種RBD多肽序列、該NP多肽序列、該IgE前導多肽序列及該自催化多肽裂解位點序列。
101. 如替代方案100所述之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:82或89具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
102. 如替代方案100或101所述之多肽，其中該多肽由與SEQ ID NO:80、81或88具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸編碼，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
103. 如替代方案99所述之多肽，其中該多肽進一步包含該M多肽序列。
104. 如替代方案103所述之多肽，其中該多肽基本上由以下組成：該一或多種RBD多肽序列、該NP多肽序列、該IgE前導多肽序列、該自催化多肽裂解位點序列及該M多肽序列。
105. 如替代方案104所述之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:85具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
106. 如替代方案104或105所述之多肽，其中該多肽由與SEQ ID NO:84具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸編碼，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
107. 如替代方案95所述之多肽，其中該多肽進一步包含CC40.8表位。
108. 如替代方案107所述之多肽，其中該多肽包含以下、由以下組成基本上由以下組成：該一或多種RBD多肽序列、該NP多肽序列、該IgE前導多肽序列及該CC40.8表位。
109. 如替代方案108所述之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:97或99具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
110. 如替代方案108或109所述之多肽，其中該多肽由與SEQ ID NO:96或98具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸編碼，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
111. 如替代方案56至110中任一項所述之多肽，其中該多肽視情況在哺乳動物、細菌、酵母、昆蟲或無細胞系統中重組表現。
112. 一種包含核酸及多肽之免疫原性組成物或產品組合，其中該核酸為如替代方案1至55中任一項所述之核酸且該多肽為如替代方案56至111中任一項所述之多肽。
113. 如替代方案112所述之免疫原性組成物或產品組合，其進一步包含佐劑，視情況其中該佐劑為Matrix-M、alum及/或QS21。
114. 如替代方案112或113所述之免疫原性組成物或產品組合，其中該核酸以重組載體形式提供。
115. 一種在受試者中產生免疫反應及/或產生中和抗體之方法，其包括以下步驟：向該受試者投與如替代方案1至55中任一項所述之核酸及/或如替代方案56至111中任一項所述之多肽。
116. 一種在受試者中產生免疫反應及/或產生中和抗體之方法，其包括以下步驟：向該受試者投與如替代方案112至114中任一項所述之免疫原性組成物或產品組合。
117. 如替代方案116所述之方法，其中該投與步驟是以初免/加強法進行，該初免/加強法包括以下步驟：a)向該受試者投與至少一劑包含該免疫原性組成物或產品組合之該核酸的初免劑量及b)向該受試者投與至少一劑包含該免疫原性組成物或產品組合之該多肽的加強劑量。
118. 如替代方案117所述之方法，其中該至少一劑加強劑量是在投與該至少一劑初免劑量後至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或數週或在由上述時間點中之任兩者所界定之一時間範圍內，例如在1-48天或1-48週內投與。
119. 如替代方案116至118中任一項所述之方法，其中該投與是藉由腸內、口服、鼻內、腸胃外、皮下、肌內、皮內或靜脈內或其任何組合提供，且視情況與活體內電穿孔一起提供。
120. 如替代方案116至119中任一項所述之方法，其中該投與是與一抗病毒療法聯合進行，視情況其中該抗病毒療法包括投與地塞米松、法匹拉韋、法維拉韋、瑞德西韋、托珠單抗、加利西韋、薩瑞魯單抗、洛匹那韋、利托那韋、達蘆那韋、利巴韋林、干擾素-α、聚乙二醇化干擾素-α、干擾素α-2b、恢復期血清或其任何組合。
在下文實施方式中，參考了形成其一部分之附圖。在圖式中，相似的符號通常標識相似的組件，除非上下文另外說明。實施方式、附圖及申請專利範圍中所描述之說明性實施例並不意謂限制。在不背離本文提出之主題之精神或範圍的情況下，可使用其他實施例，且可做出其他改變。容易理解的是，如本文一般描述且圖中所示的本揭示案之態樣可以各種不同的組態來佈置、替換、組合、分離及設計，所有佈置、替換、組合、分離及設計均明確涵蓋在本文中。 定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有如熟習此項技術者通常所理解之相同含義。除非另外說明，否則本文所參考之所有專利、申請案、公佈的申請案及其他公開案均以全文引用之方式明確併入。除非另外說明，否則若本文中之術語存在複數個定義，則以本部分之定義為準。
冠詞「一(a/an)」在本文中用於指一個(種)或超過一個(種) (例如至少一個(種))之該冠詞之語法對象。舉例而言，「一要素」意謂一個要素或一個以上的要素。
如本文所用，術語「約」或「大約」是指數量、位凖、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度變化多達參考數量、位凖、值、數目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長度之30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。
在本說明書全文中，除非上下文另外需要，否則字詞「包含(comprise)」、「包含(comprises)」及「包含(comprising)」將理解為暗示包括所述步驟或要素或步驟或要素之群組，而不排除任何其他步驟或要素或步驟或要素之群組。
「由……組成」意謂包括且限於片語「由……組成」後接之內容。因此，片語「由……組成」指示所列要素為必需或必備的，且不可存在其他要素。「基本上由……組成」意謂包括該片語之後所列之任何要素，且限於不干擾或貢獻於本揭示內容中對所列要素所規定之活性或作用之其他要素。因此，片語「基本上由……組成」指示所列要素為必需或必備的，但其他要素為可選的且可存在或可不存在，此視該等其他要素是否實質上影響所列要素之活性或作用而定。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本揭示案所屬之技術者通常所理解相同的含義。除非另外說明，否則若本文中之術語存在複數個定義，則以本部分之定義為準。除非具體相反地指示，否則本揭示案之實踐將此項技術內之分子生物學之習知方法及重組DNA技術，其中許多在以下出於說明之目的來描述。
如本文所用，術語「個體」、「受試者」或「患者」意謂人類或非人類哺乳動物，例如狗、貓、小鼠、大鼠、牛、綿羊、豬、山羊、非人類靈長類動物或鳥類，例如雞，以及任何其他脊椎動物或無脊椎動物。
術語「哺乳動物」是以其通常的生物學意義使用。因此，哺乳動物具體包括但不限於靈長類動物，包括猿猴(黑猩猩、猿、猴)及人類、牛、馬、綿羊、山羊、豬、兔、狗、貓、囓齒動物、大鼠、小鼠、豚鼠或類似哺乳動物。
本文所描述之一些實施例係關於醫藥組成物，其包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：有效量之本文所描述之寡核苷酸、蛋白質或兩者及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或其組合。本文所描述之醫藥組成物適用於人類及/或獸醫應用。
術語「功能」及「功能性」是指生物功能、酶促功能或治療功能。
如本文所用，術語「經分離」是指實質上或基本上不含在呈材料之天然狀態時通常伴隨該材料的組分。舉例而言，如本文所用，「經分離細胞」包括已自環境或處於其天然存在狀態之生物中純化之細胞、已自受試者或培養物中取出之細胞，例如該細胞與活體內或活體外物質不顯著相關。
術語「有效量」或「有效劑量」用於表示引發所示生物或藥物反應之活性化合物或藥劑之量。舉例而言，化合物之有效量可為減輕或改善疾病症狀或延長接受治療之受試者的存活所需的量。該反應可發生在組織、系統、動物或人體中，且包括減輕正在治療之疾病之體徵或症狀。鑒於本文所提供之揭示內容，有效量之決定在熟習此項技術者之能力範圍內。以劑量形式所需之本文所揭露之化合物之有效量將視投與途徑、所治療之動物(包括人)之類型以及所考慮之特定動物之身體特徵而定。可調整劑量以實現所需效果，但將視諸如體重、飲食、並行用藥之因素及熟習醫學領域技術者將認識到之其他因素而定。
術語「醫藥學上可接受之鹽」包括組成物之相對無毒的無機及有機酸或鹼加成鹽，包括但不限於鎮痛劑、治療劑、其他物質及其類似物。醫藥學上可接受之鹽的實例包括衍生自礦物酸，諸如鹽酸、硫酸之彼等鹽，以及衍生自有機酸，諸如乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸之彼等鹽，及類似鹽。用於形成鹽之適合的無機鹼之實例包括氨、鈉、鋰、鉀、鈣、鎂、鋁、鋅及其類似物之磷酸鹽、氫氧化物、碳酸鹽及碳酸氫鹽。鹽亦可用適合的有機鹼形成，包括彼等無毒且強度足以形成此類鹽之有機鹼。舉例而言，此類有機鹼之類別可包括但不限於單烷基胺、二烷基胺及三烷基胺，包括甲胺、二甲胺及三乙胺；單羥烷基胺、二羥烷基胺或三羥烷基胺，包括單乙醇胺、二乙醇胺及三乙醇胺；胺基酸，包括甘胺酸、精胺酸及離胺酸；胍；N-甲基葡萄糖胺；N-甲基葡糖胺；L-麩醯胺酸；N-甲基哌嗪；嗎啉；乙二胺；N-芐基苯乙胺；或三羥甲基乙胺。
如本文可互換使用之「調配物」、「醫藥組成物」及「組成物」是指用於向受試者投與之物質組成物之等同術語。
術語「醫藥學上可接受的」意謂與受試者，特定言之人之療法相容。
術語「劑」是指具有生物學活性且可用於療法中之活性劑。此外，「劑」可與「至少一種劑」、「化合物」或「至少一種化合物」同義，且可指任何形式之劑，諸如其衍生物、類似物、鹽或前藥。該劑可以各種形式、分子複合物之組分及醫藥學上可接受之鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、硼酸鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽及水楊酸鹽)存在。術語「劑」亦可指任何醫藥分子或化合物、治療分子或化合物、基質形成分子或化合物、聚合物、合成分子及化合物、天然分子及化合物，以及其任何組合。
適當調配物視所選投與途徑而定。本文所描述之化合物之調配及投與技術為熟習此項技術者已知的。此項技術中存在多種投與化合物之技術，包括但不限於腸內、口服、直腸、局部、舌下、經頰、耳內、硬膜外、表皮、氣霧、腸胃外、肌內、皮下、動脈內、靜脈內、門靜脈內、關節內、皮內、腹膜、髓內註射、鞘內、直接心室內、腹膜內、鼻內或眼內註射。醫藥組成物通常根據特定的預期投與途徑來進行調整。本文所描述之醫藥組成物亦可與其他療法，諸如T細胞、自然殺傷細胞、B細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、幹細胞、骨髓細胞或造血幹細胞一起向受試者投與。
醫藥化合物亦可通常以貯存或緩釋調配物形式局部而非全身方式投與，例如經由將化合物直接注射至器官、組織或感染區域中。此外，可在靶向藥物遞送系統中投與化合物，例如在塗有組織特異性抗體之脂質體中。脂質體可靶向器官、組織、癌症、腫瘤或感染區域且由其選擇性地吸收。
本文所揭露之醫藥組成物可以本身已知之方式製造，例如藉助於習知混合、溶解、粒化、糖衣錠製備、磨細、乳化、囊封、覆埋或製錠製程。如本文所描述的，用於醫藥組成物中之化合物可以具有醫藥學上相容的相對離子之鹽形式提供。
如本文所用，「載劑」是指促進化合物通過、遞送及/或併入細胞、組織及/或身體器官之化合物、顆粒、固體、半固體、液體或稀釋劑。舉例而言，非限制地，脂質奈米顆粒(LNP)為可嚢封寡核苷酸，從而保護寡核苷酸在通過血流期間免於降解及/或促進遞送至所需器官(諸如肝臟)之載劑類型。
如本文所用，「稀釋劑」是指醫藥組成物中缺乏藥理學活性但可為醫藥學上必需或所要的成分。舉例而言，稀釋劑可用於增加質量太小而無法製造及/或投與之強效藥物之體積。稀釋劑亦可為用於溶解藥物以藉由注射、攝入或吸入投與之液體。此項技術中之稀釋劑之常見形式為緩衝水溶液，諸如但不限於模擬人血液之滲透壓及/或組成的磷酸鹽緩衝鹽水。
術語「賦形劑」具有根據本說明書所理解之普通含義且是指添加至醫藥組成物中以向組成物提供但不限於體積、稠度、穩定性、結合能力、潤滑性、崩解能力等之惰性物質、化合物或材料。可併入本文所闡述之調配物中之任一或多者中的具有所需性質之賦形劑包括但不限於防腐劑、佐劑、穩定劑、溶劑、緩衝劑、稀釋劑、增溶劑、清潔劑、界面活性劑、螯合劑、抗氧化劑、醇、酮、醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸、鹽、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、硫酸鎂糖、右旋糖、葡聚醣、果糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、山梨糖醇、纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(羥丙甲纖維素)、甘油、聚乙烯醇、聚維酮、丙二醇、血清、胺基酸、聚乙二醇、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉、硬脂酸鎂、辛基酚乙氧基化物、芐索氯銨、硫柳汞、明膠、酯、醚、2-苯氧乙醇、脲或維生素，或其任何組合。賦形劑之量在醫藥組成物中之百分比可為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100% w/w或為由上述數字中之任兩者界定之範圍內的任何重量百分比。
如本文所用，術語「佐劑」是指刺激免疫反應且增加保護性免疫效力並且與免疫原性抗原、表位或組成物一起投與之物質、化合物或材料。佐劑藉由使得持續釋放抗原、上調細胞因子及趨化因子、在投與部位募集細胞、增加抗原呈遞細胞中之抗原攝取及呈遞或激活抗原呈遞細胞及炎性體來改進免疫反應。可包含於本文所闡述之調配物中之任一或多者中的常用佐劑包括但不限於alum、鋁鹽、硫酸鋁、氫氧化鋁、磷酸鋁、羥磷灰石、硫酸鋁鉀、油、礦物油、石蠟油、水包油乳液、清潔劑、Matrix-M、MF59®、角鯊烯、AS03、α-生育酚、聚山梨醇酯80、AS04、單磷醯脂質A、病毒體、核酸、聚肌苷:聚胞苷酸、皂苷、QS-21、蛋白質、鞭毛蛋白、細胞因子、趨化因子、IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、咪唑喹啉、CpG寡核苷酸、脂質、磷脂、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、雙分枝菌酸海藻糖酯、肽聚醣、細菌提取物、脂多醣或弗氏佐劑(Freund’s Adjuvant)，或其任何組合。
如本文所用，術語任何給定物質、化合物或材料之「純度」是指物質、化合物或材料相對於預期豐度之實際豐度。舉例而言，物質、化合物或材料之純度可為至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，包括其間之所有小數。純度可能受非所要雜質影響，該等雜質包括但不限於副產物、異構物、鏡像異構物、降解產物、溶劑、載劑、媒劑或污染物，或其任何組合。純度可為量測技術，包括但不限於層析法、液相層析法、氣相層析法、光譜法、UV-可見光譜法、紅外光譜法、質譜法、核磁共振法、重量法或滴定法，或其任何組合。
本文所揭露之一些實施例係關於選擇有需要之受試者或患者。在一些實施例中，選擇需要治療、抑制或改善病毒感染(諸如SARS-CoV-2)或對病毒感染(諸如SARS-CoV-2)具有免疫原性之患者。在一些實施例中，患者選擇為經鑑別具有SARS-CoV-2感染之患者或需要治療病毒感染(諸如SARS-CoV-2)之患者。在一些實施例中，選擇先前已接受過病毒感染(諸如SARS-CoV-2)治療之患者。在一些實施例中，選擇先前因處於病毒感染(諸如SARS-CoV-2)風險下而接受過治療之患者。在一些實施例中，選擇出現病毒感染(諸如SARS-CoV-2)復發之患者。在一些實施例中，選擇對病毒感染(諸如SARS-CoV-2)療法產生耐藥性之患者。在一些實施例中，選擇可能具有上述選擇標準之任意組合之患者。此類選擇可藉由受試者之臨床及診斷評價或兩者之組合來進行。在一些實施例中，病毒感染為慢性病毒感染。在一些實施例中，受試者或患者為「長途」患者，或展示出與SARS-CoV-2感染相關之症狀或後遺症，但未出現明顯量或無可偵測到之循環病毒。在一些實施例中，SARS-CoV-2包括野生型毒株或其變體。
如本文所用，術語「治療(treat/treating/treatment)」、「治療(therapeutic)」或「療法(therapy)」具有根據本說明書所理解之其普通含義，且未必意謂疾病或病狀完全治癒或消除。如本文所用(以及如此項技術中熟知的)，術語「治療(treating/treatment)」亦意謂用於在受試者之病狀中獲得有益或所需結果，包括臨床結果之方法。有益或所需臨床結果可包括但不限於減輕或改善一或多種症狀或病狀、減輕疾病程度、穩定(亦即不惡化)疾病狀態、預防疾病傳播或擴散、延遲或減緩疾病進展、改善或減輕疾病狀態、減少疾病複發及緩解，不管部分的抑或全部的，且不管可偵測到抑或不可偵測到。如本文所用，「治療(treating/treatment)」在一些但並非所有情況下可包括預防性治療。治療方法包括向受試者投與治療有效量之活性劑。投與步驟可由單次投與組成或可包括一系列投與。將組成物以足以治療患者之量及持續時間向受試者投與。治療期之長度取決於多種因素，諸如病狀之嚴重程度、患者之年齡及遺傳特徵、活性劑之濃度、治療中所用之組成物之活性或其組合。亦應瞭解，用於治療或預防之劑的有效劑量可在特定治療或預防方案過程中增加或減少。劑量之變化可藉由此項技術中已知的標準診斷測定來產生且變得顯而易見。在一些情況下，可能需要長期投與。術語「預防性治療」是指治療尚未展現出疾病或病狀之症狀但易患特定疾病或病狀或以其他方式處於患特定疾病或病狀風險下之受試者，由此該治療降低了患者產生疾病或病狀之可能性。術語「治療性治療」是指對已患有或產生疾病或病狀之受試者進行治療。
如本文所用，術語「抑制」具有根據本說明書所理解之其普通含義，且可指減少病毒感染，諸如SARS-CoV-2。減少可為減少了10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%，或在由上述值中之任兩者界定之範圍內的量。如本文所用，術語「延遲」具有根據本說明書所理解之其普通含義，且是指將諸如病毒感染之事件減慢、推遲或延期至比另外預期時間更晚的時間。延遲可為0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的延遲，或由上述值中之任兩者界定之範圍內的量。術語抑制及延遲未必表示100%抑制或延遲。可實現部分抑制或延遲。
如本文所用，術語「免疫原性組成物」是指物質或物質混合物，包括但不限於抗原、表位、核酸、肽、多肽、蛋白質、多醣、脂質、半抗原、類毒素、不活化生物或減毒生物，或其任何組合，旨在當投與宿主時引發免疫反應。免疫反應包括先天性及適應性免疫反應，後者藉由諸如記憶T細胞及記憶B細胞之細胞建立持久的免疫記憶。在對免疫原性組成物之初始免疫反應期間產生之抗體可在相同抗原、表位、核酸、肽、多肽、蛋白質、多醣、脂質、半抗原、類毒素、不活化生物或減毒生物，或展示抗原、表位、核酸、肽、多肽、蛋白質、多醣、脂質、半抗原或類毒素或其任何組合之活生物或病原體之後續攻擊中產生。以此方式，免疫原性組成物可用作針對特定病原體之疫苗。免疫原性組成物亦可包含一或多種佐劑以刺激免疫反應且增加保護性免疫之功效。
如本文所用，術語「產品組合」是指可一起用於統一功能之兩種或更多種個別化合物、物質、材料或組成物之集合。在一些實施例中，產品組合包含至少一種核酸組成物及至少一種多肽組成物，當投與宿主時至少一種核酸組成物及至少一種多肽組成物一起使用以引發免疫反應，視情況比僅投與一種組成物類型所引發之免疫反應更大。
如本文所用，術語「核酸」或「核酸分子」是指多核苷酸，諸如去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)產生之片段，以及由接合反應、斷裂、核酸內切酶作用及核酸外切酶作用中之任一者產生之片段。核酸分子可由天然存在之核苷酸(諸如DNA及RNA)或天然存在之核苷酸之類似物(例如天然存在之核苷酸的鏡像異構物形式)或兩者之組合的單體組成。修飾的核苷酸可在糖部分及/或嘧啶或嘌呤鹼基部分中具有改變。糖修飾包括例如用鹵素、烷基、胺及疊氮基團置換一或多個羥基，或糖可官能化為醚或酯。此外，整個糖部分可用空間及電子相似的結構，諸如氮雜-糖及碳環糖類似物置換。鹼基部分中修飾之實例包括烷基化嘌呤及嘧啶、醯化嘌呤或嘧啶，或其他眾所周知的雜環取代物。核酸單體可藉由磷酸二酯鍵或此類鍵聯之類似物連接。磷酸二酯鍵聯之類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒酸磷酸酯、二硒酸磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯或胺基磷酸酯。術語「核酸分子」亦包括所謂「肽核酸」，其包含與聚醯胺骨架附接之天然存在的或修飾的核酸鹼基。核酸可為單鏈的或雙鏈的。「寡核苷酸」可與核酸互換使用且可指雙鏈或單鏈DNA或RNA。一或多種核酸可含於可用於在各種生物系統中擴增及/或表現一或多種核酸之核酸載體或核酸構築體(例如質體、病毒、噬菌體、黏接質體、F型黏接質體、噬質體、細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)、酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)或人類人工染色體(human artificial chromosome，HAC))中。通常，載體或構築體亦含有以下要素：包括但不限於啟動子、增強子、終止子、誘導子、核醣體結合位點、轉譯起始位點、起始密碼子、終止密碼子、多腺苷酸化信號、複製起點、選殖位點、多重選殖位點、限制酶位點、表位、報導基因、選擇標記、抗生素選擇標記、靶向序列、肽純化標籤或輔助基因，或其任何組合。
核酸或核酸分子可包含一或多種編碼不同肽、多肽或蛋白質之序列。此等一或多種序列可相鄰地連接在相同的核酸或核酸分子中，或在其間具有額外核酸，例如接頭、重複序列或限制酶位點，或長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300個鹼基，或在由上述長度中之任兩者界定之範圍內的任何長度的任何其他序列。如本文所用，術語核酸「下游」是指在前一序列之3'端之後的序列，若核酸為雙鏈的，則在含有編碼序列之鏈(有義鏈)上。如本文所用，術語核酸「上游」是指在後一序列之5'端之前的序列，若核酸為雙鏈的，則在含有編碼序列之鏈(有義鏈)上。如本文所用，術語在核酸上「分組」是指兩種或更多種序列直接鄰近地出現或在其間具有額外核酸，例如接頭、重複序列或限制酶位點，或長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300個鹼基，或在由上述長度中之任兩者界定之範圍內的任何長度的任何其他序列，但通常其間不具有編碼功能性或催化性多肽、蛋白質或蛋白質結構域之序列。
如本文所用，關於核酸之術語「密碼子優化」是指在不改變多肽序列之情況下基於物種特異性密碼子使用偏差及靶細胞細胞質中各胺醯-tRNA之相對可用性替換核酸之密碼子以增強或最大化在特定物種宿主中之轉譯。密碼子優化及進行此種優化之技術為此項技術中已知的。含有密碼子優化演算法之程序為熟習此項技術者已知的。程序可包括例如OptimumGene、GeneGPS®演算法等。另外，合成密碼子優化序列可自例如Integrated DNA Technologies及其他可商購的DNA定序服務商購得。熟習此項技術者將理解基因表現水平取決於許多因素，諸如啟動子序列及調節元件。正如大多數細菌所指出的，由tRNA物種識別密碼子之較小子集，導致轉譯選擇，此可能是蛋白質表現之重要限制。在此態樣中，可設計許多合成基因以提高其蛋白質表現水平。
本文所描述之核酸包含核鹼基。主要典型的天然或未修飾的鹼基為腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶。其他核鹼基包括但不限於嘌呤、嘧啶、修飾的核鹼基、5-甲基胞嘧啶、假尿苷、二氫尿苷、肌苷、7-甲基鳥苷、次黃嘌呤、黃嘌呤、5,6-二氫尿嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、異鳥嘌呤、異胞嘧啶、胺基烯丙基鹼基、染料標記之鹼基、螢光鹼基或生物素標記之鹼基。
如本文所用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」是指包含由肽鍵連接之胺基酸的巨分子。肽、多肽及蛋白質之眾多功能為此項技術中已知的，且包括但不限於酶、結構、轉運、防禦、激素或信號傳導。肽、多肽及蛋白質通常但不總是由使用核酸模板之核醣體複合物生物學產生，儘管化學合成亦為可用的。藉由操控核酸模板，可進行肽、多肽及蛋白質突變，諸如超過一種肽、多肽或蛋白質之取代、缺失、截短、添加、複製或融合。超過一種肽、多肽或蛋白質之此等融合可相鄰地連接在相同分子中，或在其間具有額外胺基酸，例如接頭、重複序列、表位或標籤，或長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200或300個鹼基，或在由上述長度中之任兩者界定之範圍內的任何長度的任何其他序列。如本文所用，術語多肽之「下游」是指在前一序列之C末端之後的序列。如本文所用，術語多肽之「上游」是指在後一序列之N末端之前的序列。
在一些實施例中，本文所呈現的且在實例中所用之核酸或肽序列在包括但不限於人類、小鼠、兔、大腸桿菌( E. coli)、酵母及哺乳動物細胞之各種生物系統中具有功能性。在其他實施例中，與本文所呈現的且在實例中所用之核酸或肽序列共有至少或低於0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相似性，或在由上述百分比中之任兩者界定之範圍內的任何百分比相似性之核酸或肽序列亦可在不影響生物系統中序列功能之情況下使用。如本文所用，術語「相似性」是指核酸或肽序列分別具有與模板核酸或肽序列相同的核苷酸或胺基酸總體順序，具有特定變化，諸如序列內之取代、缺失、重複或插入。在一些實施例中，共享低至0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似性之兩個核酸序列可藉由包含在轉譯期間編碼相同胺基酸之不同密碼子而編碼相同的多肽。
如本文所用，術語「重組表現」是指在優化或適應的生物系統中產生蛋白質。此等系統提供優於天然宿主中蛋白質表現之優勢，包括但不限於高表現(過表現)、易於純化、易於轉化、可誘導性、低成本或蛋白質之穩定性。在一些實施例中，蛋白質在哺乳動物、細菌、酵母、昆蟲或無細胞重組表現系統中表現。各系統均具有其自身優點或缺點。舉例而言，細菌表現系統對於過表現進行了高度優化，但可能導致產生的蛋白質錯誤折疊或聚集，酵母系統在需要轉譯後修飾時為有用的，昆蟲及哺乳動物系統適用於在高等生物中出現的正確RNA剪接。在一些實施例中，自哺乳動物、人、原代、永生化、癌症、幹細胞、纖維母細胞、人胚胎腎(human embryonic kidney，HEK) 293、中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)、細菌、大腸桿菌、酵母、釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母( Pichia pastoris)、昆蟲、草地夜蛾( Spodoptera frugiperda) Sf9或草地夜蛾 Sf21細胞，或在無細胞系統中產生且純化重組多肽。在一些實施例中，表現基因、載體或構築體以質體、噬菌體、病毒、腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)、桿狀病毒、黏接質體、F型黏接質體、噬質體、BAC、YAC或HAC之形式遞送至重組表現系統。關於重組表現系統之更多論述參見Gomes等人，「An Overview of Heterologous Expression Host Systems for the Production of Recombinant Proteins」 ((2016) Adv. Anim. Vet. Sci. 4(7):346-356)，該文獻特此以全文引用之方式明確併入。
如本文所用，術語「冠狀病毒」是指感染哺乳動物及鳥類之包膜的正義單鏈RNA病毒家族。在人類中，冠狀病毒感染可引起如普通感冒之輕微症狀，或更嚴重的呼吸病狀，諸如嚴重急性呼吸道症候群(severe acute respiratory syndrome，SARS)、急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、咳嗽、充血、喉嚨痛、呼吸急促、肺炎、支氣管炎及缺氧症。其他症狀包括但不限於發燒、疲勞、肌痛及胃腸症狀，諸如嘔吐、腹瀉及腹痛。病毒包膜包含刺突(「S」)、包膜(「E」)、膜(「M」)及血球凝集素酯酶(「HE」)跨膜結構蛋白。S蛋白包含受體結合結構域(「RBD」)，即決定病毒株之宿主受體特異性的高免疫原性區域。病毒核衣殼包含塗覆RNA基因體之多種核衣殼(「N」或「NP」)蛋白。在感染期間，S蛋白附接至宿主細胞受體，且經由胞吞作用或包膜融合開始進入宿主細胞。RNA基因體由宿主核醣體轉譯以產生新的結構蛋白及RNA依賴性RNA聚合酶，從而復製病毒基因體。病毒顆粒在宿主內質網中組裝，且藉由高爾基體介導之胞吐作用脫落。有關冠狀病毒之結構及感染週期之更多資訊可見於Fehr AR及Perlman S. 「Coronaviruses:An Overview of Their Replication and Pathogenesis」 Methods Mol. Biol.(2015); 1282:1-23中，該文獻特此以全文引用之方式明確併入。
如本文所用，術語「SARS-CoV-2」及「2019-nCoV」是指導致人類冠狀病毒病2019 (COVID-19)大流行之一或多種冠狀病毒株。傳染性、長潛伏期及現代全球化導致病毒在全球範圍內傳播。SARS及其他呼吸問題在感染個體中之發展對醫療基礎設施造成了巨大壓力。用於人類SARS-CoV-2及其他冠狀病毒之治療及疫苗已開始獲得批准，但仍需要進行額外測試。原始野生型(Wuhan-Hu-1)毒株之參考序列可藉由以下NCBI GenBank登錄號獲得：MN908947.3 (例如完整基因體)、YP_009724390 (例如表面醣蛋白)、YP_009724393.1 (例如膜醣蛋白)及YP_009724397.2 (例如核衣殼磷蛋白)。與原始SARS病毒(SARS-CoV-1)一樣，SARS-CoV-2藉由通過S蛋白之RBD與血管張力素轉換酶2 (ACE2)結合來感染人體細胞。RBD、M蛋白及NP蛋白為開發針對SARS-CoV-2及其他冠狀病毒之治療、預防、干預、疫苗或免疫原性組成物的良好候選物。SARS-CoV-2 RBD序列之一實施例提供為SEQ ID NO:100。如本文所揭露的，在本文所提供之實施例中所用的RBD序列可具有一或多個突變，其中突變可為在SARS-CoV-2相對於原始SARS-CoV-2 (Wuhan-Hu-1)之變體中發現的彼等突變。此外，在一些實施例中，在本文所提供之實施例中所用的RBD序列可在序列中之半胱胺酸處具有一或多個突變，例如出於重組或離體表現RBD序列之目的，因為半胱胺酸之存在可能干擾蛋白質折疊或功能。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，在本文所提供之實施例中所用的RBD序列包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525處之一或多個突變，或無此等突變。本文所揭露之實施例可應用於其他冠狀病毒，包括但不限於HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV-1、HCoV NL63、HCoV-HKU1及MERS-CoV，或SARS-CoV-2之變體。
在COVID-19大流行期間，發現了新出現的基因變異。此等變體可能展現出不同的宿主特異性或增加的傳播性、傳染性及/或毒力。此外，存在對於此等變體或新變體可能降低當前批准之疫苗的功效的擔心。擔心的主要基因突變涉及病毒用於宿主受體結合之S蛋白(及相應的RBD)；由於當前疫苗針對野生型(Wuhan-hu-1) S蛋白之免疫原性，該等S蛋白可能導致對此等突變毒株之效力降低。
三個突出的所擔心變體(VOC)為α變體(B.1.1.7、20B/501Y.V1、VOC 20212/01，首先在英國發現)、β變體(B.1.351、20C/501Y.V2，首先在南非發現)，γ變體(P.1，20J/501Y.V3，起源於巴西且首先在日本發現)。已發現此等變體在世界範圍內展現出快速且廣泛的傳播。此等三種毒株中之一個常見突變為N501Y，其為與人類ACE2相互作用且已證明可增加對ACE2之親和力的RBD的六個接觸殘基中之一者(Starr等人，「Deep Mutational Scanning of SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain Reveals Constraints on Folding and ACE2 Binding」 Cell; (2020) 182(5);1295-1310，特此以全文引用之方式明確併入)。β變體亦包含突變K417N及E484K。γ變體具有17個獨特的胺基酸變化及三個缺失，包括刺突蛋白受體結合結構域中之K417T、E484K及N501Y突變。其他變體包含N439K突變。懷疑此等突變會干擾抗體識別。
δ變體(B.1.617.2)為最易傳播的VOC之一，且據信其為COVID-19大流行期間的主要變體。δ變體不同於其他VOC (α、β及γ變體)，因為其不包含RBD內之N501Y突變。相反，在基因體之其他區域中之其他突變中，δ變體包含RBD中之L452R及T478K突變。除了此變體之增強的傳播性(可能歸因於此等突變)之外，此加劇了吾人對當前可用疫苗功效之重大擔憂。由於δ變體在世界上仍普遍存在，且有可能出現新的突變體，甚至可能鑑定出更具潛在有毒力毒株。相關的δ加變體(具有K417N之δ)亦很普遍，且展現出在β及其他變體中所見之K417N突變。
ο變體(B.1.1.529)在COVID-19大流行期間後期發展成為主要的VOC。此變體包含比先前VOC顯著更多的突變(總共60個突變)，其中刺突蛋白中具有30個突變。因此，當前疫苗在預防ο變體感染方面之效力方面存在一些擔憂。ο變體包括BA.1及BA.2子譜系。在BA.1子譜系中發現的在本文所揭露之實施例中探索的突變包括G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y及Y505H。在BA.2子譜系中發現的在本文所揭露之實施例中探索的突變包括G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y、Y505H。然而，在ο變體中發現之其他突變以及突變之任何其他組合設想用於本文中。
除了此等VOC之外，其他毒株已決定為目標變體(Variant of Interest，VOI)或在監測下之變體，該等變體可能構成重大威脅，但與VOC相比，其傳播率可能並不高。例示性VOI包括θ、ι、κ、λ及μ變體。其他目標變體包括B.1.427、B.1.429、R.1、B.1.466.2、B.1.1.318、B.1.1.519、C.36.3、B.1.214.2、B.1.1.523、B.1.619、B.1.620、C.1.2、B.1.617.1、B.1.526及B.1.525。
當前VOC及VOI之列表及其序列資訊可自國際監管機構，諸如疾病控制中心及世界衛生組織獲得。一個此類實例可在全球資訊網who.int/en/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants/上獲得。除了本文所揭露之突變之外，設想本文所提供之實施例可包括與此等變體相關之呈任何構形之任一或多個突變，以便提高針對野生型SARS-CoV-2及SARS-CoV-2變體之功效。
如本文所揭露的，在一些實施例中，用作免疫原性組成物之核酸及多肽可編碼或包含本文所揭露之突變，或S蛋白或相應RBD內之其他突變，諸如在其他SARS-CoV-2變體中鑑定之彼等突變。將此等免疫原併入本文所描述之調配物及方法中將在接種患者中產生增加的抗體及T細胞反應多樣性，其將提供針對SARS-CoV-2及SARS-CoV-2變體之強大保護。
在一些實施例中，本文所用之RBD序列為串聯重複單鏈二聚體變體。RBD二聚體已表明可提高免疫原性且增加中和抗體效價。二硫鍵連接之二聚體及單鏈(共價連接)二聚體在此態樣中均為有效的。在一些實施例中，RBD串聯重複單鏈二聚體為藉由融合具有或不具有額外接頭或其他胺基酸之兩個冠狀病毒RBD序列構築的。RBD串聯重複單鏈二聚體多肽之非限制性實例體現在SEQ ID NO:46中。編碼RBD串聯重複單鏈二聚體多肽之核酸序列之非限制性實例體現在SEQ ID NO:45中。在一些實施例中，RBD串聯重複單鏈二聚體可包含本文所揭露之突變及/或與一或多種SARS-CoV-2變體(例如α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ、ο (包括BA.1或BA.2子譜系)或其他已知變體)相關之額外突變中之任一或多者。舉例而言，RBD串聯重複單鏈二聚體可包含與SARS-CoV-2變體相關之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處之突變，或無此等突變(應理解，此等突變均參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)所示)。在一些實施例中，RBD串聯重複單鏈二聚體可包含與SARS-CoV-2變體相關之K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變或其任何組合，或無此等突變(應理解，此等突變均參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)所示)。在一些實施例中，RBD串聯重複單鏈二聚體可在序列中之一或多個半胱胺酸處包含突變(例如C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525)，例如，以增強RBD串聯重複單鏈二聚體之表現(應理解，此等突變均參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)所示)。貫穿本揭示案，RBD串聯重複單鏈二聚體亦可稱為RBD版本2 (RBDv2)。關於RBD串聯重複單鏈二聚體之額外見解可見於Dai等人「A Universal Design of Betacoronavirus Vaccines against COVID-19, MERS, and SARS」 Cell.(2020);182(3):722-733中，該文獻特此以全文引用之方式明確併入。
在一些實施例中，RBD序列組裝成多聚變體，諸如具有一或多個RBD序列之3、4、5、6、7、8、9或10個拷貝之變體。在一些實施例中，RBD序列組裝成三聚變體。具有三聚RBD變體之構築體之實例為OC-2.4。在一些實施例中，呈三聚變體之RBD序列中之每一者可包含本文所揭露之突變及/或與一或多種SARS-CoV-2變體(例如α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ、ο (包括BA.1或BA.2子譜系)或其他已知變體)相關之額外突變中之任一或多者。在一些實施例中，呈多聚變體之一或多個RBD序列可包含與SARS-CoV-2變體相關之K417N、N439K、L452R、T478K、E484K、N501Y、G339D、S371L、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、N440K、G446S、S447N、Q493R、G496S、Q498R或Y505H突變或其任何組合，或無此等突變(應理解，此等突變均參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)所示)。在一些實施例中，呈多聚變體之一或多個RBD序列可包含與SARS-CoV-2變體相關之K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變或其任何組合，或無此等突變(應理解，此等突變均參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)所示)。在一些實施例中，呈多聚變體之一或多個RBD序列可在序列中之一或多個半胱胺酸處包含突變(例如C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525)，例如，以增強RBD串聯重複單鏈二聚體之表現(應理解，此等突變均參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)所示)。
如本文所用，術語「自催化肽裂解位點」或「2A肽」是指在兩種組成胺基酸之間經歷肽鍵裂解，導致序列側接之兩種蛋白質分離的肽序列。據信裂解為核醣體「跳過」2A肽序列中之C末端脯胺酸與甘胺酸之間的肽鍵形成的結果。迄今為止鑑定之四種自催化肽裂解位點序列已在生物醫學研究中得到大量使用：口蹄疫病毒2A (F2A)；馬鼻炎A病毒(ERAV) 2A (E2A)；豬鐵士古病毒-1 2A (P2A)及明脈扁刺蛾( Thosea asigna)病毒2A (T2A)。在一些實施例中，使用P2A自催化肽裂解位點核酸(SEQ ID NO:37)及多肽(SEQ ID NO:38)序列。在一些實施例中，所用P2A核酸或多肽可用F2A、E2A或T2A核酸或多肽取代。
在一些實施例中，本文所用之核酸或肽包含代表D型肝炎抗原(HDAg)變體之序列。D型肝炎為一種依賴於B型肝炎共感染或重複感染進行複製之擬病毒。D型肝炎之環狀單鏈RNA使用宿主RNA聚合酶擴增，但亦含有單一D型肝炎抗原(HDAg)基因。在B型肝炎及D型肝炎共感染或重複感染期間，完整的D型肝炎病毒用含有B型肝炎表面抗原之包膜包裝，該包膜包圍塗覆有HDAg蛋白之基因體。B型肝炎表面抗原之摻入對於D型肝炎傳染性為必不可少的，因為D型肝炎並不編碼其自身受體結合蛋白。D型肝炎之共感染或重複感染導致更嚴重的併發症，增加肝功能衰竭、肝硬化及癌症之風險。HDAg存在較小(24 kDa)及較大(27 kDa，213個胺基酸，不包括起始甲硫胺酸)同種型，且自HDV基因體上之相同開放閱讀框轉譯。編碼序列之密碼子196處之UAG終止密碼子中之腺苷的脫胺作用允許繼續轉譯且產生較大同種型。除非另外明確說明，否則本文所描述之實施例包含HDAg之較大同種型。在一些實施例中，HDAg序列包含四種不同的HDAg毒株序列中之至少一者：「HDAg基因型1A」、「HDAg基因型1B」、「HDAg基因型2A」或「HDAg基因型2B」。關於HDAg序列及其用途之額外資訊可在PCT公開案WO 2017/132332中找到，該公開案特此以引用之方式明確併入。
如本文所用，術語「IgE前導序列」是指胺基酸序列MDWTWILFLVAAATRVHS (SEQ ID NO:44)，其可附加至蛋白質之N末端以增強轉譯及增加免疫原性。當IgE前導序列與功能性Kozak序列組合使用時，轉譯尤其上調。編碼胺基酸IgE前導序列之核酸序列的例示性實施例表示為SEQ ID NO:43。然而，對於熟習此項技術者來說，開發在轉譯時產生相同胺基酸序列之替代核酸序列將為顯而易見的。關於使用IgE前導序列之更多見解可在Vijayachari等人，「Immunogenicity of a novel enhanced consensus DNA vaccine encoding the leptospiral protein LipL45」 Hum.Vaccin.Immunother.(2015);11(8):1945-53中找到，該文獻特此以全文引用之方式明確併入。
如本文所用，術語「CC40.8表位」是指β-冠狀病毒刺突蛋白之保守表位，其中β-冠狀病毒為包括SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV及其他流行的冠狀病毒病原體之病毒屬。此保守表位見於刺突蛋白之S2莖螺旋區。針對此表位產生之抗體(包括描述為與此區域結合之原始CC40.8抗體)可展現出針對多種β-冠狀病毒，包括SARS-CoV-2及其變體感染之保護活性。SARS-CoV-2之CC40.8表位的胺基酸序列表示為SEQ ID NO:91。編碼SARS-CoV-2之CC40.8表位且為在人體中表現而優化密碼子之例示性核酸序列表示為SEQ ID NO:90。在一些實施例中，代表來自其他相關冠狀病毒之CC40.8表位的序列或CC40.8序列之片段可用於本文中。關於CC40.8表位之其他資訊可在Zhou等人， A human antibody reveals a conserved site on beta-coronavirus spike proteins and confers protection against SARS-CoV-2 infection. Science. Transl. Med. (2022) doi:10.1126/scitranslmed.abi9215中找到，該文獻特此以全文引用之方式明確併入。
如本文所用，術語「活體內電穿孔」、「電穿孔」及「EP」是指使用此項技術中之已知技術使用電流將基因、核酸、DNA、RNA、蛋白質或載體遞送至活組織或生物之細胞中。電穿孔可用作其他基因轉移方法，諸如病毒(轉導)、脂質轉染、基因槍法(gene gun/biolistic)、顯微注射、囊泡融合或化學轉化之替代方法。電穿孔限制了細胞基因體之免疫原性及有害整合或突變的風險。諸如質體之DNA載體能夠進入細胞核，從而實現組成基因之轉錄及轉譯。在一些實施例中，藉由皮下、肌內或皮內註射將基因、核酸、DNA、RNA、蛋白質或載體添加至靶組織或生物中。隨後電穿孔器經由置放於注射樣品內或靠近注射樣品之電極來遞送短電脈衝。如本文所用，術語「im/EP」是指肌內(「im」)遞送之樣品的活體內電穿孔
如本文所用，術語「K18-hACE2」或「B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J」是指表現人ACE2之基因轉殖小鼠模型，該人ACE2為用以感染人體細胞之諸如SARS-CoV-1及SARS-CoV-2的冠狀病毒之受體。人ACE2之表現是由人細胞角蛋白18啟動子驅動。此等小鼠可用作SARS-CoV-2病毒感染之實驗模型。其他類似的小鼠模型可用作替代模型。
在提供數值範圍之情況下，應理解，上限及下限，以及該範圍之上限與下限之間的各插入值均涵蓋於實施例中。
如本文所用，術語「% w/w」或「% wt/wt」具有根據說明書所理解之其普通含義，且是指以成分或劑之重量佔組成物之總重量乘以100所表示之百分比。如本文所用，術語「% v/v」或「% vol/vol」具有根據說明書所理解之其普通含義，且是指以化合物、物質、成分或劑之液體體積佔組成物之總液體體積乘以100所表示之百分比。 例示性核酸及多肽
本文揭露了可用作免疫原性組成物或免疫原性產品組合之一部分的核酸，例如，以產生針對SARS-CoV-2或其他冠狀病毒之免疫反應，及/或產生針對受試者體內之SARS-CoV-2或其他冠狀病毒的中和抗體。
在一些實施例中，核酸包含至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列及至少一種編碼P2A自催化多肽裂解位點之核酸序列。在一些實施例中，至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列包括編碼受體結合結構域(RBD)多肽之核酸序列及編碼核衣殼蛋白(NP)多肽之核酸。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:1或13共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列包含編碼RBD多肽之核酸序列、編碼M多肽之核酸序列及編碼NP多肽之核酸序列。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:2-3或14-15共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，RBD多肽為RBD串聯重複單鏈二聚體多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525突變，或其任何組合，或無此等突變，在一些實施例中，編碼RBD串聯重複單鏈二聚體多肽之核酸序列與SEQ ID NO:45或47-50中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:39共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，RBD多肽包含RBD之三個串聯拷貝(或RBDv2)。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD之三個串聯拷貝各自包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD之三個串聯拷貝各自包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525突變，或其任何組合，或無此等突變。在本文所揭露之實施例中之任一者中，RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽可來源於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)或SARS-CoV-2變體，視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。在一些實施例中，RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽包含相對於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。在一些實施例中，RBD多肽包含相對於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。
如應用於本文所揭露之核酸中之任一者，在一些實施例中，核酸進一步包含5' IgE前導核酸序列。在一些實施例中，5' IgE前導核酸序列與SEQ ID NO:43共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，RBD多肽為RBD串聯重複單鏈二聚體多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525突變，或其任何組合，或無此等突變，在一些實施例中，編碼RBD串聯重複單鏈二聚體多肽之核酸序列與SEQ ID NO:45或47-50中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:45或47-50中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:40、57-60或62中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，RBD多肽包含RBD之三個串聯拷貝(或RBDv2)。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD之三個串聯拷貝各自包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD之三個串聯拷貝各自包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:61共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。
在一些實施例，至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列包含編碼RBD多肽之核酸序列及編碼M多肽之核酸序列。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:4或16共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
在一些實施例中，至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列包含編碼刺突(S)多肽之核酸序列。在一些實施例中，至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列包含編碼膜(M)多肽之核酸序列。在一些實施例中，至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列進一步包含編碼核衣殼蛋白(NP)多肽之核酸序列。在一些實施例中，至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列包含編碼S多肽之核酸序列、編碼M多肽之核酸序列或編碼NP多肽之核酸序列，或其任何組合。在一些實施例中，S多肽包含突變以促進提高的表現、溶解性及/或免疫原性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，S多肽包含K968P或V987P突變，或兩者。在一些實施例中，編碼S多肽之核酸序列與SEQ ID NO:51共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，核酸進一步包含5’ IgE前導核酸序列。在一些實施例中，5' IgE前導核酸序列與SEQ ID NO:43共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:63共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
在一些實施例中，核酸包含至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:5-7、17-19、22-24、73或75中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
在一些實施例中，核酸包含至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列及至少一種編碼D型肝炎抗原(HDAg)之核酸序列。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:8或20共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，核酸進一步包含至少一種編碼P2A自催化多肽裂解位點之核酸序列。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:9或21共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
在本文所揭露之核酸中之任一者之一些實施例中，核酸進一步包含5’ IgE前導核酸序列。在一些實施例中，5' IgE前導核酸序列與SEQ ID NO:43共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。
在本文所揭露之核酸中之任一者中，核酸可編碼本文所揭露的或此項技術中以其他方式通常已知的SARS-CoV-2多肽中之任一或多者。在一些實施例中，一或多種SARS-CoV-2多肽包含RBD多肽。在一些實施例中，RBD多肽來自SARS-CoV-2病毒或其變體。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，編碼RBD多肽之核酸由SEQ ID NO:10或22表示。在一些實施例中，RBD多肽由SEQ ID NO:34表示。在一些實施例中，RBD多肽為RBD串聯重複單鏈二聚體多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K、N501Y、G339D、S371L、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、N440K、G446S、S447N、Q493R、G496S、Q498R或Y505H突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，編碼RBD多肽之核酸由SEQ ID NO:45或47-50中之任一者表示。在一些實施例中，RBD多肽由SEQ ID NO:46或52-55中之任一者表示。在一些實施例中，編碼M多肽之核酸由SEQ ID NO:11或23表示。在一些實施例中，M多肽由SEQ ID NO:35表示。在一些實施例中，編碼NP多肽之核酸由SEQ ID NO:12或24表示。在一些實施例中，NP多肽由SEQ ID NO:36表示。
在一些實施例中，核酸包含至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列，其中該至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列包含：i)一或多種編碼SARS-CoV-2刺突受體結合結構域(RBD)多肽之核酸序列；ii)編碼SARS-CoV-2核衣殼蛋白(NP)多肽之核酸序列；iii)編碼SARS-CoV-2膜(M)多肽之核酸序列；iv)編碼D型肝炎抗原(HDAg)多肽之核酸序列；v)編碼自催化多肽裂解位點之核酸序列；vi)編碼IgE前導多肽之核酸序列；vii)編碼SARS-CoV-2刺突多肽之核酸序列；或viii)編碼CC40.8表位之核酸序列；或其任何組合。在一些實施例中，RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者可來源於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)或SARS-CoV-2變體，視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。在一些實施例中，RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者包含相對於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。在一些實施例中，RBD多肽包含相對於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。
在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之每一者包含對應於K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之每一者包含對應於K417、N439、E484或N501的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於N439及N501的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417、E484及N501的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於L452及T478的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417、N439、L452、T478、E484或N501的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417N、N439K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的一或多個突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之每一者包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
在一些實施例中，核酸包含三種編碼RBD多肽之串聯核酸序列。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列各自包含對應於K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列各自包含對應於K417、N439、L452、T478、E484或N501的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於N439及N501的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於K417、E484及N501的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於L452及T478的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於K417、N439、L452、T478及N501的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之每一者包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
在一些實施例中，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列包含1)一種編碼來自野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之RBD多肽的核酸，2)一種具有對應於N439及N501之突變的核酸，以及3)一種具有對應於K417、E484及N501之突變的核酸。在一些實施例中，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列包含1)一種編碼來自野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之RBD多肽的核酸，2)一種具有對應於K417、N439、L452、T478及N501之突變的核酸，以及3)一種具有對應於K417、E484及N501之突變的核酸。在一些實施例中，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列包含1)一種具有對SARS應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505之突變的核酸，2)一種具有對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505之突變的核酸，以及3)一種具有對應於K417、L452或T478之突變的核酸。在一些實施例中，編碼RBD多肽之三種串聯核酸序列包含1)一種具有對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505之突變的核酸，2)一種具有對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505之突變的核酸，以及3)一種具有對應於N501之突變的核酸。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之每一者包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
在一些實施例中，核酸包含編碼RBD多肽之一或多種核酸序列及編碼NP多肽之核酸序列。在一些實施例中，核酸進一步包含編碼IgE前導多肽之核酸序列。在一些實施例中，核酸基本上由以下組成：編碼RBD多肽之一或多種核酸序列、編碼NP多肽之核酸序列及編碼IgE前導多肽之核酸序列。在一些實施例中，核酸編碼與SEQ ID NO:79、87、93或95具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:77、78、86、92或94共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處，或編碼其之序列處。
在一些實施例中，核酸進一步包含編碼自催化多肽裂解位點之核酸序列，視情況其中該自催化多肽裂解位點為P2A自催化多肽裂解位點。在一些實施例中，核酸基本上由以下組成：編碼RBD多肽之一或多種核酸序列、編碼NP多肽之核酸序列、編碼IgE前導多肽之核酸序列及編碼自催化多肽裂解位點之核酸序列。在一些實施例中，核酸編碼與SEQ ID NO:82或89具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:80、81或88共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處，或編碼其之序列處。
在一些實施例中，核酸進一步包含編碼M多肽之核酸序列。在一些實施例中，核酸基本上由以下組成：編碼RBD多肽之一或多種核酸序列、編碼NP多肽之核酸序列、編碼IgE前導多肽之核酸序列、編碼自催化多肽裂解位點之核酸序列及編碼M多肽之核酸序列。在一些實施例中，核酸編碼與SEQ ID NO:85具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處。在一些實施例中，序列一致性之變化不在K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，核酸與SEQ ID NO:84共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處，或編碼其之序列處。
在一些實施例中，核酸進一步包含編碼CC40.8表位之核酸序列。在一些實施例中，核酸包含以下、由以下組成或基本上由以下組成：編碼RBD多肽之一或多種核酸序列、編碼NP多肽之核酸序列、編碼IgE前導多肽之核酸序列及編碼CC40.8表位之核酸序列。在一些實施例中，核酸編碼與SEQ ID NO:97或99具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:96或98共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處，或編碼其之序列處。
在一些實施例中，將核酸製備為質體、病毒、噬菌體、黏接質體、F型黏接質體、噬質體、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)或人類人工染色體(HAC)。在一些實施例中，核酸為環狀或線性的。在一些實施例中，核酸是在生物系統中產生，生物系統包括但不限於哺乳動物細胞、人類細胞、細菌細胞、大腸桿菌、酵母、釀酒酵母或其他合適的生物系統。在一些實施例中，核酸存在於包含在生物系統中轉錄且轉移核酸所需之要素的匣中。
本文所揭露之核酸中之任一者可用於藥劑中或用於製造藥劑。在一些實施例中，藥劑用於預防、治療或抑制受試者體內之SARS-CoV-2或其他冠狀病毒。在一些實施例中，受試者為人類。
本文亦揭露了可用作免疫原性組成物或免疫原性產品組合之一部分的多肽，例如，以產生針對SARS-CoV-2或其他冠狀病毒之免疫反應，及/或產生針對受試者體內之SARS-CoV-2或其他冠狀病毒的中和抗體。
在一些實施例中，多肽包含至少一種SARS-CoV-2多肽序列及至少一種P2A自催化多肽裂解位點。在一些實施例中，至少一種SARS-CoV-2多肽序列包含RBD多肽序列及NP多肽序列。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:25共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，至少一種SARS-CoV-2多肽序列包含RBD多肽序列、M多肽序列及NP多肽序列。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:26或27共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，RBD多肽為RBD串聯重複單鏈二聚體多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525突變，或其任何組合，或無此等突變，在一些實施例中，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽與SEQ ID NO:46或52-55中之任一者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:41共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，RBD多肽包含RBD之三個串聯拷貝(或RBDv2)。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD之三個串聯拷貝各自包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD之三個串聯拷貝各自包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525突變，或其任何組合，或無此等突變。在本文所揭露之實施例中之任一者中，RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽可來源於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)或SARS-CoV-2變體，視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。在一些實施例中，RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽包含相對於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。在一些實施例中，RBD多肽包含相對於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。
如應用於本文所揭露之多肽中之任一者，在一些實施例中，多肽進一步包含N-末端IgE前導多肽序列。在一些實施例中，N-末端IgE前導多肽序列與SEQ ID NO:44共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，RBD多肽為RBD串聯重複單鏈二聚體多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525突變，或其任何組合，或無此等突變，在一些實施例中，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽與SEQ ID NO:46或52-55中之任一者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:42、64-67或69中之任一者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，RBD多肽包含RBD之三個串聯拷貝(或RBDv2)。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD之三個串聯拷貝各自包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD之三個串聯拷貝各自包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:68共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。
在一些實施例中，至少一種SARS-CoV-2多肽序列包含RBD多肽序列及M多肽序列。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:28共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
在一些實施例中，至少一種SARS-CoV-2多肽包含刺突(S)多肽。在一些實施例中，至少一種SARS-CoV-2多肽進一步包含NP多肽。在一些實施例中，S多肽包含突變以促進提高的表現、溶解性及/或免疫原性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，S多肽包含K968P或V987P突變，或兩者。在一些實施例中，S多肽與SEQ ID NO:56共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，多肽進一步包含N-末端IgE前導多肽序列。在一些實施例中，N-末端IgE前導多肽序列與SEQ ID NO:44共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:70共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
在一些實施例中，多肽包含至少一種與SEQ ID NO:29-31、34-36、74或76中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性之SARS-CoV-2多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
在一些實施例中，多肽包含至少一種SARS-CoV-2多肽及至少一種HDAg多肽。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:32共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，多肽進一步包含至少一種P2A自催化多肽裂解位點。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:33共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
在本文所揭露之多肽中之任一者的一些實施例中，多肽進一步包含N-末端IgE前導多肽序列。在一些實施例中，N-末端IgE前導多肽序列與SEQ ID NO:44共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:42共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。
在本文所揭露之多肽中之任一者中，多肽可包含本文所揭露的或此項技術中以其他方式通常已知的SARS-CoV-2多肽中之任一或多者。在一些實施例中，一或多種SARS-CoV-2多肽包含RBD多肽。在一些實施例中，RBD多肽來自SARS-CoV-2病毒或其變體。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，編碼RBD多肽之核酸由SEQ ID NO:10或22表示。在一些實施例中，RBD多肽由SEQ ID NO:34表示。在一些實施例中，RBD多肽為RBD串聯重複單鏈二聚體多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD串聯重複單鏈二聚體多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，編碼RBD多肽之核酸由SEQ ID NO:45或47-50中之任一或多者表示。在一些實施例中，RBD多肽由SEQ ID NO:46或52-55中之任一或多者表示。在一些實施例中，編碼M多肽之核酸由SEQ ID NO:11或23表示。在一些實施例中，M多肽由SEQ ID NO:35表示。在一些實施例中，編碼NP多肽之核酸由SEQ ID NO:12或24表示。在一些實施例中，NP多肽由SEQ ID NO:36表示。
在一些實施例中，多肽包含至少一種SARS-CoV-2多肽，其中該SARS-CoV-2多肽包含：i)一或多種SARS-CoV-2刺突受體結合結構域(RBD)多肽序列；ii) SARS-CoV-2核衣殼蛋白(NP)多肽序列；iii) SARS-CoV-2膜蛋白(M)多肽序列；iv) D型肝炎抗原(HDAg)多肽序列；v)自催化多肽裂解位點序列；vi) IgE前導多肽序列；vii) SARS-CoV-2刺突(S)多肽序列；或viii) CC40.8表位；或其任何組合。在一些實施例中，RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者可來源於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)或SARS-CoV-2變體，視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。在一些實施例中，RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者包含相對於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。在一些實施例中，一或多種RBD多肽中之每一者包含相對於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο (包括BA.1或BA.2子譜系)變體。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之每一者包含K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505處之一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之每一者包含K417、N439、L452、T478、E484或N501處之一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含N439及N501處之突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含K417、E484及N501處之突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於L452及T478的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於L452R或T478K的一或多個突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417、N439、L452、T478、E484或N501的一或多個突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之每一者包含K417N、N439K、E484K或N501Y之一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的一或多個突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之每一者包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
在一些實施例中，多肽包含三種串聯RGD多肽序列。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列各自包含K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505處之一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列各自包含K417、N439、L452、T478、E484或N501處之一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之至少一者包含N439及N501處之突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之至少一者包含K417、E484及N501處之突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之至少一者包含對應於L452及T478的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之至少一者包含對應於K417、N439、L452、T478及N501的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之每一者包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y之一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之每一者包含K417N、L452R或T478K之一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之每一者包含G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H之一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，三種串聯RGD多肽序列中之每一者包含G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H之一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之每一者包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
在一些實施例中，三種串聯RBD多肽序列包含1)一種對應於來自野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之RBD多肽的RBD多肽，2)一種具有N439及N501處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有K417、E484及N501處之突變的RBD多肽。在一些實施例中，三種串聯RBD多肽序列包含1)一種對應於來自野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之RBD多肽的RBD多肽，2)一種具有K417、N439、L452、T478及N501處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有K417、E484及N501處之突變的RBD多肽。在一些實施例中，三種串聯RBD多肽序列包含1)一種具有G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，2)一種具有G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有K417、L452或T478處之突變的RBD多肽。在一些實施例中，三種串聯RBD多肽序列包含1)一種具有G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，2)一種具有G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有N501處之突變的RBD多肽。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，一或多種RBD多肽序列中之每一者包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
在一些實施例中，多肽包含一或多種RBD多肽序列及NP多肽序列。在一些實施例中，多肽進一步包含IgE前導多肽序列。在一些實施例中，多肽基本上由以下組成：一或多種RBD多肽序列、NP多肽序列及IgE前導多肽序列。在一些實施例中，多肽包含與SEQ ID NO:79、87、93或95具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處。在一些實施例中，多肽由與SEQ ID NO:77、78、86、92或94具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸編碼。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處，或編碼其之序列處。
在一些實施例中，多肽進一步包含自催化多肽裂解位點序列，視情況其中該自催化多肽裂解位點序列為P2A自催化多肽裂解位點序列。在一些實施例中，多肽基本上由以下組成：一或多種RBD多肽序列、NP多肽序列、IgE前導多肽序列及自催化多肽裂解位點序列。在一些實施例中，多肽包含與SEQ ID NO:82或89具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處。在一些實施例中，多肽由與SEQ ID NO:80、81或88具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸編碼。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處，或編碼其之序列處。
在一些實施例中，多肽進一步包含M多肽序列。在一些實施例中，多肽基本上由以下組成：一或多種RBD多肽序列、NP多肽序列、IgE前導多肽序列、自催化多肽裂解位點序列及M多肽序列。在一些實施例中，多肽包含與SEQ ID NO:85具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處。在一些實施例中，多肽由與SEQ ID NO:84具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸編碼。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處。在一些實施例中，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處，或編碼其之序列處。
在一些實施例中，多肽進一步包含CC40.8表位。在一些實施例中，多肽基本上由以下組成：一或多種RBD多肽序列、NP多肽序列、IgE前導多肽序列及CC40.8表位。在一些實施例中，多肽包含與SEQ ID NO:97或99具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之序列。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處。在一些實施例中，多肽由與SEQ ID NO:96或98具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之核酸編碼。在一些實施例中，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處，或編碼其之序列處。
本文所揭露之多肽中之任一者可用於藥劑中或用於製造藥劑。在一些實施例中，藥劑用於預防、治療或抑制受試者體內之SARS-CoV-2或其他冠狀病毒。在一些實施例中，受試者為人類。
本文所揭露之多肽中之任一者均可重組表現。在一些實施例中，多肽在哺乳動物、細菌、酵母、昆蟲或無細胞系統中重組表現。在一些實施例中，在哺乳動物、人、原代、永生化、癌症、幹細胞、纖維母細胞、人胚胎腎(HEK) 293、中國倉鼠卵巢(CHO)、細菌、大腸桿菌、酵母、釀酒酵母、畢赤酵母、昆蟲、草地夜蛾 Sf9或草地夜蛾 Sf21細胞，或在無細胞系統中產生多肽。在一些實施例中，使用此項技術中已知的技術純化多肽，該等技術包括但不限於：萃取、凍融、均質化、透化、離心、密度梯度離心、超離心、沉澱、SDS-PAGE、非變性PAGE、尺寸排阻層析、液相層析、氣相層析、疏水性相互作用層析、離子交換層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析、親和層析、免疫親和層析、金屬結合層析、鎳柱層析、表位標籤純化或凍乾。在一些實施例中，多肽經適當折疊或變性。 例示性免疫原性組成物實施例
如本文所用，術語「初免」及「加強」涉及用於異源初免-加強免疫法之單獨免疫原性組成物。免疫接種或疫苗通常需要超過一次投與免疫原性組成物以在宿主中誘導針對靶病原體之成功免疫。與為所有投與提供相同組成物之此同源方法相比，異源初免-加強投與可能更有效地建立具有更高抗體位凖且改進對一些病原體(諸如病毒、冠狀病毒、SARS-CoV-2、細菌、寄生蟲、原生動物、蠕蟲)之清除或抗性的強大的免疫力。在異源初免-加強投與中，首先提供至少一劑包含一種類型之免疫原性組成物的初免劑量。在提供至少一劑初始劑量之後，隨後提供至少一劑包含另一類型之免疫原性組成物的加強劑量。至少一劑加強劑量之投與是在投與至少一劑初免劑量後至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或數週或在由上述時間點中之任兩者所界定之時間範圍內，例如在1-48天或1-48週內進行。在一些實施例中，初免劑量包含編碼一或多種抗原或表位之核酸(例如DNA或RNA)，且加強劑量包含有包含一或多種抗原或表位之多肽。在宿主中，核酸初免是在活體內轉譯以引發免疫反應且引起針對隨後多肽加強之更大反應。
在一些實施例中，核酸初免包含來自SARS-CoV-2或其他冠狀病毒(包括其變體)之序列、基本上由其組成或由其組成。在一些實施例中，來自SARS-CoV-2或其他冠狀病毒之序列編碼S、RBD、M、E或NP多肽，包括其突變或變異多肽。在一些實施例中，核酸初免亦包括IgE前導序列。在一些實施例中，核酸初免亦包含CC40.8表位序列。在一些實施例中，核酸初免亦包括至少一個HDAg序列。在一些實施例中，核酸序列經密碼子優化以在人體中表現。在一些實施例中，多肽加強包含來自SARS-CoV-2或其他冠狀病毒(包括其變體)之多肽、基本上由其組成或由其組成。在一些實施例中，來自SARS-CoV-2或其他冠狀病毒之多肽為S、RBD、M、E或NP多肽。在一些實施例中，初免劑量為多肽，且加強劑量為核酸。關於異源初免-加強法之一般資訊可在PCT公開案WO 2006/013106、WO 2006/040334、WO 2008/094188中找到，出於描述初免-加強方法之目的，該等公開案中之每一者特此以引用之方式明確併入。
本文揭露了免疫原性組成物或產品組合。在一些實施例中，此等免疫原性組成物或產品組合可用於初免-加強法。在一些實施例中，免疫原性組成物或產品組合包含(a)包含至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列的核酸，或(b)包含至少一種SARS-CoV-2多肽之多肽，或兩者。在一些實施例中，免疫原性組成物包含核酸及多肽，其中核酸為本文所揭露之核酸中之任一者及/或多肽為本文所揭露之多肽中之任一者。
在本文所揭露之免疫原性組成物或產品組合中之任一者之一些實施例中，編碼SARS-CoV-2多肽之至少一種核酸序列包含i)編碼RBD多肽之核酸序列；ii)編碼NP多肽之核酸序列；iii)編碼M多肽之核酸序列；iv)編碼HDAg多肽之核酸序列；v)編碼P2A自催化多肽裂解位點之核酸序列；vi)編碼IgE前導多肽之核酸序列；vii)編碼S多肽之核酸序列；或viii)編碼CC40.8表位之核酸序列；或其任何組合。在一些實施例中，核酸為本文所揭露之核酸中之任一者。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:1-12中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性，該核酸視情況用於藥劑中，諸如用於預防、治療或抑制受試者，諸如哺乳動物，較佳人體中之SARS-CoV-2。在其他實施例中，核酸經密碼子優化，以在人體中表現。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:13-24、39-40、57-63、71、73、75、77-78、80-81、84、86、88、92、94、96或98中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性，該核酸視情況用於藥劑中，諸如用於預防、治療或抑制受試者，諸如哺乳動物，較佳人體中之SARS-CoV-2。在一些實施例中，RBD多肽為RBD串聯重複單鏈二聚體。在一些實施例中，RBD多肽來自SARS-CoV-2病毒或其變體。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K、N501Y、G339D、S371L、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、N440K、G446S、S447N、Q493R、G496S、Q498R或Y505H突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，RBD多肽與SEQ ID NO:46或52-55中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，核酸以重組載體形式提供。在一些實施例中，重組載體為pVAX1。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之每一者包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
在本文所揭露之免疫原性組成物或產品組合中之任一者之一些實施例中，至少一種SARS-CoV-2多肽包含i) RBD多肽序列；ii) NP多肽序列；iii) M多肽序列；iv) HDAg多肽序列；v) P2A自催化多肽裂解位點序列；vi) IgE前導多肽序列；vii) S多肽序列；或viii) CC40.8表位；或其任何組合。在一些實施例中，多肽為本文所揭露之多肽中之任一者。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:25-36、41-42、64-70、72、74、76、79、82、85、87、89、93、95、97或99中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性，該多肽視情況用於藥劑中，諸如用於預防、治療或抑制受試者，諸如哺乳動物，較佳人體中之SARS-CoV-2。在一些實施例中，RBD多肽為RBD串聯重複單鏈二聚體。在一些實施例中，RBD多肽來自SARS-CoV-2病毒或其變體。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K、N501Y、G339D、S371L、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、N440K、G446S、S447N、Q493R、G496S、Q498R或Y505H突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390中所示)，RBD多肽包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y突變，或其任何組合，或無此等突變。在一些實施例中，RBD多肽與SEQ ID NO:46或52-55中之任一者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，多肽為重組表現的。在一些實施例中，多肽在哺乳動物、細菌、酵母、昆蟲或無細胞系統中重組表現。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，RBD多肽序列包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
在一些實施方案中，本文所揭露之免疫原性組成物或產品組合中之任一者進一步包含佐劑。在一些實施例中，佐劑為此項技術中習知的任何佐劑。在一些實施例中，佐劑為Matrix-M、alum及/或QS21。 療法或用途之方法
本文揭露之在受試者體內產生免疫反應及/或產生中和抗體之方法。在一些實施例中，方法包括向受試者投與本文所揭露之核酸中之任一者及/或多肽中之任一者。
本文亦揭露了使用本文所揭露之免疫原性組成物或產品組合中之任一者在受試者體內產生免疫反應及/或產生中和抗體之方法。在一些實施例中，此等方法包括：向受試者投與至少一劑包含免疫原性組成物或產品組合中之任一者之核酸的初免劑量；及向受試者投與至少一劑包含免疫原性組成物或產品組合中之任一者之多肽的加強劑量。在一些實施例中，免疫反應及/或中和抗體是針對SARS-CoV-2或其他冠狀病毒的。在一些實施例中，受試者為哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、猴、貓、夠或人類。在一些實施例中，至少一劑加強劑量進一步包含佐劑。在一些實施例中，佐劑為此項技術中習知的任何佐劑。在一些實施例中，佐劑為Matrix-M、alum及/或QS21。在一些實施例中，至少一劑加強劑量是在投與至少一劑初免劑量後至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或數週或在由上述時間點中之任兩者所界定之時間範圍內，例如在1-48天或1-48週內投與。在一些實施例中，投與是藉由腸內、口服、鼻內、腸胃外、皮下、肌內、皮內或靜脈內或其任何組合提供，且視情況與活體內電穿孔一起提供。在一些實施例中，投與是與抗病毒療法聯合進行。在一些實施例中，抗病毒療法包括投與地塞米松、法匹拉韋、法維拉韋、瑞德西韋、托珠單抗、加利西韋、薩瑞魯單抗、洛匹那韋、利托那韋、達蘆那韋、利巴韋林、干擾素-α、聚乙二醇化干擾素-α、干擾素α-2b、恢復期血清或其任何組合。
在一些實施例中，與僅核酸或僅多肽免疫的或未免疫的對照生物相比，在本文所揭露之免疫原性組成物或產品組合中之任一者的受試者(例如小鼠、兔、猴、人類)中投與包含SARS-CoV-2或其他冠狀病毒(包括其變體)組分的核酸初免及多肽加強導致更大的抗S、抗RBD、抗M、抗E、抗NP、抗SARS-CoV-2或抗冠狀病毒抗體效價，藉由此項技術中已知的技術(諸如ELISA)定量，效價比率為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、5000、10000、100000或1000000，或由上述比率中之任兩者界定之範圍內的任何比率。在一些實施例中，與來自僅核酸或僅多肽免疫的或未免疫的對照生物之血清相比，在受試者中投與包含SARS-CoV2或其他冠狀病毒組分之核酸初免及多肽加強導致血清更有效地中和SARS-CoV2或其他冠狀病毒之活體外或活體內感染性且降低感染發生率或多重感染(multiplicity of infection，MOI)至0.00001、0.00005、0.0001、0.0005、0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0之比率，或在由上述比率中之任兩者界定之範圍內的任何比率。在一些實施例中，與僅核酸或僅多肽免疫的或未免疫的對照生物相比，在受試者中投與包含SARS-CoV2或其他冠狀病毒組分之核酸初免及多肽加強導致更多數量的干擾素γ (IFNγ)-陽性細胞(例如T細胞、巨噬細胞、自然殺傷(NK)細胞)，比率為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、5000或10000，或在由上述比率中之任兩者界定之範圍內的任何比率。
本文亦揭露了用於治療或抑制SARS-CoV-2或其他冠狀病毒(包括其變體)之免疫原性組成物或產品組合。在一些實施例中，免疫原性組成物或產品組合包含(a)包含至少一種編碼SARS-CoV-2多肽之核酸序列的核酸，或(b)包含至少一種SARS-CoV-2多肽之多肽，或兩者。在一些實施例中，編碼SARS-CoV-2多肽之至少一種核酸序列包含：i)編碼RBD多肽之核酸序列；ii)編碼NP多肽之核酸序列；iii)編碼M多肽之核酸序列；iv)編碼HDAg多肽之核酸序列；v)編碼P2A自催化多肽裂解位點之核酸序列；vi)編碼IgE前導多肽之核酸序列；vii)編碼S多肽之核酸序列；或viii)編碼CC40.8表位之核酸序列；或其任何組合。在一些實施例中，核酸為本文所揭露之核酸中之任一者。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:1-12、77或80中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，核酸經密碼子優化，以在人體中表現。在一些實施例中，核酸與SEQ ID NO:13-24、39-40、57-63、71、73、75、78、81、84、86、88、92、94、96或98中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，至少一種SARS-CoV-2多肽包含：i) RBD多肽序列；ii) NP多肽序列；iii) M多肽序列；iv) HDAg多肽序列；v) P2A自催化多肽裂解位點序列；vi) IgE前導多肽序列；vii) S多肽序列；或viii) CC40.8表位；或其任何組合。在一些實施例中，多肽為本文所揭露之多肽中之任一者。在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO:25-36、41-42、64-70、72、74、76、79、82、85、87、89、93、95、97或99中之任一或多者共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，RBD多肽為RBD串聯重複單鏈二聚體。在一些實施例中，RBD多肽與SEQ ID NO:46共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同源性或序列一致性。在一些實施例中，多肽為重組表現的。在一些實施例中，多肽在哺乳動物、細菌、酵母、昆蟲或無細胞系統中重組表現。在一些實施例中，免疫原性組成物或產品組合進一步包含佐劑。在一些實施例中，佐劑為此項技術中習知的任何佐劑。在一些實施例中，佐劑為Matrix-M、alum及/或QS21。在一些實施例中，核酸以重組載體形式提供。在一些實施例中，重組載體為pVAX1。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼RBD多肽之一或多種核酸序列中之每一者包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。在一些實施例中，參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，RBD多肽序列包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
在一些實施例中，向包括但不限於人類、小鼠、大鼠、兔、貓、狗、馬、牛、豬、綿羊、猴、靈長類動物或雞之動物投與核酸及/或多肽。在一些實施例中，核酸及/或多肽是以各劑量之間間隔1、2、3、4、5、6或7天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月，或在由上述時間中之任兩者界定之範圍內的任何時間投與。在一些實施例中，在投與多肽之前投與核酸。在一些實施例中，在核酸之前投與多肽。
在一些實施例中，核酸及/或多肽是以1、10、100、1000 ng，或1、10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 µg，或1、10、100或1000 mg之量，或在由上述量中之任兩者界定之範圍內的任何量投與。在一些實施例中，核酸及/或多肽與賦形劑一起投與。在一些實施例中，核酸及/或多肽與佐劑一起投與。在一些實施例中，核酸與活體內電穿孔一起投與。
在一些實施例中，核酸及/或多肽之投與提供了針對冠狀病毒感染之瞬時、持久或永久保護，諸如由SARS-CoV-2病毒或其變體引起之感染。在一些實施例中，針對冠狀病毒感染之瞬時、持久或永久保護優於其他免疫原性組成物。在一些實施例中，投與核酸及/或多肽是與抗病毒療法聯合進行。在一些實施例中，投與核酸及/或多肽以提供針對冠狀病毒感染之瞬時、持久或永久保護對人類為有效的。在一些實施例中，核酸及/或多肽用作疫苗或免疫原，用於治療、抑制或改善冠狀病毒感染或提供針對冠狀病毒感染之保護。
本發明大體上是在本文中使用肯定性語言來描述眾多實施例來揭露。本發明亦包括其中全部或部分排除主題，諸如物質或材料、方法步驟及條件、方案或程序之實施例。 實例
上文所論述之實施例的一些態樣在以下實例中更詳細地揭露，該等實例絕不旨在限製本揭示案之範圍。熟習此項技術者將理解，許多其他實施例亦落入本發明之範圍內，如本文上文及申請專利範圍中所描述的。 實例1：SARS-CoV-2免疫原性組成物構築體之設計
製備了若干種含有SARS-CoV-2病毒組分之重組構築體，且在表1及第1圖、第2A圖至第2C圖中進行了描繪。由於已知S蛋白之RBD具有高度免疫原性，因此大多數構築體包含RBD序列。在一些情況下，RBD序列為RBD串聯重複單鏈二聚體序列。然而，設想構築體可具有來自SARS-CoV-2病毒或任何其他冠狀病毒的呈任何順序的編碼序列的任何組合。此包括缺少RBD序列之構築體。此亦包括冠狀病毒複製蛋白或血凝素酯酶之序列。
可在SVF-1 (OC-1)、SVF-2 (OC-2)、SVF-3 (OC-3)、SVF-4 (OC-4)、SVF-5 (OC-4)、SVF-6 (OC-6)、SVF-7 (OC-7)、SVF-8 (OC-8)、SVF-9 (OC-9)、SVF-10 (OC-10)、SVF-14 (OC-14)、SVF-14.2 (OC-14.2)、SVF-14.3 (OC-14.3)、SVF-2.2 (OC-2.2)、SVF-2.3 (OC-2.3)、SVF-2.4 (OC-2.4)、SVF-2.5 (OC-2.5)、SVF-16.1、SVF-16.2、SVF-16.3及SVF-16.4，包括其任何衍生物及/或突變體中發現RBD序列。
在SVF-2.2及SVF-2.3，以及SVF-14 (OC-14)，包括其任何衍生物及/或突變體中發現了RBD串聯重複單鏈二聚體。
在SVF-2.4、SVF-2.5、SVF-14.2、SVF-14.3、SVF-14.4、SVF-14.5、SVF-16.1、SVF-16.2、SVF-16.3及SVF-16.4，包括其任何衍生物及/或突變體中發現了三聚RBD構築體。
在SVF-13 (OC-13)及SVF-15 (OC-15)，包括其任何衍生物及/或突變體中發現了S蛋白序列(其亦必然含有RBD序列)。
在SVF-1、SVF-2、SVF-3、SVF-5、SVF-6、SVF-12 (OC-12)、SVF-14、SVF-14.2、SVF-14.3、SVF-14.4、SVF-14.5、SVF-15、SVF-2.2、SVF-2.3、SVF-2.4、SVF-2.5、SVF-16.1、SVF-16.2、SVF-16.3及SVF-16.4，包括其任何衍生物及/或突變體中發現了NP蛋白序列。
在SVF-2、SVF-3、SVF-4、SVF-6、SVF-7、SVF-11 (OC-11)、SVF-2.2、SVF-2.3、SVF-2.4及SVF-2.5，包括其任何衍生物及/或突變體中發現了M蛋白序列。
在SVF-16.3及SVF-16.4，包括其任何衍生物及/或突變體中發現了CC40.8表位序列。
在SVF-1、SVF-2、SVF-3、SVF-4、SVF-9、SVF-14、SVF-14.3、SVF-14.5、SVF-15、SVF-2.2、SVF-2.3及SVF-2.4，包括其任何衍生物及/或突變體中發現了至少一個P2A自催化肽裂解位點。該P2A自催化肽裂解位點(其可由另一自催化肽裂解位點簡單地取代)之存在允許自一或多個連續核酸基因或匣轉譯靶細胞中之單獨蛋白質。自催化肽裂解位點之存在亦表明重組蛋白表現及該等構築體之純化將導致分離多肽組分，該等組分將難以純化。儘管仍有可能(例如具有相同或不同的表位標籤)，但使用其他構築體來產生用於免疫原性投與之蛋白質為更可行的。
在一些實施例中，重組構築體進一步含有B型肝炎病毒或D型肝炎病毒之組分。此在SVF-8及SVF-9中可見，其中提供了4種不同的一致序列(基因型1A、1B、2A及2B)之HDAg拷貝。HDAg亦為一種高度免疫原性多肽，且設想包括HDAg序列提高對RBD或其他冠狀病毒序列之免疫原性反應。亦設想此等構築體將提供針對SARS-CoV-2 (或其他冠狀病毒)及B型或D型肝炎之雙重免疫原性反應。
構築體SVF-10 (RBD)、SVR-11 (M)、SVF-12 (NP)及SVF-13 (S)提供為單個SARS-CoV-2序列組成物，以評估不同組分之相對免疫原性。 表 1 ： SARS-CoV-2 免疫原性組成物候選物
組成物 野生型DNA序列 人密碼子優化序列 多肽序列
SVF-1 (OC-1) SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:13 SEQ ID NO:25
SVF-2 (OC-2) SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:14 SEQ ID NO:26
SVF-3 (OC-3) SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:15 SEQ ID NO:27
SVF-4 (OC-4) SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:28
SVF-5 (OC-5) SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:29
SVF-6 (OC-6) SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:30
SVF-7 (OC-7) SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO:31
SVF-8 (OC-8) SEQ ID NO:8 SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:32
SVF-9 (OC-9) SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:33
SVF-10 (OC-10) SEQ ID NO:10 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:34
SVF-11 (OC-11) SEQ ID NO:11 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:35
SVF-12 (OC-12) SEQ ID NO:12 SEQ ID NO:24 SEQ ID NO:36
SVF-2.2 (OC-2.2) N/A SEQ ID NO:39 SEQ ID NO:41
SVF-2.3 (OC-2.3) N/A SEQ ID NO:40 SEQ ID NO:42
SVF-2.3 (OC-2.3) - N501Y N/A SEQ ID NO:57 SEQ ID NO:64
SVF-2.3 (OC-2.3) – N439K，N501Y N/A SEQ ID NO:58 SEQ ID NO:65
SVF-2.3 (OC-2.3) – K417N、E484K、N501Y N/A SEQ ID NO:59 SEQ ID NO:66
SVF-2.3 (OC-2.3) – K417N、N439K、E484K、N501Y N/A SEQ ID NO:60 SEQ ID NO:67
SVF-2.4 (OC-2.4) N/A SEQ ID NO:61 SEQ ID NO:68
SVF-14 N/A SEQ ID NO:62 SEQ ID NO:69
SVF-15 N/A SEQ ID NO:63 SEQ ID NO:70
SVF-13 (OC-13) N/A SEQ ID NO:71 SEQ ID NO:72
SVF-10.2 (OC-10.2) N/A SEQ ID NO:73 SEQ ID NO:74
SVF-10.3 (OC-10.3) N/A SEQ ID NO:75 SEQ ID NO:76
SVF-14.2 (OC-14.2) SEQ ID NO:77 SEQ ID NO:78 SEQ ID NO:79
SVF-14.3 (OC-14.3) SEQ ID NO:80 SEQ ID NO:81 SEQ ID NO:82
SVF-2.5 (OC-2.5) N/A SEQ ID NO:84 SEQ ID NO:85
SVF-14.4 (OC-14.4) N/A SEQ ID NO:86 SEQ ID NO:87
SVF-14.5 (OC-14.5) N/A SEQ ID NO:88 SEQ ID NO:89
SVF-16.1 N/A SEQ ID NO:92 SEQ ID NO:93
SVF-16.2 N/A SEQ ID NO:94 SEQ ID NO:95
SVF-16.3 N/A SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:97
SVF-16.4 N/A SEQ ID NO:98 SEQ ID NO:99
實例2：方法 動物
BALB/c、C57BL/6及K18-hACE2 (B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J)小鼠可自Jackson Laboratory獲得。所有小鼠在實驗開始時為8-10週齡且維持在標準條件下。紐西蘭白兔是自商業供應商處購得。 重組載體
SARS-CoV-2序列可自以下NCBI GenBank登錄號獲得：MN908947.3 (例如完整基因體)、YP_009724390 (例如表面醣蛋白)、YP_009724393.1 (例如膜醣蛋白)及YP_009724397.2 (例如核衣殼磷蛋白)。基因型1及2之HDAg序列是自以下四種不同的臨床分離株獲得；分別為US-2及CB，以及7/18/83及TW2476，且密碼子經優化以在人體內表現。
對於DNA免疫原性組成物，使用限制位點BamHI及XbaI將基因選殖至pVAX1主鏈(ThermoFisher)中。將質體在TOP10大腸桿菌細胞(ThermoFisher)中生長，且按照製造商說明使用Qiagen Endofree DNA純化套組(Qiagen GmbH)進行活體內註射來純化。正確的基因大小是由限制酶消化確認。另外，對所有選殖基因序列進行定序以確認正確的核苷酸序列。
對於蛋白質表現構築體，將基因選殖至pET100大腸桿菌T7表現載體(ThermoFisher)中。可使用其他市售表現載體。根據此項技術中已知方案，將表現載體轉化至BL21(DE3)大腸桿菌(或其他T7表現大腸桿菌菌株)中且誘導純化。 西方墨點法
如此項技術中已知的進行西方墨點法。使用Lipofectamine 3000轉染試劑(ThermoFisher)將HeLa細胞與各pVAX1構築體一起轉染。將具有GFP報導基因之pVAX1質體用作對照。對於蛋白質偵測，使用用SARS-CoV-2 pVAX1組成物中之一者或市售抗SARS-CoV-2抗體，以及合適的HRP二級抗體免疫兔子血清。使用Pierce TM ECL Plus Western Blotting Substrate誘導化學發光，且使用Gel Doc XR+系統(BioRad)收集影像。 免疫方案
為了活體內評價構築體之免疫原性，每月對小鼠及兔子進行接種，且兩週後處死以採集脾臟及血液。簡言之，將小鼠(每組五至十隻)在脛骨前肌(TA)肌內(i.m.)藉由常規針頭(27G)注射於無菌PBS中之30-50 μL體積之1-50 μg質體DNA來進行接種，接著使用Cliniporator2裝置(IGEA, Carpi, Italy)進行活體內電穿孔(EP)。在活體內電穿孔期間，使用1 ms 600 V/cm脈衝，接著使用400 ms 60 V/cm脈沖模式，以促進更好地吸收DNA。在疫苗注射之前，將小鼠給予鎮痛劑且在疫苗接種期間保持處於異氟醚麻醉下。對於兔子研究，將每組2-4只紐西蘭白兔用100 µg至900 µg質體DNA進行免疫。將疫苗於300μL無菌PBS中藉由i.m.注射投與至右TA肌肉，接著進行活體內EP。 藉由酶聯免疫墨點分析法 (ELISpot) 偵測 IFNγ 細胞
在最後一次接種後兩週，收集來自各合併免疫小鼠組之脾細胞，且使用SARS-CoV-2衍生之肽及/或於可商購ELISpot測定(Mabtech, Nacka Strand, Sweden)中之蛋白質，如此項技術中已知地測試該等脾細胞基於IFN-γ分泌48h誘導SARS-CoV-2特異性T細胞之能力， 藉由 ELISA 偵測抗體
使用此項技術中已知的方案偵測針對各種SARS-CoV-2肽及/或蛋白質的小鼠及兔IgG。抗體效價決定為終點血清稀釋度，在該稀釋度時OD值(例如在405 nm或492 nm處)為相同稀釋度處之陰性對照(未免疫或對照動物血清)之OD的至少兩倍。 活體外 SARS-CoV-2 中和測定
活體外評估動物免疫血清之中和能力。將Vero E6細胞在培養板上生長至會合。將含有來自用SARS-CoV-2組成物免疫之動物血清或來自對照動物之血清的培養基添加至細胞中。隨後用SARS-CoV-2病毒顆粒感染細胞。藉由偵測一或多種病毒基因體/基因，藉由計數病毒斑或病毒效價來評估病毒感染性及血清中和。 hACE2 小鼠模型中之活體內 SARS-CoV-2 中和測定
用SARS-CoV-2免疫原性組成物或對照對野生型或K18-hACE2小鼠進行免疫。採用不同的組合，包括但不限於僅DNA組成物、僅蛋白質組成物、DNA初免/蛋白質加強組成物或蛋白質初免/DNA加強組成物。隨後用SARS-CoV-2病毒顆粒K18-hACE2小鼠。對於野生型小鼠，在感染SARS-CoV-2前1-5天，該等小鼠藉由流體動力注射或其他相關技術對hACE2進行瞬時基因轉殖。評估病毒感染之影響，包括小鼠體重、症狀、發病率及死亡率，以及病毒負載。 統計分析
使用GraphPad Prism V.5及V.8軟體，以及Microsoft Excel V.16.13.1來分析數據。 實例3：SARS-CoV2 DNA及蛋白質組成物在動物體內具有免疫原性
儘管免疫原性組成物及疫苗傳統上要麼為完整的生物，要麼為抗原蛋白，但最近已表明，向活組織活體內投與DNA及隨後的抗原蛋白之轉錄及轉譯在觸發免疫反應方面亦非常有效。正在探索此等DNA初免/蛋白質加強免疫原性組成物作為針對各種疾病之潛在疫苗候選物。
將小鼠用以下免疫：(1)包含本文所揭露之組成物中之一者的DNA組成物(3個連續劑量的50 μg DNA)；(2)包含本文所揭露之組成物中之一者的多肽組成物(3個連續劑量的20 μg蛋白質與alum佐劑)；或(3)包含本文所揭露之組成物中之一者的DNA組成物，接著為包含本文所揭露之組成物中之一者的多肽組成物(2劑50μg DNA，隨後2劑20μg蛋白質與alum)。
在1、2、3、4、5、6或7天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10週，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個月，或在由上述時間中之任兩者界定之範圍內的任何時間作為投與DNA初免/蛋白質加強組成物之持續時間後，評估小鼠對SARS-CoV-2抗原之免疫力。自小鼠全血樣品純化白血球，且與純化的多肽抗原(包括S蛋白、RBD、M蛋白及NP蛋白)一起孵育。將細胞亦與作為陽性對照之伴刀豆球蛋白A (「ConA」)及作為陰性對照之兩種卵白蛋白肽(「OVA Th」及「OVA CTL」)一起孵育。藉由酶聯免疫墨點分析法(ELISpot)評估產生干擾素γ (IFNγ)之細胞響應抗原暴露之群體頻率。簡言之，將白血球在塗覆有IFNγ抗體之孔中與抗原一起孵育。隨後移除細胞，且將生物素化的IFNγ抗體、鹼性磷酸酶交聯的鏈球菌親生物素蛋白及鹼性磷酸酶受質比色試劑依次添加至孔中，且在其間徹底清洗。隨後使板乾燥，且藉由顯微鏡計數與分泌IFNγ之細胞相對應的剩餘著色斑點。
經治療小鼠總體上展現出相對更強的免疫細胞反應。此表明對於某些病原體，該DNA初免/蛋白質加強法可能比傳統的基於蛋白質或生物之組成物更有效地誘導更大的免疫原性反應。
相應實驗亦在兔子(家兔( Oryctolagus cuniculus))中進行。將紐西蘭白兔用以下免疫：(1)包含本文所揭露之組成物中之一者的僅DNA組成物；(2)包含本文所揭露之組成物中之一者的僅蛋白質組成物；或(3)包含本文所揭露之組成物中之一或多者的DNA初免/蛋白質加強組成物。在第0、4、8及12週投與組成物四次，各劑量投與900 μg DNA im/EP或300 μg蛋白質與alum。對於DNA-蛋白質組成物(3)，在第0週之第一劑投與900 µg DNA im/EP，且在第4、8及12週之第二、第三及第四劑投與300 µg蛋白質與alum。在第0、2、10及14 週(亦即各劑量後2週)評估血清中之抗RBD效價。與僅DNA (1)及僅蛋白質(2)組成物相比，DNA初免/蛋白質加強組成物(3)不僅導致更大的整體效價，且亦直至第2週時，相對於僅蛋白質組成物更快地誘導強大的抗體產生。
使用本文所描述之免疫原性組成物進行主動免疫能夠對於抗SARS-CoV-2或冠狀病毒抗原誘導功能性T細胞。 實例4：免疫原性DNA組成物誘導動物體內產生SARS-CoV-2中和抗體
向BALC/c及C57BL/6 小鼠投與包含組成物SVF-2、SVF-2.2、SVF-2.3或僅刺突蛋白(作為對照)之的單次50 μg劑量的DNA表現匣。測試小鼠之血清樣品是在投與後兩週獲得，且藉由ELISA (終點效價)及活體外中和測定來評估對SARS-CoV-2蛋白組分具有特異性的中和抗體之存在。結果示於下表2 (BALB/c)及表3 (C57BL/6)中。組成物SVF-2.3導致產生與僅刺突蛋白之組成物相當的抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗體，且亦賦予BALB/c小鼠針對SARS-CoV-2核衣殼蛋白之免疫原性。來自用組成物SVF-2.3治療之BALB/c小鼠的血清亦在活體外測定中成功中和了SARS-CoV-2感染。(S=刺突蛋白；RBD=受體結合結構域；NP=核衣殼蛋白)。在第一次接種後三週投與第二次接種後兩週展示相同的反應(表4及表5)。 表2：DNA組成物投與後BALB/c小鼠血清之定量
組成物 抗S ELISA 抗RBD ELISA 抗NP ELISA 中和 SARS-CoV-2
SVF-2 ＜60 ＜60 2160 ＜8
SVF-2.2 60 60 1080 ＜8
SVF-2.3 1440 720 1080 8
S DNA 1440 360 ＜60 8
表3：DNA組成物投與後C57BL/6小鼠血清之定量
組成物 抗S ELISA 抗RBD ELISA 抗NP ELISA 中和 SARS-CoV-2
SVF-2 ＜60 ＜60 360 ＜8
SVF-2.2 ＜60 ＜60 135 ＜8
SVF-2.3 360 210 ＜60 ＜8
S DNA 360 360 ＜60 8
表4：2輪DNA組成物投與後BALB/c小鼠血清之定量
組成物 抗S ELISA 抗RBD ELISA 抗NP ELISA 中和 SARS-CoV-2
SVF-2 ＜60 ＜60 未測試 ＜8
SVF-2.2 60 720 未測試 ＜8
SVF-2.3 51480 64800 未測試 256
S DNA 12960 12960 未測試 256
表5：2輪DNA組成物投與後C57BL/6小鼠血清之定量
組成物 抗S ELISA 抗RBD ELISA 抗NP ELISA 中和 SARS-CoV-2
SVF-2 ＜60 ＜60 未測試 ＜8
SVF-2.2 ＜60 ＜60 未測試 ＜8
SVF-2.3 36360 8280 未測試 128
S DNA 25960 25960 未測試 512
實例5：額外例示性構築體在小鼠中具有免疫原性
將BALB/c及C57BL/6小鼠在第0週及第3週使用活體內EP用50 µg質體構築體DNA進行免疫。使用的構築體為OC-2、OC-2.2、OC-2.3、OC-10、OC-10.2、OC-10.3、OC-12及OC-13，其中重組S蛋白與QS21佐劑用作對照。在第二劑量投與兩週後，自測試小鼠獲得血清樣品，且藉由ELISA評估對SARS-CoV-2 RBD及S蛋白具有特異性之中和抗體之存在(第3A圖)。位凖以終點效價給出，定義為最高稀釋度，在450 nm處之光密度為相同稀釋度下陰性對照之兩倍。構築體OC-2.3、OC-10.3及OC-13在BALB/c及C57BL/6小鼠中均展現出強大的免疫原性。
評估了免疫小鼠血清對SARS-CoV-2之活體外中和作用。將各小鼠組之合併血清樣品與SARS-CoV-2一起孵育，且隨後添加至Vero-E6細胞中。藉由在顯微鏡下檢查來決定病毒細胞病變效應(CPE)之位凖，且病毒中和效價ID 50決定為對CPE產生50%抑制的血清稀釋度(第3B圖)。用構築體OC-2.3、OC-10.3及OC-13免疫的小鼠產生強力中和SARS-CoV-2感染性之血清。 實例6：免疫原性組成物在小鼠中誘導T細胞反應
將BALB/c及C57BL/6小鼠在第0週及第3週使用活體內EP用50 µg OC-2.3及OC-10.3構築體DNA進行免疫，其中重組S蛋白與QS21佐劑作為對照。藉由乾擾素γ ELISpot偵測小鼠T細胞對跨越RBD、M及NP蛋白之肽池的反應(第4圖)。「S-KTH」表示由皇家技術大學(Royal Technical University，KTH)提供之重組S蛋白。「S-GS」表示自Genscript (#Z03501)獲得之重組S蛋白。「RBD-GS」表示自Genscript (#Z03479)獲得之S蛋白之重組RBD。此等肽池生成為具有10個胺基酸重疊之20個胺基酸長度的肽。使用卵白蛋白肽作為陰性對照，且使用伴刀豆球蛋白A作為陽性對照。用含有RBD、M及NP蛋白序列之OC-2.3免疫小鼠，導致針對RBD及N肽以及蛋白質之強烈的T細胞活化，而M肽之反應性更低。用僅包含RBD之OC-10.3免疫的小鼠導致僅針對RBD肽及蛋白質的強烈的T細胞活化。 實例7：來自免疫動物之血清可有效中和SARS-CoV-2感染
使用K18-hACE2小鼠模型或瞬時hACE2基因轉殖野生型小鼠進一步決定了誘導抗體活體內中和SARS-CoV-2感染之能力。總IgG是自免疫及未免疫的兔子純化，且注射至小鼠體內。與僅含DNA或僅含蛋白質之組成物相比，DNA初免/蛋白質加強誘導之抗體可更好地保護或顯著延遲所有受攻擊小鼠之病毒血症峰值。 實例8：針對SARS-CoV-2表位之T細胞反應可藉由初免/加強法增強
在BALB/c小鼠中測試了OC-2.3 DNA構築體及重組S蛋白與QS21佐劑(rS/QS21)之同源(僅DNA初免及加強；或僅蛋白質初免及加強)及異源初免(DNA初免，蛋白質加強；或蛋白質初免，DNA加強)之作用。在第0週及第3週，使用活體內EP或重組S蛋白與QS21佐劑，用50 μg質體構築體DNA 對小鼠進行免疫。第5A圖示出了來自免疫小鼠(5隻測試小鼠，標記為「0」、「1」、「3」、「10」及「30」)之血清中的抗S蛋白效價。4種條件中之每一者(亦即S/QS21肽與OC-2.3 DNA之不同組合作為初免或加強，或兩者)。第5B圖示出了如藉由ELISpot偵測到的免疫小鼠對跨越SARS-CoV-2 RBD、M及NP蛋白之肽池的T細胞反應。此等肽池生成為具有10個胺基酸重疊之20個胺基酸長度的肽。使用卵白蛋白肽作為陰性對照，且使用伴刀豆球蛋白A作為陽性對照。正如OC-2.3 DNA初免及rS/QS21加強法以及rS/QS21初免及OC-2.3 DNA初免法所見，異源組合導致對RBD蛋白及肽的強免疫原性，同時亦導致對NP肽及蛋白質的反應性。對SARS-CoV-2病毒組分之此改進的覆蓋將提供針對病毒以及某些組分保守之各種毒株或突變體之改進的保護。 實例9：免疫原性組成物在兔及非人靈長類動物體內具有免疫原性
評估了OC-2.3 DNA構築體在兔及石蟹獼猴體內之免疫原性能力。在第0週及第3週，使用活體內EP向兔子投與500、1000或1500 µg OC-2.3 DNA。在第0週及第3週，使用活體內EP向石蟹獼猴投與或1000 µg OC-2.3 DNA。使用定製注射裝置使用單步程序進行注射。在第二次投與後評估動物體內之抗S抗體位凖(第6A至第6B圖)。位凖以終點效價給出，定義為最高稀釋度，在450 nm處之光密度為相同稀釋度下陰性對照之兩倍。
石蟹獼猴(3組)在第0週及第3週用1000 µg OC-2.3或對照DNA (HBV DNA)以兩劑免疫，且接著用SARS-CoV-2 (以10 6pfu/mL經0.5 mL鼻內及4.5 mL氣管內)攻擊。在攻擊後第4天及第20天採集支氣管肺泡灌洗(BAL)樣品，且藉由qPCR對SARS-CoV-2 RNA進行定量(第6C圖)。Ct值大於40表示RNA位凖低於偵測極限。用OC-2.3免疫之猴子在第4天及第20天均展示基本上無法偵測到之SARS-CoV-2 RNA位凖，而用對照DNA免疫之猴子在第4天展現出可偵測到之SARS-CoV-2感染，且在第20天展現出感染清除。表6中提供了BAL中抗體效價及SARS-CoV-2 RNA存在之定量。對受試者4及5進行接種時注意到滲漏。 表6. 測試石蟹獼猴之定量
組織學發現 對照DNA (HBV) SARS-CoV-2 DNA (IgE前導-2xRBD-M-N；OC-2.3)
受試者1 受試者2 受試者3 受試者4 受試者5 受試者6
抗S效價 ＜ 50 ＜ 50 ＜ 50 31250 1250 31250
抗HBV PreS1效價 50 31250 31250 ＜ 50 ＜ 50 ＜ 50
第4天時BAL中之SARS-CoV-2 RNA (Ct值) 31.52 31.86 37.14 37.34 ＞ 40 ＞ 40
第20天時BAL中之SARS-CoV-2 RNA (Ct值) 38.39 ＞ 40 未測試 ＞ 40 37.04 ＞ 40
實例10：使用例示性免疫原性組成物候選物之人體臨床試驗
以下實例描述了使用免疫原性組成物或產品組合之實施例，該組成物或產品組合視情況由核酸組分及多肽組分構成，用於治療或預防由諸如SARS-CoV-2之冠狀病毒引起的病毒感染。
向人類患者經腸內、口服、鼻內、腸胃外、皮下、肌內、皮內或靜脈內投與DNA初免/蛋白質加強組成物。此等人類患者可能目前感染了SARS-CoV-2、先前感染了SARS-CoV-2、處於感染SARS-CoV-2之風險下或未感染SARS-CoV-2。
首先以1、10、100、1000 ng，或1、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μg，或1、10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg之量，或在由上述量中之任兩者界定之範圍內的任何量，或適合於人類最佳功效之任何其他量投與DNA初免劑量。在第一DNA初免劑量後，可在投與先前DNA初免劑量後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或週或在由上述時間中之任兩者界定之範圍內的任何時間，例如1-48天或1-48週投與1、2、3、4或5個額外DNA初免劑量。在DNA初免劑量後以1、10、100、1000 ng，或1、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 μg，或1、10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg之量，或在由上述量中之任兩者界定之範圍內的任何量，或適合於人類最佳功效之任何其他量投與蛋白質加強劑量。在投與最終DNA初免劑量後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或週或在由上述時間中之任兩者界定之範圍內的任何時間投與第一蛋白質加強劑量。在第一蛋白質加強劑量後，可在投與先前蛋白質加強劑量後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或週或在由上述時間中之任兩者界定之範圍內的任何時間投與1、2、3、4或5個額外蛋白質加強劑量。
將監測患者對SARS-CoV-2之成功反應，例如抗S-蛋白、抗RBD、抗M-蛋白、抗NP-蛋白、抗SARS-CoV2或抗冠狀病毒抗體之產生。在包括HDAg序列之條件下，亦測試了血清中之抗HDAg抗體。亦預期T細胞及其他免疫細胞在暴露於SARS-CoV-2或冠狀病毒抗原時會迅速激活，且防止未來由SARS-CoV-2或冠狀病毒感染。
在當前感染、先前感染或處於感染SARS-CoV-2或冠狀病毒風險下之患者中，可聯合抗病毒療法進行DNA初免/蛋白質加強組成物之投與。潛在抗病毒療法治療包括但不限於地塞米松、法匹拉韋、法維拉韋、瑞德西韋、托珠單抗、加利西韋、薩瑞魯單抗、洛匹那韋、利托那韋、達蘆那韋、利巴韋林、干擾素-α、聚乙二醇化干擾素-α、干擾素α-2b、恢復期血清或其任何組合。將監測患者之副作用，諸如頭暈、噁心、腹瀉、抑鬱、失眠、頭痛、瘙癢、皮疹、發燒或所提供之抗病毒療法之其他已知副作用。 實例11：材料及方法 動物
雌性BALB/c (H-2d)小鼠是自Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany獲得。雌性B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J小鼠(JAX儲備號034860)是自Jackson Laboratory, USA購得。所有小鼠在實驗開始時均為8-12週齡，且維持在瑞典卡羅林斯卡大學醫院哈丁格(Karolinska University Hospital Huddinge, Sweden)之臨床前實驗室(PKL)或瑞典索爾納卡羅林斯卡學院(Karolinska Institutet, Solna, Sweden)之Astrid Fagraeus實驗室(AFL)之標準條件下。九隻紐西蘭白兔是自Charles River, France購得且保存在AFL。所有動物程序均由地區動物倫理委員會批准(批准編號03634-2020、17114-2020及16676-2020)。攻擊實驗是在瑞典工作環境安全委員會(Swedish Board of Work Environment Safety)批准之生物安全級別(BSL)-3動物設施中進行。 DNA質體及重組蛋白
基於來自huCoV-19/WH01毒株之序列生成疫苗候選基因(第8A圖)。該等基因含有完整的刺突蛋白或RBD、N及M蛋白之組合，以及自蛋白水解P2A序列。所有序列均針對在人體細胞中之表現進行密碼子優化，且由商業供應商(Genscript)合成。將質體在TOP10大腸桿菌細胞(Life Technologies)中生長，且按照製造商說明使用Qiagen Endofree DNA純化套組(Qiagen)進行活體內註射來純化。藉由使用BamHI及XbaI (Fast Digest；Thermo Fisher Scientific)之限制酶消化及定序來確認正確的基因大小。重組N蛋白由Genscript (32878912；Ahlen等人，2020年)內部設計且生產。重組S、RBD及M是自Genscript購得。藉由哺乳動物細胞(Expi293)中之瞬時蛋白質產生，將刺突蛋白以全長形式產生。為了促進全長刺突之三聚化，根據Wrapp等人(2020)包括了C-末端T4纖維蛋白三聚化模體。此外，融合至C-末端之鏈球菌親生物素蛋白-標籤用於純化(Hober等人，2021年)。刺突之β版本(B1.351)在RBD部分(K417N E484K N501Y)中產生了三個突變。 肽
對應於huCoV-19/WH01 RBD (25個肽)、M (22個肽)及N (41個肽)以及蝙蝠N (42個肽)，總共42個具有10個aa重疊之20-mer肽是自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)購得。視實驗設置而定，將肽分為4-5或8-10個肽/池之池。 小鼠及兔之免疫及感染排程
將BALB/c (H-2d)或C57BL/6 (H-2b) (n=5)小鼠以3週間隔免疫至多三次，且如先前所描述的在最後一次免疫後2週處死以採集脾臟及血液(Ahlen等人，2020年；Maravelia等人，2021年)。將二十隻K18-hACE2小鼠分成四組(n=5)且用指定的疫苗進行免疫。各K18-hACE小鼠接受三次接種，其中各注射間隔3週。在最後一次接種後兩週，K18-hACE2小鼠感染了SARS-CoV-2 β。免疫方法簡言之，將BALB/c或K18-hACE2小鼠(每組五隻)在脛骨前肌肌內藉由常規針頭(27G)注射於50 μl體積無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之50 μg質體DNA來進行接種，接著使用Cliniporator2裝置(IGEA)使用兩個針電極進行活體內電穿孔。在疫苗注射之前，將小鼠給予鎮痛劑且在疫苗接種期間保持處於異氟醚麻醉下。在活體內電穿孔(在小鼠及兔子兩者中)期間，使用1-ms 600-V/cm脈衝，接著使用400-ms 60-V/cm脈沖模式，以促進更好地吸收DNA。另外，小鼠組在尾部皮下注射與QS21佐劑(GMP級，Alpha diagnostics) (1:1)混合之重組SARS-CoV-2刺突(S)或核(N)蛋白。用84 μg或840 μg之OC-2.4 DNA疫苗或僅調配緩衝液(Tris-EDTA，pH 7.4)媒劑免疫各紐西蘭白兔。在右側股四頭肌中投與500 μl注射劑，接著在麻醉下使用GeneDriVe (IGEA)裝置及21 mm深度之4針電極陣列進行活體內電穿孔。 小鼠攻擊模型
最後一次接種後兩週，將K18-hACE2小鼠在BSL-3設施中經由鼻內投與40 μl體積之1 × 10 5pfu SARS-CoV-2 β變體進行攻擊。每日評估動物之健康狀況長達13天，且基於若干參數進行評價，包括體重、一般狀況、豎毛以及運動及姿勢。在安樂死時，收集血液、鼻腔灌洗液、肺及脾臟。 IgG特異性抗體之偵測
來自小鼠及兔之血清用於偵測針對S或N蛋白之免疫球蛋白。簡言之，在4℃下將板用於50 mM之pH 9.6的碳酸鈉緩衝液中之1 μg/ml重組S或N蛋白(Genscript)塗覆隔夜。藉由在37℃下與稀釋緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水、2%山羊血清、1% BSA)一起孵育1 h來阻斷板。以1:60之起始稀釋度，隨後1:6之連續稀釋度添加血清。藉由鹼性磷酸酶綴合之山羊抗小鼠IgG (Sigma A1047) 1:1,000或小鼠抗兔IgG (Sigma A2556) 1:1,000來偵測血清抗體，且使用磷酸對硝基苯酯受質溶液進行可視化。在620 nm背景下，在405 nm處讀取光密度(optical density，OD)。抗體效價決定為終點血清稀釋度，在該稀釋度時OD值為相同稀釋度處之陰性對照(未免疫或對照動物血清)之OD的至少三倍。 特定的產生IFN-　之T細胞及抗體的偵測
最後一次疫苗接種後兩週，收穫來自各野生型小鼠組之脾細胞或來自兔之周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，且在肽或蛋白質刺激48 h後，如基本上所描述的(Hawman等人，2021年；Maravelia等人，2021年)使用可商購之酶聯免疫墨點(ELISpot)分析法(Mabtech)測試該等細胞基於IFN-　分泌誘導特定T細胞之能力。 病毒繁殖 自瑞典公共衛生署(Public Health Agency of Sweden)之患者樣品中分離出SARS-CoV-2 huCoV-19/WH01、β及ο毒株，且藉由定序確認。SARS-CoV-2 δ變體由Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark的Charlotta Polacek Strandh博士提供。所有變體均在VeroE6細胞上繁殖，且使用如先前所描述之噬菌斑檢定進行滴定(Varnaite_等人，2020年)，且在72 h後固定。本研究中所用之huCoV-19/WH01、δ及ο毒株傳代了三代，且β毒株傳代了兩代。所有感染實驗均在瑞典工作環境安全委員會批准之BSL-3設施中進行。 SARS-CoV-2之活體外中和
藉由基於CPE之微量中和測定法來測定小鼠及兔血清中之中和抗體效價。對於小鼠，合併來自各疫苗接種組之血清，而對於兔子，測試來自各個體之血清。簡言之，將血清在56℃下熱滅活30 min，隨後連續稀釋2倍。各稀釋以四聯方式進行，且與500 pfu之SARS-CoV-2 huCoV-19/WH01、β、δ或ο以1:1稀釋度進行混合。在37℃、5% CO 2下孵育1 h後，將100 μl血清-病毒混合液添加至96孔板上之Vero E6細胞(20 × 10 4個細胞/孔)中且在37℃、5% CO 2下孵育72 h使用Nikon Eclipse TE300顯微鏡測定各孔之CPE。作為對照，各實驗均包括僅具有培養基、僅稀釋血清、僅病毒以及已知含有與病毒混合之SARS-CoV-2中和抗體的血清的孔。所有感染實驗均在瑞典工作環境安全委員會批准之BSL-3設施中進行。 PCR/病毒RNA
使用比例為1:3之Trizol (Sigma-Aldrich)以滅活感染SARS-CoV-2之K18-hACE2小鼠的鼻腔灌洗液樣品(50 ll)中之潛在病毒。對於肺及脾，將PBS添加至各樣品(1 g/ml)中，且使用研杵壓碎器官。此後，將樣品離心(以7,000 rpm離心5 min)且將50 μl之各肺或脾臟樣品添加至Trizol (1:3)中。按照製造商說明，使用Direct-zol RNA Miniprep套組(Zymo Research)提取總RNA。此後，使用帶有引子及SARS-CoV-2 E基因探針之TagMan Fast Virus 1-Step主混和液(Thermo Fisher Scientific)，藉由定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)來量測病毒RNA。
正向：50 - ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT -30
反向：50 - ATATTGCAGCAGTACGCACACA -30
探針：FAM- ACACTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG MGB
對於肺及脾臟樣品，使用小鼠ACTB混合液(Thermo Fisher Scientific)作為內源性對照。使用毛細管Roche LightCycler 2.0系統進行PCR反應。 組織學分析 將肺用福馬林固定，包埋於石蠟中，且切片以進行H&E染色。切片由對治療組不知情之獨立獸醫病理學家進行分析。根據炎症及疾病之支氣管及肺泡徵象對所有切片進行評分。 統計分析
使用GraphPad Prism V.5軟體及Microsoft Excel V.16.13.1分析數據。動物之群體大小保持在最低限度(5隻雌性小鼠或3 + 3隻雄性及雌性兔子)，以允許有意義的統計分析大小。所有實驗均包括三個或五個重複的重複測定，其與活體外測定中動物之數量及重複的數量有關。 實例12：通用SARS-CoV-2疫苗之免疫原性。
儘管SARS-CoV-2可感染多種物種(Shi等人，2020年)，但很明顯，蝙蝠為大多數人類冠狀病毒起源之帶病原(Hu等人，2015年)。SARS-CoV及SARS-CoV-2之刺突蛋白誘導交叉反應性T細胞，但交叉反應性較差的Nab (Le Bert等人，2020年)。在SARSCoV及SARS-CoV-2之結構蛋白中，包膜蛋白M及核衣殼蛋白N與其他動物SARS-CoV病毒之遺傳相似性高於受體結合S包膜蛋白(Hu等人，2015年；Latinne等人，2020年)。對此兩種抗原具有反應性之T細胞在不同的β冠狀病毒中示出了更高的交叉反應性(Ahlen等人，2020年；Le Bert等人，2020年)。為了利用此點，吾人設計了一種更通用的SARS-CoV (OC-2.4)疫苗，其中含有對應於huCoV-19/WH01、α及β變體之S蛋白受體結合結構域(RBD)環，且與huCoV-19/WH01變體(OC2.4)之M及N蛋白組合(Dai等人，2020年；第7圖、第8A圖)。特定言之，β變體與最近出現之ο變體BA.5共有一些刺突突變，該ο變體BA.5支持使用β變體。在RBD與M及N蛋白之間插入自蛋白水解P2A序列以避免干擾RBD之折疊。M及N蛋白表現為融合蛋白(第7圖)。第7C圖示出了SARS-CoV毒株與變體之間的RBD、M及N蛋白之間的比對。第8A圖示出了疫苗設計以及誘導NAb及廣泛交叉反應性T細胞之概念。作為對照疫苗，吾人使用了不具有插入片段之pVAX質體，或與QS21佐劑混合之重組S蛋白(huCoV-19/WH01)。通用疫苗之目的為誘導廣泛反應性抗體及T細胞，以補充已在使用中之COVID-19疫苗。隨著S蛋白在SARS-CoV毒株與變體之間的差異越來越大(第7圖)，靶向其他區域之交叉反應性T細胞可能變得愈來愈重要。
吾人首先使用活體內電穿孔(EP)用OC-2.4 DNA對Balb/c小鼠進行免疫，且發現該等小鼠產生與huCoV19/WH01、β及δ變體(第8B圖、第8D圖、第8F圖及第8H圖)之重組S蛋白結合以及與N蛋白結合的高位凖抗體(平均值±SD抗N終點效價：25,920 ± 28,979)。S特異性抗體活體外有效中和了SARS-CoV-2之huCoV-19/WH01及β變體(第8C圖及第8E圖)。
在小鼠中，用於佐劑中之重組huCoV-19/WH01 S蛋白初免且用通用SARS-CoV DNA疫苗OC-2.4加強有效地將抗S位凖提高至huCoV-19/WH01 S蛋白之10倍至100倍(第8F圖)。重要的是，用通用DNA疫苗OC-2.4異源加強比同源加強誘導了更高的中和位凖(第8G圖)。此外，用通用DNA疫苗OC-2.4同源加強似乎在誘導ο變體之NAb方面具有優勢(第8G圖)。
在兔子中，吾人發現一劑、兩劑及三劑OC-2.4 DNA疫苗誘導高位凖的抗S抗體，該抗體有效中和SARSCoV-2之δ及ο變體(第8I圖、第9圖)。因此，包含三個RBD環可有效誘導針對huCoV-19/WH01、β、δ及ο變體之廣泛中和抗體。作為比較，佐劑中對應於huCoV-19/WH01變體之三劑重組刺突蛋白在針對β、δ及ο變體初免NAb方面通常不太有效(第8圖)。 實例13：通用SARS-CoV-2疫苗誘導廣泛的交叉反應性T細胞反應。
接下來，分析來自用通用SARS-CoV DNA疫苗OC-2.4免疫之動物的脾細胞(小鼠)及周邊單核細胞(兔子)對S、M及M肽及抗原的反應性，以及T細胞對蝙蝠CoV N序列之交叉反應性(第10圖)。視小鼠品系而定，小鼠產生對疫苗之所有組分具有反應性之T細胞，其中Balb/c小鼠主要產生針對S及N之T細胞(第10A圖至第10D圖)。重要的是，與僅接種rS/QS21之組相比，用rS/QS21初免且用OC-2.4 DNA加強之組中每百萬脾細胞中WH1 N及蝙蝠N肽池編號3 (第10圖)之墨點形成細胞(spot-forming cell，SFC)的平均數量顯著更高(分別為569對15及573對19個SFC/ 10 6PBMC，P ＜ 0.0001，Student的t檢定，Graph Pad Prism)。因此，用OC-2.4 DNA加強擴大了用基於S之疫苗初免之宿主中的T細胞反應性。吾人可在一或多個時間點在大多數接種疫苗之兔子中偵測到PBMC中疫苗之一或多種組分的T細胞，儘管一些兔子在任何時間點均未能產生可偵測到之T細胞反應(第10E圖至第10H圖)。在媒劑組中，在第14天(0/9)或第35天(0/11)兔子均無反應性(＞ 50個SFC/10 6個PBMC)，而與在接受84 μg劑量之OC-2.4的組分別在同一天時的6/15 (40%；P = 0.0519，費雪精準檢定(Fisher’s exact test))、7/15 (47%；P ＜ 0.05，費雪精準檢定)、9/13 (69%；P ＜ 0.01，費雪精準檢定)及10/18 (56%；P ＜ 0.05，費雪精準檢定)相比，1/11在第56天及1/12在第77天對N蛋白具有反應性(第10圖)。用基於刺突之疫苗初免及用OC-2.4 DNA疫苗加強之異源初免-加強策略有效地擴大了T細胞反應，且將新的T細胞特異性引入基於刺突之疫苗中(第10A圖至第10D圖)。此為預期人類最初將該疫苗用作加強疫苗之情況。
重要的是，與對刺突/RBD蛋白具有反應性之T細胞不同，對N蛋白具有反應性之T細胞對對應於小鼠及兔子中之蝙蝠-CoV N之序列具有高度交叉反應性(第10圖)。因此，此等數據表明，該疫苗誘導高度交叉反應性T細胞，該等T細胞亦與動物SARS-CoV蛋白發生交叉反應。
吾人亦在藉由活體內EP遞送四劑媒劑或OC-2.4疫苗後對兔子進行了全面的毒理學分析。在注射部位，在最後一次接種84 μg及840 μg劑量之媒劑後2天，發現變性及炎症。在最後一次疫苗接種後第14天，此等變化在所有接種DNA疫苗之動物中完全癒合，除了一隻雌性動物中具有輕微炎症及變性。此外，生化或血液學標記之變化與治療無關。因此，除了OC-2.4疫苗具有免疫原性之外，其似乎亦為安全的，無任何病理學徵象，除了在治療部位接種疫苗後立即出現的徵象，此為疫苗所預期的。 實例14：通用SARS-CoV-2疫苗:保護K18小鼠免受SARS-CoV-2 β變體之致命攻擊。
最後，吾人分析了通用DNA疫苗OC-2.4在人ACE2基因轉殖K18小鼠中誘導針對SARS-CoV-2 β變體之致命攻擊的保護性免疫反應的能力。對小鼠組進行三次接種，間隔3週，且最後一劑後2週，用1×10 5pfu之SARS-CoV-2 β變體鼻內攻擊小鼠(第11A圖)，且隨後密切追蹤症狀及體重變化13天。通用DNA疫苗OC-2.4保護此等小鼠完全避免致命感染，且展示出完全防止上呼吸道及脾臟中之病毒複製(第11C圖及第11D圖)。然而，疾病此等之組織病理學徵象較少，儘管與模擬接種組無顯著差異(第11B圖)。與對照相比，接種OC-2.4之小鼠肺中之病毒複製亦顯著降低(第11D圖)。相反，用於QS21佐劑中之重組S進行疫苗接種亦可防止致命感染，且導致肺部感染率低，但仍可在上呼吸道及脾臟中偵測到病毒複製(第11C圖)。此外，與模擬接種組相比，該組未展示出顯著降低的疾病組織病理學徵象(第11B圖)。有趣的是，僅激活針對N之抗體及T細胞反應的用於QS21佐劑(rN/QS21)中之重組N蛋白(WH1變體)進行疫苗接種，展示出對上呼吸道中致命疾病及病毒複製的60%保護，但在肺中的保護作用較小(第11C圖及第11D圖)。然而，與接種重組S及OC-2.4之組相比，該組具有明顯更顯著的組織學疾病(第10B圖)。此有力地支持了單獨的T細胞在對抗嚴重疾病方面具有關鍵作用(Gao等人，2022年；Pardieck等人，2022年)，且T細胞在上呼吸道及下呼吸道中之作用可能不同的觀點。
為了比較藉由活體內EP遞送之DNA與於佐劑中之重組N蛋白之間的N特異性抗體及產生IFNγ之T細胞的初免，吾人用單獨編碼N之質體、於alumn中之rN或rN/QS21免疫C57BL/6小鼠(與K18小鼠相同的背景)兩次(第12圖)。包括未處理組作為陰性對照。此表明rN/QS21在誘導N抗體方面最有效，而DNA在初免產生IFNγ之N特異性T細胞方面最有效，但在初免產生IL-2之N特異性T細胞方面與rN/QS21相當(第12圖)。此外，對池6肽之反應性很可能是由於CD8限制性反應，因為其僅在用DNA免疫後可見(第12圖)。總體而言，QS21在初免N特異性抗體級T細胞反應方面優於alumn (第12圖)，此有助於解釋其在K18模型中之T細胞依賴性及部分保護作用(第11圖)。 實例15：論述
在此研究中，吾人在此處設計且評價了一種全新的疫苗設計策略。吾人將來自SARS-CoV-2之三種不同變體的RBD環與高度保守的M及N蛋白組合。與全球所用之針對SARS-CoV-2之疫苗中之任一者相比，該概念旨在誘導具有廣泛反應性及中和性的抗體，以及更廣泛的新T細胞特異性。吾人可證明，當以DNA形式遞送時，疫苗有效地誘導了廣泛的反應性及中和性的抗體，以及全新的T細胞特異性。重要的是，吾人可證明，此疫苗設計可用作當前所用之基於刺突的疫苗的加強疫苗，藉由提高抗刺突抗體位凖，以及擴大T細胞反應。最後，吾人可證明，吾人的疫苗有效地保護了K18 hACE2小鼠免受由SARS-CoV-2 β變體(與當前流行的ο變體共有許多突變的變體)引起之致命疾病。因此，綜合所有資料以及在兔毒理學研究中獲得之良好安全性，此支持了該疫苗的臨床開發。一個非常有趣的觀測結果為，單獨接種N蛋白之小鼠儘管受到保護免於致命疾病，但與使用Nab及T細胞初免之小鼠相比，其損傷更為明顯。此支持了T細胞確實防止嚴重疾病及死亡的概念(Pardieck等人，2022年)。然而，NAb之缺失很可能導致病毒傳播及隨後的T細胞介導之殺傷，從而導致更明顯的組織學疾病。
總之，對於如SARS-CoV-2之病毒展示出令人印象深刻的突變能力及在疫苗覆蓋率高的人群中傳播之能力，需要新的疫苗設計。此處，吾人描述了一種獨特的通用SARS-CoV DNA疫苗，與標準基於刺突之疫苗相比，該通用SARS-CoV DNA疫苗誘導更廣泛的針對huCoV-19/WH01、β、δ及ο變體之中和活性(第13圖)。吾人的資料支持針對SARS-CoV-2疫苗之此全新方法的臨床開發，以補充現有疫苗作為異源加強劑，且亦有可能防止已取代或極大改變SARS-CoV-2之刺突蛋白的未來SARS-CoV病毒。 實例17：材料及方法 動物
雌性C57BL/6 (H-2 b)及BALB/c (H-2 d)小鼠是自Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany獲得。所有小鼠在實驗開始時均為8-12週齡，且維持在瑞典卡羅林斯卡大學醫院哈丁格之臨床前實驗室(PKL)之標準條件下。九隻紐西蘭白兔是自商業供應商購得且保存在卡羅林斯卡學院的Astrid Fagreus設施處。自Marshall Bioresources (NY)購買總共18隻雪貂且適應21天。根據雪貂指南，在卡羅林斯卡學院的Astrid Fagraeus實驗室(AFL)之生物安全等級-3 (BSL-3)設施處之每兩層籠子中飼養三隻動物。購買了總共六隻非人類靈長類動物(NHP；石蟹獼猴)。根據NHP指南，該等動物在卡羅林斯卡學院的AFL之生物安全等級-3 (BSL-3)設施處成對飼養。
所有動物程序均由地區動物倫理委員會批准(批准03634-2020、16171-2020、7602-2020、17114-2020)。 DNA質體及重組蛋白
基於來自Wuhan毒株之序列生成總共八種基因(第14圖)。該等基因在具有或不具有自蛋白水解P2A序列情況下含有RBD、N及M蛋白之組合或單獨含有RBD、N及M蛋白。所有序列均針對在人體細胞中之表現進行密碼子優化，且由商業來源(Genscript)合成。將質體在TOP10大腸桿菌細胞(Life Technologies)中生長，且按照製造商說明使用Qiagen Endofree DNA純化套組(Qiagen)進行活體內註射來純化。藉由使用BamHI及XbaI (Fast Digest；Thermo Fisher Scientific)之限制酶消化來確認正確的基因大小。重組N蛋白由Genscript (32878912)內部設計且生產。重組S、RBD及M是自Genscript購得。藉由哺乳動物細胞(Expi293)中之瞬時蛋白質產生，將刺突蛋白以全長形式產生。為了促進全長刺突之三聚化，根據Wrapp等人包括了C-末端T4纖維蛋白三聚化模體。此外，融合至C-末端之鏈球菌親生物素蛋白-標籤用於純化(Hober等人，2021年)。刺突之β版本(B1.351)在RBD部分(K417N E484K N501Y)中產生了三個突變。 肽
對應於Wuhan RBD (25個肽)、M (22個肽)及N (41個肽)以及蝙蝠N (42個肽)，總共42個具有10個aa重疊之20-mer肽是自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)購得。視實驗設置而定，將肽分為4-5或8-10個肽/池之池。 小鼠、雪貂及NHP之免疫排程
將小鼠間隔三週接種兩次，且第二次免疫後2週處死小鼠，已進行脾臟及血液採集。簡言之，將C57BL/6或BALB/c小鼠(每組5隻)在脛骨前肌肌內藉由常規針頭(27G)注射於50 μL體積之無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之50 μg質體DNA來進行接種，接著使用Cliniporator2裝置(IGEA)使用2個電極進行活體內電穿孔。在疫苗注射之前，將小鼠給予鎮痛劑且在疫苗接種期間保持處於異氟醚麻醉下。在活體內電穿孔(在小鼠、兔子、雪貂及NHP中)期間，使用1-ms 600-V/cm脈衝，接著使用400-ms 60-V/cm脈沖模式，以促進更好地吸收DNA。小鼠組在尾部皮下注射與QS21佐劑(GMP級，Alpha diagnostics) (1:1)混合之重組蛋白。
對於兔子研究，每組3隻紐西蘭白兔用250、500或750 μg OC-2.3 DNA疫苗進行接種。疫苗是在右側脛骨前肌中於500、1000或1500 μL無菌PBS中投與，接著使用GeneDriVe (IGEA)裝置及具有1 cm深度之4電極陣列的GeneGun電極(IGEA)進行活體內電穿孔。
雪貂以3隻為一組，用300 μg DNA疫苗在脛骨前肌中接種，接著使用EPSGun進行活體內電穿孔。將一組雪貂皮下接種於QS-21中之重組蛋白。
將六隻NHP在右股四頭肌肌內接種呈500 μL之1 mg SARS-CoV-2 OC-2.3 DNA或對照DNA (HBV)，接著使用EPSGun進行活體內電穿孔。 雪貂攻擊模型
將雪貂經由鼻內投與0.5 mL體積來用1×10 6pfu SARS-CoV-2攻擊。感染後每日評估動物之體重、一般健康狀況及體溫。在感染後(PI)2、4、7及9天收集鼻腔灌洗液(NAL)。PI十天，對動物實施安樂死，在進行支氣管肺泡灌洗(BAL)後，切除氣管及肺用於進行組織病理學分析。 非人類靈長類動物攻擊模型
將NHP經由鼻內投與0.5 mL體積及鞘內投與4.5 mL體積來用5×10 6pfu SARS-CoV-2攻擊。感染後每日評估動物之健康狀況。在感染前-35、-21及0天以及感染後第4、10、14及21天採集血樣。感染後第4天及第10天進行支氣管肺泡灌洗(BAL)以偵測病毒。 IgG特異性抗體之偵測
小鼠、兔、雪貂及NHP免疫球蛋白對S、RBD或N之偵測是根據先前所描述之方案進行(Ahlen等人，2007年)。藉由鹼性磷酸酶綴合之山羊抗小鼠IgG (Sigma A1047) 1:1000或小鼠抗兔IgG (Sigma A2556) 1:1000來偵測血清抗體，且使用磷酸對硝基苯酯受質溶液進行可視化。在620 nm背景下，在405 nm處讀取光密度(optical density，OD)。抗體效價決定為終點血清稀釋度，在該稀釋度時OD值為相同稀釋度處之陰性對照(未免疫或對照動物血清)之OD的至少三倍。 特定的產生IFN-γ之T細胞的偵測
最後一次疫苗接種後兩週，自各免疫小鼠組、雪貂組或非人靈長類動物組採集脾細胞或周邊血液單核細胞(PBMC)，且基本上如所描述的測試該等細胞誘導基於IFN-γ及IL-2 (小鼠)之特定T細胞的能力、肽刺激36至48h後之分泌(Maravelia等人，2021年)。小鼠及兔IgG針對PreS1一致序列及重疊20mer-肽之偵測是按照先前所描述之方案進行(Maravelia等人，2021年，Hawman等人，2021年)。 病毒繁殖
自瑞典公共衛生署之患者樣品中分離出SARS-CoV-2 huCoV-19/WH01、β及ο毒株，且藉由定序確認。SARS-CoV-2 δ變體由Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark的Charlotta Polacek Strandh博士提供。所有變體均在Vero-E6細胞上繁殖且使用如前所先前所描述之噬菌斑檢定進行滴定(Varnaite等人，2021年)，且在72 h後固定。本研究中所用之huCoV-19/WH01、δ及ο毒株傳代了3代，且β毒株傳代了2代。 SARS-CoV-2之活體外中和
藉由基於CPE之微量中和測定法來測定小鼠及兔血清中之中和抗體效價。對於小鼠，合併來自各疫苗接種組之血清，而對於兔子，測試來自各個體之血清。簡言之，將血清在56℃下熱滅活30 min，隨後連續稀釋2倍。各稀釋以四聯方式進行，且與500 pfu之SARS-CoV-2 huCoV-19/WH01、β、δ或ο以1:1稀釋度進行混合。在37℃、5% CO 2下孵育1小時後，將100 uL血清-病毒混合液添加至96孔板上之Vero E6細胞(20×10 4個細胞/孔)中且在37℃、5% CO 2下孵育72小時。使用Nikon Eclipse TE300顯微鏡測定各孔之CPE。作為對照，各實驗均包括僅具有培養基、僅稀釋血清、僅病毒以及已知含有與病毒混合之SARS-CoV-2中和抗體的血清的孔。 PCR/病毒RNA
使用比例為1:3之Trizol (Sigma-Aldrich)以滅活感染SARS-CoV-2之K18-hACE2小鼠的鼻腔灌洗液樣品(50 μL)中之潛在病毒。對於肺及脾，將PBS添加至各樣品(1 g/ml)中，且使用研杵壓碎器官。此後，將樣品離心(以7000 rpm離心5 min)且將50 μL之各肺或脾臟樣品添加至Trizol (1:3)中。按照製造商說明，使用Direct-zol RNA Miniprep套組(Zymo Research)提取總RNA。此後，使用帶有引子及SARS-CoV-2 E基因探針之TagMan Fast Virus 1-Step主混和液(Thermo Fisher Scientific)，藉由定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)來量測病毒RNA。
正向：5’-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3’
反向：5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’
探針：FAM- ACACTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG MGB
對於肺及脾臟樣品，使用小鼠ACTB混合液(Thermo Fisher Scientific)作為內源性對照。使用毛細管Roche LightCycler 2.0系統進行PCR反應。 組織學分析
將肺用福馬林固定，包埋於石蠟中，且切片以進行H&E染色。切片由對治療組不知情之獨立獸醫病理學家進行分析。根據炎症及疾病之支氣管及肺泡徵象對所有切片進行評分。 統計分析
在GraphPad Prism V.5軟體及Microsoft Excel V.16.13.1上分析數據。 實例18：實驗疫苗之產生
很明顯，人類冠狀病毒來源於蝙蝠(Hu等人，2015年)。SARS-CoV及SARS-CoV-2之刺突蛋白誘導交叉反應性T細胞，但交叉反應性較差的Nab (Le Burt等人，2020年)。在SARS-CoV及SARS-CoV-2之結構蛋白中，M及N蛋白與其他動物SARS-CoV病毒具有更高的遺傳同源性(Hu等人，2015年，Latinne等人，2020年)，且T細胞對此等病毒展示出更好的跨β冠狀病毒之交叉反應性(Le Burt等人，2020年)。吾人最近證實，此等蛋白質誘導可識別穿山甲及蝙蝠SARS-CoV病毒之序列的T細胞(EMBO Mol Med)。因此，吾人可證實，含有不同版本之受體結合結構域之通用SARS-CoV疫苗與M及N蛋白組合誘導廣泛反應(EMBO Mol Med)。作為先前研究之延伸，吾人在此生成了多種嵌合疫苗基因，此等基因誘導T細胞，也同時誘導NAb及T細胞，以更好地定義T細胞在保護及疾病中的作用(第14圖)。
實例19：初免抗體
由於SARS-CoV毒株之間的刺突蛋白存在顯著差異，因此對交叉反應性T細胞之需求增加。與先前觀測結果類似，RBD序列之設計影響了誘導針對RBD及S之NAb的能力(Dai等人，2020年) (第14圖)。然而，此並不影響誘導針對RBD、M及N之T細胞的能力(第15圖)。含有單個線性RBD環但不含Ig前導序列之構築體(OC-2及OC-10)未能誘導針對重組RBD或S之可偵測抗體，儘管T細胞之有效初免(第14圖至第15圖)。含有雙RBD環之構築體(OC-2.2)略微提高了B細胞免疫原性(第14圖)。如所預期的，添加Ig前導序列，接著添加雙RBD環，在單獨或與其他SARS-CoV-2蛋白組合誘導重組RBD或S之抗體方面高度有效(OC-2.3及OC-10.3；第14圖)。此等疫苗亦有效誘導了針對所有疫苗組分之T細胞(第15圖)。
與Balb/c小鼠相比，C57BL/6小鼠對RBD及S之抗體反應(而非T細胞反應)較弱(第14A圖)。含N之構築體誘導了針對N之抗體及T細胞(第14B圖、第15A圖)。含M之構築體誘導了針對M之T細胞(第15A圖)。無論使用何種抗原，均不能重複偵測到針對M之抗體，此可能反映了由於構築體設計，序列未暴露於B細胞，或偵測中多用之抗原未能偵測到此等抗體(資料未示出)。
關於DNA疫苗之一個核心問題為在大型動物體內保持免疫原性之能力。因此，一種SARS-CoV DNA疫苗(OC-2.3)用於使用新開發的用於人類使用之名為Egun的裝置來對兔子進行免疫(第14C圖)。該裝置允許DNA與活體內EP之一步遞送。接受250、500或750 µg之兩種DNA劑量的兔子產生在10 3-10 5之間的抗S位凖(Wuhan毒株；第14D圖)。對該等兔子之活體外中和Wuhan及β/B.1.351 SARS-CoV-2 VOC之能力進行了評價(第14D圖)。此表明需要對Wuhan病毒進行高位凖的抗S初免，以實現β VOC之良好交叉中和作用。因此，吾人可證實，高位凖的抗體對於有效交叉中和不同的SARS-CoV VOC至關重要。 實例20：由通用SARS-CoV疫苗誘導之T細胞
含有單或雙RBD環之DNA疫苗有效地使T細胞針對各別疫苗中之不同組分進行初免(OC-2及OC-2.3；第15A圖)。Balb/c與C57BL/6小鼠對不同組分之識別略有不同，其中Balb/c小鼠主要識別RBD及N，而C57BL/6亦展示出對M之反應(第16圖)。此說明了在遺傳多樣性宿主中包括多種SARS-CoV-2蛋白初免廣泛反應性T細胞反應方面之優勢。重要的是，吾人發現由通用疫苗初免之SARS-CoV-2特異性T細胞與來自蝙蝠SARS-CoV之N蛋白序列對應的肽發生交叉反應(第16B圖)。此與穿山甲衍生之SARS-CoV序列具有100%同源性之鼠類N特異性T細胞識別區域的觀測結果一致(Ahlen等人，2020年)，且支持通用SARS-CoV疫苗之概念。另外，在用相同疫苗(下文將詳細描述)免疫兩次之三隻NHP中之兩隻中，SARS-CoV-2 N特異性T細胞確實與蝙蝠-SARS-CoV N序列發生交叉反應(第15C圖)。因此，添加M及N序列確保對動物SARS-CoV之交叉反應性。
大多數已批准的COVID-19疫苗均基於刺突蛋白(Golob等人，2021年)。因此，任何新的疫苗候選物均需要與此等疫苗結合良好，且添加當前疫苗中不存在之新特性。因此，吾人將吾人的通用SARS-CoV疫苗與基於刺突蛋白之疫苗組合在異源初免加強策略中。用於QS21中之重組刺突(rS)免疫有效誘導針對之抗體、NAb及T細胞(第14B圖及第16圖)。然而，為了誘導更廣泛的T細胞反應性，需要額外SARS-CoV蛋白。在用通用SARS-CoV DNA疫苗OC-2.3之異源初免-加強方案中，擴大了T細胞反應性(第16圖)。無論組合如何，高位凖之抗S抗體與對M及N的更廣泛的T細胞反應性組合。此表明通用SARS-CoV DNA疫苗可有效地用於異源初免-加強策略中，以促進及擴大現有的基於刺突之疫苗產生的反應。 實例21：抗體及T細胞在保護雪貂免於SARS-CoV-2感染中之作用
對T細胞在保護或控制SARS-CoV-2感染中之作用知之甚少。吾人使用雪貂模型以利用誘導SARS-CoV-2特異性T細胞，但不誘導NAb或記憶B細胞之吾人的兩種DNA疫苗，以更好地區分此等反應在防止SARS-CoV-2中之作用。在一項先導實驗中，三隻雪貂保持未處理且三隻雪貂用10 6pfu之SARS-CoV-2感染，受感染動物在感染後10天產生SARS-CoV-2特異性抗體及T細胞(第17A圖且資料未示出)。接下來，在第零週及第三週，用對照DNA疫苗(Maravelia等人，2021年)、OC-2構築體(RBD-M-N；第14A圖)、OC-12 (N；第14A圖)構築體及rS/QS21接種雪貂組。最後一次疫苗接種後兩週，所有雪貂均用SARS-CoV-2攻擊。與鼠類資料一致，在攻擊前接種OC-2 (RBD/M/N)或OC-12 (N) DNA疫苗之組確實未產生針對S之抗體，但產生針對N之抗體(第17B圖且資料未示出)。相反，在攻擊前接種rS/QS21誘導高位凖的S抗體(第17B圖)。除了兩隻(一隻在OC-2組且另一隻在OC-12組)雪貂外，所有雪貂在第二天至第四天均未表現出臨床症狀或表現出輕微的臨床症狀，諸如輕微的嗜睡。剩下的兩隻雪貂在第二天至第四天受到明顯著影響，鼻子裡有濃稠的黏液、食慾缺乏及嗜睡。該等雪貂在第四天至第五天恢復。對照疫苗組在第二天至第九天的鼻腔沖洗液中具有高位凖的SARS-CoV-2 RNA，且在第10天的BAL中均具有RNA (第17C圖)。相反，接種rS/QS21之組的鼻腔沖洗液中之SARS-CoV-2 RNA位凖迅速下降，且至第10天，除了一隻以外，其他雪貂均清除了BAL中之病毒。有趣的是，在攻擊前接種疫苗誘導SARS-CoV-2特異性T細胞的兩組具有在對照DNA組與rS/QS21疫苗組之間的平均鼻SARS-CoV-2 RNA位凖。接種OC-2.3或OC-12之兩隻動物出現了臨床症狀，且具有與對照組相似的鼻SARS-CoV-2 RNA位凖(資料未示出)。最後，僅OC-2 (RBD-M-N) DNA接種組在第10天時BAL中之SARS-CoV-2 RNA為完全陰性的(第17B圖)。
對照DNA組具有緩慢出現的S及N抗體位凖，包括反映自然感染動力學之NAb (第17B圖且資料未示出)。相反，接種誘導SARS-CoV-2特異性T細胞之疫苗之動物關於N抗體及Nab展示出記憶反應(第17B圖且資料未示出)。最後，關於屍體剖驗時之組織學發現，其中最顯著的變化為接種OC-2 (RBD-M-N)或OC-12 (N) DNA之所有動物及接種rS/QS21之組中的一隻的氣管及氣管隆突中之多灶性腔內細胞碎片(第17D圖)。在所有組中均注意到鼻甲中不同程度的炎症。在氣管及氣管隆突中，OC-2 (RBD-M-N)或OC-12 (N) DNA接種組之炎症似乎比其他組更多。因此，儘管T細胞初免之疫苗可幫助控制SARS-CoV-2複製，但組織學檢查表明，此控制可能藉由消除SARS-CoV-2感染的細胞來實現，從而導致稍微更明顯的病理學。總之，組織學結果表明，疫苗策略均不可完全防止疾病之組織學徵象(第17D圖)，此可能是因為用於攻擊之劑量比感染實驗中經常使用之劑量高2-10倍(Shi等人，2020年)。總之，此研究表明SARS-CoV-2特異性T細胞直接藉由消除受感染細胞、或間接藉由促進記憶抗體反應，或兩者之組合在控制SARS-CoV-2複製中之作用。在高劑量攻擊之前，在不存在NAb之情況下觀察到呼吸道組織病理學增加，表明藉由T細胞消除感染細胞可能有助於病毒控制及病理學。因此，此支持了NAb在限制SARS-CoV-2傳播中之核心作用，且表明B細胞及T細胞在控制及清除SARS-CoV-2中之協同作用。 實例22：抗體及T細胞在致命疾病模型中防止SARS-CoV-2感染之作用
為了評價NAb及T細胞在致命疾病模型中之作用，吾人用不同的免疫原兩次接種K18，即表現hACE2受體之小鼠(第18圖)。再次，接種rS/QS21的組被保護免於致命疾病。相反，該等組僅T細胞被初免，類似於雪貂，從而部分保護免於致命疾病(20-25%；第18圖)。然而，與對照組相比，T細胞疫苗組之體重減輕顯著延遲(第四天體重減輕＞10%；對照組為5/5對OC-2及OC-12組合組為2/9，p＜0.05，費雪精準檢定)。在兩組OC-2.3及OC-10.3中，隨著刺突抗體位凖增加，保護作用分別為60%及80%。因此，此證實了NAb在防止疾病中之關鍵作用，且證實了T細胞對疾病之部分保護作用。
接下來，吾人評價了用於用β變體異源攻擊之不同免疫原。對K18小鼠組進行三次接種，間隔3週，且最後一劑後2週，用1×10 5pfu之SARS-CoV-2 β變體鼻內攻擊小鼠(第19圖)，且隨後密切追蹤症狀及體重變化13天。所有表現RBD之組均具有100%的存活率，證明了Wuhan與β菌株之間的交叉保護。 實例23：抗體及T細胞在保護NHP免於SARS-CoV-2中之作用
吾人在石蟹獼猴之先導實驗中評價了一種通用SARS-CoV DNA疫苗 OC-2.3 (IgL-RBDx2-M-N)。將三隻NHP之組在第-35天及第-14天兩次接種編碼HBV疫苗(Maravelia等人，2020年)或通用SARS-CoV DNA疫苗OC-2.3之對照DNA，且隨後在第零天用5×10 6pfu SARS-CoV-2之總劑量在右鼻孔及氣管內進行攻擊(第20圖)。此導致所有六隻動物均感染。在第4天取樣BAL期間，其中一隻對照疫苗動物在麻醉下死亡，可能為對麻醉之反應，或為麻醉與感染之組合的反應。所有對照動物在第4天時在BAL中均具有RNA，且在第20天時，兩隻動物中之一隻(無636)在BAL中具有病毒(第20圖)。兩隻存活對照動物具有輕度至中度的組織學疾病，且在攻擊後均產生了主要針對重組N及S蛋白之弱T細胞反應。直至攻擊後第10天才偵測到對S之抗體反應。
在攻擊前，接種SARS-CoV DNA疫苗之組均產生了抗S及抗RBD (第20A圖至第20B圖)。在攻擊前，抗S/RBD位凖＞10 4之兩隻動物對於SARS-CoV-2 Wuhan毒株均具有低位凖的NAb，但對於β VOC不具有低位凖的NAb (第20B圖)。所有接種疫苗之動物均展示出強烈的記憶反應，且在第10天時，對Wuhan毒株之抗S效價達至＞10 5，且對β VOC之抗S效價達至＞10 4。重要的是，在攻擊前，所有接種疫苗之動物均具有可偵測之SARS-CoV-2特異性T細胞反應，且此等反應之強度與抗S位凖密切相關(第20C圖)。對照組與疫苗組的鼻腔沖洗液中之SARS-CoV-2 RNA位凖無差異(資料未示出)，此強調了高位凖NAb之重要性。相反，三分之二的SARS-CoV-2疫苗接種動物在第4天清除了BAL中之SARS-CoV-2 RNA，且兩隻在第20天清除(第20A圖)，且所有接種疫苗之動物在攻擊後均產生了強烈的多特異性記憶T細胞反應(第20C圖)。應注意到，與具有最強疫苗誘導反應之兩隻動物相比，在攻擊前具有最低抗S及T細胞反應之動物具有更顯著的組織學變化(第20圖)。總之，此受限的先導研究支持快速清除SARS-CoV-2 RNA及控制氣道感染需要NAb及T細胞之協同激活的觀點。 實例24：論述
存在大量處於臨床開發階段的針對SARS-CoV-2之疫苗，其中超過10種已在若干國家獲批供人類使用(Golob等人，2021年)。除兩種滅活全病毒疫苗外，所有此等疫苗均基於SARS-CoV-2之刺突蛋白，目的為誘導Nab (Golob等人，2021年)。最近發現表明，在位置484中攜帶突變之SARS-CoV-2 VOC在臨床試驗中能夠降低至少三種不同的基於S的疫苗之有效性(Madti等人，2021年；Shinde等人，2021年；Sadoff等人，2021年；Sheikh等人，2021年)。此強烈表明NAb在防止輕度及中度疾病方面具有高度依賴性，但對於嚴重疾病及死亡之依賴性可能較低。獼猴感染SARS-CoV-2誘導體液及細胞免疫反應(Shaan Lakshmanappa等人，2021年)，且先前感染在再次攻擊時具有保護作用(Chandrashekar等人，2020年)。抗體及T細胞之個別貢獻仍未完全瞭解。因此，NAb及T細胞之各別貢獻需要進一步研究。
為了進一步瞭解NAb及T細胞，吾人在此生成了編碼RBD、膜蛋白及/或核蛋白之通用DNA疫苗的模板，該等疫苗有效誘導T細胞，但不誘導NAb，或兩者皆誘導，以闡明T細胞如何幫助控制COVID-19感染。此等通用SARS-CoV疫苗候選物有效誘導了中和抗體且初免廣泛反應的T細胞。當達成高位凖的Nab時，則此等抗體活體外中和Wuhan及β VOC。然而，當使用僅誘導T細胞之疫苗時，吾人可證實預先存在的T細胞導致記憶抗體反應，且更好地控制SARS-CoV-2複製，如藉由雪貂攻擊模型中之較低的鼻SARS-CoV-2位凖及肺清除率證明的。因此，誘導SARS-CoV特異性T細胞之疫苗促進SARS-CoV-2之控制及清除，此可能與感染及疫苗接種有關。然而，重要的是應注意，在不存在NAb之情況下，病毒控制可能會獲得更明顯的可能由感染細胞之消除所致的組織學損傷。此處，不同疫苗技術在誘導不同類型T細胞之有效性方面可能有所不同。因此，同樣清楚的是，NAb對於快速控制及遏制雪貂模型中之感染至關重要。此等資料在K18 huACE2攻擊模型中得到重申，在該攻擊模型中單獨T細胞提供了有限的保護，而隨著對S及RBD之抗體位凖增加，控制得到改進。最後，用通用SARS-CoV DNA疫苗接種NHP導致出現了一起介導肺中病毒之快速消除的抗S及RBD抗體、低位凖的NAb及廣泛反應性T細胞。關於S/RBD抗體及廣泛反應性T細胞，攻擊後之回憶反應極強烈。在攻擊之前，抗S反應、NAB位凖及T細胞反應之間存在初步關聯。較低的抗S反應保護肺部但不保護上呼吸道之觀測結果與NHP中之其他疫苗研究完全一致(Feng等人，2020年；Guebre-Xabier等人，2020年；Mercado等人，2020年；van Doremalen等人，2020年；Vogel等人，2020年；Yu等人，2020年)。
總之，吾人可首次證實，僅誘導SARS-CoV-2特異性T細胞之疫苗可促進SARS-CoV-2之控制及清除。此保護作用主要見於下呼吸道，且在上呼吸道中之作用較小。然而，對疾病之全面保護需要NAb及T細胞。通用SARS-CoV疫苗很可能具有誘導與多種SARS-CoV交叉反應之T細胞記憶的能力。在不存在交叉反應性NAb之情況下，此等T細胞可能有助於控制未來SARS-CoV爆發之感染，且將醫療保健負擔降至最低。另外，部分控制病毒複製之疫苗初免的S特異性T細胞之存在有助於解釋為什麼攜帶逃避NAb之突變的VOC仍導致輕度至中度疾病，但防止住院或死亡。
在先前所描述之實施例中之至少一些中，在一實施例中所用之一或多個要素可在另一實施例中互換使用，除非此類替換在技術上不可行。熟習此項技術者將理解，在不脫離所主張主題之範圍的情況下，可對上文所描述之方法及結構進行各種其他的省略、添加及修改。所有此類修改及變化皆意欲落入如所附申請專利範圍界定之主題之範圍內。
關於本文中基本上任何複數及/或單數術語之使用，熟習此項技術者可視上下文及/或應用由複數翻譯成單數及/或由單數翻譯成複數。為清楚起見，可在本文中明確闡述各種單數/複數排列。
熟習此項技術者應理解，一般而言，本文且尤其所附申請專利範圍(例如所附申請專利範圍之主題)中所用之術語通常旨在為「開放」術語(例如術語「包括(including)」應解釋為「包括但不限於(including but not limited to)」、術語「具有(having)」應解釋為「具有至少(having at least)」、術語「包括(includes)」應解釋為「包括但不限於(includes but is not limited to)」等)。熟習此項技術者應進一步理解，若意欲引用特定數量的所引入請求項敘述，則此類意圖將在申請專利範圍中明確地敘述，且在不存在此類敘述之情況下，不存在此類意圖。舉例而言，為了幫助理解，以下所附申請專利範圍可能包括使用介紹性片語「至少一個(種)」及「一或多個(種)」來介紹請求項敘述。然而，此類片語之使用不應解釋為暗示由不定冠詞「一(a/an)」引入請求項敘述將包含此類引入的請求項敘述之任何特定請求項限制為僅含有一個此類敘述之實施例，即使相同請求項包括介紹性片語「一或多個(種)」或「至少一個(種)」及不定冠詞，諸如「一(a/an)」(例如，「一(a/an)」應解釋為「至少一個(種)」及「一或多個(種)」)；用於介紹請求項敘述之定冠詞的使用亦如此。另外，即使明確敘述了所引入的請求項敘述的具體數目，熟習此項技術者將認識到，此類敘述應解釋為意謂至少所敘述之數量(例如無其他修飾語之「兩次敘述」的簡單敘述，意謂至少兩次敘述，或兩次或更多次敘述)。此外，在使用類似於「A、B及C等中之至少一者」的慣例之彼等情況下，一般而言，此類結構意欲在熟習此項技術者理解慣例的意義中(例如「具有A、B及C中之至少一者的系統」將包括但不限於具有單獨A、單獨B、單獨C、A及B一起、A及C一起、B及C一起，及/或A、B及C一起等)。在使用類似於「A、B或C等中之至少一者」的慣例之彼等情況下，一般而言，此類結構意欲在熟習此項技術者理解慣例的意義中(例如「具有A、B或C中之至少一者的系統」將包括但不限於具有單獨A、單獨B、單獨C、A及B一起、A及C一起、B及C一起，及/或A、B及C一起等)。熟習此項技術者將進一步理解，實際上呈現兩個或更多個替代術語之任何分離詞及/或片語，無論在說明書中抑或申請專利範圍中，均應理解為涵蓋包括術語中之一者、術語中之另一者或兩個術語之可能性。舉例而言，片語「A或B」應理解為包括「A」或「B」，或「A及B」之可能性。
另外，在本揭示案之特徵或態樣係關於馬庫什組經描述的情況下，熟習此項技術者將認識到本揭示案亦由此關於馬庫什組之任何個別成員或成員之子組經描述。
熟習此項技術者將理解，出於任何及所有目的，諸如就提供書面描述而言，本文所揭露之所有範圍亦包括其任何及所有可能子範圍及其子範圍之組合。任何所列範圍均可容易地識別為充分描述且能夠將相同範圍分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作為一非限制性實例，本文所論述之各範圍均可容易地分解成下三分之一、中間三分之一及上三分之一等。如亦由熟習此項技術者理解的，諸如「至多」、「至少」、「大於」、「小於」之語言及類似語言包括所列舉之數字且是指可隨後分解成如上文所論述之子範圍的範圍。最後，如熟習此項技術者應理解，範圍包括各個別成員。因此，舉例而言，具有1-3個物品之群組是指具有1、2或3個物品之群組。類似地，具有1-5個物品之群組是指具有1、2、3、4或5個物品等等之群組。
本文所述之所有參考(包括但不限於經公開及未公開之申請案、專利及文獻參考)均以全文引用之方式併入本文中且特此構成本說明書之一部分。倘若以引用之方式併入之公開案及專利或專利申請案與本說明書中所含之揭示內容相矛盾，則本說明書意欲取代及/或優先於任何此類矛盾材料。
雖然本文已經揭露各種態樣及實施例，但其他態樣及實施例將對熟習此項技術者顯而易見。本文所揭露之各個態樣及實施例皆是出於說明之目的而不旨在限制，真實範圍及精神由以下申請專利範圍指示。 參考文獻 Dai et al. 「A Universal Design of Betacoronavirus Vaccines against COVID-19, MERS, and SARS」 Cell. (2020);182(3):722-733. Fehr AR & Perlman S. 「Coronaviruses:An Overview of Their Replication and Pathogenesis」 Methods Mol.Biol.(2015); 1282:1-23. Starr et al. 「Deep Mutational Scanning of SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain Reveals Constraints on Folding and ACE2 Binding」 Cell; (2020) 182(5);1295-1310. Vijayachari et al. 「Immunogenicity of a novel enhanced consensus DNA vaccine encoding the leptospiral protein LipL45」 Hum.Vaccin.Immunother.(2015);11(8):1945-53. Wu A et al. 「Genome Compositions and Divergence of the Novel Coronavirus (2019-nCoV) Originating in China」 Cell Host Microbe. (2020); 27(3):325-328. Zhou et al. A human antibody reveals a conserved site on beta-coronavirus spike proteins and confers protection against SARS-CoV-2 infection. Science.Transl.Med.(2022) doi:10.1126/scitranslmed.abi9215.
無
除上文所描述之特徵之外，其他特徵及變化將自附圖及例示性實施例之以下描述而顯而易見。應理解，此等附圖描繪了典型實施例且並不旨在限制範圍。
第1圖描繪了可用作藥劑之例示性重組免疫原性組成物，諸如用於預防、治療或抑制受試者體內之SARS-CoV-2，例如利用異源初免-加強法。本文所示之例示性組成物中之任一者可用於本文所揭露之方法或用途中之任一者。
第2A圖至第2C圖描繪了可用作藥劑之額外例示性重組免疫原性組成物，諸如用於預防、治療或抑制受試者體內之SARS-CoV-2，包括不同的變體，例如利用異源初免-加強法。本文所示之例示性組成物中之任一者可用於本文所揭露之方法或用途中之任一者。
第3A圖至第3B圖描繪了使用本文所揭露之例示性SARS-CoV-2構築體對BALB/c及C57BL/6小鼠之免疫。第3A圖示出了小鼠血清針對RBD及S蛋白之終點ELISA。第3B圖示出了使用來自免疫小鼠之血清的活體外SARS-CoV-2病毒中和。
第4圖描繪了免疫小鼠對由ELISpot偵測到的涵蓋SARS-CoV-2 RBD、M蛋白及NP蛋白之肽池的T細胞反應。
第5A圖描繪了使用OC-2.3 DNA及重組S蛋白聯合QS21佐劑(rS/QS21)之初免/加強法免疫的小鼠中之抗S蛋白抗體效價。所測試之組合為：1) OC-2.3 DNA初免及rS/QS21蛋白加強；2) OC-2.3 DNA初免及OC-2.3 DNA加強；3) rS/QS21蛋白初免及rS/QS21蛋白加強；4) rS/QS21蛋白初免及OC-2.3 DNA加強。
第5B圖描繪了來自用第5A圖之初免/加強法免疫之小鼠對涵蓋SARS-CoV-2 RBD、M蛋白或NP蛋白或全長RBD、M蛋白或NP蛋白之肽池的T細胞反應。
第6A圖描繪了在第一劑(在第2週)或第二劑(在第5週)後兩週用所測試之OC-2.3 DNA免疫且投與500 µg、1000 µg或1500 µg之DNA的兔子中之抗S蛋白抗體效價。
第6B圖描繪了用所測試之OC-2.3 DNA免疫之石蟹獼猴在兩劑1000 µg劑量後第0週或第5週時的抗S蛋白或抗NP (N)蛋白抗體效價。
第6C圖描繪了在SARS-CoV-2攻擊後第4天或第20天用OC-2.3 DNA或對照DNA免疫的石蟹獼猴中之SARS-CoV-2 RNA的定量。
第7A圖描繪了SARS-CoV毒株與變體之間的S蛋白比對。
第7B圖描繪了包含M蛋白及N蛋白之融合蛋白的分析。
第7C圖描繪了SARS-CoV毒株與變體之間的RBD蛋白、N蛋白及M蛋白比對。
第8A圖至第8I圖描繪了通用SARS-CoV-2疫苗之免疫原性。第8A圖描繪了已給定的通用SARS-CoV-2 DNA疫苗OC-2.4基因設計之示意圖示。第8B圖至第8E圖描繪了SARS-CoV-2 DNA疫苗OC-2.4誘導針對huCoV-19/WH01 (第8B圖)及β變體(第8D圖)之S蛋白的抗體的能力，以及活體外中和此等病毒(第8C圖及第8E圖)之能力。第8F圖、第8G圖描繪了通用SARS-CoV-2 DNA疫苗OC-2.4在用於佐劑中之重組S蛋白初免後初免及加強S蛋白(huCoV-19/WH01)抗體之能力(第8F圖)，以及此等抗體活體外中和δ及ο變體之能力(第8G圖)。第8H圖、第8I圖描繪了三劑通用SARS-CoV-2 DNA疫苗OC-2.4如何在小鼠體內誘導與來自huCoV-19/WH01、β及δ變體之S蛋白發生交叉反應之抗體(第8H圖)且四次840 μg劑量之相同疫苗如何在雌性紐西蘭白兔中誘導活體外中和δ及ο變體變體之抗體(第8I圖)。
第9圖描繪了一劑、二劑及三劑OC-2.4 DNA疫苗後誘導之抗N抗體及抗S抗體之位凖。
第10圖描繪了通用SARS-CoV-2疫苗如何誘導廣泛的交叉反應性T細胞反應。第10A圖至第10D圖描繪了如藉由ELISpot使用活體內電穿孔在用於QS21佐劑中之刺突蛋白 (rS/QS21) (第10A圖)、50 μg通用SARS-CoV-2疫苗OC-2.4 (第10B圖)免疫三次、用rS/QS21初免且用兩劑OC-2.4加強(第10C圖)或空pVAX質體(第10D圖)免疫三次之Balb/c小鼠中決定的T細胞反應。獲取脾臟，且使用指定抗原分析個別小鼠中產生IFNγ之T細胞的存在。數據以每百萬個脾細胞中產生IFNγ (斑點形成)之細胞(SFC)的數量形式給出。各顏色表示個別小鼠。第10E圖至第10H圖描繪了紐西蘭白兔中之T細胞反應的分析，將該等白兔使用活體內電穿孔用僅媒劑(第10E圖)，或84 μg (第10F圖)或840 μg (第10G圖)通用SARS-CoV-2 DNA疫苗OC-2.4免疫四次。獲取周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)且使用指定抗原分析產生IFNγ之T細胞的存在。數據以每百萬個PBMC之IFNγ SFC之數量形式給出。虛線表示50 SFC閾值。亦示出了(第10H圖)在各時間點(天)處對各免疫兔組(84 μg DNA、840 lg DNA及僅媒劑)向RBD、M及N肽池中一起添加之每百萬個PBMC之累積IFNγ SFC數。圖之x軸上之數字(第10A圖至第10D圖)表示涵蓋所示蛋白質之一部分的各別肽池(WH1變體)之數量。
第11A圖至第11D圖描繪了通用SARS-CoV-2疫苗如何保護K18小鼠免受SARS-CoV-2 β變體之致命攻擊。第11A圖描繪了在人ACE2受體基因轉殖的K18-hACE2小鼠中評價不同疫苗策略之實驗設計。第11B圖、第11C圖描繪了三劑各別疫苗完全或部分保護小鼠免受嚴重疾病的影響，如藉由支氣管及肺泡肺組織之組織學評分(第11B圖)、體重減輕百分比(第11C圖)決定的。第11D圖描繪了三劑各別疫苗亦防止病毒在鼻、肺及脾中復製。數值以循環時間(CT)之形式給出，其中較低值表示較高病毒負載。圖中之統計比較是用帶一個星號表示P ＜ 0.05及兩個星號P ＜ 0.01 (曼－惠特尼U檢定(Mann–Whitney U-test)，GraphPad Prism)之線示出。
第12A圖至第12E圖描繪了一個實驗，其中C57BL/6小鼠用編碼單獨N、於alumn中之rN或rN/QS21值質體免疫兩次。第12A圖描繪了藉由上文所描述之方法產生的針對N蛋白之分析效價。第12B圖至第12E圖描繪了對產生IFNγ之N特異性T細胞初免及產生IL-2之N特異性T細胞初免之上述方法的評估。
第13圖描繪了疫苗基因及疫苗蛋白之示意圖以及交叉反應性抗體及T細胞反應之解釋。
第14A圖描繪了基於SARS-CoV-2衍生序列之通用SARS-CoV疫苗候選物的示意性設計。第14B圖描繪了用於間隔三週免疫Balb/c及C57BL/6小鼠兩次之疫苗，且藉由ELISA測定第二劑後兩週對刺突(S)之受體結合結構域(RBD)的抗體終點效價。第14B圖描繪了Wuhan及B.1.351 VOC之NAb位凖，該位凖是藉由病毒中和測定決定，作為在微量中和測定中使50%病毒中和之抗體效價(VNT ID 50)。第14C圖描繪了用於雪貂、兔及NHP中之基因遞送及活體內電穿孔的EPS槍(IGEA)手柄裝置。第14D圖描繪了在兩劑OC-2.3 DNA疫苗之後需要高位凖抗Wuhan抗體以在活體外誘導針對Wuhan及B.1351 β變體之中和抗體。
第15A圖至第15C圖描繪了在第二劑後兩週SARS-CoV-2特異性T細胞在Balb/c及C57BL/6小鼠中之初免，如藉由IFNγ ELISPOT偵測到之對應於RBD、S、M及N抗原之肽及蛋白質之反應性。第15A圖描繪了一個實驗，其中獲取脾臟且使用指定抗原分析小鼠脾細胞池中產生IL-2及IFNγ之T細胞的存在。數據以每百萬個脾細胞中產生IL-2或IFNγ (斑點形成)之細胞(SFC)的數量形式給出。第15B圖描繪了來自由於佐劑中之重組S或含RBD-M-N之OC-2.3 DNA疫苗初免的Balb/c之T細胞的交叉反應性，如藉由ELISPOT中之IL-2產生所決定的。第15C圖描繪了用1 mg SARS-CoV-2 OC-2.3 DNA在右股四頭肌內免疫兩次，接著使用EPSGun進行活體內電穿孔之兩個NHP (385、796)中之T細胞反應的分析。
第16圖描繪了對通用SARS-CoV疫苗OC-2.3擴大經由基於rS/QS21之疫苗誘導之反應的能力的評估，如藉由IFNγ ELISPOT決定對應於RBD、S、M及N抗原之肽及蛋白質的反應性。右列示出了兩次接種後針對S (Wuhan毒株)之抗體效價。
第17A圖至第17D圖描繪了一個實驗，其中三隻雪貂組未感染或被10 5pfu之SARS-CoV-2感染，且T細胞反應藉由IFNγ ELISPOT決定為對對應於RBD、S、M及N抗原之肽及蛋白質之反應性。第17B圖、第17C圖描繪了一個實驗，其中三隻雪貂組經疫苗接種，如所示，且隨後被SARS-CoV-2感染。在攻擊前藉由ELISA測定針對S之抗體，且測定NAb及鼻SARS-CoV-2位凖。在攻擊後第2、4、7、9及10天自鼻腔洗液中量測SARS-CoV-2 RNA位凖，在感染後10天處死所有動物，且進行組織學評價。自BAL樣品評價SARS-CoV-2 RNA位凖(第17B圖)，且對鼻腔及肺組織進行組織學評分(第17D圖)。
第18圖描繪了一個實驗，其中在hACE2 K18疾病模型中T細胞僅部分保護免受SARS-CoV-2感染。用SARS-CoV-2進行同源攻擊後，兩次T細胞疫苗接種可部分保護小鼠免受嚴重疾病影響，如藉由體重減輕百分比所決定的。接種rS/QS21的組被保護免於致命疾病(100%)。所有其他組僅T細胞初免(OC-2、OC-2.3、OC-10.3及OC-12)，從而被部分保護免於致命疾病。
第19A圖至第19C圖描繪了一個實驗，其中通用SARS-CoV-2疫苗保護K18小鼠免受SARS-CoV-2 β變體之致命攻擊。如藉由體重減輕百分比(第19A圖)、支氣管及肺泡組織之組織學評分(第19C圖)所決定，三劑各別疫苗完全或部分地保護小鼠免受嚴重疾病之影響。鼻洗液中之SARS-CoV-2 RNA (第19B圖)位凖已以各樣品重複測定之平均循環時間值形式給出。肺及脾組織中之SARS-CoV-2 RNA位凖已以重複測定之平均循環時間(CT)值形式給出。組織學評分(第19C圖)是由未知實驗組之獨立病理學家完成。數據已以各小鼠之各測定的個體組織病理學評分形式給出，該評分在0 (無)至4 (明顯/嚴重)組織損傷範圍內。
第20A圖至第20C圖描繪了一個實驗，其中用OC-2.3 DNA或對照DNA (HBV)免疫3個NHP組。在第二次疫苗接種後兩週(W5)評價接種疫苗之動物的抗S、RBD及HBV PreS1效價及NAb (第20A圖)。評價了在感染後第4天及第10天收集之BAL樣品中之基因體SARS-CoV-2 RNA (第20A圖)。評價了在感染前(-35、-21、0)及感染後(4、10、14、21)收集之血清樣品中之針對Wuhan及β之SARS-CoV-2特異性抗體之初免(第20B圖)。藉由乾擾素-γ ELISpot對對應於RBD、S、M及N抗原之肽及蛋白質的反應性偵測到之針對Wuhan毒株的SARS-CoV-2特異性T細胞(第20C圖)。
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Claims (120)

  1. 一種包含至少一種編碼一SARS-CoV-2多肽之核酸序列的核酸，其中該至少一種編碼一SARS-CoV-2多肽之核酸序列包含： i) 一或多種編碼一SARS-CoV-2刺突受體結合結構域(RBD)多肽之核酸序列； ii) 編碼一SARS-CoV-2核衣殼蛋白(NP)多肽之一核酸序列； iii) 編碼一SARS-CoV-2膜(M)多肽之一核酸序列； iv) 編碼一D型肝炎抗原(HDAg)多肽之一核酸序列； v) 編碼一自催化多肽裂解位點之一核酸序列； vi) 編碼一IgE前導多肽之一核酸序列； vii) 編碼一SARS-CoV-2刺突(S)多肽之一核酸序列；或 viii) 編碼一CC40.8表位之一核酸序列； 或其任何組合。
  2. 如請求項1所述之核酸，其中該RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者來源於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)或一SARS-CoV-2變體，視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
  3. 如請求項1或2所述之核酸，其中該RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者包含相對於該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在一SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之核酸，其中該RBD多肽包含相對於該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在一SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之核酸，其中參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之一或多種核酸序列中之每一者包含對應於K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之每一者包含對應於K417、N439、L452、T478、E484或N501的一或多個突變，或無此等突變。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於N439及N501的突變。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417、E484及N501的突變。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於L452及T478的突變。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417、N439、L452、T478、E484或N501的突變。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417N、N439K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的一或多個突變。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
  18. 如請求項1至15中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
  19. 如請求項1至16中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之至少一者包含對應於G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
  20. 如請求項1至19中任一項所述之核酸，其中該核酸包含編碼一RBD多肽之三種串聯核酸序列。
  21. 如請求項20所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列各自包含對應於K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
  22. 如請求項20或21所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列各自包含對應於K417、N439、L452、T478、E484或N501的一或多個突變，或無此等突變。
  23. 如請求項20至22中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於N439及N501的突變。
  24. 如請求項20至23中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於K417、E484及N501的突變。
  25. 如請求項20至24中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於L452及T478的突變。
  26. 如請求項20至25中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於K417、N439、L452、T478及N501的突變。
  27. 如請求項20至26中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。
  28. 如請求項20至27中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的突變。
  29. 如請求項20至28中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。
  30. 如請求項20至29中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的突變。
  31. 如請求項20至30中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
  32. 如請求項20至31中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的突變。
  33. 如請求項20至32中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列中之每一者包含對應於G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
  34. 如請求項20至33中任一項所述之核酸，其中編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列包含1)一種編碼來自該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之該RBD多肽的核酸，2)一種具有對應於N439及N501之突變的核酸，以及3)一種具有對應於K417、E484及N501之突變的核酸。
  35. 如請求項20至33中任一項所述之核酸，其中編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列包含1)一種編碼來自該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之該RBD多肽的核酸，2)一種具有對應於K417、N439、L452、T478及N501之突變的核酸，以及3)一種具有對應於K417、E484及N501之突變的核酸。
  36. 如請求項20至33中任一項所述之核酸，其中編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列包含1)一種具有對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505之突變的核酸，2)一種具有對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505之突變的核酸，以及3)一種具有對應於K417、L452或T478之突變的核酸。
  37. 如請求項20至33中任一項所述之核酸，其中編碼該RBD多肽之該三種串聯核酸序列包含1)一種具有對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505之突變的核酸，2)一種具有對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505之突變的核酸，以及3)一種具有對應於N501之突變的核酸。
  38. 如請求項1至37中任一項所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列中之每一者包含對應於C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525的一或多個突變，或無此等突變。
  39. 如請求項1至38中任一項所述之核酸，其中該核酸包含編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列及編碼一NP多肽之該核酸序列。
  40. 如請求項39所述之核酸，其中該核酸進一步包含編碼一IgE前導多肽之該核酸序列。
  41. 如請求項40所述之核酸，其中該核酸基本上由以下組成：編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列、編碼該NP多肽之該核酸序列及編碼該IgE前導多肽之該核酸序列。
  42. 如請求項41所述之核酸，其中該核酸編碼與SEQ ID NO:79、87、93或95具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一多肽，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
  43. 如請求項41或42所述之核酸，其中該核酸與SEQ ID NO:77、78、86、92或94共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
  44. 如請求項40所述之核酸，其中該核酸進一步包含編碼該自催化多肽裂解位點之該核酸序列，視情況其中該自催化多肽裂解位點為一P2A自催化多肽裂解位點。
  45. 如請求項44所述之核酸，其中該核酸基本上由以下組成：編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列、編碼該NP多肽之該核酸序列、編碼該IgE前導多肽之該核酸序列及編碼該自催化多肽裂解位點之該核酸序列。
  46. 如請求項45所述之核酸，其中該核酸編碼與SEQ ID NO:82或89具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一多肽，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
  47. 如請求項45或46所述之核酸，其中該核酸與SEQ ID NO:80、81或88共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
  48. 如請求項44所述之核酸，其中該核酸進一步包含編碼該M多肽之該核酸序列。
  49. 如請求項48所述之核酸，其中該核酸基本上由以下組成：編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列、編碼該NP多肽之該核酸序列、編碼該IgE前導多肽之該核酸序列、編碼該自催化多肽裂解位點之該核酸序列及編碼該M多肽之該核酸序列。
  50. 如請求項49所述之核酸，其中該核酸編碼與SEQ ID NO:85具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一多肽，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
  51. 如請求項49或50所述之核酸，其中該核酸與SEQ ID NO:84共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
  52. 如請求項40所述之核酸，其中該核酸進一步包含編碼一CC40.8表位之一核酸序列。
  53. 如請求項52所述之核酸，其中該核酸基本上由以下組成：編碼該RBD多肽之該一或多種核酸序列、編碼該NP多肽之該核酸序列、編碼該IgE前導多肽之該核酸序列及編碼該CC40.8表位之該核酸序列。
  54. 如請求項53所述之核酸，其中該核酸編碼與SEQ ID NO:97或99具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一多肽，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
  55. 如請求項53或54所述之核酸，其中該核酸與SEQ ID NO:96或98共有或包含至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
  56. 一種包含至少一種SARS-CoV-2多肽之多肽，其中該SARS-CoV-2多肽包含： i)一或多種SARS-CoV-2刺突受體結合結構域(RBD)多肽序列； ii) 一SARS-CoV-2核衣殼蛋白(NP)多肽序列； iii) 一SARS-CoV-2膜蛋白(M)多肽序列； iv) 一D型肝炎抗原(HDAg)多肽序列； v) 一自催化裂解位點序列； vi) 一IgE前導多肽序列；或 vii) 一SARS-CoV-2刺突(S)多肽序列；或 viii) 一CC40.8表位； 或其任何組合。
  57. 如請求項56所述之多肽，其中該RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者來源於野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)或一SARS-CoV-2變體，視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
  58. 如請求項56或57所述之多肽，其中該RBD多肽、NP多肽、M多肽或S多肽中之一或多者包含相對於該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在一SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
  59. 如請求項56至58中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽中之每一者包含相對於該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)在一SARS-CoV-2變體中發現之一或多個突變，該變體視情況為α、β、γ、δ、θ、ι、κ、λ、μ或ο變體。
  60. 如請求項56至59中任一項所述之核酸，其中參考完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之每一者包含K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505處之一或多個突變，或無此等突變。
  61. 如請求項56至60中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之每一者包含K417、N439、L452、T478、E484或N501處之一或多個突變，或無此等突變。
  62. 如請求項56至61中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之N439及N501處之突變。
  63. 如請求項56至62中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之K417、E484及N501處之突變。
  64. 如請求項56至63中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之L452及T478的突變。
  65. 如請求項56至64中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之L452R或T478K的一或多個突變。
  66. 如請求項56至65中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之K417、N439、L452、T478、E484或N501的一或多個突變。
  67. 如請求項56至66中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之K417N、N439K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。
  68. 如請求項56至67中任一項所述之多肽，其中該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變。
  69. 如請求項56至68中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的一或多個突變。
  70. 如請求項56至69中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。
  71. 如請求項56至70中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
  72. 如請求項56至71中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
  73. 如請求項56至72中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的一或多個突變，或無此等突變。
  74. 如請求項56至73中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
  75. 如請求項56至74中任一項所述之多肽，其中該多肽包含三種串聯RBD多肽序列。
  76. 如請求項75所述之核酸，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列各自包含K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505處之一或多個突變，或無此等突變。
  77. 如請求項75或76所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列各自包含參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之K417、N439、L452、T478、E484或N501處之一或多個突變，或無此等突變。
  78. 如請求項75至77中任一項所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)之N439及N501處之突變。
  79. 如請求項75至78中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含K417、E484及N501處之突變。
  80. 如請求項75至79中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含對應於L452及T478的突變。
  81. 如請求項75至80中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417、N439、L452、T478及N501的突變。
  82. 如請求項75至81中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之每一者包含K417N、N439K、L452R、T478K、E484K或N501Y的一或多個突變，或無此等突變。
  83. 如請求項75至82中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含對應於K417、L452或T478的突變。
  84. 如請求項75至83中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之每一者包含K417N、L452R或T478K的一或多個突變，或無此等突變。
  85. 如請求項75至84中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505的突變。
  86. 如請求項75至85中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之每一者包含G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
  87. 如請求項75至86中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之至少一者包含對應於G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505的突變。
  88. 如請求項75至87中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該三種串聯RBD多肽序列中之每一者包含G339D、S371F、S373P、S375F、T376A、D405N、R408S、K417N、N440K、S477N、T478K、E484A、Q493R、Q498R、N501Y或Y505H的一或多個突變，或無此等突變。
  89. 如請求項75至88中任一項所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列包含1)一種對應於來自該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之該RBD多肽的RBD多肽，2)一種具有N439及N501處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有K417、E484及N501處之突變的RBD多肽。
  90. 如請求項75至89中任一項所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列包含1)一種對應於來自該野生型SARS-CoV-2毒株(Wuhan-hu-1)之該RBD多肽的RBD多肽，2)一種具有K417、N439、L452、T478及N501處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有K417、E484及N501處之突變的RBD多肽。
  91. 如請求項75至90中任一項所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列包含1)一種具有G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，2)一種具有G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有K417、L452或T478處之突變的RBD多肽。
  92. 如請求項75至91中任一項所述之多肽，其中該三種串聯RBD多肽序列包含1)一種具有G339、S371、S373、S375、K417、N440、G446、S477、T478、E484、Q493、G496、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，2)一種具有G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、K417、N440、S477、T478、E484、Q493、Q498、N501或Y505處之突變的RBD多肽，以及3)一種具有N501處之一突變的RBD多肽。
  93. 如請求項75至92中任一項所述之多肽，其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白(例如如NCBI登錄號YP_009724390 (SEQ ID NO:83)中所示)，該一或多種RBD多肽序列中之每一者包含C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525處之一或多個突變，或無此等突變。
  94. 如請求項75至93中任一項所述之多肽，其中該多肽包含該一或多種RBD多肽序列及該NP多肽序列。
  95. 如請求項94所述之多肽，其中該多肽進一步包含該IgE前導多肽序列。
  96. 如請求項95所述之多肽，其中該多肽基本上由以下組成：該一或多種RBD多肽序列、該NP多肽序列及該IgE前導多肽序列。
  97. 如請求項96所述之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:79、87、93或95具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一序列，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
  98. 如請求項96或97所述之多肽，其中該多肽由與SEQ ID NO:77、78、86、92或94具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一核酸編碼，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
  99. 如請求項95所述之多肽，其中該多肽進一步包含該自催化多肽裂解位點序列，視情況其中該自催化多肽裂解位點序列為一P2A自催化多肽裂解位點序列。
  100. 如請求項99所述之多肽，其中該多肽基本上由以下組成：該一或多種RBD多肽序列、該NP多肽序列、該IgE前導多肽序列及該自催化多肽裂解位點序列。
  101. 如請求項100所述之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:82或89具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一序列，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
  102. 如請求項100或101所述之多肽，其中該多肽由與SEQ ID NO:80、81或88具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一核酸編碼，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
  103. 如請求項99所述之多肽，其中該多肽進一步包含該M多肽序列。
  104. 如請求項103所述之多肽，其中該多肽基本上由以下組成：該一或多種RBD多肽序列、該NP多肽序列、該IgE前導多肽序列、該自催化多肽裂解位點序列及該M多肽序列。
  105. 如請求項104所述之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:85具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一序列，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
  106. 如請求項104或105所述之多肽，其中該多肽由與SEQ ID NO:84具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一核酸編碼，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
  107. 如請求項95所述之多肽，其中該多肽進一步包含一CC40.8表位。
  108. 如請求項107所述之多肽，其中該多肽包含以下、由以下組成基本上由以下組成：該一或多種RBD多肽序列、該NP多肽序列、該IgE前導多肽序列及該CC40.8表位。
  109. 如請求項108所述之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO:97或99具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一序列，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中之K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中之C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合處。
  110. 如請求項108或109所述之多肽，其中該多肽由與SEQ ID NO:96或98具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之一核酸編碼，視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484、N501、G339、S371、S373、S375、T376、D405、R408、N440、G446、S447、Q493、G496、Q498或Y505或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化不在該RBD多肽中編碼K417、N439、L452、T478、E484或N501或其任何組合之序列處；視情況其中參考該完整SARS-CoV-2 S蛋白，序列一致性之變化在該RBD多肽中編碼C336、C361、C379、C391、C432、C480、C488或C525或其任何組合之序列處。
  111. 如請求項56至110中任一項所述之多肽，其中該多肽視情況在一哺乳動物、細菌、酵母、昆蟲或無細胞系統中重組表現。
  112. 一種包含一核酸及一多肽之免疫原性組成物或產品組合，其中該核酸為如請求項1至55中任一項所述之核酸且該多肽為如請求項56至111中任一項所述之多肽。
  113. 如請求項112所述之免疫原性組成物或產品組合，其進一步包含一佐劑，視情況其中該佐劑為Matrix-M、alum及/或QS21。
  114. 如請求項112或113所述之免疫原性組成物或產品組合，其中該核酸以一重組載體形式提供。
  115. 一種在一受試者中產生一免疫反應及/或產生中和抗體之方法，其包括以下步驟：向該受試者投與如請求項1至55中任一項所述之核酸及/或如請求項56至111中任一項所述之多肽。
  116. 一種在一受試者中產生一免疫反應及/或產生中和抗體之方法，其包括以下步驟：向該受試者投與如請求項112至114中任一項所述之免疫原性組成物或產品組合。
  117. 如請求項116所述之方法，其中該投與步驟是以初免/加強法進行，該初免/加強法包括以下步驟：a)向該受試者投與至少一劑包含該免疫原性組成物或產品組合之該核酸的初免劑量及b)向該受試者投與至少一劑包含該免疫原性組成物或產品組合之該多肽的加強劑量。
  118. 如請求項117所述之方法，其中該至少一劑加強劑量是在投與該至少一劑初免劑量後至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36或48天或數週或在由上述時間點中之任兩者所界定之一時間範圍內，例如在1-48天或1-48週內投與。
  119. 如請求項116至118中任一項所述之方法，其中該投與是藉由腸內、口服、鼻內、腸胃外、皮下、肌內、皮內或靜脈內或其任何組合提供，且視情況與活體內電穿孔一起提供。
  120. 如請求項116至119中任一項所述之方法，其中該投與是與一抗病毒療法聯合進行，視情況其中該抗病毒療法包括投與地塞米松、法匹拉韋、法維拉韋、瑞德西韋、托珠單抗、加利西韋、薩瑞魯單抗、洛匹那韋、利托那韋、達蘆那韋、利巴韋林、干擾素-α、聚乙二醇化干擾素-α、干擾素α-2b、恢復期血清或其任何組合。
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